FI80345B - Visualiseringsfoerfarande foer direkt eller indirekt detektering av ett agglomerat bildat av ett specifikt bindande aemne och en motsvarande acceptorsubstans vid blot overlay-bestaemningar och i dessa bestaemningar anvaendbar testfoerpackning. - Google Patents

Description

i 80345

Visualisointimenetelmä spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta akseptoriaineesta muodostuneen agglomeraatin toteamiseksi suoraan tai epäsuorasti blot overlay-määri-tyksissä sekä näissä määrityksissä käyttökelpoinen testi-5 pakkaus Käsiteltävänä oleva keksintö koskee menetelmää spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta akseptoriaineesta muodostuneen agglomeraatin toteamiseksi tai määrittämisek-10 si blot overlay-tekniikkaa käyttävien yleismenetelmien avulla, joissa käytetään merkittyjä komponentteja. Lisäksi keksintö koskee testipakkausta, jolla todetaan tai määritetään yksi spesifisen sitoja-aineen ja vastaavan aksep-toriaineen välisessä reaktiossa muodostuvan agglomeraatin 15 komponenteista yleisellä blot overlay-määritysmenetelmäl-lä.

Akseptoriaine on tavallisesti vesipitoisessa tes-tinäytteessä ja määrityksen myöhemmässä vaiheessa se adsorboidaan ja/tai sidotaan kovalenttisesti immobilisoivaan 20 matriisiin. Esimerkkejä immobilisoivista matriiseista ovat nitroselluloosa (NC)-kalvo (ohut, tunnetun huokoisuuden omaava, typpihapolla esteröidystä selluloosasta valmistettu kalvo), diatsobentsyylioksimetyylillä (DBM) ja diatso-fenyylitioeetterillä (DPT) modifioitu selluloosapaperi, 25 syaanibromidilla aktivoitu paperi tai selluloosa-asetaatti sekä nailonista valmistetut kalvot kuten Gene Screen ja Zetabind. Jälkimmäinen on nailonmatriisi (polyheksamety-leeniadipamiini, josta käytetään nimeä nailon 66), joka valmistuksen yhteydessä on modifioitu liittämällä siihen 30 useita tertiäärisiä aminoryhmiä. Mainittuja immobilisoivia matriiseja kutsutaan usein blottausväliaineiksi (ks. esim.

J.M. Gershoni ja G.E. Pallade, Analytical Biochemistry 131, 1-15 (1983)).

Blot overlay-määritysmenetelmät jaetaan yleensä 35 kahteen ryhmään: 2 80345 A. Sandwich overlay-määrityksessä puhdistettu tai konsentroitu spesifinen sitoja-aine liitetään immobilisoi-vaan matriisiin jäljempänä esitettävän kohdan B mukaisesti, edullisesti pienenä täplänä, ja akseptoriaineen an- 5 netaan sitoutua siihen, jolloin matriisi immobilisoi akseptoriaineen, joka voidaan tämän jälkeen todeta. Spesifisen sitoja-aineen spesifisyyden ansiosta on mahdollista eristää akseptoriaine monimutkaisesta testinäytteestä, esim. virtsasta, plasmasta, seerumista, muista kehon nes-10 teistä, soluttomista siirtosysteemeistä, solu- ja kudos-lysaateista jne, ja käyttää tätä kykyä hyväksi puolikvan-titatiivisissa ja/tai -kvalitatiivisissa (diagnostisissa) määrityksissä eli ns. sandwich blot overlay-määrityksessä (SBOA). Tähän saakka SBOA:n käyttöarvo on ollut olematon, 15 koska tähän saakka on ollut tarjolla vain suhteellisen monimutkaisia toteamismenetelmiä. Tämän keksinnön toteuttamismuodon ansiosta toteaminen on erittäin yksinkertaista ja näin ollen SBOA:n diagnostinen käyttö saattaa kasvaa.

B. Suorassa blot overlay-määrityksessä akseptoriai-20 ne sidotaan suoraan blottausväliaineeseen menettelyn avulla, jota kutsutaan "transferoinniksi" tai "blottaukseksi". Kirjallisuudesta löytyy erilaisia tunnettuja tapoja tämän toteuttamiseksi. Voidaan esim. siirtää pieniä pisaroita, joiden tilavuus on suunnilleen 1 μΐ (tilavuus voi olla 25 muukin) ja jotka sisältävät vesipitoisessa liuoksessa tunnetun tai tuntemattoman määrän akseptoriainetta (puhdistettuna tai puhdistamattomana), blottausvällaineelle täpliksi, jolloin akseptoriaine voi kiinnittyä blottausväliaineeseen. Tällaisia täpläblottauksia voidaan mahdollises-30 ti käyttää diagnostisesti, kun erilaisista kehon nesteistä halutaan todeta immobilisoituun akseptoriaineeseen liittyneiden spesifisten sitoja-aineiden läsnäolo. Jos akseptoriaine muodostaa osan monimutkaisesta seoksesta, seos voidaan akseptoriaineen tunnistamiseksi ensin erottaa kom-35 ponenteikseen erilaisin kromatografisin tekniikoin, esim.

3 80345 ohutkerroskromatografialla tai elektroforeesitekniikoilla esim. polyakryyliamidigeeleissä, joista tekniikoista esimerkkeinä natriumdodekyylisulfaatti (SDS)-elektroforeesi, isoelektrinen fokusointi, kaksiulotteinen geelielektrofo-5 reesi, gradienttigeeli- ja happo-ureageelielektroforeesi ja denaturoimaton geelielektroforeesi. Joissakin tapauksissa esim. nukleiinihapoille, voidaan myös käyttää agar-geelejä. Sitten toisistaan elektroforeettisesti erotetut komponentit (esim. proteiinit, peptidit ja nukleiinihapot) 10 siirretään immobilisoivaan matriisiin menettelyin, jotka tunnetaan kapillaari-, vakuumi- tai elektrosiirtona (eli -blottauksena). Sitten komponentit immobilisoidaan blot-tausväliaineelle, jolloin niiden alkuperäinen elektrofo-reettinen kuvio säilyy suurelta osin. Tämä kuvio voidaan 15 kokonaisuudessaan visualisoida tunnetuin värjäystekniikoin esim. amidomustalla ja coomassiesinisellä ja näin tutkittava komponentti (akseptoriaine) voidaan määrittää (ks. alla) ja sen sijainti voidaan paikallistaa kokonaiselekt-roforeesi kuviossa.

20 Useimmat tähän saakka käytetyistä sitoja-aineista ovat olleet proteiineja, jotka sitoutuvat tarkoin tunnettuihin kohtiin akseptorlaineessa. Glykoproteiinien toteamiseksi on käytetty lektiinejä. Polyklonaalisia ja mono-klonaalisia vasta-aineita on käytetty niitä vastaavien 25 antigeenien tai hapteenien toteamiseksi (esim. biotiini tai biotinyloitu DNA reagoi antibiotiinin kanssa, dinitro-fenyloiduissa proteiineissa oleva DNP anti-DNP:n kanssa). Blot overlay-määrityksiä käytetään jo yleisesti vasta-aineiden spesifisyyden testaamiseksi ja monoklonaalisten 30 vasta-aineiden seulontatutkimuksissa. Näiden laajasti käytettyjen systeemien ohella voidaan analysoida monien muiden proteiinien (esim. kalmoduliinia tai aktiinia sitovien proteiinien) välisiä tai proteiinin ja ligandin (esim. avidiinin ja biotiinin) välisiä vuorovaikutuksia, joista 35 komponenteista jokin immobilisoidaan. Näihin kuuluvat DNA- i 80345 proteiini- ja RNA-proteiinivuorovaikutukset, reseptori-ligandivuorovaikutukset ja yleensä kaikki riittävän spesifiset ja affiiniset makromolekyyli-makromolekyylivuorovaikutukset .

5 Blot overlay-määritysten olennainen osa muodostuu menetelmästä immobi li soidun akseptoriaineen visualisointi-seksi. On olemassa suoria ja epäsuoria menettelyjä. Visualisoinnissa käytetään merkkiaineita: radioaktiivisia isotooppeja (3 H, 14 C, 32 P, 3 5 S tai 12 5I), jonka jälkeen kehi-10 tetään autoradiografisesti; entsyymejä, jotka pystyvät muodostamaan liukenemattomia, värillisiä tuotteita ja fluorikromeja. Suorissa menettelyissä merkkiaine sidotaan spesifiseen sitoja-aineeseen. Epäsuorassa menettelyssä se sidotaan makromolekyyliin, joka spesifisesti pystyy sitou-15 tumaan ensimmäiseen spesifiseen sitoja-aineeseen. Jos jälkimmäisenä on vasta-aine, makromolekyylinä voi olla proteiini A tai toinen vasta-aine. Vasta-aineille voidaan myös käyttää monivaihetekniikkoja, esim. avidiinin ja bio-tinyloidun piparjuuriperoksidaasin muodostamaa kompleksia 20 (ABC) käyttävää menettelyä ja merkitsemättömän peroksidaa-sin ja anti-peroksidaasin välistä reaktiota (PAP) käyttävää menettelyä.

Käsiteltävänä olevan keksinnön olennaisena kohtana on käyttää blot overlay-tekniikoissa visualisointi- ja/tai 25 toteamiskeinona dispersiota, joka sisältää metallia tai metalliyhdistettä tai metallilla tai metalliyhdisteellä pinnoitettuja ytimiä. Tässä tekstissä käytetyllä sanonnalla "kolloidiset metallihiukkaset" tarkoitetaan hiukkasia sisältäviä dispersioita, valinnaisesti soolia, jotka hiuk-30 kaset muodostuvat metallista, metalliyhdisteestä tai metallilla tai metalliyhdisteellä pinnoitetuista ytimistä.

Kolloidiset metallihiukkaset voidaan valmistaa tekniikan tason tuntemin menetelmin, esim. menetelmin kolloidisen kullan, hopean tai rautaoksidin ym. valmistamiseksi. 35 Kolloidiset metallihiukkaset voidaan suoraan tai epäsuo- 5 80345 rasti liittää spesifiseen sitojaproteiiniin tai akseptori-aineeseen tai makromolekyyliin, joka sitoutuu spesifisesti ensimmäiseen spesifiseen sitoja-aineeseen, esim. proteiini Aihan, toiseen vasta-aineeseen (kun määritetään ensimmäi-5 nen vasta-aine) tai streptavidiiniin ja avidiiniin (kun jokin komponenteista on biotinyloitu), jolloin alkuperäinen sitoutumisaktiivisuus säilyy suurimmaksi osaksi. Liittäminen suoritetaan tekniikan tason tuntemin menetelmin. Liittämisellä tarkoitetaan kaikkia kemiallisia tai fysi-10 kaalisia sitoutumistapoja kuten sitoutumista kovalenttisi-dosten välityksellä, vetysiltojen välityksellä, poolisen vetovoiman avulla ja adsorption avulla.

Nyt on havaittu, että kun blottausväliainetta ja siihen joko epäsuorasti (ks. A) tai suoraan (ks. B) sidot-15 tua akseptoriainetta inkuboidaan asiamukaisen määrän kanssa spesifistä sitoja-ainetta, joka on merkitty kolloidi-silla metallihiukkasilla, (suora toteamismenetelmä) tai sitä inkuboidaan ensin merkitsemättömän spesifisen sitoja-aineen kanssa ja sitten kolloidisilla metallihiukkasilla 20 merkityn makromolekyylin kanssa, joka pystyy spesifisesti sitoutumaan ensimmäiseen spesifiseen sitoja-aineeseen, (epäsuora toteamismenetelmä), kolloidiset metallihiukkaset akkumuloituvat spesifisiin sitoutumiskohtiin ja tulevat yllättäen näkyviksi värinä, joka on tunnusomainen käyte-25 tyille kolloidisille metallihiukkasille. Esimerkiksi käytettäessä metallina kultaa saadaan väri, joka on vaaleanpunaisesta tummanpunaiseen, ja hopeaa käytettäessä saadaan väri, joka on keltaisesta ruskeaan mustaan. Tämä väri on signaali, joka on kvalitatiivisesti luettavissa paljaalla 30 silmällä tai valinnaisesti mitattavissa tekniikan tason tuntemin spektrofotometrisin menetelmin, esim. densitomet-risesti.

Kolloidisten metallihiukkasten hiukkaskoko on mieluiten 3-100 nm ja erityisesti 5-50 nm.

35 Esimerkkeinä kolloidisista metallihiukkasieta, jot ka voidaan liittää spesifisiin sitoja-aineisiin, on kuvat- 6 80345 tu metallit platina, kulta, hopea ja kupari ja metalliyh-disteet hopeajodidi, hopeabromidi, kidevesipitoinen kuparioksidi, rautaoksidi, rautahydroksidi tai vesipitoinen rautaoksidi, alumiinihydroksi tai vesipitoinen alumiiniok-5 sidi, kromihydroksidi tai vesipitoinen kromioksidi, vana-diinioksidi, arseenisulfidi, mangaanihydroksidi, lyijysul-fidi, elohopeasulfidi, bariumsulfaatti ja titaanidioksidi. Tunnetusti voidaan myös käyttää kolloideja, jotka sisältävät ytimiä, jotka on pinnoitettu yllä mainituilla metal-10 leiliä tai metalliyhdisteillä. Nämä hiukkaset vastaavat ominaisuuksiltaan metalli- tai metalliyhdistekolloideja, mutta niiden koko, tiheys ja metallipitoisuus voidaan yhdistää optimaalisella tavalla. Yleensä voidaan käyttää kaikkia kolloidisia metallihiukkasia tai metalliyhdistei-15 tä, jotka voidaan liittää spesifisiin sitoja-aineisiin näiden sitomisaktiivisuutta vahingoittamatta ja jotka blot overlay-määritykeissä muodostavat paljaalla silmällä havaittavan väri-intensiteetin. Herkkyys on edullisesti yhtä hyvä tai parempi kuin kullalla ja hopealla saavutettava 20 herkkyys.

Menettelyt, joissa käytetään kolloidisia metallihiukkasia ja erityisesti kultasoolihiukkasia, jotka pystyvät pinnoittamaan spesifisiä sitoja-aineita kuten vasta-aineita, lektiinejä, proteiini A:ta, avidiinia ja monia 25 muita tai jopa akseptoriproteiineja kuten antigeenejä, ovat nykyään vakiinnuttaneet paikkansa monissa sytokemial-lisissa merkitsemistekniikoissa läpivalaisu- ja pyyhkäisyelektronimikroskopiassa. Esimerkki kolloidisen metallihiukkasen käytöstä, joka on metallilla pinnoitetun poly-30 meerin muodossa, on raudalla pinnoitettu dekstraani, joka liittyneenä vasta-aineisiin on erittäin käyttökelpoinen merkkiaine läpivalaisuelektronimikroskopiassa. Tällaisessa käytössä käytetään kuitenkin hyväksi tämän tyyppisille merkkiaineille tyypillistä elektroniläpäisemättömyyttä 35 (läpivalaisuelektronimikroskopia) tai niiden kykyä emit toida sekundäärielektroneja tai takaeroittuvia primääri- 7 80345 elektroneja (pyyhkäisyelektronimikroskopia).

Kolloidisia metallihiukkasia, erityisesti kullasta ja hopeasta valmistettuja, on myös käytetty merkkiaineina valomikroskooppisissa sytokemiallisissa merkintäteknii-5 koissa, kun oli osoitettu, että tällaisten kolloidisten metallihiukkasten akkumuloituminen sitoutumiskohtiin ob-jektilasilla olevassa kudosvalmisteessa tai solun pintaan voitiin havaita valomikroskoopilla.

Kolloidisia metallihiukkasia käytetään myös jois-10 sakin kvalitatiivisissa ja kvantitatiivisissa määrityksissä, joissa määritetään in vitro immunologisia komponentteja kuten hapteeneja, antigeenejä ja vasta-aineita vesivä-liaineessa. Näitä tekniikkoja on kutsuttu soolihiukkasim-munomäärityksiksi ja passiiviseksi kulta-agglutinaatioksi 15 (Geoghegan).

Passiivisessa kulta-agglutinaatiotekniikassa agglu-tinoidaan kullalla merkitty antigeeni (kultahiukkaset 18-20 nm) merkitsemättömällä vasta-aineella. Käytetään stan-dardimikrotitterilaitteistoa, jossa aggregoitumaton kulta 20 valuu syvennysten seinämää pitkin alaspäin muodostaen punaisen raidan. Tämä tekniikka on analoginen klassilliselle passiiviselle hemagglutinaatiolle ja on yhtä herkkä kuin tämä. On väitetty tällä tekniikalla pystyttävän käänteis-agglutinaatioon, jolloin vasta-aine merkitään kullalla.

25 Soolihiukkasimmunomääritykset jakaantuvat kahdeksi ryhmäksi. Ensimmäinen on ns. homogeeninen soolihiukkasim-munomääritys, jossa kolloidisilla hiukkasilla merkitty vasta-aine agglutinoidaan immunokemiallisesti kaksi- tai moniarvoisilla antigeeneillä tai hapteeneilla, jotka on 30 sidottu kantajaproteiiniin. Agglutinaatiosta johtuva värin heikkeneminen mitataan kolorimetrisesti käyttäen puskuria nollanäytteenä. Näytteestä peräisin olevat vapaat haptee-nimolekyylit voivat sitten estää kolloidisten metallihiukkasten agglutinoitumisen. Tällaisia menetelmiä on kuvattu 35 EP-patenttijulkaisussa nro 0 007 654.

Soolihiukkasimmunomäärityksen toinen tyyppi perus- 8 80345 tuu vapaiden/sitoutuneiden kolloidisten metallihiukkasten muodostaman konjugaatin erotusmeentelmiin, jotka ovat analogisia radioimmunomääritykselle ja entsyymi-immunomääri-tykselle. Tällaisia menetelmiä on kuvattu EP-patenttijul-5 kaisussa nro 0 007 654. Yhtä tällaista menetelmää kutsutaan sandwichsoolihiukkasimmunomääritykseksi (SSPIA) ja se on analoginen sandwich-ELISA eli kiintofaasisandwich-radioimmunomääritykselle. SSPIA:ssa toimitaan tyypillisesti siten, että määritettävän antigeenin vasta-aine adsor-10 boidaan ensin esim. polystyreeniä olevan mikrotitrauslevyn pinnalle. Näyte (antigeenistandardi tai nollanäyte), joka on liuotettu asianmukaiseen puskuriin, pipetoidaan vasta-aineella peitettyihin syvennyksiin ja inkuboidaan asianmukaisella tavalla. Lisätään kullalla merkittyä vas-15 ta-ainetta ja reaktioseoksen inkubointia jatketaan. Syvennykset imetään ja pestään sitoutumattoman konjugaatin poistamiseksi. Lopuksi sidottu immuunikompleksi ja homogenoidut kolloidiset metallihiukkaset irroitetaan toisistaan. Joko tarkastellaan saadun dispersion väri-intensi-20 teettiä visuaalisesti tai mitataan metallin konsentraatio kolorimetrisesti. Visuaalista (esim. dispergoidun kullan värin) tarkastelua voidaan käyttää vain suurilla antigee-nikonsentraatioilla.

On huomattava, että soolihiukkasmäärityksiä on myös 25 kuvattu käyttökelpoisiksi ei-immunologisiksi määrityksiksi ja yleensä, "kun todetaan ja/tai määritetään yksi tai useampi komponentti spesifisen sitojaproteiinin ja vastaavan sitoutuvan aineen välisessä reaktiossa vesipitoisessa testinäytteestä siten, että käytetään hyväksi tällaisten 30 komponenttien tunnettua molemminpuolista sitomisaffini-teettiä, jolloin käytetään yhtä tai useampaa merkittyä komponenttia, jotka saadaan kytkemällä mainitun reaktion haluttu komponentti suoraan tai epäsuorasti veteen disper-goituihin hiukkasiin, jotka ovat metallista, metalliyhdis-35 teestä tai metallilla tai metalliyhdisteellä pinnoitetuista polymeeriytimistä muodostuvia hiukkasia, joiden hiuk- 9 80345 kaskoko on vähintään 5 nm, jolloin reaktion aikana tai asianmukaisen reaktioajan jälkeen ja valinnaisesti sitoutuneiden ja vapaiden merkittyjen komponenttien toisistaan erottamisen jälkeen määritetään tekniikan tason tuntemin 5 menetelmin testinäytteestä tai yhdestä siitä saadusta fraktioista metallin ja/tai muodostuneen metallipitoisen agglomeraatin fysikaaliset ominaisuudet ja/tai määrä, joka määritys ilmaisee kvalitatiivisesti ja/tai kvantitatiivisesti todettavan ja/tai määritettävän komponentin tai kom-10 ponentit".

Käsiteltävänä olevassa keksinnössä käytetään kolloidista metallihiukkasia merkkiaineina blot overlay-mää-ritysmenetelmissä, mikä käyttö on täysin uutta ja minkä toteuttaminen on yllättäen mahdollista.

15 Kolloidisiin metallihiukkasiin katsotaan kuuluvan metallista, metalliyhdisteestä tai metallilla tai metal-liyhdisteellä pinnoitetuista ytimistä muodostuva dispersio.

Kolloidisten metallihiukkasten käyttö merkkiaineina 20 on sovellettavissa kaikkiin blot overlay-määritysmuotoihin ja niiden käytön etuna on, että blottausväliaineen pinnan sitoutumiskohtiin akkumuloituvat kolloidiset metallihiukkaset voidaan nähdä pelkällä silmällä herkkyydellä, joka on vähintään yhtä hyvä kuin nykyisten tekniikkojen esim. 25 entsyymeihin perustuvien blot overlay-määritysten erittäin suuri herkkyys. On erityisesti tähdennettävä, että keksintö olisi arvoton ilman tätä viimeistä näkökohtaa. Keksinnön tärkeänä etuna on, että tulos on luettavissa ilman toista entsymaattista reaktiota, autoradiografiaa tai 30 fluoresoivien värien havaitsemissysteemiä, ja että sitoutuneita kolloidisia metallihiukasia ei tarvitse irroittaa seuraavaa määritystä varten paljaalla silmällä (pieni herkkyys), kolorimetrisesti tai CRAAS:llä (suurempi herkkyys) kuten sandwichsoolihiukkasimmunomääritykeissä. Kek-35 sinnön suurimpana etuna on sen yksinkertaisuus, koska väri kehittyy reaktion aikana. Tämä mahdollistaa reaktion kes- 10 80345 keyttämisen halutun signaalin muodostumisen jälkeen tai systeemin kalibroinnin ennalta määritellyn tuloksen saavuttamiseksi vakioaikarajoissa.

Kullalla merkittyjen vasta-aineiden käyttö on pal-5 jon yksinkertaisempi ja yhtä herkkä menettely kuin tunnetusti hyvin herkkä inununoperoksidaasimenetelmä. Tämä yksinkertainen määritys voidaan suorittaa testipakkauksella, jolla voidaan epäsuorasti todeta spesifisten sitoja-ainei-den läsnäolo, jotka sitoutuvat blottausvällaineeseen si-10 dottuun akseptorlaineeseen, ja ensimmäisen spesifisen si-toja-aineen kolloidisilla metallihiukkasilla merkityn spesifisen sitoja-aineen läsnäolo. Jos spesifisenä sitoja-aineena on vasta-aine, tänä toisena sitoja-aineena voi olla kolloidisilla metallihiukkasilla merkitty toinen vas-15 ta-aine tai proteiini A. Toteaminen voi tapahtua hyvin yksinkertaisena kastoliuskatestinä, esim. täpläblot overlay- immunomäärityksenä, jolla voidaan nopeasti seuloa valitun antigeenin vasta-aineiden läsnäolo vesipitoisesta testinäytteestä kuten seerumista.

20 Keksinnön mukaiselle menetelmälle spesifisestä si- toja-aineesta ja vastaavasta akseptoriaineesta muodostuneen agglomeraatin toteamiseksi tai määrittämiseksi blot overlay-tekniikkaa käyttävien yleismenetelmien avulla, joissa käytetään merkittyjä komponentteja, on tunnusomais-25 ta, että merkityt komponentit, jotka on saatu kytkemällä kolloidisiin metallihiukkasiin agglomeraatin haluttu komponentti, joka agglomeraatti on muodostunut spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta akseptoriaineesta, tai kytkemällä kolloidisella metallilla merkittyyn sitoja-ainee-30 seen agglomeraatin haluttu komponentti, joka agglomeraatti on muodostunut spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta aksepetoriaineesta, visualisoidaan värisignaalina, joka sijaitsee spesifisen sitoja-aineen ja vastaavan akseptori-aineen välisen reaktion reaktiokohdassa blottausväliaineen 35 pinnalla, tai määritetään kvantitatiivisesti tässä kohdas- 11 sa sinänsä tunnetuilla spektrofotomertrisillä menetelmil lä.

n 80345

Menetelmä muodostuu seuraavista vaiheista: 1. Akseptoriaine immobilisoidaan immobilisoivaan 5 matriisiin, jota myös kutsutaan blottausväliaineeksi.

I.I Joko adsorboidaan suoraan ja/tai sidotaan kova-lenttisesti menettelyn avulla, jonka yleisnimi on blot-taus, mahdollisesti sen jälkeen kun on erotettu elektrofo-reettisesti ja siirretty tai blotattu elektroforeesiväli-10 aineesta blottausväliaineeseen, ja tekemällä sitten jäljellä olevat proteiinin sitoutumiskohdat tehottomiksi tekniikan tason tuntemin menettelyin esimerkiksi BSA:n, gelatiinin, PEG:n tai Tween 20:n avulla, I. II tai annetaan akseptoriaineen sitoutua spesifi-15 seen sitoja-aineeseen, joka on immobilisoitu blottausväliaineeseen, saattamalla mainittu blottausväline kosketukseen akseptoriainetta sisältävän vesiliuoksen kanssa.

II. Saatetaan kohdan I) blottausväliaine ennen pesua ja ilmakuivausta määräajaksi kosketukseen: 20 II.I joko kolloidisilla metallihiukkasilla merkit tyjen spesifisten sitoja-aineiden kanssa, jotka konsetraa-tioiltaan ovat sopivia, II. II tai ensin merkitsemättömän spesifisen sitoja-aineen kanssa, jonka konsentraatio on sopiva, ja sitten 25 kolloidisella metallilla merkityn proteiinin kanssa, joka on spesifinen merkitsemättömän spesifisen sitoja-aineen suhteen.

III. Luetaan muodostunut värisignaali, joka on tunnusomainen blottausväliaineen pinnalle sidotuille kolloi- 30 disille metallihiukkasille, paljaalla silmällä tai tekniikan tason tuntemin spektrofotometrisin menetelmin, esim. densitometrisesti.

Tämä keksintö koskee myös testipakkauksia, joilla määritetään suoraan tai epäsuorasti yksi komponenteista, 35 joka syntyy spesifisen sitoja-aineen ja vastaavan aksep- 12 80345 torlaineen reaktiossa, blot overlay-määrityksessä. Näille testipakkauksille on tunnusomaista, että a) kolloidisilla metallihiukkasilla merkittyjä komponentteja, jotka aiheuttavat värisignaalin mainitun spe- 5 sifisen sitoja-aineen ja mainitun akseptoriaineen välisen reaktion reaktiokohdalla, immobilisoivan matriisin pinnalla; b) fysikaalisen kehitteen komponentteja ja c) muita reagensseja.

10 Kolloidisilla metallihiukkasilla merkityt komponen tit on saatu kytkemällä yllä kuvatusta reaktiosta saatu komponentti tai komponentti, jolla tämä reaktio voidaan todeta epäsuorasti, yllä määriteltyihin kolloidisiin metallihiukkasiin. Jos reaktio on immunologista tyyppiä, 15 testipakkausta voidaan käyttää sandwich blot overlay-mää-rityksissä (ks. esimerkki lii) ja vasta-aineiden läsnäolon toteamiseksi seerumista valikoitujen antigeenien avulla (ks. esimerkki I).

Käsiteltävänä olevan keksinnön eräänä piirteenä on 20 se seikka, että blot overlay-määrityksessä voidaan blot-tausvällaineen pintaan sidotut kolloidiset metallihiukkaset todeta visualisoimalla ne epäsuorasti ja/tai parantaa toteamista käyttämällä fysikaalista kehitettä, joka voidaan pelkistää vastaaviksi metalleiksi. Sopivia fysikaali-25 siä kehitteitä ovat esim. hopealaktaatti, hopeanitraatti ja vastaavat. Kun fysikaalisena kehitteenä käytetään esim. hopeaa, reaktio tapahtuu aluksi metallihiukkasten pinnalla, jotka katalysoivat pelkistymisen, ja tämän jälkeen nämä ymppihiukkaset autokatalysoivat reaktion. Tällä ta-30 voin muodostuu musta, erittäin kontrastoiva signaali, joka johtuu akkumuloituneesta hopeametallista. Tämä merkitsee herkkyyden huomattavaa paranemista. Olemme myös havainneet, että valolle epäherkän hopeasaostuman saamiseksi on blotit kiinnitettävä mikrovalokuvauksessa käytettävällä 35 kiinnitteellä.

13 80345

Fysikaalisia kehitteitä on jo useita vuosia käytetty veteen liukenemattomien metallien, erityisesti metal-lisulfidien visualisoimiseksi kudoksissa (ks. Danscher, Histochemistry 71, 1-16, 1981). Metallisulfidit ja metal-5 linen hopea katalysoivat hopeaionien pelkistymistä. Kudoksessa oleva kolloidinen metallinen kulta voidaan myös osoittaa fysikaalisella kehitteellä, jota havaintoa Hol-gate et ai. (J. Histochem. Cytochem. 31, 938-944 (1983)) ovat käyttäneet hyväksi esittämässään immunokulta/hopea-10 värjäysmenetelmsssään, jonka herkkyys on paljon parempi kuin alkuperäisessä immunokultavärjäysmenetelmässä.

Tämän keksinnön lisätunnusmerkin tärkeimpänä etuna on sen suunnaton herkkyys, joka on suurempi kuin missään nykyisessä blot overlay-määrityksessä. Se on käyttökelpoi-15 nen, kun käyttäjä haluaa tehdä reagenssien käytön taloudellisemmaksi tai kun käytettävissä on äärimmäisen pieniä määriä akseptoriainetta ja/tai spesifistä sitoja-ainetta.

Käsiteltävänä olevan keksinnön toisena lisätunnus-merkkinä on valokuvauksessa käytettävän kiinnitteen käyt-20 tö, joka vähentää taustahäiriötä ja parantaa fysikaalisella kehitteellä saadun reaktiotuotteen pysyvyyttä.

Seuraavat esimerkit valaisevat käsiteltävänä olevan keksinnön piiriä.

Esimerkki I

25 Yksinkertainen täplä-blot overlay-immunomääritys koiran aivoista saadun tubuliinin ja kalmoduliinin vasta- aineiden osoittamiseksi epäsuorasti kullalla merkityillä sekundäärisillä vasta-aineilla immunisoitujen kaniinien seerumista.

30 1.1 Antiseerumien valmistus 1.1 Antiseerumien kehittäminen

Sekoitettiin 1 mg koiran aivoista saatua tubuliinia (uutettu SDS-polyakryyliamidigeeleistä) 1,0 ml:ssa puskuria (0,1-m PIPES, pH 6,9) tai 1 mg elektroforeettisesti 35 puhdasta, koiran aivoista saatua kalmoduliinia (vedessä) 14 80345 ja 1,0 ml Freundin täydellistä apuainetta (Dlffco). Homo-genoinnin jälkeen antigeeni ruiskutettiin intradermaalisti viiteen kohtaan valkoisen kaniinin selkärankaa. Neljän viikon välein annettiin tehosteruiskeita. Antigeeni val-5 mistettiin muuten samalla tavoin, mutta käytettiin Freundin epätäydellistä apuainetta. Viikko jokaisen tehoste-ruiskeen jälkeen kaniineista otettiin verta (n. 60 ml) ja valmistettiin seerumi, jota varastoitiin ennen käyttöä pienempinä erin -20°C:ssa.

10 1.2 Kolloidisella kullalla merkityt sekundääriset vasta-aineet Näiden toimittajana oli Janssen Life Sciences Products, 2340, Beerse, Belgia, koodi GAR G20. Nämä vasta-aineet ovat vuohesta saatuja kaniini-IgG:n affiniteettipuh-15 distettuja vasta-aineita, jotka on merkitty 20 nm:n kolloidisilla kultahiukkasilla.

Antigeeniä sisältävien täplien muodostaminen nitro-selluloosaliuskoihin

Kymmenen 1 μΐ tippaa puhtaan tubuliinin nelinker-20 täisiä sarjalaimennuksia (lähtien määrästä 250 ng/μΐ) 0,1 moolisessa PIPES:issä, 1 millimoolisessa EGTA:ssa ja 1 millimoolisessa MgCl2:ssa, pH 6,75, tai puhdasta kalmodu-liinia vedessä, siirrettiin täplärivinä kuiville nitrosel-luloosaliuskoille (6 cm x 0,6 cm). Täplien kuivuttua (noin 25 viiden minuutin kuluttua) liuskoilla olevien proteiinitäplien jäljellä olevat sitoutumiskohdat tehtiin tehottomiksi inkuboimalla niitä liuoksen kera, jossa oli 5 % naudansee-rumialbumiinia (BSA) 20 millimoolisessa tris-puskuroidussa keittosuolaliuoksessa, pH 8,2, 30 minuuttia 37°C:ssa.

30 1.3 Testiprotokolla tubuliini- ja kalmoduliinivas- ta-alneiden toteamiseksi. Kullalla merkittyjen vasta-aineiden käytön ja ABC-peroksidaasitoteamismenetelmän vertailu

Jollei muuta mainita, menettelyn ainoana puskurina 35 oli 0,1 % BSA-tris (0,1 % BSA 20 millimoolisessa tris-HC1:ssä, 0,9 % NaCl, pH 8,2, 20 mmol NaN3 ).

15 80 345 a. Inkubolntl primäärisen antiseerumin kera

Kaksi liuskaa inkuboitiin kaksi tuntia huoneen lämpötilassa 5 ml:n tulpitetuissa muoviputkissa 1 ml:n kera kaniinin antitubuliiniseerumia, 1:1000 laimennos 0,1 5 %:isessa BSA-trispuskurissa.

Kaksi liuskaa inkuboitiin kuten yllä sama antiseerumi absorboituna tubuliiniin, joka oli kovalenttisesti sidottu Sepharose-4B:hen. Liuskat toimivat antigeenispesi-fisyyskontrollina.

10 Kaksi liuskaa inkuboitiin kuten yllä kaksi tuntia huoneen lämpötilassa 1 ml:n kera kaniinin antikalmodulii-niseerumia, 1:1000-laimennos 0,1 %:isessa BSA-trispuskurissa.

Kaksi liuskaa inkuboitiin kuten yllä sama antisee-15 rumi absorboituna kalmoduliiniin, joka oli kovalenttisesti sidottu Sepharose-4B:hen.

Absorboituneiden ja absorboitumattomien primääristen antiseerumien inkuboinnin päätyttyä liuskoja pestiin 3 x 10 minuuttia 0,1 %:isessa BSA-trispurkurissa. Toinen 20 liuska kustakin parista inkuboitiin edelleen GAR G20:n kera (ks. 1.3.b).

Toinen liuska inkuboitiin käyttäen hyvin herkkää Vectastain ABC-immunoperoksidaasipakkausta, valmistaja Vector Laboratories, valmistajan ohjeiden mukaan (ks.

25 1,3.c).

b. Inkubointi kullalla merkityn sekundaarisen vasta-aineen kera: GAR G20

Pestyjä liuskoja (ks. 1.3.a) inkuboitiin kaksi tuntia GAR G20:n kera laimennettuna absorbanssiarvoon 1 30 cm/520 nm = 0,21 0,1 %:isessa BSA-trispurksurissa + 0,4 %.isessa gelatiinissa. Inkuboinnin päätyttyä liuskat pestiin 0,1 %:isessa BSA-trispuskurissa 2 x 10 minuuttia ja kuivattiin ilmassa.

c. Inkubointi Vectastain-pakkauksen avulla 35 Pestyjä liuskoja (ks. 1.3.a) inkuboitiin tunti se kundäärisen biotinyloidun vasta-aineliuoksen kera (1:200 16 80345 0,1 %:ista BASA-trlspuskuria 3 x 10 minuuttia ja inkuboi-tiin sitten tunti avidiini-biotinyyliperoksidaasikomplek-sin kera. Kompleksi valmistettiin valmistajan ohjeiden mukaan: 100 μΐ reagenssi A:ta (avidiini DH) lisättiin 10 5 ml:aan PBS:ää (Belbecco, ei Mg2*- ja Ca2*-ioneja). Lisättiin jatkuvasti sekoittaen 100 μΐ reagenssi B:ta (biotiny-loitu piparjuuriperoksidaasi). Kompleksi käytettiin viiden minuutin kuluttua. Liuskat pestiin 0,1 %:isessa BSA-tris-puskurissa (2 x 10 minuuttia) ja sitten 100 millimoolises-10 sa tris-HCl-puskurissa, pH 7,6. Sitten immobilisoitu per-oksidaasi visualisoitiin 4-kloori-lnaftoli substraattina: 20 mg 4-kloori-l-naftolia liuotettiin 1 ml:aan etanolia ja laimennettiin edelleen 20 ml:11a 100 millimoolista tris-HCl-puskuria, pH 7,6, lämmitettiin n. 50°C:een, li-15 sättiin 200 μΐ 1 %:ista vetyperoksidia ja substraattiliuos lisättiin liuskoihin ruiskulla mikrosuodattimen (0,2 μ, Millipore) läpi, joka oli kiinnitetty ruiskuun. Reaktion annettiin jatkua viisi minuuttia ja sitten reaktio keskeytettiin pesemällä liuskat vedellä. Liuskat kuvattiin il-20 massa.

1.4 Arviointi ABC-menettelyssä sininen väri merkitsee positiivista tulosta. Käytettäessä kolloidista kultaa positiivinen tulos näkyy värinä, joka on vaaleanpunaista punertavaan, 25 käytetyn kullan hiukkaskoosta riippuen (suurehkot kulta-hiukkaset, esim. 40 nm, antavat purppuranpunertavan värin). Molemmat menetelmät ovat herkkyydeltään täysin vertailukelpoisia eli herkkyys on tubuliinille n. 5 ng/μΐ ja kalmoduliinille n. 30 ng/μΐ käytetyissä olosuhteissa. Ne-30 gatiivinen reaktio on merkkinä spesifisyydestä, kun anti-seerumit adsorboituvat niitä vastaavan antigeenin kera.

Esimerkki II

Mikrotubulusproteiineihin reagoivien hiiren mono-klonaalisten vasta-aineiden läsnäolon seulontatutkimus 35 kasvavien hybridoomien viljelysupernatanteista käyttäen 17 80345 vuohesta saatuja, kullalla merkittyjä hiiren lgG:n vasta-aineita.

2.1. Hiirien immunisointi

Hiiriin (Balb/C) ruiskutettiin homogenoitu seos 5 (ks. esimerkki 1.1), joka muodostui rotan aivojen mikro-tubulusproteiineista (100 pg/hiiri), (valmistettu kahden lämpötilasta riippuvan polymerointi-depolymerointisyklin avulla) ja Freundin täydellisestä apuaineesta. Ruiskeet annettiin selkään ihon alle viiteen kohtaan. Annettiin 10 kolme kertaa kahden viikon välein tehosteruiskeita, jotka sisälsivät 100 pg antigeeniä valmistettuna Freundin epätäydellisen apuaineen avulla. Kolme päivää ennen pernasolujen ja myeloomasolulinjan fuusioimista hiirille annettiin tehosteruiskeena laskimoon 50 pg antigeeniä/hiiri 100 15 pl:ssa PBS-puskuria.

2.2 Pernasolujen ja NS-1 myeloomasolujen fuusioiminen NS-1- solut fuusioitiin kahden immunisoidun hiiren 20 pernasoluihin tekniikan tason tuntemin menetelmin ja muodostuneita hybridoomeja viljeltiin viidellä 96:11a syvennyksellä varustetulla levyllä (Nunc) 37°C:ssa vedellä kyllästetyssä ilmakehässä, joka sisälsi 7 % hiilidioksidia. Kun kasvu oli jatkunut noin kaksi viikkoa, syvennyksistä 25 otettiin 100 pl kasvavia hybridoomeja sisältävää viljely-supernatanttia, josta testattiin erittyneiden monoklonaa-listen vasta-aineiden läsnäolo (ks. 2.4).

2.3 Nitroselluloosapaperiliuskojen valmistus, joihin on elektroblottaamalla muodostettu täplä proteiineja 30 sisältävällä SDS-polyakryyllamidigeelillä

Antigeenin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (kaksi kertaa polymeroituja mikrotubulusproteiineja) suoritettiin Laemmlin mukaan 7,5 %:isella geelillä. Antigeeni, joka oli liuotettu näytepuskuriin ja keitetty siinä, 35 panostettiin yhtenäisenä kerroksena koholla olevan geelin 18 80345 yläpinnalle, 300 pg geeliä kohti. Kun väririntama oli tunkeutunut 3 cm erotusgeeliin, elektroforeesi lopetettiin. Geelistä leikattiin irti pieni vaakasuora liuska värjäystä varten coomassiesinisellä ja loput geelistä käytettiin 5 elektroblottaukseen nitroselluloosapaperille. Geeliä tasapainotettiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa siirtopus-kurissa (25 mmol tris-192 mmol glysiini/20 t/t-% metanoli, pH 8,3). Geeli asetettiin nitroselluloosaarkille (esikos-tutettu puskurissa) välttäen ilmakuplia ja poistaen sul-10 keuksiin jääneet ilmakuplat. Tämä yhdistelmä asetettiin kahden esikostutetun suodatinpaperin ja kahden nailonverk-kotuen väliin. Näin syntynyt yhdistelmä sopi tiukasti EC-elektroblottauslaitteen suljettuun elektrodiverkkopiti-meen. Elektroblotattiin yli yön huoneen lämpötilassa vir-15 ralla 400 mA. Elektroforeettisen siirron jälkeen nitrosel-luloosapaperiin jääneet proteiinin sitoutumiskohdat tehtiin tehottomiksi inkuboimalla arkkeja liuoksessa, jossa oli 5 % BSA:ta 20 mmol tris:illä puskuroidussa keittosuolaliuoksessa, pH 8,2, 30 minuuttia 37°C:ssa. Sitten nitro-20 selluloosa-arkki leikattiin 3 mm leveiksi liuskoiksi, jotka olivat yhdensuuntaisia elektroforeesin kulun kanssa. Näitä liuskoja käytettiin hydridoomasolujen seulomiseksi supernatanteista.

2.4 Monoklonaalisten vasta-aineiden toteaminen 25 100 μΐ jokaista hybrididoomaviljelysupernatanttia otettiin 3,5 cm pitkiin 0,5 ml:n Eppendorf-kärkiin ja laimennettiin suhteessa 1:5 0,4 ml:11a 0,1 %:ista BSA-tris-puskuria. Kärjet ja liuskat varustettiin koodinumerolla. Jokaiseen kärkeen liitettiin yksi liuska ja tätä yhdistel-30 mää inkuboitiin kaksi tuntia. Liuskat pestiin panoksittain ylimäärällä 0,1 %:ista BSA-trispuskuria ja inkuboitiin myös panoksittain GAM G20:n kera (vuohesta saatu anti-hiiri IgG, merkitty 20 nm:n kolloidisilla kultahiukkasilla), Janssen Life Sciences Products, 2340 Beerse, Belgia. GAM 35 G20 laimennettiin 0,1 %:isella BSA-trispuskurilla + 0,4

II

19 80345 %:isella gelatiinilla absorbanssiarvoon 1 cm/520 nm = 0,1 ja annettiin reagoida yli yön. Liuskat pestiin 0,1 %:isel-la BSA-trispuskurilla ja vedellä ja kuivattiin ilmassa.

Positiivinen reaktio näkyi selvästi väriltään vaa-5 leanpunaisesta punertavaan vaihtelevina vyöhykkeinä, jotka vastasivat proteiinivyöhykkeitä määrätyllä molekyylimassa-alueella. Tällä erittäin yksinkertaisella seulontamenet-telyllä ei voida vain tunnistaa vasta-ainetta erittäviä hybridoomeja, vaan sillä saadaan myös välittömästi tietoja 10 ko. vasta-aineen spesifisyydestä ja siten menettelystä on suuri apu valittaessa mielenkiintoisia vasta-ainetta erittäviä hybridoomeja.

Esimerkki III

Sandwich immuno-blot overlay-määritysmenetelmä an-15 tigeenien toteamiseksi vesipitoisesta testinäytteestä: IgG-antigeenien toteaminen vesipitoisesta testinäytteestä.

3.1 Määrityksen periaate

Pieni pisara (n. 1 μΐ) puhdistettua tai väkevöityä vasta-ainetta, joka on monospesifinen määritettävälle an-20 tigeenille, blotattiin nitroselluloosapaperiliuskalle (tai muulle sopivalle blottausväliaineelle), kuivattiin ja proteiinin vapaat sitoutumiskohdat tehtiin tehottomiksi (ks. esimerkki 1.3). Valinnaisesti nämä vasta-ainetta sisältävät, sitoutumiskohdiltaan tehottomiksi tehdyt liuskat voi-25 daan pestä vedessä, kuivata ilmassa ja varastoida. Sitten tällainen liuska inkuboidaan määrätyn tilavuuden kera antigeeniä sisältävää testiliuosta määrätyn pituisen ajan. Kun sitoutumattomat aineet on pesty pois, liuskojen inku-bointia jatketaan asianmukaisesti laimennetun, kolloidi-30 silla metallihiukkasilla (esim. kulta- tai hopeasoolilla) merkityn monospesifisen vasta-aineen kera, joka on samanlainen kuin blottausväliaineelle adsorboitu vasta-aine. Valinnaisesti voidaan käyttää kahta monoklonaalista vasta-ainetta, joista kumpikin tunnistaa erilaisen antigeeniepi-35 toopin. Toinen on sidottu blottausvällaineeseen ja toinen 20 8 0 3 4 5 on sidottu kolloidisiin metallihiukkasiin. Vakio-olosuhteissa menetelmällä voidaan todeta antigeeninen ennalta määritelty minimikonsentraatio ja sitä voidaan käyttää kvalitatiivisena diagnostisena testinä edellyttäen, että 5 sillä voidaan tunnetusta testiliuoksesta todeta vaadittava minimikonsentraatio.

3.2 Periaatteen sovellutusesimerkki: kaniinin igG-antigeenien toteaminen puskuroidusta liuoksesta, joka sisältää kaniinin konsentraatioltaan tunnettua lgG;tä 10 Tämän uuden sanwichtekniikan toimivuuden testaami seksi suoritettiin seuraava koe:

Kuusi nitroselluloosapaperiliuskaa (6 x 0,6 cm) blotattiin pisaroilla (1 μΐ), jotka sisälsivät kasvavia määriä (puolilaimennussarja, lähtöarvona 125 ng/μΐ) vuo-15 hesta saatuja affiniteettipuhdistettuja kaniinin IgG:n (GAR IgG) vasta-aineita kuten kuvattiin esimerkissä 1.2.

Proteiinin jäljellä olevat sitoutumiskohdat tehtiin tehottomiksi esimerkissä 1.2 kuvatulla tavalla. Yksi liuska (n:o 6) pestiin 20 mmol trispuskuri-keittosuolaliuok-20 sessa, blotattiin kuivana suodatinpaperille, kuivattiin ilmassa ja käytettiin yli yön huoneen lämpötilassa kuivana varastoinnin jälkeen.

Muut viisi liuskaa inkuboitiin tulpitetuissa muoviputkissa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa seuraavalla 25 tavalla: nro 1: RIgG:n kera, 1 ml, l/pg/ml nro 2: RIgG:n kera, 1 ml, 0,25 pg/ml nro 3: RIgG:n kera, 1 ml, 0,063 pg/ml nro 4: RIgG:n kera, 1 ml, 0,015 pg/ml 30 nro 5: RIgG:n kera, 1 ml, 0 pg/ml

Kaniinin IgG laimennettiin 0,1 %:isella BSA-tris-puskurilla. Liuska nro 6 inkuboitiin 0,25 pg/ml kera RIgG:tä.

Liuskat pestiin (2 x 10 minuuttia) 0,1 %:isessa 35 BSA-trispuskurissa.

Il 21 80345

Kaikkia liuskoja inkuboitiin tasan yksi tunti huoneen lämpötilassa GAR G20:ssä (vuohesta saatuja kaniinin IgG:n vasta-aineita, merkitty kolloidisilla kultahiukka-silla, halkaisija 20 nm), Janssen Life Sciences Products, 5 B-2340 Beerse, Belgia. GAR G20 laimennettiin absorbenssi- arvoon 1 cm/520 nm = 0,2 0,1 %:isella BSA-trispuskurilla + 0,4%:isella gelatiinilla.

Liuskat pestiin 0,1 %:isella BSA-trispuskurilla ja sitten vedellä ja kuivattiin ilmassa.

10 3.3 Arviointi Täplät, joissa oli niinkin vähän kuin 15 ng adsorboitunutta GAR IgG:tä tulivat näkyviin vaaleanpunaisina pilkkuina, kun oli inkuboitu vain 30 minuuttia 1 ml:ssa liuosta, jossa oli 15 ng/ml RlgGrtä, jonka jälkeen inku-15 boitiin tunti 1 ml:n kera GAR G20:tä, 0,0520 nm = 0,2. Liuosten, joissa oli vähintään tämä määrä RlgGrtä, katsottiin reagoivan positiivisesti. Liuskojen nro 6 ja nro 2 tulokset olivat indenttiset. Tämä osoittaa, että liuskat voidaan kuivata tehottomaksi tekemisvaiheen jälkeen ilman 20 vasta-aineaktiivisuuden menettämistä.

Esimerkki IV

Nitroselluloosapaperiin sidotun antigeenin suora toteaminen kolloidisella hopealla merkityllä primäärisellä vasta-aineella: hiiren IgG-antigeenejä sisältävien täplien 25 toteaminen hiiren IgG:n kolloidisella hopealla merkityillä, vuohesta saaduilla vasta-aineilla.

Nitroselluloosapaperisuikaleet (6 cm x 0,6 cm) hiotettiin hiiren IgG:tä (1 μΐ) sisältävillä täplillä, jotka saatiin kaksinkertaisella laimennussarjalla 250-0,4 ng/μΐ, 30 esimerkissä 1.2 kuvatulla tavalla.

Proteiinin jäljellä olevat sitoutumiskohdat tehtiin tehottomiksi kuten esimerkissä 1.2.

Liuskat inkuboitiin hiiren IgG:n kolloidisella hopealla merkittyjen, vuohesta saatujen vasta-aineiden kera 35 (valmistaja E.Y. Laboratories, SP-0011) laimennoksena 22 80345 1:100 0,1 %:isessa BSA-trispuskurissa yksi tunti kolmekymmentä minuuttia huoneen lämpötilassa.

Liuskat pestiin 2 x 10 minuuttia 0,1 %:isella BSA-trispuskurilla ja vedellä ja kuivattiin ilmassa.

5 Positiiviset täplät tunnistettiin keltaisen värin avulla. Näissä olosuhteissa voitiin todeta n. 30 ng 1 μ1:η täplässä.

Esimerkki V

Kananpojan kuvusta saadun aktiinin affiniteettipuh-10 distetun, kaniinista saadun vasta-aineen spesifisyyden testaaminen aktiinin suhteen, joka esiintyy kananpojan keuhkojen epiteelisolujen sekundääriviljelmistä saadussa kokonaissolulysaatissa, käyttäen blot overlay-immunomääri-tystä ja kullalla merkittyä sekundääristä vasta-ainetta 15 ja tämän jälkeistä hopealla voimistamista.

5.1 Anti-aktiinin antiseerumin valmistus

Elektroforeettisesti puhdas kananpojan kuvun aktiini homogenoitiin ja ruiskutettiin kaniineihin kuten on kuvattu tubuliinin ja kalmoduliinin yhteydessä esimerkissä 20 1.1. Seerumi valmistettiin ja varastoitiin kuten esimer kissä 1.1 on kuvattu.

5.2 Aktiinin vasta-aineen affiniteettipuhdlstus

Aktiini kytkettiin Sepharose-4-B-CNBr:ään (Pharmacia) valmistajan ohjeiden mukaan. Vasta-aine puhdistettiin 25 suoraan seerumista. Jälkimmäistä inkuboitiin antigeeniä sisältävän geelin kera. Käytettiin 20 ml seerumia 10:tä milligrammaa kohti kytkettyä antigeeniä. Kahden tunnin inkuboinnin jälkeen geeli kaadettiin pylvääseen ja pestiin 10 millimoolisella tris-puskuroidulla keittosuolaliuoksel-30 la (TBS), kunnes absorbanssi aallonpituudella 280 nm oli olennaisesti nolla. Ei-spesifinen adsorboiva aines eluoi-tiin TBStllä, jossa oli 1 moolista NaCl:ää ja sitten pestiin TBS:llä. Spesifinen vasta-aine eluoitiin 0,1 mooli-sella glysiini-HCl-puskurilla pH-arvossa 2,8. Yhden mil-35 lilitran fraktiot neutraloitiin välittömästi 100 pl:lla 1 23 8 0 3 4 5 moolista tris-HCl-puskuria, pH 8,5. Vasta-aineen konsent-raatio mitattiin aallonpituudella 280 nm käyttäen E2 % = 14,3. Eluoitujen vasta-aineiden määräosia varastoitiin li-säkäsittelemättä -20° C:ssa.

5 5.3 Kananpoikasikiön keuhkoista saatujen epiteeli solu jenviljely

Kananpoikasikiön keuhkoepiteelisolut eristettiin 14 vrk vanhojen kananpoikasikiöiden keuhkoista. Kudos hienonnettiin käsin ja sitä trypsinoitiin 20 minuuttia 10 37°C:ssa 0,25 %:isessa trypsiinissä Hanksin tasapainotetussa suolaliuoksessa, jossa ei ollut Ca2*- ja Mg2*-ioneja. Reaktio keskeytettiin elatusalustalla ja 10 %:isella FCSrllä. Sentrifugoinnin ja uudelleensuspendoimisen jälkeen solut siirrettiin 75 cm2 T-kolveihin ja annettiin 15 kiinnittyä 12-24 tuntia ennen elatusalustan vaihtamista. Kun oli viljelty 3-5 vuorokautta solut trypsinoitiin nopeasti (2-3 minuuttia) (0,25 %:isessa trypsiiniliuoksessa) ja soluista valmistettiin maljaviljelmiä petrimaljoissa, joiden halkaisija oli 9 cm, ja käytettiin 3-5 vuorokauden 20 kasvun jälkeen eli solujen kasvettua yhteen. Soluja viljeltiin Eaglen minimum essential medium'issa, johon oli lisätty ei-välttämättömiä aminohappoja ja 10 % naudansi-kiöseerumia, kostutetussa 5 % C02/ilmakehässä 37°C:ssa.

5.4 Kananpoikasikiön keuhkoista saatujen epiteeli-25 solujenkokonalssolu-SDS-lysaatin valmistus

Petrimaljoissa (halkaisija 9 cm) kasvaneet solut pestiin Ca2* - ja Mg2 +-ioneja sisältämättömässä PBS:ssä (Dulbecco) ja otettiin talteen kumilastalla ja upotettiin Eppendorf-kärjessä (1,5 ml) absoluuttiseen asetoniin 30 -20°C:ssa. Asetoni haihdutettiin ja kuiva solujäännös liuotettiin kiehuvaan SDS-näytepuskuriin, jossa oli 1 mil-limoolista TAME (proteaasin estoaine). Sentrifugoinnin jälkeen saatu liukenematon aines hylättiin. Tästä lysaa-tista saadut SDS-geelit (Laemmlin mukaan) ajettiin sarja-35 laimennettuina näytepuskurilla ja värjättyinä coomassiesi-nisellä sopivimman näytelaimennuksen arvioimiseksi. Siir- 24 8 0 3 4 5 rettäessä sitten elektroforeettisesti geenin seulontamem-braaniin (valmistaja NEN) käytettiin laimennussuhdetta 1:16. Yksi siirtoyksikkö muodostui yhdestä kaistasta tätä lysaattilaimennosta ja yhdestä kaistasta seosta, jossa oli 5 puhdistettuja vertailuproteiineja Ch. g. filamiini, Ch. g. myosiini (H- + L-ketju), Ch. g. α-aktiini, BSA, rotan-aivotubuliini ja sianmahatropomyosiini, jokaista 0,06 pg kaistaa kohti.

Tämän jälkeen annettiin puskuririntaman laskeutua 10 geelin alapäähän ja elektroforeettinen siirto geenin seu-lontamembrääniin tapahtui samoin kuten esimerkissä 2.3. Blottausyksikkö leikattiin irti ja proteiinin jäljelle jääneet sitoutumiskohdat tehtiin tehottomiksi kuten esimerkeissä 1.2 ja 2.3 on kuvattu. Inkubointi aktiinin vas-15 ta-aineen (0,5 pg/ml) ja GAR G20:n (abrorbanssiarvo 520 nm » 0,2) kera ja GAR G20:n laimentaminen 0,1 %:isella BSA-trispuskurilla ja 0,4 %:isella gelatiinilla suoritettiin suljetuissa muovipusseissa, joiden koko vastasi suunnilleen arkin kokoa, kumpikin toimenpide kesti kaksi tun-20 tia kuten esimerkissä 2.4 on kuvattu.

Kun oli kaksi tuntia inkuboitu GAR G20:n kera, arkit pestiin 0,1 %:isella BSA-trispuskurilla ja preparoitiin hopealla voimistamista varten. Tänä aikana tulivat jo näkyviin aktiinin liikkuessa väriltään vaaleanpunaises-25 ta punertavaan vaihteleva vyöhyke lysaatissa, joka vyöhyke vastasi aktiinia proteiiniseoksessa.

5.5 Hopealla voimistaminen

Arkit pestiin kaksi minuuttia sitraattiperuspusku-rin 1:10-laimennoksessa. Tämä puskuri sisälsi 100 ml:ssa 30 25,5 g trinatriumsitraattia ja 23,5 g sitruunahappoa, pH

4.

Sitten arkkeja inkuboitiin 15 minuuttia, huolellisesti valolta suojattuna, fysikaalisessa kehitteessä, joka sisälsi: 25 80 3 45 60 ml deionoitua vettä 0,85 g hydrokinonia 15,0 ml:ssa deionoitua vettä 10 ml sltraattlpuskurla, pH 4 0,11 g hopealaktaattia 15,0 ml:ssa deionoitua vettä 5 Hopealaktaattl suojattiin huolellisesti valolta ja lisättiin muihin komponentteihin juuri ennen käyttöä.

Reaktioajan päätyttyä arkit pestiin runsaalla vesimäärällä ja käsiteltiin Agefixilla (1:4 vedessä), joka on valokuvauskiinnite.

10 Arkit pestiin uudelleen runsaalla vesimäärällä ja kuivattiin ilmassa.

5.6 Tulokset

Aikaisemmin vaaleanpunaisen-punertavaksi värjäyty-nyt vyöhyke näkyi nyt intensiivisen mustana. Aktiinin vas-15 ta-ainetta voidaan pitää äärimmäisen spesifisenä ja vasta-aineella on saatu hyviä tuloksia värjättäessä immunosyto-kemiallisesti soluviljelmien aktiinipitoisia rakenteita.

5.7 Päätelmät

Hopealla voimistaminen parantaa voimakkaasti totea-20 mismenetelmän kontrastia ja herkkyyttä. Niinpä jatkettaessa esimerkkiä IV kehittämällä värjäytyneet, kolloidisella hopealla merkityt vasta-aineet saatiin toteamisrajaksi vain viiden minuutin reaktion jälkeen 3 ng 30 ng:n asemasta täplää kohti.

25

Claims (13)

26 80 345

1. Menetelmä spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta akseptoriaineesta muodostuneen agglomeraatin to-5 teamiseksi tai määrittämiseksi blot overlay-tekniikkaa käyttävien yleismenetelmien avulla, joissa käytetään merkittyjä komponentteja, tunnettu siitä, että merkityt komponentit, jotka on saatu kytkemällä kolloidisiin metallihiukkasiin agglomeraatin haluttu komponentti, joka 10 agglomeraatti on muodostunut spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta akseptoriaineesta, tai kytkemällä kolloidisella metallilla merkittyyn sitoja-aineeseen agglomeraatin haluttu komponentti, joka agglomeraatti on muodostunut spesifisestä sitoja-aineesta ja vastaavasta akseptoriai- 15 neesta, visualisoidaan värisignaalina, joka sijaitsee spesifisen sitoja-aineen ja vastaavan akseptoriaineen välisen reaktion reaktiokohdassa blottausväliaineen pinnalla, tai määritetään kvantitatiivisesti tässä kohdassa sinänsä tunnetuilla spektrofotometrisillä menetelmillä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että spesifinen sitoja-aine on spesifinen sitojaproteiini.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vai- 25 heet: I) immobilisoidaan akseptoriaine immobilisoivaan matriisiin, II) saatetaan mainittu immobilisoiva matriisi kosketukseen kolloidisilla metallihiukkasilla merkityn spesi- 30 fisen sitoja-aineen kanssa ja III) todetaan värisignaali reaktiokohdassa immobi-lisoivan matriisin pinnalla.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vai- 35 heet: 27 80 345 I) immobi li soidaan akseptoriaine inunobi li soivaan matriisiin, II) saatetaan mainittu immobilisoiva matriisi kosketukseen merkitsemättömän spesifisen sitoja-aineen kanssa 5 ja sitten kolloidisella metallilla merkityn proteiinin kanssa, joka on spesifinen merkitsemättömälle spesifiselle sitojaproteiinille, ja III) todetaan värisignaali reaktiokohdassa immobi-lisoivan matriisin pinnalla.

5. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisointivaihe suoritetaan adsorboimalla suoraan ja/tai sitomalla kovalenttises-ti, mahdollisesti sen jälkeen, kun on erotettu elektrofo-reettisesti ja siirretty tai blotattu elektroforeesiväli-15 aineesta blottausväliaineeseen, ja tekemällä sitten jäljellä olevat sitoja-aineelle spesifiset sitoutumiskohdat tehottomiksi sinänsä tunnetuilla menetelmillä.

6. Patenttivaatimuksen 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisointivaihe suorite- 20 taan antamalla akseptoriaineen sitoutua spesifiseen sitojaproteiiniin, joka on immobilisoitu blottausväliaineeseen, saattamalla mainittu blottausväliaine kosketukseen akseptoriainetta sisältävän vesiliuoksen kanssa.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen mene-25 telmä, tunnettu siitä, että kolloidiset metallihiukkaset ovat kultaa, hopeaa tai platinaa tai näiden metallien tai raudan tai kuparin yhdisteitä, ja niiden hiuk-kaskoko on 3-100 nm.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen mene-30 telmä, tunnettu siitä, että kolloidiset metallihiukkaset ovat kulta- ja/tai hopeahiukkasia, joiden hiuk-kaskoko on 3-100 nm.

9. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolloidisten metalli- 35 hiukkasten lopullinen toteaminen suoritetaan fysikaalisen kehitteen käyttämisen jälkeen. 28 80345

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fysikaalinen kehite on hopea-pitoinen yhdiste.

11. Testipakkaus, jolla todetaan tai määritetään 5 yksi spesifisen sitoja-aineen ja vastaavan akseptoriaineen välisessä reaktiossa muodostuvan agglomeraatin komponenteista yleisellä blot overlay-määritysmenetelmällä, tunnettu siitä, että siinä on a) kolloidisilla metallihiukkasilla merkittyjä kom-10 ponentteja, jotka aiheuttavat värisignaalin mainitun spesifisen sitoja-aineen ja mainitun akseptoriaineen välisen reaktion reaktiokohdalla, immobilisoivan matriisin pinnalla; b) fysikaalisen kehitteen komponentteja ja 15 c) muita reagensseja.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että muut reagenssit on valittu seuraavista aineista (i) puskurit, 20 (ii) immunologista sitoutumista optimoivat aineet, (iii) merkitsemätön sitoja-aine ja (iv) kiinnitysaine.

13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen testi-pakkaus käytettäväksi jonkin patenttivaatimuksista 1-10 25 mukaisessa menetelmässä. tl 29 80345