FI120836B - Kolmoiskierremuodosteen puhdistus immobilisoidulla oligonukleotidilla - Google Patents
Kolmoiskierremuodosteen puhdistus immobilisoidulla oligonukleotidilla Download PDFInfo
- Publication number
- FI120836B FI120836B FI972526A FI972526A FI120836B FI 120836 B FI120836 B FI 120836B FI 972526 A FI972526 A FI 972526A FI 972526 A FI972526 A FI 972526A FI 120836 B FI120836 B FI 120836B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- sequence
- dna
- oligonucleotide
- plasmid
- seq
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 122
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 73
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 105
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 32
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 11
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims 2
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 45
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 8-oxoadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC(=O)N2 RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M sodium chlorate Chemical compound [Na+].[O-]Cl(=O)=O YZHUMGUJCQRKBT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical class CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- STGXGJRRAJKJRG-JDJSBBGDSA-N (3r,4r,5r)-5-(hydroxymethyl)-3-methoxyoxolane-2,4-diol Chemical compound CO[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O STGXGJRRAJKJRG-JDJSBBGDSA-N 0.000 description 1
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NXCOIQLTGGBRJE-XLPZGREQSA-N 7-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2C=C1 NXCOIQLTGGBRJE-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100065885 Caenorhabditis elegans sec-15 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical group [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Natural products O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N dXTP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- -1 lipopolysaccharides) Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical group CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- UMWKZHPREXJQGR-UHFFFAOYSA-N n-methyl-n-(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)decanamide Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)C(O)C(O)C(O)CO UMWKZHPREXJQGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical group 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 229940096913 pseudoisocytidine Drugs 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
- Y10S977/924—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis using nanostructure as support of dna analysis
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Description
Kolmoiskierremuodosteen puhdistus immobilisoidulla oligo-nukleotidilla
Esillä olevan keksinnön kohteena on uusi menetelmä 5 DNA:n puhdistamiseksi. Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan puhdistaa nopeasti farmakologisesti käyttökelpoista kaksijuosteista DNA:ta. Erityisemmin keksinnön mukaisessa puhdistusmenetelmässä käytetään hyväksi DNA-sekvenssin ja erään oligonukleotidin välistä spesifistä hybridi-10 säätiötä.
Geeni- ja soluterapiaan liittyvissä tekniikoissa tapahtuu tällä hetkellä valtavaa kehitystä. Näiden tekniikoiden edellytyksenä on kuitenkin, että kyetään tuottamaan suuria määriä farmaseuttisesti puhdasta DNA:ta. Näissä 15 uusissa hoitomuodoissa lääkkeenä käytetään usein itse DNA:ta ja olennaista on kyetä valmistamaan sitä sopivina määrinä, eristämään ja puhdistamaan se asianmukaisella tavalla ajatellen sen käyttöä ihmiseen kohdistetuissa hoi-tosovellutuksissa.
20 Esillä olevassa keksinnössä kuvataan uusi, yksin kertainen ja erityisen tehokas menetelmä DNA:n puhdistamiseksi. Tällä menetelmällä päästään etenkin erityisen suuriin puhtauksiin ja suuriin saantoihin.
Keksinnön mukainen menetelmä perustuu olennaisesti 25 puhdistettavaan DNA:hän istutetun sekvenssin ja erään, luonnollisista tai muokatuista emäksistä koostuvan oligonukleotidin väliseen spesifiseen vuorovaikutukseen.
Alalla on osoitettu jokin aika sitten, että tietyillä oligonukleotideillä on spesifistä vuorovaikutusta 30 DNA-kaksoiskierteen suuressa urassa siten, että syntyy paikallisia kolmoiskierteitä, jotka johtavat kyseisten geenien kopioitumisen estymiseen [Helene ja Toulme, Bio-chim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99]. Nämä oligonukleotidit tunnistavat selektiivisesti DNA-kaksoiskierteen oligopu-35 riini.oligopyrimidiini-sekvenssien kohdalta, eli niissä 2 alueissa, joissa yksi juoste käsittää oiigopuriinisekvenssin ja sitä täydentävä vastinjuoste käsittää oligopyrimi-diinisekvenssin, ja ne muodostavat tässä alueessa paikallisesti kolmoiskierteen. Tämän kolmannen juosteen (oligo-5 nukleotidin) emäkset muodostavat vetysidoksia (Hoogsteen-sidoksia tai käänteisiä Hoogsteen-sidoksia) Watson-Crick-emäsparien puriinien kanssa.
Tämäntyyppisen vuorovaikutuksen hyväksikäyttö plas-midin eristämiseksi on kuvattu jo alalla. Niinpä julkai-10 sussa Ito et ai., PNAS 89 (1992), 495, on kuvattu sellaisten biotinyloitujen oligonukleotidien käyttö, jotka oligo-nukleotidit kykenevät tunnistamaan plasmidista määrätyn sekvenssin ja muodostamaan sen kanssa kolmoiskierteen. Täten muodostuneet kompleksit saatetaan sitten kosketuk-15 seen streptavidiinilla pinnoitettujen magneettikuulien kanssa. Sitten tämä plasmidi voidaan eristää biotiinin ja streptavidiinin välisen vuorovaikutuksen avulla erottamalla kuulat magneettisesti ja eluoimalla. Tähän menetelmään liittyy kuitenkin tiettyjä haittoja. Erityisesti siinä 20 tarvitaan kahdenlaisia spesifisiä peräkkäisiä vuorovaiku tuksia, ensin oligonukleotidin ja plasmidin välillä ja sitten biotinyloidun kompleksin ja streptavidiinikuulien välillä. Edelleen lopullinen liuos voi olla kontaminoitunut biotinyloidulla oligonukleotidillä, jota ei voida 25 käyttää farmaseuttisessa koostumuksessa.
Esillä olevassa keksinnössä kuvataan uusi parannettu menetelmä DNA:n puhdistamiseksi, jossa menetelmässä käytetään hyväksi tämäntyyppistä vuorovaikutusta. Erityisemmin keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään kanta-30 jaan kovalenttisesti sidottuja oligonukleotideja. Tämä menetelmä on erityisen nopea ja sillä päästään erityisen suuriin saantoihin ja erityisen suuriin puhtauksiin. Lisäksi sen avulla voidaan puhdistaa DNA:ta monimutkaisista seoksista, jotka käsittävät erityisesti muita nukleiini-35 happoja, proteiineja, endotoksiineja (kuten lipopolysakka- 3 rideja), nukleaaseja ja muita vastaavia. Käytettyjä kantajia voidaan lisäksi kierrättää helposti ja saatujen DNA: molekyylien farmaseuttiseen turvallisuuteen liittyvät ominaisuudet ovat parantuneet. Lisäksi tässä menetelmässä 5 tarvitaan vain yksi vaihe, toisin kuin tekniikan nykytason mukaisissa menetelmissä.
Näin ollen esillä olevan keksinnön ensimmäisenä kohteena on menetelmä kaksijuosteisen DNA:n puhdistamiseksi, jossa menetelmässä liuos, joka sisältää mainittua 10 DNA:ta sekoittuneena muihin komponentteihin, johdetaan kantajan läpi, johon kantajaan on sidottu kovalenttisesti sellainen oligonukleotidi, joka kykenee muodostamaan hyb-ridisaation avulla kolmoiskierteen mainitussa DNA:ssa läsnä olevan erityisen sekvenssin kanssa. Tämä erityinen sek-15 venssi voi olla tässä kaksijuosteisessa DNA:ssa luontaisesti läsnä oleva sekvenssi tai siihen keinotekoisesti liitetty synteettinen sekvenssi.
Esillä olevassa keksinnössä käytetyt oligonukleoti-dit ovat sellaisia oligonukleotideja, jotka hybridisoitu-20 vat suoraan tämän kaksijuosteisen DNA:n kanssa. Nämä oligonukleotidi t voivat sisältää seuraavia emäksiä: - tymidiiniä (T), joka kykenee muodostamaan trip-lettejä kaksijuosteisessa DNA:ssa läsnä olevien dublettien A.T kanssa [Rajagopal et ai., Biochem. 28 (1989) 7859]; 25 - adeniinia (A) , joka kykenee muodostamaan triplet- tejä kaksijuosteisessa DNA:ssa läsnä olevien dublettien A.T kanssa; - guaniinia (G) , joka kykenee muodostamaan triplet-tejä kaksijuosteisessa DNA:ssa läsnä olevien dublettien 30 G.C kanssa; - protonoitua sytosiinia (C+), joka kykenee muodostamaan triplettejä kaksijuosteisessa DNA:ssa läsnä olevien dublettien G.C kanssa (Rajagopal et ai., mainittu edellä) ,- - urasiilia (U), joka kykenee muodostamaan triplet- 35 tejä emäsparien A.U tai A.T kanssa.
4
Edullista on se, että käytetyllä oligonukleotidilla on runsaasti sytosiinejä sisältävä homopyrimidiinisekvenssi ja että DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi on ho-mopuriini-homopyrimidiini-sekvenssi. Sytosiinien läsnäolon 5 ansiosta saadaan aikaan kolmoiskierre, joka on pysyvä hap-pamissa pH-arvoissa, jolloin sytosiinit ovat protonoitu-neet, ja pysymätön aikalisissä pH-arvoissa, jolloin sytosiinit ovat neutraloituneet.
Kolmoiskierteen muodostumiselle hybridisaation seulo rauksena tärkeää on se, että oligonukleotidi ja DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi ovat toisiaan täydentäviä vastinsekvenssejä ("komplementtisekvenssejä"). Niinpä mahdollisimman suuriin saantoihin ja hyvään selektii-visyyteen pääsemiseksi keksinnön mukaisessa menetelmässä 15 käytetään oligonukleotidia ja erityistä sekvenssiä, jotka ovat toisiaan täydellisesti vastaavia komplementteja. Kysymyksessä voi olla erityisesti oligonukleotidina poly-CTT ja erityisenä sekvenssinä poly-GAA. Eräänä esimerkkinä voidaan mainita oligonukleotidi, jolla on sekvenssi 20 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' [GAGG(CTT)7] (sekvenssi nro 1) , jossa emäkset GAGG eivät muodosta kolmoiskierrettä, vaan joiden avulla oligonukleotidi saadaan kauemmaksi si-doshaarasta; samoin voidaan mainita sekvenssi (CTT)7 (sekvenssi nro 26). Nämä oligonukleotidit kykenevät muodosta-25 maan kolmoiskierteen komplementtiryhmiä (GAA) käsittävän erityisen sekvenssin kanssa. Kysymyksessä voi olla erityisesti alue, joka käsittää 7, 14 tai 17 GAA-ryhmää, kuten esimerkeissä on kuvattu.
Eräs toinen mielenkiintoinen erityinen sekvenssi on 30 seuraava: 5'-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3' (sekvenssi nro 5) Tämä sekvenssi muodostaa kolmoiskierteen oligonuk-leotidin 5'-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3' (sekvenssi nro 6) tai 35 5'-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (sekvenssi nro 7) kanssa.
5 Tässä tapauksessa oligonukleotidi kiinnittyy vasta-suuntaisesti suuntautuneena polypuriinijuosteeseen. Nämä kolmoisjuosteet eivät ole pysyviä kuin ionien Mg2+ läsnä ollessa (Vasques et ai., Biochemistry, 1995, 34, 7243 - 5 7251; Beal et Dervan, Science, 1991, 251, 1360 - 1363).
Kuten edellä on esitetty, erityinen sekvenssi voi olla DNA-kaksoisjuosteessa luontaisesti läsnä oleva sekvenssi, tai siihen keinotekoisesti istutettu synteettinen sekvenssi. Erityisen mielenkiintoista on käyttää sellais-10 ta oligonukleotidia, joka kykenee muodostamaan kolmois-kierteen DNA-kaksoisjuosteessa, esimerkiksi plasmidin rep-likaation alkamiskohdassa tai merkkigeenissä luontaisesti läsnä olevan sekvenssin kanssa. Tätä silmällä pitäen hakija on analysoinut plasmidien sekvenssejä ja hän on 15 kyennyt osoittamaan, että näiden DNA-molekyylien tietyissä alueissa, erityisesti replikaation alkamiskohdassa, voi esiintyä homopuriini-homopyrimidiini-alueita. Syntetisoimalla sellaisia oligonukleotideja, jotka kykenevät muodostamaan kolmoiskierteitä luonnollisten homopuriini-20 homopyrimidiini-alueiden kanssa, keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa edullisesti muokkaamattomiin plasmideihin, erityisesti tyyppiä pUC, pBR322, pSV jne., oleviin kaupallisiin plasmideihin. Näistä DNA-kaksoisjuosteessa luontaisesti läsnä olevista homopuriini-homo-25 pyrimidiini-sekvensseistä voidaan mainita sekvenssi, joka käsittää kokonaisuudessaan tai osittain sekvenssin 5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (sekvenss i nro 2) , j oka esiintyy E. colin replikaation alkamiskohdassa ColEl. Tässä tapauksessa kolmoiskierteen muodostavalla oligonukleotidilla on 30 sekvenssi: 5'-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3' (sekvenssi nro 3) ja se kiinnittyy vaihtoehtoisesti kaksoisjuosteen jompaankumpaan kahteen juosteeseen, kuten Beal ja Dervan ovat kuvanneet (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976 - 4982), samoin kuin Jayasena et Johnston (Nucleic Acids Res., 1992, 20, 35 5279 - 5288) . Samoin voidaan mainita plasmidin pBR322 β- 6 laktamaasin geenin sekvenssi 5'-GAAAAAGGAAGAG-3' (sekvenssi nro 4) (Duval-Valentin et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.
USA, 1992, 89, 504 - 508). Sellaisen oligonukleotidin, joka kykenee muodostamaan kolmoiskierteen merkkigeenin 5 replikaation alkamiskohdassa läsnä olevan sekvenssin kanssa, käyttö on erityisen edullista, koska tällöin tämän saman oligonukleotidin avulla voidaan puhdistaa kaikki sellainen DNA, joka sisältää tällaisen replikaation alkamiskohdan tai mainitun merkkigeenin. Tällöin ei ole siis 10 välttämätöntä muokata tätä plasmidia tai DNA-kaksoisjuos-tetta istuttamalla siihen erityinen keinotekoinen sekvenssi.
Vaikka edullisia ovatkin toisiaan täydellisesti vastaavat komplementtisekvenssit, niin kuitenkin selvää 15 on, että tiettyjä oligonukleotidin ja DNA:ssa läsnä olevan sekvenssin välisiä yhteensopimattomuuksia voidaan sietää, kunhan ne vain eivät johda affiniteetin liian suureen häviöön. Esimerkkinä voidaan mainita E. colin β-laktamaasin geenissä läsnä oleva sekevnssi 5'-ÄAAAAAGGGAATAAGGG-3' 2 0 (sekvenssi nro 8) . Tässä tapauksessa kolmannen juosteen guaniini voi tunnistaa tämän polypuriinisekvenssin katkaisevan tymiinin, jolloin muodostuu siis tripletti ATG, joka on pysyvä, kun sitä reunustaa kaksi TAT-triplettiä (Kiess-ling et ai., Biochemistry, 1992, 31, 2829 - 2834).
25 Erään erityisen suoritusmuodon mukaan keksinnön mu kaiset oligonukleotidit käsittävät sekvenssin (CCT)nf sekvenssin (CT)n tai sekvenssin (CTT)n, missä n on alueella 1-15, rajat mukaan lukien, oleva kokonaisluku. Erityisen edullista on käyttää tyyppiä (CT)n tai (CTT)n olevia sek-30 venssejä. Hakija on osoittanut, että oligonukleotidissä läsnä oleva C-määrä vaikuttaa puhdistuksen saantoon. Erityisesti, kuten esimerkissä 7 on esitetty, puhdistuksen saanto kasvaa mitä vähemmän oligonukleotidissä on sytosii-nejä. On selvää, että keksinnön mukaisissa oligonukleoti-35 deissa voidaan myös yhdistää ryhmiä (CCT), (CT) tai (CTT).
: 7 Käytetty oligonukleotidi voi olla luonnollinen (joka koostuu luonnollisista, muokkautumattomista emäksistä) tai sitä on voitu muokata kemiallisesti. Erityisesti tässä oligonukleotidissa voi olla läsnä edullisesti tiettyjä ke-5 miallisia muokkauksia, jotka parantavat sen kykyä kestää nukleaaseja tai suojautumista niitä vastaan, tai parantavat sen affiniteettia erityisen sekvenssin suhteen.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti oligonukleoti-dilla tarkoitetaan myös kaikkia sellaisia nukleosidiketju-10 ja, joiden runkoa on muokattu siksi, että ne saadaan kestämään paremmin nukleaaseja. Mahdollisista muokkauksista voidaan mainita fosforotioaattioligonukleotidit, jotka kykenevät muodostamaan kolmoiskierteitä DNA:n kanssa (Xodo et ai., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 3322 - 3330), samoin 15 kuin formasetaali- tai metyylifosfonaattirungon käsittävät oligonukleotidit (Matteucci et ai., J. Am. Chem. Soc. , 1991, 113, 7767 - 7768). Samoin voidaan käyttää oligonuk-leotideja, jotka on syntetisoitu nukleotidien a-anomeereja käyttäen, ja jotka muodostavat samoin kolmoiskierteitä 20 DNA:n kanssa (Le Doan et ai., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 7749 - 7760). Eräs muu rungon muokkaus on fosforami- daattisidos. Esimerkkinä voidaan mainita esimerkiksi Gryaznovin ja Ohenin kuvaama nukleotidien välinen fosfor-amidaattisidos N3'-P5', joiden avulla aikaan saadut oligo-25 nukleotidit muodostavat DNA:n kanssa erityisen pysyviä kolmoiskierteitä (J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143 - 3144). Rungon muista muokkauksista voidaan mainita samoin ribonukleotidien, 2'-O-metyyliriboosin, fosfodiesterin ja muiden vastaavien käyttö (Sun ja Helene, Curr. Opinion 30 Struct. Biol., 116, 3143 - 3144). Fosforoitu runko voidaan lopulta korvata polyamidirungolla, kuten asianlaita on PNArssa (peptidinukleiinihappo), joka voi myös muodostaa kolmoiskierteitä [Nielsen et ai., Science, 1991, 254, 1497 - 1500; Kim et ai., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 35 6477 - 6481)] tai guanidiiniin perustuvalla rungolla, ku- 8 ten asianlaita on DNG-molekyyleissä (deoksiribonukleiini-guanidiini; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 6097 - 6101), jotka ovat myös kolmoiskierteitä muodostavia poly-kationisia DNA-analogeja.
5 Kolmannen juosteen tymidiini voidaan korvata myös 5-bromiurasiililla, mikä parantaa oligonukleotidin affiniteettia DNA:n suhteen (Povsic et Derven, J. Am. Che. Soc., 1989, 111, 3059 - 3061). Tämä kolmas juoste voi myös sisältää epäluonnollisia emäksiä, joista voidaan mainita 10 7-deatsa-2'-deoksiksantosiini (Milligan et ai., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327 - 333), 1-(2-deoksi-E-D-ribofu-ranosyyli) -3-metyyli-5-amino-lH-pyratsolo [4,3-d] -pyrimi-diini-7-oni (Koh ja Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470 - 1478), 8-oksoadeniini, 2-aminopuriini, 2'-0-metyy-15 li-pseudoisosytidiini tai mikä tahansa muu, alan asiantuntijalle tuttu muokkaus (yleiskatsaus esitetty julkaisussa Sun ja Helene, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345 -356) .
Erään toista tyyppiä olevan oligonukleotidimuok-20 kauksen tavoitteena on erityisemmin parantaa oligonukleotidin ja erityisen sekvenssin välistä vuorovaikutusta ja/ tai affiiniteettia. Erityisesti eräässä keksinnön mukaisessa, hyvin edullisessa muokkauksessa oligonukleotidin sytosiinit metyloidaan (vrt. esimerkki 5). Täten metyloi-25 dulla oligonukleotidilla on se hyvin huomattava ominaisuus, että se muodostaa pysyvän kolmoiskierteen erityisen sekvenssin kanssa lähes neutraaleissa pH-arvoissa (>5) . Sen avulla voidaan siis työskennellä suuremmissa pH-ar-voissa kuin tekniikan nykytason mukaisilla oligonukleo-30 tideilla, toisin sanoen sellaisissa pH-arvoissa, joissa plasmidi-DNA:n hajoamisen vaara on paljon pienempi.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetyn oligonukleotidin pituus on vähintään 3 emästä ja edullisesti 5-30 emästä. Edullisesti käytetään oligonukleotidia, jo-35 ka on pitempi kuin 10 emästä. Alan asiantuntija voi muut- 9 taa tätä pituutta tapauskohtaisesti vuorovaikutuksen tavoitellusta selektiivisyydestä ja pysyvyydestä riippuen.
Keksinnön mukaiset oligonukleotidit voidaan syntetisoida millä tahansa tunnetulla tekniikalla. Ne voidaan 5 erityisesti valmistaa nukleiinihapposyntetisaattoreilla. Myös mitä tahansa muuta, alan asiantuntijalle käyttökelpoista menetelmää voidaan käyttää.
Oligonukleotidi muutetaan yleensä funktionaaliseen muotoon sen kovalenttiseksi kytkemiseksi kantajaan. Niinpä 10 sitä voidaan muokata päättävällä, joko 5'- tai 3'-aseman tioli-, amiini- tai karboksyyliryhmällä. Erityisesti esimerkiksi tioli-, amiini- tai karboksyyliryhmän lisääminen tekee mahdolliseksi oligonukleotidin kytkemisen kantajaan, jossa on funktionaalinen disulfidi-, maleimidi-, amiini-, 15 karboksyyli-, esteri-, epoksidi-, syaanigeenibromidi- tai aldehydiryhmä. Nämä sidokset muodostuvat, kun oligonukleotidin ja kantajan välille syntyy disulfidi-, tioesteri-, esteri-, amidi- tai amiinisidos. Käyttökelpoinen on myös mikä tahansa muu, alan asiantuntijalle tuttu menetelmä, 20 kuten esimerkiksi bifunktionaalisiin sidosreagensseihin perustuva menetelmä.
Lisäksi kytketyn oligonukleotidin kanssa tapahtuvan hybridisaation parantamiseksi saattaa olla edullista, että oligonukleotidi käsittää "sivuhaaran" sekä "väliemäs"-sek-25 venssin. Sivuhaaran käyttö tekee mahdolliseksi oligonukleotidin kiinnittämisen valitulle etäisyydelle kantajasta, mikä parantaa niitä olosuhteita, joissa vuorovaikutus DNA:n kanssa tapahtuu. Tämä sivuhaara muodostuu edullisesti suorasta hiiliketjusta, joka käsittää 1-18, edulli-30 sesti 6 tai 12 CH2-ryhmää, sekä amiinista, joka tekee mahdolliseksi kytkeytymisen pylvääseen. Tämä sivuhaara liittyy oligonukleotidin fosfaattiin tai "väliryhmään", joka koostuu sellaisista emäksistä, jotka eivät häiritse hybridisaatiota. Niinpä tämä "väliryhmä" voi käsittää puriini-35 emäksiä. "Väliryhmä" voi käsittää esimerkiksi sekvenssin 10 GAGG. Sivuhaara koostuu edullisesti 6 tai 12 hiiliatomia käsittävästä suorasta hiiliketjusta.
Erityyppisiä kantajia voidaan käyttää esillä olevan keksinnön toteuttamiseksi. Kysymykseen voivat tulla toi-5 minnalliseen muotoon saatetut kromatografiset kantajat, jotka ovat joko vapaana tai jotka ovat edeltä käsin vakioidussa muodossa pylväässä, funktionaaliseen muotoon saatetut muovipinnat tai funktionaliseen muotoon saatetut lateksihelmet, jotka voivat olla magneettisia, mikä ei ole 10 kuitenkaan välttämätöntä. Kysymykseen tulevat edullisesti kromatografiset kantajat. Esimerkkeinä käyttökelpoisista kromatografisista kantajista voidaan mainita agaroosi, ak-ryyliamidi tai dekstraani sekä niiden johdannaiset (kuten Sephadex, Sepharose, Superose, ...), sellaiset polymeerit, 15 kuten poly(styreenidivinyylibentseeni) tai oksastettu tai oksastamaton piidioksidi. Kromatografiapylväiden toiminta voi perustua diffuusioon tai perfuusioon.
Erityisen edullisella tavalla, puhdistuksessa parempiin saantoihin pääsemiseksi, plasmidissa käytetään 20 sellaista sekvenssiä, joka käsittää lukuisia oligonukleo-tidin kanssa hybridisoituvia asemia. Lukuisten hybridisaa-tioasemien läsnäolo on todellakin edullista mainitun sekvenssin ja oligonukleotidin välisiä vuorovaikutuksia ajatellen, mikä johtaa puhdistuksen saantojen paranemiseen. 25 Niinpä sellaisen oligonukleotidin, joka käsittää n kertaa toistuvan ryhmän (CCT) , (CT) tai (CTT), tapauksessa on edullista käyttää sellaista DNA-sekvenssiä, joka käsittää vähintään n kappaletta täydentäviä vastinryhmiä ja edullisesti n+1 täydentävää vastinryhmää. Niinpä n+1 täydentävää 30 vastinryhmää käsittävässä sekvenssissä on kaksi sellaista asemaa, johon oligonukleotidi voi hybridisoitua. Edullisessa tapauksessa tämä DNA-sekvenssi käsittää jopa 11 hyb-ridisaatioasemaa, toisin sanoen n+10 täydentävää vastinryhmää .
11
Esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää mitä tahansa tyyppiä olevan kaksijuosteisen DNA:n puhdistamiseksi. Kysymyksessä voi olla esimerkiksi rengasmainen DNA, kuten plasmidi, joka käsittää yleensä yhden 5 tai useamman terapeuttisesti mielenkiintoisen geenin. Tämä plasmidi voi käsittää samoin replikaation alkamiskohdan, merkkigeenin, jne... Keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa suoraan soluhajotteeseen. Tässä suoritusmuodossa plasmidi, jota on monistettu ensin transformoimalla soluja 10 ja sitten viljelemällä niitä, puhdistetaan suoraan solujen hajottamisen jälkeen. Keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa myös kirkkaaseen hajotteeseen, toisin sanoen supernatanttiin, joka on saatu soluhajotteen neutraloinnin ja sentrifugoinnin jälkeen. Tätä menetelmää voidaan luon-15 nollisestikin soveltaa myös liuokseen, joka on puhdistettu edeltäkäsin tunnetuilla menetelmillä. Tämän menetelmän avulla voidaan myös puhdistaa mielenkiinnon kohteena olevan sekvenssin käsittävä lineaarinen tai rengasmainen DNA lähtemällä erilaisten DNA-sekvenssien seoksesta. Keksinnön 20 mukaista menetelmää voidaan samoin käyttää kaksijuosteisen RNA:n puhdistamiseksi.
Soluhajote voi olla prokariootti- tai eukariootti-solujen hajote.
Prokarioottisoluj en tapauksessa esimerkkinä voidaan 25 mainita bakteerit E. coli, B. subtilis, S. typhimurium tai Streptomvces. Eukarioottisolujen tapauksessa voidaan mainita eläinsolut, hiivat, sienet jne. ja erityisemmin hiivat Kluvveromvces tai Saccharomvces tai COS-, CHO-, C127-, NIH3T3-solut ja vastaavat.
30 Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä on eri tyisen edullinen, koska sen avulla saadaan nopealla ja yksinkertaisella tavalla hyvin puhdasta plasmidi-DNA:ta. Erityisesti, kuten esimerkeissä on esitetty, tämän menetelmän avulla voidaan erottaa tehokkaasti mielenkiinnon 35 kohteena oleva plasmidi-DNA kontaminoivista komponenteis- 12 ta, kuten kromosomaalisista DNA-kappaleista, endotoksii-neista, proteiineista, nukleaaseista ja muista vastaavista. Erityisemmin keksinnön mukaisen menetelmän avulla voidaan saada kaksijuosteiseen DNA:hän perustuva valmiste, 5 erityisesti plasmidi-DNA-valmiste, jossa kromosomaalisen DNA:n pitoisuus on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,5 %. Vieläkin edullisemmin saaduissa DNA-valmisteissa kromosomaalisen DNA:n pitoisuus on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,2 %. Niinpä esillä olevassa keksinnössä on kuvattu far-10 maseuttisesti, erityisesti geeni- tai soluterapiassa käyt tökelpoiset, plasmidi-DNA:ta sisältävät koostumukset. Näin ollen keksinnön kohteena on myös joko lineaarista tai plasmidista kaksijuosteista DNA:ta käsittävä farmaseuttinen koostumus, joka on valmistettu edellä kuvatulla mene-15 telmällä.
Keksinnön kohteena ovat myös plasmidi-DNA-valmis-teet, joissa kromosomaalisen DNA:n pitoisuus on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,5 %, edullisesti 0,2 % ja edullisemmin 0,1 %.
20 Nämä koostumukset voivat käsittää "paljasta" plas- midi-DNA:ta tai tämä plasmidi-DNA voi olla liittyneenä kuljetinvektoreihin, kuten liposomeihin, nanohiukkasiin, kationisiin lipideihin, polymeereihin, proteiineihin, yh-distelmä-DNA-teknisiin viruksiin tai muihin vastaaviin.
25 Oheinen hakemus kuvataan nyt yksityiskohtaisemmin seuraavien, keksintöä havainnollistavien, ei kuitenkaan rajoittavien esimerkkien avulla.
Yleisiä kloonaus- ja molekyylibiologisia tekniikoita 30 Perinteisiä molekyylibiologian menetelmiä, kuten pilkkominen restriktioentsyymeillä, elektroforeesi geelillä, transformointi E. coli -bakteeriin, nukleiinihappojen saostus ja muita vastaavia on kuvattu kirjallisuudessa (Maniatis et ai., T., E.F. Fritsch ja J. Sambrook, 1989, 35 Molecular Cloning: a laboratory manual, toinen painos, 13
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F.M., R.Brent, R.E. Kinston, D. D. Moore, J.A. Smith, J.G. Seidman ja K. Struhl, 1987,
Current protocols in molecular biology, 1987 - 1988, John 5 Wiley and Sons, New York). Nukleotidisekvenssit on määritetty ketjujen päättymiseen perustuvalla menetelmällä alalla jo kuvatulla tavalla (Ausubel et ai., 1987).
Restriktioentsyym.it on saatu yhtiöstä New England Biolabs, Beverly, MA (Biolabs).
10 Ligatointia varten DNA-kappaleita inkuboidaan 59 mM
Tris-HCl-puskurissa, pH 7,4, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, T4-faagin DNA-ligaasin (Biolabs) läsnä ollessa.
Oligonukleotidit syntetisoidaan käyttäen β-asemas-taan syaanietyyliryhmällä suojattuihin fosforamidiitteihin 15 perustuvaa kemiaa (Sinha, N.D., J. Biernat, J. McManus ja H. Köster, 1984, Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of β-cyanoethyl-N,N-dialkylamino/N-morpho-lino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of 20 the final product (Polymeerin kannattama oligonukleotidi-synteesi, XVIII: deoksinukleosidien β-syaanietyyli-N,N-di-alkyyliamino/N-morfolino-fosforamidiitin käyttö DNA-kappa-leiden syntetitoimiseksi, joka käyttö helpottaa suojaavien ryhmien poistamista lopputuotteesta ja tuotteen eristämis-25 tä). Nucl. Acids Res., 12, 4539 - 4557; Giles, J.W. 1985.
Advances in automated DNA-synthesis. Am. Biotechnol.,
Nov./Dec.) automaattisella DNA-syntetisaattorilla Biosearch 8600, valmistajan suositusten mukaisesti.
Ligatoitujen DNA-molekyylien tai sellaisten DNA-30 molekyylien, joiden transformointikyky haluttiin selvittää, avulla transformoitiin vastaanottokykyiseksi tehty E. coli DH5o!-kanta: [F' / endAl. hsdR17, supE44 . thi-1, recAl, gyrA96, relAl. ό (lacZYA-araF) U169. deoR, <£80dlac- :j (lacZ6M15) 1 | -;f 14
Plasmidi-DNA:n minipreparaatit tehdään tavalla, joka on kuvattu julkaisussa Klein et ai., 1980.
LB-elatusalustaa käytetään E, coli -kantojen viljelemiseksi (Maniatis et ai., 1982). Näitä kantoja inkuboi-5 daan 37 °C:ssa. Bakteerit levitetään LB-alustaa, jota on täydennetty asianmukaisilla antibiooteilla, käsittäville maljoille.
Esimerkki 1 1.1. Pylvään valmistaminen 10 Materiaalit: Käytetty pylväs on HiTrap-pylväs, jota on aktivoitu 1 ml :11a N-hydroksisukkinimidiä (NHS, Pharmacia), ja joka on liitetty peristalttiseen pumppuun (virtausnopeus alle 1 ml/min) . Käytetty erityinen oligonukleotidi käsittää NH2-15 ryhmän 5'-asemassa. Sillä on seuraava sekvenssi: 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (sekvenssi nro 1) Tässä esimerkissä käytettiin seuraavia puskureita:
Kytkemispuskuri: NaHC03 0,2 M; NaCl 0,5 M, pH 8,3.
A-puskuri: etanoliamiini 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3. 20 B-puskuri: asetaatti 0,1 M, NaCl 0,5 M, pH 4.
Menetelmä:
Pylväs pestään 6 ml :11a 1 mM HCl-liuosta, sitten pylvääseen laitetaan kytkentäpuskurilla laimennettua oli-gonukleotidia (50 nanomoolia 1 ml:ssa) ja jätetään siihen 25 30 minuutiksi ympäristön lämpötilassa. Pylväs pestään pe räkkäin 3 kertaa 6 ml :11a A-puskuria ja sitten 6 ml :11a B-puskuria. Tällä tavalla oligonukleotidi saadaan kytkeytymään kovalenttisesti pylvääseen CONH-sidoksella. Pylvästä säilytetään 4 °C:ssa PBS-puskurissa, 0,1 % NaN3, ja sitä 30 voidaan käyttää vähintään neljä kertaa.
1.2. Plasmidien muodostus
Seuraavat kaksi oligonukleotidia syntetisoitiin. Oligonukleotidi 4817: 5' -GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA 35 GAAGAAGG-3' (sekvenssi nro 9) 15
Oligonukleotidi 4818: 5'-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT CTTCG-3' (sekvenssi nro 10)
Sen jälkeen kun nämä oligonukleotid.it on hybridi-5 soitu ja kloonattu plasmidiin, ne saavat aikaan vastaavassa plasmidissa edellä kuvatun homopuriini-homopyrimidiini-sekvenssin (GAA)17.
Näitä kahta hybridisoitua oligonukleotidia vastaava sekvenssi on kloonattu plasmidin pBKS+ (Stratagene Cloning 10 System, La Jolla CA) moninkertaiseen kloonauskohtaan, jossa on ampisilliinin vastustuskyvyn geeni. Tätä tarkoitusta varten oligonukleotidit hybridisoitiin seuraavalla tavalla. Yksi μg näitä kahta oligonukleotidiä yhdistettiin 40 ml:ssa viimeistä puskuria 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM
15 MgCl2. Tämä seos kuumennettiin 95 °C:n lämpötilaan, sitten sitä pidettiin ympäristön lämpötilassa siten, että lämpötila laski hitaasti. 10 ng näiden hybridisoitujen oligo-nukleotidien seosta ligatoitiin 200 ng:aan pBKS+-plasmidia (Stratagene Cloning System, La Jolla CÄ) , joka oli pilkot-20 tu entsyymeillä BamHI ja EcoRI 30 μΐ-.ssa lopullista viimeistä puskuria. Ligatoinnin jälkeen pieni määrä transformoitiin DH5224-kantaan. Transformointiseos levitettin L-alustalle, jota oli täydennetty ampisilliinilla (50 mg/1) ja X-gal:lla (20 mg/1). Yhdistelmä-DNA-teknisistä 25 klooneista täytyy puuttua sininen väri tällä alustalla toisin kuin lähtöplasmidista (pBKS+), jossa E. coli:n β-galaktosidaasin omega-kappaleen «-täydentäminen on mahdollista. Sen jälkeen kun pieni määrä plasmidi-DNA:ta oli preparoitu 6 kloonista, niissä kaikissa todettiin plasmi-30 dissa pBKS+ kohtien EcoRI ja BamI välissä sijainneen Pstl-kohdan katoaminen sekä moninkertaisen kloonauskohdan sisältävän, 448 emäsparia käsittävän PvuII-vyöhykkeen mole-kyylipainon suureneminen. Yksi klooni otettiin talteen ja vastaavasta plasmidista käytettiin merkintää pXL2563. 35 Kloonattu sekvenssi varmistettiin sekvenssimäärityksellä 16 käyttäen plasmidin pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA) aluketta -20 [5'-TGACCGGCAGCAAAATG-3' (sekvenssi nro 11)] (Viera J. ja J. Messing, 1982, The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and 5 sequencing with synthetic universal primers; pUC-plasmi-dit, M13mp7-peräinen järjestelmä istutusmutageneesin aikaansaamiseksi ja sekvenssin määrittämiseksi synteettisillä yleisalukkeilla). Gene, 19, 259 - 268). Tämä plasmidi pXL2563 puhdistettiin reagenssipakkauksella Wizard Mega-10 prep (Promega Corp., Madison, WI) valmistajan suositusten mukaisesti. Tätä plasmidi-DNA-valmistetta käytettiin sitten jäljempänä kuvatuissa esimerkeissä.
1.3. Plasmidin puhdistus
Materiaalit: 15 Plasmidi pXL2563 (kuvattu kohdassa 1.2) puhdistet tiin myös plasmidia pBKS+ sisältävästä liuoksesta HiTrap-pylväällä, johon oli sidottu kohdassa 1.1 kuvattua oligo-nukleotidia. Tässä puhdistuksessa käytettiin seuraavia puskureita: 20 F-puskuri: NaCl 2M, asetaatti 0,2 M, pH 4,5 - 5.
E-puskuri: Tris IM, HC1 pH 9, EDTA 0,5 mM.
Menetelmä:
Pylväs pestiin 6 ml :11a F-puskuria, sitten plasmi-dit (20 μg pXL2563 ja 20 μg pBKS+ 400 μΐ-.ssa F-puskuria) 25 laitettiin pylvääseen ja inkuboitiin kaksi tuntia ympäristön lämpötilassa. Pylväs pestiin 10 ml:11a F-puskuria ja sitten sitä eluoitiin E-puskurilla. Plasmidit ilmaistiin toteuttamalla elektroforeesi l-%:isella agaroosigeelillä ja värjäämällä etidiumbromidilla. Plasmidien osuus liuok-30 sissa arvioidaan määrittämällä niiden transformoiva aktiivisuus E. colin avulla.
Tulokset:
Kun lähdetään sellaisesta seoksesta, joka sisältää 30 % plasmidia pXL2563 ja 70 % plasmidia pBKS+, niin pyl-35 vään ulostulosta saadaan tällöin talteen liuos, joka si- 17 sältää 100 % plasmidia pXL2563. Puhtaus, joka arvioidaan optiselle tiheydelle aallonpituuksilla 260 ja 280 nm mitattujen arvojen välisen suhteen avulla, muuttuu arvosta 1,9 arvoon 2,5, mikä osoittaa, että tällä menetelmällä 5 päästään eroon kontaminoivista proteiineista.
Esimerkki 2 2.1. Tässä esimerkissä kuvataan plasmidi-DNA:n puhdistus. Oligonukleotidin [5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (sekvenssi nro 1)] kytkeminen pylvääseen tehdään esimer- 10 kissä 1 kuvatulla tavalla. Tätä kytkemistä varten oligo-nukleotidia muokataan 5'-päästä amiiniryhmällä, joka on sidottu välikappaleen fosfaattiin 6 hiiliatomia sisältävän sivuryhmän avulla (Oligonucleotide modifie Eurogentec SA Belgia). Plasmidi pXL2563 on puhdistettu reagenssipakkauk-15 sella Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) valmistajan suositusten mukaisesti. Tässä esimerkissä käytettiin seuraavia puskureita: F-puskuri: NaCl 0-2M, asetaatti 0,2 M, pH 4,5 - 5.
E-puskuri: Tris IM, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.
20 Pylväs pestiin 6 ml :11a F-puskuria, sitten 100 μg plasmidia pXL2563 laimennettuna 400 μΐ-.lla. F-puskuria laitettiin pylvääseen ja inkuboitiin kaksi tuntia ympäristön lämpötilassa. Pylväs pestiin 10 ml :11a F-puskuria ja sitten sitä eluoitiin E-puskurilla. Plasmidin määrä määritet-25 tiin mittaamalla optinen tiheys aallonpituudella 260 nm. Tässä esimerkissä kiinnitys toteutettiin puskurissa, jonka NaCl-molaarisuus vaihteli alueella 0 - 2 M (F-puskuri). Puhdistuksen saanto pienenee NaCl-molaarisuuden pienentyessä. Kiinnityspuskurin pH voi vaihdella alueella 4,5 -5 30 puhdistuksen saannon ollessa paras pH-arvossa 4,5. Menetelmässä voidaan myös käyttää jotakin muuta eluointipus-kuria, jolla on emäksinen pH: tällöin eluointi toteutetaan 50 mM boraattipuskurilla, pH 9, EDTA 0,5 mM.
2.2. Oligonukleotidi 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT- 35 3' (sekvenssi nro 1) kytketään pylvääseen esimerkissä 1 18 kuvatulla tavalla. Plasmidi pXL2563 on puhdistettu rea-genssipakkauksella Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) valmistajan suositusten mukaisesti. Tässä esimerkissä käytettiin seuraavia puskureita: 5 F-puskuri: NaCl 0,1 M, asetaatti 0,2 M, pH 5.
E-puskuri: Tris IM, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM.
Pylväs pestiin 6 ml :11a F-puskuria, sitten 100 μg plasmidia pXL2563 laimennettuna 400 μΐ-.lla F-puskuria laitettiin pylvääseen ja inkuboitiin yksi tunti ympäristön 10 lämpötilassa. Pylväs pestiin 10 ml :11a F-puskuria ja sitten sitä eluoitiin E-puskurilla. Plasmidinäytteissä läsnä olevan, E. colin perimästä tai kromosomeista peräisin olevan DNA:n osuus määritetään ennen oligonukleotidipylvään läpi johtamista ja pylvään jälkeen. Tämän perimä-DNA:n 15 määrä määritetään PCR-reaktiolla käyttäen käynnistimiä E.
colin galK-geenissä. Tällöin meneteltiin seuraavasti: Näiden käynnistimien sekvenssi on kuvattu julkaisussa Debouck et ai., Nucleic Acids Res., 1985, 13, 1841 - 1853: 5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (sekvenssi nro 20 24) sekä 5'-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3' (sekvenssi nro 25) .
Reaktioseos käsittää 25 μΐ-.ssa PCR-puskuria (Prome-25 ga France, Charbonnieres) : 1,5 mM MgCl2; 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay) ; 0,5 μΜ käynnistintä; 20 U/ml Taq-polymeraa-sia (Promega). Reaktio toteutettiin seuraavissa vaiheissa: 5 minuuttia 92 °C:ssa 30 jaksoa 10 sekuntia 95 °C:ssa 30 30 sekuntia 60 °C:ssa 1 minuutti 78 °C:ssa 10 minuuttia 78 °C:ssa.
124 emäsparin pituinen monistettu DNA-kappale erotettiin elektroforeesilla käyttäen 3-%:ista agaroosigee-35 liä, SybrGreen I -koettimen (Molecular Probes, Eugene, 19 USA) läsnä ollessa, minkä jälkeen sen määrä määritettiin vertaamalla E. coli B -kannan (Sigma, viite D4889) perimästä saatuihin Ultrapur-DNA-molekyyleihin.
Näyte sisältää 1 % kromosomaalista DNA:ta ennen 5 pylvästä ja oligonukleotidipylvään avulla puhdistettu näyte sisältää sitä 0,2 %.
Esimerkki 3
Koe kirkasta hajotetta käyttäen Tässä esimerkissä kuvataan plasmidi-DNA:n puhdistus 10 bakteeriviljelmän kirkkaasta hajotteesta "miniprep" -mitassa: 1,5 ml yön aikana saatua, plasmidin pXL2563 sisältävien DH5af-kantojen viljelmää sentrifugoitiin ja kasauma suspendoitiin uudestaan 100 μΐ-.aan liuosta, jonka koostumus oli: glukoosi 50 mM, Tris 25 mM HCl pH 8, EDTA 10 mM. 15 Sitten lisätään 200 μΐ 0,2 M NaOH-liuosta, 1 % SDS, putkia sekoitetaan kääntämällä ylösalaisin, sitten lisätään 150 μΐ 3 M kaliumasetaattia, pH 5, ja putkia sekoitettiin kääntämällä ylösalaisin. Sentrifugoinnin jälkeen superna-tantti otetaan talteen ja laitetaan esimerkissä 1 kuvatul-20 la tavalla saatuun oligonukleotidipylvääseen. Kiinnitys, pesut ja eluutio toteutetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 1. Tällä tavalla saadaan noin 1 jiig plasmidia lähtemällä 1,5 ml:sta viljelmää. Saatu plasmidi analysoitiin elektroforeettisesti agaroosigeelillä ja värjättiin eti-25 diumbromidilla, minkä perusteella se esiintyy vain yhtenä "ylirullautuneen" rengasmaisen DNA:n vyöhykkeenä. Tällä menetelmällä puhdistetussa plasmidissa ei todettu lainkaan sellaista DNA:ta, jolla on suuri molekyylipaino (kromoso-maalinen DNA), eikä RNA:ta. Aallonpituuksilla 260 ja 280 30 nm mitattujen optisten tiheyksien välinen suhde on 2.
Esimerkki 4 4.1. Tässä esimerkissä kuvataan plasmidi-DNA:n puhdistus esimerkissä 3 kuvatuissa olosuhteissa lähtemällä 20 ml:sta plasmidin pXL2563 sisältävien DH5o;-kantojen viljel-35 mää. Solukasauma sekoitetaan 1,5 ml:aan liuosta, jonka 20 koostumus oli: glukoosi 50 mM, Tris 25 mM HC1 pH 8, EDTA 10 mM. Hajottaminen toteutetaan 2 ml:11a 0,2 M NaOH-liuos-ta, 1 % SDS, ja neutralointi 1,5 ml :11a 3M kaliumasetaat-tia, pH 5. Sitten DNA saostetaan 3 ml :11a 3 ml 2-propano-5 lolia, kasauma sekoitetaan uudestaan 0,5 ml:aan liuosta, joka sisältää 0,2 M natriumasetaattia, pH 5, 0,1 M NaCl, ja laitetaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla saatuun oli-gonukleotidipylvääseen. Kiinnitys, pylvään pesu ja eluutio toteutetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 1 lukuun ot-10 tamatta pesupuskuria, jossa NaCl-molaarisuus on 0,1 M.
Tällöin saadaan noin 16 μg plasmidi-DNA:ta. Saatu plasmidi analysoitiin elektroforeettisesti agaroosigeelillä ja värjättiin etidiumbromidilla, minkä perusteella se esiintyy vain yhtenä "ylirullautuneen" rengasmaisen DNA:n vyöhyk-15 keenä. Puhdistetussa plasmidissa ei todettu lainkaan sellaista DNA:ta, jolla on suuri molekyylipaino (kromosomaa-linen DNA), eikä RNA:ta. Tämän plasmidin pilkkominen rest-riktioentsyymillä tuottaa vain yhden 3 kiloemäksen suuruisen vyöhykkeen, jolla on odotettu molekyylipaino. Näyttei-20 den proteiinipitoisuus muuttuu kirkkaan hajotteen arvosta 125 μg/ml pienemmäksi kuin 1 μg/ml puhdistetussa plasmidissa (Micro-BCA-analyysi, Pierce). Endotoksiinien pitoisuus LAL-analyysillä arvioiden (Biosepra) pienenee alle 10-osaan puhdistetussa plasmidissa verrattuna lähtöaineena 25 toimineeseen kirkkaaseen hajotteeseen.
4.2. Käytetty plasmidi käsittää kasetin, joka sisältää sytomegaloviruksen promoottorin, lusiferaasia koo-daavan geenin sekä homopuriini-homopyrimidiini-sekvenssin (GAA) 17 plasmidista pXL2563. Tämän plasmidin sisältävää 30 DHl-kantaa (Maniatis et ai., 1989) viljellään 7 litran fermentorissa. Kirkas hajote valmistetaan 200 grammasta soluja: solukasauma sekoitetaan uudestaan 2 litraan liuosta, jonka koostumus on Tris 25 mM, pH 6,8, glukoosi 50 mM, j EDTA 10 mM, mihin lisätään 2 litraa 0,2 M NaOH-liuosta,
35 1 % SDS. Hajote neutraloidaan lisäämällä yksi litra 3M
21 kaliumasetaattia. Diasuodatuksen jälkeen 4 ml hajotetta laitetaan 5 ml:n suuruiseen HiTrap-NHS-pylvääseen, johon on kytketty esimerkissä 1.1 kuvatulla menetelmällä oligo-nukleotidi, jolla on sekvenssi 5 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (sekvenssi nro 1)
Pesu ja eluointi toteutetaan esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Talteen saadaan noin 400 μg plasmidia. Perimä-DNA:n osuus tässä näytteessä on 0,1 % mitattuna esimerkissä 2.2. kuvatulla tekniikalla.
10 Esimerkki 5
Muokatun oligonukleotidin käyttö Tässä esimerkissä kuvataan metyloituja sytosiinejä sisältävän oligonukleotidin käyttö.
Käytetyllä oligonukleotidilla on seraava sekvenssi: 15 5, _GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTT_3, (sekvenssi nro 1) Tämän oligonukleotidin 5'-päässä on NH2-ryhmä. MeC = 5-metyylisytosiini. Tämän oligonukleotidin avulla voidaan puhdistaa plasmidi pXL2563 esimerkin 1 olosuhteissa käyttäen kiinnityspuskuria, jonka pH on 5 (tällä tavalla pie-20 nennetään plasmidin hajoamisen vaaraa).
Esimerkki 6
Edellisissä esimerkeissä käytettyä oligonukleoti-dia on muokattu 5'-päästä fosfaattiin sitoutuneella amii-niryhmällä 6 hiiliatomia sisältävän sivuryhmän avulla: NH2-25 (CH2)6. Tässä esimerkissä amiiniryhmä on sidottu 5'-päät teen fosfaattiin 12 hiiliatomia käsittävän sivuryhmän välityksellä: NH2- (CH2) 12 . Oligonukleotidin kytkeminen pylvääseen ja näytteen johtaminen pylvään läpi toteutetaan esimerkissä 2 kuvatulla tavalla käyttäen F-puskuria: 2 M 30 NaCl, 0,2 M asetaatti, pH 4,5. Tämän oligonukleotidin avulla puhdistuksessa päästään parempiin saantoihin: saannoksi saavutetaan 53 %, kun taas 6 hiiliatomia käsittävän oligonukleotidin tapauksessa tämä saanto on noin 45 %, muuten samoissa olosuhteissa.
22
Esimerkki 7
Esimerkissä 1.2. kuvattua kloonausstrategiaa noudattaen muodostettiin kaksi muuta plasmidia, joissa on ho-mopuriini-homopyridimiini-sekvenssi: eli plasmidi pXL2725, 5 joka sisältää sekvenssin (GGA) 15, sekä plasmidi pXL2726, joka sisältää sekvenssin (GA)^.
Esimerkki 7.1.
Plasmidien muodostaminen
Plasmidit pXL2725 ja pXL2726 muodostettiin analogi-10 sella tavalla plasmidiin pXL2563 nähden esimerkissä 1.2. kuvatulla kloonaustekniikalla käyttäen seuraavista oligo-nukleotideistä muodostettuja pareja: 5986: 5' -GATCC (GA) 25GGG- 3 ' (sekvenssi nro 13) 5987: 5' -AATTCCC (TC) 2gG-3 ' (sekvenssi nro 14) 15 5981: 5' -GATCC (GGA) 17-3 ' (sekvenssi nro 15) 5982: 5' -AATT (CCT) 17CCG-3' (sekvenssi nro 16) i
Oligonukleotidien 5986 ja 5987 paria käytettiin plasmidin pXL2726 muodostamiseksi kloonaamalla nämä oligo-nukleotidit plasmidissa pBKS+ (Stratagene Cloning System, 2 0 La Jolla CA) BamHI- ja EcoRI-kohtiin, kun taas olgonuk- leotideja 5981 ja 5982 käytettiin plasmidin pXL2725 muodostamiseksi. Tässä käytettiin samoja koeolosuhteita kuin plasmidin pXL2563 muodostamiseksi, ainoastaan oligonukleo-tidiparit on vaihdettu. Samoin kloonatut sekvenssit on 25 varmistettu määrittämällä näiden plasmidien sekvenssit.
Tällöin nähdään, että plasmidi pXL2725 käsittää muokkauksen odotettuun sekvenssiin nähden, 17 kertaan toistuvan GGA-sekvenssin sijasta siinä esiintyy GGAGA(GGA)15 (sekvenssi nro 17).
3 0 Esimerkki 7.2.
Pylväiden valmistus ja puhdistus Näiden homopuriinisekvenssien kanssa kolmoiskier-teitä muodostavat oligonukleotidit on kytketty HiTrap-pyl-väisiin esimerkissä 1.1. kuvatulla tavalla. Kysymyksessä 35 on oligonukleotidi, jolla on sekvenssi 23 5'-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (sekvenssi nro 18) plasmi-din pXL2725 puhdistamiseksi, sekä oligonukleotidi, jolla on sekvenssi 5'-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (sekvenssi nro 19) plas-5 midin pXL2726 puhdistamiseksi.
Näillä kahdella tällä tavalla saadulla pylväällä on voitu puhdistaa vastaavia plasmideja esimerkissä 2 kuvatulla tekniikalla käyttäen seuraavia puskureita: F-puskuri: 2M NaCl, 0,2 M asetaatti, pH 4,5.
10 E-puskuri: IM Tris, HC1 pH 9, 0,5 mM EDTA.
Plasmidien pXL2725 ja pXL2726 tapauksessa päästiin vastaavasti saantoihin 23 % ja 31 %.
Esimerkki 8 Tämä esimerkki havainnollistaa plasmidissa läsnä 15 olevan erityisen sekvenssin pituuden vaikutusta puhdistuk sen saantoihin.
Esimerkki 8.1.
Plasmidien muodostus Näissä kokeissa käytetty havaintogeeni keksinnön 20 mukaisten koostumusten aktiivisuuden osoittamiseksi on lusiferaasia koodaava geeni (Luc).
Plasmidi pXL2621 käsittää kasetin, joka sisältää 661 emäsparin suuruisen sytomegaloviruksen (CMVj promoottorin, joka on saatu muodosteesta pcDNA3 (Invitrogen, 25 Corp., San Diego, CA) pilkkomalla restriktioentsyymeillä
MluI ja HindiII, ja joka on kloonattu ennen lusiferaasia koodaavaa geeniä pGL-vektorin MluI- ja HindiII-kohtiin (pGL basic Vector; Promega Corp., Madison, WI) . Tämä plasmidi on muodostettu käyttäen molekyylibiologian standardi-30 tekniikoita.
Plasmidit pXL2727-l ja pXL2727-2 on muodostettu seuraavalla tavalla.
2 μg plasmidia pXL2621 on tehty lineaariseksi entsyymillä BamHI; entsyymi inaktivoitiin käsittelemällä 10 j 35 minuuttia 65 °C:ssa; samanaikaisesti oligonukleotidit 6006 24 ja 6008 hybridisoitiin tavalla, joka on kuvattu plasmidin pXL2563 muodostuksen yhteydessä.
6006: 5 ' -GATCT (GAA) 17CTGAGATCT-3 ' (sekvenssi nro 20) 6008: 5' -GATCAGATCTGCAG (TTC) 17A- 3 ' (sekvenssi nro 21) 5 Tämä hybridisaatioseos kloonattiin plasmidin pXL2621 BamHI-päihin ja DH5of-soluihin transformoinnin jälkeen yhdistelmä-DNA-tekniset kloonit on määritetty analysoimalla restriktioentsyymin PstI avulla, koska nämä oligonukleotidit saavat aikaan PstI-kohdan. Kaksi 10 kloonia otettiin talteen ja kloonatun kappaleen nukleo-tidisekvenssi varmistettiin alukkeen avulla [6282, 5'- ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (sekvenssi nro 22)], joka aluke toimi sekvenssireaktion käynnistäjänä (Viera J. ja J. Messing, 1982, The pUC plasmids, an Ml3mp7-derived system for 15 insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers; pUC-plasmidit, M13mp7-peräinen järjestelmä istutusmutageneesin aikaansaamiseksi ja sekvenssin määrittämiseksi synteettisillä yleisalukkeilla). Gene, 19, 259 -268) .
20 Ensimmäinen klooni (pXL2727-l) sisältää 10 kertaan toistuvan sekvenssin GAA. Toinen klooni (pXL2727-2) sisältää sekvenssin 5 '-GAAGAAGAG (GAA) 7GGAAGAGAA-3 ' (sekvenssi nro 23).
Esimerkki 8.2.
25 Pylväiden valmistus ja puhdistus Tässä käytetään esimerkissä 1 kuvatun kaltaista pylvästä, johon on kytketty oligonukleotidi 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (sekvenssi nro 1).
Plasmidissa pXL2727-l käsittää 14 kertaa toistuvan 30 GAA-sekvenssin. Niinpä edellä kuvattu oligonukleotidi, joka käsittää vain t kertaa toistuvan vastaavan CTT-hybri-disaatiosekvenssin, voi hybridisoitua tähän plasmidiin 8:ssa eri kohdassa. Sitä vastoin plasmidin pXL2727-2 käsittämä hybridi soi tuva (GAA) 7-sekvenssi on yhtä pitkä kuin 35 pylvääseen kiinnitetty oligonukleotidi. Tämä oligonukleo- 25 tidi voi siis hybridisoitua plasmidissa pXL2727-2 vain yhteen asemaan.
Tämä koe on samanlainen kuin esimerkissä kuvattu koe, ja siinä käytettiin seuraavia puskureita: 5 F-puskuri: 2M NaCl, 0,2 M asetaatti, pH 4,5.
E-puskuri: IM Tris, HC1 pH 9, 0,5 mM EDTA.
Puhdistuksen saanto on 29 % plasmidilla pXL2727-l ja 19 % plasmidilla pXL2727-2.
Esimerkki 8.3.
10 Nisäkässolujen in vitro -transfektio Käytetyt solut ovat NIH 3T3-soluja, joita siirros-tetaan koetta edeltävänä päivänä 24 kuoppaa käsittäville viljelylevyille määränä 50 000 solua/kuoppa. Plasmidi laimennetaan 150 mM NaCl-liuoksella ja siihen sekoitetaan 15 RPR115335-lipofektanttia. Lipofektantin positiivisten va rausten ja DNA:n negatiivisten varausten välinen suhde asetetaan arvoon 6. Seosta sekoitetaan pyörittämällä, sen annetaan seisoa 10 minuuttia ympäristön lämpötilassa, se laimennetaan viljelyalustalla, joka ei sisällä sikiövasi-20 kan seerumia, sitten sitä lisätään soluihin määränä, joka on 1 μg DNA:ta viljelykuoppia kohden. Viljelmää pidetään kaksi tuntia 37 °C:ssa, minkä jälkeen siihen lisätään 10 % til./til. sikiövasikan seerumia ja soluja inkuboidaan 48 tuntia 37 °C:ssa olosuhteissa, joissa on läsnä 5 % C02:ta. 25 Solut pestään kahteen kertaan PBS-liuoksella ja lusiferaa-sin aktiivisuus määritetään kuvatulla menetelmällä (rea-genssipakkaus Promega, Promega Corp. Madison, WI) käyttäen luminometriä Lumat LB9501 (EG ja G Berthold, Evry). Esimerkissä 8.2. kuvatulla tavalla puhdistetulla plasmidilla 30 pXL2727-l saavutetut transfektiosaannot ovat kaksi kertaa suurempia kuin saannot, joihin päästään tällä samalla plasmidilla, joka on puhdistettu reagenssipakkauksella Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI).
(1) YLEISET TIEDOT: 26
Sekvenssi1istaus (i) HAKIJA:
(A) NIMI: RHONE-POULENCE RORER
(B) KATU: 20 AVENUE RAYMOND ARON
(C) KAUPUNKI: ANTONY CEDEX
(E) MAA: RANSKA
(F) POSTINUMERO: 92165 (G) PUHELINNUMERO: 40.91.69.22 (H) TELEFAX: 40.91.72.91 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: Kolmoiskierremuodosteen puhdistus ixnmobilisoidulla oligonukleotidilla (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 25 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC -yhteensopiva
(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS
(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, Versio #1.30 (OEB) (2) SEKVENSSIN NRO 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 25 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(Xl) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 1: GA.GGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25 (2) SEKVENSSIN NRO 2 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
: 27 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 2: CTTCCCGAAG GGAGAAAGG 19 (2) SEKVENSSIN NRO 3 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 21 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 3: GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C 21 (2) SEKVENSSIN NRO 4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 13 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 4: GAAAAAGGAA GAG 13 (2) SEKVENSSIN NRO 5 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 5: AAGGGAGGGA GGAGAGGAA 19 (2) SEKVENSSIN NRO 6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 28
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 6: AAGGAGAGGA GGGAGGGAA 19 (2) SEKVENSSIN NRO 7 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 19 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 7: TTGGTGTGGT GGGTGGGTT 19 (2) SEKVENSSIN NRO 8 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 8: AAAAAAGGGA ATAAGGG 17 (2) SEKVENSSIN NRO 9 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 9: GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGG 58 (2) SEKVENSSIN NRO 10 TIEDOT: 29 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 10: AA.TTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCG 58 (2) SEKVENSSIN NRO 11 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 11: TGACCGGCAG CAAAATG 17 (2) SEKVENSSIN NRO 12 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(ix) OMINAISPIIRTEET: (D) MUUT TIEDOT: sekvenssin kaikki sytosiinit C ovat metyloituneet (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 12: GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25 (2) SEKVENSSIN NRO 13 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: 1ineaarinen 30
(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 13: GATCCGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGGG 58 (2) SEKVENSSIN NRO 14 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA ; (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 14: AATTCCCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCG 58 (2) SEKVENSSIN NRO 15 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 15: GATCCGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGG 58 (2) SEKVENSSIN NRO 16 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 16: AATTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCTCC TCCTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCG 58 (2) SEKVENSSIN NRO 17 TIEDOT: 31 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 58 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 17: GGAGAGGAGG AGGAGGAGGÄ GGAGGAGGÄG GAGGAGGÄGG AGGAGGA.GGA 50 (2) SEKVENSSIN NRO 18 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 25 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 18: AATGCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCT 25 (2) SEKVENSSIN NRO 19 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 26 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 19: AGTGCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCT 26 (2) SEKVENSSIN NRO 20 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 66 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
32 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 20: GATCTGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAACTGC 60 AGATCT 66 (2) SEKVENSSIN NRO 21 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 66 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 21: GATCAGATCT GCAGTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT 60 TCTTCA 66 (2) SEKVENSSIN NRO 22 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 21 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 22: ACAGTCATAA GTGCGGCGAC G 21 (2) SEKVENSSIN NRO 23 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 39 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 23: GAAGAAGAGG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GGAAGAGAA 39 (2) SEKVENSSIN NRO 24 TIEDOT: 33 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 24: CCGAATTCTG GGGACCAAAG CAGTTTC 27 (2) SEKVENSSIN NRO 25 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 27 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: yksinkertainen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(i i) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI NRO 25: CCAAGCTTCA CTGTTCACGA CGGGTGT 27
Claims (31)
1. Menetelmä rengasmaiseen kaksijuosteiseen DNA:han perustuvan lääkkeen valmistamiseksi, tunnettu siitä, et- 5 tä se käsittää vähintään yhden sellaisen puhdistusvaiheen, jossa liuos, joka sisältää tätä DNA:ta muihin komponentteihin sekoittuneena, johdetaan kromatografisen kantajan läpi, johon kantajaan on kytketty kovalenttisesti oligonukleotidi, joka kykenee muodostamaan hybridisaation avulla kolmoiskier- 10 teen tässä DNArssa läsnä olevan erityisen homopuriini/homo-pyrimidiini-sekvenssin kanssa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittua DNA:ta sisältävä liuos on so-luhajote.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että soluhajote on kirkas hajote.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tämä kaksijuosteinen DNA on puhdistettu alustavasti.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että erityinen sekvenssi on istutettu keinotekoisesti kaksijuosteiseen DNA:han.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oligonukleotidi käsittää poly-CTT- 25 sekvenssin ja DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi on poly- GAA-sekvenssi.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oligonukleotidilla on sekvenssi GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (sekvenssi nro 1).
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että oligonukleotidilla on sekvenssi (CTT)7 (sekvenssi nro 26).
9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA:ssa läsnä oleva erityinen sek- 35 venssi käsittää sekvenssin (GAA) 7, (GAA) i4 tai (GAA)l7. j
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi käsittää sekvenssin nro 5 ja oligonukleotidi käsittää sekvenssin nro 6 tai sekvenssin nro 7.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi käsittää sekvenssin nro 17 ja oligonukleotidi käsittää sekvenssin nro 18.
12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun- 10 nettu siitä, että DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi käsittää sekvenssin (GA)25 ja oligonukleotidi käsittää sekvenssin nro 19.
13. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erityinen sekvenssi on kak- 15 sijuosteisessa DNA:ssa luontaisesti läsnä oleva erityinen sekvenssi.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA:ssa luontaisesti läsnä oleva erityinen sekvenssi on plasmidin replikaation alkamiskohdassa 20 läsnä oleva homopuriini-homopyrimidiini-sekvenssi.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erityinen DNA-sekvenssi käsittää kokonaisuudessaan E. coli ColEl:n replikaation alkamiskohdassa sijaitsevan sekvenssin nro 2 tai sen osan.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että oligonukleotidi käsittää sekvenssin nro 3.
17. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erityinen DNA-sekvenssi käsittää koko- 30 naisuudessaan plasmidin pBR322 β-laktamaasigeenissä sijait sevan sekvenssin nro 4 tai sekvenssin nro 8, tai sen osan.
18. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oligonukleotidi on kytketty kromatografiseen kantajaan disulfidi-, tioeette- 35 ri-, esteri-, amidi- tai amiinisidoksella.
19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että oligonukleotidi on kiinnitetty kromatografiseen kantajaan hiiliketjusta (CH2)n, missä n on alueella 1 - 18 oleva kokonaisluku, rajat mukaan lukien, koostuvan 5 sivuryhmän välityksellä, ja että tämä sivuryhmä liittyy oli-gonukleotidiin fosfaatin välityksellä ja pylvääseen ami-disidoksella.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sivuryhmä koostuu 6 hiiliatomia käsit- 10 tävästä lineaarisesta hiiliketjusta.
21. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sivuryhmä koostuu 12 hiiliatomia käsittävästä lineaarisesta hiiliketjusta.
22. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mu- 15 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että oligonukleotidis- sa on vähintään yksi kemiallinen muokkaus, jonka saa tässä oligonukleotidissa aikaan nukleaasien vastustuskyvyn tai joka suojaa oligonukleotidia nukleaaseilta tai parantaa sen affiniteettia erityisen sekvenssin suhteen.
23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että oligonukleotidi käsittää homopyrimi-diinisekvenssin, jossa vähintään yksi sytosiineistä on mety-loitunut.
24. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mu- 25 kainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA käsittää li säksi yhden tai useamman terapeuttisesti mielenkiintoisen sekvenssin.
25. Jonkin edellä esitetyn patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaksi juos teinen
26. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kaksijuosteisessa DNA:ssa läsnä oleva erityinen sekvenssi käsittää lukuisia asemia oligonukleoti-diin hybridisoitumiseksi. \
27. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromosomaalisen DNA:n pitoisuus lääkkeessä on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,5 %.
28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen menetelmä, tun-5 nettu siitä, että kromosomaalisen DNA:n pitoisuus lääkkeessä on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,2 %.
29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromosomaalisen DNA:n pitoisuus lääkkeessä on pienempi tai yhtä suuri kuin 0,1 %.
30. Menetelmä kaksijuosteisen ENA:n puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään yhden sellaisen vaiheen, jossa liuos, joka sisältää tätä RNA:ta muihin komponentteihin sekoittuneena, johdetaan kromatografisen kantajan läpi, johon kantajaan on kytketty kovalenttisesti 15 oligonukleotidi, joka kykenee muodostamaan hybridisaation avulla kolmoiskierteen tässä RNA:ssa läsnä olevan erityisen sekvenssin kanssa.
30 DNA on rengasmainen DNA, kuten plasmidi.
31. Menetelmä plasmidi-DNA:n puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vähintään yhden sellaisen 20 vaiheen, jossa liuos, joka sisältää tätä DNA:ta muihin komponentteihin sekoittuneena, johdetaan kromatografisen kantajan läpi, johon kantajaan on kytketty kovalenttisesti oligonukleotidi, joka kykenee muodostamaan hybridisaation avulla kolmoiskierteen tässä DNA:ssa läsnä olevan erityisen homopu-25 riini/homopyrimidiini-sekvenssin kanssa.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9415162 | 1994-12-16 | ||
| FR9415162A FR2728264B1 (fr) | 1994-12-16 | 1994-12-16 | Purification d'adn par formation de triple helice avec un oligonucleotide immobilise |
| FR9501468 | 1995-02-03 | ||
| PCT/FR1995/001468 WO1996018744A2 (fr) | 1994-12-16 | 1995-11-08 | Purification d'adn par formation de triple helice avec un oligonucleotide immobilise |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI972526L FI972526L (fi) | 1997-06-13 |
| FI972526A0 FI972526A0 (fi) | 1997-06-13 |
| FI120836B true FI120836B (fi) | 2010-03-31 |
Family
ID=9469865
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI972526A FI120836B (fi) | 1994-12-16 | 1997-06-13 | Kolmoiskierremuodosteen puhdistus immobilisoidulla oligonukleotidilla |
Country Status (31)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6287762B1 (fi) |
| EP (2) | EP1281774B1 (fi) |
| JP (2) | JPH10510427A (fi) |
| KR (1) | KR100431163B1 (fi) |
| CN (1) | CN100591776C (fi) |
| AT (1) | ATE233825T1 (fi) |
| AU (1) | AU715630B2 (fi) |
| BG (1) | BG64198B1 (fi) |
| BR (1) | BR9510089A (fi) |
| CA (1) | CA2208245C (fi) |
| CY (1) | CY1110372T1 (fi) |
| CZ (1) | CZ295474B6 (fi) |
| DE (1) | DE69529842T2 (fi) |
| DK (1) | DK0797682T3 (fi) |
| ES (2) | ES2446983T3 (fi) |
| FI (1) | FI120836B (fi) |
| FR (1) | FR2728264B1 (fi) |
| HU (1) | HU221062B1 (fi) |
| IL (2) | IL116398A (fi) |
| MX (1) | MX9703670A (fi) |
| NO (1) | NO320428B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ297023A (fi) |
| PL (1) | PL184430B1 (fi) |
| PT (1) | PT797682E (fi) |
| RO (1) | RO116970B1 (fi) |
| RU (1) | RU2174125C2 (fi) |
| SK (2) | SK288366B6 (fi) |
| TW (1) | TW459043B (fi) |
| UA (1) | UA72421C2 (fi) |
| WO (1) | WO1996018744A2 (fi) |
| ZA (1) | ZA9510756B (fi) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7038026B2 (en) | 2000-05-26 | 2006-05-02 | Centelion | Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide |
| DE19806962B4 (de) * | 1997-02-22 | 2004-08-05 | Universität Heidelberg | Markierung von Nukleinsäuren mit speziellen Probengemischen |
| US20030105040A1 (en) * | 2001-11-13 | 2003-06-05 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of inhibitor-kappa B-R expression |
| JP2002535987A (ja) * | 1999-02-04 | 2002-10-29 | インヴィトロゲン・コーポレーション | 核酸分子の単離 |
| US7052844B2 (en) * | 1999-12-21 | 2006-05-30 | Ingeneus, Inc. | Purification of DS-DNA using heteropolymeric capture probes and a triplex, quadruplex or homologous duplex binding mechanism |
| KR100853040B1 (ko) * | 2000-05-26 | 2008-08-19 | 센텔리옹 에스아에스 | 고정된 올리고뉴클레오타이드로 삼중나선 형성의 정제방법 |
| US20060008817A1 (en) | 2000-12-08 | 2006-01-12 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for generating recombinant nucleic acid molecules |
| DE10104025B4 (de) * | 2001-01-31 | 2008-07-10 | Qiagen North American Holdings, Inc. | Verfahren zur Aufreinigung und anschließenden Amplifikation von Doppelstrang-DNA |
| CN1498276A (zh) * | 2001-03-23 | 2004-05-19 | ��������I�����ɷ� | 通过三螺旋相互作用纯化与检测双链dna靶序列的方法 |
| FR2822476B1 (fr) * | 2001-03-23 | 2004-04-02 | Aventis Pharma Sa | Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice |
| KR100790764B1 (ko) | 2002-11-12 | 2008-01-03 | 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코포레이션 | 조혈세포 집단에서 정지세포를 증대시키는 방법 |
| NZ545449A (en) * | 2003-09-17 | 2009-07-31 | Centelion Formerly Gencell Sas | Device and Method of preparation of pharmaceutical grade plasmid DNA |
| DE602005018166D1 (de) | 2004-02-12 | 2010-01-21 | Population Genetics Technologi | Genetische analyse mittels sequenzspezifischem sortieren |
| PL1737945T3 (pl) | 2004-04-19 | 2011-07-29 | Aventis Pharma Sa | Sposób oczyszczania plazmidowego DNA |
| EA010576B1 (ru) * | 2004-04-19 | 2008-10-30 | Сентельон | Способ очистки плазмидной днк |
| AU2005280356B2 (en) | 2004-08-16 | 2008-09-25 | Clague P. Hodgson | Improved strains of E. coli for plasmid DNA production |
| US7407757B2 (en) * | 2005-02-10 | 2008-08-05 | Population Genetics Technologies | Genetic analysis by sequence-specific sorting |
| CN105316314B (zh) * | 2014-07-29 | 2018-07-27 | 深圳新诺微环生物科技有限公司 | 一种高纯度的微环dna及其制备方法和应用 |
| EP3601617B3 (en) * | 2017-03-24 | 2024-03-20 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2540122B1 (fr) * | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
| US5166315A (en) * | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
| US4766072A (en) * | 1985-07-17 | 1988-08-23 | Promega Corporation | Vectors for in vitro production of RNA copies of either strand of a cloned DNA sequence |
| US5665541A (en) | 1986-10-28 | 1997-09-09 | The Johns Hopkins University | Formation of triple helix complexes for the detection of double stranded DNA sequences using oligomers which comprise an 8-modified purine base |
| JPH02501353A (ja) | 1987-09-17 | 1990-05-17 | アプリジン | 少なくとも１つの自然または合成ｄｎａ片を含有する分子の結合または分離法 |
| US5352578A (en) | 1989-02-15 | 1994-10-04 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Method of separating oligonucleotides from a mixture |
| AU5269590A (en) | 1989-03-10 | 1990-10-09 | Gene-Trak Systems | Immobilized oligonucleotide probes and uses therefor |
| CA2015515C (en) * | 1990-01-03 | 1999-12-07 | Jean-Marie Saint-Remy | Pharmaceutical compositions containing antigen-antibody complexes and uses therefor |
| AU9094991A (en) * | 1990-11-23 | 1992-06-25 | Gilead Sciences, Inc. | Triplex-forming oligomers containing modified bases |
| WO1992011390A1 (en) * | 1990-12-17 | 1992-07-09 | Idexx Laboratories, Inc. | Nucleic acid sequence detection by triple helix formation |
| WO1992013963A1 (en) | 1991-01-30 | 1992-08-20 | Hyman Edward D | Method for preparation of closed circular dna |
| WO1992018647A1 (fr) | 1991-04-15 | 1992-10-29 | Sumitomo Electric Industries, Ltd. | Procede de separation ou d'extraction d'acide nucleique a partir d'un echantillon contenant celui-ci |
| DE69231003T2 (de) | 1991-12-24 | 2000-10-19 | Tepnel Medical Ltd., Manchester | Manipulation von nukleinsäuresequenzen |
| WO1994000600A1 (en) | 1992-06-25 | 1994-01-06 | Microprobe Corporation | Solid supports for nucleic acid hybridization assays |
| US5401632A (en) | 1992-07-16 | 1995-03-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Triple helix purification and sequencing |
| WO1994017086A1 (en) * | 1993-01-25 | 1994-08-04 | Apollon, Inc. | Gene regulation by targeting putative intramolecular triple helix |
-
1994
- 1994-12-16 FR FR9415162A patent/FR2728264B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-08-11 UA UA97062835A patent/UA72421C2/uk unknown
- 1995-11-08 BR BR9510089A patent/BR9510089A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-11-08 SK SK5104-2008A patent/SK288366B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-11-08 RU RU97111878/1497111878/14A patent/RU2174125C2/ru active
- 1995-11-08 MX MX9703670A patent/MX9703670A/es unknown
- 1995-11-08 NZ NZ297023A patent/NZ297023A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-11-08 CZ CZ19971858A patent/CZ295474B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-11-08 PL PL95320697A patent/PL184430B1/pl unknown
- 1995-11-08 ES ES02012081.2T patent/ES2446983T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 SK SK756-97A patent/SK286956B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1995-11-08 JP JP8518319A patent/JPH10510427A/ja active Pending
- 1995-11-08 AT AT95940285T patent/ATE233825T1/de active
- 1995-11-08 EP EP02012081.2A patent/EP1281774B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 US US08/860,038 patent/US6287762B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 AU AU41789/96A patent/AU715630B2/en not_active Expired
- 1995-11-08 EP EP95940285A patent/EP0797682B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 HU HU9701886A patent/HU221062B1/hu unknown
- 1995-11-08 ES ES95940285T patent/ES2197928T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 CN CN95196817A patent/CN100591776C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 PT PT95940285T patent/PT797682E/pt unknown
- 1995-11-08 DK DK95940285T patent/DK0797682T3/da active
- 1995-11-08 CA CA2208245A patent/CA2208245C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 WO PCT/FR1995/001468 patent/WO1996018744A2/fr not_active Ceased
- 1995-11-08 RO RO97-01102A patent/RO116970B1/ro unknown
- 1995-11-08 KR KR1019970703997A patent/KR100431163B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-08 DE DE69529842T patent/DE69529842T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-12-14 IL IL116398A patent/IL116398A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-12-14 IL IL171488A patent/IL171488A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-12-16 TW TW084113451A patent/TW459043B/zh not_active IP Right Cessation
- 1995-12-18 ZA ZA9510756A patent/ZA9510756B/xx unknown
-
1997
- 1997-06-12 NO NO19972710A patent/NO320428B1/no not_active IP Right Cessation
- 1997-06-13 FI FI972526A patent/FI120836B/fi not_active IP Right Cessation
- 1997-06-16 BG BG101620A patent/BG64198B1/bg unknown
-
2000
- 2000-05-26 US US09/580,923 patent/US6319672B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-03-07 CY CY20081100271T patent/CY1110372T1/el unknown
- 2008-10-16 JP JP2008267538A patent/JP2009045070A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI120836B (fi) | Kolmoiskierremuodosteen puhdistus immobilisoidulla oligonukleotidilla | |
| US8399636B2 (en) | Purification of a triple helix formation with an immobilized obligonucleotide | |
| AU2007202804B2 (en) | Purification of a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide | |
| AU2001263459A1 (en) | Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide | |
| IL152860A (en) | Purification of dna by a triple helix formation with an immobilized oligonucleotide |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Ref document number: 120836 Country of ref document: FI |
|
| MA | Patent expired |