DE69231003T2

DE69231003T2 - Manipulation von nukleinsäuresequenzen

Info

Publication number: DE69231003T2
Application number: DE69231003T
Authority: DE
Inventors: Stephen Minter
Original assignee: Tepnel Medical Ltd
Current assignee: Tepnel Medical Ltd
Priority date: 1991-12-24
Filing date: 1992-12-23
Publication date: 2000-10-19
Anticipated expiration: 2012-12-24
Also published as: FI943054A7; BR9206985A; AU679903B2; NO942399L; NZ246203A; NO942399D0; EP0620863A1; EP0620863B1; FI943054A0; CA2126748A1; OA10068A; AU3169493A; WO1993013220A1; KR940703927A; JPH07502405A; DE69231003D1; ATE192503T1; FI943054L; RU2186852C2; RU94031166A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Methode und eine Einrichtung zur Ausführung von Manipulationen an Nucleinsäuresequenzen unter Zuhilfenahme eines festen Trägersystems, sowie auf Träger zur Verwendung bei der Methode und der Einrichtung.
Es sind verschiedene Vorgehensweisen für das Manipulieren von Nucleinsäuresequenzen bekannt. Beispielsweise wird in EP-A-0 200 362 (Cetus) ein Flüssigphasenverfahren für die Amplifikation, das Erfassen und/oder das Klonieren von Nucleinsäuresequenzen beschrieben. Das Verfahren umfaßt folgende Schritte
(i) das Behandeln einzelner komplementärer Stränge der Nucleinsäuresequenz mit zwei Oligonucleotidprimern, wobei jeder der beiden an einen der Stränge hybridisiert;
(ii) Verlängern der Primer zur Bildung von Doppelstrang- Nucleinsäuresequenzen;
(iii) Denaturieren des Produkts aus (ii) zur Bildung von Einzelsträngen der Nucleinsäure; und
(iv) Verwendung der Einzelstränge aus (iii) bei der Wiederholung der Schritte (i) -(iii), wobei das Verfahren insgesamt so oft wie nötig wiederholt wird.
Es ist ein charakteristisches Merkmal dieses Stands der Technik, daß beide komplementären Stränge als Matrizen für den zweiten und die weiteren Amplifikationsschritte verwendet werden. Des weiteren umfaßt bei der Methode der EP-A-0 200 362 die Reaktandenmischung unhybridisierte Zielnucleinsäure, ein unhybridisiertes Kopieziel und unhybridisierten Primer, wodurch das System sehr ineffizient wird. Außerdem führt ein beim Kopieren, gleichgültig in welcher Stufe, unterlaufender Fehler dazu, daß der Fehler in die "Kettenreaktion" kopiert wird.
Amplifikationsverfahren unter Verwendung von Festphasenträgersystemen sind ebenfalls bekannt, beispielsweise DYNAL (Warenzeichen)-Magnetperlen, wie sie in EP-A-0 091 453 und EP-A-0 106 873 geoffenbart werden. Bei der Verwendung derartiger Perlen wird die DNA auf eine Magnetperle synthetisiert und daraufhin durch Ammoniumhydroxid davon abgespalten. Die Perlen können dann mit Hilfe eines Magnets von der synthetisierten DNA getrennt werden. Als Alternative kann Biotin an ein Ende einer synthetisierten oder natürlichen DNA- Sequenz angelagert und die Sequenz mit Hilfe einer Magnetperle isoliert werden, die an Streptavidin vorkonjugiert worden ist (wodurch das Biotin angezogen wird unter Abtrennen der DNA). Eine Schwierigkeit bei dieser Art von festem Träger besteht darin, daß die Biotin-Streptavidin-Verknüpfung biologisch abbaubar ist.
Andere bekannte feste Trägersysteme sind unter anderem die porenhaltigen Siliciumdioxide. Die Anwesenheit der Poren kann zu Problemen führen, da innerhalb der Poren ein Nucleotidkettenwachstum stattfindet, was zu ineffizientem Waschen und auch dazu führt, daß Reste innerhalb der Poren verbleiben, was wiederum die Ausbeute reduziert und zu relativ ineffizienten Kupplungsvorgängen führt.
In EP-A-0 184 056 wird eine Methode für die Herstellung von DNA-Sonden in großem Maßstab unter Verwendung eines festen Substrats beschrieben. Das Verfahren dieser Beschreibung des Stands der Technik umfaßt das kovalente Anknüpfen, an ein festes Substrat, eines Polynucleotids, das der herzustellenden Sonde komplementär ist, gefolgt vom Hybridisieren des Polynucleotids mit einem Oligonucleotid, das als Primer wirkt. Das Oligonucleotid wird daraufhin in einer vom Substrat abgewendeten Richtung verlängert (unter Zuhilfenahme des Polynucleotids als Matrize) unter Bildung einer verlängerten Sequenz, die dem gebundenen Polynucleotid komplementär ist. Das hybridisierte Polynucleotid und das verlängerte Oligonucleotid werden daraufhin denaturiert, um das verlängerte Oligonucleotid aus dem festen Substrat zum Zwecke des Einsammelns freizusetzen. Das verlängerte Oligonucleotid kann als Analysensonde verwendet werden. So kann es sich bei dem ursprünglich an den Träger gebundenen Oligonucleotid um ein Gen handeln und das verlängerte Oligonucleotid kann als Sonde für das Erfassen des Vorliegens des Gens in einer biologischen Probe benutzt werden.
Die in EP-A-0 184 056 beschriebene Methode ist jedoch mit einer Reihe von Nachteilen behaftet. Insbesondere werden in dem Fall, in dem das an den Träger zu bindende Polynucleotid nicht "rein" ist und andere Polynucleotide enthält, diese ebenfalls an den Träger gebunden. Dadurch kann das Oligonucleotid auch an diese anderen Polynucleotide hybridisieren, so daß das schließlich erhaltene verlängerte Oligonucleotid in der Tat aus einer Mischung von Produkten bestehen kann. Aus diesem Grund ist diese Methode für die Herstellung "reiner" Proben von Nucleinsäure nicht besonders vorteilhaft.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die oben erwähnten Nachteile zu umgehen oder zu mildern.
Einer ersten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung gemäß, wird eine Methode bereitgestellt zur Ausführung einer Manipulation einer Nucleinsäuresequenz, wobei die Methode folgende Schritte umfaßt:
(a) Bereitstellen in einem Durchlaufgefäß eines festen Trägersystems, an das ein einzelsträngiges Oligonucleotid kovalent gebunden ist, das eine Sequenz von Basen aufweist, die einem Teil der Sequenz einer bestimmten, eine höhere Anzahl von Basen als das Oligonucleotid aufweisenden Zielnucleinsäure komplementär ist, wobei die Oligonucleotide für die Zielnucleinsäure spezifisch sind,
(b) Anlagern einer Quelle einer einzelsträngigen Zielnucleinsäure an das feste Trägersystem,
(c) Hybridisieren der Zielnucleinsäure an das Oligonucleotid,
(d) Bewirken eines Durchlaufwaschens des Trägers nach der Hybridisierung zur Entfernung jeglicher nicht hybridisierter Zielnucleinsäure in dem Trägersystem, wobei eine reine Probe der Zielnucleinsäure an dem festen Trägersystem bereitgestellt wird, und
(e) Durchführen an der an dem Träger immobilisierten Zielnucleinsäure in dem Durchlaufgefäß einer Manipulation, die unter dem Kopieren der, der Denaturierung der und/oder der Hybridisierung an die Zielnucleinsäure ausgewählt wird.
Die obige Methode führt dazu, daß die Zielnucleinsäure selektiv an das Oligonucleotid auf dem Träger hybridisiert wird. Eventuelle, in dem System vorliegende Verunreinigungen (z. B. diejenigen, die in der die Zielnucleinsäure enthaltenden Probe eingeführt werden) können durch Waschen entfernt werden unter Hinterlassen einer "reinen" Probe der Zielnucleinsäure, an der die Manipulation ausgeführt werden kann. Das Waschen findet bei einer Temperatur statt, bei der die Zielnucleinsäure nicht vom Oligonucleotid abschmilzt.
Bei der Zielnucleinsäure kann es sich beispielsweise um eine gereinigte oder ungereinigte, native oder synthetisierte Nucleinsäure handeln. Die Zielsäure kann aus irgendeiner DNA- oder RNA-Sequenz aus viraler, bakterieller, tierischer oder pflanzlicher Quelle bestehen.
Das an den Träger gebundene Oligonucleotid umfaßt im allgemeinen mindestens 8 Nucleotide. Typischerweise umfaßt das daran anzuhybridisierende Polynucleotid 1000 bis 2000 Basen und ist wesentlich länger als das Oligonucleotid.
Das Oligonucleotid kann durch Reaktion zwischen geeigneten, auf dem Träger bereitgestellten, reaktionsfähigen Gruppen und dem Oligonucleotid an den Träger gebunden werden. Alternativ kann das Oligonucleotid in situ auf dem Träger synthetisiert werden.
Das Oligonucleotid kann in der 3'→ 5' oder in der 5' → 3'-Orientierung auf den festen Träger gebunden werden.
Vor dem Hybridisierungsschritt (c) werden alle schützenden Gruppen auf dem Oligonucleotid entfernt.
Bei der erfindungsgemäßen Methode wird die einsträngige Zielnucleinsäure an das an den Träger gebundene Oligonucleotid hybridisiert. Die Oligonucleotidsequenz ist für die zu hybridisierende Zielnucleinsäure sehr spezifisch. Aus diesem Grund kann die Hybridisierung bei einer Temperatur durchgeführt werden, die für die Hybridisierung zwischen dem Oligonucleotid und der Zielsäure spezifisch ist. Die Hybridisierung der Zielnucleinsäure an das Oligonucleotid auf dem Träger wird idealerweise bei einer Temperatur durchgeführt, die gerade (z. B. 1-3ºC) unterhalb der Temperatur (Tm) liegt, bei der die Zielnucleinsäure von dem Oligonucleotid "abschmilzt". In der Regel kann Tm aus der folgenden im Stand der Technik bekannten, als Richtlinie dienenden Formel
Tm 2 (A + T) + 3(G + C)
berechnet werden, in der A, T, G und C jeweils die Anzahl der Adenin-, Thymin-, Guanin- und Cytosinreste, die in dem an den Träger gebundenen Oligonucleotid vorliegen, darstellen. Die Formel ist gewöhnlich auf Sequenzen von bis zu ca. 30 Nucleotiden anwendbar. Nach dem Hybridisierungsschritt kann der Träger bei einer Temperatur gewaschen werden, die geringfügig unter Tm liegt, wobei jegliche nicht reassoziierte Zielsäure und Verunreinigungen (z. B. Proteine oder unerwünschte Nucleinsäuresequenzen) entfernt werden. Es ist dadurch möglich, eine Mischung von Polynucleotiden (wie sie in einer biologischen Probe vorliegen kann) an das feste Trägersystem anzulagern, es wird jedoch nur das spezifische Polynucleotid, das von Interesse ist (z. B. die Zielsäure) auf dem Träger zurückgehalten. Nach dem Waschen ist es daher möglich, Manipulationen des Polynucleotids an einer "reinen" Probe desselben durchzuführen.
Es ist möglich, aufeinanderfolgende Manipulationen an der hybridisierten Zielnucleinsäure durchzuführen. Als Alternative kann eine anfängliche Manipulation zur Bildung einer Kopie der an den Träger gebundenen Zielsäure durchgeführt werden. Diese Kopie wird dann für darauffolgende Manipulationsvorgänge verwendet.
Zwischen den einzelnen Manipulationen kann der Träger der Notwendigkeit entsprechend gewaschen werden, um Verunreinigungen zu entfernen und Produkt kann daraufhin den Erfordernissen entsprechend eingesammelt werden. Nach einem weiteren Waschen des Trägers (falls erforderlich) kann die Manipulation wiederholt werden.
Die Manipulation kann beispielsweise das Kopieren, die Amplifikation der Zielnucleinsäuresequenz, die Transkription in vitro oder die Reinigung der DNA- Bindeproteine umfassen. Die Manipulation kann auch dem Erfassen des Vorliegens von Zielsäure durch Prüfen auf die Hybridisierung eines markierten Primers an die Zielsäure dienen.
Manipulationen an der Polynucleotidsequenz können durch im Stand der Technik bekannte Vorgehensweisen durchgeführt werden. Beispielsweise können DNA-Polymerase I, Klenow-Fragmente derselben, wärmestabile Polymerase oder Reverstranskriptase zusammen mit Deoxynucleotidtriphosphaten und/oder Dideoxynucleotidtriphosphaten je nach Zweckmäßigkeit bei den (unten beschriebenen) Manipulationsprozessen verwendet werden. Die Nucleotide können, falls erwünscht, beispielsweise mit ³&sup5;S ³²P, Chromophoren, Biotin oder irgendwelchen anderen wahlweisen biologischen Markern gelabelt werden.
Die erfindungsgemäße Methode ist für die Analyse von Proben (z. B. medizinischen Proben) zum Erfassen des Vorliegens (oder Nichtvorliegens) einer bestimmten Nucleinsäure besonders nützlich. Handelt es sich beispielsweise um eine Probe, die auf einen Gesundheitszustand hin untersucht wird, bei der eine relativ große Menge einer bestimmten Nucleinsäure (der Zielsäure) vorliegt, kann die Erfassung der Zielsäure wie folgt durchgeführt werden. Nachdem die Zielsäure (falls sie vorliegt) an den Träger hybridisiert und letzterer gewaschen worden ist, um eine "reine" Probe der Zielnucleinsäure zu hinterlassen, wird ein gelabelter Oligonucleotidprimer, von dem bekannt ist, daß er einer Sequenz auf der Zielsäure komplementär ist, dem Träger unter Bedingungen angelagert, unter denen der Primer an die Zielsäure hybridisiert. Das Label kann beispielsweise aus einem radioaktiven Label, einem Chromophor oder einem mit dem Reaktanden verknüpften Enzym bestehen. Der Träger wird dann zur Entfernung von nicht reassoziiertem Primer gewaschen, wobei das Waschen bei einer Temperatur erfolgt, die unterhalb derjenigen liegt, bei der der an die Zielnucleinsäure hybridisierte Primer von der Zielsäure "abgeschmolzen" wird. Daraufhin kann die Temperatur des Trägers erhöht werden, um den hybridisierten Primer (mit oder ohne Ziel-DNA) abzuschmelzen. Daraufhin kann ein Detektor verwendet werden, um die Anwesenheit des Primers festzustellen. Wird Primer festgestellt, so ist dies eine Bestätigung, daß die Zielnucleinsäure in der Probe vorgelegen hatte.
Handelt es sich bei der Probe jedoch um eine, die wahrscheinlicherweise nur eine relativ geringe Menge der Zielnucleinsäure enthält, so können wiederholte Amplifikationsreaktionen (siehe unten) ausgeführt werden (wobei eine jede gelabelte Kopien des amplifizierten Produkts bildet, wenn die ursprünglich vermutete Zielsäure vorgelegen hatte). Es kann dann eine Erfassungsoperation durchgeführt werden, um festzustellen, ob ein gelabeltes Amplifikationsprodukt gebildet worden ist. Ist dies der Fall, so stellt dies eine Bestätigung dafür dar, daß die ursprünglich vermutete Zielsäure vorgelegen hatte. Man sollte sich natürlich im Klaren darüber sein, daß eine jegliche erwünschte Anzahl von Amplifikationen durchgeführt werden können, so daß der Test sehr empfindlich eingestellt werden kann, was die Möglichkeit anbetrifft, die Anwesenheit sehr geringer Mengen der Zielsäure in der ursprünglichen Probe zu bestimmen.
Es ist ein wesentliches Merkmal der Erfindung, daß die Erfassung des Vorliegens der Zielsäure in der ursprünglichen Probe ohne die Notwendigkeit der Trennung von Produkten auf Gelen durchgeführt werden kann.
Erfindungsgemäß wird der Träger in einem Durchlaufgefäß (z. B. einer Säule) bereitgestellt, was das Waschen des Trägers sowie die darauffolgende Manipulation erleichtert, wie aus der folgenden Beschreibung zu entnehmen ist.
Die Verwendung eines Durchlaufgefäßes ist ein wichtiges charakteristisches Merkmal und einer zweiten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung gemäß wird daher ein Durchlaufgefäß bereitgestellt, das einen Einlaß und einen Auslaß aufweist und ein festes Trägersystem enthält, an das ein einzelsträngiges Oligonucleotid durch basenstabile Verknüpfungen kovalent gebunden ist, das eine Sequenz von Basen aufweist, die einem Teil der Sequenz einer bestimmten, eine höhere Anzahl von Basen als das Oligonucleotid aufweisenden Zielnucleinsäure komplementär ist, wobei das Oligonucleotid für die Zielnucleinsäure spezifisch ist, wobei das Gefäß porenhaltige Rückhalteelemente aufweist zum Zurückhalten der Teilchen in dem Gefäß.
Das Gefäß kann beispielsweise eine Größe von 150-250 ul aufweisen.
Die Manipulation kann unter Zuhilfenahme einer Einrichtung (in der sich das Durchlaufgefäß befindet) für die Speisung von Reaktandenlösungen zum Gefäß und für das Einsammeln und Erfassen des Manipulationsprodukts durchgeführt werden.
Einer dritten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung gemäß, wird eine Einrichtung bereitgestellt für die Ausführung einer Manipulation an einer Nucleinsäuresequenz, die folgendes umfaßt:
ein Durchlaufgefäß, das mit einem festen Trägersystem ausgestattet ist, an das durch basenstabile Verknüpfungen ein einzelsträngiges Oligonucleotid kovalent gebunden ist, das eine Sequenz von Basen aufweist, die einem Teil der Sequenz einer bestimmten, eine höhere Anzahl von Basen als das Oligonucleotid aufweisenden Zielnucleinsäure komplementär ist, wobei das Oligonucleotid für die Zielnucleinsäure spezifisch ist,
eine Lagervorrichtung für das Lagern von Lösungen, die während des Waschens oder anderen Vorgängen aus dem Gefäß entfernt worden sind, bevor sie in das Gefäß zurückgegeben werden,
eine Detektorvorrichtung für das Erfassen von Nucleinsäuremanipulationsprodukten und eine Regelvorrichtung für das Umleiten von Lösungen in das und aus dem Gefäß, in Abfallstoff oder Lagerbereiche und zu der Detektorvorrichtung.
Bei einer bevorzugten Form der Einrichtung kann der Auslaß des Gefäßes wahlweise mit (i) einem Reagenslagerbereich; (ii) einem Manipulationsprodukt- Erfassungsbereich und (iii) einem Abfallstoffauslaß verbunden sein. Der Reagenseinsammelbereich ermöglicht es ursprünglich dem Gefäß durch den Einlaß desselben zugespeiste Reagenslösung an den Reagenseinsammelbereich zu leiten für das darauffolgende Zurückführen zu dem Gefäß, wo wiederholte Manipulationen an der gleichen Zielnucleinsäure (oder Kopien derselben) ausgeführt werden sollen. Produkt aus jedem Manipulationsvorgang kann daraufhin zu dem Erfassungsbereich für Erfassungszwecke weitergeleitet werden. Falls erwünscht, kann die Einrichtung derart gestaltet sein, daß das Produkt aufeinanderfolgender Manipulationen vor dem Weiterleiten an den Detektor eingesammelt wird.
Die Einrichtung umfaßt natürlich geeignete Ventilmittel (z. B. durch Magnetspule betätigte Ventile) damit Lösungen, Produkt usw. (bevorzugt unter Gasdruck) durch die Einrichtung befördert werden können.
Der feste Träger kann porenfreie Teilchen umfassen, die eine Größe von 100- 200 um (Mikrometern) aufweisen. Die Verwendung eines porenfreien Materials ist besonders vorteilhaft, da dadurch gewisse Probleme vermieden werden, die mit im Stand der Technik verwendeten porenhaltigen Trägern verbunden sind, nämlich das Wachstum von Nucleotidketten innerhalb der Poren, was zu ineffizientem Waschen sowie dazu führt, daß Reste innerhalb der Poren verbleiben, was wiederum die Ausbeute reduziert und zu relativ ineffizienter Kupplungsbildung führt. Der Träger kann aus kalzinierten kugelförmigen Teilchen eines Durchmessers von 100-200 um (Mikrometern) bestehen. Der Träger kann beispielsweise aus porenfreiem Siliciumdioxid bestehen.
Der Träger kann (vor dem Immobilisieren der Oligonucleotide) reaktionsfähige Gruppen (z. B. Epoxygruppen) zur Verwendung beim Immobilisieren der Oligonucleotid-Sequenz auf dem Träger aufweisen.
Bevorzugterweise weist der Träger (vor dem Immobilisieren der Oligonucleotide) eine vernetzte Siloxanmatrix mit reaktionsfähigen Gruppen auf, die zur Bereitstellung eines immobilisierten Oligonucleotids auf dem Träger verwendet werden kann.
Die Verwendung der Siloxanmatrix ist aufgrund ihrer Säure-/Basenstabilität besonders vorteilhaft, im Gegensatz zu Trägern des Stands der Technik, die eine biologisch abbaubare Biotin-Streptavidin-Verknüpfung enthalten. Die Siloxanmatrix erlaubt es, eine umfangreiche Reihe von Manipulationen durchzuführen, ohne daß das Oligonucleotid von dem Träger entfernt wird. Beispielsweise kann Ammoniak als Reagens für das Entfernen des Schutzes von dem auf dem Träger verbleibenden Oligonucleotid verwendet werden. Normale Bernsteinsäureverknüpfungen, wie sie für das Immobilisieren von Oligonucleotid verwendet werden, sind basenlabil und veranlassen, daß das Oligonucleotid sich vom Träger löst.
Bevorzugt handelt es sich bei der reaktionsfähigen Gruppe, die für die Immobilisation der Nucleinsäuresequenz verwendet wird, um eine Epoxygruppe.
Falls erwünscht, können freie, auf dem Träger vorhandene Hydroxygruppen nach der Reaktion mit dem Siloxanmatrixvorläufer, jedoch vor Bildung der vernetzten Siloxanmatrix, z. B. durch Verwendung eines Chlorsilans überdeckt werden.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Siloxanmatrixvorläufer um eine Glycidoxyverbindung der Formel
(RO)&sub3;-Si-R¹-O-
in der R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R' einen Alkylenrest darstellt. Am bevorzugtesten stellt R Methyl und R'-(CH&sub2;)&sub3;- dar.
Ein synthetisches Oligonucleotid kann über die Epoxygruppe kovalent an den Träger gebunden sein. Als Alternative kann ein Natriumsalz eines Nucleotids kovalent an den Träger gebunden sein und die Oligonucleotidsynthese (unter Verwendung von β-Cyanoethylphosphoamidit) durchgeführt werden.
Die Erfindung wird durch Beispiele ausschließlich mit Bezug auf die beiliegenden graphischen Darstellungen noch in weiteren Einzelheiten beschrieben, in denen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Prinzipien der Erfindung darstellt;
Fig. 2 einen Längsschnitt einer das Oligo-Feststoffsystem enthaltende Durchlaufsäule zeigt;
Fig. 3 einen Reaktionsweg veranschaulicht für die Bildung eines festen Trägers für das Immobilisieren eines Oligonucleotids;
Fig. 4a eine schematische Darstellung des festen Trägersystems und und 4b der Reaktionen zeigen, die beim Binden eines Oligonucleotids an dieses eine Rolle spielen;
Fig. 5a eine schematische Darstellung der Schritte zeigen, die bei der bis 5d Amplifikation einer Zielnucleinsäure mitspielen;
Fig. 6 eine Einrichtung veranschaulicht für das Durchführen einer erfindungsgemäßen Manipulation; und
Fig. 7 ein Autoradiogramm der Ergebnisse von Beispiel 3 zeigt.
Was Fig. 1 anbetrifft, so werden dort (in stark vergrößertem Maßstab) eine Mehrzahl von Teilchen 1 eines festen Trägermaterials veranschaulicht, wobei auf jedem eine Anzahl identischer Oligonucleotidsequenzen 2 immobilisiert sind, die für eine einsträngige Zielnucleinsäuresequenz 3 spezifisch sind, die in einer Probe 4 enthalten ist, die auch unerwünschte Verunreinigungen (z. B. andere Nucleinsäuresequenzen, Proteine usw.) wie durch die Dreiecke 5 dargestellt, enthält.
Die Probe 4 wird dem Träger 1 unter Hybridisierungsbedingungen derart angelagert, daß einige der Nucleinsäuresequenzen 3 sich an das Oligonucleotid binden unter Zurücklassen nicht hybridisierter Säure 3 zusammen mit den Verunreinigungen 5 in der flüssigen Phase. Während des darauffolgenden Waschens wird die nicht hybridisierte Säure 3 zusammen mit den Verunreinigungen 5 wie gezeigt vom Träger 1 entfernt unter Zurücklassen einer reinen Probe der an den Träger gebundenen Zielnucleinsäure 3.
Es ist besonders vorzuziehen, daß die Teilchen 1 innerhalb einer Durchlaufsäule 6 (vergleiche Fig. 2), die Einlaß- und Auslaßventile 7 und 8, wie gezeigt, sowie eine Heizvorrichtung 9 aufweist, enthalten sind. Die Teilchen können durch porenhaltige Elemente 10 innerhalb der Säule zurückgehalten werden. Der Bequemlichkeit halber sind die in Fig. 2 veranschaulichten Teilchen 1 so gezeigt, als ob sie nur eine darauf immobilisierte Oligonucleotidsequenz aufweisen.
Die Zielnucleinsäure wird der Durchlaufsäule über das Einlaßventil 7 im Verhältnis von Oligonucleotid zur Zielsäure von beispielsweise 1000 : 1 in einem geeigneten Puffer, z. B. Hybridisationspuffer von hohem Salzgehalt, zugegeben und die Hybridisierung wird unter Bedingungen durchgeführt, die für das auf dem Träger gebundene Oligonucleotid und die Zielnucleinsäure spezifisch sind. Wenn doppelsträngige DNA die Quelle der Zielnucleinsäure darstellt, wird sie zuerst durch herkömmliche Methoden entweder vor der Zugabe zur Säule oder während sie sich in der Säule befindet in einzelne Stränge getrennt.
Die Probe 4 wird dadurch in der Säule gehalten, daß das Auslaßventil 8 geschlossen ist. Nach dem Hybridisierungsschritt können die unerwünschten Verunreinigungen 5 (die nicht auf dem Träger immobilisiert worden sind) durch Waschen (wobei das Ventil 8 offen ist) unter Zurücklassen der reinen Probenzielnucleinsäure auf dem Träger entfernt werden.
Die Art und Weise, auf die der feste Träger (mit dem immobilisierten Oligonucleotid) zubereitet wird, ist in Fig. 3-5 dargestellt. Zuerst wird Bezug genommen auf Fig. 3, die eine Ausführungsform des Reaktionswegs zur Herstellung eines Trägers mit reaktionsfähigen Gruppen veranschaulicht, an die ein Oligonucleotid immobilisiert werden kann.
Ber Vorgang beginnt mit Siliciumdioxid-Gelteilchen (I) die, wie gezeigt, Hydroxygruppen an der Oberfläche aufweisen. In einem ersten Reaktionsschritt werden die Teilchen mit 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan (11) beispielsweise bei einer Temperatur von nicht über 95ºC 2 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre behandelt. Dadurch findet eine Kondensationsreaktion statt, durch die Reste von (11) an die Siliciumdioxidteilchen (I) gebunden werden unter Bildung des als (III) veranschaulichten Produkts. Obwohl die Zeichnung nur zwei an das Siliciumdioxidteilchen gebundene Reste zeigt, dient dies einfach dem Zweck der Klarheit und in der Praxis werden wesentlich mehr Reste an das Siliciumdioxidteilchen gebunden. Typischerweise beträgt das Bindungsmaß 40- 45 Mikromole (I)/Gramm Siliciumdioxid.
Das Produkt (III) wird daraufhin mit trockenem Toluol, trockenem Methanol und trockenem Ether gewaschen, und zwar in dieser Reihenfolge.
Der nächste Schritt beinhaltet das Erhitzen des Produkts, um das Vernetzen der Reste zu bewirken. Typischerweise wird diese Vernetzungsreaktion bei einer Temperatur von 110ºC mindestes 2 Stunden Lang durchgeführt. Das dadurch erzielte Produkt ist als (IV) veranschaulicht und es ist ersichtlich, daß die Siliciumatome durch Sauerstoffatome miteinander verknüpft sind.
Falls erwünscht, können freie, an der Oberfläche des Silciumdioxidteilchens verbleibende Hydroxygruppen mit einem Chlorsilan überdeckt werden. Das Überdeckungsmittel kann beispielsweise aus Trimethylchlorsilan bestehen, wobei die Reaktion 2 Stunden in Pyridin bei Raumtemperatur durchgeführt wird. Auf das Überdecken hin kann der Träger dem oben beschriebenen Waschvorgang unterworfen werden.
Der dadurch erhaltene Träger weist freie Epoxygruppen auf, die der Immobilisierung eines Oligonucleotids dienen können.
Es ist beispielsweise möglich, unter Anwendung bekannter Verfahren ein Oligonucleotid in situ auf dem Träger zu synthetisieren, wobei das Oligonucleotid einer spezifischen Sequenz auf einer Zielnucleinsäure komplementär ist. So kann das Natriumsalz eines mit Dimethoxytrityl (DMT) geschützten Nucleotids mit dem Träger reagiert werden, wobei die -tV-Gruppe in der 3'-Stellung des Nucleotids mit der freien Epoxygruppe unter Bildung des Produkts (V) reagiert. Das Natriumsalz kann aus dem DMT-Nucleotid (das über P&sub2;O&sub5; getrocknet worden ist) durch Lösen in trockenem DMF, Halten der Lösung in einer wasserfreien Atmosphäre und Zusetzen von Natriumhydrid zubereitet werden. Daraufhin wird das Natriumhydrid abfiltriert, um das Natriumsalz zurückzulassen.
Nach Entfernung der DMT-Schützgruppe kann ein erwünschtes Oligonucleotid aus den einzelnen Nucleotiden unter Anwendung bekannter Verfahren für die Oligonucleotidsynthese synthetisiert werden.
Als Alternative ist es möglich, ein vorsynthetisiertes Oligonucleotid (das einer spezifischen Sequenz auf einer Zielnucleinsäure komplementär ist und bevorzugt außerdem eine Restriktionsendonucleasestelle enthält) an den Träger zu binden.
Eine Anzahl synthetischer Oligonucleotide stehen komplementär zu einer Anzahl von Zielnucleinsäuresequenzen zur Verfügung, die als Sonden zur Ermittlung des Vorliegens gewisser Bakterien, Viren, Parasiten und dergleichen angewendet werden können, vergleiche Anhang A. Als spezifisches Beispiel kann die Erfindung beispielsweise zur Erfassung der folgenden verwendet werden, für die die unten angegebenen Oligonucleotidsequenzen auf dem Träger immobilisiert werden würden.
Das Oligonucleotid kann entweder in der 3' → 5' oder der 5' → 3'-Orientation auf den Träger gebunden werden. Das Binden in der 3' → 5'-Orientation kann durch Reagieren der Epoxygruppe auf dem Träger mit einer primären Hydroxygruppe des Natriumsalzes eines Nucleotids (z. B. Thymidinnucleotid(dimethoxytrityldeoxy-iribonucleosid (dT) (vergleiche Fig. 4a)) unter Bildung einer Bindung erzielt werden, die, im Gegensatz zu den gegenwärtig verwendeten Verknüpfungsgruppen, sowohl säure- als auch alkalibeständig ist.
Das Binden in der 5' → 3'-Orientation kann wie folgt erzielt werden (vergleiche auch Fig. 4b). 5'-Iodo-5'-deoxythymidin wird mit Natriumtriphenylmethylmercaptil in DMF unter Bildung einer S- Tritylverbindung reagiert. Diese Verbindung wird mit Diisopropylaminotetrazolid und 2-Cyanoethoxy-bis (NN-Diisopropylamino)- phosphoamidit in DCM unter Bildung des β-Cyanoethyls weiterreagiert. Die S- Tritylgruppe wird durch Reduktionsreaktionen unter Zuhilfenahme im Stand der Technik bekannter Methoden (Connolly, Nucleic Acid Research, 13, 12, 1985; Chu, Nucleic Acid Research, 16, 9, 1988; Guar, Nucleic Acid Research, 17, 11, 1989) vor dem Verknüpfen mit dem epoxysubstituierten Träger unter Zuhilfenahme von Natriumhydrid entfernt. Andere Methode zur Zubereitung von Oligonucleotiden für das Verknüpfen in der 5' → 3'-Orientation sind bekannt (Anisorge, Nucleic Acid Research; 15, 11, 1987; Sproat, Nucleic Acid Research, 15, 12, 1987; Zuckerman, Nucleic Acid Research, 13, 5305, 1987; Verheyden, JOREGA CI-IEM, 35, 2319, 1970), obwohl diese Liste nicht umfassend ist und jegliche andere Methode, die für den Fachmann offensichtlich ist, für die Zubereitung von Oligonucleotiden entweder in der 3' → 5'-Orientation oder der 5' → 3'-Orientation für die Verknüpfung an das erfindungsgemäße feste Trägersystem verwendet werden kann.
Weist das Oligonucleotid aufgrund der Synthesereaktion schützende Gruppen, wie beispielsweise Butyl-/Isopropyl-Gruppen auf den Basen (G, A, C) des 3' → 5'- Oligos und β-Cyanoethylgruppen des 5' → 3'-Oligos auf, so müssen diese nach der Synthese entfernt werden. Zur Entfernung der schützenden Gruppen unter Erzielung des nicht mehr geschützten Oligonucleotids kann das Oligo-/fester Träger-System 2 Stunden in 38%-igen NH&sub4;OH auf 55ºC erhitzt werden.
Ein Beispiel einer für dieses System geeigneten Manipulation ist die Amplifikation der Zielnucleinsäuresequenz.
Die Fig. 5a-c zeigen eine graphische Darstellung der Schritte, die bei Amplifikationsverfahren, je nach der Position der Primärstelle, der Orientierung des Oligonucleotids (d. h. 3' → 5' oder 5' → 3') und daher der Zielnucleinsäuresequenz und des Vorliegens einer oder zweier Oligonucleotidsequenzen (d. h. Reversorientationsoligos) stattfinden. Die bei der Amplifikation stattfindenden Schritte, d. h. das Anlagern von Primer, die Primerverlängerung, das Anlagern eines zweiten Primers, um eine Sicherungskopie der Zielkopie zu erzielen usw., sind bekannt.
Bei der in Fig. 5a veranschaulichten Ausführungsform kann das 5'-Ende des Oligonucleotids an den Träger gebunden sein und die Manipulation kann in Form einer Amplifikation der an das Oligonucleotid hybridisierten Zielnucleinsäure stattfinden. In diesem Fall kann das Oligonucleotid als Primer dienen oder ein anderer Primer 11 kann vor dem Hybridisierungsschritt an das Oligonucleotid ligiert werden. In beiden Fällen wird ein Primerverlängerungsprodukt 12 (unter Zuhilfenahme der Zielnucleinsäure als Matrize) von dem Primer an das Ende der Zielnucleinsäure synthetisiert. Auf diese Weise erhält man eine Nucleinsäuresequenz, die an den Träger gebunden und der Zielnucleinsäure komplementär ist. Aus Bequemlichkeitsgründen wird die komplementäre Sequenz hier als "Kopieziel" bezeichnet.
Der Träger kann daraufhin gewaschen und die hybridisierten Nucleinsäurestränge (d. h. die Zielsäure und das Kopieziel) können daraufhin mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Verfahren (z. B. Erhitzen auf eine bestimmte Temperatur) denaturiert werden, wodurch nur das Kopieziel (über das Oligonucleotid) an den festen Träger gebunden bleibt. Aus Bequemlichkeitsgründen wird der feste Träger mit gebundenem Oligonucleotid in der folgenden Beschreibung auch als "Oligo-/fester Träger" bezeichnet.
Das Trägersystem kann gewaschen und das darauf verbleibende Kopieziel kann daraufhin für das Synthetisieren weiterer Mengen der ursprünglichen Zielnucleinsäure verwendet werden. Eine derartige Synthese umfaßt das Hybridisieren eines Primers 13 an das Kopieziel, das Waschen des Trägers zur Entfernung von nicht hybridisiertem Primer, das Ausführen der Primerverlängerung (wobei das Kopieziel als Matrize dient) und das darauffolgende Denaturieren und Einsammeln der synthetisierten Nucleinsäuresequenz 14. Dieses Verfahren kann so oft wie notwendig wiederholt werden, wobei die ursprüngliche Zielnucleinsäure in der Praxis bis zu einem erwünschten Grad amplifiziert wird. Man sollte sich im Klaren darüber sein, daß bei jedem Amplifikationsschritt der gleiche Satz von Kopiezielmolekülen verwendet wird.
Das in Fig. 5a veranschaulichte Verfahren ist für das Erfassen des Vorliegens geringer Mengen einer Zielnucleinsäure in einer medizinischen Probe besonders geeignet. Der Primer 13 kann durch bekannte Verfahren gelabelt werden und es wird eine Erfassungsoperation durchgeführt zum Erfassen der entsprechend gelabelten Nucleinsäuresequenz 14. Wird ein Label erfaßt, so ist dies die Bestätigung dafür, daß die Zielnucleinsäure 3 in der ursprünglichen Probe vorgelegen hatte.
In Abwandlung des für Fig. 5a beschriebenen Verfahrens kann die doppelsträngige Nucleinsäure eine Restriktionsstelle (wie sie beispielsweise durch einen an das Oligonucleotid ligierten Primer geliefert wird) und das entsprechende, dann zum Spalten des doppelsträngigen Moleküls vom Träger verwendete Restriktionsenzym enthalten.
Bei einer alternativen Ausführungsform der Erfindung (vergleiche Fig. 5b) in der das 3'-Ende des Oligonucleotids an den Träger gebunden ist, kann die Manipulation das Sequenzieren der hybridisierten Zielnucleinsäure unter Anwendung einer Standardmethodologie (z. B. Sanger-DNA- Sequenzierverfahren) beinhalten. So kann ein Primer 15 an die Zielnucleinsäure (die an das Oligonucleotid auf dem Träger hybridisiert ist) hybridisiert werden. Bei dem Primer muß es sich um einen solchen handeln, der bei einer Temperatur an die Zielsäure hybridisiert, bei der die Zielsäure nicht von dem Oligonucleotid abschmilzt. Daraufhin wird eine Strangsynthesereaktion mit einer Mischung der 4 Deoxynucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) in Verbindung mit einem einzigen Dideoxynucleotid ausgeführt. Die Synthese findet in der 5' → 3'- Richtung vom Primer auf das Oligonucleotid zu statt. Die Reaktion wird viermal durchgeführt, wobei jedes Mal ein anderes Dideoxynucleotid verwendet wird. Wie allgemein bekannt ist, führt die Anwesenheit von Dideoxynucleotid zur Bildung von Nucleinsäuresequenzen verschiedener Längen - wie sie durch die gestrichelten Linien dargestellt sind. Die Produkte der vier Reaktionen werden parallel auf einem geeigneten Gel untersucht und die Sequenz aus den Lagen der Banden in den vier Spuren bestimmt. Diese besondere Ausführungsform der Erfindung eignet sich insbesondere für das Erfassen von Punktmutationen in einer Nucleinsäure (die beispielsweise als medizinische Probe vorliegt), durch Vergleich der dadurch erhaltenen Sequenz mit der einer Kontrollprobe, von der bekannt ist, daß sie eine "normale" Sequenz aufweist.
Die Ausführungsform, in der das 3'-Ende des Oligonucleotids an den Träger gebunden ist, kann auch zum Amplifizieren der Zielnucleinsäuresequenz verwendet werden. Wie im Falle des oben beschriebenen Sequenzierens kann ein Primer an die Zielnucleinsäure hybridisiert werden. Bei dem verwendeten Primer muß es sich um einen solchen handeln, der an die Säure bei einer Temperatur hybridisiert, die niedriger ist als diejenige, bei der die Zielsäure vom Oligonucleotid abschmilzt. Die Verlängerung des Primers findet dann unter bekannten Bedingungen statt, wobei die Verlängerung auf das und bis zum Oligonucleotid hin durchgeführt wird. Das dadurch erhaltene Kopieprodukt kann von der Zielnucleinsäure unter Bedingungen abgeschmolzen werden, unter denen letztere zur Verwendung in weiteren Amplifikationsreaktionen am Träger hybridisiert bleibt.
Bei allen oben beschriebene Amplifikationsreaktionen bleibt die gleiche Matrize an den Oligo-/festen Träger gebunden und wird für weitere Amplifikationsreaktionen verwendet. Dies stellt einen signifikanten Unterschied zwischen der vorliegenden Erfindung und der in EPA-0 200 362 geoffenbarten Technik dar, da bei letzterer beide Stränge der Zielnucleinsäure als Matrizen verwendet werden und die Zielstränge, sobald sie kopiert sind, sowie die kopierten Stränge alle als Matrizen für den zweiten und weitere Amplifikationsschritte verwendet werden. Unterläuft also ein Fehler während irgendeiner Stufe beim Kopieren, so wird der Fehler in die "Kettenreaktion" kopiert.
Bei der vorliegenden Erfindung wird dieses Problem dadurch vermieden, daß man entweder eine einzige Kopierstufe benutzt und diese Kopie für alle weiteren Amplifikationen oder die ursprüngliche Zielsequenz für alte Amplifikationen beibehält. Die vorliegende Erfindung ist auch effizienter als die in EP-A-0 200 362 beschriebene, da in der ersteren nicht hybridisierte Primer und Zielsäure oder Kopiesequenzen durch Waschen vom System entfernt werden, während bei letzterer Methode unhybridisierte Zielsäure, Primer und Kopieprodukt vorliegen, was das System ineffizient macht.
Bei einer weiteren Ausführungsform (vergleiche Abb. 5c) können zwei Primer, die den verschiedenen Teilen der Zielsäure oder dem Kopieziel komplementär sind, entweder in der 5' → 3' oder der 3 → 5'-Orientation angelagert und dazu verwendet werden, die Sequenz auf Punktmutationen auf eine im Stand der Technik bekannte Weise (DNA-Legase-Reassoziationsreaktion) zu prüfen. Bei dieser Analyse sind die Primer gewöhnlich gelabelt und der Test wird beispielsweise für die Schnelldiagnose von P53-Tumorsupressor-Genmutationen benutzt, da 75% aller Darmkrebspatienten einen Deletionspunkt in diesem Gen aufweisen.
Aus der obigen Beschreibung wird klar, daß das vorliegende Verfahren sich von bekannten Verfahren dadurch unterscheidet, daß das Festphasensystem und die Einrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung eine höhere Wirksamkeit und eine größere Ausbeute an amplifzierter Nucleinsäure erlauben. Das ist der Möglichkeit des stufenweisen Ausführens des Verfahrens zuzuschreiben. Die Säule kann nach jeder Hybridisierung gewaschen werden, um nicht hybridisertes DNA usw. zu entfernen und das System "zu säubern", wodurch die Wirksamkeit wesentlich verbessert wird. Der Inhalt der Säule an Reaktionslösung, d. h. neu amplifizierter Zielsequenz, kann direkt in einen Detektor, wie eine optische Zelle, umgeleitet werden, die an die Säule angeschlossen ist und die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Zielsequenz läßt sich dadurch schnell bestätigen. Dies läßt sich insbesondere für die Diagnose von Patientenproben anwenden, die auf Anwesenheit eines krankheitserregenden Organismus auf einfache, schnelle, verläßliche und bisher nicht zur Verfügung stehende Weise untersucht werden sollen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung (bei der keine Amplifikation stattfindet) ist in Fig. 5d veranschaulicht; die auf das Untersuchen von Proben auf Anwesenheit (oder Abwesenheit) einer relativ großen Menge einer Zielnucleinsäure anwendbar ist. Bei der Ausführungsform der Fig. 5d kann ein gelabelter Primer 16 an das Trägersystem angelagert werden, wobei es sich bei dem Primer um einen solchen handelt, der bei einer Temperatur an die Zielnucleinsäure hybridisiert, die unterhalb derjenigen liegt, bei der die Zielsäure von dem Oligonucleotid abschmilzt. Liegt die Zielnucleinsäure 3 vor, so wird der Primer sich daran hybridisieren. Der Träger kann nun bei einer Temperatur gewaschen werden, die unterhalb derjenigen liegt, bei der der Primer 16 von der Zielnucleinsäure abgeschmolzen wird, um den nicht reassoziierten Primer 16 zu entfernen. In der nächsten Stufe wird der feste Träger auf eine Temperatur erhitzt, bei der der Primer 16 (entweder mit oder ohne Zielsäure) abgeschmolzen wird, der Träger wird gewaschen und eluiertes Produkt zu einem Detektor geleitet. Wird das Label erfaßt, so beweist das das Vorhandensein der Zielnucleinsäure in der ursprünglichen Probe.
Was Fig. 6 anbetrifft, so wird dort eine Einrichtung veranschaulicht, in der die Hybridisierung der Zielnucleinsäure an das an den Träger gebundene Oligonucleotid sowie Amplifikationsreaktionen durchgeführt werden können.
Die in Fig. 6 veranschaulichte Einrichtung umfaßt eine Säule 20 (entsprechend der Säule 6 in Fig. 2), die mit Trägerteilchen 21, an die Oligonucleotid 22 gebunden ist, vorbeladen worden sind. Säule 20 weist typischerweise ein Volumen von ca. 200 ul auf und ist mit einem Einlaß 23 und einem Auslaß 24 ausgestattet, der mit porenhaltigen Rückhalteelementen 25 ausgestattet ist, um die Teilchen 21 innerhalb der Säule zurückzuhalten. Die Einrichtung weist eine Anordnung von Ventilen 26-34, wie gezeigt, auf und ist außerdem mit einer Druckgasquelle ausgestattet, die den Pfeilen G entsprechend angelegt werden kann. Das Gas wird zur Ausführung der Bewegung von Reagentien und Produkten innerhalb der Einrichtung verwendet. Gewisse dieser Ventile sind so ausgerichtet, daß das Entlüften des Gases, wie durch Pfeile V gezeigt, stattfindet.
Das Ventil 26 erlaubt die selektive Kommunikation des Säuleninneren 20 mit einer Reagensspeisevorrichtung 35, die mit einzelnen Gefäßen 35a-35d ausgestattet ist, die Lösungen (z. B. Proben, Primer, Puffer usw.) enthalten, die über die offenen Ventile 26 und 27 durch Gasdruck an die Säule 20 gespeist werden. Das Ventil 29 kann während dieses Vorgans zum Ablassen von übermäßigem Gasdruck benutzt werden.
Auf der Auslaßseite des Ventils 28 befindet sich ein Übertragungsbereich 36 der wahlweise (über Ventil 30) mit einem Produktsammelbereich 37 in Verbindung stehen kann, der mit einem Detektor 38 assoziiert ist, der beispielsweise aus einem optischen Detektor oder einem Detektor für Radiolabel bestehen kann. Andere Detektortypen können ebenfalls verwendet werden.
Der Übertragungsbereich 36 kann auch wahlweise (über Ventil 3.1) mit einem Lösungshaltebereich 39 oder einem Abfallstoffempfänger 40 in Verbindung stehen. Der Lösungssammelbereich 39 ist mit einer der Rohrleitungen der Einrichtung ausgestattet und besitzt ein Volumen, das mindestens dem der Säule 20 entspricht.
Eine Heizvorrichtung 41 ist, wie gezeigt, um die Säule herum angebracht.
Bei den Ventilen der veranschaulichten Einrichtung kann es sich beispielsweise um nullpunkttote Ventile mit Teflonsitz (wie sie beispielsweise von General Valve, U. S. A. erhältlich sind) handeln. Bei den in der Einrichtung verwendeten Reagenzgläsern kann es sich um Teflonreagenzgläser von 1,5 mm Durchmesser handeln.
Bei der praktischen Anwendung der Einrichtung wird die Probe zusammen mit entsprechenden Puffern wie oben aufgeführt unter Gasdruck zur Säule 20 geliefert. Die Hybridisierung von Zielnucleinsäure wird bei der entsprechenden Temperatur bewirkt und daraufhin wird die Säule (mit der aus der Vorrichtung 35 gelieferten Lösung) gewaschen. Die Waschflüssigkeiten können (über entsprechend eingestellte Ventile 28 und 31) zur Abfallstoffaufnahrnevorrichtung 40 geleitet werden. Das Ventil 34 kann während dieses Vorgangs zum Ablassen von übermäßigem Druck geöffnet sein.
Es ist nun möglich, eine Manipulation an der auf dem Träger gehaltenen Zielnucleinsäure durchzuführen. Zu diesem Zweck werden Reagenslösungen je nach Erfordernis von der Vorrichtung 35 über entsprechend eingestellte Ventile (sowohl für die Zulieferung von Flüssigkeit als auch für das Ablassen von Druck) zugespeist.
Nach der Manipulation kann die Reagenslösung von der Säule 20 zum Lösungshaltebereich 39 geleitet werden.
Das Manipulationsprodukt kann nun von dem Träger 21 abgeschmolzen und entweder zur sofortigen Erfassung oder zur Lagerung an den Produktsammelbereich 37 geleitet werden.
Soll eine weitere Manipulation an der Zielnucleinsäure (oder der Kopie derselben) auf dem Träger durchgeführt werden, so kann die im Bereich 39 gehaltene Lösung unter Gasdruck durch Ventil 32 wieder an die Säule 20 zurückgeführt werden.
Der obige Vorgang kann daraufhin wiederholt werden.
Das Manipulationsprodukt kann so oft wie erforderlich im Bereich 37 eingesammelt werden. Während des Einsammelns von Produkt wird das Ventil 33 auf Entlüften eingestellt. Um zu verhindern, daß das Produkt sofort zum Detektor geleitet wird, kann das Ventil 33 nach kurzer Zeit geschlossen werden, derart, daß eingesammeltes Produkt nicht genügend weit dem Bereich 37 entlang geleitet werden kann, um den Detektor 38 zu erreichen. Das Bereitstellen der Gasspeisung zum Detektor 38 bietet eine Möglichkeit für das Reinigen des Detektors, wenn dies erforderlich ist.
Man wird sich im Klaren darüber sein, daß die oben beschriebene Einrichtung automatisiert werden kann, wobei das Einstellen der Ventile elektronisch gesteuert wird.
Die Einrichtung kann, wie in Fig. 6 veranschaulicht, eine einzige Säule oder mehrere Säulen für das Untersuchen mehrerer Oligonucelotidsonden an einer einzigen Probe oder für das Untersuchen einer einzigen Oligonucleotidsonde (z. B. HIV I) auf mehreren Proben umfassen.
Außerdem braucht die Säule 20 nicht ein fester Teil der Einrichtung zu sein. Es ist beispielsweise möglich, Wegwerfsäulen 20 bereitzustellen, die mit festem Träger, an den Oligonucleotid gebunden ist, vorbeladen sind und die Säule daraufhin in eine wie ansonsten in Fig. 6 gezeigte Einrichtung zu setzen. Dadurch wird die Notwendigkeit des Entleerens von festem Träger aus der Säule, wie sie bei einer festen Säule entsteht, vermieden.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht. Die in den Beispielen verwendeten Oligonucleotide - sowohl die säulengebundenen als auch die säulengespaltenen (Primerproben) - wurden durch ein Standardkupplungsprogramm an einem Biosearch DNA-Synthetisierer, Modell 8500, synthetisiert. Durch β-Cyanoethyl geschützte Phosphoamiditen wurden für die Synthese verwendet. Die säulengespaltenen Primerproben wurden vollständig entblockt (alle DMTr-Gruppen wurden entfernt) und automatisch von den CPG-Säulen NH&sub4;OH_gespalten. Die säulengebundenen Oligonucleotide wurden nicht NH&sub4;OH_gespalten und die DMTr-Endgruppe wurde nur dann entfernt, wo angegeben. Auf die Synthese hin wurden sowohl säulengebundene als auch säulengespaltene Oligonucleotide in 38%-iges NWOH (1 ml) enthaltende Reagenzgläser mit Schraubdeckel übertragen. Die Reagenzgläser wurden zur Entfernung der schützenden Gruppen in Klemmen 1 Stunde in einen Ofen bei 55ºC gestellt. Daraufhin wurden die Reagenzgläser und die Klemmen 10 Minuten in eine Gefriertruhe bei -20ºC übertragen. Der NH&sub4;OH&supmin;Überstand wurde von den säulengebundenen Oligonucleotiden entfernt und weggeschüttet. Die Proben wurden in einer Savant-Trockenzentrifuge einer Gefriertrocknung unterzogen und in einem Exsikkator gelagert. Jedes säulengespaltene Oligonucleotid wurde über 3 Reagenzgläser verteilt und einer Gefriertrocknung unterzogen. Eines dieser Reagenzgläser wurde daraufhin ausgewählt und das darin enthaltene Roholigonucleotid gereinigt.

Beispiel I

Zubereitung des Siliciumdioxid-Gelträgers

Träger aus kalziniertem Spherisorb GC (1 g) wurde mit 40 ml wasserfreiem Toluol über P&sub2;O&sub5; in einem Rundkolben getrocknet. Der Kolbeninhalt wurde mit einem Magnetrührer gerührt und die daraufhin erhaltene Aufschlämmung wurde in einem Ölbad auf 90-95ºC erhitzt. Wasserfreies 3- Glycidoxypropyltrimethoxysilan (1,5 ml) wurde der Aufschlämmung zugesetzt und die Reaktion unter Rühren 3 Stunden bei 90-95ºC fortgesetzt. Es wurde darauf geachtet, sicherzustellen, daß die Temperatur 95ºC nicht überstieg. Nach 3 Stunden wurde die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur abgekühlt, filtriert und mit wasserfreiem Toluol (40 ml), Methanol (40 ml) und Ether (20 ml) getrocknet. Das funktionalisierte Siliciumdioxidgel wurde über P&sub2;O&sub5; und Siliciumdioxid über Nacht getrocknet.

Beispiel 2

Synthese von durch Cytosinnucleotid substituiertem Träger

(a) Zubereitung des Natriumsalzes des C-Nucleotidderivats:

Dimethoxytrityldeoxyribonucleosidcytosin (DMTr dC) (1 g) wurde über P&sub2;O&sub5; und Siliciumdioxid mehrere Tage lang getrocknet. Das getrocknete DMTr dC wurde in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (DMF) (20 ml) unter Stickstoff gelöst. Nach dem vollständigen Lösen wurde Natriumhydrid (0,6 g) zugegeben und mit dem DMTr dC in wasserfreiem AMF unter Rühren 20 Minuten reagiert. Das NaH wurde daraufhin von der Reaktionsmischung abfiltriert.
(b) Reaktion des zubereiteten Siliciumdioxidgels und Nucleosidderivats: Der Träger aus getrocknetem Siliciumdioxidgel wurde direkt dem filtrierten Nucleosidnatriumsalz zugegeben und die Mischung unter Rückfluß 2 Stunden gerührt. Die gekoppelte Nucleosid- und Trägermischung wurde über Nacht auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Träger aus substituiertem Siliciumdioxid wurde durch eine silonisierte Glasfritte filtriert und mit jeweils 20 ml wasserfreiem DMF, wasserfreiem Toluol, Methanol und Ether gewaschen. Zum Schluß wurde der feste Träger getrocknet und in einem Exsikkator gelagert.
Der 5'-Sauerstoff des Zuckeranteils des Nucleosidderivats ist durch eine DMTr- Gruppe geschützt, die säurelabil ist und durch wasserfreie Säuren wie Dichloressigsäure (DCS) entfernt werden kann unter Bildung eines hellorangen DMTr-Kations. Ein Teil des getrockneten substituierten Trägers wurde mit Dichloressigsäure (1 ml 2%-iger DCS in Dichlormethan) behandelt und es trat eine hellorange Farbe auf, was andeutet, daß das Verkoppeln des Trägersiliciumdioxids und des Cytosinnucleosidderivats erfolgreich gewesen ist.

Beispiel 3

Als Prüfsystem wurde ein Verfahren erstellt für das Isolieren eines Klons von einer Mischung von Bakterien- und Viren-DNA. Die Zielsequenz (kloniertes Gen) wurde innerhalb des Bakteriophagen M 13 mp lokalisiert und enthielt die folgenden beiden Sequenzen:
GCG GGT CCC AAAA GGG TCA GTG CTG (1)
AGT GTG TCC TTT GTC GAT ACTG (2)
M13 mp ist ein Standardvirus, das in der molekularen Biologie sowie routinemäßig als Sequenziervehikel verwendet wird.
Ein Oligonucleotid folgender Sequenz, d. h. homolog zur Sequenz (1) wurde auf den in Beispiel 2 hergestellten Träger synthetisiert.
CGC CCA GGG TTT CCC AGT CAC GAC (3)
Der Cytosinrest am linken Ende der obigen Sequenz ist derjenige, der in den in Beispiel 2 hergestellten Träger eingebaut wurde.
Der feste Träger (15 g) mit der daran gebundenen Oligonucleotidsequenz wurde daraufhin in die Durchlaufsäule gegeben und eine Mischung von E. coli (das Produkt von 10&sup8; Zellen) und 1 ug M13 DNA wurde nach dem Denaturieren durch Hitze auf die Säule gegeben. Die Säule wurde bei einer Temperatur von (Tm 2)ºC gehalten, wobei Tm die Schmelztemperatur der Sequenz (3), der folgenden Formel entsprechend berechnet, ist
Tm = 2(A + T) + 3(G + C)
in der A, T, G und C jeweils die Anzahl der Adenin-, Thymin, Guanin- und Cytosinreste in der Sequenz (3) darstellen.
Da die Säule etwas unterhalb der Schmelztemperatur (Tm) gehalten wird, kann die Viren-DNA sich an das gebundene Oligonucleotid reassoziieren.
Die Säule wurde bei (Tm-2)ºC gehalten und mit 2,5 ml reassoziiertem Puffer (10 mM MgCl&sub2; und 10 mM TRIS HCl, pH-Wert 7,5) gewaschen. Die Waschflüssigkeiten aus der Säule wurden in 200 ul-Anteilen (insgesamt 11) in Reagenzgläsern eingesammelt.
Jeder der eingesammelten Anteile wurde daraufhin einer Standardsequenzierreaktion (Sanger Coulson Methode) durch Zusatz von 1 ng der obigen Sequenz (3) zu jedem der Reagenzgläser in Verbindung mit DNA- Polymerase (Klenow-Fragment) und Deoxyribonucleotiden und Dideoxyribonucleotiden in der Standardreaktionsmischung unterworfen. 32P gelabeltes Deoxythymidin wurde der Reaktionsmischung ebenfalls zugesetzt.
Eine Sequenzierreakfion wurde an dem auf der Säule inunobilisierten Material ebenfalls durchgeführt. Das säulengebundene Material wurde von der Säule abgeschmolzen und eingesammelt. Das Sequenzieren wurde mit Hilfe der gleichen Reaktionsmischung durchgeführt wie derjenigen, die beim Lösungsphasensequenzieren verwendet wurde.
Die Produkte der Sequenzierreaktionen, und zwar sowohl die trägergebundenen als auch die Lösungsphase, wurden daraufhin auf einem 8%-igen Standardpolyacrylamidgel unter Anwendung von Standardverfahren entwickelt. Die Ergebnisse sind im Autoradiogramm der Fig. 7 aufgezeigt in dem
Spur Erklärung
1 Sequenz, die nach dem Waschen mit 2,5 ml einer reassoziierten Mischung an einem an einen festen Träger gebundenen Material gebildet wird
2 die ersten hergestellten 200 ul Sequenz
3 die zweiten hergestellten 200 ul Sequenz
4 usw.
5 "
6 "
7 "
8 "
9 "
10 "
11 "
12 "
Spur 1 zeigt, daß die Zielnucleinsäure (Viren-DNA) tatsächlich an den Träger gebunden war (wie die Tatsache beweist, daß die Primersequenz (3) sich an die Zielnucleinsäure reassozüeren konnte und das Stattfinden der Sequenzierreaktion erlaubte). Spuren 1-10 zeigen ebenfalls, daß keine induktive Störung oder Verschmieren von E- coli-DNA auftritt. Aus diesem Grund war die Viren-DNA selektiv auf dem Träger zurückgehalten worden. Außerdem wird die trägergebundene Ziel-DNA dauerhaft auf dem Träger gehalten. Durch den Träger selbst wird keine sterische Hinderung des Klenow-Fragments verursacht, da die Sequenzierreaktionen an der trägergebundenen DNA durchgeführt worden sind.
Spuren 2-12 zeigen fortschreitend abnehmende Mengen der Ziel-DNA (d. h. der Viren-DNA) in den Waschflüssigkeiten aus der Säule. Aus diesem Grund war überschüssige Viren-DNA der Säule zugesetzt und nicht an die Oligonucleotidsequenz (3) reassoziiert worden. Es ist daher möglich, die Bindefähigkeit der Säule auf die Konzentration der Zielnucleinsäure ,einzustellen'.

ANHANG A

Tierische Viren

Schweineparvovirus
Pigmycoplasma hypneumoniae

Herpes-Virus

Cytomegalovirus (CMV)
Epstein Barr
Herpes simplex-Virus

Papillom-Viren

Humanes Papillom-Virus 6 (HPV)
""" 11
""" 16
""" 18
""" 33

Parvo-Viren

Parvo-Virus B 19

Picorna-Viren

Rhinovirus (Enterovirus)
Rhinovirus HRV 2-14

Hepatitis-Virus

Hepatitis A (HPV)
Hepatitis B
Hepatitis C
Hepatitis D

Retroviren

Humanes Immunschwächevirus 1 (HIV I)
" " " 2 (HIV II)
Virus der humanen T-Zell-Leukämien (HTLV I)
" " " " II (HTLV II)

Bakterien

Legionella pneumophilia
Mycobacteruim avium
bovis
fortuitum
tuberculosis
Mycoplasma pneumoniae
Escherichia coli toxin
Borrelia burgdorferi
Clamydia trachomatis
Salmonella typhimurium
Staphylococcus aureus
Clostridium perfringens
Klebstella pneumoniae
Aeromonas almonicida
Mycobalterium bovis

Parasiten

Trypanosoma:
Trypanosoma brucei brucei
Trypanosoma cruzi
Trypanosoma congolense
Toxoplasma
Toxoplasma gondii
Plasmodia
Plasmodium falciparum
ovale
vivax
malariae

Claims

1. Methode zur Ausführung einer Manipulation einer Nucleinsäuresequenz, wobei die Methode folgende Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellen in einem Durchlaufgefäß eines festen Trägersystems, an das ein einzelsträngiges Oligonucleotid kovalent gebunden ist, das eine Sequenz von Basen aufweist, die einem Teil der Sequenz einer bestimmten, eine höhere Anzahl von Basen als das Oligonucleotid aufweisenden Zielnucleinsäure komplementär ist, wobei die Oligonucleotide für die Zielnucleinsäure spezifisch sind,

(b) Anlagern einer Quelle einer einzelsträngigen Zielnucleinsäure an das feste Trägersystem,

(c) Hybridisieren der Zielnucleinsäure an das Oligonucleotid,

(d) Bewirken eines Durchlaufwaschens des Trägers nach der Hybridisierung zur Entfernung jeglicher nichthybridisierter Zielnucleinsäure in dem Trägersystem, wobei eine reine Probe der Zielnucleinsäure an dem festen Trägersystem bereitgestellt wird, und

(e) Durchführen an der an dem Träger immobilisierten Zielnucleinsäure in den Durchlaufgefäß einer Manipulation, die unter dem Kopieren der, der Denaturierung der und/oder der Hybridisierung an die Zielnucleinsäure ausgewählt wird.

2. Methode nach Anspruch 1, bei der das Durchlaufgefäß eine Säule ist.

3. Methode nach Anspruch 1 oder 2, bei der das feste Trägersystem Siliciumdioxid umfaßt.

4. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der das feste Trägersystem Teilchen umfaßt.

5. Methode nach Anspruch 4, bei der die Teilchen nicht porenhaltig sind.

6. Methode nach Anspruch 4, bei der die Teilchen eine Größe von 100 bis 200 um (Mikrometern) aufweisen.

7. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei der die Oligonucleotide durch basenstabile kovalente Bindungen kovalent an das feste Trägersystem gebunden sind.

8. Methode nach Anspruch 7, bei der die Bindungen 2 Stunden in 38%igem NH&sub4;OH bei 55ºC beständig sind.

9. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der das feste Trägersystem eine vernetzte Siloxanmatrix aufweist.

10. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei der das Durchlaufgefäß eine Größe von 150-250 ul aufweist.

11. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei der die Manipulation das Kopieren der Zielnucleinsäure-Sequenz unter Bildung einer Kopie mindestens eines Teils der Sequenz umfaßt.

12. Methode nach Anspruch 11, bei der das 5'-Ende des Oligonucleotids kovalent an den Träger gebunden ist und das Kopieren das Verlängern des Oligonucleotids in 5' → '-Richtung unter Zuhilfenahme der hybridisierten Zielnucleinsäure als Matrize umfaßt, wobei eine immobilisierte Kopie der kovalent an den Träger gebundenen Zielnucleinsäure gebildet wird.

13. Methode nach Anspruch 12, die des weiteren folgende Schritte umfaßt:

(i) das Denaturieren der Zielnucleinsäure von der imniobilisierten Kopie der kovalent an den Träger gebundenen Zielnucleinsäure,

(ii) das Bewirken eines Durchlaufwaschens des festen Trägersystems zur Entfernung der Zielnucleinsäure von diesem,

(iii) das Hybridisieren eines Primers an die immobilisierte Kopie der kovalent an den Träger gebundenen Zielnucleinsäure, und

(iv) das Verlängern des Primers in der 5' → 3'-Richtung zurück auf den festen Träger zu unter Zuhilfenahme der Kopie der Zielnucleinsäure als Matrize unter Bildung eines verlängerten Primerprodukts.

14. Methode nach Anspruch 13, die des weiteren folgende Schritte umfaßt:

(v) das Denaturieren des verlängerten Primerprodukts von der immobilisierten Kopie und

(vi) das Einsammeln des verlängerten Primerprodukts.

15. Methode nach Anspruch 14, die das mindestens einmalige Wiederholen der Sehritte (i) bis (vi) umfaßt.

16. Methode nach Anspruch 13, bei der der in Schritt (iii) angelagerten Primer markiert wird unter Bildung eines markierten verlängerten Primerprodukts und die Methode des weiteren den Schritt des Erfassens des markierten verlängerten Primerprodukts umfaßt.

17. Methode nach Anspruch 11, bei der das 3'-Ende des Oligonucleotids kovalent an den Träger gebunden ist und die Methode den Schritt des Hybridisierens eines Primers an die Zielnucleinsäure und das Kopieren das Verlängern des Primers in der 5' → 3'-Richtung zurück auf den Träger zu unter Bildung eines verlängerten Primerprodukts umfaßt.

18. Methode nach Anspruch 17, die des weiteren die Schritte des Denaturierens des verlängerten Primerprodukts von der Zielnucleinsäure umfaßt, während die Zielnucleinsäure an das Oligonucleotid hybridisiert bleibt.

19. Methode nach Anspruch 17, bei der es sich um eine Sequenzierreaktion handelt, die folgende Schritte umfaßt:

(i) Ausführen der Kopierreaktion mit einer Mischung der vier Deoxynucleotide dATP, dTTP, dGTP und dCTP in Verbindung mit einem einzigen der vier Dideoxynucleotide ddATP, ddTTP, ddGTP und ddCTP,

(ii) Denaturieren und Einsammeln der verlängerten Primerprodukte, während die Zielnucleinsäure an das Oligonucleotid hybridisiert bleibt,

(iii) Wiederholen der Schritte (i) und (ii) nacheinander mit jedem der drei anderen Dideoxynucleotide und

(iv) Analysieren der eingesammelten verlängerten Primerprodukte zur Bestimmung der Sequenz der Zielnucleinsäure.

20. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei der die Manipulation das Denaturieren der Zielnucleinsäure von den Oligonucleotiden umfaßt.

21. Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei der die Manipulation das Hybridisieren einer markierten Sonde an die Zielnucleinsäure umfaßt.

22. Einrichtung für die Ausführung einer Manipulation an einer Nucleinsäuresequenz, die folgendes umfaßt:

ein Durchlaufgefäß, das mit einem festen Trägersystem ausgestattet ist, an das durch basenstabile Verknüpfungen ein einzelsträngiges Oligonucleotid kovalent gebunden ist, das eine Sequenz von Basen aufweist, die einem Teil der Sequenz einer bestimmten, eine höhere Anzahl von Basen als das Oligonucleotid aufweisenden Zielnucleinsäure komplementär ist, wobei das Oligonucleotid für die Zielnucleinsäure spezifisch ist,

eine Lagervorrichtung für das Lagern von Lösungen, die während des Waschens oder anderen Vorgängen aus dem Gefäß entfernt worden sind, bevor sie in das Gefäß zurückgegeben werden,

eine Detektorvorrichtung für das Erfassen von Nucleinsäuremanipulationsprodukten und eine Regelvorrichtung für das Umleiten von Lösungen in das und aus dem Gefäß, in Abfallstoff oder Lagerbereiche und zu der Detektorvorrichtung.

23. Einrichtung nach Anspruch 22, bei der das Durchlaufgefäß eine Säule ist.

24. Einrichtung nach den Ansprüchen 22 oder 23, bei der das feste Trägersystem Teilchen umfaßt.

25. Einrichtung nach Anspruch 24, bei der die Teilchen eine Größe von 100 bis 200 um (Mikrometern) aufweisen.

26. Einrichtung nach Anspruch 24 oder 25, bei der die Teilchen nicht porenhaltig sind.

27. Einrichtung nach Anspruch 24, bei der die Teilchen aus Siliciumdioxid bestehen.

28. Einrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, bei der die Oligonucleotide durch kovalente Bindungen kovalent an den festen Träger gebunden sind, wobei die Bindungen 2 Stunden in 38%igem NH&sub4;OH bei 55ºC beständig sind.

29. Einrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 28, bei der das feste Trägersystem mit einer vernetzten Siloxanmatrix ausgestattet ist, an die die Oligonucleotide kovalent gebunden sind, um die säure- und basenstabile Verknüpfungen der Oligonucleotide an das feste Trägersystem bereitzustellen.

30. Einrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 29, bei der das Gefäß ein Volumen von 150 bis 250 ul aufweist.

31. Durchlaufgefäß, das einen Einlaß und einen Auslaß aufweist und ein festes Trägersystem enthält, an das ein einzelsträngiges Oligonucleotid durch basenstabile Verknüpfungen kovalent gebunden ist, das eine Sequenz von Basen aufweist, die einem Teil der Sequenz einer bestimmten, eine höhere Anzahl von Basen als das Oligonucleotid aufweisenden Zielnucleinsäure komplementär ist, wobei das Oligonucleotid für die Zielnucleinsäure spezifisch ist, wobei das Gefäß porenhaltige Rückhalteelemente aufweist zum Zurückhalten der Teilchen in dem Gefäß.

32. Gefäß nach Anspruch 31, das eine Säule ist.

33. Gefäß nach Anspruch 31 oder 32, bei dem das feste Trägersystem Teilchen umfaßt.

34. Gefäß nach Anspruch 33, bei dem die Teilchen eine Größe von 100 bis 200 um (Mikrometern) aufweisen.

35. Gefäß nach den Ansprüchen 33 oder 34, bei dem die Teilchen nicht porenhaltig sind.

36. Gefäß nach einem der Ansprüche 33 bis 35, bei dem die Teilchen aus Siliciumdioxid bestehen.

37. Gefäß nach einem der Ansprüche 31 bis 36, bei dem die Oligonucleotide durch kovalente Bindungen kovalent an das feste Trägersystem gebunden sind, wobei die Bindungen 2 Stunden in 38%igem NH&sub4;OH bei 55ºC beständig sind.

38. Gefäß nach einem der Ansprüche 31 bis 37, bei dem die Teilchen mit einer vernetzten Siloxanmatrix ausgestattet sind, an die die Oligonucleotide kovalent gebunden sind, um die säure- und basenstabilen Verknüpfungen der Oligonucleotide an die Teilchen bereitzustellen.

39. Gefäß nach einem der Ansprüche 32 bis 38, bei dem das Gefäß ein Volumen von 150 bis 250 ul aufweist.