[go: up one dir, main page]

FI107927B - Menetelmä polyetyleeni-proteiinikonjugaattien valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä polyetyleeni-proteiinikonjugaattien valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI107927B
FI107927B FI921267A FI921267A FI107927B FI 107927 B FI107927 B FI 107927B FI 921267 A FI921267 A FI 921267A FI 921267 A FI921267 A FI 921267A FI 107927 B FI107927 B FI 107927B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
protein
oxy
peg
sru
conjugate
Prior art date
Application number
FI921267A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI921267L (fi
FI921267A0 (fi
Inventor
John Hakimi
Perry Rosen
Patricia Kilian
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27101069&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI107927(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of FI921267A0 publication Critical patent/FI921267A0/fi
Publication of FI921267L publication Critical patent/FI921267L/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI107927B publication Critical patent/FI107927B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/964—Chemistry: molecular biology and microbiology including enzyme-ligand conjugate production, e.g. reducing rate of nonproductive linkage
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
  • Vending Machines For Individual Products (AREA)

Description

107927
Menetelmä polyetyleeni-proteiinikonjugaattien valmistamiseksi
Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä uusi-5 en proteiinien polyetyleeniglykoli (PEG) -konjugaattien valmistamiseksi. Tarkemmin, keksinnön kohteena on menetelmä fysiologisesti aktiivisen proteiinikonjugaatin valmistamiseksi, jonka kaava on 10 RI-a(CH2CH20\l-CH2CH2-F?N^ ^NH' - proteiini c
II
R3 Jm 15 jossa R1 on alempi alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiliatomia; R2 on -O- tai -NH-; R3 on =N-R4, =S tai =0; R4 on alempi C^g-alkyyli tai sykloalkyyli; m ja n ovat kokonaislukuja >. 1 valittuina siten, että konjugaatilla on ainakin osa konju-goimattoman proteiinin biologisesta aktiivisuudesta; ja 20 jossa proteiini on interleukiini-1, interleukiini-lra, . interferoni-α tai interleukiini 2, sillä edellytyksellä, ·1 että kun R2 on -0-, niin R3 ei ole =N-R4 ja että kun R2 on • · · *·«' -O- ja R3 on =0, niin proteiini ei ole interleukiini-2.
• ♦ *.2: Erilaisilla luonnon- ja rekombinanttiproteiineilla *:2: 25 on lääketieteellistä ja farmaseuttista käyttöä. Puhdistet-tuina, erotettuina ja formuloituina niitä voidaan antaa lääkkeeksi ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta erilaisiin terapeuttisiin tarkoituksiin. Ruoansulatuskanavan ulkopuo-lisesti annetut proteiinit voivat kuitenkin olla immuno- • · 4...# 30 geenisiä, ne voivat olla suhteellisen huonosti veteen liu- *Γ1 kenevia ja niiden farmakologinen puoliintumisaika saattaa ** ♦ 1·♦ olla lyhyt. Näistä syistä proteiinien terapeuttisesti ··· J ϊ käyttökelpoisten veritasojen saaminen potilaissa saattaa : [·. olla vaikeaa.
• · · • · · · 0 910 * · · 2 • · 2 107927 Nämä ongelmat voidaan voittaa konjugoimalla proteiinit polymeerien, kuten polyetyleeniglykolin (PEG), kanssa. Davis et ai. ovat US-patenttijulkaisussa 4 179 337 esittäneet polyetyleeniglykolin (PEG) konjugoimisen pro-5 teiineihin, kuten entsyymeihin ja insuliiniin tarkoituksella muodostaa konjugaatteja, joissa proteiini on vähemmän immunogeeninen ja säilyttää kuitenkin olennaisen osan fysiologisesta aktiivisuudestaan. Nakagawa et ai. ovat US-patenttijulkaisussa 4 791 192 esittäneet, että konjugoi-10 maila PEG-saarekkeita aktivoivaan proteiiniin saadaan sivuvaikutukset ja immunogeenisyys vähenemään. Veronese et ai., Applied Biochem. and Biotech. 11:141 - 152 (1985) kuvaavat polyetyleeniglykolien aktivoimisen fenyylikloori-formiaateilla käytettäviksi ribonukleaasin ja superoksidi-15 dimutaasin modifioimiseen. Katre et ai. ovat US-patentti-julkaisuissa 4 766 106 ja 4 917 888 esittäneet myös poly-meerikomjugointia proteiinin liuottamiseksi. PEG ja muut polymeerit voidaan konjugoida rekombinanttiproteiineihin näiden immunogeenisyyden vähentämiseksi ja puoliintumis-20 ajan pidentämiseksi. Katso Nitecki et ai., US-patenttijui-. kaisu 4 902 502, Enzon, Inc., kansainvälinen patenttihake- ·* mus PCT/US90/02133, Nishimura et ai., EP-patenttihakemus • * · *.ί·* 154 316 ja Tomasi, kansainvälinen patenttihakemus PCT/ • ♦ :.*·· US85/02 572. King et ai., Int. Archs. Allergy appi. Immun.
*·**! 25 66., 439 - 446 (1981) , ovat kuvanneet menetelmän proteii- nien liittämiseksi PEGriin käyttäen O-(RO-PEG)-S-karboks- • · amidometyyliditiokarbonaatti-välituotteita.
Aikaisempiin menetelmiin PEG-proteiinikonjugaattien muodostamiseksi ja näillä menetelmillä tuotettuihin konju- • ♦ ... 30 gaatteihin liittyy useita ongelmia. Eräs näistä ongelmista on, että muodostettaessa proteiini-PEG-konjugaatteja tie- • · • *·· tyillä menetelmillä proteiinit inaktivoituvat, joten tu- lokseksi saatujen konjugaattien biologinen aktiivisuus on « · · . heikko. Lisäksi näiden PEG-proteiinikonjugaattien muodos- • * · **’ I 35 tuksessa käytetyillä tietyillä liitäntäaineilla saattaa in • · · • · ♦ • · 3 107927 vivo olla taipumus pilkkoutua hydrolyyttisesti, Kun tällainen pilkkoutuminen tapahtuu lääkeannon jälkeen, niin nämä konjugaatit menettävät PEG:n aikaansaamat edulliset ominaisuudet.
5 Keksinnön kohteena on erityisesti menetelmä fysio logisesti aktiivisen proteiinikonjugaatin valmistamiseksi, jonka kaava on ii-O-fCHaC^O^-CHgCHa-R2^ ' Proteiini
10 \\ I
R3 J m jossa R1 on alempi alkyyli; R2 on -O- tai -NH-; R3 on =N-R4, =S tai =0; R4 on alempi alkyyli tai sykloalkyyli; m ja n 15 ovat kokonaislukuja k 1 valittuina siten, että konjugaa-tilla on ainakin osa konjugoimattoman proteiinin biologisesta aktiivisuudesta; sillä edellytyksellä, että kun R2 on -0-, niin R3 ei ole =N-R4; että kun R2 on -0- ja R3 on =0, niin proteiini on interferoni-α, interleukiini-1 tai in-20 terleukiini-lra ja että kun R2 on -0- ja R3 on =S, niin . proteiini ei ole tuoksukin siitepölystä peräisin oleva ·* ” antigeeni E eikä naudan plasma-albumiini.
• · · *·ί·* Erityisesti keksinnön kohteena ovat menetelmät seu- • · ·.*·! raavien kaavojen mukaisten proteiinikonjugaattien valmis- ’·*’! 25 tamiseksi: • · • · · • · ·
«Js Γ H H
N N· -* proteiini . r'-OICHjCHjO) -CH2CH2 (f Ι·Α ΐ: 30 ” NR< m ♦ · • · · • ·
• · __ «B
: ·· H
Ff-0(CH2CH20)n-CH2CH2-0. N — proteiini
I-B
: : : li m I 35 . S .
• · · • · · • · 4 107927 Γ Η Ν ΝΗ· “ proteiini ι / V· / ff-OtCHzCHaO^-CHzCH/ C j.c O m 5
N "I
H NH—proteiini / \ /
R1-0-(CH2CH20) ijCH2CH2' c l1D
10
O NH— proteiini tf-CHCHsCHgO) -CH2CH/ C j.E
O m 15 joissa kaavoissa R1, R4, m, n ja proteiini merkitsevät samaa kuin edellä.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle fysiologisesti aktiivisen proteiinikonjugaatin valmistamiseksi, jonka 2 0 kaava on R1-0-(CH2CH20)n-CHzCH2-Rz>s - proteiini
* 1 1 A
!::1i n (I) • : R3 m T‘: 25 • · • · · • · · • « • ··
: jossa R on alempi alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiliatomia; R
on -O- tai -NH-; R3 on =N-R4, =S tai =0; R4 on alempi C^g-·...! alkyyli tai sykloalkyyli; m ja n ovat kokonaislukuja >. 1 .···. 30 valittuina siten, että konjugaatilla on ainakin osa konju-goimattoman proteiinin biologisesta aktiivisuudesta; ja • · ί 2 jossa proteiini on interleukiini-1, interleukiini-lra, ··· interferoni-α tai interleukiini 2, sillä edellytyksellä, : että kun R2 on -O-, niin R3 ei ole =N-R4 ja että kun R2 on * · · ··· · » • · · • · · 2 • · 5 107927 -O- ja R3 on =0, niin proteiini ei ole interleukiini-2 on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti on myös ensimmäisen kerran valmistettu proteiinien interleukiini-l-re-5 septoriantagonistin (IL-Ira) ja interleukiini-1:n (IL-1) PEG-konjugaatit.
Tämän keksinnön mukaisesti kaavan I mukainen pro-teiinikonjugaatti valmistetaan kondensoimalla aktivoitu PEG, nimittäin PEG, jossa yksi hydroksiryhmä on korvattu 10 aktivoidulla liitäntäaineella, proteiinin yhden tai useamman vapaan aminoryhmän kanssa. Konjugaattien valmistuksessa käytetyillä aktivoiduilla PEG-yhdisteillä on seuraavat kaavat: 15 II-A R1 OCCF^CH^O)^- CH2CH2-N= C =N-R4
Π-B R10(CH2CH20)ir CH2CHf-- Ö—C
20
Vs]) :* II-C ^0(ΟΉ2Οί20)η-ch2ch2-nh — C -o -^N^ ::: Il :*·. o • · · • *· • ·
·:··: 25 II-D R!0(CH2CH20)n-CH2-CH2—N =C=S
• · • ·#· v : π-e r*o(cm2ch2ovch2ch2--nh—c —o—^NJk
Il Fr
S
* ··": 30 , II-F R0(CH2CH20)n<M2CH2-0—C —0 Γ·.. Il s • · • · 35 11-6 R'CKC^C^OVCHiCHj—0-C—0-U»NJ* 6 107927 joissa R1 on alempi alkyyli, R4 on alempi alkyyli tai syk-loalkyyli ja R5 on alempi alkyyli tai H ja n on kokonaisluku 1 - 1 000.
Kun keksinnön mukaisesti käytetään kaavan II-A, 5 II-B, II-C, II-D, II-E, II-F tai II-G mukaista aktivoitua PEG-yhdistettä konjugaatin muodostamiseksi, niin proteiinissa olevien vapaiden aminoryhmien ja PEG-yhdisteen välille muodostuu niitä liittävä sidos siten, että ainakin osa proteiinin biologisesta aktiivisuudesta säilyy samalla 10 kun proteiinin immunogeenisyys vähenee. Lisäksi liitosryh-mät, jotka muodostuvat keksinnön mukaisten konjugaattien valmistuksessa käyttäen mitä tahansa kaavojen II-A - II-G mukaisista aktivoiduista polyetyleeniglykoleista, saavat aikaan proteiinikonjugaatin, joka ei ole taipuvainen hyd-15 rolyyttisesti pilkkoutumaan ja jolla ei ole muita aikaisemmin tunnettujen PEG-proteiinikonjugaattien epäkohtia.
Keksinnön mukaisesti R1 ja R5 voivat olla mitä tahansa alempia alkyyliryhmiä, edullisesti ne ovat metyyli-ryhmiä. Ilmaisu alempi alkyyli tarkoittaa alempaa alkyyli-20 ryhmää, jossa on 1 - 6 hiiliatomia, kuten metyyliä, etyy-liä, n-propyyliä, isopropyyliä jne. Yleensä edullinen ai-
• · M
• . kyyliryhmä on alempi alkyyliryhmä, joka sisältää 1-4 • · · ···] hiiliatomia, ja edullisin niistä on metyyli.
• · · *· *ί Tämän keksinnön mukaisesti m ja n voidaan valita :** 25 kokonaisluvuista ^ 1 siten, että saadulla proteiinikonju-• · *.’·· gaatilla on ainakin osa konjugaatin muodostuksessa käyte- ♦#iϊ tyn proteiinin biologisesta aktiivisuudesta. On ilmeistä, että summa n + m on kääntäen verrannollinen konjugaatissa jäljellä olevaan proteiinin biologisen aktiivisuuden mää- .···. 3 0 rään. n:n numeroarvo tarkoittaa konjugaatin muodostukseen käytetyn polyetyleeniglykolin etyleeniglykoliyksiköiden i ** lukua, ja se on 1 - 1 000. Ilmaisu m tarkoittaa aktivoidun ··· PEG: n kanssa reagoivan proteiinin sisältämien vapaiden : .·. aminoryhmien lukua. m:n arvo on edullisesti 1 - 5 ja edul- ··· · .·. · 35 lisimmin 1. Mitä suurempi summan m + n arvo on, sitä suu- • ♦♦ • · 7 107927 rempi on konjugaatin molekyylipaino. Kaavojen II-A - II-G mukaisten polyetyleeniglykolipolymeerien ja kaavojen I ja I-A - I-E mukaisten proteiinikonjugaattien molekyylipainot pystyy alan asiantuntija helposti määrittämään. Määrite-5 tyistä molekyylipainoista voidaan johtaa m:n ja n:n arvot. Ilmaisuun proteiini sisältyvät toisaalta polypeptidit ja toisaalta niiden fysiologisesti hyväksyttävät additiosuo-lat.
Kun mikä tahansa kaavojen II-A - II-G mukaisista 10 yhdisteistä saatetaan reagoimaan sellaisen proteiinin kanssa, joka sisältää enemmän kuin yhden vapaan aminoryh-män, niin tuotettu konjugaatti saattaa muodostua erilaisten proteiini-PEG-konjugaattien seoksesta. Siinä tapauksessa, että proteiini sisältää kaksi vapaata aminoryhmää, 15 aktivoitu PEG voi reagoida joko yhden vapaan aminoryhmän kanssa tai molempien vapaiden aminoryhmien kanssa. Tässä tapauksessa seos sisältää konjugaattia, joka on muodostunut kahden vapaan aminoryhmän ja PEG:in välisessä reaktiossa, ja toista konjugaattia, joka on muodostunut yhden 20 vapaan aminoryhmän ja PEG:n välisessä reaktiossa. Kun seoksessa olevien molempien konjugaattien molekyylipainot • · * · * . ovat erilaiset, nämä konjugaatit voidaan erottaa toisis- • · ♦ ·**! taan tavanomaisin menetelmin kuten kromatografiällä. Sen • · » *· *· toteamiseksi, onko m ja n valittu sopivasti, erotetuilla *: 25 konjugaateilla voidaan suorittaa seulontakokeita biologi- • § V*: sen aktiivisuuden toteamiseksi samanlaisilla kokeilla, :T: joita käytetään lähtöproteiinin biologisen aktiivisuuden seulontaan, ja siten todeta, onko konjugaatissa jäljellä osa konjugaatin valmistukseen käytetyn proteiinin biologi- .···. 3 0 sesta aktiivisuudesta. Tällä tavoin m:n ja n.-n numeroarvot *·* voidaan säätää halutulla tavalla halutun aktiivisuuden • · ϊ ** saamiseksi.
M· :...· Tämän keksinnön edullisen toteutusmuodon mukaan m j .·. jän ovat mitä tahansa kokonaislukuja, joiden vaikutukses- V · 35 ta konjugaatin molekyylipaino ilman proteiinin painoa on • ·· • · 8 107927 noin 300 - noin 30 000 daltonia. Edullisen toteutusmuodon mukaan m on 1. Kun m on 1, niin konjugaatti voidaan muodostaa myös silloin, kun vapaita aminoryhmiä on kaksi tai useampia. Aktivoitu PEG-yhdiste reagoi ensin yhden pro-5 teiiniryhmissä olevan vapaan aminoryhmän kanssa. Reagens-sien (kuten proteiinin) konsentraatiota ja reaktio-olosuhteita säätämällä proteiinin sisältämien vapaiden aminoryh-mien PEG-yhdisteeseen liittymistä voidaan amiinikondensaa-tion standardimenetelmin säädellä. Kun proteiineihin si-10 sältyy yksi tai useampia vapaita aminoryhmiä, joista yksi vapaista aminoryhmistä on reaktiivisempi kuin muut amino-ryhmät, niin reaktio-olosuhteet voidaan valita siten, että proteiini saatetaan reagoimaan aktivoidun PEG-yhdisteen kanssa sellaisen kaavan I mukaisen yhdisteen muodostami-15 seksi, jossa m on 1. Muut vapaat aminoryhmät aminohapoissa, joista proteiini koostuu, voidaan sitten saattaa reagoimaan PEG:n kanssa antamalla kondensaatioreaktion jatkua kauemmin tai käyttämällä muita vahvempia reaktio-olosuhteita. Edullisessa menetelmässä, jossa m on 1, n on mikä 20 tahansa sellainen kokonaisluku, että konjugaatin muodosta- . van polyetyleeniglykolin molekyylipaino on 300 - 30 000 ·· · * * , daltonia, mikä vastaa n:n arvoa noin 6 - 680. Edullisemmin • · { ··· n on noin 28, 112 tai 225, jotka arvot vastaavat molekyy- *· ’ί lipainoja 1 325, 5 000 ja 10 000, jolloin kaikkein edulli- 25 sin n:n arvo on 112. Polyetyleeniglykolipolymeerin tunnuk- • ♦ !.*·· sena käytetään mieluummin molekyylipainoa kuin PEG-poly- ί|Γ: meerin toistuvien yksiköiden lukua, sillä kokonaisluku n vaihtelee mahdollisesti epähomogeenisissa PEG-lähtöaineis- sa, joiden määrittelemiseen tavallisesti käytetään keski- .···. 3 0 määräistä molekyylipainoa eikä toistuvien yksiköiden luku- *ί* määrää. Lähtöaineina käytettyjä, molekyylipainoltaan eri- • · : ** laisia PEG-yhdisteitä voidaan valmistaa alalla tunnetuin ··· ·...* menetelmin tai niitä on saatavissa kaupallisina tuotteina.
• j .·. Siinä tapauksessa, että molekyylipainojen määri- ί·# « #·] · 35 tyksellä saadut m:n ja n:n arvot eivät ole kokonaislukuja • ·♦ • · 9 107927 (kuten on tavallista), niin nämä arvot on pyöristetty tavallisella tavalla ylöspäin tai alaspäin.
Kun R4 on alempi alkyyli, niin se voi olla mikä tahansa alempi alkyyliryhmä, jossa on 1 - 6 hiiliatomia, ku-5 ten jokin edellä määritellyistä. Kun R5 on sykloalkyyli, se on edullisesti 3-7 hiiliatomia sisältävä sykloalkyyli, kuten syklopropyyli, syklopentyyli tai sykloheksyyli. Edullinen sykloalkyyliryhmä on sykloheksyyli.
Seuraavien esimerkkien otsikkoyhdisteiden nimet 10 ovat IUPAC-nimistön mukaiset. Näistä yhdisteistä voidaan kuitenkin käyttää myös seuraavia nimiä:
Esimerkit 1, 2, 3 ja 4: a-[[2-[(sykloheksyylikarbonimidoyyli)aminoetyyli]-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyylin) nimi on vaihtoehtoi-15 sesti a-[2-[[(sykloheksyyliamino)metyleeni]amino]etyyli]-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli).
Esimerkit IA, la ja Id: a-(2-kloorietyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidi-yylin) nimi on vaihtoehtoisesti a-metoksi-ω-(2-kloorietyy-20 li)poly(oksi-1,2-etaanidiyyli).
·, Esimerkit IB, Ib ja le: i · ·· ] . a-(2-atsidoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidi- ***. yylin) nimi on vaihtoehtoisesti a-metoksi-ω-(2-atsidoetyy- • « · *· *| li) poly (oksi-1,2-etaanidiyyli) .
* * 25 Esimerkit 1C, le ja lf: • · a-(2-aminoetyyli) -ω-metoksipoly (oksi-1,2-etaanidi- ··· V * yylin) nimi on vaihtoehtoisesti a-metoksi-ω-(2-aminoetyy- li)poly(oksi-1,2-etaanidiyyli).
·:··· Esimerkit 11, 11a, 11b, 12, 12A ja 13 - 17: .*·*. 30 a-metyyli-ω- [2- [ [ (2-pyridinyylioksi) karbonyyli] ami- «·· ./ no]etoksi]poly(oksi-1,2-etaanidiyylin) nimi on vaihtoeh- « « • ** toisesti a-[2[[(2-pyridinyylioksi)karbonyyli]amino] etyy- , *··.’ li]-ω-metoksipoly (oksi-1/2-etaanidiyyli) .
• ;*· Esimerkit 18, 18a, 19, 19A, 20, 20A, 21 ja 22: ··· · • · • * « • tl t · 10 107927 cc- [ (2-pyridinyylioksi) karbonyyli] -ω-metoksipoly (ok-si-1,2-etaanidiyylin) nimi on vaihtoehtoisesti α-metyyli-ω- [2- [ [ (2-pyridinyylioksi)karbonyyli]oksi]etoksi]poly(ok-si-1,2-etaanidiyyli).
5 Esimerkit 23 - 27: a- [2- (isotiosyanaatto) etyyli] -ω-metoksipoly(oksi- 1,2-etaanidiyylin) nimi on vaihtoehtoisesti a-[metoksi-ω-[2-(isotiosyanaatto)etyyli] poly (oksi-1,2-etaanidiyyli) . Esimerkki 28: 10 a-[(2-pyridinyylioksi) tiokarbonyyli]-ω-metoksipo- ly (oksi-1,2-etaanidiyylin) nimi on vaihtoehtoisesti ct-me-tyyli-ω- [2- [ [ (2-pyridinyylioksi)tiokarbonyyli]oksi]etoksi] poly (oksi-1, 2-etaanidiyyli) .
Esillä olevan keksinnön kohteena on myös menetelmä 15 yleisen kaavan I mukaisten tai yleisten kaavojen I-A - I-E mukaisten PEG-proteiinikonjugaattien valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että jokin aktivoiduista yhdisteistä, joiden yleiset kaavat ovat II-A R10(CH2CH2OXrCH2CH2-^=C=N~R4 2 0
Π-B R^O^CHPV CH2CHr- O - C
=:-: I ΐ * · · • ·· • · ·:··: 25 r5 ί\: ys
II-C R10(OrI2CH20)I7· CH2CH2-NH — C -O - WN JJ
• * Il
O
: Π-D R10(CH2CH20)n-CH2-CH2-^i =C=S
: *- Π-E R10(CH2CH20)n-CH2CH2—NH —C —0—\\
V I
; 35 : Π-F R1CXCH2CH20)n-CH2CH2”O—C —O'
S
11 107927 ? Π-G r'CKC^CHjOJj-CHjCHj-O— C—0-^νχ> 5 joissa R1, R5 ja n merkitsevät samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan proteiinin tai sen suolan sisältämän vapaan aminoryhmän kanssa ja proteiinikonjugaatti eristetään reaktioseoksesta.
10 Proteiiniin liitettävien yksittäisten PEG-johdan naisten synteesi sekä näiden johdannaisten reaktio proteiinin kanssa voidaan suorittaa erityisesti siten kuin seuraavissa kappaleissa ja esimerkeissä kuvataan.
Sellaisen proteiinikonjugaatin valmistamiseksi, 15 jossa R2 on -NH-, ja R3 on =N-R4 (kaavan I-A mukainen yhdiste) , voidaan käyttää seuraavan reaktiokaavion mukaista menetelmää:
R1CKCH2CH20)„CH2CH2-0H —2_► R10(CH2CH20)aCH2CH2X
20
.I-.. NaN3, DMF
• ·*· 1 F
• · · ··· • · • · · • ·· *:·*: 25 R10(OT2CH20)nCH2CH2NH2 "*-Hz- R10(CH2CH20)IlCH2CH2N3 • · • · · • · · • · • · · • · · • · ·
R4-N=C=S
• · · · · • · . r 30 ;·!* , HAHe.
i ” R10(CH2CH20)nCH2CH2N-C N-Fr • · • · ··· • ·
• · · TTT
• · «5 3 • · · • · · • · 12 107927 H S h R10(CH2CH20)nCH2CH2 N-Ö 'N-F? ca4>. R10(CH2CH20)nCH2CH2N:C=N - Ff* ΙΠ
5 Π A
H H
N N- - proteiini
R1-0(CH2CH20)n-CH2CH2// Y I-A
10 NR4 m " m jossa R1, R4, n, m ja proteiini merkitsevät samaa kuin edellä.
Reaktiokaaviossa PEG-molekyylin päässä oleva hyd- 15 roksyyliryhmä muutetaan halogeeniryhmäksi tavanomaisella tavalla kuten käsittelemällä tionyylihalogenidilla. Saatu PEG-halogenidi muutetaan atsidiksi tavanomaisella tavalla kuten käsittelemällä natriumatsidilla. PEG-atsidi voidaan sitten muuttaa amiiniksi tavanomaisella tavalla kuten hyd- 20 raamalla. PEG-amiini saatetaan sitten regoimaan alkyyli- . tai sykloalkyyli-isotiosyanaatin, kuten sykloheksyyli-iso- ·* tiosyanaatin, kanssa kaavan III mukaisen tiourean muodos- • · · *·ϊ.* tamiseksi, joka sitten desulfuroidaan tavanomaisella ta- • · ·.*·: valla kaavan II-A mukaiseksi yhdisteeksi, joka sisältää *·*"· 25 funktionaalisen karbodi-imi di ryhmän. Muutettaessa kaavan : *.i III mukainen tiourea kaavan IIA mukaiseksi PEG-karbodi- • · :*·*: imidiksi desulfurointlaineena käytetään edullisesti tri- fenyylifosfiinia.
Kaavan II-A mukainen PEG-karbodi-imidi voidaan sit- • · 30 ten kondensoida proteiinin kanssa missä tahansa sellaisis- *!' sa olosuhteissa, joita tavallisesti käytetään karbodi - imi - • · • ’·· dien kondensoinnissa amiinien kanssa. Tämä reaktio suori- • · · tetaan tavallisesti vesipitoisessa standardipuskuriliuok-
: .·. sessa, jonka pH-arvo on 7 - 9, jolloin saadaan kaavan I-A
• · · ! 35 mukainen konjugaatti. Kondensaatioreaktion tuloksena voi- • ·· • · 13 107927 daan proteiinissa olevien vapaiden aminoryhmien lukumäärästä ja reaktioajasta riippuen saada molekyylipainoltaan vaihtelevien PEG-proteiinikondensaattien seosta. PEG-pro-teiinikonjugaatit voidaan sitten jakaa erillisiksi kompo-5 nenteiksi tavanomaisin menetelmin kuten suurisuoritusky-kyisellä nestekromatografiällä tai geelielektroforeesilla.
Sellaisten proteiinikonjugaattien valmistamiseksi, joissa R2 on -O- ja R3 on =S (kaavan IB mukainen yhdiste) , voidaan käyttää seuraavan reaktiokaavion mukaista menetel-10 mää: r'0(CH2CHz0)„CH2CH2^»H +
VVY
15 ° S O
-- R^^CH^OT^-O. JO
20 YT
20 II-B s • · ·· *·ί·* NH2' proteiini « · • · · « · ·
• · 1 I
*:··: 25
Γ H
.·:*! R1-0(CH2CH20\1-CH2CH 2~0 Ni—proteiini [ Ϊ J» " • * ... 30 • · ··· ·· • · • ·· • jossa R1, m, n ja proteiini merkitsevät samaa kuin edellä.
. \ Tässä reaktiossa PEG:ia kuumennetaan palautusjääh- • · · ::: I 35 dyttäen 1, l-karbonotioyylibis-2 (1H) -pyridinonin kanssa • · · • · · • · 14 107927 korkealla kiehuvassa hiilivetyliuottimessa, jolloin saadaan kaavan II-B mukainen yhdiste. Kaavan II-B mukainen yhdiste voidaan kondensoida proteiinissa olevan yhden tai useamman vapaan aminoryhmän kanssa kaavan I-B mukaisen 5 konjugaatin saamiseksi noudattaen samankaltaista menetelmää kuin kaavan II-A mukaisen yhdisteen kondensaatiossa proteiinin kanssa kaavan I-A mukaisen konjugaattiseoksen muodostamiseksi. Saatu konjugaattiseos voidaan jakaa eri molekyylipainoisiin tuotteisiin edellä kuvatulla tavalla.
10 Vaihtoehtoisesti sellainen proteiinikonjugaatti, jossa R2 on -O- ja R3 on =S (kaavan I-B mukainen yhdiste) voidaan valmistaa esillä olevan keksinön mukaisesti seu-raavan reaktiokaavion mukaisella menetelmällä: 15 r1o(ch2ch2o)2ch2ch2oh + I 1 II | il
VI
20 o :;··· Λ /Ί . .·. R10(CH2CH20)nCH2CH20 ··· • · ♦ · ♦ « ··
•H 25 n-F
• ·
• · · I
·. ·: .···. I NH2- proteiini
T
H
j..; 30 R'-0(CH2CH20)n-CH2CH2-0v N -proteiini k Y1- “ ··· 1 • ♦ * · «·1 e : jossa R1, m, n ja proteiini merkitsevät samaa kuin edellä.
• · · · • · • · 1 • ♦♦ • ♦ 15 107927 Tämän kaavion mukaisesti PEG saatetaan reagoimaan orgaanisessa liuottimessa kaavan VI mukaisen tiokarbonaa-tin kanssa kaavan II-F mukaiseksi PEG-tiokarbonaatiksi. Tämän reaktion suorittamiseen voidaan käyttää mitä tahansa 5 tavanomaista menetelmää, jota käytetään tiokarbonaatin ja hydroksiryhmän välisessä kondensaatioreaktioissa.
Kaavan II-F mukainen yhdiste muutetaan kaavan I-B mukaiseksi konjugaatiksi kondensoimalla kaavan II-F mukainen yhdiste ainakin yhden proteiiniin sisältyvän vapaan 10 aminoryhmän kanssa. Tämä reaktio suoritetaan samalla tavalla kuin edellä kuvattu kaavan II-A mukaisen yhdisteen reaktio kaavan I-A mukaiseksi konjugaatiksi. Tässä reaktiossa saatu reaktiotuote voi käytetyn proteiinin vapaiden aminoryhmien määrästä riippuen koostua eri molekyylipa!-15 noisten konjugaattien seoksesta. Nämä konjugaatit voidaan jakaa eri molekyylipainoisiksi tuotteiksi edellä kuvatulla tavalla.
Sellainen proteiinikonjugaatti, jossa R2 on -NH- ja R3 on =0 (kaavan I-C mukainen yhdiste), voidaan valmistaa 20 noudattamalla seuraavan reaktiokaavion mukaista menetel- . mää: • · · · •H 2s (Y ♦ ale
y NY
• « · • ♦ · ;? “ (XOo ··· • · • ♦ ··· iv • · · • · · ··· · 1 · • · · • · · • · 1< 16 107927 R10(CH2CH20)nCH2CH2NH2
R10(CH2CH20)n-CH2CH2- N
H
10 n-C
NHr proteiini 'r
15 Γ H
N NH-- proteiini
R1-0(CH2CH20)n-CH2CH2/ Ό JC
0 2 0 jossa R1, R5, m, n ja proteiini merkitsevät samaa kuin . edellä.
M · ·
Kaavan IV mukainen yhdiste valmistetaan kondensoi- • « t maila fosgeeni 2-hydroksipyridiinin kanssa (substituoitu, • · · ’· *| jos R5 on alempi alkyyli) tavanomaisella happohalogenidin :*** 25 ja alkoholin välisessä kondensaatioreaktiossa käytetyllä • · J.*·* menetelmällä.
··· ϊ^ϊ : PEG-amiinin kondensaatio kaavan IV mukaisen yhdis teen kanssa suoritetaan kuumentamalla palautusjäähdyttäen halogeenihiilivetyliuottimessa, jolloin saadaan kaavan .···. 30 II-C mukainen yhdiste. Kaavan II-C mukainen yhdiste kon- « *** densoidaan yhden tai useamman vapaan aminoryhmän sisältä- ·· J *·· vän proteiinin kanssa kaavan I-C mukaiseksi yhdisteeksi.
• t·
ϊ,,.ϊ Tämä reaktio suoritetaan samalla tavalla kuin kaavan II-A
: .·. mukaisen yhdisteen kondensaatioreaktio kaavan I-A mukaisen • · · . 35 konjugaatin saamiseksi. Riippuen kaavan II-C kanssa rea- • · 17 107927 goivan proteiinin vapaiden arainoryhmien lukumäärästä kaavan I-C mukainen konjugaatti voidaan saada eri molekyyli-painoisten konjugaattien seoksena. Tämä konjugaattiseos voidaan erottaa edellä kuvatulla tavalla.
5 Sellaisen esillä olevan proteiinikonjugaatin val mistamiseksi keksinnön mukaisesti, jossa konjugaatissa R2 on -NH- ja R3 on =S (kaavan I-D mukainen yhdiste) voidaan käyttää seuraavan reaktiokaavion mukaista menetelmää: 10 R10(CH2CH20)nCH2CH2NH2 + di-2-pyridyylitionokarbonaatti
R10(CH2CH20)nCH2CH2N=C=S
15 II-D
| nh2- proteiini
20 Γ N
H ,NH +— proteiini :·'··· R'0-(CH2CH20)nCH2CH/ 'C m
• ·*· S
• · L
··· • · * « · • ·· » ♦
I-D
: · 25 • · V*j jossa R1, m, n ja proteiini merkitsevät samaa kuin edellä.
Ml ·#ί ϊ Tässä reaktiokaaviossa PEG-amiini saatetaan reagoi maan di-2-pyridyylitionokarbonaatin kanssa kaavan II-D mu-♦···· kaiseksi yhdisteeksi. Tässä menetelmässä voidaan käyttää 30 mitä tahansa tavanomaista amiinin ja tiokarbonaatin kon-
Ml • densointimenetelmää isotiosyanaatin valmistamiseksi. Kaa-• · ϊ *’ van II-D mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan proteiinin ··· ·...· kanssa kaavan I-D mukaisen konjugaatin muodostamiseksi : samalla tavalla kuin edellä kuvattiin kaavan II-A mukaisen I · · • M · J 35 yhdisteen muuttaminen kaavan I-A mukaiseksi yhdisteeksi.
• M • · 18 107927
Proteiiniin sisältyvien vapaiden aminoryhmien lukumäärästä riippuen kaavan II-D mukaisen yhdisteen kondensaatiossa proteiinin kanssa saadaan konjugaattiseos, joka voidaan erottaa erillisiksi komponenteiksi siten kuin edellä ku-5 vattiin kaavan I mukaisen konjugaatin komponenteiksi jakamisen yhteydessä.
Vaihtoehtoisesti kaavan I-D mukainen yhdiste voidaan valmistaa seuraavan reaktiokaavion mukaisesti:
10 S
r\ + ci-t-ci
R^N^OH
15 RR5 20 y • · · * . + • · · • * ♦ .*!*: R10(CH2CH20)2CH2CH2NH2 • · T*; 25
·*♦ · I
*·· f • · · ' ! ·:··: R10(CH2CH20)nCH2CH2NH/Xo/^ N ^ R5 30 *:** Π-Ε • · • · t .***. 1 NH2- proteiini *···’ i • · • ♦ · • · ♦ ··· ♦
: 35 I-D
• · · • · 19 107927
Kaavan V mukainen yhdiste valmistetaan kondensoi-malla tiofosgeeni 2-hydroksipyridiinin kanssa (substituoi-tu, kun R5 on alempi alkyyli) noudattaen mitä tahansa tavanomaista happohalogenidin ja alkoholin välistä konden-5 sointimenetelmäää. Yhdiste V saatetaan sitten reagoimaan PEG-amiinin kanssa siten kuin kaavan II-C mukaisen yhdisteen valmistuksen yhteydessä kuvattiin. Saatu yhdiste on kaavan II-E mukainen yhdiste. Kaavan II-E mukainen yhdiste kondensoidaan proteiinin yhden tai useamman vapaan amino-10 ryhmän kanssa, jolloin saadaan kaavan I-D mukainen konju-gaatti. Tämä reaktio suoritetaan samalla tavalla kuin kon-jugaatin I-A valmistus.
Sellaisen proteiinikonjugaatin valmistamiseksi keksinnön mukaisesti, jossa konjugaatissa R2 on -O- ja R3 on 15 0 (kaavan I-E mukainen yhdiste), voidaan käyttää seuraavaa reaktiokaaviota: R^CHiCHiOhC^CHiOH + 1 jT ji 20 | v:: X n :-'j RI0(CH2ai20)„CH2CH20/ T‘; 25 • · ·
*:.:·* II-G
• · · • · · | NHj- proteiini • · .**·. 30 • M * O NH--proteiini
!’*·· R1-0-(CH2CH20)n-CH2CH2/ I„E
Γ*: H m ·:* o • · • · · • · # .·. : 35 jossa R1, m, n ja proteiini merkitsevät samaa kuin edellä. • · · • · 20 107927
Edellä olevassa reaktiokaaviossa di-2-pyridyylikar-bonaatti saatetaan reagoimaan PEG-yhdisteen kanssa kaavan II-G mukaiseksi yhdisteeksi. Tämä reaktio suoritetaan kon-densoimalla tavanomaisissa alkoholin kondensoitiolosuh-5 teissä karbonaatin kanssa. Kaavan II-G mukainen yhdiste muutetaan kaavan I-E mukaiseksi yhdisteeksi kondensoimalla kaavan II-G mukainen yhdiste proteiinin yhden tai useamman vapaan aminoryhmän kanssa. Tämä reaktio suoritetaan samalla tavalla kuin edellä kuvattu kaavan II-A mukaisen yhdis-10 teen kondensointi kaavan I-A mukaiseksi yhdisteeksi. Näin saatu reaktioseos voi sisältää proteiiniin sisältyvien vapaiden arainoryhmien lukumäärästä riippuen kaavan I-E mukaisten konjugaattien seosta. Tämä seos koostuu eri mo-lekyylipainoisista konjugaateista. Eri konjugaatit voidaan 15 erottaa seoksesta edellä kuvatuilla menetelmillä.
Keksinnön edullisen toteutusmuodon mukaan voidaan valmistaa interferoni-a:n konjugaatti PEG:n kanssa seuraa-van reaktiokaavion mukaisesti: ? V)
: :* H
• · · • · ·
II-C
• · T*: 25 :*·.· NH2- interferoni-<x.
• · · · · • · · • · ·
H
. N NH— interferoni-Ot
jo R1-0(CH2CH2O)„-CH2CH2/' V
• o ·· • · • · · • · · jossa R1 on metyyli, n on noin 112. Tämä reaktio on erityi- : sen mielenkiintoinen koskien interferoni-α :n alatyyppiä « ·· ♦ • · • · * • · · • · 21 107927 interferoni-α-Α (käytetään myös nimitystä interferonien) .
Aktivoidun PEG-yhdisteen II-C synteesi on edellä kuvattu sellaisen proteiinikonjugaatin synteesin yhteydes-5 sä, jossa R2 on -NH- ja R3 on =0. Lopputuote interferoni-a-konjugaatti voidaan saada analogisesti edellä kuvatun kanssa tai analogisesti esimerkeissä kuvatun proteiinikonjugaatin I-C synteesin kanssa.
PEG:n kanssa konjugaatiksi voidaan muodostaa mikä 10 tahansa fysiologisesti aktiivinen proteiini tai sen suola edellyttäen, että proteiini sisältää ainakin yhden konden-soitumiseen sopivan aminoryhmän.
Esillä olevassa keksinnössä käytettäviksi sopivia edullisia proteiineja ovat interleukiini-1 (IL-1), inter-15 leukiini-l-reseptoriantagonisti (IL-lra), interleukiini-2 (IL-2) ja interferonit, nimittäin IFN-α (leukosyytti-interferonit) , IFN-S (fibroblasti-interefroni) ja IFN-γ (immuuni-interferoni) , niiden luonnossa esiintyvät muodot sekä analogit, homologit tai katkaistut muodot.
20 Interleukiini-l-reseptoriantagonisti (IL-lra) voi- •# daan tällöin saada kudosviljelmistä tai rekombinanttitek- • · · * . nilkalla. Erään menetelmän mukaan IL-lra voidaan valmistaa • · · käsittelemällä ihmisen myelomonosyyttisiä soluja U937 *· (ATCC CRL 1593) forbolimyristaattiasetaatti (PMA) -diffe- : * 25 rentiointlaineella ja sitten stimuloimalla niitä granu-• · ·.'·· losyytti-makrofagi-kolonian stimulointitekijällä (GM-CSF; • ·· ϊ^ϊ .* saatavissa firmasta Amgen) ja eristämällä ja puhdistamalla IL-lra viljelmän päällä olevasta nesteestä siten kuin Carter et ai., Nature 344, 633 - 637, (1990) ovat kuvan- ,···. 30 neet.
• Rekombinantti IL-lra viittaa IL-lra:hän, jonka bio- • · : ** loginen aktiivisuus on verrattavissa natiivisen IL-Ira:n ··· aktiivisuuteen, mutta joka on valmistettu edellä kuvatulla $ .·. Carterin et ai. tai Eisenbergin et ai., Nature 343. 341 - .·, : 35 346 (1990) kuvaamalla rekombinanttitekniikalla.
• ·« • · 22 107927
Interferoni käsittää kaikki interferonityypit, kuten α-, β-, γ- tai ω-interferonit ja näiden kaikki alatyypit. Interferoneja voidaan saada kudoksista tai kudosvil-jelraistä, tai niitä voidaan valmistaa rekombinanttiteknii-5 kalla, kuten kirjallisuudessa, esim. EP-hakemusjulkaisussa 43 980 on kuvattu. Muut menetelmät luonnon interferonien tai rekombinantti-interferonien saamiseksi ja eristämiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja.
Tämän keksinnön mukaisesti on todettu, että keksin-10 non mukaisesti valmistetuilla proteiinikonjugaateilla on samat käyttömahdollisuudet kuin konjugaatin valmistuksessa käytetyllä proteiinilla. Siten nämä konjugaatit ovat terapeuttisesti aktiivisia samalla tavalla kuin proteiini, josta ne on valmistettu, ja niitä voidaan käyttää samalla 15 tavalla kuin itse proteiinia, ilman että esiintyy sellaisia ei-toivottuja immuunivasteita, joita lääkkeensaajalla esiintyy itse proteiinia annettaessa. Siten tässä kuvataan myös kaavan I mukaisiin yhdisteisiin ja niiden suoloihin perustuvat farmaseuttiset koostumukset ja menetelmät näi-20 den valmistamiseksi.
. Tässä kuvatut sairauksien hoitoon tai ehkäisemiseen • · · käytetyt farmaseuttiset koostumukset sisältävät yleisen • · · *···] kaavan I mukaista proteiinikonjugaattia ja terapeuttisesti • « · '· vaikuttamatonta, myrkytöntä ja terapeuttisesti hyväksyttä- : 1 25 vää kantaja-ainetta. Käytettävät farmaseuttiset koostumuk- • · set voidaan formuloida ja annostaa hyvän lääketieteellisen • ·· J : : tavan mukaisesti ottaen huomioon käsiteltävä sairaus, hoi- dettavan potilaan tila, proteiinikonjugaatin annostuspaik-ka, annostusmenetelmä ja muut hoitavan lääkärin tuntemat .···. 30 eri tekijät.
• Seuraavat esimerkit kuvaavat esillä olevan keksin- • · • · ϊ 2 nön erilaisia toteutusmuotoja eivätkä ne rajoita keksinnön • · · ·...· suojapiiriä.
• · • · · • · · • ·· · · • · · • · · 2 • · 23 107927
Esimerkki 1 g- Γ2- Γ Γ (svklohekswlikarbonimidowli) amino! etwli-ω-metoksioolv(oksi-1.2-etaanidiyyli) SRU 117,7 ;n valmistus 5 A. g-(2-kloorietyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaa- nidiyyli) SRU 111,7:n valmistus (tässä käytettynä SRU tarkoittaa PEG-polymeerin sisältämien toistuvien yksikköjen lukua) MPEG:n (metoksipolyetyleeniglykoli, molekyylipaino 10 5 000) (50 g) ja tolueenin (700 ml) seoksesta tislattiin 200 ml liuotinta. Palautusjäähdyttäen kuumennettuun liuokseen lisättiin tipoittain 0,8 ml pyridiiniä ja 2,2 ml tio-nyylikloridia. 4 tunnin keittämisen jälkeen palautusjäähdyttäen reaktioseosta sekoitettiin yön yli. Sitten liuotin 15 poistettiin alennetussa paineessa ja jäännökseen lisättiin 500 ml CH2C12:a. Saatu liuos kuivattiin vedettömällä kaliumkarbonaatilla ja johdettiin emäksisen aluminiumoksidi-kerroksen (50 g, Wolem Super I) lävitse. Sitten suurin osa metyleenikloridista poistettiin alennetussa paineessa 20 ja jäännöksenä saatuun siirappiin lisättiin 1 litra di- \ etyylieetteriä. Eetteri poistettiin tislaamalla, sitten • ·· ] φ·φ lisättiin vielä dietyylieetteriä, jolloin muodostui sakka.
• t · **'. Seosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 2 tuntia, sitten • · · •’I seos suodatettiin, jolloin saatiin a- (2-kloorietyyli)-ω- • * 25 metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7 (45 g).
*. *i Analyysi, laskettu kaavalle C3H7C10 (CH2CH20) 111,7 : v : C 53,97; H 9,12; Cl 0,71. Saatu: C 54,21; H 8,70; Cl 0,71.
B. a-(2-atsidoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaa-*:··: nidiyyli) SRU 111,7 :n valmistus ·***· 30 20 g natriumatsidia ja 50 g a- (2-kloorietyyli) -ω- ··· metoksipoly (oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7 :ä kuumennet- ♦ · • ** tiin vedettömässä DMF:ssa 120 - 125 °C:ssa 7 tuntia. Sit- ··· • · *···* ten liuotin poistettiin suurvakuumissa. Jäännös liuotet- 1 · • tiin metyleenikloridiin (500 ml) ja suodatettiin diatomii- ··· · j'.J 35 tin lävitse. Sitten suurin osa metyleenikloridista haihdu- • · 24 107927 tettiin ja jäännökseen lisättiin dietyylieetteriä, jolloin saatiin sakka. Seosta sekoitettiin yön yli, sitten seos suodatettiin. Sakka liuotettiin 50 °C:ssa mahdollisimman pieneen määrään glyymiä, liuos jäähdytettiin ja saostunut 5 tuote suodatettiin, jolloin saatiin a-(2-atsidoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7.
Analyysi, laskettu kaavalle C3H3N30 (CH2CH20) 111,7 : C 53,77; H 9,09; N 0,84. Saatu: C 53,61; H 9,08; N 0,89.
C. a- (2-aminoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaani-10 diyyli) SRU 111,7:n valmistus a- (2-atsidoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:n (25 g) ja vedettömän glyymin (250 ml) seokseen lisättiin 3,5 g 10-%:ista Pd/C-katalysaattoria. Seosta hydrattiin ravistellen H2-paineessa 345 kPa 15 50 °C:ssa 18 tuntia. Sitten seos suodatettiin, kiinteä aine pestiin metyleenikloridilla ja yhdistetyt orgaaniset liuokset haihdutettiin alennetussa paineessa. Jäännös liuotettiin 100 ml:aan lämmintä glyymiä ja tuotteen annettiin saostua jäähdytetystä liuoksesta. Sakka suodatettiin 20 ja kuivattiin lämmittämällä alennetussa paineessa, jolloin ·, saatiin 23 g a-(2-aminoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2- . .·. etaanidiyyli) SRU lll,7:ä.
• · · V’. Analyysi, laskettu kaavalle C3H9NO (CH2CH20) 111,7: ** C 54,43; H 9,20; N 0,28. Saatu: C 54,43; H 9,18; N 0,36.
j | 25 Vaihtoehtoisessa menetelmässä a-(2-atsidoetyyli)-ω- • · · *•*1 metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:n (40 g) ja • · · *.· · trifenyylifosfiinin (6,7 g, 25,6 mmol) liuosta vedettömäs sä metyleenikloridissa (200 ml) sekoitettiin yön yli ar-*:**: gonkehässä. Seokseen lisättiin vettä (2 ml) ja sitten se- ·***· 3 0 koitettiin vielä 12 tuntia. Suurin osa metyleenikloridista ··· haihdutettiin vakuumissa ja jäännökseen lisättiin dietyy- • · ·..]* lieetteriä (400 ml) . Sakka suodatettiin, pestiin eetteril- • · *···* lä ja liuotettiin 300 ml:aan lämmintä (50 °C) glyymiä.
• :*: Seos sai seistä huoneebn lämpötilassa yön yli, muodostunut #·· ♦ •\j 35 sakka suodatettiin, pestiin glyymillä (2 x 100 ml) , di- • · 25 107927 etyylieetterillä (2 x 100 ml) ja kuivattiin vakuumissa N2-virrassa, jolloin saatiin 35 g a-(2-aminoetyyli)-ω-metok-sipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:ä.
D. a-[2-[[(sykloheksyyliamino)tiokarbonyyli]amino]-5 etyyli]-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:n valmistus cc-(2-aminoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:n (4 g) liuokseen vedettömässä glyymissä (60 ml) lisättiin 40 °C:ssa 0,1 ml sykloheksyyli-isotio-10 syanaattia. Liuosta sekoitettiin 40 °C:ssa 18 tuntia. Sitten seos suodatettiin ja liuotin poistettiin suurvakuumis-sa. Jäännös liuotettiin 100 ml:aan lämmintä glyymiä, liuos jäähdytettiin ja saatu sakka suodatettiin ja kuivattiin suurvakuumimssa, jolloin saatiin 3,5 g cc-[2-[ [ (syklohek-15 syyliamino)tiokarbonyyli]amino]etyyli]-ω-metoksipoly(oksi- 1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:ä.
Analyysi, laskettu kaavalle C1QH2oN2OS (CH2CH20) 111,7 : C 54,25; H 9,13; N 0,54; S 0,62. Saatu: C 54,39; H 8,87; N 0,55; S 0,59.
20 E. cc-[2- [ [(sykloheksyylikarbonimidoyyli)amino]etyy- li]-ω-metoksipoly (oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU lll,7:n vai- • * . ,·. mistus i · · !*’. a- [2- [ [ (sykloheksyyliamino) tiokarbonyyli] amino] - • * · * etyyli]-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:n j | 25 (lg), trifenyylifosfiinin (120 mg), CCl4:n (90 μΐ) ja tri- • · i *· *1 etyyliamiinin (84 μΐ) liuosta vedettömässä metyleeniklori- ··· :.· · dissa (5 ml) kuumennettiin palautus jäähdyttäen 72 tuntia.
Liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja jäännös liuo-*:**: tettiin mahdollisimman vähäiseen määrään vedetöntä glyy- •***j 3 0 miä. Liuos jäähdytettiin, saostunut tuote suodatettiin ja • · · kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin a-[2-[ [ (syklohek- • * syylikarbonimidoyyli)amino]etyyli] -ω-metoksipoly(oksi-1,2-*···’ etaanidiyyli) SRU 111,7.
• ;*: Analyysi laskettu kaavalle C10H18N2O (CH2CH20) 111,7: ··· · 35 C 54,61; H 9,15; N 0,55. Saatu: C 54,95; H 9,27; N 0,50.
« « 26 107927
Esimerkki la g- (2-kloorietwli) -ω-metoksipolv (oksi-1,2-etaanidi-wli) SRU 225 :n valmistus
Esimerkissä IA kuvatulla menetelmällä MPEG (mole-5 kyylipaino 10 000) muutettiin a-(2-kloorietyyli)-ω-metok- sipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 225:ksi.
Analyysi, laskettu kaavalle C3H7ClO (CH2CH20) 225: C 54,37; H 9,14; Cl 0,35. Saatu: C 54,30; H 9,15; Cl 0,41. Esimerkki Ib 10 g- (2-atsidoetwli) -ω-metoksipolv(oksi-1.2-etaanidi- vvli) SRU 225:n valmistus
Esimerkissä IB kuvatulla menetelmällä a-(2-kloorietyyli) -ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 225 muutettiin g-(2-atsidoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaani-15 diyyli) SRU 225:ksi.
Analyysi, laskettu kaavalle C3H7N30 (CH2CH20) 225: C 54,34; H 9,13; N 0,42. Saatu: C 54,32; H 9,28; N 0,50. Esimerkki le g - (2-aminoetwli) -ω-metoksipolv (oksi-1.2-etaanidi-20 wli) SRU 225:n valmistus ·. Esimerkissä 1C kuvatulla menetelmällä a-(2-atsido-
• M
... etyyli) -ω-metoksipoly (oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 225 muu- • · Γ*. tettiin a-(2-aminoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidi- • · · *' *5 yyli) SRU 225 :ksi.
* * 25 Analyysi, laskettu kaavalle C3H9NO (CH2CH20) 225: ·*.**: C 54,48; H 9,17; N 0,14. Saatu: C 54,80; H 9,21; N 0,12.
··· V · Esimerkki Id g- (2-kloorietwli) -ω-metoksipolv (oksi-1.2-etaanidi -·:··; vvli) SRU 28.3 :n valmistus ·***. 30 Vastatislatun oksalyylikloridin (0,5 ml) liuokseen M· ..· 40 ml:ssa vedetöntä metyleenikloridia tiputettiin 0 °C:ssa • · 0,5 ml vedetöntä DMF:a 10 ml:ssa metyleenikloridia. Saa-*...* tu liuos lämmitettiin huoneenlämpötilaan, sitä sekoitet- • ;'· tiin 15 minuuttia ja sitten liuos jäähdytettiin jälleen • ·· · .*.#i 35 0 °C:seen. Sitten lisättiin 5,6 g MPEG:tä (molekyylipaino • · 27 107927 1 325) ja saatua liuosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 5 tuntia. Seos kaadettiin veteen ja uutettiin metyleeni-kloridilla. CH2Cl2-liuos kuivattiin (MgS04) ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin 1,7 g g-(2-5 kloorietyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 28,3:a valkeana jauheena.
Analyysi, laskettu kaavalle C3H7C10 (CH2CH20) 28,3 : C 53,38; H 9,03; Cl 2,64. Saatu: C 53,48; H 9,10; Cl 2,41. Esimerkki le 10 g- (2-atBidoetwli) -ω-metoksipolv(oksi-1,2-etaanidi- vvli) SRU 28.3:n valmistus
Esimerkissä IB kuvatulla menetelmällä a-(2-kloori-etyyli) -ω-metoksipoly (oksi-1, 2-etaanidiyyli) SRU 28,3 muutettiin a-(2-atsidoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaani-15 diyyli) SRU 28,3:ksi.
Analyysi, laskettu kaavalle C3H7N30 (CH2CH20) 28,3 : C 53,12; H 8,99; N 3,11. Saatu: C 53,21; H 9,07; n 2,98. Esimerkki lf g-(2-aminoetwli)-ω-metoksipolv(oksi-1.2-etaanidi-20 vvli) SRU 28,3:n valmistus
Esimerkissä 1C kuvatulla menetelmällä a-(2-atsido-. etyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 28,3 muu-
• M
: tettiin g-(2-aminoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidi- • ·· yyli) SRU 28,3:ksi.
* ♦ l . 25 Analyysi, laskettu kaavalle C3H9NO (CH2CH20) 28,3: • · · C 54,47; H 9,17; N 0,14. Saatu: C 54,44; H 9,19; N 0,15.
• · · *·* * Esimerkki 2
Rekombinantti-interferoni-g:n (IFN-g) PEG-koniuaaa- *i,,: tin valmistus g- Γ2- Γ Γ (svklohekswlikarbonimidow- ··· 30 li)amino1 etvvlil -ω-metoksipolv(oksi-1.2-etaanidivv- ··) li) SRU 111.7 reaaenssin avulla • ··
Esimerkin 1 mukaisesti valmistettua a-[2-[ [syklo- • · *** heksyylikarbonimidoyyli) amino] etyyli] -ω-metoksipoly (oksi- • · ·.· · 1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7 lisättiin 1 mg:aan homogeenis- :\j 35 ta IFN-a:a 200 ^l:ssa puskuriliuosta (0,1-m natriumboraat- 28 107927 ti, pH 9,0) moolisuhteessa 10 moolia reagenssia yhtä IFN-a:n moolia kohti. Liuoksia sekoitettiin perusteellisesti ja pegylointireaktion annettiin jatkua huoneenlämpötilassa 60 minuuttia.
5 IFN-a:n johdannaismuodostus (pegylointi) määritet tiin SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesilla (SDS-PAGE) (taulukko 1) . Proteiinit saatiin näkyviksi Coomas-sie-sinivärjäyksellä. 60 minuutin reaktion jälkeen saatujen tuotteiden analyysi osoitti, että oli muodostunut PEG-10 konjugoitua IFN-a:a vastaavia uusia korkeampimolekyylipai-noisia proteiinilajeja. IFN-a:n näennäinen molekyylipaino on SDS-PAGE:11a määritettynä 15 kD. Modifioimaton IFN-a, jonka näennäinen molekyylipaino pysyy muuttumattomana, ei siten ole konjugoitu PEG:n kanssa. PEG-modifioidun IFN-a-15 tuotteen näennäinen molekyylipaino on 28 kD.
Taulukko I: IFN-a:n modifiointi esimerkissä 1 kuvatulla reagenssilla iFN-proteiinin näennäinen Reaktiossa saatu %:eina 20 molekyylipaino (kD) koko proteiinimäärästä 15 (modif ioimaton) 80 ϊ 28 20 «·· • ♦ • · « • ·« • *
Esimerkki 3 • » ; 25 Rekombinantti-interleukiini-2 :n (rIL-2) PEG-koniu- • ·· !..* paatin valmistus α- Γ2- Γ Γ (svkloheksvvlikarbonimido- • · · * * vvlil amino) etvvlil -ω-metoksipolv(oksi-1.. 2-etaanidi- wli) SRU 111.7 reaqenssin avulla * * Esimerkin 1 mukaisesti valmistettua a-[2-[[(syklo- ··· 30 heksyylikarbonimidoyyli] amino] etyyli] -ω-metoksipoly (oksi-:·. 1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7 lisättiin 2 mg:aan rIL-2:a
• M
.···. 200 ^l:ssa puskuriliuosta (0,1-m natriumboraatti, pH 9,0) • · *1* moolisuhteessa 10 moolia reagenssia yhtä rIL-2:n moolia • · j.: : kohti. Liuoksia sekoitettiin perusteellisesti ja reaktion * · •#*.j 35 annettiin jatkua huoneenlämpötilassa 60 minuuttia.
29 107927
Proteiinin johdannaismuodostus (pegylointi) määritettiin SDS-PAGE:lla (taulukko 21) . Proteiinit saatiin näkyviksi Coomassie-sinivärjäyksellä. 60 minuutin reaktion jälkeen saatujen tuotteiden analyysi osoitti, että oli 5 muodostunut rIL-2:ta vastaavia uusia PEG-konjugoituja kor-keampimolekyylipainoisia proteiinilajeja. rIL-2:n näennäinen molekyylipaino on SDS-PAGE:lla määritettynä 15 kD. Reaktioseoksesta erotettu proteiini, jonka molekyylipaino pysyy muuttumattomana, on modifioimaton rIL-2, joka ei 10 ole konjugoitu PEG:n kanssa. Pääasiallisena tuotteena saadun PEG-modifioidun rIL-2:n näennäinen molekyylipaino on 28 kD.
Taulukko II: rIL-2-proteiinin modifiointi esimerkissä 1 15 kuvatulla reagenssilla rIL-2-proteiinin näennäinen Reaktiossa saatu %:eina molekyylipaino (kD) koko proteiinimäärästä 15 (modifioimaton) 20 28 50 20 33 20 43 10 9 • 99 “99 999 : Pegyloitu rIL-2 puhdistettiin reaktioseoksesta
Kartren et ai. [Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 84:1483 - 1491 m1m j 25 (1987)] kuvaamalla tavalla käyttäen hydrofobista ionin- J..1 vaihtokromatografiaa (Bio-Rad; Biogel-phenyl 5-PW) . PEG- *** modifioidun ja modifioimattoman rIL-2:n erottamiseen käytettiin lineaarista gradienttia, jossa (NH4) 2S04-pitoisuus **** 50 mM-natriumfosfaattiliuoksessa (pH 7,0) alennettiin 30 999 30 minuutin aikana 1,53-molaarisesta 0,0-molaariseen. Frak- ;·. tion alikvooteista tehtiin SDS-PAGE-määrityksiä ja yhdis- .···. tettyjen fraktioiden ominaisaktiivisuus testattiin CTLL- 9 9 Γ soluproliferaatio-kokeella menetelmällä, jonka ovat kuvan- 9 9 : neet Gillis et ai. [J. Immunology 120:2027 - 2032 (1978)] .
• · 35 Proteiinikonsentraatiot määritettiin spektrofotometrisesti 30 107927 aaltopituudella 280 nm käyttäen rIL-2:lle ekstinktioker-rointa 0,667. Eristettyjen rIL-2-proteiinien ominaisaktii-visuus ilmoitetaan yksikköinä/mg proteiinia ja tulokset on koottu taulukkoon III. On ilmeistä, että rIL-2:n omainais-5 aktiivisuus ei ole merkitsevästi muuttunut PEG-konjugaation vaikutuksesta.
Taulukko III: Esimerkissä 1 kuvatulla reagenssilla PEG-konjugoidun rIL-2:n bioaktiivisuus 10 rIL-2-proteiinin näennäinen Ominaisaktiivisuus ominaispaino (yks./mg) 15 (modifioimaton IL-2) 2,0 x 107 28 2,4 x 107 15 Esimerkki 4
Rekombinantti-interleukiini-l-«:n (rIL-1-α) PEG-koniuqaatin valmistus α- Γ2- Γ Γ (svkloheksyvlikarboni-midoyvlil amino! etvvlil -ω-metoksipolv (oksi-1.2-etaa-nidiwli) SRU 111,7 reaqenssin avulla 20 Esimerkissä 1 kuvattua reagenssia lisättiin 2,0 • *.. mgraan homogeenista rIL-l-a:a 1,0 ml: ssa 0,1-m natriumbo- • :*: raattia, pH 9,0, moolisuhteessa 10 moolia reagenssia yhtä ··· rIL-l-a:n moolia kohti. Liuosta sekoitettiin perusteella- • · sesti ja pegylointireaktion annettiin jatkua huoneenlämpö-.·, · 25 tilassa 60 minuuttia.
β M
J..* Proteiinin johdannaismuodostus (pegylointi) määri- • · · • tettiin SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesilla (SDS-PAGE) (taulukko IV). Proteiinit saatiin näkyviksi Coomas- ’ * sie-sinivärjäyksellä. 60 minuutin reaktion jälkeen saatu-
• M
3 0 jen tuotteiden analyysi osoitti, että oli muodostunut rIL- i*. 1-a-proteiinia vastaavia PEG-komjugoituja uusia korkeampi- ,·»·, molekyylipainoisia proteiinilajeja. rIL-l-ot:n näennäinen • · *!* molekyylipaino on SDS-PAGE:lla määritettynä 17 kD. Modi- f : fioimaton rIL-1-α on reaktioseoksen sisältämä proteiini, • · 3 5 jonka näennäinen molekyylipaino pysyy muuttumattomana, 31 107927 eikä siten ole konjugoitu PEG:n kanssa. PEG-modifioidun rIL-l-g-tuotteen näennäinen molekyylipaino on 30 kD.
Taulukko IV: rIL-l-a:n modifiointi esimerkissä 1 kuvatulla 5 reagenssilla rIL-l-a-proteiinin näennäinen Reaktiossa saatu %:eina molekyylipaino (kD) koko proteiinimäärästä 17 (modifioimaton) 85 30 15 10
Esimerkki 5 g-Γ(1.2-dihvdro-2-okso-l-Oyridinwli)tiokarbonvv-
lil-ω-metoksipolv(oksi-1,2-etaanidivvli)_SRU
111,7:n valmistus 15 MPEG:n (metoksipolyetyleeniglykoli) (molekyylipaino 5 000) (lg) liuoksesta 15 ml:ssa vedetöntä tolueenia tislattiin pois 5 ml liuotinta. Saatu liuos jäähdytettiin ja siihen lisättiin 46,5 mg (0,2 mmol) 1,1-karbonotioyy Iibis-2(1H)-pyridinonia. Sitten seosta kuumennettiin palautus-20 jäähdyttäen argonkehässä 4 tuntia. Liuotin poistettiin sitten vakuumissa, jäännös liuotettiin 5 ml .-aan vedetöntä • ** glyymiä ja liuoksen annettiin seistä yön yli. Muodostunut sakka suodatettiin ja pestiin vedettömällä glyymillä (2 x ♦ « i/·· 5 ml) ja dietyylieetterillä (5 ml). Tuote kuivattiin sit- *:**: 25 ten vakuumiuunissa hitaassa typpi virrassa, jolloin saatiin :*·.· 0,96 g g-[ (1,2-dihydro-2-okso-l-pyridinyyli) tiokarbonyy- • · li] -ω-metoksipoly (oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:ä.
Analyysi, laskettu kaavalle CgH^NC^S (CH2CH20) 111,7 :
ββφ#: C 54,37; H 8,99; N 0,27; S 0,62. Saatu: C 54,03; H 8,98; N
!..* 30 0,18; S 0,59.
• ♦ **·* Esimerkki 5a g - Γ (1,2-dihvdro-2-okso-l-pvridinwli) tiokarbonw-lii-ω-metoksipolv(oksi-1.2-etaanidivyli) SRU 225:n • · · . *. valmistus • · · 1 | 35 Noudattamalla esimerkin 5 menetelmää MPEG (metoksi- • · · ’· polyetyleeniglykoli) (molekyylipaino 10 000) muutettiin 32 107927 α-[(1,2-dihydro-2-okso-l-pyridinyyli)tiokarbonyyli]-ω-me-toksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 225:ksi.
Analyysi, laskettu kaavalle C9H11N03S (CH2CH20) 225: C 54,54; H 9,08; N 0,14; S 0,32. Saatu: C 54,38; H 9,16; 5 N 0,15; S, 031.
Esimerkki 6
Interleukiini-1-reseptori-antagonistin_(IL-lra) PEG - koni uqaa tin valmistus «-Γ (1.2-dihvdro-2-okso-l-pvridinvvli)tiokarbonvvlil -ω-metoksipolv(oksi-1.2-10 etaanidiwli) SRU 111,7 :n avulla
Esimerkin 5 mukaisesti valmistettua a-[ (1,2-dihyd-ro-2-okso-l-pyridinyyli) tiokarbonyyli] -ω-metoksipoly(oksi- 1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:ä lisättiin 10 mg:aan homogeenista IL-lra-proteiinia 1,0 ml:ssa puskuria (0,1-m nat-15 riumboraatti, pH 9,0) moolisuhteessa 5 moolia reagenssia yhtä IL-lra:n moolia kohti. Liuosta sekoitettiin perusteellisesti ja pegylointireaktion annettiin jatkua huoneenlämpötilassa 60 minuuttia.
Proteiinin johdannaismuodostus (pegylointi) määri-20 tettiin SDS-polyakryyliamidi-geelielektroforeesilla (SDS- PAGE) (taulukko V) . Proteiinit saatiin näkyviksi Coomas- • ’1 sie-sinivärjäyksellä. 60 minuutin reaktion jälkeen saatu- • · » jen tuotteiden analyysi osoitti, että oli muodostunut IL- • · lra-proteiinia vastaavia uusia PEG-konjugoituja korkeampi- *;2: 25 molekyylipainoisia proteiinilajeja. IL-lra:n näennäinen :1·.· molekyylipaino SDS-PAGE:lla määritettynä on 19 kD. Reak- • · ;’j1. tioseoksen sisältämä modifioimaton IL-lra on proteiini, jonka näennäinen molekyylipaino pysyy muuttumattomana, ..... eikä se siten ole konjugoitu PEG:n kanssa. Pääasiallisesti • · ... 30 muodostuneiden PEG-modifioitujen IL-lra-tuotteiden näen- • 1 **· näiset molekyylipainot ovat 26 ja 33 kD.
• · • · • · · • · · • 1 • 1 ··· • « • · · • · · • · · · · • · · • · · 2 • · 33 107927
Taulukko V: IL-Ira:n modifiointi esimerkissä 5 kuvatulla reagenssilla IL-lra-proteiinin näennäinen Reaktiossa saatu %:eina molekyylipaino (kD) koko proteiinimäärästä 5 19 (modifioimaton) 36 26 33 33 21 >33 10 10 Pegyloitu IL-lra puhdistettiin reaktioseoksesta käyttäen hydrofobista ioninvaihtokromatografiaa (Bio-Rad; HRLC MP7 HIC). PEG-modifioidun ja modifioimattoman IL-lra: n erottamiseen käytettiin lineaarista gradienttia, jossa (NH4) 2S04-pitoisuus 50 mM-natriumfosfaattiliuoksessa 15 (pH 7,0) alennettiin 20 minuutin aikana 0,43-molaarisesta 0,0-molaariseen. Fraktion alikvooteista tehtiin SDS-PAGE-määrityksiä ja yhdistetyt fraktiot testattiin kilpailevalla IL-l-radioreseptorisidontakokeella [Kilian et ai. [J. Immunology 136:4509 - 4514 (1986)]. Lyhyesti selitettynä: 20 IL-Ira:ta ja PEG-IL-Ira:ta inkuboitiin eri konsentraatioi-. na EL-4 membraanien kanssa 30 minuuttia 37 °C:ssa. Sitten • " lisättiin [125I] IL-1-α ja inkubointia jatkettiin 30 minuut- « · · *.i.‘ tia. Koe päätettiin vakuumisuodattamalla ja ottamalla tai- • · ·.**: teen suodatinlevyiltä soluihin sitoutunut [125I]IL-l. IL- 25 lra:n tai PEG-IL-Ira:n konsentraatio, joka estää [125I] IL-:\i l:n sitoutumisen 50-%:isesti (IC50) määritettiin graafises- ti. Tulokset nähdään taulukossa VI. IL-Ira:n IC50 tässä ko-keessa on 1 - 2,0 ng/ml. Pegyloitu IL-lra-seos säilytti kykynsä sitoutua IL-l-reseptoriin EL-4 membraaneilla si- • · ... 30 toutumisen ollessa 2-3-kertainen verrattuna modifioimat- • p *;* toman IL-Ira:n sitoutumiseen.
• · • · • · · « • · · • · • · ♦ · · • · • · · • · · • · · · « · • · · • · · • · 34 107927
Taulukko VI: Esimerkissä 5 kuvatulla reagenssilla konju-goidun IL-lra:n kyky estää [125I]IL-l:n sitoutuminen IL-lra-proteiinin näennäinen molekyylipaino (kD) ICB0 (ng/ml) 5 19K (modifioimaton) 2,0 26K, 33K (seos) 5,0 IL-lra-proteiinin farmakodynaamiset ominaisuudet arvioitiin in vivo testaamalla ILra:n kyky estää rIL-la:n 10 indusoima interleukiini-6:n muodostuminen. rIL-la:lla käsiteltyjen hiirien seerumin IL-6-pitoisuudet ovat korkeat [McIntosh et ai., Immunol. 143: 162 - 167 (1989)]. Antamalla hiirille modifioimatonta IL-lra:ta yhdessä IL-la:n kanssa (ajankohta 0 h) IL-6 muodostuminen estyy. Tätä koe-15 systeemiä käytettiin modifioimattoman ja PEG-IL-lra:n far-makodynaamisten ominaisuuksien vertaamiseen. Kolmen naaraspuolisen C57Bl/6-hiiren muodostamat ryhmät saivat ihonalaisena injektiona 200 μg modifioimatonta IL-lra:ta tai PEG-ILlra:ta 48 h, 24 h tai 6 h ennen rIL-lan (0,2 μg) 20 antamista tai samanaikaisesti (0 h) rIL-la:n (0,2 ^g) . kanssa. 3 tuntia myöhemmin hiiristä otettiin seeruminäyt- • [1 teet. IL-6-tasot (yksiköt) määritettiin käyttäen aikai- • · « ’·ί·1 semmin kuvatun IL-6-kokeen muunnosta [Van Snick et ai., • · :.1·ί Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 9679 - 9683)]. IL-6-kokees- *;2· 25 sa B9-hybridoma-soluja käsiteltiin 96-syvennyksisillä mik-• · !/.: rotitterilevyillä koeseerumm kaksinkertaisilla sarjalai- mennuksilla. 3 vuorokauden inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa kosteutetussa C02:n (5 %) ja ilman (95 %) seoksessa syven-nyksiin lisättiin 0,5 μΟί tritioitua tymidiiniä ja inku- • ♦ ... 3 0 bointia jatkettiin vielä 18 tuntia. Sitten solut koottiin *!1 lasikuitusuotimille ja niihin sisältyvän tritioidun tyrni- ·♦ • 1·· diinin taso määritettiin tuikelaskurilla. IL-6-aktiivisuus ilmoitetaan yksikköinä/ml (U/ml) . IL-6-yksiköt määritel- : 1·. lään sen seerumilaimennuksen käänteisarvoksi, joka tuottaa • · · ♦ ·· · · • · · • · · 2 • · 35 107927 tritioidun tymidiinin maksimitason puoliarvon vertailu-standardiin verrattuna.
Farmakodynaamiset koetulokset on koottu taulukkoon Dl. Pelkästään IL-l:llä käsitellyillä hiirillä saatiin 5 koetulos 28 852 U/ml IL-6. Sekä modifioimaton että modifioitu IL-lra ehkäisi IL-6:n muodostusta 0 h kokeessa. Pegyloidulla IL-lra:11a saatiin kuitenkin pitempiaikainen IL-6:n estovaikutus kuin modifioimattomalla IL-lra:11a 8 h ja 24 h kokeissa.
10
Taulukko Dl: Esimerkissä 5 kuvatun reagenssin kanssa kon-jugoidun IL-lra:n farmakodynaaminen profiili Aika (h) ennen IL-l:n IL-6 (yks./ml)
antamista 19 kD 26 kD
15 0 772 705 6 8 361 1 587 24 22 525 9 844 48 18 485 21 119 72 13 220 21 470 20
. Esimerkki 6A
• / a- Γ (1.2-dihvdro-2-okso-l-pvridinwli) tiokarbonw- • ♦ · ***** lii-ω-metoksipolv (oksi-1.2-etaanidiwli) SRU 225 -reagenssin avulla PEG:n kanssa koniugoidun inter- ***** 25 leukiini-l-reseptoriantaqonistin (IL-lra) valmistus • · IL-lra konjugoitiin ja puhdistettiin esimerkissä 6 :*;*: kuvatulla menetelmällä käyttäen esimerkissä 5a kuvattua reagenssia.
Pääasiallisesti saatujen PEG-modifioitujen IL-lra- • · .···. 30 proteiinien näennäiset molekyylipainot olivat 33 kD ja *Γ 48 kD. 33 kD proteiinin osuus oli 46 % ja 48 kD proteiinin ·♦ • *·· 27 % reaktioseoksen koko proteiinimäärästä.
··· Näiden proteiinien kyky inhiboida IL-l:n sitoutumi- ; |·. nen testattiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla, ja se on • · · \ 35 yhteenvetona taulukossa VII. 33 kD:n PEG-modifioitu pro- • · · • · 36 107927 teiini säilytti kykynsä inhiboida IL-l:n sitoutumista kuusinkertaisena verrattuna ILl-ra:han, ja vahvemmin PEG-mo-difioidulla proteiinilla, 48 kD proteiinilla tulokseksi saatiin IL-l-reseptoriin sitoutumisen olennainen häviämi-5 nen.
Taulukko VII: Esimerkissä 5a kuvatun reagenssin kanssa konjugoitujen IL-lra-proteiinien estovaikutus [125I]IL-l:n sitoutumiseen 10 IL-lra-proteiinin näennäinen molekyylipaino (kD) IC50 (ng/ml) 19 (modifioimaton) 1,6 33 9,0 48 50,0 15 PEG-IL-Ira:n farmakokineettisen profiilin määrittämiseksi C57BF/6-hiirille annettiin ihonalaisesti 100 μg modifioituja tai pegyloituja IL-lra-lajeja. Modifioimaton-ta IL-lra:ta saaneista hiiristä otettiin seeruminäytteet 20 1, 2, 3, 4 ja 6 tunnin kuluttua ja PEG-IL-Ira: ta saaneista . hiiristä 2, 4, 8, 10 ja 24 tunnin kuluttua. Seerumitasot * / määritettiin esimerkissä 6 kuvatulla EL4- membraani-sitou- • · · *·:·1 tumiskokeella. Tulokset on koottu taulukoon D2. PEG-IL- • ·
Ira:ta esiintyi seeruminäytteissä suurempina konsentraa- *:1’· 25 tioina ja pidemmän aikaa kuin IL-lra:ta, mikä osoittaa • · !/·· pidentynyttä vaikutusta seerumissa.
··· m · · • · · ·#··· • · • · · • · « • · · ·· • · • · · • · « • · • · ♦ · · · f · · * · · * « · ♦ • · • · · • ·· • · 37 107927
Taulukko D2: Esimerkin 6a mukaisesti pegyloidun IL-Ira:n farmakokineettinen profiili IL-Ira:n seerumikon-sentraatio
5 Aika (h) IL-lra:n antamisesta 19 kD 33 kD
1 400 2 130 2 500 3 40 4 15 800 10 6 16 8 300 10 250 24 15 15 Esimerkki 7 rIL-l-a:n PEG-konnuqaatin valmistus α-Γ (1,2-dihvd-ro-2-okso-l-pyridinyyli)tiokarbonvvlil-ω-metoksipo-lv (oksi-1,2-etaanidiwli) SRU 111.7 reaaenssin avulla 20 Rekombinantti IL-la pegyloitiin esimerkissä 5 kuva- . tulla reagenssilla noudattaen esimerkissä 4 kuvattua mene- • ** telmää. Reaktioseoksesta identifioitiin SDS-PAGE:lla 3 mo- ♦ ♦ · *·:·| lekyylipainoltaan vallitsevaa lajia, joiden näennäiset mo- *. *J lekyylipainot olivat 17 (modifioimaton) , 26 ja 33 kD. Kah- 25 den viimeksi mainitun osuus koko proteiinimäärästä oli • · ί vastaavasti 25 ja 55 %.
:*·*: Pegyloitu rIL-Ια puhdistettiin reaktioseoksesta 60 minuutin kuluttua hydrofobisella ioninvaihtokromatogra-f iällä (Bio-Rad; HRLC MP7 HIC) . Pegyloidun rIL-l-a:n ja • ♦ 30 modifioimattoman rIL-l-a:n erottamiseen käytettiin lineaa- ♦ *1* rista gradienttia alenevalla suolapitoisuudella [(0,43-m - • · • *♦· 0,0-m (NH4)2S04] 50 mM natriumfosfaattiliuoksessa (pH 7,0) • ·· 2 0 minuutin aikana. Fraktioden alikvootit analysoitiin ; [·. SDS-PAGE:lla ja yhdistettyjen fraktioiden ominaisaktiivi- • · · ’Γ j 35 suus määritettiin D10-soluproliferaatiokokeissa menetel- • · · • · 38 107927 mällä, jonka ovat kuvanneet Kaye et ai. [J. Exp. Med. 158:836 - 854 (1983)]. Proteiinikonsentraatiot määritet tiin spektrofotometrisesti aaltopituudella 280 nm käyttäen ekstinktiokerrointa 1,0 rIL-la:lle. rIL-l-ot:n ominaisak-5 tiivisuus on noin 1,0 x 108 yksikköä/mg. Ominaisaktiivi-suuskokeiden tulokset on koottu taulukkoon VIII. 26 kD pegyloitu IL-la-konjugaatti säilyttää bioaktiivisuutensa 2 - 3-kertaisena IL-l-a:an verrattuna. Lisämodifiointi, jonka tuloksena saadaan 33 kD proteiinia, aiheuttaa olen-10 naista bioaktiivisuuden vähenemistä.
Taulukko VIII: Esimerkissä 5 kuvatun reagenssin kanssa konjugoidun rIL-la:n bioaktiivisuus rIL-1- a-proteiinin Ominaisaktiivisuus 15 näennäinen molekyylipaino (kD) (yks./mg) 17 (modifioimaton) 4,6 x 107 26 1,9 x 107 33 4,5 x 107 20 Esimerkki 8 . IFN-a:n PEG-kon-iuoaatin valmistus a- F (1.2-dihvdro- • · · * . 2-okso-l-Pvridinyvli)tiokarbonwlil -ω-metoksipolv- « · · ’···] (oksi-1.2-etaanidiwli) SRU 111,7:n avulla • · · *· '! Esimerkin 5 mukaisesti valmistettua a-[ (1,2-dihyd- *;**· 25 ro-2-okso-l-pyridinyyli) tiokarbonyyli] -ω-metoksipoly (oksi- 1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7 :ä lisättiin 1 mg:aan puhdisti1: tettua IFN-a:a 100 μ1:θ83 puskuria (0,1-m natriumboraat- ti, pH 9,0) moolisuhteessa 8 moolia PEG-reagenssia yhtä IFN-C:n moolia kohti. Liuoksia sekoitettiin perusteelli-.···. 3 0 sesti ja pegylointireaktion annettiin jatkua huoneenlämpö- *·1 tilassa 60 minuuttia.
* · l ** Molekyylipainoon perustuen reaktioseoksen pääasial- ··· lisesti muodostuneet lajit identifioitiin SDS-PAGE:lla ♦ j .·. proteiineiksi, joilla on näennäiset molekyylipainot 15 ; 35 (modifioimaton) ja 28 kD. Pegyloitu IFN-α puhdistettiin 60 ♦ ·· • · 39 107927 minuutin reaktioseoksesta ja karakterisoitiin hydrofobisella ioninvaihtokromatografiällä (Bio-Rad; Biogel-phenyl-S-PW) . Pegyloitu IFN-α ja modifioimaton IFN-α erotettiin toisistaan käyttäen lineaarista gradienttia alenevalla 5 suolakonsentraatiolla [0,42-m - 0,0-m (NH4)2S04] 50 mM nat-riumfosfaattiliuoksessa (pH 7,0) 20 minuutin ajan. Fraktioiden alikvootit analysoitiin SDS-PAGE:lla ja yhdistettyjen fraktioiden virusvastainen aktiivisuus (ominaisak-tiivisuus) määritettiin MDBK-kokeessa menetelmällä, jonka 10 ovat kuvanneet Familletti et ai. [Methods Enzym. 78., 387 -394 (1987)].
Proteiinikonsentraatiot määritettiin spektrofoto-metrisesti aaltopituudella 280 nm käyttäen ekstinktioker-rointa 1,0 1 mg/ml IFN-a:a sisältävälle puskuroidulle 15 liuokselle. Eristettyjen proteiinien ominaisaktiivisuus ilmoitetaan yksikköinä proteiinin mg:aa kohti ja tulokset nähdään taulukossa IX.
Tulokset osoittavat, että 28 kD pegyloidun IFN-a:n ominaisaktiivisuus ei ollut merkitsevästi erilainen kuin 20 IFN-a:lla.
• ·· * . Taulukko IX: Esimerkin 5 reagenssin kanssa konjugoidun • · · *···1 IFN-a:n bioaktiivisuus • · • · · *· 2ί IFN-α-proteiinin Ominaisaktiivisuus *:3 25 näennäinen molekyylipaino (kD) (yks./mg) 1/·· 15 (modif ioimaton) 1,1 x 10® :T: 28 1,4 x io8
Esimerkki 8A • · " .···. 30 IFN-a:n PEG-koniugaatin valmistus α- Γ (1.2-dihvdro- 2-okso-l-pvridinwli) tiokarbonvvlil -e-metoksipolv- i 1·1 (oksi-l. 2-etaanidiwli) SRU 225 :n avulla ··♦ *...· IFN-α pegyloitiin samalla tavalla kuin esimerkissä : .·. 8 esimerkissä 5a kuvatulla reagenssilla. 60 minuutin ku- ♦ · · 35 luttua reaktioseoksesta erotetut 3 molekyylipainoltaan 2 • · · 3 • · 40 107927 vallitsevaa lajia identifioitiin SDS-PAGE:lla ja niiden molekyylipainot olivat 15 (modifioimaton) , 35 ja 43 kD.
Kahden viimeksi mainitun pegyloidun proteiinin osuudet reaktioseoksen koko proteiinimäärästä olivat vastaavasti 5 35 ja 33 %.
Pegyloitujen IFN-a-lajien ominaisaktiivisuudet määritettiin esimerkissä 8 kuvatulla tavalla ja tulokset on koottu taulukkoon X. Tulokset osoittavat, että 35 kD pegy-loitu IFN-a-tuote säilytty biologisen aktiivisuutensa 2 -10 3-kertaisena IFN-a:an verrattuna. 43 kD konjugaatti menet ti olennaisesti aktiivisuutta.
Taulukko X: Esimerkin 5a reagenssin kanssa konjugoidun IFN-a:n bioaktiivisuus 15 IFN-a-proteiinin Ominaisaktiivisuus näennäinen molekyylipaino (kD) (yks./mg) 15 (modifioimaton) 3,3 x 108 35 1,2 x 108 43 1,5 x 107 20
. Esimerkki 8B
• · · * . rIL-2;n PEG - koni ucraa tin valmistus α- Γ(1.2-dihvdro- • · · *···[ 2-okso-l-pvridinwli) tiokarbonvvlil -ω-metoksipolv- *· *· (oksi-1,2-etaanidiyvli) SRU 111.7 :n avulla : * 25 rIL-2 pegyloitiin esimerkissä 5 kuvatulla reagens- • · ·.*·; silla ja puhdistettiin esimerkissä 3 kuvatulla menetel- : :: mäiiä.
60 minuutin kuluttua reaktioseoksesta erotetut mo- lekyylipainoltaan vallitsevat lajit identifioitiin SDS- .···. 3 0 PAGE :11a ja niiden molekyylipainot olivat 15 (modifioima- ton) ja 25 kD. 25 kD pegyloidun proteiinin osuus reaktio- Ϊ ” seoksen koko proteiinimäärästä oli 60 %.
···
Eristettyjen rIL-2-proteiinien ominaisaktiivisuus » ; .·. mitattiin esimerkissä 3 kuvatulla tavalla ja tulokset on • * * .·, · 35 esitetty taulukossa XI yksikköinä/mg proteiinia.
• ♦· • · 41 107927
Taulukosta XI voidaan nähdä, että PEG-konjugointi ei muuttanut IL-2:n biologista aktiivisuutta.
Taulukko XI: Esimerkin 5a reagenssin kanssa konjugoidun 5 rIL-2:n bioaktiivisuus rIL-2-proteiinin Ominaisaktiivisuus näennäinen molekyylipaino (kD) (yks./mg) 15 (modifioimaton) 2,0 x 107 25 2,0 x 107 10
Esimerkki 8C
rIL-2:n PEG-konnuqaatin valmistus α- Γ (1.2-dihvdro-2-okso-l-pvridinwli)tiokarbonvvlil-ω-metoksipolv-(oksi-1.2-etaanidiyyli) SRU 225 reagenssin avulla 15 rIL-2 pegyloitiin esimerkissä 3 kuvatulla menetel mällä esimerkissä 5a kuvatulla reagenssilla.
Reaktioseoksesta 60 minuutin reaktion jälkeen SDS-PAGE:11a identifioitujen pääasiallisten tuotteiden mole-kyylipainot olivat 15 kD (modifioimaton), 33 kD ja 43 kD. 20 33 kD ja 43 kD pegyloitujen proteiinin osuudet reaktio- seoksen koko proteiinimäärästä olivat vastaavasti 60 ja : 20 %.
• · « *···* Esimerkki 9 • · — *. *i IFN-a:n PEG-konnuqaatin valmistus α-Γ (1.2-dihvdro- *;**· 25 2-okso-l-pvridinwli) tiokarbonvvlil -ω-metoksipolv- • · i.*«j (oksi-1.2-etaanidiwli) SRU 111.7 reagenssin avulla
Vaihtoehtoinen menetelmä IFN-a:n konjugoimi seksi PEG:11a suoritettiin seuraavasti: IFN-cc (5 mg 1 ml:ssa) dialysoitiin puskuria vas-
.···. 30 taan, joka sisälsi 5 mM natriumasetaattia, pH 5,0, 120 mM
*!* NaCl-liuoksessa. Dialysoituun proteiiniliuokseen lisättiin »· J *·· kiinteää kaliumtiosyanaattia suolan loppukonsentraatioksi ··« 0,5 M, ja pH säädettiin arvoon 10,0 lisäämällä 1/10 tila- : vuutta 1 M trisiini-natriumhydroksidiliuosta, pH 11,9.
« » · *·[ · 35 Liuokseen lisättiin a-[(1,2-dihydro-2-okso-l-pyridinyy- • · · • · 42 107927 li) tiokarbonyyli]-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyliä) moolisuhteessa 3 moolia reagenssia yhtä proteiinimoolia kohti. Modifiointireaktion annettiin jatkua huoneenlämpö-tilassa 30 minuuttia, sitten se päätettiin lisäämällä 1 M 5 glysiiniliuosta, pH 6,3, loppukkonsentraatioon 20 mM. PEG-modifioitu proteiini saostettiin liuoksesta lisäämällä puskuria, joka sisälsi 3,5 M ammoniumsulfaattia, 50 mM natriumfosfaattia (pH 7,0), ammoniumsulfaatin loppukonsen-traatioon 1,1 M, ja sakka koottiin linkoamalla (10 000 x 10 g, 12 min) . Pelletti pestiin puskurilla, joka sisälsi 1,1 M ammoniumsulf aattia, 50 mM natriumfosfaattia (pH 7,0) ja liuotettiin sitten puskuriin, joka sisälsi 25 mM ammo-niumasetaattia (pH 5,0). PEG-modifioitu proteiini puhdistettiin ja karakterisoitiin esimerkissä 2 kuvatulla taval-15 la. Saatiin yksi ainoa pegyloitu IFN-laji, jonka näennäinen molekyylipaino oli 28 kD. Modifioidun proteiinin vi-rusvastainen aktiivisuus (ominaisaktiivisuus) määritettiin esimerkissä 8 kuvatulla menetelmällä. Lähtöaineena käytetyn IFN-α-.η omimnaisaktiivisuus oli 2,6 x 10® U/mg ja PEG-20 konjugoidun IFN-a:n ominaisaktiivisuus oli 1,0 x 108 U/mg, . mikä osoittaa, että PEG-konjugoitu IFN-α säilyttää biolo- • · · gisen aktiivisuutensa kolminkertaisena verrattun IFN-a:an.
• · · ···1 Esimerkki 10 • · ' • · · *· 2 IFN-a:n PEG-koniuaaatin valmistus α-Γ (1.2-dihvdro- f 2 25 2-okso-l-pvridinwli) tiokarbonvvlil -ω-metoksipolv- ·.1·; (oksi-1 2-etaanidiwli) SRU 225 :n avulla : IFN-α konjugoitiin PEG:in kanssa esimerkissä 9 ku vatulla menetelmällä. Proteiinit puhdistettiin ja karakte-risoit iin esimerkeissä 2 ja 9 kuvatuilla menetelmillä. .···. 30 Lähtöaineena PEG-konjugoidun IFN-a:n valmistuksessa käy-*·1 tetyn IFN-a:n ominaisaktiivisuus oli 2,6 x 108 U/mg, ja J 2 saadun PEG-konjugoidun IFN-a:n (näennäinen molekyylipaino ··· Σ...! 31 kD) ominaisaktiivisuus määritettynä esimerkissä 8 kuva- : .·. tulla menetelmällä oli 1,0 x 108. Konjugoidun IFN-a:n bio- ♦ · ♦ ··· · # • · · • ·· 2 • · 43 107927 aktiivisuus oli kolminkertainen verrattuna IFN-ct:n aktiivisuuteen.
Esimerkki 11 g-metwli-ω- f2- Γ Γ (2-pvridinwlioksi) karbonwlil ami-5 nol etoksil polv (oksi-1.2-etaanidiwli) SRU 111.7 :n valmistus a- (2-aminoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaani-diyyli) SRU 111,7:n (valmistettu esimerkissä 1C) (1 g, 0,2 mmol) liuoksesta vedettömässä metyleenikloridissa 10 (40 ml) tislattiin pois 15 ml liuotinta. Jäljelle jäänee seen liuokseen lisättiin 0 °C:ssa 65 mg (0,3 mmol) di-2-pyridyylikarbonaattia ja seosta sekoitettiin vielä 4 tuntia. Sitten liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja jäännöstä hierrettiin dietyylieetterissä. Sakka suodatet-15 tiin ja pestiin eetterillä (50 ml) ja sitten heksaanilla (50 ml) . Tuote kuivattiin vakuumiuunissa hitaassa typpi-virrassa, jolloin saatiin 1 g a-metyyli-ω-[2-[[(2-pyridi-nyylioksi)karbonyyli]amino]etoksi]poly(oksi-1,2-etaanidi-yyli) SRU 111,7:ä valkeana jauheena.
20 Analyysi, laskettu kaavalle C9H12N203 (CH2CH20) 111,7: .. C 54,56; H 9,04; N 0,55. Saatu: C 54,26; H 9,00; N 0,53.
• ··
Esimerkki 11a ct-metwli-ω- Γ2- Γ Γ (2-Pvridinwlioksi) karbonwlil ami- » · < *· ’· nol etoksil polv(oksi-l, 2-etaanidiwli) SRU 225 :n : 1 2 3 25 valmistus • « ·.1·· a- (2-aminoetyyli) -ω-metoksipoly (oksi-1,2-etaanidi- ··· ί#ί i yyli) SRU 225 (valmistettu esimerkissä le) muutettiin esi merkissä 11 kuvatulla menetelmällä a-metyyli-ω-[2-[[(2-py-·;··· ridinyylioksi) karbonyyli] amino] etoksi] poly (oksi-1,2-etaa- .···. 30 nidiyyli) SRU 225:ksi.
Analyysi, laskettu kaavalle C9H12N203 (CH2CH20) 225: : 1·1 C 54,54; H 9,10; N 0,28. Saatu: C 54,49; H 9,27; N 0,31.
··· • · • · ··· · • « · 2 « · · 3 · « · • · · • · · • · 44 107927 ' Esimerkki lib α-n^wli-Q)- Γ2- i r(2-p^ridiiwIid<si)kattaJwIi1amxrilebrfc^1pnlYH<Hi-l .2-etaanidiwli) SRU 28.3 :n valmistus a-(2-aminoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidi-5 yyli) SRU 28,3 (valmistettu esimerkissä If) muutettiin esimerkissä 11 kuvatulla menetelmällä a-metyyli-ω-[2-[[ (2-pyridinyylioksi) karbonyyli] amino] etoksi] poly (oksi -1,2-etaanidiyyli) SRU 28,3:ksi.
Analyysi, laskettu kaavalle C9H12N203 (CH2CH20) 28,3: 10 C 54,61; H 8,75; N 1,94. Saatu: C 54,67; H 8,96; N 1,63. Esimerkki 12 IL-lra-.n PEG-koniuaaatin valmistus a-metyyli-ω- f2-Γ Γ (2-Pvridinwlioksi) karbonvvlil amino] etoksil polv-(oksi-1.2-etaanidiwli) SRU 111,7 :n avulla 15 a-metyyli-ω- [2- [ [ (2-pyridinyylioksi) karbonyyli] ami no] etoksi]poly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:ä lisättiin 25 mg:aan puhdistettua IL-lra:ta 2,5 ml:ssa puskuria (0,1-m natriumboraatti, pH 9,0) moolisuhteessa 1 mooli reagenssia yhtä IL-lra:n moolia kohti. Liuoksia sekoitet-20 tiin perusteellisesti ja pegylointireaktion annettiin jat- . kua huoneenlämpötilassa 60 minuuttia. PEG-modifioitu IL- • ·· * . Ira puhdistettiin esimerkissä 6 kuvatulla menetelmällä.
• · · 60 minuutin reaktiossa saatujen pääasiallisten pe- • · « ** gyloitujen tuotteiden näennäiset molekyylipainot olivat Ϊ 1 25 28 kD ja 38 kD ja niiden osuudet koko proteiinimäärästä ·.1·· olivat vastaavasti 42 ja 29 %.
··· : Reaktioseoksesta puhdistettujen IL-lra-proteiinien kyky inhiboida IL-l:n sitoutumista määritettiin esimerkis- ....i sä 6 kuvatulla menetelmällä ja tulokset nähdään taulukossa .···. 30 XII. 28 kD tuotteen sitoutumisominaisuudet eivät olleet • olennaisesti muuttuneet ja 38 kD proteiini säilytti aktii- Σ 2 3 visuutensa viisinkertaisena IL-Ira:hän verrattuna.
··· • · • · ··· · 2 • · · • · < 3 · • · • « · • ·· • · 45 107927
Taulukko XII: Esimerkissä 11 kuvatulla reagenssilla pegy-loidun IL-lra:n kyky estää [12SI]IL-l:n sitoutuminen IL-lra-proteiinin näennäinen molekyylipaino (kD) IC50 (ng/ml) 5 19K (modifioimaton) 2,0 28 3,0 38 10,0 PEG-IL-lra:n farmakodynaaminen profiili määritet-10 tiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla. Tulokset on koottu taulukkoon D3. Pelkällä IL-l:llä saatiin IL-6:a 27 283 U/ml. Modifioimaton IL-lra ehkäisi 6 tunnin kuluttua antamisesta alle 50-%:isesti IL-l-vasteen. Sensijaan PEG IL-lra, joka oli aikaisina ajankohtina vähemmän aktiivinen, 15 oli 24 ja 48 tuntia injektion jälkeen aktiivisempi. Siten PEG-IL-Ira:n farmakodynaaminen profiili osooittautui pitkävaikutteiseksi .
Taulukko D3: Esimerkissä 11 kuvatun reagenssin kanssa kon-20 jugoidun IL-lra:n farmakodynaaminen profiili
Aika (h) ennen IL-l:n IL-6 (yks./ml) » · ·
antamista 19 kD 26 kD
• · · 0 4 789 23 806 • * :·**ϊ 6 15 324 10 833 T#: 25 24 24 841 5 727 V·! 48 16 348 9 364 :T: 72 12 067 12 054 •
····· Esimerkki 12A
,··*, 30 IL-lra:n PEG-kon~iuaaatin valmistus a-metwli-ω- Γ2- ]·* Γ Γ (2-pyridinwlioksi) karbonvvlil aminol etoksipolv- ί ** (oksi-1.2-etaanidiwli) SRU 225 :n avulla ·...· a-metyyli-ω- [2- [ [ (2-pyridinyylioksi) karbonyyli] ami- : no] etoksi] poly (oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 225:ä (kuvattu ; 35 aikaisemmin esimerkissä 11a) lisättiin 25 mg:aan puhdis-• · · • · 46 107927 tettua IL-lra:ta 2,5 mltssa puskuria (0,1-m natriumboraat-ti, pH 9,0) moolisuhteessa 4 moolia reagenssia yhtä IL-lra:n moolia kohti. Liuoksia sekoitettiin perusteellisesti ja pegylointireaktion annettiin jatkua huoneenlämpötilassa 5 60 minuuttia. PEG-modifioitu IL-lra puhdistettiin esimer kissä 6 kuvatulla menetelmällä.
60 minuutin reaktiossa saatujen pääasiallisten pe-gyloitujen tuotteiden näennäiset molekyylipainot olivat 33 kD ja 48 kD ja niiden osuudet koko proteiinimäärästä 10 olivat vastaavasti 76 ja 15 %.
Reaktioseoksesta puhdistettujen IL-lra-proteiinien kyky inhiboida IL-l:n sitoutumista nähdään taulukossa XIII. 33 kD PEG-modifioitu proteiini proteiini säilytti kykynsä inhiboida IL-l:n sitoutumista 8-kertaisena IL-15 Irathan verrattuna. 48 kD tuote menetti olennaisesti sito-miskykyänsä.
Taulukko XIII: Esimerkissä 11a kuvatulla reagenssilla pe- gyloidun IL-Ira:n kyky estää [125I]IL-l:n sitoutuminen 20 IL-lra-proteiinin näennäinen ·. molekyylipaino (kD) IC50 (ng/ml) ♦ ·· . 19K (modifioimaton) 0,8 • · · y.'i 33 6,0 *· 1· 48 18,0 T" 25 · ·.1i PEG-IL-lra:n farmakokineettinen profiili määritet- ··· ϊ.ί i tiin esimerkissä 6A kuvatulla tavalla. Tulokset on koottu taulukkoon D4. PEG-IL-lra esiintyi seeruminäytteissä suu- ····· rempina konsentraatioina ja kauemmin, kun vertailuna oli .···. 3 0 modif ioimaton IL-lra.
♦ ·1 ·· • · • ·· ··· • · • « ··· « • ♦ • I · • · · • M · · • · · • ·· 9 · 47 107927
Taulukko D4: Esimerkissä 11a kuvatulla reagenssilla konju-goidun IL-Ira:n farmakokineettinen profiili IL-Ira:n seerumikonsentraatio (ng/ml)
5 Aika (h) IL-lra:n antamisesta 19 kD 33 kD
1 220 2 33 700 3 13 4 5,3 500 10 6 1,5 8 150 10 83 24 5 15 Esimerkki 13 rIL-2 :n PEG-koniuaaatin valmistus a-metwli-ω-Γ2- Γ Γ(2-pvridinvvlioksi)karbonvvlil amino! etoksipolv- (oksi-1.2-etaanidivvli) SRU 111.7 :n avulla rIL-2 pegyloitiin a-metyyli-ω-[2-[[(2-pyridinyyli- 20 oksi)karbonyyli]amino]etoksi]poly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:n avulla esimerkeissä 3 ja 8b kuvatulla menetel- : *·· mällä. IL-2-proteiinin ominaisaktiivisuus määritettiin : : ϊ esimerkissä 8 kuvatulla tavalla. 15 kD modifioimattoman • · · rIL-2:n ominaisaktiivisuus oli 2 x 107 yks./mg ja 29 kD *:*·: 25 pegyloidun IL-2:n ominaisaktiivisuus oli 2,4 x 107 yks./mg IL-2: ta, mikä osoittaa, ettei pegylointi aiheuttanut bio- • · logisen aktiivisuuden olennaista alenemista.
• · ·
Esimerkki 14 . PEG-modifioidun rIL-l-a:n valmistus koniuqoimalla ' 30 PEG:iin «-metyyli-ω-f2-Γ Γ(2-ovridinvvlioksi)karbo- • ·
♦··* nvvlil amino] etoksi] polv(oksi-l. 2-etaanidivyli) SRU
111.7 :n avulla .***. rIL-1-α pegyloitiin esimerkissä 11 kuvatulla rea- ··« genssilla, a-metyyli-ω-[2-C[(2-pyridinyylioksi)karbonyy- • i · :·* | 35 li] amino] etoksi] poly (oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU lll,7:llä • · ♦ • ·♦ 48 107927 esimerkeissä 4 ja 7 kuvatulla menetelmällä. Reaktioseok-sesta saatiin kaksi pegyloitua rIL-l-a-proteiinia, joiden näennäiset molekyylipainot olivat 28 kD ja 38 kD, ja joiden osuudet reaktioseoksen koko proteiinimäärästä 60 mi-5 nuutin kuluttua olivat vastaavasti 50 ja 25 %.
Esimerkki 15 IFN-a:n PEG-koniuaaatin valmistus a-metwli-ω- Γ2-Γ Γ (2-pvridinwlioksi) karbonwlil amino! etoksilpolv-(oksi-1.2-etaanidiwli) SRU 111.7 ;n avulla 10 IFN-a pegyloitiin esimerkissä 11 kuvatulla reagens- silla, a-metyyli-ω-[2-[[(2-pyridinyylioksi)karbonyyli]amino] etoksi] poly (oksi-1, 2-etaanidiyyli) SRU lll,7:llä esimerkissä 8 kuvatulla menetelmällä. 60 minuutin kuluttua proteiinista oli 60 % pegyloitunut, ja tuotteen näennäinen 15 molekyylipaino oli 26 kD.
Esimerkki 16 IFN-«:n PEG-konnugaatin valmistus cc-metwli-ω-Γ2-Γ Γ (2-pvridinwlioksi) karbonwlil aminol etoksil polv-(oksi-1,2-etaanidiwli) SRU 111.7 :n avulla 20 Vaihtoehtoinen menetelmä IFN-a:n peovloimiseksi
Noudattaen esimerkissä 9 kuvattua menetelmää IFN-a : *·· konjugoitiin a-metyyli-ω-[2-[[ (2-pyridinyylioksi) karbonyy- JJ.J li]amino]etoksi]poly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:n kanssa. IFN-a:n ominaisaktiivisuus määritettiin esimerkis- • · • j··· 25 sä 8 kuvatulla tavalla. Lähtöaineena käytetyn IFN-a :n omi- : naisaktiivisuus oli 1,7 x 108 U/mg ja a-metyyli-ω-[2-[[ (2- • · .···. pyridinyylioksi) karbonyyli] amino] etoksi] poly (oksi-1,2 - « · · etaanidiyyli) SRU 111,7:n kanssa PEG-konjugoidun IFN-a:n . ominaisaktiivisuus oli 0,8 x 108 U/mg, so. noin 2 - 3-ker- • · · · · 30 täinen IFN-a:n ominaisaktiivisuuteen verrattuna.
• · · • · ···* Esimerkki 17 ·*·.. IFN-a:n PEG-koniugaatin valmistus a-metwli-ω- Γ2- ;***: Γ Γ (2-pvridinwlioksi) karbonwlil aminol etoksi] polv- « · * . *. (oksi-1,2-etaanidivvli) SRU 225:n avulla • · · ··· : 35 Noudattaen esimerkissä 9 kuvattua menetelmää IFN-a • · • · · *. " pegyloitiin esimerkissä 11a kuvatun reagenssin avulla.
49 107927 PEG-konjugoidun IFN-αη ominaisaktiivisuus määritettiin esimerkissä 8 kuvatulla tavalla ja se oli 0,4 x 108 U/mg, joka osoittaa, ettei biologinen aktiivisuus olennaisesti alentunut.
5 Esimerkki 18 cc- Γ (2-Pvridinwlioksi) karbonvvlil -ω-metoksipolv(ok-si-1.2-etaanidiyvli) SRU 111,7: valmistus MPEG:n (molekyylipaino 5 000) (1 g) liuoksesta ve dettömässä metyleenikloridissa (30 ml) tislattiin pois 10 10 ml liuotinta. Liuos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja siihen lisättiin 132 mg (0,6 mmol) di-2-pyridyylikarbo-naattia ja 4 mg DMAP:tä. Seosta sekoitettiin 14 tuntia, sitten liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännöstä hierrettiin dietyylieetterissä ja muodostunut sakka suodatettiin. 15 Tuote liuotettiin sitten 7 mlraan vedetöntä glyymiä samalla kuumentaen liuoksen saamiseksi, ja saadun liuoksen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan, jossa sitä seisotettiin useita tunteja. Muodostunut sakka suodatettiin ja pestiin vedettömällä glyymillä (2x5 ml) . Tuote kuivat-20 tiin vakuumiuunissa hitaassa typpivirrassa, jolloin saatiin 0,7 g a-[(2-pyridinyylioksi)karbonyyli]-ω-metoksipo-; 1·· ly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:ä.
Analyysi, laskettu kaavalle C9H1;LN04 (CH2CH20) 111,7: C 54,57; H 9,02; N 0,28. Saatu: C 54,51; H 9,19; N 0,28.
• · *:1♦; 25 Esimerkki 18a .·. J α- Γ (2-pvridinvvljoksi)karbonvvlil -<a-metoksipolv(ok- si-1.2-etaanidiwli) SRU 225 :n valmistus • · ·
Esimerkissä 18 kuvatulla tavalla MPEG (metoksipoly-. etyleeniglykoli) (molekyylipaino 10 000) muutettiin a-[(2- 30 pyridinyylioksi)karbonyyli]-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaani-diyyli) SRU 225:ksi.
Analyysi, laskettu kaavalle C9H1:LN04 (CH2CH20) 225: ♦ .1··. C 54,54; H 9,08; N 0,14. Saatu: C 54,54; H 9,12; N 0,11.
··· • · • · « • » t • · · · · • · · • · · • · 50 107927
Esimerkki 19 IL-lra:n PEG-kornuaaatin valmistus cc-Γ(2-pvri-dinwlioksi) karbonwlil -ώ-metoksipolv(oksi-1.2-etaanidiwli) SRU 111.7 :n avulla IL-lra pegyloitiin a-[(2-pyridinyylioksi)karbo-nyyli]-ω-mektoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU lll,7:llä aikaisemmi esimerkeissä 6 ja 12 kuvatulla menetelmällä. Pääasiallisten pegyloitujen tuotteiden molekyylipainot olivat 26 kD ja 33 kD ja niiden osuudet 60 minuutin reak-tioseoksessa koko proteiinimäärästä olivat vastaavasti 31 ja 57 %. Reaktioseoksesta puhdistettujen IL-lra-proteii-nien kyky inhiboida IL-1 sitoutumista määriteltiin esimerkissä 6 kuvatulla tavalla ja tulokset nähdään taulukossa XIV. 26 kD pegyloitu IL-lra-konjugaatti säilytti sitomis-kykynsä nelinkertaisena IL-lra:hän verrattuna. 33 kD kon-jugaatti menetti merkitsevästi sitoutumiskykyään, kuten 15-kertainen kilpailevan sitomisaktiivisuuden aleneminen osoittaa.
Taulukko XIV: Esimerkissä 18 kuvatun reagenssin kanssa pegyloitujen IL-lra-proteiinien estovaikutus [125I]IL-l:n ·. sitoutumiseen • · · IL-lra-proteiinin näennäinen • · · **\ molekyylipaino (kD) IC50 (ng/ml) • · · *· “ 19 (modifioimaton) 2,0 *:“·* 26 8,0 • · ·. ·; 33 30,0 • ·· • · · • · ·
Esimerkki 19A
····· PEG-koniuaoidun IL-lra:n valmistus a-Γ (2-pvri- .*··. dinvvlioksi) karbonwlil -ω-metoksipolv (oksi-1.2- etaanidivvli) SRU 225:n avulla • · • ** IL-lra pegyloitiin a-((2-pyridinyylioksi)karbo- • ·· ·...* nyyli]-ω-metoksipoly (oksi-1,2-etaanid'iyyli) SRU 225:llä : edellä esimerkissä 19 kuvatulla menetelmällä. Pääasiallisten • · · • · · · .·. : pegyloitujen tuotteiden molekyylipainot olivat 3 3 kD ja • · · • · 51 107927 48 kD ja niiden osuudet 60 minuutin reaktioseoksessa koko proteiinimäärästä olivat vastaavasti 47 ja 25 %.
Reaktioseoksesta puhdistettujen IL-lra-proteiinien kyky inhiboida IL-1 sitoutumista määritettiin esimerkissä 5 6 kuvatulla tavalla ja tulokset nähdään taulukossa XV.
33 kD proteiini säilytty sitomiskykynsä kuusinkertaisena IL-lra:han verrattuna. Korkeampimolekyylipainoinen konju-gaatti menetti merkitsevästi aktiivisuuttaan.
10 Taulukko XV: Esimerkissä 18a kuvatun reagenssin kanssa pegyloitujen IL-lra-proteiinien estovaikutus [125I]IL-l:n sitoutumiseen IL-lra-proteiinin näennäinen molekyylipaino (kD) IC50 (ng/ml) 15 19 (modifioimaton) 1,5 33 9,0 48 40,0 PEG-IL-lra:n farmakokineettinen profiili määritet- 20 tiin esimerkissä 6A kuvatulla tavalla. Tulokset on koottu taulukkoon D5. PEG-IL-lra:ta esiintyi seeruminäytteissä : '·· kauemmin kuin modifioimatonta IL-lra:ta, mikä osoittaa « puoliintumisajan lisääntymistä seerumissa. PEG-IL-lra:n farmakodynaaminen profiili määritettiin esimerkissä 6 ku- • · ..··· 25 vatulla tavalla, jolloin kuitenkin rIL-1 -ö:n annos oli 0,05 μg. Pelkän IL-l:n vaste oli 9 203 yks./ml IL-6. Pi- #»j·, dentynyt inhibitioaika modifioimattomaan IL-lra-.han ver- • · · rattuna voidaan havaita aina 72 tuntiin asti PEG-IL-Ira:n , antamisesta, mikä osoittaa parantuneita farmakodynaamisia 30 ominaisuuksia. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ··· • · ...* vaikka pegyloidun proteiinin aktiivisuus in vitro on alen- ·*·.. tunut, niin sen farmakodynaamiset ominaisuudet in vivo .***. voivat olla paremmat.
• · ·
Taulukko D5: Esimerkissä 18a kuvatulla reagenssilla konju- • · · ··· * 35 goidun IL-lra:n farmakokineettinen profiili • · ♦ · · • ·· • · 52 107927 IL-lra:n seerumikonsentraa-tio (mg/ml)
Aika (h) IL-lra:n antamisesta 19 kD 33 kD
1 580 52 75 100 3 30 4 30 60 6 8 8 12 10 10 17 24 10
Taulukko D6: Esimerkissä 18 kuvatulla reagenssilla konju-goidun IL-lra:n farmakodynaaminen profiili 15 Aika (h) ennen IL-l:n IL-6 (yks./ml)
antamista 19 kD 26 kD
0 521 454 6 2 334 416 20 24 13 486 2 552 48 16 577 4 667 : *·· 72 12 800 5 148 • · · • · · • · · : Esimerkki 20 • m " ·:*·· 25 PEG-koniuqoidun IFN-«:n valmistus «-Γ (2-pvridinw- lioksi) karbonwlil -ω-metoksipolv(oksi-1,2-etaanidi- • · wli) SRU 111.7 :n avulla • · ♦ a- [ (2-pyridinyylioksi)karbonyyli]-ω-metoksipoly(ok- . si-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7:ä lisättiin 1 mg:aan puh- ]>#* 30 distettua IFN-a:a 200 μ1:383 puskuria (0,1-m natriumbo-• ♦ ·;·* raatti, pH 9,0) moolisuhteessa 10 moolia reagenssia yhtä t\. IFN-a:n moolia kohti. Liuoksia sekoitettiin perusteelli- sesti ja pegylointireaktion annettiin jatkua huoneenlämpö-
• M
. *. tilassa 60 minuuttia. PEG-modifioitu IFN-α saatiin sitten • · · ··· | 35 esimerkissä 8 kuvatulla menetelmällä. 36 % proteiinista • · » • ·· • * 53 107927 oli konjugoitunut ja tuotteen näennäinen molekyylipaino oli 28 kD.
Reaktioseoksesta puhdistettujen IFN-proteiinien ominaisaktiivisuus määritettiin esimerkissä 8 kuvatulla 5 tavalla ja saadut tulokset nähdään taulukossa XVI. Modifioidun IFN:n biologinen aktiivisuus in vitro oli alentunut 5 - 6-kertaisesti.
Taulukko XVI: Esimerkin 18 reagenssin kanssa konjugoidun 10 IFN-a:n bioaktiivisuus IFN-a-proteiinin Ominaisaktiivisuus näennäinen molekyylipaino (kD) (yks./mg) 15 (modifioimaton) 1,88 x 108 28 8,0 x 107 15
Esimerkki 20A
PEG-koniucroidun rIL-2:n valmistus a-Γ (2-pvridinw-lioksi) karbonvylil -a)-metoksipolv(oksi-1.2-etaanidi-wli) SRU 111,7 :n avulla 20 Aikaisemmin esimerkissä 18 kuvattua a-[(2-pyridi- nyylioksi)karbonyyli]-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) : " SRU 111,7:ä lisättiin 1 mg:aan puhdistettua rIL-2:a 200 ^l:ssa puskuria (0,1-m natriumboraatti, pH 9,0) moolisuh- • · J/.j teessä 5 moolia reagenssia yhtä rIL-2:n moolia kohti.
·£··: 25 Liuoksia sekoitettiin perusteellisesti ja pegylointireak- .‘.J tion annettiin jatkua huoneenlämpötilassa 60 minuuttia.
• · 60 minuutin reaktioseoksen pääasialliset molekyyli-painolajit identifioitiin SDS-PAGE:11a, ne olivat 15 kD . (modifioimaton) ja 25 kD pegyloitu proteiini, ja niiden 30 osuus koko proteiinimäärästä oli 60 %.
• · • · · • · • · • · · ··· : : • · 1 • · • · · • · · ··· ♦ · • · · • ·· • · 54 107927
Esimerkki 21 PEG-koniugoidun IFN-a:n valmistus α-Γ (2-pvridinw-lioksi)karbonvvlil -ω-metoksipolv(oksi-1,2-etaanidi-wli) SRU 111.7 :n avulla 5 IEN-e pegyloitiin esimerkissä 18 kuvatulla reagens- silla esimerkissä 9 kuvatulla menetelmällä.
Ominaisaktiivisuus määritettiin esimerkissä 8 kuvatulla tavalla: lähtöaineena käytetyn modifioimattoman IFN-a:n ominaisaktiivisuus oli 1,0 x 108 U/mg ja PEG-konjugoi-10 dun ominaisaktiivisuus oli 0,4 x 108 U/mg, mikä osoittaa, ettei bioaktiivisuus olennaisesti alentunut.
Esimerkki 22 PEG - koni ugo idun IFN-a:n valmistus α-Γ (2-pvridinw-1joksi)karbonvvlil -ω-metoksipolv(oksi-1,2-etaanidi-15 vvli) SRU 225:n avulla IFN-α PEG-konjugoitiin esimerkissä 18a kuvatulla reagenssilla esimerkissä 9 kuvatulla menetelmällä. Ominaisaktiivisuus määritettiin esimerkissä 8 kuvatulla menetelmällä: PEG-konjugoidun IFN-a:n ominaisaktiivisuus oli 2 0 0,3 x 108 U/mg.
Esimerkki 23 • ' ϊ ** α-Γ2-(isotiosvanaatto)etvvlil -ω-metoksipolv(oksi- ·.·.· 1.2-etaanidiwli) SRU 111.7 :n valmistus • · :/.j a-(2-aminoetyyli)-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidi- ·;··· 25 yyli) SRU 111,7 :n (2 g) liuokseen metyleenikloridissa • \j (100 ml) lisättiin 94,2 mg di-2-pyridyylitionokarbonaat- • · tia. Liuosta sekoitettiin 18 tuntia, sitten uutettiin pie-neliä määrällä kylmää vettä. Suurin osa metyleenikloridis-. ta poistettiin alennetussa paineessa, ja jäännökseen li- 30 sättiin eetteriä, jolloin muodostui sakka. Tuote suodatet- • · ·;·* tiin ja kuivattiin suurvakuumissa, jolloin saatiin a- [2- (isotiosyanaatto) etyyli] -ω-metoksipoly (oksi-1,2-etaanidi- • .**·. yyli) sru iii,7.
··· . Analyysi, laskettu kaavalle C4H7NOS (CH2CH20) 111,7: • · · | 35 C 53,88; H 9,07; N 0,28; S 0,64. Saatu: C 54,45; H 8,93; N 0,28; S 0,53.
55 107927
Esimerkki 24 PEG-koniucroidun IFN-dt:n valmistus tt-Γ2-(isotiosva-naatto) etwlil -ω-metoksipolv (oksi-1.2-etaanidiwli) SRU 111.7:n avulla 5 Edellä esimerkissä 23 kuvattua a-[2-(isotiosyanaat- to)etyyli]-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7 reagenssia lisättiin 1 mg:aan puhdistettua IFN-a:a 200 ^l:ssa puskuria (0,1-m natriumboraattia, pH 9,0) moolisuh-teessa 10 moolia reagenssia yhtä IFN-a:n moolia kohti. 10 Liuoksia sekoitettiin perusteellisesti ja pegylointireak-tion annettiin jatkua huoneenlämpötilassa 60 minuuttia. 30 % tuotteesta konjugoitui ja konjugoidun tuotteen näennäinen molekyylipaino oli 26 kD.
Esimerkki 25 15 PEG-koniuaoidun rIL-2:n valmistus a- Γ2-(isotiosva- naatto) etwlil -ω-metoksipolv (oksi-1.2-etaanidiwli) SRU 111,7:n avulla
Edellä esimerkissä 23 kuvattua a-[2-(isotiosyanaat- to)etyyli]-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 111,7 20 reagenssia lisättiin 1 mg:aan rekombinantti-IL-2:a (rIL-2) 100 μΐ.-ssa puskuria (0,1-m natriumboraattia, pH 9,0) moo- : ** lisuhteessa 10 moolia reagenssia yhtä rIL-2:n moolia koh- ;.j.: ti. Liuoksia sekoitettiin perusteellisesti ja pegylointi- i1.j reaktion annettiin jatkua huoneenlämpötilassa 60 minuut- *:··: 25 tia. Puhdistettu PEG-modifioitu rIL-2 saatiin sitten esi-♦ ·*·.; merkissä 3 kuvatulla menetelmällä. Pegylointireaktion tu- • · lokset nähdään taulukossa XVII.
• · · . Taulukko XVII: rIL-2:n modifiointi esimerkissä 23 kuvatul- 30 la reagenssilla • · ···1 rIL-2-proteiinin näennäinen Reaktiossa saatu %:eina molekyylipaino (kD) koko proteiinimäärästä ·***; 15 (modif ioimaton) 70 .**! 26 20 • · · • · · ·« · · · • 1 · • · · • · 56 107927
Esimerkki 26 PEG-koniuaoidun IL-lra:n valmistus α- Γ2- (isotiosva-naatto) etvvlil -ω-metoksipolv(oksi-1.2-etaanidiwli) SRU 111.7:n avulla 5 IL-lra pegyloitiin edellä esimerkissä 6 kuvatulla menetelmällä a-[2-(isotiosyanaatto)etyyli]-ω-metoksipoly-(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU lll,7:llä. Pääasiallisesti muodostuneiden pegyloitujen tuotteiden molekyylipainot olivat 26, 31, 38 ja 48 kD ja niiden vastaavat osuudet 10 koko proteiinimäärästä olivat noin 17, 44, 15 ja 10 %.
60 minuutin reaktioseoksesta saadun puhdistetun 26 kD IL-ra proteiinin kyky inhiboida IL-l:n sitoutumista määritettiin esimerkissä 6 kuvatulla menetelmällä ja tulokset nähdään taulukossa XVIII. Pegyloitu proteiini säi-15 lytti sitoutumiskykynsä 2-3 kertaisena IL-lra:hän verrattuna .
Taulukko XVIII: Esimerkissä 23 kuvatulla reagenssilla pe-gyloidun IL-lra:n kyky estää [12BI] IL-1 :n sitoutuminen 20 IL-lra-proteiinin näennäinen molekyylipaino (kD) IC50 (ng/ml) Ϊ 1·2 19 2,0 :.i!: 26 5,0 • « • · · • «i
• I
*:··· 25 Esimerkki 27 • ——————————— PEG-koniuaoidun rIL-l-oc;n valmistus cc- Γ2-(isotio- • · svanaatto) etwlil -ω-metoksipolv (oksi-1,2-etaanidi-wli) SRU 111,7 :n avulla . Rekombinantti IL-1-α pegyloitiin esimerkissä 4 ku- ... 30 vatulla tavalla a- [2- (isotiosyanaatto) etyyli] -ω-metoksipo- • · ···1 ly (oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU lll,7:llä. 60 minuutin reak- tioseoksesta saadut kaksi pääasiallista pegyloitua tuotet- 2 ·3· ta identifioitiin SDS-PAGE:lla tuotteiksi, joiden näennäi- 3 . 1. set molekyylipainot olivat 26 kD ja 38 kD, ja niiden vas- • · · ··· ] 35 taavat osuudet koko proteiinimäärästä olivat 46 ja 48 %.
• · · • · · • · 57 107927
Pegyloitu rIL-ΐα puhdistettiin reaktioseoksesta ja karakterisoitiin siten kuin esimerkissä 4 kuvattiin.
Yhdistettyjen puhdistettujen fraktioiden bioaktii-visuus D10-soluproliferäätiokokeessa suoritettiin esimer-5 kissa 7 kuvatulla tavalla ja tulokset on koottu taulukkoon XIX. Taulukossa seoksiksi ilmoitetut näytteet sisälsivät enemmän kuin yhden proteiinilajin eikä näitä näytteitä edelleen puhdistettu. 26 kD pegyloidun proteiinin ominais-aktiivisuus oli olennaisesti sama kuin IL-l:n ominaisak-10 tiivisuus.
Taulukko XIX: Esimerkin 23 reagenssin kanssa PEG-konju-goidun rIL-l-a:n bioaktiivisuus rIL-l-a-proteiinin näen- Ominaisaktiivisuus 15 näinen molekyylipaino (kD) (yks./mg) 17 1,1 x 108 25 1,7 x 108 26, 38 (seos) 2,0 x 108 >38 (seos) 6,0 x 106 20
Esimerkki 28 : **· a- Γ (2-pvridinwlioksi) tiokarbonvvlil -ω-metoksipolv- JJ,· (oksi-1.2-etaanidiwli) SRU 225 :n valmistus MPEG:n (metoksipolyetyleeniglykoli, molekyylipaino *:*·· 25 10 000) (l g) liuoksesta metyleenikloridissa (30 ml) tis- .*· ϊ lättiin pois 10 ml liuotinta. Jäljelle jäänyt liuos jääh- • · dytettiin ja siihen lisättiin 69,7 mg (0,3 mmol) di-2-py- • · « ridyylitionokarbonaattia ja 2 mg DMAPitä. Seosta sekoitet- . tiin sitten argonkehässä 18 tuntia. Liuotin poistettiin ] 30 vakuumissa ja jäännös liuotettiin mahdollisimman pieneen • · ···' määrään metyleenikloridia. Liuokseen lisättiin eetteriä, sakka suodatettiin ja pestiin eetterillä. Tuote liuotet-tiin sitten 5 ml .-aan lämmintä glyymiä, ja saadun liuoksen ··· e *. annettiin seistä yön yli. Muodostunut sakka suodatettiin • · · ··· * 35 ja pestiin glyymillä (2x5 ml) ja dietyylieetterillä • · · • * · • · 58 107927 (5 ml) . Tuote kuivattiin sitten vakuumiuunissa hitaassa typpivirrassa, jolloin saatiin 0,9 g a-[(2-pyridinyyliok-si) tiokarbonyyli] --ω-metoksipoly (oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 225:ä.
5 Analyysi, laskettu kaavalle 0,,^311038(0^0^0)225,3: C 54,46; H 9,04. Saatu: C 54,67; H 9,30.
Esimerkki 29 PEG-koniuaoidun IL-Ira:n valmistus a- Γ (2-pvridinw-lioksi)tiokarbonvvlil -ω-metoksipolv(oksi-1,2-etaa-10 nidiwli) SRU 225 :n avulla
Esimerkissä 28 valmistettua a-[(2-pyridinyylioksi)-tiokarbonyyli]-ω-metoksipoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 225 reagenssia lisättiin 2 mg:aan IL-Ira:ta 1 ml:ssa puskuria (0,1-m natriumboraattia, pH 9,0) moolisuhteessa 2 15 moolia reagenssia yhtä IL-lra:n moolia kohti. Liuoksia sekoitettiin perusteellisesti ja pegylointireaktion annettiin jatkua huoneenlämpötilassa 60 minuuttia. PEG-modi-fioitu IL-lra puhdistettiin sitten esimerkissä 6 kuvatulla menetelmällä.
2 0 Pääasiallisesti saadun pegyloidun tuotteen näennäi nen molekyylipaino oli 33 kD ja sen osuus 60 minuutin : *·· reaktioseoksen koko proteiinimäärästä oli noin 17 %. Reak- tioseoksesta puhdistettujen IL-lra proteiinien kyky inhi-boida IL-l:n sitoutumista määritettiin esimerkissä 6 kuva- • ·
·:*·· 25 tulla tavalla ja tulokset on koottu taulukkoon XX. 33 kD
J proteiinin sitomiskyky oli 3-4 kertainen IL-Ira:hän ver- • « rattuna.
« · · , Taulukko XX: Esimerkissä 28 kuvatulla reagenssilla pegy- 30 loidun IL-lra:n kyky estää [125I]IL-l:n sitoutuminen • · ···* IL-lra-proteiinin näennäinen molekyylipaino (kD) IC50 (ng/ml) .***. 19 (modifioimaton) 1,4 • t* 33 5,0 • · · * · · «·· · « · • · · • ·· • · 59 107927
Esimerkki 30
Karbonotiohapon O. O-di (6-metwli-2-pvridinvvli) esteri 6-metyyli-2-hydroksipyridiinin (10 g, 0,09 mol) 5 liuokseen vedettömässä metyleenikloridissa (250 ml) lisättiin 12,7 ml trietyyliamiinia. Liuos jäähdytettiin 0 °C:seen ja siihen lisättiin tipoittain argonkehässä 4,1 ml (0,046 mol) tiofosgeenin CCl4-liuosta (85 %) . Seosta sekoitettiin 5 tuntia huoneenlämpötilassa, seos suodatet-10 tiin ja CH2Cl2-liuos pestiin kyllästetyllä NaHC03-liuoksella (2 x 100 ml) . Orgaaninen kerros kuivattiin ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Jäännökseen lisättiin heksaania (100 ml) ja seoksen annettiin seistä yön yli. Muodostunut sakka suodatettiin, pestiin heksaanilla ja 15 kuivattiin vakuumiuunissa hitaassa typpivirrassa, jolloin saatiin 5,7 g karbonotiohapon Ο,Ο-di(6-metyyli-2-pyridi-nyyli)esteriä, sp. 155 - 156 °C.
Analyysi, laskettu kaavalle C13H12N202S: C 59,98; H 4,65; N 10,76; S 12,32. Saatu: C 59,65; H 4,59; N 10,75; 20 S 12,06.
Esimerkki 31 : *·· a-metwli-ω- Γ2- Γ i (6-metyyli-2-pvridinvvl joksi) tio- karbonvvlil aminol etoksil polv(oksi-l. 2-etaanidiwli) SRU 225 • · ·;··· 25 a-metoksi-ω-(2-aminoetyyli)poly(oksi-1,2-etaanidi- • : yyli) SRU 225:n (valmistettu esimerkissä le) (1 g) ja kar- bonotiohapon O, O-di (6-metyyli-2-pyridinyyli) esterin (esi- • · · merkki 30) (52,7 mg) liuosta 15 ml:ssa vedetöntä mety- . leenikloridia sekoitettiin yön yli huoneenlämpötilassa.
] * 30 Liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja jäännöstä • · ···* hierrettiin dietyylieetterissä. Sakka suodatettiin ja pes- ·*·,. tiin eetterillä. Sitten tuote liuotettiin lämpimään glyy- • .*·*. miin (5 ml) ja liuos suodatettiin 0,75 μτη Millipore-suoti- • 4· mella. Liuoksen annettiin seistä huoneenlämpötilassa 48 • · · : 35 tuntia ja muodostunut sakka suodatettiin. Tuote kuivattiin • · • « · • ·· « · 60 107927 vakuumiuunissa typpikehässä 18 tuntia, jolloin saatiin 0,9 g a-metyyli-ω- [2-[ [(6-metyyli-2-pyridinyylioksi)tio-karbonyyli]amino]etoksilpoly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 225:ä.
5 Analyysi, laskettu kaavalle C10H14N2O2S (CH2CH20) 225: C 54,50; H 9,09; N 0,27; S 0,32. Saatu: C 54,38; H 9,20; N 0,21; S 0,37.
Esimerkki 32 PEG-koniuqoidun rIL-lra:n valmistus oc-metwli-ω- Γ2-10 Γ Γ(6-metyyli-2-pvridinvvljoksi)tiokarbonvvlil ami no] etoksiloolv(oksi-1,2-etaanidivvli) SRU 225 rea-qenssin avulla
Edellä esimerkissä 31 valmistettua reagenssia lisättiin 5,0 mg:aan puhdistettua rIL-lra:ta 1,0 ml:ssa 15 0,1-m natriumboraattia (pH 9,0) moolisuhteessa 2,0 moolia reagenssia yhtä rIL-lra:n moolia kohti. Liuosta sekoitettiin perusteellisesti ja reaktion annettiin jatkua huoneenlämpötilassa 60 minuuttia.
rIL-lra-tuotteet analysoitiin esimerkissä 6 kuva-20 tulla menetelmällä. Taulukossa XXI on reaktioseoksen sisältämien modifikaatioiden eniten esiintyvien molekyyliin*· painolajien prosenttimäärät.
• « · • · ··· • · t *.! Taulukko XXI: rIL-lra:n modifiointi esimerkissä 31 kuva- • · ·:··· 25 tulla reagenssilla •\j rIL-lra-proteiinin näennäinen Reaktiossa saatu %:eja • · .*:*. molekyylipaino (kD) koko proteiinimäärästä 19 (modifioimaton) 30,0 35 65,0 !..* 30 48 5,0 • ♦ m ··· Γ*.. Reaktioseoksesta saadut rIL-Ira-tuotteet puhdistet- j1· tiin esimerkissä 6 kuvatulla menetelmällä.
··» . \ Reaktioseoksen puhdistetut fraktiot testattiin · 35 edellä esimerkissä 6 kuvatulla kilpailevalla rIL-Ι radio- • · · • ·· • · 61 107927 reseptorisitomiskokeella. Tulokset nähdään taulukossa XXII. Nämä tulokset osoittavat, että 35 kD proteiinin aktiivisuus IL-l:n sitoutumisen ehkäisyssä oli kuudesosa modifioimattoman IL-lra:n aktiivisuudesta ja 48 kD pro-5 teiinin aktiivisuus oli vastaavasti 1/20 modifioimattoman IL-Ira:n aktiivisuudesta.
Taulukko XXII: Esimerkissä 31 kuvatulla reagenssilla kon-juoidun rIL-lra:n kyky estää [125I]IL-l:n sitoutuminen 10 rIL-lra-proteiinin näennäinen molekyylipaino (kD) IC50 (ng/ml) 19 (modifioimaton) 1,5 35 9,0 48 30,0 15 Esimerkki 33 g- Γ2- Γ Γ (2-pvridinwlioksi) karbonvvlil aminol etvvlil -o- Γ2- Γ Γ (2-pvridinyvlioksi) karbonwlil amino) etoksi) -polv(oksi-1.2-etaanidivyli) SRU 180 A. a- (2-kloorietyyli)-ω-(2-kloorietoksi)poly(oksi-20 1,2-etaanidiyyli) SRU 180:n valmistus MPGE:n (polyetyleeniglykoli, molekyylipaino 8 000) (80 g) ja tolueenin (750 ml) seoksesta tislattiin pois • ·*; 2 00 ml liuotinta. Palautujäähdyttäen kuumennettuun liuok- • · · : seen lisättiin tipoittain 1,7 ml vedetöntä pyridiiniä ja • · 25 4,7 ml tionyylikloridia. 12 tunnin kuumentamisen jälkeen • · ^ . palautusjäähdytyslämpötilassa sekoitettiin yön yli. Sitten • · · *..* lisättiin metyleenikloridia (50 ml) ja saatu liuos suoda- • · · *·* * tettiin emäksisen aluminiumoksidin (Wolem Super 1) (60 g) lävitse. Pylväs eluoitiin metyleenikloridilla (500 ml), t 3 0 orgaaniset faasit yhdistettiin ja liuotin poistettiin ··· alennetussa paineessa. Jäännös liuotettiin metyleeniklori-diin (300 ml) ja liuokseen lisättiin hitaasti eetteriä • · · samalla poistaen liuottimia höyryhauteella. Tätä jatket- • · tiin, kunnes muodostui samea suspensio. Saatua seosta se- • · :.· : 35 koitettiin huoneenlämpötilassa useita tunteja, sitten tuo- • · • · · • · · • · te suodatettiin, saatiin 73 g a-(2-kloorietyyli)-ω-(2- kloorietoksi)poly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 180:ä.
62 107927
Analyysi, laskettu kaavalle C2H4Cl2 (CH2CH20) 180: C 54,16; H 9,09; Cl 0,88. Saatu: C 53,40; H 8,81; Cl 0,93. 5 B. a-(2-atsidoetyyli)-ω-(2-atsidoetoksi)poly(oksi- 1,2-etaanidiyyli) SRU 180:n valmistus a- (2-kloorietyyli)-ω-(2-kloorietoksi)poly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 180:n (72 g), natriumatsidin (25 g) ja vedettömän DMF:n (700 ml) seosta kuumennettiin 125 °C:ssa 10 12 tuntia. Liuotin poistettiin sitten suurvakuumissa, jäännös liuotettiin 1 litraan metyleenikloridia ja liuos suodatettiin Celitellä. Sitten metyleenikloridi poistettiin höyryhauteella samalla lisäten dietyylieetteriä tuotteen saostamiseksi. Seosta sekoitettiin yön yli, sitten 15 suodatettiin. Sakka liuotettiin 50 °C:ssa mahdollisimman pieneen määrään glyymiä, liuos jäähdytettiin hitaasti ja suodatettiin. Tuote kuivattiin vakUumiuunissa typpivirras-sa, jolloin saatiin 69 g a-(2-atsidoetyyli)-ω-(2-atsidoetoksi) poly (oksi-1, 2-etaanidiyyli) SRU 180:ä.
20 Analyysi, laskettu kaavalle C2H4N6 (CH2CH20) 180: C 54,07; H 9,08; N 1,044. Saatu: C 53,76; H 9,28; N 0,96. .1·.. C. a-(2-aminoetyyli)-ω-(2-aminoetoksi)poly(oksi- : j‘; 1,2-etaanidiyyli) SRU 180:n valmistus • · · : a-(2-atsidoetyyli) -ω- (2-atsidoetoksi) poly (oksi-1,2- • · 25 etaanidiyyli) SRU 180 :n (69 g) ja trifenyylifosfiinin • · . (6,7 g, 25,6 mmol) liuosta vedettömässä metyleenikloridis- • · · sa (200 ml) sekoitettiin yön yli argonkehässä. Seokseen • · · lisättiin vettä (2 ml) ja sekoittamista jatkettiin vielä 12 tuntia. Suurin osa metyleenikloridista poistettiin va-30 kuumissa ja jäännökseen lisättiin 400 ml dietyylieetteriä.
• · *
Sakka suodatettiin, pestiin eetterillä ja liuotettiin ;·. 300 ml:aan lämmintä (50 °C) glyymiä. Liuos sai seistä huo- • «· S-, neenlämpötilassa yön yli, muodostunut sakka suodatettiin, • · pestiin glyymillä (2 x 100 ml) , dietyylieetterillä (2 x • · ·.· : 35 100 ml) ja kuivattiin vakuumiuunissa typpivirrassa, joi- • * • · · • · · • · 63 107927 loin saatiin 66 g a-(2-aminoetyyli)-ω-(2-aminoetoksi)poly-(oksi-l;2-etaanidiyyli) SRU 180:ä.
Analyysi, laskettu kaavalle C2H8N2 (CH2CH20) 180: C 54,42; H 9,18; N 0,35. Saatu: C 53,85; H 9,20; N 0,43.
5 D. a-[2-[[(2-pyridinyylioksi)karbonyyli]amino]etyy li] -ω-[2-[[(2-pyridinyylioksi)karbonyyli]amino]etoksi]poly (oksi- 1, 2-etaanidiyyli) SRU 180 a-(2-aminoetyyli)-ω-(2-aminoetoksi)poly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 180:n (1 g) liuoksesta 40 mlrssa vede-10 töntä metyleenikloridia tislattiin pois 15 ml liuotinta.
Liuos jäähdytettiin 0 °C:seen ja siihen lisättiin 85 mg (6,39 mmol) di-2-pyridyylikarbonaattia. Seosta sekoitettiin 0 °C:ssa 4 tuntia, sitten liuotin poistettiin vakuu-missa. Jäännöstä hierrettiin dietyylieetterissä, tuote 15 suodatettiin ja pestiin eetterillä (2 x 75 ml). Tuote kuivattiin sitten vakuumissa ja liuotettiin 8 ml-.aan vedetöntä glyymiä (50 °C) . Liuoksen annettiin jäähtyä ja sitä seisotettiin huoneenlämpötilassa 12 tuntia. Saostunut tuote suodatettiin, pestiin glyymillä (2x5 ml) ja kuivat-2 0 tiin vakuumiuunissa typpivirrassa, jolloin saatiin a- [2-t[(2-pyridinyylioksi)karbonyyli]amino]etyyli]-ω-[2—[ [ (2-pyridinyylioksi) karbonyyli] amino] etoksi] poly (oksi-1,2- : ·*: etaanidiyyli) SRU 180 (1 g) .
··· .‘.j Analyysi, laskettu kaavalle C14H14N404 (CH2CH20) 180: 25 C 54,57; H 8,99; N 0,68. Saatu: C 54,32; H 8,79; N 0,77.
• · I . Esimerkki 34 • · · ,l·" ---- • · · α- Γ2 - Γ Γ (2-pvridinwlioksi) karbonvvlil amino] etvvlil - • · · *·* * co- Γ2 - Γ Γ (2-pvridinvvlioksi) karbonvvlil aminol etoksil - polv(oksi-1.2-etaanidiyyli) SRU 452 30 A. a-(2-kloorietyyli) -ω- (2-kloorietoksi) poly (oksi- • · · 1,2-etaanidiyyli) SRU 452 :n valmistus ;·. Esimerkissä 33A kuvatulla menetelmällä polyetylee- • · · niglykoli (molekyylipaino 20 000) muutettiin a-(2-kloori- • ·
*!* etyyli) -ω- (2-kloorietoksi) poly (oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU
• · : 35 452 :ksi.
• · • · · • · · • · 64 107927
Analyysi, laskettu kaavalle C2H4C12 (CH2CH20) 452: C 54,38; H 9,13; Cl 0,35. Saatu: C 54,36; H 9,23; Cl 0,40.
B. a-(2-atsidoetyyli)-ω-(2-atsidoetoksi)poly(oksi- 1.2- etaanidiyyli) SRU 452:n valmistus 5 Esimerkissä 33B kuvatulla menetelmällä a-(2-kloo- rietyyli)-ω-(2-kloorietoksi)poly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 452 muutettiin a-(2-atsidoetyyli)-to- (2-atsidoetoksi) -poly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 452:ksi.
Analyysi, laskettu kaavalle C2H4N6 (CH2CH20) 452: 10 C 54,35; H 9,12; N 0,42. Saatu: C 54,38; H 9,30; N 0,47.
C. a- (2-aminoetyyli) -co- (2-aminoetoksi)poly(oksi- 1.2- etaanidiyyli) SRU 452:n valmistus
Esimerkin 33C menetelmällä a-(2-atsidoetyyli)-ω-(2-atsidoetoksi)poly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 452 muutet-15 tiin a-(2-aminoetyyli)-ω-(2-aminoetoksi)poly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 452:ksi.
Analyysi, laskettu kaavalle C2H8N2 (CH2CH20) 452: C 54,49; H 9,17; N 0,14. Saatu: C 54,44; H 9,19; N 0,15.
D. a- [2 - [ [ (2-pyridinyylioksi) karbonyyli] amino] etyy- 20 li] -ω- [2- [ [ (2-pyridinyylioksi) karbonyyli] amino] etoksi]po ly (oksi-1, 2-etaanidiyyli) SRU 452
Esimerkissä 33D kuvatulla menetelmällä a- (2-amino-
: etyyli) -ω- (2-aminoetoksi)poly (oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU
• · · j*.#: 452 muutettiin a-[2-[[ (2-pyridinyylioksi) karbonyyli] ami- • · 25 no] etyyli] -ω- [2- [[ (2-pyridinyylioksi) karbonyyli] amino] - • · ... . etoksi] poly (oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 452:ksi.
Analyysi, laskettu kaavalle C14H,4N404 (CH2CH20) 452: • · · *** * C 54,56; H 9,08; N 0,28. Saatu: C 54,33; H 9,13; N 0,33.
Esimerkki 35 • " * * 30 PEG - koni uqoidun rIL-lra:n valmistus reacrenssin • · · «- Γ2- Γ Γ (2-pvridinwlioksi) karbonvvlil aminol etvvlil - ω- Γ2- Γ Γ (2-ovridinwl joksi) karbonyyli] aminol etoksil - .···. polv (oksi-1.2-etaanidivyli) SRU 452:n avulla • · *·’ Edellä esimerkissä 34 kuvattua reagenssia lisättiin • · :.! : 35 5,0 mg:aan puhdistettua rIL-lra:ta 1,0 ml:ssa 0,1-m nat- • · • · · • · · • · 65 107927 riumboraattia (pH 9,0) moolisuhteessa 1,0 mooli reagenssia rIL-lra:n 4,0 moolia kohti. Liuosta sekoitettiin perusteellisesti huoneenlämpötilassa 60 minuuttia.
rlL-lra tuotteet analysoitiin esimerkissä 6 kuva-5 tulla tavalla. Taulukossa XXIII on reaktioseoksen sisältämien pääasiallisten modifikaatioiden molekyylipainot.
Taulukko XXIII: rIL-lra:n modifiointi esimerkissä 33 kuvatulla reagenssilla 10 rIL-lra-proteiinin näennäinen Reaktiossa saatu %:eja molekyylipaino (kD) koko proteiinimäärästä 19 (modifioimaton) 50,0 55 35,0 75 15,0 15
Esimerkki 36
Bis(3-metyyli-2-pvridvvli)karbonaatti 3-metyyli-2-hydroksipyridiinin (4,6 g, 42 mmol) ja trietyyliamiinin (6 ml) liuos 20 ml:ssa metyleenikloridia 20 lisättiin tipoittain 0 °C:ssa metyleenikloridin (50 ml) ja fosgeenin (11 ml) liuokseen tolueenissa (1,93-m). Seosta sekoitettiin 0 °C:ssa 2 tuntia. Reaktioseos pestiin kyl- : lästetyllä NaHC03-liuoksella ja sitten kyllästetyllä NaCl- • ·· liuoksella ja kuivattiin (Na2S04) . Liuotin poistettiin • · 25 alennetussa paineessa ja jäännös kiteytettiin EtOAc/hek- • · . saaniseoksesta, jolloin saatiin 3 g bis (3-metyyli-2-pyri- • · · I..1 dyyli) karbonaattia, sp. 110 - 112 °C.
« · · • · · * Analyysi, laskettu kaavalle C13H12N203: C 63,93; H 4,95; N 11,47. Saatu: C 63,78; H 4,86; N 11,23.
30 Esimerkki 3 7 • · · cc-metyyli-ω- Γ2- f Γ (3-metwli-2-pvridinwlioksi) kar- * · ;·. bonvvlil amino) etoksil nolv(oksi-1.2-etaanidivvli) • · · SRU 225 • · 1 1 • · 11 oc-metoksi-ω- (2-aminoetyyli)poly (oksi-1,2-etaanidi- • · : 35 yyli) SRU 225:n (1 g) liuoksesta 25 ml:ssa metyleeniklori- • · • · · • · · • · 66 107927 dia tislattiin pois 10 ml liuotinta. Liuokseen lisättiin sitten 49,2 mg (0,2 mmol) bis(3-metyyli-2-pyridyyli)karbonaattia ja seosta sekoitettiin argonkehässä yön yli. Liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja jäännökseen 5 lisättiin 80 ml dietyylieetteriä. Kiinteä aine suodatettiin, pestiin eetterillä ja liuotettiin sitten 10 ml:aan metyleenikloridia. Liuokseen lisättiin hitaasti eetteriä samalla haihduttaen pois liuotinta, kunnes liuos sameni. Seos sai sitten seistä 18 tuntia huoneenlämpötilassa ja 10 muodostunut sakka suodatettiin. Sakka liuotettiin 8 ml:aan lämmintä glyymiä ja liuoksen annettiin seistä huoneenlämpötilassa vielä 18 tuntia. Tuote suodatettiin ja kuivattiin vakuumiuunissa typpikehässä, jolloin saatiin a-metyy-Ιί-ω-[2-[[(3-metyyli-2-pyridinyylioksi)karbonyyli]amino]-15 etoksi]poly(oksi-1,2-etaanidiyyli) SRU 225 (0,6 g).
Analyysi, laskettu kaavalle C10H14N2O3 (CH2CH20) 225: C 54,59; H 9,09; N 0,28. Saatu C 55,64; H 9,14; N 0,22. Esimerkki 38 PEG-koniuaoidun rIL-lra:n valmistus reaqenssin 2 0 g-metvvli-ω- Γ2- Γ Γ (3-metwli-2-Pvridinwlioksi) kar- bonyylil amino] etoksil polv (oksi-1,2-etaanidivvli) SRU 225:n avulla . .1. Edellä esimerkissä 37 valmistettua reagenssia li- • · · —' • · · : sättiin 5,0 mg:aan puhdistettua rIL-lra:ta 1,0 ml:ssa • ·· 25 0,1-n natriumboraattia (pH 9,0) moolisuhteessa 2,0 moolia • · I . reagenssia yhtä rIL-lra:n moolia kohti. Liuosta sekoitet- • · · tiin perusteellisesti ja reaktion annettiin jatkua 60 mi- • · · *·1 ' nuuttia.
rIL-Ira-tuotteet analysoitiin esimerkissä 6 kuva- 3 0 tulla menetelmällä. Taulukossa XXIV nähdään reaktioseoksen • · · sisältämien pääasiallisten modifikaatioiden prosentuaali- ;·1 set osuudet.
• · · ··· • · • · • · · • · • · · • · · • · 1 · · • 1 · • ·· • · 67 107927
Taulukko XXIV: rIL-lra:n modifiointi esimerkissä 37 kuvatulla reagenssilla rIL-lra-proteiinin näennäinen Reaktiossa saatu %:eja molekyylipaino (kD) koko proteiinimäärästä 5 19 (modifioimaton) 45,0 35 43,0 45 12,0 rlL-lra tuotteet puhdistettiin reaktioseoksesta 10 esimerkissä 6 kuvatulla tavalla. Reaktioseoksen puhdistetut fraktiot testattiin edellä esimerkissä 6 kuvatulla kilpailevalla rIL-1 radioreseptorisitomiskokeella. Tulokset nähdään taulukossa XXV. Nämä tulokset osoittavat, että 35 kD proteiinin aktiivisuus IL-l:n sitoutumisen ehkäisys-15 sä oli neljäsosa modifioimattoman IL-Ira:n aktiivisuudesta ja 45 kD proteiinin aktiivisuus oli vastaavasti 1/30 modi-fioimattoman IL-lra:n aktiivisuudesta.
Esimerkki XXV
Esimerkissä 35 kuvatulla reagenssilla koniuoidun 20 rIL-lra:n kyky estää f125I1IL-l:n sitoutuminen rIL-lra-proteiinin näennäinen molekyylipaino (kD) IC50 (ng/ml) . 19 (modifioimaton) 1,0 35 4,0 * I 25 45 30,0 ····« • · 0 • · • · ♦ • ♦♦ • ♦ • · · • · ♦ • · · ♦ • ♦ ··« * · • · · » · • · • 1♦ • · · • · • · ··« • · • · » • · » ··· · · « ♦ · • · · • ·

Claims (12)

1. Menetelmä fysiologisesti aktiivisen proteiini-konjugaatin valmistamiseksi, jonka kaava on 5 Ri-0-(CH2CH20)^-CH2CH2-R2's^ P* 'proteiini (τ) c li R3 m 10 jossa R1 on alempi alkyyli, jossa on 1 - 6 hiiliatomia; R2 on -O- tai -NH-; R3 on =N-R4, =S tai =0; R4 on alempi Ci_6-alkyyli tai sykloalkyyli; m ja n ovat kokonaislukuja > 1 15 valittuina siten, että konjugaatilla on ainakin osa konju-goimattoman proteiinin biologisesta aktiivisuudesta; ja jossa proteiini on interleukiini-1, ineterleukiini-lra, in-terferoni-α tai interleukiini 2, sillä edellytyksellä, että kun R2 on -0-, niin R3 ei ole =N-R4 ja että kun R2 on -0- ja 20 R3 on =0, niin proteiini ei ole interleukiini-2, tunnet-tu siitä, että jokin aktivoiduista yhdisteistä, joiden • · · · ’ . yleiset kaavat ovat seuraavat: • · · • · * «·· • · : ! Π-A R10(CH2CH20)rCH2CH2-N=C=N-R4 T*: 25 Π-B RCKCHjOTjOXj-C^CH*— O—C —tkJ1 I T ·:::= 30 U-C R'CKCH^OJ-CHjCHj-NH—C-0— : *“ Il ··· o : : u ··· : : Π-D R’0(CH2CH20)n-CH2-CHrN =C =S Ml * • · 35 • · · • · 107927 Π-E R^CHjCHiOVCH^-NH—C —O — H Fr S 5 Π-F R1CXCH2CH20)n-CH2CH2—O - C -O -^N ? O
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että m ja n valitaan siten, että pegylointi-tähteen tai -tähteiden molekyylipaino proteiinimolekyyliä 20 kohti on 300 - 30 000 daltonia.
. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, • · · · *. tunnettu siitä, että m on 1 tai 2.
• · · *···] 4 . Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen • · · *· *Σ menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan ro- *:*** 25 teiinikonjugaatti, jonka kaava on • · • · · • · · V*·· H H N N·-proteiini. (I_A) . R1-0(CH2CH20) 'CH2CHf Y ” NR4 _ .···. 30 m * ··· ·· : **· jossa R1, R4, m, n ja proteiini merkitsevät samaa kuin pa- • ·· ·...· tenttivaatimuksessa 1.
: 5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen • * » · 35 menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan proteiini- • · · konjugaatti, jonka kaava on 107927 Hl rf-OfCHgCH^O) -CH2CH2-0 n —proteiini T j- 5 jossa R1, m, n ja proteiini merkitsevät samaa kuin patenttivaatimuksessa 1.
6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan pro- 10 teiinikonjugaatti, jonka kaava on H N NH· - proteiini tf-0(CH2CH2O^H2CH/ g (I-C) O m
15 L jossa R1, m, n ja proteiini merkitsevät samaa kuin patenttivaatimuksessa 1.
7. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan pro- 20 teiinikonjugaatti, jonka kaava on • v1 m :2·· N H NH—proteiini R1-0-{CH2CH20) -CHzCHf Nc (I-D) ·:! ' I - : · 25 L J • · - ·.1·· jossa R1, m, n ja proteiini merkitsevät samaa kuin patent- tivaatimuksessa 1.
8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan pro- .···. 30 teiinikonjugaatti, jonka kaava on ··· ·· r l 2 O NH-—proteiini O rf-O-iCHjC^O)-CHgCH^ Xc/ (I-E) . '· Il : : U m ♦·· · u · • · · • · · 2 • · 107927 jossa R1, m, n ja proteiini merkitsevät samaa kuin patent-* tivaatimuksessa 1.
9. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että R1 on CH3.
10 H3C-0(CH2CH20)n-CH2CH/// C O jossa n on noin 112.
10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan proteiinikonjugaatti, jonka kaava on H ^NH— interferoni-oc
10 II-G ^0(012(^0)5-0120312-0-0-0-^^,^ joissa R1, R4 ja R5 merkitsevät samaa kuin edellä ja n on mikä tahansa kokonaisluku 1-1 000, saatetaan reagoimaan 15 proteiinin vapaan aminoryhmän tai sen suolan kanssa ja pro-teiinikonjugaatti eristetään reaktioseoksesta.
11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että valmistetaan proteiinikonjugaatti, jonka kaava on
0 NH— interferoni- 0C. HaC-0-(CH2CH20) -CHgCHf N q II 20 o . jossa n on noin 112.
• • . 12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen menetel- • · · '···’ mä, tunnettu siitä, että interferoni-α on interferoni-a • · • · · *· ·: a. ····· • · • · • · · • ·· • · ··« • · 1 • » · • · • · · • · ·1· ·· • 1 • · · ··· • · • · ··· • · • · · • « « ··· · · • · · • · · • · 107927
FI921267A 1991-03-25 1992-03-24 Menetelmä polyetyleeni-proteiinikonjugaattien valmistamiseksi FI107927B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67400191A 1991-03-25 1991-03-25
US67400191 1991-03-25
US76700091 1991-09-27
US07/767,000 US5595732A (en) 1991-03-25 1991-09-27 Polyethylene-protein conjugates

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI921267A0 FI921267A0 (fi) 1992-03-24
FI921267L FI921267L (fi) 1992-09-26
FI107927B true FI107927B (fi) 2001-10-31

Family

ID=27101069

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI921267A FI107927B (fi) 1991-03-25 1992-03-24 Menetelmä polyetyleeni-proteiinikonjugaattien valmistamiseksi
FI20011554A FI20011554L (fi) 1991-03-25 2001-07-17 Polyetyleeni-proteiinikonjugaatteja

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20011554A FI20011554L (fi) 1991-03-25 2001-07-17 Polyetyleeni-proteiinikonjugaatteja

Country Status (32)

Country Link
US (7) US5595732A (fi)
EP (1) EP0510356B1 (fi)
JP (1) JP2637010B2 (fi)
KR (1) KR920018079A (fi)
CN (2) CN1038035C (fi)
AT (1) ATE176159T1 (fi)
AU (2) AU657311B2 (fi)
BG (1) BG60800B2 (fi)
BR (1) BR9201015A (fi)
CA (1) CA2063886C (fi)
CS (1) CS87192A3 (fi)
CY (1) CY2169B1 (fi)
DE (1) DE69228269T2 (fi)
DK (1) DK0510356T3 (fi)
EE (1) EE9400356A (fi)
ES (1) ES2128329T3 (fi)
FI (2) FI107927B (fi)
GR (1) GR3030049T3 (fi)
HU (2) HUT60512A (fi)
IE (1) IE920936A1 (fi)
IL (1) IL101348A0 (fi)
IS (1) IS3824A (fi)
MW (1) MW1892A1 (fi)
MX (1) MX9201298A (fi)
MY (1) MY131095A (fi)
NO (1) NO921142L (fi)
NZ (2) NZ248022A (fi)
OA (1) OA09760A (fi)
RO (1) RO109543B1 (fi)
SI (1) SI9210294A (fi)
ZA (1) ZA922110B (fi)
ZW (1) ZW4392A1 (fi)

Families Citing this family (254)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
AU5006993A (en) * 1992-08-21 1994-03-15 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5478860A (en) * 1993-06-04 1995-12-26 Inex Pharmaceuticals Corp. Stable microemulsions for hydrophobic compound delivery
KR100361933B1 (ko) 1993-09-08 2003-02-14 라 졸라 파마슈티칼 컴파니 화학적으로정의된비중합성결합가플랫폼분자및그것의콘주게이트
US5880131A (en) * 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5965566A (en) * 1993-10-20 1999-10-12 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
CA2174350A1 (en) * 1993-10-20 1995-04-27 Richard B. Greenwald 2'- and/or 7- substituted taxoids
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
CA2176229C (en) * 1993-11-10 2003-05-27 Carl W. Gilbert Improved interferon polymer conjugates
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US7008624B1 (en) * 1995-02-22 2006-03-07 Immunex Corporation Antagonists of interleukin-15
DE19512484A1 (de) * 1995-04-04 1996-10-17 Bayer Ag Kohlenhydratmodifizierte Cytostatika
DE19514087A1 (de) * 1995-04-13 1996-10-17 Deutsches Krebsforsch Konjugat aus einem Wirkstoff, einem Polyether und ggfs. einem nicht als körperfremd angesehenen, nativen Protein
ES2093593T1 (es) * 1995-05-05 1997-01-01 Hoffmann La Roche Proteinas obesas (ob) recombinantes.
ZA963530B (en) * 1995-05-05 1996-11-05 Hoffmann La Roche Recombinant obese (ob) proteins
JP2000507917A (ja) 1995-11-02 2000-06-27 シェーリング コーポレイション 持続的低用量サイトカイン注入治療
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US6025324A (en) * 1996-05-15 2000-02-15 Hoffmann-La Roche Inc. Pegylated obese (ob) protein compositions
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
DE69800640T2 (de) * 1997-01-29 2001-07-05 Polymasc Pharmaceuticals Plc, London Pegylationsverfahren
EP0973384A4 (en) 1997-02-13 2004-10-13 Sky High Llc ORGAN PRESERVATION SOLUTION
JP4108760B2 (ja) 1997-02-21 2008-06-25 ジェネンテック，インコーポレーテッド 抗体フラグメント−ポリマー複合体およびヒト化抗ｉｌ−８モノクローナル抗体
US7122636B1 (en) 1997-02-21 2006-10-17 Genentech, Inc. Antibody fragment-polymer conjugates and uses of same
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US6458355B1 (en) 1998-01-22 2002-10-01 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory disease with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
US6468532B1 (en) 1998-01-22 2002-10-22 Genentech, Inc. Methods of treating inflammatory diseases with anti-IL-8 antibody fragment-polymer conjugates
US7005504B2 (en) * 1998-01-22 2006-02-28 Genentech, Inc. Antibody fragment-peg conjugates
FR2774687B1 (fr) * 1998-02-06 2002-03-22 Inst Nat Sante Rech Med Lipopeptides contenant un fragment de l'interferon gamma, et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques
US6180096B1 (en) 1998-03-26 2001-01-30 Schering Corporation Formulations for protection of peg-interferon alpha conjugates
WO1999055377A2 (en) * 1998-04-28 1999-11-04 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Polyol-ifn-beta conjugates
ES2172288T3 (es) 1998-05-15 2002-09-16 Schering Corp Terapia de combinacion que comprende ribavirina e interferon alfa en pacientes que no han sido sometidos a tratamiento antiviral y que tienen infeccion cronica de hepatitis c.
ID29285A (id) * 1998-06-08 2001-08-16 Hoffmann La Roche PENGGUNAAN PEG-IFN-α DAN RIBAVIRIN UNTUK PENGOBATAN HEPATITIS C KRONIS
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
EA005005B1 (ru) 1998-10-16 2004-10-28 Байоджен, Инк. ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД β1α-ИНТЕРФЕРОНА ЧЕЛОВЕКА, ЕГО МУТАНТНЫЕ ФОРМЫ И ПРОИЗВОДНЫЕ И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ
SG2008070138A (en) 1998-10-16 2017-08-30 Biogen Ma Inc Polymer conjugates of interferon beta- 1a and their uses
DK2319928T3 (da) 1998-10-23 2013-06-24 Kirin Amgen Inc Dimere trombopoietiske peptidomimetika, der binder til MPL-receptor og har trombopoietisk aktivitet
US6362162B1 (en) 1999-04-08 2002-03-26 Schering Corporation CML Therapy
US6605273B2 (en) 1999-04-08 2003-08-12 Schering Corporation Renal cell carcinoma treatment
US6923966B2 (en) 1999-04-08 2005-08-02 Schering Corporation Melanoma therapy
PT1043026E (pt) 1999-04-08 2005-09-30 Schering Corp Terapeutica do melanoma
US7169889B1 (en) 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
JO2291B1 (en) 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
AU4934299A (en) * 1999-07-15 2001-02-05 Kuhnil Pharm. Co., Ltd. Novel water soluble-cyclosporine conjugated compounds
BR0015506A (pt) 1999-11-12 2002-07-23 Maxygen Holdings Ltd Conjugados de interferon gama, métodos para sua preparação, composições farmacêuticas que compreendem ás moléculas e seu uso no tratamento de doenças
YU32402A (sh) 1999-11-12 2005-03-15 Maxygen Holdings Ltd. Konjugati gama interferona
CZ20022727A3 (cs) 2000-01-10 2002-11-13 Maxygen Holdings Ltd Polypeptidový konjugát, způsob jeho výroby a farmaceutický prostředek
EP1982732A3 (en) 2000-02-11 2011-06-08 Bayer HealthCare LLC Factor VII or VIIA-like conjugates
US7309694B2 (en) * 2000-02-15 2007-12-18 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
IT1317835B1 (it) * 2000-02-15 2003-07-15 San Raffaele Centro Fond Citochine modificate per uso nella terapia del cancro.
US7109303B2 (en) * 2000-02-15 2006-09-19 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Modified cytokines for use in cancer therapy
US6586398B1 (en) 2000-04-07 2003-07-01 Amgen, Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
SG98393A1 (en) 2000-05-19 2003-09-19 Inst Materials Research & Eng Injectable drug delivery systems with cyclodextrin-polymer based hydrogels
WO2001093914A2 (en) 2000-06-08 2001-12-13 La Jolla Pharmaceutical Company Multivalent platform molecules comprising high molecular weight polyethylene oxide
US7208167B2 (en) * 2000-08-07 2007-04-24 Sciclone Pharmaceuticals, Inc. Treatment of hepatitis C with thymosin and peptide combination therapy
IL153923A0 (en) * 2000-09-08 2003-07-31 Gryphon Therapeutics Inc Synthetic erythropoiesis stimulating proteins
US7118737B2 (en) * 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
US20020065397A1 (en) * 2000-10-12 2002-05-30 Joseph Roberts Protecting therapeutic compositions from host-mediated inactivation
US6867183B2 (en) 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7060675B2 (en) 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
PL367154A1 (en) 2001-02-27 2005-02-21 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
US7038015B2 (en) * 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
US6828305B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6713452B2 (en) * 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828297B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
ATE376020T1 (de) 2001-08-22 2007-11-15 Bioartificial Gel Technologies Inc Verfahren zu herstellung von aktivierten polyethylenglykolen
US6913903B2 (en) 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7312192B2 (en) 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US6770625B2 (en) 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7030082B2 (en) * 2001-09-07 2006-04-18 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith
US7196059B2 (en) 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7166571B2 (en) 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
UA78726C2 (en) * 2001-11-01 2007-04-25 Sciclone Pharmaceuticals Inc Pharmaceutical composition of thymosin alpha 1 conjugated with polyethylene glycol, method for production, and method for treatment
US20040058865A1 (en) * 2001-11-26 2004-03-25 Danishefsky Samuel J Homing peptide multimers, their preparation and uses
KR100488351B1 (ko) * 2001-12-11 2005-05-11 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체
US7041855B2 (en) * 2001-12-11 2006-05-09 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US6916962B2 (en) * 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US6956135B2 (en) * 2001-12-11 2005-10-18 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
KR100888371B1 (ko) 2002-01-17 2009-03-13 동아제약주식회사 가지 달린 고분자 유도체와 인터페론 결합체를 포함하는 항바이러스제
PT3025726T (pt) 2002-01-18 2020-01-09 Biogen Ma Inc Compostos do polímero polialquileno e utilizações dos mesmos
US20030191056A1 (en) * 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
GB0209893D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
GB0209896D0 (en) * 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
US7601688B2 (en) 2002-06-13 2009-10-13 Biocon Limited Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus
US20040002451A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-01 Bruce Kerwin Compositions of pegylated soluble tumor necrosis factor receptors and methods of preparing
BR0311978A (pt) 2002-06-21 2005-03-22 Novo Nordisk Healthcare Ag Preparação, método para preparar a mesma, formulação farmacêutica, métodos para tratar de uma sìndrome responsiva ao fator vii, para prevenir hemorragias indesejáveis, para prevenir coagulação sanguìnea indesejável e para prevenir as reações mediadas pelo fator tecidual, e, uso de uma preparação
MY140819A (en) 2002-06-28 2010-01-29 Idenix Caymans Ltd Modified 2' and 3'-nucleoside prodrugs for treating flaviviridae
US7524931B2 (en) * 2002-07-03 2009-04-28 Maxygen Holdings Ltd. Full-length interferon gamma polypeptide variants
ES2601143T3 (es) 2002-07-19 2017-02-14 Omeros Corporation Copolímeros tribloque biodegradables, métodos de síntesis de los mismos, e hidrogeles y biomateriales preparados a partir de los mismos
EP1382352A1 (de) * 2002-07-19 2004-01-21 GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH Bisacyloxypropylcystein-Konjugate und deren Verwendung
MXPA05000796A (es) * 2002-07-24 2005-04-19 Hoffmann La Roche Aditivos de acidos polialquilenglicolicos.
US7563507B2 (en) * 2002-08-16 2009-07-21 University Of Massachusetts Pyridine and related ligand compounds, functionalized nanoparticulate composites and methods of preparation
US7314613B2 (en) 2002-11-18 2008-01-01 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
US7217845B2 (en) * 2002-11-25 2007-05-15 Sun Bio, Inc. Bifunctional polyethylene glycol derivatives
US9125880B2 (en) 2002-12-26 2015-09-08 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
KR101162908B1 (ko) * 2002-12-26 2012-07-06 마운틴 뷰 파마슈티컬즈, 인크. 수용체-결합 활성이 보존된, 사이토카인, 케모카인,성장인자, 폴리펩티드 호르몬 및 이들의 길항제의 중합체접합체
US20040176655A1 (en) * 2003-02-05 2004-09-09 Ayoub Paul Marie Methods of preparing branched alkyl aromatic hydrocarbons
WO2004084949A2 (en) * 2003-03-20 2004-10-07 Xencor Generating protein pro-drugs using reversible ppg linkages
CA2458085A1 (en) 2003-03-21 2004-09-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Transcriptional activity assay
PL2604620T5 (pl) 2003-05-30 2024-10-14 Gilead Pharmasset Llc Zmodyfikowane fluorowane analogi nukleozydu
GB0320638D0 (en) 2003-09-03 2003-10-01 Novartis Ag Organic compounds
SG176455A1 (en) * 2003-10-09 2011-12-29 Ambrx Inc Polymer derivatives
EP1673387B1 (en) 2003-10-10 2010-09-15 Novo Nordisk A/S Il-21 derivatives
ES2428358T3 (es) 2003-10-17 2013-11-07 Novo Nordisk A/S Terapia de combinación
ZA200606224B (en) * 2004-02-02 2007-11-28 Ambrx Inc Modified human growth hormone polypeptides and their uses
SG135176A1 (en) 2004-02-02 2007-09-28 Ambrx Inc Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
US7351787B2 (en) * 2004-03-05 2008-04-01 Bioartificial Gel Technologies, Inc. Process for the preparation of activated polyethylene glycols
JP2008507298A (ja) 2004-05-19 2008-03-13 マキシジェン， インコーポレイテッド インターフェロンαポリペプチドおよび結合体
US20060194726A1 (en) * 2004-05-25 2006-08-31 Rueger David C Methods of treating cartilage defects
US20060018875A1 (en) * 2004-06-14 2006-01-26 Blatt Lawrence M Interferon compositions and methods of use thereof
CN102603895B (zh) 2004-06-18 2016-09-28 Ambrx公司 新颖抗原结合多肽和其用途
KR101146160B1 (ko) * 2004-06-30 2012-07-16 넥타르 테라퓨틱스 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체
EP1773400A2 (en) * 2004-07-08 2007-04-18 Amgen Inc. Therapeutic peptides
US7872095B2 (en) 2004-07-19 2011-01-18 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
WO2006091231A2 (en) * 2004-07-21 2006-08-31 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
CN101023094B (zh) * 2004-07-21 2011-05-18 法莫赛特股份有限公司 烷基取代的2-脱氧-2-氟代-d-呋喃核糖基嘧啶和嘌呤及其衍生物的制备
MX2007001663A (es) * 2004-08-12 2007-04-10 Schering Corp Formulacion de interferon pegilado estable.
NZ554442A (en) * 2004-09-14 2011-05-27 Pharmasset Inc Preparation of 2'fluoro-2'-alkyl-substituted or other optionally substituted ribofuranosyl pyrimidines and purines and their derivatives
WO2006073846A2 (en) 2004-12-22 2006-07-13 Ambrx, Inc. Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone
US7816320B2 (en) 2004-12-22 2010-10-19 Ambrx, Inc. Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid at position 35
CN103690936A (zh) 2004-12-22 2014-04-02 Ambrx公司 经修饰的人类生长激素
MX2007007581A (es) 2004-12-22 2007-07-24 Ambrx Inc Composiciones de amino acil-arnt sintetasa y sus usos.
BRPI0519562A2 (pt) 2004-12-27 2009-01-27 Baxter Int construÇço proteinÁcea, complexo, mÉtodo para prolongar a meia-vida in vivo de fator viii (fviii) ou um derivado biologicamente ativo do mesmo composiÇço farmacÊutica, e, mÉtodo para formar uma construÇço proteinÁcea
US7662781B2 (en) 2005-01-31 2010-02-16 Eci, Inc. Immunopotentiating agent
WO2007044083A2 (en) 2005-05-18 2007-04-19 Maxygen, Inc. Evolved interferon-alpha polypeptides
US20070015701A1 (en) * 2005-06-01 2007-01-18 Samuel Zalipsky Macromolecular conjugates of bone morphogenetic protein-7
CN101247821B (zh) * 2005-06-03 2013-01-23 Ambrx公司 经改良人类干扰素分子和其用途
EP1893632B1 (en) 2005-06-17 2015-08-12 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
AR054778A1 (es) 2005-06-17 2007-07-18 Novartis Ag Uso de sangliferina en hcv
EP3725299A1 (en) * 2005-06-24 2020-10-21 Duke University A direct drug delivery system based on thermally responsive biopolymers
JP4829969B2 (ja) 2005-08-18 2011-12-07 アンブルックス，インコーポレイテッド ｔＲＮＡ組成物、およびその使用
US20070123646A1 (en) * 2005-09-13 2007-05-31 Lele Bhalchandra S Protein-polymer conjugates and synthesis thereof
EP1776963A1 (en) * 2005-10-19 2007-04-25 Gbf-Gesellschaft Für Biotechnologische Forschung Mbh Hexosylceramides as adjuvants and their uses in pharmaceutical compositions
HRP20110404T1 (hr) * 2005-11-08 2011-08-31 Ambrx Ubrzivači za modifikaciju ne-prirodnih aminokiselina i polipeptida ne-prirodnih aminokiselina
KR20080079643A (ko) 2005-11-16 2008-09-01 암브룩스, 인코포레이티드 비-천연 아미노산을 포함하는 방법 및 조성물
AU2006326404B2 (en) * 2005-12-14 2011-11-03 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
EP1971355B1 (en) 2005-12-20 2020-03-11 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
US8841255B2 (en) * 2005-12-20 2014-09-23 Duke University Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides
US20130172274A1 (en) 2005-12-20 2013-07-04 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
CA2636914C (en) 2006-01-12 2016-08-09 Kuniaki Yoshioka Oral composition containing interferon-.alpha.
US20070179094A1 (en) 2006-01-31 2007-08-02 Bayer Schering Pharma Ag Modulation of MDL-1 activity for treatment of inflammatory disease
DE602007008627D1 (de) * 2006-02-14 2010-10-07 Genetix Ltd Zellkulturmedium
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
NZ572050A (en) * 2006-03-31 2011-09-30 Baxter Int Factor VIII conjugated to polyethylene glycol
BRPI0710878A2 (pt) 2006-04-11 2015-03-31 Novartis Ag Compostos orgânicos e seus usos
JO3324B1 (ar) 2006-04-21 2019-03-13 Amgen Inc مركبات علاجية مجففة بالتبريد تتعلق بالعصارة الهضمية
RU2008145084A (ru) 2006-05-24 2010-06-27 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг (Ch) Аналоги фактора ix, имеющие пролонгированное время полужизни in vivo
EP1897557A1 (en) * 2006-09-07 2008-03-12 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Use of glycolipids as adjuvants
EP2064333B1 (en) * 2006-09-08 2014-02-26 Ambrx, Inc. Suppressor trna transcription in vertebrate cells
CN101541955B (zh) * 2006-09-08 2016-09-28 Ambrx公司 用于脊椎动物细胞的杂合抑制tRNA
CA2663083A1 (en) * 2006-09-08 2008-03-13 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their uses
BRPI0809583B1 (pt) 2007-03-30 2022-02-22 Ambrx, Inc Polipeptídeo fgf-21 modificado, composição compreendendo o mesmo, método para produzir o referido polipetídeo fgf-21 e célula compreendendo um polinucleotídeo
US7964580B2 (en) 2007-03-30 2011-06-21 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidate prodrugs
MX2009011870A (es) 2007-05-02 2009-11-12 Ambrx Inc Polipeptidos de interferon beta modificados y usos de los mismos.
CN101939023B (zh) 2007-10-16 2016-08-03 百康有限公司 可经口给药的固体药物组合物及其方法
ES2632504T3 (es) 2007-11-20 2017-09-13 Ambrx, Inc. Polipéptidos de insulina modificados y sus usos
NZ620606A (en) 2008-02-08 2015-08-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
TW200946541A (en) * 2008-03-27 2009-11-16 Idenix Pharmaceuticals Inc Solid forms of an anti-HIV phosphoindole compound
TWI573806B (zh) 2008-04-17 2017-03-11 巴克斯歐塔公司 生物活性胜肽
US8173621B2 (en) * 2008-06-11 2012-05-08 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside cyclicphosphates
WO2009158704A2 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Duke University Therapeutic agents comprising elastin-like peptides
PE20110426A1 (es) 2008-07-23 2011-07-01 Ambrx Inc Polipeptidos g-csf bovinos modificados
CN101671390B (zh) * 2008-09-10 2012-10-03 海南四环心脑血管药物研究院有限公司 人干扰素α衍生物及其聚乙二醇化修饰物的制备和用途
PT2337846T (pt) 2008-09-26 2018-04-05 Ambrx Inc Vacinas e microrganismos dependentes da replicação de aminoácidos não naturais
CN102232085A (zh) 2008-09-26 2011-11-02 Ambrx公司 修饰的动物促红细胞生成素多肽和其用途
US8716263B2 (en) 2008-12-23 2014-05-06 Gilead Pharmasset Llc Synthesis of purine nucleosides
EA019341B1 (ru) 2008-12-23 2014-02-28 Джилид Фармассет, Ллс. Фосфорамидаты нуклеозидов
EA201100851A1 (ru) 2008-12-23 2012-04-30 Фармассет, Инк. Аналоги нуклеозидов
US8512690B2 (en) 2009-04-10 2013-08-20 Novartis Ag Derivatised proline containing peptide compounds as protease inhibitors
US20110182850A1 (en) 2009-04-10 2011-07-28 Trixi Brandl Organic compounds and their uses
CN101870728A (zh) 2009-04-23 2010-10-27 派格生物医药(苏州)有限公司 新型Exendin变体及其缀合物
TWI576352B (zh) 2009-05-20 2017-04-01 基利法瑪席特有限責任公司 核苷磷醯胺
US8618076B2 (en) 2009-05-20 2013-12-31 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside phosphoramidates
EP2437768B1 (en) * 2009-06-04 2016-08-10 The University of North Carolina At Chapel Hill Compounds and methods for treating bone disorders and controlling weight
US20110097302A1 (en) * 2009-07-16 2011-04-28 Ta Tung Yuan Il-1ra-polymer conjugates
US20110027229A1 (en) 2009-07-31 2011-02-03 Medtronic, Inc. Continuous subcutaneous administration of interferon-alpha to hepatitis c infected patients
PL3311828T3 (pl) * 2009-08-14 2021-11-22 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Zmodyfikowane wazoaktywne peptydy jelitowe
US8475652B2 (en) 2009-10-19 2013-07-02 Jan A. K. Paul Method for purification of uncatalyzed natural fuels from metal ions by means of at least one hemeprotein and use of the at least on hemeprotein
EA201200650A1 (ru) 2009-10-30 2012-12-28 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Курсы комбинированного лечения вируса гепатита с, включающие bi201335, интерферон-альфа и рибавирин
WO2011087810A1 (en) 2009-12-21 2011-07-21 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
JP2013515080A (ja) 2009-12-21 2013-05-02 アンブルックス，インコーポレイテッド 修飾されているウシのソマトトロピンポリペプチドおよびそれらの使用
US9815876B2 (en) 2010-03-05 2017-11-14 Omeros Corporation Chimeric inhibitor molecules of complement activation
MX2012011171A (es) 2010-03-31 2013-02-01 Gilead Pharmasset Llc Fosforamidatos de nucleosido.
US8563530B2 (en) 2010-03-31 2013-10-22 Gilead Pharmassel LLC Purine nucleoside phosphoramidate
EP2569331A1 (en) 2010-05-10 2013-03-20 Perseid Therapeutics LLC Polypeptide inhibitors of vla4
EP2585065A1 (en) 2010-06-24 2013-05-01 Panmed Ltd. Treatment of hepatitis c virus related diseases using hydroxychloroquine or a combination of hydroxychloroquine and an anti-viral agent
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
AU2011291943B2 (en) 2010-08-17 2015-01-22 Ambrx, Inc. Modified relaxin polypeptides and their uses
RU2013114783A (ru) 2010-09-03 2014-10-10 Академиа Синика Anti-с-мет антитела и способы их применения
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
WO2012045704A1 (en) 2010-10-05 2012-04-12 Novartis Ag New treatments of hepatitis c virus infection
AU2011311880B2 (en) 2010-10-08 2014-07-24 Novartis Ag Vitamin E formulations of sulfamide NS3 inhibitors
KR20200070407A (ko) * 2010-11-12 2020-06-17 넥타르 테라퓨틱스 Ｉｌ-2 부분 및 중합체의 접합체
CN105381450A (zh) 2010-11-30 2016-03-09 诺华有限公司 丙型肝炎病毒感染的新疗法
JP6069215B2 (ja) 2010-11-30 2017-02-01 ギリアド ファーマセット エルエルシー 化合物
US8440309B2 (en) 2011-01-31 2013-05-14 Confluent Surgical, Inc. Crosslinked polymers with the crosslinker as therapeutic for sustained release
WO2012130996A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Novartis Ag Alisporivir to treat hepatitis c virus infection
JP2014509630A (ja) 2011-04-01 2014-04-21 ノバルティス アーゲー Ｂ型肝炎ウイルス単独の感染症またはデルタ肝炎ウイルスとの複合感染症および付随する肝疾患の治療
WO2012140082A1 (en) 2011-04-13 2012-10-18 Novartis Ag Treatment of hepatitis c virus infection with alisporivir
WO2012170524A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 Phasebio Pharmaceuticals, Inc. Use of modified vasoactive intestinal peptides in the treatment of hypertension
CA2838833A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
MX2014000031A (es) 2011-07-01 2014-07-09 Bayer Ip Gmbh Polipeptidos de fusion de relaxina y usos de los mismos.
BR112014007247A2 (pt) 2011-09-27 2017-03-28 Novartis Ag alisporivir para o tratamento de infecção por vírus da hepatite c
US8767214B2 (en) 2011-10-06 2014-07-01 Nordson Corporation Powder flow detection
US8889159B2 (en) 2011-11-29 2014-11-18 Gilead Pharmasset Llc Compositions and methods for treating hepatitis C virus
JP2015509980A (ja) 2012-03-14 2015-04-02 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｈｃｖ−ｈｉｖ同時感染患者集団のｈｃｖ感染症を治療するための併用療法
JP2015512900A (ja) 2012-03-28 2015-04-30 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 特別な患者の遺伝子亜型分集団のｈｃｖ感染症を治療するための併用療法
CA2871579A1 (en) * 2012-04-25 2013-10-31 Daiichi Sankyo Company, Limited Use of a c-type natriuretic peptide as a bone repair promoter
US9738724B2 (en) 2012-06-08 2017-08-22 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
DK2863955T3 (en) 2012-06-26 2017-01-23 Sutro Biopharma Inc MODIFIED FC PROTEINS, INCLUDING LOCATION-SPECIFIC NON-NATURAL AMINO ACID RESIDUES, CONJUGATES THEREOF, METHODS OF PRODUCING ITS AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
IN2015DN00552A (fi) 2012-07-19 2015-06-26 Redwood Bioscience Inc
ES2775192T3 (es) 2012-08-16 2020-07-24 Ipierian Inc Procedimientos de tratamiento de una tauopatía
BR112015004022B1 (pt) 2012-08-31 2023-04-25 Sutro Biopharma, Inc Aminoácidos modificados compreendendo um grupo azido
CA3124553A1 (en) 2012-10-25 2014-05-01 Bioverativ Usa Inc. Anti-complement c1s antibodies and uses thereof
CN116063483A (zh) 2012-11-02 2023-05-05 美国比奥维拉迪维股份有限公司 抗补体C1s抗体和其用途
EP2922870B1 (en) 2012-11-21 2019-08-07 The Governors of the University of Alberta Immunomodulatory peptides and methods of use thereof
US20140205566A1 (en) 2012-11-30 2014-07-24 Novartis Ag Cyclic nucleuoside derivatives and uses thereof
HUE050485T2 (hu) 2013-06-10 2020-12-28 Ipierian Inc Tauopathia kezelési módszerei
ES2658039T3 (es) 2013-07-10 2018-03-08 Sutro Biopharma, Inc. Anticuerpos que comprenden múltiples residuos de aminoácidos no naturales sitio-específicos, métodos para su preparación y métodos de uso
EP3038601B1 (en) 2013-08-27 2020-04-08 Gilead Pharmasset LLC Combination formulation of two antiviral compounds
US9840493B2 (en) 2013-10-11 2017-12-12 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
MX384909B (es) 2013-11-27 2025-03-14 Ipierian Inc Un anticuerpo anti-tau para usarse al tratar una tauopatía.
AU2015255752B2 (en) 2014-05-08 2020-07-23 Immunoforge Co., Ltd. Methods and compositions for treating Cystic Fibrosis
EP3183264B1 (en) 2014-08-19 2020-07-29 Biogen MA Inc. Pegylation method
SG11201702824UA (en) 2014-10-24 2017-05-30 Bristol Myers Squibb Co Modified fgf-21 polypeptides and uses thereof
JP6824888B2 (ja) 2015-02-09 2021-02-03 フェーズバイオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド 筋肉の疾患および障害を治療するための方法および組成物
MX2018002610A (es) 2015-09-02 2018-09-27 Immutep Sas Anticuerpos anti-lag-3.
MA47290A (fr) 2015-10-08 2019-11-27 Nektar Therapeutics Combinaison d'un agoniste sélectif de l'il-2rbeta et d'un agoniste de l'il-15 à action prolongée
CN108135979A (zh) 2015-11-03 2018-06-08 豪夫迈·罗氏有限公司 Hbv衣壳组装抑制剂和干扰素的组合疗法
WO2017176651A1 (en) 2016-04-04 2017-10-12 True North Therapeutics, Inc. Anti-complement factor bb antibodies and uses thereof
WO2018087345A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 F. Hoffmann-La Roche Ag COMBINATION THERAPY OF AN HBsAg INHIBITOR, A NUCLEOS(T)IDE ANALOGUE AND AN INTERFERON
KR102670432B1 (ko) 2017-02-08 2024-05-28 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 약동학적 인핸서를 포함하는 변형된 렐락신 폴리펩티드 및 그의 용도
MA49578A (fr) 2017-07-11 2021-04-07 Synthorx Inc Incorporation de nucléotides non naturels et procédés associés
IL322312A (en) 2017-08-03 2025-09-01 Synthorx Inc Cytokine conjugates for the treatment of infectious diseases and cell proliferation
SG11202102427XA (en) 2018-09-11 2021-04-29 Ambrx Inc Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
AU2019361206A1 (en) 2018-10-19 2021-06-03 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates, dimers thereof, and their uses
CA3127689A1 (en) 2019-02-06 2020-08-13 Synthorx, Inc. Il-2 conjugates and methods of use thereof
CN119455004A (zh) 2019-02-12 2025-02-18 Ambrx公司 包含抗体-tlr激动剂缀合物的组合物、方法和用途
CA3174114A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and methods of use thereof
WO2022040596A1 (en) 2020-08-20 2022-02-24 Ambrx, Inc. Antibody-tlr agonist conjugates, methods and uses thereof
KR20240004342A (ko) 2021-04-03 2024-01-11 암브룩스, 인코포레이티드 항-her2 항체-약물 접합체 및 이의 용도
CN119431229A (zh) * 2023-08-04 2025-02-14 华为技术有限公司 缩合剂及其在制备异硫氰酸酯中的用途

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE337223B (fi) * 1967-05-23 1971-08-02 Pharmacia Ab
US3619371A (en) * 1967-07-03 1971-11-09 Nat Res Dev Production of a polymeric matrix having a biologically active substance bound thereto
SE343210B (fi) * 1967-12-20 1972-03-06 Pharmacia Ab
DK132327A (fi) * 1968-07-16
BE758425A (fr) * 1969-12-02 1971-04-16 Baxter Laboratories Inc Streptokinase liee chimiquement a une matrice en carbohydrate (
DE2247163A1 (de) * 1972-09-26 1974-03-28 Merck Patent Gmbh Traegermatrix zur fixierung biologisch wirksamer stoffe und verfahren zu ihrer herstellung
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US4100271A (en) * 1976-02-26 1978-07-11 Cooper Laboratories, Inc. Clear, water-miscible, liquid pharmaceutical vehicles and compositions which gel at body temperature for drug delivery to mucous membranes
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
US4094744A (en) * 1976-11-18 1978-06-13 W. R. Grace & Co. Water-dispersible protein/polyurethane reaction product
DE2862449D1 (en) * 1977-08-22 1984-11-22 Nat Res Dev Macromolecular covalent conjugates, methods for preparing and pharmaceutical compositions containing them
JPS55110105A (en) * 1979-02-19 1980-08-25 Japan Atom Energy Res Inst Preparation of polymer composition containing physiologically active material
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4640835A (en) * 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
JPS5896785A (ja) * 1981-12-04 1983-06-08 Stanley Electric Co Ltd 発光ダイオ−ドの合成樹脂レンズ成形方法
US4609546A (en) * 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4486344A (en) * 1983-03-28 1984-12-04 Miles Laboratories, Inc. Urea-linked immunogens, antibodies, and preparative method
JPS6098988A (ja) * 1983-11-01 1985-06-01 Chemo Sero Therapeut Res Inst Ｌｐｆ−ｈａの精製法
US4496689A (en) * 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
DE3572982D1 (en) * 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8430252D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4732863A (en) * 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4847079A (en) * 1985-07-29 1989-07-11 Schering Corporation Biologically stable interferon compositions comprising thimerosal
US5100664A (en) * 1985-09-20 1992-03-31 Cetus Corporation Human IL-2 as a vaccine adjuvant
US4818769A (en) * 1985-09-20 1989-04-04 Cetus Corporation Method of controlling stress-related disease in livestock by administration of human IL-2
US5102872A (en) * 1985-09-20 1992-04-07 Cetus Corporation Controlled-release formulations of interleukin-2
US5034514A (en) * 1986-03-17 1991-07-23 Cetus Corporation Novel cross-linking agents
US4797491A (en) * 1986-03-17 1989-01-10 Cetus Corporation Compound 1-(3-(2-pyridyldithio)propionamido)-12-(5-hydrazidoglutaramido)-4,9-dioxadodecane
JPH0443882Y2 (fi) * 1986-06-23 1992-10-16
US4791192A (en) * 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4810638A (en) * 1986-07-24 1989-03-07 Miles Inc. Enzyme-labeled antibody reagent with polyalkyleneglycol linking group
US4894226A (en) * 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US4851220A (en) * 1986-11-26 1989-07-25 Schering Corporation Stable oleaginous gel
US4871538A (en) * 1987-07-13 1989-10-03 Schering Corporation Insoluble copper-alpha interferon complex
AU611932B2 (en) * 1987-08-21 1991-06-27 Wellcome Foundation Limited, The Novel complex
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5153265A (en) * 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US5214131A (en) * 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
GB8824591D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
AU4660789A (en) * 1988-11-23 1990-06-12 Genentech Inc. Polypeptide derivatives
US4902502A (en) * 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5089261A (en) * 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
WO1990013540A1 (en) * 1989-04-19 1990-11-15 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5234903A (en) * 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
JP3187044B2 (ja) * 1989-12-01 2001-07-11 ビーエーエスエフ アクチェンゲゼルシャフト ヒルジン突然変異蛋白質及びヒルジンポリアルキレングリコール複合体
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
BG60800B2 (bg) 1996-03-29
BR9201015A (pt) 1992-11-24
US5849860A (en) 1998-12-15
AU671045B2 (en) 1996-08-08
ES2128329T3 (es) 1999-05-16
HU9200955D0 (en) 1992-05-28
CA2063886A1 (en) 1992-09-26
AU1316092A (en) 1992-10-01
JPH05117300A (ja) 1993-05-14
NO921142D0 (no) 1992-03-24
MX9201298A (es) 1992-10-01
FI921267L (fi) 1992-09-26
SI9210294A (en) 1995-10-31
KR920018079A (ko) 1992-10-21
ATE176159T1 (de) 1999-02-15
US5539063A (en) 1996-07-23
CN1175465A (zh) 1998-03-11
FI20011554A7 (fi) 2001-07-17
AU657311B2 (en) 1995-03-09
NZ248022A (en) 1993-12-23
HUT60512A (en) 1992-09-28
EP0510356B1 (en) 1999-01-27
CY2169B1 (en) 2002-08-23
HU211945A9 (en) 1996-01-29
IS3824A (is) 1992-09-26
CS87192A3 (en) 1992-10-14
ZW4392A1 (en) 1992-09-23
EP0510356A1 (en) 1992-10-28
CN1038035C (zh) 1998-04-15
IE920936A1 (en) 1992-10-07
EE9400356A (et) 1996-04-15
CN1108814C (zh) 2003-05-21
US5747646A (en) 1998-05-05
MW1892A1 (en) 1994-01-12
CN1065465A (zh) 1992-10-21
JP2637010B2 (ja) 1997-08-06
RO109543B1 (ro) 1995-03-30
DE69228269D1 (de) 1999-03-11
NO921142L (no) 1992-09-28
AU7761594A (en) 1995-01-12
US5834594A (en) 1998-11-10
FI921267A0 (fi) 1992-03-24
GR3030049T3 (en) 1999-07-30
MY131095A (en) 2007-07-31
OA09760A (fr) 1993-11-30
US5792834A (en) 1998-08-11
CA2063886C (en) 2002-08-20
ZA922110B (en) 1992-11-25
DK0510356T3 (da) 1999-09-13
NZ242084A (en) 1993-12-23
US5595732A (en) 1997-01-21
US5559213A (en) 1996-09-24
IL101348A0 (en) 1992-11-15
FI20011554L (fi) 2001-07-17
DE69228269T2 (de) 1999-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI107927B (fi) Menetelmä polyetyleeni-proteiinikonjugaattien valmistamiseksi
Katre Immunogenicity of recombinant IL-2 modified by covalent attachment of polyethylene glycol.
JP4574007B2 (ja) ポリオール−ｉｆｎ−ベータ複体
EP0593868B1 (en) PEG-interferon conjugates
PL186949B1 (pl) Fizjologicznie czynny koniugat PEG-IFN-alfa, sposób jego wytwarzania oraz zawierające go kompozycjefarmaceutyczne
CA2698396A1 (en) Interferon alpha2a modified by polyethylene glycol, the preparation and use thereof
KR100480432B1 (ko) Ｇ-ｃｓｆ와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체
MXPA00010223A (en) Polyol-ifn-beta conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired