FI107116B - Menetelmä proteiinien eristämiseksi ja muuntelemiseksi - Google Patents

Description

107116

Menetelmä proteiinien eristämiseksi ja muuntelemiseksi

Keksintö koskee menetelmää proteiinien eristämiseksi, erityisesti herasta tai soijasta 5 ja eristettyjen proteiinien muuntelemiseksi, saattamalla proteiinit, erityisesti hera tai soija tai sen konsentraatti, kosketuksiin sulfiitti-ioneja muodostavan reagenssin kanssa proteiinin sulfonoimiseksi.

Heraproteiinit ovat muihin proteiineihin nähden ravintoarvoltaan ylivoimaisia erityi-10 sesti lysiini-ja metioniinipitoisuutensa vuoksi. Heraproteiinien jalostus ihmisravinnoksi ja terveysvaikutteisiksi ravintotuotteiksi nostaisi heran jalostusarvoa ja lisäisi näin juustontuotannon kannattavuutta. Vaikka heraproteiinilla on hyvät käyttöedellytykset elintarvikeraaka-aineena, suurimpina esteinä sen käytölle ovat talteenotto-prosessien ja fraktioiden eristysprosessien kalleus sekä proteiinikonsentraattien ja 15 isolaattien vaihtelevat ja heikot toiminnalliset ominaisuudet, kuten huono liukoisuus, emulgoituvuus, geeliytyvyys ja vaahtoutuvuus.

Heran proteiinien eristämistä vaikeuttaa niiden hyvä liukoisuus, eikä siihen voida vaikuttaa pH:n muutoksella välillä pH 2-9 proteiinien ollessa natiivissa muodossa. 20 Proteiineja voidaan eristää neljän päämenetelmän mukaisesti: 1. denaturointi kuumentamalla ja saostus, 2. ultrasuodatus, 3. ioninvaihtoja 4. kemiallinen muunteluja saostus.

Yleisimmin tunnettu menetelmä heraproteiinien eristämiseksi on kuumennusdenatu-25 rointi ja pH:n laskeminen happamalle puolelle. Tällä menetelmällä saadaan proteiini, joka on menettänyt lähes kaikki tärkeimmistä toiminnallisista ominaisuuksistaan. Sitä käytetään pääasiassa erilaisissa levitteissä, esimerkiksi sulatejuustoissa, osittain tai kokonaan korvaamaan juusto (Hill et ai., Can. Int. Food Sei. Technol. J. 15 (1982), 155-160).

30

Nykyään heran proteiinit eristetään pääasiassa proteiinikonsentraattina käyttämällä ultrasuodatusta ja kuivausta tai proteiini-isolaattina käyttämällä ioninvaihtoadsorp-tiotekniikkaa ja kuivausta. Molemmilla menetelmillä on mahdollista saada eristetyt proteiinit toiminnallisina. Määräävänä tekijänä näiden tuotantomenetelmien valin-35 nassa on saavutettava tuotteen toiminnallisuus ja tuotantokustannukset.

Edellä mainituilla menetelmillä aikaansaatujen proteiinikonsentraattien koostumuksessa, toiminnallisuudessa sekä aistittavissa ominaisuuksissa esiintyy kuitenkin 2 107116 suurta vaihtelua ja sen vuoksi teollisuus vieroksuu niiden käyttöä. Vaihtelu jphtuu käytettävän heran erilaisesta koostumuksesta ja esikäsittelyn sekä valmistus- ja käsittelyolosuhteiden erilaisuudesta.

5 Proteiini-isolaateissakin esiintyy edellä mainituista syistä eri ominaisuuksien viaihte-lua. Niiden valmistuksessa käytetty ioninvaihtoadsorptiomenetelmä tasaa vailjitelua jonkin verran ja antaa koostumukseltaan erilaisen lopputuotteen kuin ultrasuo4atuk-sella tuotettu proteiinikonsentraatti on. On havaittu, että isolaatit ovat selvästji laadukkaampia ja toiminnallisempia kuin konsentraatit proteiinin ja rasvan mjäärän 10 suhteen sekä proteiinin liukoisuuden, vaahtoavuuden ja vaahdon pysyvyyden] proteiinin denaturoimattomuuden ja kokkareisuuden sekä maun ja hajun suhteen. Kon-sentraattien suhteellisen korkea laktoosi- ja mineraalipitoisuus sekä heikko maku ja haju ovat tekijöitä, jotka rajoittavat konsentraattien käyttöä elintarviketeollisuu4essa. Heraproteiini-isolaattien käyttökelpoisuutta rajoittaa hyvistä ominaisuuksista huoli-15 matta valmistusmenetelmästä johtuva tuotteen korkea hinta.

Tunnettua on myös, että muuttamalla proteiinien rakennetta kemiallisella reaktiolla voidaan vaikuttaa molekyylin avaruusrakenteeseen/konformaatioon, varaukseen ja hydrofobisuuteen sekä siten proteiinin eräisiin muihinkin ominaisuuksiin, kuten liu-20 koisuuteen, viskositeettiin, vaahtoavuuteen ja emulgoituvuuteen.

Käytännöllisin ja yksinkertaisin kemiallinen menetelmä proteiinin molekyyliin rakenteen muuntelussa on sulfonointi, tarkemmin tiolisulfonointi eli S-sulfonointi, joka saadaan aikaan oksidatiivisella sulfitolyysillä. Siinä proteiinien aminohappoketju-25 jen väliset rikkisillat eli disulfidisidokset aukaistaan, mikä saadaan aikaan lisäämällä sulfiitti-ioneja, jolloin käynnistyy hapetuspelkistysreaktio, jossa toinen rikki hapettuu sulfonaatiksi ja toinen pelkistyy sulfhydryyliryhmäksi.

Lisäämällä mukaan vielä hapettava tekijä hapettuvat vapaat sulfhydryyliryhmä[t jäl-30 leen disulfidisidoksiksi, jotka puolestaan jatkavat reaktiossa niin kauan, kunnes kaikki sulfhydryyliryhmät ovat sulfonoituneet tai reaktion jokin muu tekijä on muodostunut rajoittavaksi. Oksidatiivisen sulfitolyysin periaate on kuvattu seuraavilla yhtälöillä: 3 107116

2RS-SR + 2HS03’ <-> 2RS-S03' + 2RSH

2RSH + hapetin —> RS-SR + 2H-hapetin 5 RS-SR + 2HSCV + hapetin —> 2RS-SO3* + 2H-hapetin (kokonaisreaktio)

Siinä RS-SR kuvaa proteiinimolekyyliä, joka koostuu kahdesta aminohappoketjusta R, jolloin S-S on kahden aminohappoketjun välissä oleva disulfidisidos. Se yhdistää aminohappoketjut ja pitää niitä osaltaan lukittuna tiettyyn asentoon. Muunnellut 10 proteiinimolekyylit ovat saostettavissa liuoksesta laskemalla pH:ta sulfitolyysireak-tion pH.sta pH 3-5:een.

Oksidatiivista sulfitolyysiä on julkaisussa Keila, N. K. D. et ai., J. Agr. Food Chem. 37, (1989), 1203-1210, käytetty heran proteiini-isolaattien molekyylien muunteluun 15 tarkoituksena vaikuttaa proteiinien toiminnallisiin ominaisuuksiin, kuten liukoisuuteen, viskositeettiin, vaahtoavuuteen ja vaahdon pysyvyyteen. Ominaisuuksiin vaikuttavana tekijänä oli disulfidisidosten vähentäminen suhteessa alkuperäisten disul-fidisidosten määrään. Tietyt ominaisuudet paranivat tai huononivat disulfidisidosten määrän vähetessä. Mm. liukoisuus huononi alle 5 %:n jo 25 %:n disulfidisidoksista 20 avauduttua ja samalla liukoisuus-pH-käyrän liukoisuusminimi muuttui.

Muuntelureaktiossa proteiini-isolaattien konsentraatio oli 1,0 % ja sulfiitin 0,1 M, urean 4 M sekä pH 7,0 ja lämpötila 25 °C. Hapettimena käytettiin liuoksen läpi puhallettua happea ja katalysaattorina CuS04:a liuotettuna 800 mM konsentraatioon. . 25 Eriasteisesti muunnellut proteiini-isolaatit eristettiin saostamalla ammoniumsulfaa tilla, jota lisättiin liuokseen niin paljon, että siitä muodostui 50-prosenttisesti kyllästetty. Muuttuneita liukoisuusominaisuuksia ei käytetty hyväksi proteiinien eristämisessä.

30 Julkaisussa Gonzalez, J. M., Damodaran, S., J. Food Sei., 55 (1990), no 6, 1559-1563, käytettiin oksidatiivista sulfitolyysiä tarkoituksena eristää sellaisen makean raakaheran proteiineja, jonka proteiinipitoisuus oli noin 0,6 %, lähes samoissa koeolosuhteissa kuin edellä; pH 7,0, sulfiittikonsentraatio 0,1 M, lämpötila 25 °C sekä hapettimena happi ja katalysaattorina Cu2+-ioni CuCC>3:na, mutta tässä tapauksessa 35 kiinteinä helminä ja pakattuna lasikolonniin. Sulfitolyysin tuote hapetettiin sulfo-naattijohdannaiseksi kierrättämällä sitä mainituilla helmillä täytetyssä kolonnissa. Sen jälkeen helmien jäännökset poistettiin nestemäisestä reaktioseoksesta sentrifu-goimalla. Tekijät osoittivat, että pelkällä sulfitolyysillä eli 0,1 M:n sulfiittilisäyksen 4 107116 jälkeen edellä kuvatuissa olosuhteissa vain noin 0,4 moolia disulfidi- ja sulfhydryy-liryhmistä 43000 grammamoolia proteiinia kohti sulfonoitui 30 minuutissa, ja senkin oletettiin johtuneen heran luontaisesta hapetuskyvystä. Vastaavissa olosuhteissa hapetettaessa hapella katalysaattorin avulla noin 1,5 moolia disulfidi-ja sulfh>jdryy-5 liryhmistä sulfonoitui 3 minuutissa ja noin 2,3 moolia 30 minuutissa. Sulfonoijiut ja kuparin kanssa kelatoituneet proteiinit eristettiin toiminnallisina seostamalla pj-kssa 4,5. Ennen saostamista liuoksesta jouduttiin kuitenkin poistamaan sulfonoituun heran proteiiniin kelatoitunut kupari EDTA-käsittelyllä.

10 Tässä oli kysymyksessä monimutkainen laboratoriomittakaavan toteutus kon-sentroimattomalla heraproteiinilla. Siinä ei voitu hyödyntää korotetun lämpötilan reaktiota nopeuttavaa vaikutusta, koska hapen liukoisuus ja siten sen pitoisuus liuoksessa pienenee niin, että se on reaktiota rajoittava tekijä. Lisäksi elektrolyyttien runsas mukanaolo vielä rajoittaa hapen liukoisuutta ja siten myös happipitoisuutta.

15

Oksidatiivista sulfitolyysiä (Keila, N. K. D., et ai., J. Agr. Food Chem., 37 (1989), 1203-1210) on käytetty soijaproteiinien, esimerkiksi glysiinin, jaotteluun/fraktioin-tiin pienemmiksi alayksiköiksi. Glysiini koostuu useasta alayksiköstä, jotka ovat puolestaan muodostuneet kahdesta polypeptidistä. Polypeptidit ovat kiinnittyneet 20 toisiinsa yhdellä disulfidisidoksella, joten aukaisemalla disulfidisidoksia oksidajtiivi-sella sulfitolyysillä proteiini on jaoteltavissa pienempiin osiin, mikä vaikuttaa puo-lestaan toiminnallisiin ominaisuuksiin mm. emulgoituvuuteen, geeliytyvyyteen ja vaahtoutuvuuteen kuten Petracelli, S. ja Anon, M. C., J. Agric. Food Chem., 43 (1995), 2001-2006, ovat osoittaneet.

. " 25

Sulfitolyysiä on myös käytetty soijan biologisesti aktiivisen proteiinin, trypgiini-inhibiittorin rakenteen/konformaation muunteluun siten, että ihmisen ruoansulatukselle haitallisen proteiinin aktiivisuus katoaa. Trypsiini-inhibiittori on inaktivpita-vissa kuumentamalla, mutta 1 tunnin kuumennus 75 °C:ssa tai 10 min kuumennus 30 100 °C:ssa inaktivoi inhibiittorista vain noin 80 %. Kuumennuksen jatkamineiii ai heuttaa proteiinin ravintoarvon alentumista. Kuumentamalla yhden tunnin ajan soijajauhoa 700 g 2,1 litrassa 0,5 M Tris-puskuria pH 8,5, jossa on Na2SC>3:a 4,?8 g (0,03 moolia), trypsiini-inhibiittorin aktiivisuus hävisi kokonaan. Jäännössulfiitin poistamiseen käytettiin dialysointia, joka kesti 3 päivää. Vaihtoehdoksi sulfiitin 35 poistoon suositeltiin proteiinien saostamista isoelektrisessä pisteessä, pH 4,5issä, jota käytetään saostukseen soijaisolaatin teollisessa valmistuksessa. Toimenpiteessä hyödynnetään jäljempänä esitetyssä reaktiossa vapautuneen sulfiitin pesemistä pois proteiinin eristyksen yhteydessä.

5 107116

Trypsiini-inhibiittorin rakenteen/konformaation muuntelun selitettiin perustuvan sulfiitin aiheuttamaan disulfidiryhmän avautumiseen seuraavan kaavan mukaan: P - S-S - F + S03=<-> P - S + F - S - S03‘ 5

Sen jälkeen muodostunut S-sulfonaatti reagoi toisen sulfhydryyliryhmän kanssa, joka on jo ollut olemassa tai muodostunut samassa sulfitolyysissä ja muodostaa sen kanssa uuden disulfidiryhmän eri paikkaan proteiinimolekyylissä. Samalla vapautuu S-sulfonaattiryhmästä sulfiittia seuraavan kaavan mukaan: 10 F - S - S03· + P - S* <-> F - S - S - P + S03=

Kokonaisvaikutus on uuden disulfidiryhmän muodostuminen ja lähes kaiken sulfiitin vapautuminen (Friedman, M. ja Gumbmann, M. R., J. Food Sei. 51 (1986), 15 1239-1241).

Edellä esitetyt sovellutukset, jotka perustuvat oksidatiiviselle sulfitolyysille, eivät joko pyrkineet tarjoamaan ratkaisua eristämiselle, vaan ainoastaan tiettyjen ominaisuuksien muunteluun hera-ja soijaproteiineilla, tai esitetty ratkaisu on niin vaikeasti 20 hyödynnettävissä tuotantomitassa, ettei se ole ollut toteuttamiskelpoinen. Sama koskee sulfitolyysin käyttöä biologisesti aktiivisten proteiinien inaktivointiin ja molekyylirakenteen muunteluun soijalla.

FI-patentissa 96266 "Menetelmä heraproteiinien eristämiseksi" ja FI-patenttihake-25 muksessa 944110 "Menetelmä ja laite heraproteiinien eristämiseksi" on kehitetty menetelmä ja prosessi, jossa on pyritty mahdollisimman yksinkertaiseen, toimivaan ja taloudelliseen heran proteiinien eristämiseen ja fraktiointiin ja tuottamaan mahdollisimman toiminnallisia proteiineja, joilla on toiminnallisina ominaisuuksina mm. emulgoituvuus, geeliytyvyys ja vaahtoutuvuus. Tuotteet on tarkoitettu tasoltaan ih-30 misravintona käytettäviksi.

Edellä mainitussa suomalaisessa keksinnössä heraproteiinit käytetään 4-16 kertaa konsentroituna, jolloin niiden proteiinipitoisuus on 2-7 paino/tilavuus-%. Oksida-tiivinen sulfitolyysi suoritetaan lisäämällä heraproteiinikonsentraattiin sulfiittia sel-35 lainen määrä, jolla voidaan säädellä aukaistujen ja sulfonoitujen disulfidisidosten suhdetta disulfidisidosten alkuperäiseen määrään.

6 107116

Hapetus suoritetaan sulfitolyysin jälkeen sopivalla elintarvikekäyttöön kelpaavjalla ja hallittavalla kemiallisella yhdisteellä esimerkiksi Ca02:lla, jolloin vältetään hankala hapen ja katalysaattorin käyttö ja siihen liittyvät rajoitukset. Reaktiolämpötilana käytetään 30-55 °C ja reaktio-pH:na 5,0-8,5.

5

Sulfonoidut heraproteiinit ovat saostettavissa alentamalla pH:ta 2,5-5,5:een. Alentamalla pH:ta eri pH-tasoille voidaan heraproteiinista saostaa koostumukseltaan erilaisia fraktioita, joissa on heran pääproteiineja a-laktalbumiinia, BSA:ta (naudan seerumialbumiinia) ja β-laktoglobuliinia eri suhteissa.

10

Happamessa, saostuksen yhteydessä vapautuvat oksidatiivisessa sulfitolyysissä muodostuneet S-sulfoniryhmät sekä jäljellä oleva sulfiitti muutetaan rikkidiokjsidik-si, joka puhalletaan pois sopivalla steriilillä kaasulla ja otetaan neutraloimalla talteen uudelleenkäyttöä varten.

15

Saostettu proteiinifraktio erotetaan mikrosuodattamalla sekä konsentroidaan ja pestään ultrasuodattamalla. Tuloksena on proteiinifraktiokonsentraatti, jossa on tietty proteiini-, laktoosi-ja suolapitoisuus. Liukoisen fraktion proteiinit konsentroidaan ja pestään ultrasuodattamalla, minkä tuloksena saadaan halutunlainen proteiinifraktio-20 konsentraatti.

Vaikka edellä esitetyissä suomalaisissa keksinnöissä heraproteiinien eristys erilaisina fraktioina yksinkertaistui ja eristys ensimmäistä kertaa toteutettiin aiempaa; suuremmassa mittakaavassa ja sen taloudellinen toteuttaminen oli mahdollista, koko ; 25 eristysprosessissa on vielä monta vaihetta, jotka pidentävät prosessiaikaa ja moni mutkaistavat käsittelyä aiheuttaen kustannuksia.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on yksinkertaistaa proteiinien, erityisesti hera- ja soijaproteiinien sekä eräiden muiden proteiinien sulfonoimalla tapahtuvaa 30 muuntelua ja nopeuttaa fraktiointitapahtumaa sekä fraktioiden jatkokäsittelyä. Tämä on saatu aikaan siten kuin on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Esillä olevassa keksinnössä on oivallettu, että proteiinien, kuten hera- tai soijaproteiinien, muuntelussa sulfitolyysi yksistään aiheuttaa jo riittävän disulfidisidosten au-35 keamisen eikä hapetus ole välttämätön proteiinimolekyylin konformaation muuttamiseksi ja proteiinien saostamiseksi happamissa olosuhteissa. Hapetuksen poisjääminen yksinkertaistaa ja nopeuttaa prosessia ja parantaa sen kannattavuutta. Käyttämällä heraproteiinien sulfitolyysin reaktiolämpötilana noin 40-65 °C reaktio no- 7 107116 peutuu ja reaktiotasapaino siirtyy sulfonoitujen tuotteiden puolelle, jolloin tarvittavan sulfiitin määrä pienenee.

Seuraavassa keksintöä kuvataan sovellettuna heraproteiinin muunteluun ja eristämi-5 seen, mutta keksinnön mukainen menetelmä soveltuu käytettäväksi myös muiden proteiinien, kuten soijaproteiinin, käsittelyyn.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään taloudellisista syistä mahdollisimman korkean proteiinipitoisuuden omaavaa heraproteiinikonsentraattia. Edullisim-10 maksi on osoittautunut noin 16-20-kertaa alkuperäiseen heraan nähden konsentroitu heraproteiini. Sen proteiinipitoisuus on 9-12 paino-%.

Keksinnön mukaisesti hera- tai soijaproteiinien muuntelu, disulfidisidosten avaaminen ja konformaation muuntelu saadaan aikaan sulfitolyysillä, jossa sulfiitti-ioni 15 reagoi spesifisesti disulfidisidoksen toisen rikin kanssa ja muodostaa S-sulfonaatti-johdannaisen. Toinen rikki pelkistyy sulfhydryyliryhmäksi. Käyttökelpoisimpia sul-fiitteja ovat liukoiset ja elintarvikelaatuiset natriumsulfiitti, natriumvetysulfiitti sekä natriummetabisulfiitti, mutta myös muita voidaan käyttää. Kaikista edellä nimeltä mainituista muodostuu reaktio-olosuhteissa valtaosaltaan natrium- ja natriumvety-20 sulfiittia. Lopputuotteiden toiminnallisiin ja muihin ominaisuuksiin pystytään vaikuttamaan valmistusprosessin sulfitolyysillä määrittelemällä sulfiitin määrän suhde proteiinissa olevien disulfidisidosten määrään. Heraproteiinien sulfitolyysissä sopiva sulfiitin määrä on välillä 0,02-0,20 M, edullisesti 0,05-0,10 M.

25 pH:hon perustuvan saostuksen kannalta sulfitolyysillä sulfonoidut hera- tai soijapro- • * teiinit eivät tarvitse hapetusta ja siten sulfonoinnin jatkaminen niin, että kaikki sulfitolyysissä vapautuneet sulfhydryyliryhmät sulfonoituisivat, ei ole tarpeen. Oksida-tiivinen sulfitolyysi eli sulfitolyysi ja hapetus on käyttökelpoinen menetelmä silloin, kun tilanne ja olosuhteet vaativat aukaistujen disulfidisidosten molempien rikki-30 atomien sulfonointia.

«

Keksinnön mukaisen menetelmän optimoimiseksi on määriteltävä myös sopiva re-aktiolämpötila, pH, saostuksissa käytetyt pH:t, pH:n muutoksissa käytetyt hapot ja emäkset, muut reagenssit sekä sopivat toimenpiteet ja menetelmät haluttujen omi-35 naisuuksien saamiseksi tuotteille, jotka voivat olla proteiinikonsentraatteja tai suih-kekuivattuja jauheita.

8 107116

Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaan sulfitolyysin lämpötila on 40-65 °C. Sulfitolyysi tapahtuu pH:ssa 5,5-8,0, edullisesti 6,0-7,0. Reaktioaika on 10-50 min, edullisesti 20-40 min.

5 Edellä mainituilla tekijöillä pystytään vaikuttamaan muunneltujen proteiinjen ja fraktioiden toiminnallisiin ominaisuuksiin sekä saostus-pH.lla fraktioiden määrään ja koostumukseen α-laktalbumiiniin, BSA.han ja β-laktoglobuliiniin nähden.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä suoritetaan ensin heraproteiinikonsentjraatin 10 proteiinien muuntelu sulfitolyysillä ja sen jälkeen heraproteiinien tietyn osan saostus happamassa pH:ssa. Saostus suoritetaan pH:ssa 1,5-5,5 ja edullisesti pH:ssa 4;0-5,0 ja lämpötilan ollessa tarpeeksi korkea, edullisesti 40-65 °C, edullisimmin välillä 50-60 °C.

15 Sulfolyysillä muunnellut proteiinit voidaan jättää saostamattakin, jolloin saadaan eri asteisesti muunneltuja heran kokonaisproteiineja, joiden proteiinikoostumus ön sama kuin herakonsentraatin alkuperäinen koostumus, mutta sen toiminnalliset ominaisuudet ovat muuttuneet muunteluasteesta riippuen.

20 Saostuksessa tai erikseen suoritettavassa toimenpiteessä pH:n ollessa selvästi; hap-pamen puolella, pH 1,5-4,5, sulfitolyysissä muodostuneet sulfoniryhmät ja sijlfito-lyysissä jäljelle jäänyt sulfiitti vapautuvat rikkidioksidina ja se johdetaan puhaltamalla steriilillä kaasulla, edullisesti ilmalla tai sen typpiseoksella, vastaanottcisäili-öön, jossa se otetaan talteen natrium- ja natriumvetysulfiitin seoksena ja on käytet-; 25 tävissä seuraavassa sulfitolyysissä. Vapautunut rikkidioksidi voidaan siis käyttää uudelleen, mikä säästää kyseistä raaka-ainetta eikä prosessi rasita ympäristöä rikkidioksidipäästöillä.

Fraktioimattomaksi jätettävän heraproteiininkin pH lasketaan happamen puolelle ar-30 voihin, jossa saadaan vapautetuksi sulfoniryhmät ja jäljelle jäänyt sulfiitti rikkidioksidina, joka puhalletaan edellä kuvatulla tavalla.

Haluttaessa saostuksen jälkeen voidaan toteuttaa fraktiointi, jossa saostuma eli saos-tettu proteiini erotetaan sopivalla menetelmällä, edullisesti mikrosuodattamalla tai 35 sentrifugoimalla, liukoisesta proteiinista. Haluttaessa muunneltuja kokonaisproteiineja erotus jätetään suorittamatta.

9 107116

Fraktiot pestään haluttaessa ja konsentroidaan ultrasuodattamalla saostus-pH:ssa tai lähellä sitä. Pesulla tarkoitetaan edullisesti diasuodatusta, jossa pestävään liuokseen ' tai suspensioon lisätään puhdasta vettä ja sekoituksen jälkeen suodatetaan se pois, jolloin pienimolekyylisiä yhdisteitä, kuten suoloja ja laktoosia, poistuu suodoksen 5 mukana. Toimenpidettä voidaan jatkaa niin kauan, kunnes saavutetaan haluttu koostumus, proteiini-, laktoosi-ja suolapitoisuus, käsiteltävälle fraktiolle.

Muunteluaste osoittaa avautuneiden disulfidisidosten määrän. Happamissa olosuhteissa pH 1,5-4,5 vapautuvat sulfitolyysissä muodostuneet sulfoniryhmät, jolloin 10 avautuneesta disulfidiryhmästä jää jäljelle kaksi sulfhydryyliryhmää. Lopputuottee na käytettävä muunnettu kokonaisproteiinikonsentraatti ja proteiinifraktiokonsent-raatit tai niistä kuivatut jauheet voivat olla tätä tyyppiä, jolloin vapaita sulfhydryyli-ryhmiä voidaan hyödyntää monella tavalla parantuneina toiminnallisina ominaisuuksina, kuten emulgoituvuutena, geeliytyvyytenä, vaahtoutuvuutenajahydrolysoi-15 tuvuutena/sulavuutena.

Vapaat sulfhydryyliryhmät aiheuttavat helposti sopivissa olosuhteissa disulfidiryh-mien avautumista ja syntyneet sulfhydryyliryhmät muodostavat toisten sulfhydryyli-ryhmien kanssa uusia disulfidiryhmiä, jolloin muodostuu proteiini verkkoja, jotka 20 muodostavat suspensiossa emulgoivan proteiinikalvon vesipisaran ympärille tai vaahdossa ilmakuplan ympärille tai sopivan vahvan verkoston geelinmuodostusta varten.

Sulfhydryyliryhmät ovat hapetettavissa hapettavalla yhdisteellä edullisesti ilman ha-y 25 peliä, dehydroaskorbiinihapolla ja yleensä elintarvikelaatuisilla hapettimilla disulfi-disidoksiksi edullisesti pH:ssa 4,5-8,5, edullisimmin pH 6,5-7,5, lämpötilassa 45-75 °C, edullisimmin välillä 50-70 °C ja sekoittamalla suspensiota tai liuosta tehokkaasti niin, että disulfidisidokset muodostuvat eri sulfhydryyliryhmien kanssa kuin proteiinin alkuperäisessä konformaatiossa. Lopputuote, muunnettu proteiini- tai 30 proteiinifraktiokonsentraatti tai vastaava jauhe on pH.ltaan korkeampi kuin edellä kuvattu tuote, siinä on vähemmän vapaita sulfhydryyliryhmiä ja sillä on muuntelun asteesta johtuvia toiminnallisia ominaisuuksia kuten dispergoituvuus, emulgoitu-vuus, geeliytyvyys ja hydrolysoituvuus/sulavuus.

35 S-sulfoniryhmistä ja sulfiitista vapautunut ja puhalluksessa mahdollisesti poistumatta jäänyt rikkidioksidi muuttuu pH:n noston yhteydessä sulfiitiksi ja hapettuu sulfaatiksi reaktorissa puhallettaessa ilmaa ja sekoitettaessa tehokkaasti pH:ssa 4-7, 10 107716 edullisesti pH 5-6 ja lämpötilassa 45-65 °C, edullisimmin välillä 50-60 °C. Kyseessä on pienen noin 0,01 %:n sulfiittimäärän hapettuminen sulfaatiksi.

Sulfitolyysillä voidaan edellä esitetyn periaatteen mukaan muunnella myös imuita 5 proteiineja, kuten soijaproteiineja, esimerkiksi soijaisolaatteja, -konsentraattpja ja -jauhoja, vaikka niiden muuntelu vaatiikin toisenlaiset olosuhteet, jotka ovat riijttävät sulfitolyysin tapahtumiselle ja siten disulfidisidosten avautumiselle. Soijaisolajattien muuntelu voidaan suorittaa sulfitolyysillä esimerkiksi seuraavalla tavalla: Soijjaiso-laatista tehdään 6-10-prosenttinen suspensio veteen. Sulfitolyysissä käytetään sullo fiittimäärää 0,02-0,2 M, edullisesti 0,05-0,10 M. Reaktiolämpötila on 60-80 °C, edullisesti välillä 65-75 °C. Sulfitolyysi tapahtuu pH.ssa 5,5-8,0, edullisesti pulissa 6,0-7,0. Reaktioaika on 10-50 min edullisesti 20-40 min. Muuntelun jälkeen sjoijai-solaatti on eristettävissä ja pestävissä pH 4,5:ssä, joka on soijaproteiinien isoel|ektri-nen piste. Ylimääräinen sulfiitti poistuu pesuveden mukana sitä täydellisemmin mitä 15 useammin pesu tapahtuu; 2-3 kertaa on riittävä. Sulfiitti on otettavissa talteen pesuvesistä alentamalla pH 2:een ja puhaltamalla vapautunut rikkidioksidi vastaanotto-astiaan sulfiitiksi myöhempää käyttöä varten. Tämän jälkeen, kun suurin osa sulfii-tista on poistunut, muunnellun soijaisolaatin pH lasketaan 2-3:een, jolloin saosjtuma liukenee osittain ja sulfitolyysissä muodostuneet S-sulfonaattiryhmät vapautuvat 20 rikkidioksidina näin happamessa ympäristössä. Tarvittaessa rikkidioksidi on puhallettavissa pois tässä vaiheessa. Nostettaessa pH jälleen 4,5:een muodostunut pieni rikkidioksidimäärä muuttuu natriumvetysulfiitiksi ja se on pestävissä pois.

Sulfitolyysin aikaansaamalla soijaisolaatin muuntelulla voidaan inaktivoida bidlogi-• 25 sesti aktiivisia proteiineja esimerkiksi trypsiini-inhibiittori sekä parantaa protejiinin toiminnallisia ominaisuuksia vapaiden sulfhydryyliryhmien lisäännyttyä muuntelu-asteen osoittamalla määrällä.

Keksinnön erään suoritusmuodon mukaan heran proteiinien muuntelu, fraktioin ti, 30 eristys ja muu käsittely tapahtuu seuraavina jaksoina: Heran proteiinien tkon-sentrointi ultrasuodattamalla, konsentraatin proteiinien rakenteen/konforma^tion muuntelu sulfitolyysillä, osan muunnelluista proteiineista saostaminen laskemalla pH:ta, happamessa pH.ssa sulfoniryhmistä ja sulfiitista muodostuneen rikkidioksidin puhaltaminen reaktorista sekä talteenotto sulfiittina seuraavaa sulfitolyysiä vajrten, 35 saostettujen proteiinien erotus liukoisista proteiineista mikrosuodattamalla, saostet-tujen proteiinien sekä muunnettujen kokonaisproteiinien pesu ja konsentrointi ultra-suodattamalla saostus-pH:ssa tai yleensä happamessa pH:ssa, mikrosuodatuksen suodoksen pesuja konsentrointi ultrasuodattamalla saostus-pH:ssa tai sen yläpuolet- u 107116 la, vaihtoehtoisesti, saostettujen proteiinien konsentraatin, muunneltujen kokonais-proteiinien konsentraatin sekä liukoisten proteiinien konsentraatin vapaiden sulfhyd-’ ryyliryhmien hapetus disulfidiryhmiksi uuteen järjestykseen sekä kaikkien proteiini- konsentraattien pesu ja konsentrointi ultrasuodattamalla ja lopputuotteiksi saattami-5 nen konsentraatteina tai kuivattuina jauheina.

Heran konsentrointi aloitetaan mikrosuodatuksella, jolloin herasta poistetaan mahdolliset kaseiinihiukkaset, ja vähennetään fosfolipoproteiinien ja bakteerien määrää. Mikrosuodatuksen tuloksena ultrasuodatus helpottuu. Saatua mikrosuodatuksen 10 suodosta ultrasuodatetaan 6000-30000 D:n kalvoilla proteiinipitoisuuden väkevöi-miseksi alkuperäisestä 0,6 %:sta 16-20-kertaiseksi, joka vastaa 9-12 %:n proteiini-määrää. Edullinen konsentraatin proteiiniväkevyys on 10-11 %.

Heraproteiinien rakenteen muuntelu tapahtuu sulfitolyysin avulla, jolloin haluttu osa 15 disulfidisidoksista aukaistaan ja saavutetaan haluttu muunteluaste alkuperäisten di-sulfidisidosten määrään nähden. Heraproteiinien sulfitolyysi toteutetaan tässä suoritusmuodossa seuraavalla tavalla:

Heraproteiinikonsentraattia, proteiinipitoisuus esimerkiksi 10 %, otetaan tarvittava 20 määrä reaktoriin, jossa on tehokas sekoitus sekä lämpötilan ja pH:n mittaus ja säätö. Konsentraatin lämpötilaksi säädetään 40-65 °C, edullisesti 50-60 °C. Lämpötilan valintaan vaikuttaa mm. haluttu reaktionopeus, käytetyt kemikaalit sekä eristettäville proteiineille halutut toiminnalliset ja muut ominaisuudet. Vakiolämpöiseen proteii-nikonsentraattiin lisätään sulfiittia joko NaHSC>3:na, Na2S205:nä tai Na2S03:na . 25 0,02-0,2 M, esimerkiksi 0,05-0,1 M, ja sekoitetaan tehokkaasti. Lisättävän sulfiitin määrä riippuu mm. proteiinikonsentraatiosta ja halutusta sulfitolyysiasteesta. pH säädetään välille 5,5-8, edullisesti välille 6-7, esimerkiksi 6,5. pH:n säädössä käytetään elintarvikelaatuisia happoja ja emäksiä, kuten HCl:ää ja NaOH:ta. Reaktioaika, jonka sulfiitti vaikuttaa proteiineihin, on 10-50 min, edullisesti 20-40 min. Aika 30 määräytyy edellä mainittujen tekijöiden yhteisvaikutuksesta halutun muunteluasteen * saavuttamiseksi.

Proteiinit, halutun muuntelun jälkeen, saostetaan laskemalla pH 1,5-5,5 :een, edullisesti 4,0-5,0:aan. Saostuksessa käytettävä pH riippuu pääasiassa fraktioille halutusta 35 proteiinikoostumuksesta sekä jonkin verran proteiinien muunteluasteesta.

Saostamiseen käytetty aika on 10-40 min, esimerkiksi 20-30 min. Tietyn asteisesti muunnellut proteiinit voidaan jättää saostamatta, kun halutaan muunneltuja koko- 12 107116 naisproteiineja, ja pH lasketaan suoraan tarpeeksi alas pH l,5-4,5:een sulfoniryhmi-en ja ylimääräisen sulfiitin vapauttamiseksi rikkidioksidina, joka puhalletaan steriilillä ilmalla tai ilman ja typen seoksella vastaanottosäiliöön natrium- ja natriumve-tysulfiitin seoksena seuraavaa sulfitolyysiä varten.

5

Saostetut proteiinit erotetaan liukoisista proteiineista mikrosuodattamalla. Muodostuneet jakeet käsitellään erikseen.

Fraktioiduista proteiineista, saostettu ja liukoinen fraktio, sulfoniryhmät ja ylimää-10 räinen sulfiitti vapautetaan happamassa pH:ssa rikkidioksidina ja puhalletaan pois reaktioseoksesta, kuten edellä on kuvattu.

Muodostuneet jakeet pestään suolojen ja laktoosin vähentämiseksi ja konsentroidaan vaadittuun proteiinipitoisuuteen sekä laktoosi- ja suolapitoisuuteen happamessa 15 pH:ssa, esimerkiksi 4,5:ssä.

Haluttaessa jakeen pH nostetaan 5,5-7,5, esimerkiksi 6,5:een, sen läpi puhalletaan steriloitua ilmaa, jolloin vapaana olevat sulfhydryyliryhmät muodostavat disulfidisi-doksia alkuperäisestä poikkeaviin kohtiin proteiinimolekyylissä sekoituksen ansios-20 ta. Käsiteltävä fraktio on pestävissä ja konsentroitavissa ennen pH:n nostoa tai sen jälkeen tai molemmissa vaiheissa.

Pestyt, edellä kuvatuilla tavoilla tuotetut konsentraatit saatetaan vaadittuun proteiinipitoisuuteen ja ne ovat käytettävissä jatkosovellutuksiin. Konsentraatit voidaan v 25 myös kuivata jauheeksi ja käyttää sellaisenaan jatkosovellutuksiin.

Sulfitolyysin kaikilla tärkeillä muuttujilla eli proteiinikonsentraatin proteiinipitoisuudella, sulfiitin määrällä, reaktiolämpötilalla ja -pH:lla eri vaiheissa sekä eri vaiheissa käytetyillä reaktioajoilla voidaan vaikuttaa eristysprosessin eri osareakti<j>iden 30 toteutumiseen ja kokonaisuutena koko prosessin lopputulokseen eli eristettäviein ja-keiden proteiinien määrään, koostumukseen ja haluttuihin ominaisuuksiin.

Seuraavat esimerkit kuvaavat edellä esitettyä keksintöä.

35 Esimerkki 1

Heraproteiinikonsentraatin valmistukseen käytettiin tuoretta edam-juuston valmistuksessa syntynyttä heraa. Sen proteiinipitoisuus oli 0,6 %, joka on saatu kertomalla 13 107116

Kjeldahl-menetelmällä määritetty proteiinityppi vakiolla 6,38. Hera mikrosuodatet-tiin ensin 0,45 pmrn suodatinkalvoilla Millipore Pellicon -laboratoriolaitteistolla. 1 Mikrosuodatuksen suodos konsentroitiin suodattamalla se samalla laitteistolla 10000 D:n ultrasuodatuskalvoilla niin, että konsentraattien proteiinipitoisuudet vaihtelivat 5 8-12 %:n välillä.

Muuntelua ja firaktiointia varten otettiin 0,5 1 8,5-paino/tilavuusprosenttista herakon-sentraattia 1,0 l:n lasiastiaan. Se asetettiin lämpötilaltaan säädettävään vesihauteeseen ja sen sisältöä sekoitettiin tehokkaalla sekoittimella. Konsentraatin lämpötilaksi 10 säädettiin 45°C.

Sulfitolyysi käynnistettiin lisäämällä proteiinikonsentraattiin 2,4 g Na2S20s (nat-riummetabisulfiittia) ja pH säädettiin 6,0:aan lisäämällä NaOHrta. Seosta sekoitettiin ja reaktio sai jatkua 30 min. Tämän jälkeen osa muunnelluista proteiineista saos-15 tettiin laskemalla pH 4,8:aan lisäämällä seokseen HClrää. Saostumaa sisältävää seosta sekoitettiin vielä 15 min. Saostuma erotettiin sentrifugoimalla Sorvali RC-5B -sentrifugilla 10000 kierr./min 30 min. Saostuneet proteiinit erottuivat hyvin ja saatu liukoinen osa oli kirkasta. Liukoisesta osasta eli kirkasteesta määritettiin proteiinipitoisuus. Alkuperäisen proteiinikonsentraatin ja kirkasteen proteiinipitoisuuksien ero-20 tuksena voitiin laskea, ottamalla huomioon suorituksen aikana tapahtunut laimentuminen, proteiinien jakautuminen saostuneeseen ja liukoiseen osaan kokonaispro-teiiniin nähden. Tässä tapauksessa saostuneen proteiinin osuus oli 21 % ja liukoisen vastaavasti 79 %.

; · 25 Esimerkki 2

Muuntelua ja fraktiointia varten otettiin 0,5 1 10,5-prosenttista edellä kuvatulla tavalla suodattamalla konsentroitua heraproteiinikonsentraattia 1,0 l:n lasiastiaan. Konsentraatin lämpötilaksi säädettiin 50 °C ja sekoitettiin tehokkaasti. Sulfitolyysi käyn-30 riistettiin lisäämällä proteiinikonsentraattim 2,4 g natriummetabisulfiittia ja pH sää-" \ dettiin 6,Oraan lisäämällä NaOHrta.

Seosta sekoitettiin edelleen ja reaktio sai jatkua 30 min. Tämän jälkeen osa muunnelluista proteiineista saostettiin laskemalla pH 5,3reen lisäämällä seokseen HClrää. 35 Saostumaa sisältävää seosta sekoitettiin vielä 15 min. Saostuma erotettiin sentrifugoimalla 10000 kierr./min. 30 min. Saostuneen proteiinin osuus oli 16 % ja liukoisen vastaavasti 84 %.

14 107116

Esimerkki 3

Muuntelua ja fraktioinpa varten otettiin 0,5 1 10,5-prosenttista edellisessä esimerkissä käytettyä heraproteiinikonsentraattia 1,0 l:n lasiastiaan. Konsentraatin länjipöti-5 läksi säädettiin 55 °C ja sitä sekoitettiin tehokkaasti. Sulfitolyysi suoritettiin lisäämällä proteiinikonsentraattiin 2,4 g natriummetabisulfiittia ja pH säädettiin 6,Ö:aan lisäämällä NaOH:ta. Seosta sekoitettiin koko ajan ja reaktio sai jatkua 30 mirj Tämän jälkeen osa muunnelluista proteiineista saostettiin laskemalla pH 4,8:aan lisäämällä seokseen HCl:ää. Saostumaa sisältävää seosta sekoitettiin vielä 15 min. Saos-10 tuma erotettiin sentrifugoimalla 10000 kierr./min. 30 min. Saostuneen proteiinin osuus oli 26 % ja liukoisen vastaavasti 74 %.

Esimerkki 4 15 Muuntelua ja fraktiointia varten otettiin 0,45 1 9,0-prosenttista heraproteiinikoijsent-raattia 1,0 l:n lasiastiaan. Heraproteiinikonsentraatti oli laimennettu teollisesti dia-suodatuksella tuotetusta 16-prosenttista konsentraatista, joka oli ennen laimentamista mikrosuodatettu 0,45 pm:n kalvolla Millipore Prostak -laitteistolla mahdollisten kaseiinihiukkasten poistamiseksi ja lipoproteiinien vähentämiseksi. Konsentraatin 20 lämpötilaksi säädettiin 55 °C ja sitä sekoitettiin tehokkaasti.

Sulfitolyysi käynnistettiin lisäämällä proteiinikonsentraattiin 3,25 g natriummetabisulfiittia ja pH säädettiin 6,0:aan lisäämällä NaOH:ta. Seosta sekoitettiin kokoi ajan ja reaktio sai jatkua 30 min. Tämän jälkeen osa muunnelluista proteiineista saostet-: 25 tiin laskemalla pH ensin 5,3:aan ja sen jälkeen 4,8 lisäämällä seokseen HCl:ää. Sa ostumaa sisältävää seosta sekoitettiin pH:n laskun jälkeen vielä 15 min ennen näytteenottoa. Saostumat erotettiin sentrifugoimalla 10000 kierr./min. 30 min. Saostuneen proteiinin osuus pH 5,3:ssa oli 39 % ja liukoisen 61 %. Vastaavat luvut pH 4,8:ssa olivat 46 % ja 54 %.

30

Geelielektroforeesimääritykset osoittivat, että pH 5,3:ssa fraktioidussa liukoisessa osassa oli vielä vähän BSA:ta (naudan seerumialbumiinia) mukana β-laktoglobulii-nin lisänä, mutta pH 4,8:ssa BSA:ta ei enää ollut, vaan β-laktoglobuliinia pelkästään.

35 ,5 107116

Esimerkki 5

Muuntelua ja fraktioinpa varten otettiin 0,5 1 8,57-prosenttista herakonsentraattia 1,0 l:n lasiastiaan. Konsentraatin lämpötilaksi säädettiin 60 °C ja sekoitettiin tehok-- 5 kaasti. Sulfitolyysi käynnistettiin lisäämällä proteiinikonsentraattiin 4,8 g natrium- metabisulfiittia ja pH säädettiin 6,0:aan lisäämällä NaOH:ta. Seosta sekoitettiin ja reaktio sai jatkua 30 min. Tämän jälkeen osa muunnelluista proteiineista saostettiin laskemalla pH 4,5:een lisäämällä seokseen HCl:ää. Saostumaa sisältävää seosta sekoitettiin vielä 15 min. Saostuma erotettiin sentrifugoimalla 10000 kierr./min. 30 10 min. Saostuneen proteiinin osuus oli 66 % ja liukoisen vastaavasti 34 %.

Esimerkki 6 15 l:n reaktoriin, jossa oli sekoitus, lämpötilan ja pH:n säätö sekä kaasun puhallus-15 mahdollisuus reaktorin pohjalta, otettiin laboratoriolaitteilla mikrosuodatettua ja ult-rasuodatuksella konsentroitua 11,1-prosenttista heraproteiinikonsentraattia 9,0 1 heraproteiinin muuntelua varten. Konsentraatin lämpötila säädettiin 55 °C:een ja sitä sekoitettiin tehokkaasti.

20 Sulfitolyysi käynnistettiin lisäämällä proteiinikonsentraattiin 63 g natriummetabi-sulfiittia ja pH säädettiin 6,0:aan lisäämällä NaOH:ta. Seosta sekoitettiin ja reaktion annettiin jatkua 30 min. Tämän jälkeen muunnellun proteiinikonsentraatin pH laskettiin lisäämällä HCl:ää ja sekoittaen 2,0:aan, jossa sulfiitista suurin osa on tasapainoreaktion osana rikkidioksidina sekä muunteluasteen osoittamiin määriin disul-% 25 fidisidoksia muodostuneet S-sulfonaattiryhmät ovat vapautuneet myös rikkidioksi dina. Sekoitusta jatkettiin 15 min. Rikkidioksidin poistamiseksi puhallettiin reaktoriin steriloitua ilmaa 3 1/min noin tunnin ajan samalla sekoittaen tehokkaasti, jolloin rikkidioksidi poistui puhalletun ilman ja vesihöyryn mukana. Rikkidioksidipitoinen ilma otettiin vastaanottoastiaan, jossa se pH 7,0:ssa liuotettiin veteen ja neuraloitiin 30 natrium- ja natriumvetysulfiitin seokseksi. Tämän jälkeen muunnellun proteiinikon-' '·’ sentraatin pH nostetaan 5,0:aan ja mahdollisesti rikkidioksidin poistopuhalluksen jälkeenkin jäänyt pieni sulfiittimäärä hapetettiin sulfaatiksi puhaltamalla steriiliä ilmaa reaktoriin edellä kuvatulla tavalla ja samalla sekoittaen noin 30 min ajan.

35 Tämän jälkeen muunnettu proteiinikonsentraatti pestiin diasuodattamalla 10000 D -ultrasuodatuskalvoilla kolme kertaa omalla tilavuudellaan vettä, jolloin laktoosin ja suolojen määrä väheni yhteen kolmasosaan. Saatu muunnettu proteiinikonsentraatti on koostumukseltaan alkuperäisen kaltainen, mutta sen toiminnalliset ominaisuudet 16 107116 ovat muuttuneet, mm. sen pepsiinihydrolysoituvuus (hydrolyysinopeus) on alkuperäiseen konsentraattiin nähden 2,2-kertainen kolmen tunnin aikana

Esimerkki 7 5

Esimerkissä 4 mainittua 9,0-prosenttista heraproteiinikonsentraattia otettiin esimerkissä 6 mainittuun reaktoriin 7,0 1 muuntelua ja fraktiointia varten. Konsentraatin lämpötila säädettiin 55°:een ja sekoitettiin tehokkaasti.

10 Sulfitolyysi käynnistettiin lisäämällä proteiinikonsentraattiin 32 g natriummetabi-sulfiittia ja pH säädettiin 6,0:aan NaOH:lla. Seosta sekoitettiin ja reaktion annjettiin edetä 30 min. Tämän jälkeen osa proteiinikonsentraatin muunnelluista proteiineista saostettiin laskemalla pH 4,5:een HClillä. Saostumaa sisältävää seosta sekoitettiin vielä 15 min saostuneen ja liukoisen proteiinien määrän tasapainottumiseksi. $aos-15 tuneet proteiinit erotettiin saostuksen jälkeen suodattamalla 0,45 pm:n mikrosijoda-tuskalvoilla ja pestiin kerran omalla tilavuudellaan vettä. Suodos otettiin talteen ja käytettiin mikrosuodatuksen suodoksen eli liukoisen osan ensimmäisenä pesuvetenä.

Saostuman pH laskettiin HClillä 2,Olaan ja vapautunut rikkidioksidi puhallettiin! pois 20 ja sen jälkeen pH nostettiin 5,Olaan ja puhallettiin uudelleen pienen sulfiittijäämän hapettamiseksi sulfaatiksi, kuten esimerkissä 6 on kuvattu. Lopuksi tämä fräktio pestiin ultrasuodattamalla laktoosin ja suolojen vähentämiseksi sekä konsentroitiin 10 %:n proteiinipitoisuuteen.

: 25 Liukoisesta osasta poistettiin sulfiitti- ja S-sulfoniryhmät kuten edellä tehtiin saostu- • neen osan kohdalla. Sen jälkeen pH nostettiin 4,5:een ja pestiin ultrasuodattaipalla ensin mikrosuodatuksen pesuvedellä ja sitten kaksi kertaa vedellä ja konsentroitiin 15 %:n proteiinipitoisuuteen.

30 Esimerkki 8

Soijaproteiinm muuntelua varten sekoitettiin 70 g isolaattia 1,0 liaan vettä 2 Iin lasi-astiassa. Soijaisolaatin proteiinipitoisuus oli noin 85 %. Suspension lämpötilaksi säädettiin 70 °C ja sitä sekoitettiin tehokkaasti.

35

Sulfitolyysi käynnistettiin lisäämällä isolaattisuspensioon 9,5 g natriummetabisul-fiittia ja pH säädettiin 6,5:een NaOHilla. Reaktioaika oli 30 min ja koko ajan suspensiota sekoitettiin tehokkaasti.

17 107116

Muuntelun jälkeen suspension pH laskettiin 4,5:een, jolloin soijan proteiinit saostuivat. Saostuma sentriiugoitiin 10000 kierr./min. 30 min, jolloin proteiinisaostuma ; jäi putken pohjalle ja kirkkaaseen vesikerrokseen, kirkasteeseen jäivät suolat mm.

sulfiitti sekä vähän proteiinia (noin 0,5 %). Kahden pesukerran jälkeen suolojen - 5 määrä pieneni olennaisesti, mutta näissä pesuvesissä proteiinia oli vain nimeksi. Pe sujen jälkeen pH laskettiin 2,5:een ja pidettiin siellä 15 min samalla sekoittaen.

pH nostettiin uudelleen 4,5:een, jossa saostuma pestiin vielä kerran ja alkuperäiseen konsentraatioon liuotetun proteiinin pH nostettiin 6,0:aan. Tämä oli lopputuote, 10 josta tehtiin trypsiini-inhibiittorin aktiivisuuden määritys sekä geelielektroforeesi-määritys proteiinin molekyylikoon jakautumisesta. Trypsiini-inhibiittorin aktiivisuus määritettiin menetelmällä, joka on esitetty julkaisussa Kakade, M. L., Rackis, J. J., McGhee, J. E. ja Puski, G., Cereal Chem. 51 (1974), 376-382.

15 Määritystulosten mukaan muunnettu soijaisolaattiproteiini oli menettänyt kokonaan trypsiini-inhibiittoriaktiivisuutensa, mutta vertailuna käytetyssä alkuperäisessä iso-laattiproteiinissa aktiivisuutta oli menetelmässä käytetyn laimennus sarjan väkevim-mässä ja toiseksi väkevimmässä näytteessä selvästi ja kolmannessa havaittavasti. Geelielektroforeesimääritys osoitti vertailtaessa alkuperäisen soijaisolaatin ja muun-20 nellun isolaatin proteiinimolekyylien jakautumaa, että muunnellussa isolaatissa mo-lekyylipainoltaan pienempien proteiinien eli isompien proteiinien osaproteiinien määrä oli selvästi lisääntynyt.

Edellä on esitetty eräitä keksinnön sovelluksia. Keksintöä luonnollisesti ei rajoiteta : 25 edellä esitettyihin esimerkkeihin, vaan keksinnön mukaista periaatetta voidaan muunnella patenttivaatimusten suoja-alan puitteissa.

Claims (12)

18 107116

1. Menetelmä proteiinin, erityisesti hera- tai soijaproteiinien, muuntelemiseksi ja eristämiseksi, tunnettu siitä, että 5 a) saatetaan proteiini, kuten hera tai soija tai sen konsentraatti, kosketuksiin suljSitti-ioneja muodostavan reagenssin kanssa proteiinin sulfonoimiseksi ilman hapetinia, ja b) saostetaan sulfonoitu proteiini happamassa pHissa, ja c) otetaan saostunut ja/tai liukoinen sulfonoitu proteiini talteen ja suoritetaan sille mahdollinen jälkikäsittely. 10

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hera tai sen konsentraatti saatetaan kosketuksiin sulfntti-ioneja muodostavan reagenssin kanssa proteiinin sulfonoimiseksi lämpötilassa 40-65 °C, edullisesti 50-60 °C.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että herakon- sentraatin proteiinipitoisuus on 9-12 paino-%.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soya tai; sen konsentraatti saatetaan kosketuksiin sulfntti-ioneja muodostavan reagenssin kanssa 20 proteiinin sulfonoimiseksi lämpötilassa 60-80 °C, edullisesti 65-75 °C.

5. Patenttivaatimuksen 1, 2, 3 tai 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdassa (a) pH säädetään arvoon 5,5-8, edullisesti 6-7.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koh- dan (a) sulfonoinnissa käytetään sulfiittia 0,02-0,20 M, edullisesti 0,05-0,10 M.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiinin sul-fonoitumisasteeseen vaikutetaan reaktio-olosuhteita ja reagenssien määrää muutta- 30 maila.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sulfonoidut proteiinit saostetaan koostumukseltaan erilaisina fraktioina pH-arvoa säätelemällä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sulfonoidut proteiinit saostetaan laskemalla pH arvoon 1,5-5,5, edullisesti arvoon 4,0-5,0. · 107116 19

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saostuneesta ja/tai liukoisesta sulfonoidusta proteiinista poistetaan sulfoniryhmät sekä samasta liuoksesta sulfiitit laskemalla pH noin l,5-4:ään, jolloin molemmat vapautuvat rikkidioksidina ja proteiiniin muodostuu vapaita sulfhydryyliryhmiä. 5

11. Patenttivaatimuksen 1 tai 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jäljelle jäänyt sulfiitti hapetetaan sulfaatiksi puhaltamalla ilmaa seokseen pH:ssa 4-7.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vapaista 10 sulfhydryyliryhmistä muodostetaan uudelleen disulfidiryhmiä puhaltamalla ilmaa proteiiniseokseen, jonka pH on 4,5-8,5 ja lämpötila 45-75 °C.