ES3051391T3

ES3051391T3 - Inducible caspases and methods for use

Info

Publication number: ES3051391T3
Application number: ES17791508T
Authority: ES
Inventors: Eric Ostertag; Devon Shedlock
Original assignee: Poseida Therapeutics Inc
Current assignee: Poseida Therapeutics Inc
Priority date: 2016-10-06
Filing date: 2017-10-06
Publication date: 2025-12-29
Anticipated expiration: 2037-10-06
Also published as: DK3523325T3; PT3523325T; MX2019003983A; IL265664B1; EP4640273A3; JP7054694B2; JP2019528774A; US20190225667A1; IL265664A; CN110267980A; US12358966B2; EP4640273A2; KR102447083B1; US20260001929A1; RU2757058C2; RS67390B1; CA3038708A1; US11718656B2; RU2019113152A3; FI3523325T3

Abstract

La divulgación proporciona polipéptidos de caspasa inducibles, composiciones que comprenden polipéptidos de caspasa inducibles y secuencias que los codifican, células modificadas para expresar los polipéptidos y composiciones de la divulgación, así como métodos para su elaboración y métodos para su uso para terapia celular adoptiva. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Caspasas inducibles y procedimientos para su uso

[0003] Campo de la divulgación

[0004] La divulgación se refiere a biología molecular y, más específicamente, a composiciones que contienen al menos una secuencia que codifica una proteína caspasa inducible, así como a procedimientos de uso de la misma.Antecedentes

[0005] Karin C Straathofet al.Blood, American Society of Hematology, 105:11, pp. 4247-4254 (2005) y Teyet al.Biology of Blood and Marrow Transplantation, 13:8, pp. 913-924 (2007) describen interruptores de seguridad de caspasa 9 inducible para tratamiento de linfocitos T Los documentos WO2016/135470 y WO2015/134877 describen el uso médico de un interruptor de seguridad de caspasa 9 para expresar un agente terapéutico. En la técnica ha existido una necesidad sentida desde hace mucho tiempo pero no cubierta de un procedimiento para inducir selectivamente la apoptosis en células modificadas genéticamente y, en particular, en aquellas células modificadas destinadas a su administración a un sujeto como, por ejemplo, un tratamiento celular adoptivo. La divulgación proporciona una solución a esta necesidad sentida desde hace mucho tiempo pero no cubierta.Sumario

[0006] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier otro aspecto, configuración o caso como se establece en el presente documento que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones es solo para fines informativos. Cualquier referencia a procedimientos de tratamiento se debe interpretar como una referencia a la composición de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de ese tipo.

[0007] En el presente documento se describen con propósitos ilustrativos polipéptidos proapoptóticos inducibles enlazados de forma funcional a una región de unión a ligando que se puede optimizar para unirse a un inductor químico de dimerización. Cuando la región de unión a ligando se une específicamente al agente de inducción, las moléculas diana proapoptóticas se reticulan y, en consecuencia, se activan para inducir selectivamente la apoptosis en una célula que contiene un polipéptido proapoptótico inducible de la divulgación. Los polipéptidos proapoptóticos inducibles incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos de caspasa inducibles, incluyendo polipéptidos de caspasa 9 inducibles. Los polipéptidos de caspasa 9 inducibles pueden comprender un polipéptido de caspasa 9 truncado codificado por una secuencia de aminoácidos y/o de ácido nucleico truncada o modificada que codifica el polipéptido de caspasa 9 truncado. El polipéptido proapoptótico inducible de la invención es un polipéptido de caspasa inducible que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, que comprende un polipéptido de caspasa 9 truncado.

[0008] Los polipéptidos proapoptóticos inducibles de la divulgación son superiores a los polipéptidos inducibles existentes porque los polipéptidos proapoptóticos inducibles de la divulgación son mucho menos inmunogénicos. Si bien los polipéptidos proapoptóticos inducibles de la divulgación son polipéptidos recombinantes y, por lo tanto, no naturales, las secuencias que se recombinan para producir los polipéptidos proapoptóticos inducibles de la divulgación no comprenden secuencias no humanas que el sistema inmunitario humano huésped podría reconocer como "no propias" y, en consecuencia, inducen una respuesta inmunitaria en el sujeto que recibe un polipéptido proapoptótico inducible de la divulgación, una célula que comprende el polipéptido proapoptótico inducible o una composición que comprende el polipéptido proapoptótico inducible o la célula que comprende el polipéptido proapoptótico inducible. Aunque la secuencia del conector es una secuencia artificial, la secuencia del conector no comprende una secuencia no humana. Por ejemplo, la secuencia del conector no comprende un sitio de restricción.

[0009] En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se proporciona un polipéptido proapoptótico inducible que comprende (a) una región de unión a ligando, (b) un conector y (c) un polipéptido proapoptótico, en el que el polipéptido proapoptótico inducible no comprende una secuencia no humana. En determinados casos, la secuencia no humana comprende un sitio de restricción. En determinados casos, la región de unión a ligando puede ser una región de unión a ligando multimérica.

[0010] En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se proporciona un polipéptido de caspasa inducible que comprende (a) una región de unión a ligando, (b) un conector y (c) un polipéptido de caspasa, en el que el polipéptido proapoptótico inducible no comprende una secuencia no humana. En determinados casos, la secuencia no humana comprende un sitio de restricción. En determinados casos, la región de unión a ligando puede ser una región de unión a ligando multimérica.

[0011] En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se proporciona un polipéptido de caspasa inducible que comprende (a) una región de unión a ligando, (b) un conector y (c) un polipéptido de caspasa 9 truncado, en el que el polipéptido proapoptótico inducible no comprende una secuencia no humana. En determinados casos, la secuencia no humana comprende un sitio de restricción. En determinados casos, la región de unión a ligando puede ser una región de unión a ligando multimérica. De acuerdo con la invención, el polipéptido de caspasa inducible comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9.

[0013] La región de unión a ligando del polipéptido de caspasa inducible se unirá específicamente a un agente de inducción y activará la transcripción del polipéptido proapoptótico (por ejemplo, polipéptido de caspasa) de la divulgación. Por ejemplo, la región de unión a ligando no se unirá a un agente terapéutico. Los agentes de inducción unidos específicamente por la región de unión a ligando de los polipéptidos inducibles no inducen directamente la transcripción de genes endógenos.

[0015] Los polipéptidos proapoptóticos (por ejemplo, de caspasa) inducibles de la divulgación y el polipéptido de la invención reivindicada pueden estar bajo el control de uno o más elementos reguladores transcripcionales, incluyendo, pero sin limitarse a, un promotor que puede iniciar la transcripción del polipéptido de caspasa en una célula modificada para contener un polipéptido de caspasa inducible de la divulgación. Por ejemplo, los polipéptidos de caspasa inducibles pueden estar bajo el control de uno o más elementos reguladores transcripcionales, incluyendo, pero sin limitarse a, un promotor de mamífero que puede iniciar la transcripción del polipéptido de caspasa en una célula de mamífero modificada para contener un polipéptido de caspasa inducible de la divulgación. Por ejemplo, los polipéptidos de caspasa inducibles pueden estar bajo el control de uno o más elementos reguladores transcripcionales, incluyendo, pero sin limitarse a, un promotor heterólogo o exógeno que puede iniciar la transcripción del polipéptido de caspasa en una célula de mamífero modificada para contener un polipéptido de caspasa inducible de la divulgación. Las células de mamífero preferentes incluyen, pero no se limitan a, células humanas.

[0017] En un caso relacionado de los polipéptidos proapoptóticos inducibles, polipéptidos de caspasa inducibles o polipéptidos de caspasa 9 truncados, la región de unión a ligando puede comprender un polipéptido de proteína 12 de unión a FK506 (FKBP12). En determinados casos, la secuencia de aminoácidos de la región de unión a ligando que comprende un polipéptido de proteína 12 de unión a FK506 (FKBP12) puede comprender una modificación en la posición 36 de la secuencia. La modificación puede ser una sustitución de fenilalanina (F) por valina (V) en la posición 36 (F36V). En el polipéptido de caspasa inducible de la invención, la región de unión a ligando comprende un polipéptido de proteína 12 de unión a FK506 (FKBP12), en el que el polipéptido de FKBP12 se codifica por una secuencia de aminoácidos que comprende GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCWHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFML GKQEVI RGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO: 3). En determinados modos de realización, el polipéptido de FKBP12 se codifica por una secuencia de ácido nucleico que comprende GGGGTCCAGGTCGAGACT’AT

[0018] TTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGG GGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAG GACGGGAAGAAAGTG GACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAA GTG ATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCC AAACTGACCATTAGCCCTGACT ACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATC ATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTG AAGCTGGAG (SEQ ID NO: 4). En determinados modos de realización, el agente de inducción específico para la región de unión a ligando puede comprender un polipéptido de proteína 12 de unión a FK506 (FKBP12) que tiene una sustitución de fenilalanina (F) por valina (V) en la posición 36 (F36V) comprende AP20187 y/o AP1903 (rimiducid), ambos fármacos sintéticos.

[0020] En determinados casos de los polipéptidos proapoptóticos inducibles, polipéptidos de caspasa inducibles o polipéptidos de caspasa 9 truncados de la divulgación que se proporcionan con propósitos ilustrativos, y de acuerdo con el polipéptido de caspasa inducible de la invención, la región de conector se codifica por una secuencia de aminoácidos que comprende GGGGS (SEQ ID NO: 5) o una de ácido nucleico que comprende GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 6). En determinados modos de realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica el conector no comprende un sitio de restricción.

[0022] En determinados casos de los polipéptidos de caspasa 9 truncados de la divulgación proporcionados con propósitos ilustrativos, el polipéptido de caspasa 9 truncado se codifica por una secuencia de aminoácidos que no comprende una arginina (R) en la posición 87 de la secuencia. De forma alternativa, o además, en determinados casos de los polipéptidos proapoptóticos inducibles, polipéptidos de caspasa inducibles o polipéptidos de caspasa 9 truncados, el polipéptido de caspasa 9 truncado se codifica por una secuencia de aminoácidos que no comprende una alanina (A) en la posición 282 de la secuencia. En determinados casos de los polipéptidos proapoptóticos inducibles, polipéptidos de caspasa inducibles o polipéptidos de caspasa 9 truncados de la divulgación, y de acuerdo con el polipéptido de caspasa inducible de la invención reivindicada, el polipéptido de caspasa 9 truncado se codifica por una secuencia de aminoácidos que comprende GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCUINNVNFCRESGL RTRTGSNIDCEKLRR RFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVWILSHGCQASHLQFPG AVYGTD GCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDE SPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAI SSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVE TLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRK KLFFKTS (SEQ ID NO: 7) o una de ácido nucleico que comprende

[0024]

[0027] De acuerdo con el polipéptido proapoptótico inducible de la invención, en el que el polipéptido comprende un polipéptido de caspasa 9 truncado, el polipéptido proapoptótico inducible se codifica por una secuencia de aminoácidos que comprende GVQVETISPGDGRTFPKR GQTCWHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEE GVAQMSVGQRA KLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADL AYILSMEPCG HCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTA KKMVLALLELAQQDHGALDCCVWILSHGC QASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVN IFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDA TPFQEGLR TFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSL LLRVA-NAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 9) o la secuencia de ácido nucleico que comprende

[0029]

[0030]

[0032] La invención proporciona una composición que comprende el polipéptido de caspasa inducible de la invención. En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulga una composición que comprende un polipéptido proapoptótico inducible, polipéptido de caspasa inducible, polipéptido de caspasa 9 inducible y/o polipéptido de caspasa 9 truncado inducible de la divulgación.

[0033] La invención proporciona un transposón que comprende el polipéptido de caspasa inducible de la invención. En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulga un transposón que comprende un polipéptido proapoptótico inducible, polipéptido de caspasa inducible, polipéptido de caspasa 9 inducible y/o polipéptido de caspasa 9 truncado inducible de la divulgación.

[0034] En determinados modos de realización, el transposón comprende además una secuencia que codifica una proteína terapéutica.

[0035] En determinados modos de realización, la proteína terapéutica es natural. En determinados modos de realización, la proteína terapéutica es una proteína endógena. En determinados modos de realización, la proteína terapéutica es una proteína exógena.

[0036] En determinados modos de realización, la proteína terapéutica es una proteína sintética. En determinados modos de realización, la proteína terapéutica es una proteína quimérica o una recombinante. En determinados modos de realización, la proteína terapéutica es una proteína de fusión. En determinados modos de realización, la proteína terapéutica es una proteína humana, una proteína natural o una variante de secuencia de la misma. En determinados modos de realización, la proteína terapéutica comprende una proteína de superficie celular, una proteína unida a la membrana, una proteína unida a la membrana extracelular, una proteína unida a la membrana intracelular, una proteína intracelular, una proteína localizada nuclear, una proteína nuclear, una proteína citoplásmica, una proteína citosólica, una proteína secretada, una proteína lisosómica, una proteína endosómica, una proteína asociada a vesículas, una proteína mitocondrial, una proteína del retículo endoplásmico, una proteína citoesquelética, una proteína implicada en la señalización intracelular y/o una proteína implicada en la señalización extracelular.

[0037] En determinados modos de realización, la proteína terapéutica comprende un receptor de antígeno. En determinados modos de realización, el receptor de antígeno comprende un receptor de linfocitos T. En determinados modos de realización, el receptor de antígeno comprende un receptor aislado o derivado de un receptor de linfocitos T En determinados modos de realización, el receptor de antígeno comprende una o más variaciones de secuencia y/o mutaciones en comparación con un receptor de linfocitos T natural. En determinados modos de realización, el receptor de linfocitos T es un receptor de linfocitos T recombinante. En determinados modos de realización, el receptor de antígeno es un receptor quimérico de antígeno (CAR). En determinados modos de realización, el CAR comprende una o más secuencias de centirina. En determinados modos de realización, el CAR es una CARTirina. En determinados modos de realización, el CAR comprende una o más secuencias de VHH. En determinados modos de realización, el CAR es un VCAR.

[0038] En determinados modos de realización, un transposón de la divulgación o invención puede comprender además al menos un péptido autoescindible. En determinados modos de realización, un transposón puede comprender al menos un péptido autoescindible y en los que un péptido autoescindible se localiza entre el polipéptido proapoptótico inducible, polipéptido de caspasa inducible, polipéptido de caspasa 9 inducible y/o polipéptido de caspasa 9 truncado inducible y otra secuencia en el transposón. En determinados modos de realización, un transposón puede comprender al menos un péptido autoescindible y en los que un péptido autoescindible se localiza en dirección 5' del polipéptido proapoptótico inducible, polipéptido de caspasa inducible, polipéptido de caspasa 9 inducible y/o polipéptido de caspasa 9 truncado inducible y un segundo péptido autoescindible se localiza en dirección 3' del polipéptido proapoptótico inducible, polipéptido de caspasa inducible, polipéptido de caspasa 9 inducible y/o polipéptido de caspasa 9 truncado inducible. En determinados modos de realización, un transposón puede comprender al menos un péptido autoescindible y en los que un péptido autoescindible se localiza inmediatamente en dirección 5' del polipéptido proapoptótico inducible, polipéptido de caspasa inducible, polipéptido de caspasa 9 inducible y/o polipéptido de caspasa 9 truncado inducible y un segundo péptido autoescindible se localiza inmediatamente en dirección 3' del polipéptido proapoptótico inducible, polipéptido de caspasa inducible, polipéptido de caspasa 9 inducible y/o polipéptido de caspasa 9 truncado inducible. El al menos un péptido autoescindible puede comprender un péptido T2A, péptido GSG-T2A, un péptido E2A, un péptido<g>S<g>-E2A, un péptido F2A, un péptido GSG-F2A, un péptido P2A o un péptido GSG-P2A. En determinados modos de realización, el péptido T2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende EGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 11). En determinados modos de realización, el péptido GSG-T2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 12). En determinados modos de realización, el péptido E2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 13). En determinados modos de realización, el péptido GSG-E2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende GSGQCTNYALLKLAGD\/ESNPGP (SEQ ID NO: 14). En determinados modos de realización, el péptido F2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 15). En determinados modos de realización, el péptido GSG-F2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 16). En determinados modos de realización, el péptido P2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 17). En determinados modos de realización, el péptido GSG-P2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18).

[0040] La invención proporciona una composición que comprende el transposón de la invención. En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulga una composición que comprende un transposón de la divulgación. En determinados modos de realización de las composiciones que comprenden un transposón, la composición puede comprender además un plásmido que comprende una secuencia que codifica una enzima transposasa. La secuencia que codifica una enzima transposasa puede ser una secuencia de ARNm. En determinados modos de realización, el transposón es un transposón piggyBac. En determinados modos de realización, el transposón es un transposón piggyBac y la transposasa es una transposasa Super piggyBac.

[0042] Los transposones pueden comprender transposones piggyBac. En determinados modos de realización de este procedimiento, el transposón es un transposón de ADN plasmídico con una secuencia que codifica el polipéptido de caspasa inducible flanqueado por dos elementos aislantes reguladores en cis. En determinados modos de realización, el transposón es un transposón piggyBac. Las enzimas transposasas pueden incluir transposasas piggyBac o enzimas compatibles. En determinados modos de realización, y, en particular, aquellos modos de realización en los que el transposón es un transposón piggyBac, la transposasa es una transposasa piggyBac™ o Super piggyBac™ (SPB). En determinados modos de realización, y, en particular, aquellos modos de realización en los que la transposasa es una transposasa Super piggyBac™ (SPB), la secuencia que codifica la enzima transposasa es una secuencia de ARNm.

[0044] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, la enzima transposasa es una enzima transposasa piggyBac™ (PB). La enzima transposasa piggyBac (PB) puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o cualquier porcentaje intermedio a:

[0047]

[0048]

[0050] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, la enzima transposasa es una enzima transposasa piggyBac™ (PB) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución aminoacídica en una o más de las posiciones 30, 165, 282 o 538 de la secuencia:

[0053]

[0055] En determinados modos de realización, la enzima transposasa es una enzima transposasa piggyBac™ (PB) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución aminoacídica en dos o más de las posiciones 30, 165, 282 o 538 de la secuencia de SEQ ID NO: 1. En determinados modos de realización, la enzima transposasa es una enzima transposasa piggyBac™ (PB) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución aminoacídica en tres o más de las posiciones 30, 165, 282 o 538 de la secuencia de SEQ ID NO: 1. En determinados modos de realización, la enzima transposasa es una enzima transposasa piggyBac™ (PB) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución aminoacídica en cada una de las siguientes posiciones 30, 165, 282 o 538 de la secuencia de SEQ ID NO: 1. En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 30 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 es una sustitución de una isoleucina (I) por una valina (V). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 165 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 es una sustitución de una glicina (G) por una serina (S). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 282 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 es una sustitución de una metionina (M) por una valina (V). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 538 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 es una sustitución de una asparagina (N) por una lisina (K).

[0057] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, la enzima transposasa es una enzima transposasa Super piggyBac™ (SPB). En determinados modos de realización, las enzimas transposasas Super piggyBac™ (SPB) pueden comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que la sustitución aminoacídica en la posición 30 es una sustitución de una isoleucina (I) por una valina (V), la sustitución aminoacídica en la posición 165 es una sustitución de una glicina (G) por una serina (S), la sustitución aminoacídica en la posición 282 es una sustitución de una metionina (M) por una valina (V) y la sustitución aminoacídica en la posición 538 es una sustitución de una asparagina (N) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la enzima transposasa Super piggyBac™ (SPB) puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o cualquier porcentaje intermedio a:

[0059]

[0060]

[0063] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, incluyendo aquellos modos de realización en los que la transposasa comprende las mutaciones descritas anteriormente en las posiciones 30, 165, 282 y/o 538, la enzima transposasa piggyBac™ o Super piggyBac™ puede comprender además una sustitución aminoacídica en una o más de las posiciones 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 y 591 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinados modos de realización, incluyendo aquellos modos de realización en los que la transposasa comprende las mutaciones descritas anteriormente en las posiciones 30, 165, 282 y/o 538, la enzima transposasa piggyBac™ o Super piggyBac™ puede comprender además una sustitución aminoacídica en una o más de las posiciones 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 y 570. En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 3 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una serina (S) por una asparagina (N). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 46 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una alanina (A) por una serina (S). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 46 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una alanina (A) por una treonina (T). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 82 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una isoleucina (I) por un triptófano (W). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 103 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una serina (S) por una prolina (P). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 119 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una arginina (R) por una prolina (P). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 125 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una cisteína (C) por una alanina (A). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 125 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una cisteína (C) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 177 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una tirosina (Y) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 177 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una tirosina (Y) por una histidina (H). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 180 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una fenilalanina (F) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 180 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una fenilalanina (F) por una isoleucina (I). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 180 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una fenilalanina (F) por una valina (V). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 185 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 187 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una alanina (A) por una glicina (G). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 200 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una fenilalanina (F) por un triptófano (W). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 207 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una valina (V) por una prolina (P). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 209 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una valina (V) por una fenilalanina (F). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 226 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una fenilalanina (F). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 235 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una leucina (L) por una arginina (R). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 240 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 1 es una sustitución de una valina (V) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 241 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una fenilalanina (F) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 243 de<s>E<q>ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una prolina (P) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 258 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una asparagina (N) por una serina (S). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 296 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una leucina (L) por un triptófano (W). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 296 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una leucina (L) por una tirosina (Y). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 296 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una leucina (L) por una fenilalanina (F). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 298 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 298 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una alanina (A). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 298 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una valina (V). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 311 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una prolina (P) por una isoleucina (I). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 311 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una prolina (P) por una valina. En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 315 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una arginina (R) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 319 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una treonina (T) por una glicina (G). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 327 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una tirosina (Y) por una arginina (R). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 328 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una tirosina (Y) por una valina (V). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 340 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una cisteína (C) por una glicina (G). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 340 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una cisteína (C) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 421 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución del ácido aspártico (D) por una histidina (H). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 436 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una valina (V) por una isoleucina (I). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 456 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una tirosina (Y). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 470 de s Eq ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una leucina (L) por una fenilalanina (F). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 485 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una serina (S) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 503 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 503 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una isoleucina (I). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 552 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una valina (V) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 570 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una alanina (A) por una treonina (T). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 591 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una glutamina (Q) por una prolina (P). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 591 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una glutamina (Q) por una arginina (R).

[0065] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, incluyendo aquellos modos de realización en los que la transposasa comprende las mutaciones descritas anteriormente en las posiciones 30, 165, 282 y/o 538, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender o la enzima transposasa Super piggyBac™ puede comprender además una sustitución aminoacídica en una o más de las posiciones 103, 194, 372, 375, 450, 509 y 570 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, incluyendo aquellos modos de realización en los que la transposasa comprende las mutaciones descritas anteriormente en las posiciones 30, 165, 282 y/o 538, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender o la enzima transposasa Super piggyBac™ puede comprender además una sustitución aminoacídica en dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las posiciones 103, 194, 372, 375, 450, 509 y 570 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinados modos de realización, incluyendo aquellos modos de realización en los que la transposasa comprende las mutaciones descritas anteriormente en las posiciones 30, 165, 282 y/o 538, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender o la enzima transposasa Super piggyBac™ puede comprender además una sustitución aminoacídica en las posiciones 103, 194, 372, 375, 450, 509 y 570 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 103 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una serina (S) por una prolina (P). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 194 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una valina (V). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 372 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una arginina (R) por una alanina (A). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 375 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una lisina (K) por una alanina (A). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 450 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de un ácido aspártico (D) por una asparagina (N). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 509 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una serina (S) por una glicina (G). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 570 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una asparagina (N) por una serina (S). En determinados modos de realización, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender una sustitución de una metionina (M) por una valina (V) en la posición 194 de<s>E<q>ID NO: 1. En determinados modos de realización, incluyendo aquellos modos de realización en los que la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender una sustitución de una metionina (M) por una valina (V) en la posición 194 de SEQ ID NO: 1, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender además una sustitución aminoacídica en las posiciones 372, 375 y 450 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinados modos de realización, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender una sustitución de una metionina (M) por una valina (V) en la posición 194 de SEQ ID NO: 1, una sustitución de una arginina (R) por una alanina (A) en la posición 372 de SEQ ID NO: 1 y una sustitución de una lisina (K) por una alanina (A) en la posición 375 de SEQ ID NO: 1. En determinados modos de realización, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender una sustitución de una metionina (M) por una valina (V) en la posición 194 de SEQ ID NO: 1, una sustitución de una arginina (R) por una alanina (A) en la posición 372 de SEQ ID NO: 1, una sustitución de una lisina (K) por una alanina (A) en la posición 375 de SEQ ID NO: 1 y una sustitución de un ácido aspártico (D) por una asparagina (N) en la posición 450 de SEQ ID NO: 1.

[0066] En determinados modos de realización de este procedimiento, el transposón es un transposón de ADN plasmídico con una secuencia que codifica el polipéptido de caspasa inducible flanqueado por dos elementos aislantes reguladores en cis. En determinados modos de realización de las composiciones que comprenden un transposón, la composición puede comprender además un plásmido que comprende una secuencia que codifica una enzima transposasa. La secuencia que codifica una enzima transposasa puede ser una secuencia de ARNm. En determinados modos de realización, el transposón es un transposón Sleeping Beauty. En determinados modos de realización, el transposón es un transposón Sleeping Beauty y la transposasa es una transposasa Sleeping Beauty o una transposasa Sleeping Beauty hiperactiva (SB100X).

[0068] Los transposones pueden comprender transposones Sleeping Beauty. En determinados modos de realización y, en particular, aquellos modos de realización en los que el transposón es un transposón Sleeping Beauty, la composición comprende además un plásmido que comprende una secuencia que codifica una enzima transposasa. En determinados modos de realización, la secuencia que codifica la enzima transposasa es una secuencia que codifica una transposasa Sleeping Beauty o una transposasa Sleeping Beauty hiperactiva (SB 100X). En determinados modos de realización, la secuencia que codifica la enzima transposasa es una secuencia de ARNm.

[0070] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, la enzima transposasa Sleeping Beauty comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o cualquier porcentaje intermedio a:

[0072]

[0074] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, la enzima transposasa Sleeping Beauty hiperactiva (SB 100X) comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o cualquier porcentaje intermedio a:

[0076]

[0078] En determinados modos de realización de este procedimiento, el transposón es un transposón de ADN plasmídico con una secuencia que codifica el polipéptido de caspasa inducible flanqueado por dos elementos aislantes reguladores en cis. En determinados modos de realización de las composiciones que comprenden un transposón, la composición puede comprender además un plásmido que comprende una secuencia que codifica una enzima transposasa. La secuencia que codifica una enzima transposasa puede ser una secuencia de ARNm. En determinados modos de realización, el transposón es un transposón Hellraiser. En determinados modos de realización, el transposón es un transposón Hellraiser y la transposasa es una transposasa Helitron.

[0079] Los transposones pueden comprender transposones Hellraiser. En determinados modos de realización de este procedimiento, el transposón es un transposón de ADN plasmídico con una secuencia que codifica el polipéptido de caspasa inducible flanqueado por dos elementos aislantes reguladores en cis. En determinados modos de realización de este procedimiento, el transposón es un transposón Hellraiser. En determinados modos de realización y, en particular, aquellos modos de realización en los que el transposón es un transposón Hellraiser, la composición comprende además un plásmido que comprende una secuencia que codifica una enzima transposasa. En determinados modos de realización, la secuencia que codifica la enzima transposasa comprende una secuencia que codifica una transposasa Helitron. En determinados modos de realización, la secuencia que codifica la enzima transposasa es una secuencia de ARNm.

[0081] En determinados modos de realización, la transposasa es una transposasa Helitron. Las transposasas Helitron movilizan el transposón Hellraiser, un elemento antiguo del genoma de murciélago que estuvo activo hace aproximadamente de 30 a 36 millones de años. Un transposón Hellraiser ejemplar incluye Helibat1, que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende:

[0082]

[0083]

[0085] A diferencia de otras transposasas, la transposasa Helitron no contiene un dominio catalítico similar a RNasa-H, sino que, en su lugar, comprende un motivo RepHel constituido por un dominio iniciador de replicación (Rep) y un dominio de ADN helicasa. El dominio Rep es un dominio de nucleasa de la superfamilia de nucleasas HUH.

[0087] Una transposasa Helitron ejemplar comprende una secuencia de aminoácidos que comprende:

[0089] En las transposiciones Helitron, una horquilla cerca del extremo 3' del transposón funciona como un finalizador. Sin embargo, esta horquilla se puede eludir por la transposasa, dando como resultado la transducción de las secuencias flanqueantes. Además, la transposición de Hellraiser genera intermedios circulares cerrados covalentemente. Además, las transposiciones Helitron pueden carecer de duplicaciones de sitio diana. En la secuencia de Hellraiser, la transposasa está flanqueada por secuencias terminales izquierda y derecha denominadas LTS y RTS. Estas secuencias finalizan con un motivo 5'-TC/CTAG-3' conservado. Una secuencia palindrómica de 19 pb con el potencial de formar la estructura de finalización en horquilla se localiza 11 nucleótidos en dirección 5' de la RTS y consiste en la secuencia GTGCACGAATTTCGTGCACCGGGCCACTAG (SEQ ID NO: 23).

[0091] En determinados modos de realización de este procedimiento, el transposón es un transposón de ADN plasmídico con una secuencia que codifica el polipéptido de caspasa inducible flanqueado por dos elementos aislantes reguladores en cis. En determinados modos de realización de las composiciones que comprenden un transposón, la composición puede comprender además un plásmido que comprende una secuencia que codifica una enzima transposasa. La secuencia que codifica una enzima transposasa puede ser una secuencia de ARNm. En determinados modos de realización, el transposón es un transposón Tol2. En determinados modos de realización, el transposón es un transposón Tol2 y la transposasa es una transposasa Tol2.

[0093] Los transposones pueden comprender transposones Tol2. En determinados modos de realización de este procedimiento, el transposón es un transposón de ADN plasmídico con una secuencia que codifica el polipéptido de caspasa inducible flanqueado por dos elementos aislantes reguladores en cis. En determinados modos de realización de este procedimiento, el transposón es un transposón Tol2. En determinados modos de realización y, en particular, aquellos modos de realización en los que el transposón es un transposón Tol2, la composición comprende además un plásmido que comprende una secuencia que codifica una enzima transposasa. En determinados modos de realización, la secuencia que codifica la enzima transposasa comprende una secuencia que codifica una transposasa Tol2. En determinados modos de realización, la secuencia que codifica la enzima transposasa es una secuencia de ARNm.

[0095] Los transposones Tol2 se pueden aislar o derivar del genoma del pez medaka, y pueden ser similares a los transposones de la familia hAT. Los transposones Tol2 ejemplares se codifican por una secuencia que comprende aproximadamente 4,7 kilobases y contienen un gen que codifica la transposasa Tol2, que contiene cuatro exones. Una transposasa Tol2 ejemplar comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la siguiente:

[0097]

[0099] Un transposón Tol2 ejemplar de la divulgación, incluyendo repeticiones invertidas, secuencias subterminales y la transposasa Tol2, se codifica por una secuencia de ácido nucleico que comprende la siguiente:

[0102]

[0103]

[0104]

[0106] La invención proporciona un vector que comprende el polipéptido de caspasa inducible de la invención. En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulga un vector que comprende el polipéptido proapoptótico inducible, polipéptido de caspasa inducible, polipéptido de caspasa 9 inducible y/o polipéptido de caspasa 9 truncado inducible de la divulgación. En determinados modos de realización, el vector es un vector vírico.

[0108] Los vectores víricos pueden comprender una secuencia aislada o derivada de un retrovirus, un lentivirus, un adenovirus, un virus adenoasociado (AAV) o cualquier combinación de los mismos. En determinados modos de realización, el vector vírico comprende una secuencia aislada o derivada de un retrovirus. En determinados modos de realización, el retrovirus es un gammarretrovirus. En determinados modos de realización, el retrovirus es un lentivirus. En determinados modos de realización, los vectores víricos pueden ser vectores recombinantes.

[0109] Los vectores víricos pueden comprender una secuencia aislada o derivada de un virus adenoasociado. En determinados modos de realización, el AAV comprende un AAV de un serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 o AAV11. En determinados modos de realización, el AAV comprende una secuencia de uno o más de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 o AAV11. En determinados modos de realización, el AAV comprende una secuencia aislada, derivada o recombinada de uno o más de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 o AAV11. En determinados modos de realización, el AAV comprende una secuencia aislada, derivada o recombinada de AAV2. En determinados modos de realización, incluyendo aquellos en los que el vector atraviesa la barrera hematoencefálica (BHE), el AAV comprende una secuencia aislada, derivada o recombinada de AAV9. Los virus adenoasociados y virus adenoasociados recombinantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, AAV autocomplementario (scAAV) e híbridos de AAV que contienen el genoma de un serotipo y la cápside de otro serotipo (por ejemplo, AAV2/5, AAV-DJ y AAV-DJ8). Los virus adenoasociados y virus adenoasociados recombinantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, rAAV-LK03, rAAV-NP59 y rAAV-NP84. En determinados modos de realización, el AAV comprende una secuencia aislada o derivada de rAAV-LK03, rAAV-NP59 o rAAV-NP84. En determinados modos de realización, los vectores víricos pueden ser vectores recombinantes.

[0111] En determinados modos de realización, el vector es un vector de nanopartículas.

[0113] Los vectores de nanopartículas pueden comprender un ácido nucleico, un aminoácido, un polímero, una micela, lípido, una molécula orgánica, una molécula inorgánica o cualquier combinación de los mismos. Las nanopartículas pueden estar compuestas por polímeros divulgados, por ejemplo, en la publicación de patente internacional n.° WO 2012/094679, publicación de patente internacional n.° WO 2016/022805, publicación de patente internacional n.° WO/2011/133635, publicación de patente internacional n.° WO/2016/090111, publicación de patente internacional n.° WO/2017/004498, documento WO/2017/004509, solicitud de patente internacional n.° PCT/US2017/030271, patente de EE. UU. n.° 6.835.394, patente de EE. UU. n.° 7.217.427 y patente de EE. UU. n.° 7.867.512.

[0115] Los vectores de nanopartículas pueden comprender además al menos un péptido autoescindible. En determinados modos de realización, un vector de nanopartículas puede comprender al menos un péptido autoescindible y en los que un péptido de autoescisión se localiza entre el polipéptido proapoptótico inducible, polipéptido de caspasa inducible, polipéptido de caspasa 9 inducible y/o polipéptido de caspasa 9 truncado inducible y otra secuencia enlazada a la nanopartícula. En determinados modos de realización, un vector de nanopartículas puede comprender al menos un péptido autoescindible y en los que un péptido autoescindible se localiza en dirección 5' del polipéptido proapoptótico inducible, polipéptido de caspasa inducible, polipéptido de caspasa 9 inducible y/o polipéptido de caspasa 9 truncado inducible y un segundo péptido autoescindible se localiza en dirección 3' del polipéptido proapoptótico inducible, polipéptido de caspasa inducible, polipéptido de caspasa 9 inducible y/o polipéptido de caspasa 9 truncado inducible de la divulgación. El al menos un péptido autoescindible puede comprender un péptido T2A, péptido GSG-T2A, un péptido E2A, un péptido GSG-E2A, un péptido F2A, un péptido GSG-F2A, un péptido P2A o un péptido GSG-P2A. En determinados modos de realización, el péptido T2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende EGRGSLLTCGD VEENPGP (SEQ ID NO: 11). En determinados modos de realización, el péptido GSG-T2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 12). En determinados modos de realización, el péptido E2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 13). En determinados modos de realización, el péptido GSG-E2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 14). En determinados modos de realización, el péptido F2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 15). En determinados modos de realización, el péptido GSG-F2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 16). En determinados modos de realización, el péptido P2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 17). En determinados modos de realización, el péptido GSG-P2A comprende una secuencia de aminoácidos que comprende GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 18).

[0117] La invención proporciona una composición que comprende un vector de la invención. En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulga una composición que comprende un vector de la divulgación.

[0119] La invención proporciona una célula que comprende el polinucleótido de caspasa inducible de la invención. En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulga una célula que comprende un polipéptido proapoptótico inducible, un polipéptido de caspasa inducible, un polipéptido de caspasa 9 inducible y/o un polipéptido de caspasa 9 truncado inducible de la divulgación. La invención proporciona una célula que comprende el transposón de la invención. En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulga una célula que comprende un transposón de la divulgación. La invención proporciona una célula que comprende el vector de la invención. En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulga una célula que comprende un vector de la divulgación. En determinados modos de realización, la célula expresa la proteína caspasa inducible tras el contacto con un agente de inducción.

[0121] En determinados modos de realización, las células que comprenden un polipéptido, transposón o vector de la invención o divulgación pueden ser células humanas.

[0123] En determinados modos de realización, las células pueden ser células inmunitarias. Los ejemplos de células inmunitarias incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales (NK), células de tipo linfocitos citolíticos naturales (NK), células progenitoras hematopoyéticas, linfocitos T derivados de sangre periférica (PB) y linfocitos T derivados de sangre del cordón umbilical (UCB). En determinados modos de realización, las células pueden ser linfocitos T. En determinados modos de realización, las células pueden ser linfocitos T activados. En determinados modos de realización, las células pueden ser linfocitos T activados que expresan una secuencia iC9 de la divulgación. En determinados modos de realización, las células pueden ser células presentadoras de antígenos (APC) artificiales. Las células inmunitarias pueden incluir además cualquier línea celular comercialmente disponible o línea celular modificada, incluyendo, pero sin limitarse a, líneas celulares de células dendríticas, linfocitos B, macrófagos y monocitos.

[0125] En determinados modos de realización, las células pueden ser células inmunitarias. Los ejemplos de células inmunitarias incluyen, pero no se limitan a, linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales (NK), células de tipo linfocitos citolíticos naturales (NK), células progenitoras hematopoyéticas, linfocitos T derivados de sangre periférica (PB) y linfocitos T derivados de sangre del cordón umbilical (UCB). En determinados modos de realización, las células pueden ser linfocitos T. En determinados modos de realización, la célula es una célula presentadora de antígeno artificial.

[0127] En determinados modos de realización, las células pueden ser células madre. Las células madre pueden ser células madre humanas. Las células madre pueden ser células madre embrionarias (obtenidas sin implicar la destrucción de embriones humanos) o adultas. Las células madre pueden ser totipotentes (no humanas), pluripotentes o multipotentes. En determinados modos de realización, las células madre pueden ser una célula madre pluripotente inducida (iPSC).

[0129] En determinados modos de realización, las células pueden ser células somáticas. Las células somáticas se pueden aislar o derivar de cualquier parte de un cuerpo y, preferentemente, un cuerpo humano, incluyendo, pero sin limitarse a, un corazón humano; músculo esquelético o liso; vaso sanguíneo, vena o capilar; bazo; tiroides; ganglio linfático o vaso linfático; hueso o médula ósea; piel o endotelio; glándula suprarrenal; esófago; laringe; cerebro o médula espinal; sistema nervioso periférico; ojo; hipotálamo; hígado; tejido olfativo; próstata; estómago; intestino grueso o delgado; pulmón o bronquios; riñón; páncreas; glándula del timo; uréter o uretra; vejiga; tejido auditivo; vejiga; glándula paratiroidea; glándula salival; o tráquea. Las células somáticas se pueden aislar o derivar de un precursor o célula madre que se puede diferenciar en cualquier parte de un cuerpo y, preferentemente, un cuerpo humano, incluyendo, pero sin limitarse a, un corazón humano; músculo esquelético o liso; vaso sanguíneo, vena o capilar; bazo; tiroides; ganglio linfático o vaso linfático; hueso o médula ósea; piel o endotelio; glándula suprarrenal; esófago; laringe; cerebro o médula espinal; sistema nervioso periférico; ojo; hipotálamo; hígado; tejido olfativo; próstata; estómago; intestino grueso o delgado; pulmón o bronquios; riñón; páncreas; glándula del timo; uréter o uretra; vejiga; tejido auditivo; vejiga; glándula paratiroidea; glándula salival; o tráquea. Las células somáticas se pueden aislar o derivar de células transdiferenciadas.

[0131] La invención proporciona una composición que comprende una célula de la invención que comprende el polipéptido, transposón o vector de la invención. En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulga una composición que comprende una célula de la divulgación que comprende un polipéptido, transposón o vector de la divulgación.

[0133] La invención proporciona la composición de la invención para su uso en un tratamiento celular adoptivo. En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulgan las composiciones de la divulgación para su uso en un tratamiento celular adoptivo. En determinados modos de realización, las células de la composición pueden ser autólogas. En determinados modos de realización, las células de la composición pueden ser alogénicas.

[0135] La divulgación proporciona un uso de las composiciones de la divulgación, o la composición que comprende una célula de la divulgación, para un tratamiento génicoex vivo.En determinados modos de realización, las células de la composición pueden ser autólogas. En determinados modos de realización, las células de la composición pueden ser alogénicas.

[0137] La invención proporciona la composición de la invención para su uso en un procedimiento de modificación de un tratamiento celular, como se enumera en las reivindicaciones. En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulga un procedimiento de modificación de un tratamiento celular en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una célula que comprende un agente terapéutico y un polipéptido de caspasa inducible / composición / transposón y una composición que comprende una transposasa / vector de la divulgación, en el que se puede inducir selectivamente la apoptosis en la célula poniendo en contacto la célula con un agente de inducción.

[0139] En determinados modos de realización de los procedimientos de modificación de un tratamiento celular, las células de la composición pueden ser autólogas. En determinados modos de realización, las células de la composición pueden ser alogénicas. En determinados modos de realización de este procedimiento, el tratamiento celular es un tratamiento celular adoptivo. En determinados modos de realización, el agente terapéutico se ha introducido mediante tratamiento génicoex vivo.En determinados modos de realización, el agente terapéutico es una secuencia que codifica un gen endógeno modificado, un gen exógeno o una porción de los mismos. En determinados modos de realización de este procedimiento, la modificación del tratamiento celular es una finalización del tratamiento celular. En determinados modos de realización de este procedimiento, la modificación del tratamiento celular es una disminución de una porción de las células proporcionadas en el tratamiento celular. Esta disminución puede ser transitoria o se puede mantener durante un periodo de tiempo, por ejemplo, durante un periodo de remisión de una enfermedad o trastorno. En determinados modos de realización, el procedimiento comprende además la etapa de administrar un inhibidor del agente de inducción para inhibir la modificación del tratamiento celular, restableciendo de este modo la función y/o eficacia del tratamiento celular. Por ejemplo, si una enfermedad o trastorno reaparece tras una remisión o la desaparición de reacción adversa de un sujeto, el tratamiento celular se puede reanudar administrando al sujeto un inhibidor del agente de inducción.

[0141] Se pueden usar procedimientos de modificación de un tratamiento celular para finalizar o moderar un tratamiento en respuesta a, por ejemplo, un signo de recuperación o un signo de disminución de la gravedad/progresión de la enfermedad, un signo de remisión/cese de la enfermedad y/o la aparición de un acontecimiento adverso. Los tratamientos celulares se pueden reanudar inhibiendo el agente de inducción si un signo o síntoma de la enfermedad reaparece o se incrementa su gravedad y/o se resuelve un acontecimiento adverso.

[0143] En determinados modos de realización, la composición que comprende una célula de la divulgación o la célula modificada se administra a un paciente por medio de inyección o infusión intravenosa. En determinados modos de realización, una dosis terapéuticamente eficaz de la composición o de composiciones que comprenden células modificadas comprende entre 2 x 105 y 5 x 108 células por kg de peso corporal del paciente por administración, o entre de 0,2 x 106 a 20 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, o cualquier intervalo, valor o fracción de los mismos. En determinados modos de realización, una dosis terapéuticamente eficaz comprende 0,2 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, 2 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, 20 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, o cualquier número intermedio de células por kg de peso corporal del paciente por administración. En determinados modos de realización, una dosis terapéuticamente eficaz comprende 1 x 106 células o aproximadamente 1 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración. En determinados modos de realización, una dosis terapéuticamente eficaz comprende 3 x 106 células o aproximadamente 3 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración. En determinados modos de realización, la dosis terapéuticamente eficaz comprende entre de 0,7 x 106 a 6,7 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, tal como 0,7 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, 6,7 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración o cualquier número intermedio de células por kg de peso corporal del paciente por administración. En determinados modos de realización, la dosis terapéuticamente eficaz comprende entre de 0,7 x 106 a 16 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, tal como 0,7 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, 2 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, 6 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, 10,7 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, 16 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración o cualquier número intermedio de células por kg de peso corporal del paciente por administración. En determinados modos de realización, una dosis terapéuticamente eficaz comprende de 1,2 x 106 a 7,1 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, tal como 1,2 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, 7,1 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración o cualquier número de células por kg de peso corporal del paciente por administración. En determinados modos de realización, la dosis terapéuticamente eficaz comprende entre de 2 x 106 a 3 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración. En determinados modos de realización, una dosis terapéuticamente eficaz comprende de 1 x 106 a 2 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, tal como 1 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, 2 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración o cualquier número intermedio de células por kg de peso corporal del paciente por administración. En determinados modos de realización, la dosis terapéuticamente eficaz comprende de 0,7 x 106 a 1,3 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, tal como 0,7 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración, 1,3 x 106 células por kg de peso corporal del paciente por administración o cualquier número intermedio de células por kg de peso corporal del paciente por administración.

[0145] En determinados modos de realización, la composición que comprende una célula o una célula modificada se administra a un paciente por medio de inyección o infusión intravenosa. En determinados modos de realización, una dosis terapéuticamente eficaz de la composición o de composiciones que comprenden células modificadas comprende una única dosis o múltiples dosis. En determinados modos de realización, una dosis terapéuticamente eficaz de una composición o de composiciones que comprenden células modificadas comprende una dosis fraccionada. En determinados modos de realización, una dosis terapéuticamente eficaz de una composición o de composiciones que comprenden células modificadas comprende una dosis inicial y una dosis de mantenimiento.

[0147] La invención proporciona una composición para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto que lo necesita, como se enumera en las reivindicaciones. En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulga un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto que lo necesita que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una célula que comprende un agente cinético y un polipéptido de caspasa inducible / composición / transposón y una composición que comprende una transposasa / vector de la divulgación, en el que se puede inducir selectivamente la apoptosis en la célula poniendo en contacto la célula con un agente de inducción, y en el que la célula que comprende el agente cinético induce toxicidad tisular local dentro de un tejido diana del sujeto, e induciendo selectivamente la apoptosis en la célula que comprende el agente cinético antes de la inducción de toxicidad en un tejido no diana del sujeto, de este modo eliminando el tejido diana, conservando el tejido no diana y tratando la enfermedad o trastorno en el sujeto.

[0149] Como se usa en el presente documento, un agente cinético pretende describir un agente terapéutico que tiene especificidad por un tejido diana y toxicidad conocida/intencional o bien desconocida/no intencional hacia el tejido no diana que, en cualquier caso, se puede controlar o limitar de modo que la toxicidad no afecte significativamente a los tejidos no diana. Los agentes cinéticos se dirigen específicamente a un tejido, inducen toxicidad específica y localmente, pero, antes de que un agente cinético pueda inducir toxicidad o daño significativo en un tejido no diana, se puede administrar un agente de inducción para reducir o evitar la toxicidad en el tejido no diana. El grado en que cualquier toxicidad afecta a tejidos fuera de la diana(off-target)(por ejemplo, daño a tejidos no diana) se puede limitar mediante la administración del agente de inducción y puede corresponder a una duración de la exposición del tejido no diana al agente cinético. En determinados modos de realización de la divulgación, las células que comprenden un agente terapéutico pueden reaccionar tanto con células específicas en el tumor (on-target on-tumor)como con células específicas fuera del tumor (on-target offtumor)al mismo tiempo y en múltiples tejidos diferentes. Las células específicas fuera del tumor se conservan a través de la activación de los polipéptidos de caspasa inducibles en las células que comprenden un agente terapéutico para eliminar las células que comprenden los polipéptidos de caspasa inducibles de la divulgación, por ejemplo, después de que se elimine el tumor. En determinados modos de realización, los efectos inespecíficos fuera del tumor(off-target off-tumor)se pueden deber a la reactividad cruzada del agente cinético. En determinados modos de realización, si los efectos inespecíficos son demasiado grandes, la toxicidad del agente cinético se puede limitar o eliminar mediante la administración de un agente de inducción antes de que se complete el tratamiento de una enfermedad del sujeto.

[0150] El término "toxicidad significativa en un tejido no diana" puede describir un nivel de toxicidad en el que las células del tejido están muertas (por ejemplo, han muerto como resultado de necrosis o apoptosis), se han vuelto de otro modo no viables o han dejado de realizar una o más funciones fisiológicas esenciales. En determinados modos de realización, una toxicidad significativa indica daño permanente a una célula o un tejido. En determinados modos de realización, una toxicidad significativa indica una pérdida transitoria de una función de una célula o un tejido. En determinados modos de realización, una toxicidad significativa induce síntomas en un sujeto que son reconocibles como tales por un experto en la técnica. En determinados modos de realización, una toxicidad significativa da lugar a muerte, a una esperanza de vida reducida o a una calidad de vida reducida de un sujeto. En determinados modos de realización de los procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno de la divulgación, la enfermedad o trastorno es un trastorno proliferativo o cáncer. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende un tumor. En determinados modos de realización, el tumor es benigno. En determinados modos de realización, el tumor es maligno. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende un tejido expuesto o margen de un tumor resecado. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende un sitio de probable metástasis. En determinados modos de realización, el sitio de metástasis comprende uno o más de un ganglio linfático, líquido linfático, sangre circulante periférica, sangre circulante local, un hueso, una médula ósea y líquido cefalorraquídeo (LCR).

[0151] En determinados modos de realización de los procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno de la divulgación, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno inflamatorio. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende un sitio de inflamación.

[0152] En determinados modos de realización de los procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno de la divulgación, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno inmunitario o autoinmunitario. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende un sitio de tejido expuesto o infectado. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende un tejido quemado o uno herido.

[0153] En determinados modos de realización de los procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno de la divulgación, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno infeccioso. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende un tejido infectado.

[0154] En determinados modos de realización de los procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno de la divulgación, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno genético o epigenético. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende una o más células que comprenden la modificación genética o epigenética en comparación con una célula natural.

[0155] En determinados modos de realización de los procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno de la divulgación, la enfermedad o trastorno es un trastorno metabólico. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende una o más células con el trastorno metabólico.

[0156] En determinados modos de realización de los procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno de la divulgación, la enfermedad o trastorno es un trastorno vascular. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende una o más células de una vena, vaso sanguíneo, capilar o un componente de sangre circulante.

[0157] En determinados modos de realización de los procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno de la divulgación, la enfermedad o trastorno es un trastorno respiratorio. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende una o más células de una fosa nasal, esófago o pulmón.

[0158] En determinados modos de realización de los procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno de la divulgación, la enfermedad o trastorno es un trastorno fibrótico. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende un fibroma o una célula en proximidad del fibroma.

[0159] En determinados modos de realización de los procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno de la divulgación, un tratamiento celular adoptivo comprende la célula que comprende el agente cinético. En determinados modos de realización, la célula que comprende el agente cinético es autóloga. En determinados modos de realización, la célula que comprende el agente cinético es alogénica. En determinados modos de realización, la célula que comprende el agente cinético es un linfocito T En determinados modos de realización, el agente cinético es un receptor no natural. En determinados modos de realización, el receptor no natural es un receptor sintético, modificado, recombinante o quimérico. En determinados modos de realización, el receptor quimérico es un receptor quimérico de antígeno (CAR).

[0161] En determinados modos de realización de los procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno de la divulgación, la enfermedad o trastorno es un trastorno proliferativo o un cáncer. En determinados modos de realización, el tejido diana comprende un tumor. En determinados modos de realización, el tratamiento del tumor comprende una composición que comprende una célula que comprende un polipéptido de caspasa inducible de la divulgación. En determinados modos de realización, la composición que comprende una célula que comprende un polipéptido de caspasa inducible comprende además un receptor quimérico de antígeno (CAR). En determinados modos de realización, el receptor quimérico de antígeno (CAR) se une específicamente a una secuencia expresada en una célula de un tumor, confiriendo de este modo especificidad del CAR por la célula tumoral. En determinados modos de realización, la célula que expresa el CAR que se une específicamente a una célula tumoral es un linfocito T, produciendo de este modo un T-CAR que se une específicamente a una célula tumoral. En determinados modos de realización, las composiciones que comprenden linfocitos T-CAR que se dirigen específicamente a células tumorales destruirán selectivamente solo aquellas células tumorales que expresen la secuencia de antígeno. Sin embargo, en determinados modos de realización, el antígeno tumoral se puede expresar en otros tejidos normales, dando lugar a la actividad específica fuera del tumor de los linfocitos T-CAR en tejidos no diana. Por ejemplo, el antígeno puede ser CD19 y CD19 se expresa casi exclusivamente en linfocitos B. En el caso de CD19, la actividad inespecífica de los linfocitos T-CAR anti-CD19 es mínima. Sin embargo, si, por ejemplo, el antígeno es PSMA (folato hidrolasa 1) y PSMA se expresa en varios tipos de células normales, los linfocitos T-CAR anti-PSMA se pueden dirigir a células normales además de a las células diana patógenas en una actividad llamada toxicidad específica fuera del tumor. En determinados modos de realización, una vez que las células diana patógenas (por ejemplo, las células tumorales) son erradicadas por los linfocitos T-CAR anti-PSMA, el tratamiento del sujeto con el agente de inducción para inducir la muerte celular programada en los linfocitos T-CAR anti-PSMA usando los polipéptidos de caspasa inducibles elimina los efectos específicos fuera del tumor.

[0163] En determinados procedimientos de la divulgación, incluyendo aquellos en los que un tratamiento celular adoptivo comprende la célula que comprende el agente cinético, el agente cinético comprende un agente antineoplásico. En determinados modos de realización, el agente antineoplásico comprende un agente anti-CD19. En determinados modos de realización, el agente antineoplásico comprende un agente anti-BCMA. En determinados modos de realización, el agente antineoplásico comprende un agente anti-PSMA. En determinados modos de realización, el agente antineoplásico comprende un agente anti-Muc1. En determinados modos de realización, el agente cinético comprende un receptor no natural. En determinados modos de realización, el receptor no natural comprende un receptor sintético, modificado, recombinante o quimérico. En determinados modos de realización, el receptor quimérico es un receptor quimérico de antígeno (CAR). En determinados modos de realización, el CAR comprende una o más secuencias de VHH. En determinados modos de realización, el CAR es un VCAR. En determinados modos de realización, el agente cinético induce una aplasia. En determinados modos de realización, la aplasia no es mortal. En determinados modos de realización, el agente de inducción elimina la célula que comprende el agente cinético. En determinados modos de realización, la célula es un linfocito T En determinados modos de realización, el agente de inducción elimina o reduce un signo o un síntoma de la aplasia. En determinados modos de realización, el tratamiento con T-CAR elimina la neoplasia maligna, pero continúa dirigiéndose a linfocitos B sanos de modo que el sujeto debe recibir tratamiento con infusiones de IGIV. En determinados modos de realización, el tratamiento con T-CAR anti-BCMA elimina las células plasmáticas no mutadas propias del sujeto, de modo que el sujeto también debe recibir tratamiento con IGIV. En determinados modos de realización, el T-CAR que provoca la aplasia se puede eliminar a través de los polipéptidos de caspasa 9 y el agente de inducción. En determinados modos de realización, el tratamiento del sujeto con el agente de inducción alivia un signo o un síntoma de la aplasia.

[0165] Breve descripción de los dibujos

[0167] La figura 1 es un diagrama esquemático que representa un polipéptido de caspasa 9 truncado inducible ejemplar de la divulgación.

[0169] La figura 2 es una serie de gráficos de citometría de flujo que representan la abundancia de células que se mueven desde un área de células vivas (el cuadrante inferior derecho seleccionado) a un área poblada por células apoptóticas (el cuadrante superior izquierdo) en función del incremento de la dosificación del agente de inducción (AP1903, también llamado rimiducid) en células modificadas para expresar un agente terapéutico (una CARTirina) solo o en combinación con un polipéptido de caspasa inducible de la divulgación (codificado por una construcción iC9 (también conocido como "interruptor de seguridad") introducida en las células por una transposasa piggyBac (PB)) el día 12 después de la nucleofección.

[0171] La figura 3 es una serie de gráficos de citometría de flujo que representan la abundancia de células que se mueven desde un área de células vivas (el cuadrante inferior derecho seleccionado) a un área poblada por células apoptóticas (el cuadrante superior izquierdo) en función del incremento de la dosificación del agente de inducción (AP1903, también llamado rimiducid) en células modificadas para expresar un agente terapéutico (una CARTirina) solo o en combinación con un polipéptido de caspasa inducible de la divulgación (codificado por una construcción iC9 (también conocido como "interruptor de seguridad") introducida en las células por una transposasa piggyBac (PB)) el día 19 después de la nucleofección.

[0172] La figura 4 es un par de gráficos que representan una cuantificación de los resultados agregados mostrados en la figura 2 (gráfico izquierdo) o bien la figura 3 (gráfico derecho). Específicamente, estos gráficos muestran el impacto del interruptor de seguridad iC9 sobre el porcentaje de viabilidad celular en función de la concentración del agente de inducción (AP1903, también llamado rimiducid) del interruptor iC9 para cada tipo de célula modificada el día 12 (figura 2 y gráfico izquierdo) o bien el día 19 (figura 3 y gráfico derecho).

[0173] La figura 5 es un diagrama que muestra una línea de tiempo de estudio y un esquema para un estudioin vivo.A ratones NSG se les inyectaron i.v. células MM.1S/luciferasa+, se estadificaron el día 8, se les inyectaron linfocitos T el día 9 y recibieron tratamiento con AP1903 (rimiducid) el día 12 a las dosis indicadas. 24 horas después, se sacrificaron los ratones y se recogieron y tiñeron células sanguíneas, de bazo y de médula ósea para detectar la presencia de células huCD45+.

[0174] La figura 6 es un gráfico que demuestra la destrucción altamente eficaz de células que comprenden P-BCMA-101 usando rimiducid (AP1903)in vivo.La figura 6 muestra la presencia de células CARTirina+ en sangre, bazo y médula ósea tras el tratamiento con AP1903. Se analizaron las células sanguíneas, de bazo y de médula ósea por citometría de flujo para detectar la presencia de células huCD45+. La viabilidad relativa se determinó por: ((n.° de células huCD45/n.° de células msCD45) / (promedio de huCD45/msCD45 en el grupo sin tratamiento)) * 100 % por cada 1500 acontecimientos de microesferas para cada muestra. Cada punto de datos representa un ratón diferente. En el eje de abscisas se representa el porcentaje de viabilidad relativa de T-CAR de 0 a 175 en incrementos de 25. En el eje de ordenadas, de izquierda a derecha para cada panel, sangre, bazo y médula ósea tras el tratamiento con AP1903 (rimiducid). Incremento de AP1903 (rimiducid) por panel de izquierda a derecha en el siguiente orden: 0 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,5 mg. kg, 5 mg/kg y 5 mg/kg en ausencia del gen iC9.

[0175] Descripción detallada

[0176] La invención, como se define por las reivindicaciones, proporciona polipéptidos proapoptóticos inducibles, así como transposones, vectores y células que comprenden los polipéptidos proapoptóticos inducibles. Los polipéptidos proapoptóticos inducibles se pueden introducir en una célula de forma simultánea o secuencial con un agente terapéutico. Por ejemplo, los polipéptidos proapoptóticos inducibles se pueden introducir en una célula de forma simultánea o secuencial con una o más secuencias que codifican un receptor quimérico de antígeno para producir una célula modificada. Estas células modificadas se pueden usar en tratamientos basados en células. Para controlar la actividad de las células modificadas que comprenden el polipéptido proapoptótico inducible y, opcionalmente, un agente terapéutico, la célula y/o el polipéptido proapoptótico inducible se pueden poner en contacto con un agente de inducción que se une específicamente a la región de unión a ligando del polipéptido proapoptótico inducible y, en última instancia, provoca el inicio de la apoptosis en la célula que comprende el polipéptido proapoptótico inducible. Cuando se usa una célula modificada como tratamiento celular, el agente de inducción se puede administrar local o sistémicamente al sujeto que recibió el tratamiento celular. Se puede administrar un inhibidor del agente de inducción local o sistémicamente al sujeto que recibió el tratamiento celular y el agente de inducción.

[0177] Como se usa en el presente documento, el término "agente terapéutico" se puede referir a cualquier molécula, orgánica o inorgánica que, cuando se introduce en una célula destinada al tratamiento celular, modifica una actividad, una vía de señalización, un resultado de señalización y/o una interacción de esa célula con el entorno interno o externo de la célula, incluyendo, pero sin limitarse a, células vecinas, ligandos extracelulares y moléculas de señalización, sistema inmunitario del huésped de la célula o de un componente del mismo, infección del huésped, una célula enferma (por ejemplo, una célula cancerosa) del huésped, ligandos intracelulares y moléculas de señalización, regulación epigenética, transcripción génica, regulación génica, transcriptoma, traducción de ADN/ARN, procesos de secreción o procesamiento de proteínas, y proteoma. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, receptores de superficie celular recombinantes y/o quiméricos, receptores transmembranarios recombinantes y/o quiméricos, canales iónicos recombinantes y/o quiméricos, y receptores de antígeno recombinantes y/o quiméricos. En determinados modos de realización, el agente terapéutico es un receptor quimérico de antígeno (CAR) y, opcionalmente, un receptor quimérico de antígeno en el que la región de reconocimiento de antígeno comprende al menos una centirina. Como se usa a lo largo de la divulgación, un CAR que comprende una centirina se denomina CARTirina.

[0178] Los polipéptidos proapoptóticos inducibles descritos en el presente documento comprenden una región de unión a ligando, un conector y un péptido proapoptótico, en el que el polipéptido proapoptótico inducible no comprende una secuencia no humana. En determinados modos de realización, la secuencia no humana comprende un sitio de restricción. Los polipéptidos proapoptóticos inducibles dimerizan a través de la interacción con un agente de inducción. La dimerización de un primer polipéptido proapoptótico inducible y un segundo polipéptido proapoptótico inducible facilita o activa una interacción, una reticulación, una activación cruzada o una activación de los polipéptidos de caspasa. La interacción, reticulación, activación cruzada o activación de los polipéptidos de caspasa inicia la apoptosis en una célula que comprende los polipéptidos proapoptóticos inducibles o una secuencia que codifica los polipéptidos proapoptóticos inducibles de la divulgación. Los polipéptidos proapoptóticos inducibles no inician la apoptosis a menos que y el polipéptido proapoptótico inducible se ponga en contacto con un agente de inducción. El contacto entre un agente de inducción y un polipéptido proapoptótico inducible se puede producirin vivo, ex vivooin vitro.El contacto entre un agente de inducción y un polipéptido proapoptótico inducible se puede producir intracelularmente. El polipéptido proapoptótico inducible de la invención es un polipéptido de caspasa inducible que comprende SEQ ID NO: 9.

[0180] Con respecto a los tratamientos celulares, en un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, la divulgación proporciona linfocitos T modificados para tratamientos celulares adoptivos que comprenden un polipéptido proapoptótico inducible o una secuencia que codifica un polipéptido proapoptótico inducible de la divulgación. Los linfocitos T de la invención comprenden el polipéptido de caspasa inducible de la invención que comprende SEQ ID NO: 9, o el polinucleótido de la invención que comprende SEQ ID NO: 10, que codifica el polinucleótido de caspasa inducible.

[0182] Los linfocitos T modificados para tratamientos celulares adoptivos pueden ser autólogos o alogénicos. El término "alogénico", como se usa en el presente documento, se refiere a locus de HLAo MHC que son antigénicamente distintos. Las células o tejidos transferidos de la misma especie pueden ser antigénicamente distintos. Los ratones singénicos pueden diferir en uno o más locus (congénicos) y los ratones alogénicos pueden tener la misma ascendencia.

[0184] Los linfocitos T modificados para tratamientos celulares adoptivos pueden incluir linfocitos T activados. Los linfocitos T pertenecen a un grupo de glóbulos blancos denominados linfocitos. En general, los linfocitos están implicados en la inmunidad celular. La "T" en "linfocitos T" se refiere a células derivadas de o con una maduración que está influenciada por el timo. Los linfocitos T se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos tales como linfocitos B y linfocitos citolíticos naturales (NK) por la presencia de proteínas de superficie celular conocidas como receptores de linfocitos T. El término "linfocitos T activados", como se usa en el presente documento, se refiere a linfocitos T que se han estimulado para producir una respuesta inmunitaria (por ejemplo, expansión clonal de linfocitos T activados) mediante el reconocimiento de un determinante antigénico presentado en el contexto de un marcador de histocompatibilidad principal (MHC) de clase II. Los linfocitos T se activan por la presencia de un determinante antigénico, citocinas y/o linfocinas y una agrupación de proteínas de superficie celular de diferenciación (por ejemplo, CD3, CD4, CD8, similares y combinaciones de las mismas). A menudo se dice que las células que expresan una agrupación de proteínas diferenciales son "positivas" para la expresión de esa proteína en la superficie de los linfocitos T (por ejemplo, las células positivas para expresión de CD3 o CD4 se denominan CD3+ o CD4+). Las proteínas CD3 y CD4 son receptores o correceptores de superficie celular que pueden estar implicados directa y/o indirectamente en la transducción de señales en linfocitos T.

[0186] Los linfocitos T modificados para tratamientos celulares adoptivos pueden incluir "pan-linfocitos T". Como se usa en el presente documento, pan-linfocitos T incluyen todos los linfocitos T aislados de una muestra biológica, sin clasificación por subtipo, estado de activación, estado de maduración o expresión de marcador de superficie celular.

[0188] Los linfocitos T modificados para tratamientos celulares adoptivos se pueden obtener y/o preparar a partir de, por ejemplo, sangre completa, sangre periférica, sangre del cordón umbilical, líquido linfático, tejido de ganglios linfáticos, médula ósea y líquido cefalorraquídeo (LCR). Por "obtener o preparar" como, por ejemplo, en el caso de células, se entiende que las células o el cultivo celular se aíslan, purifican o purifican parcialmente de la fuente, donde la fuente puede ser, por ejemplo, sangre de cordón umbilical, médula ósea o sangre periférica. Los términos también se pueden aplicar al caso donde se ha cultivado la fuente original, o un cultivo celular, y se han replicado las células, y donde las células descendientes se derivan ahora de la fuente original. El término "sangre periférica", como se usa en el presente documento, se refiere a componentes celulares de la sangre (por ejemplo, glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas) que se obtienen o preparan a partir de la sangre circulante y no secuestrada dentro del sistema linfático, bazo, hígado o médula ósea. La sangre del cordón umbilical es distinta de la sangre periférica y de la sangre secuestrada dentro del sistema linfático, bazo, hígado o médula ósea. Los términos "sangre del cordón umbilical", "sangre umbilical" o "sangre del cordón", que se pueden usar de manera intercambiable, se refieren a la sangre que permanece en la placenta y en el cordón umbilical adjunto después del parto. La sangre del cordón a menudo contiene células madre, incluyendo células hematopoyéticas.

[0189] En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, la divulgación proporciona polipéptidos proapoptóticos inducibles que comprenden una región de unión a ligando, un conector y un péptido proapoptótico, en el que el polipéptido proapoptótico inducible no comprende una secuencia no humana. En determinados casos, la secuencia no humana comprende un sitio de restricción. En determinados casos, el péptido proapoptótico es un polipéptido de caspasa. En determinados casos, el polipéptido de caspasa es un polipéptido de caspasa 9. En determinados casos, el polipéptido de caspasa 9 es un polipéptido de caspasa 9 truncado. Los polipéptidos proapoptóticos inducibles de la divulgación pueden ser no naturales.

[0191] Los polipéptidos de caspasa de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, caspasa 1, caspasa 2, caspasa 3, caspasa 4, caspasa 5, caspasa 6, caspasa 7, caspasa 8, caspasa 9, caspasa 10, caspasa 11, caspasa 12 y caspasa 14. Los polipéptidos de caspasa de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, aquellos polipéptidos de caspasa asociados con la apoptosis, incluyendo caspasa 2, caspasa 3, caspasa 6, caspasa 7, caspasa 8, caspasa 9 y caspasa 10. Los polipéptidos de caspasa de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, aquellos polipéptidos de caspasa que inician la apoptosis, incluyendo caspasa 2, caspasa 8, caspasa 9 y caspasa 10. Los polipéptidos de caspasa de la divulgación incluyen, pero no se limitan a, aquellos polipéptidos de caspasa que ejecutan la apoptosis, incluyendo caspasa 3, caspasa 6 y caspasa 7.

[0193] Los polipéptidos de caspasa ilustrativos de la divulgación se pueden codificar por una secuencia de aminoácidos o una de ácido nucleico que tiene una o más modificaciones en comparación con una secuencia de aminoácidos o una de ácido nucleico natural. La secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de caspasa de la divulgación puede tener codones optimizados. La una o más modificaciones en una secuencia de aminoácidos y/o de ácido nucleico de un polipéptido de caspasa de la divulgación pueden incrementar una interacción, una reticulación, una activación cruzada o una activación del polipéptido de caspasa de la divulgación en comparación con una secuencia de aminoácidos o una de ácido nucleico natural. De forma alternativa, o además, la una o más modificaciones en una secuencia de aminoácidos y/o de ácido nucleico de un polipéptido de caspasa de la divulgación pueden disminuir la inmunogenicidad del polipéptido de caspasa de la divulgación en comparación con una secuencia de aminoácidos o una de ácido nucleico natural.

[0195] Los polipéptidos de caspasa de la divulgación se pueden truncar en comparación con un polipéptido de caspasa natural. Por ejemplo, un polipéptido de caspasa se puede truncar para eliminar una secuencia que codifica un dominio de activación y reclutamiento de caspasa (CARD) para eliminar o minimizar la posibilidad de activar una respuesta inflamatoria local además de iniciar la apoptosis en la célula que comprende un polipéptido de caspasa inducible de la divulgación. La secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de caspasa de la divulgación se puede empalmar para formar una secuencia de aminoácidos variante del polipéptido de caspasa de la divulgación en comparación con un polipéptido de caspasa natural. Los polipéptidos de caspasa de la divulgación se pueden codificar por secuencias recombinantes y/o quiméricas. Los polipéptidos de caspasa recombinantes y/o quiméricos de la divulgación pueden incluir secuencias de uno o más polipéptidos de caspasa diferentes. De forma alternativa, o además, los polipéptidos de caspasa recombinantes y/o quiméricos de la divulgación pueden incluir secuencias de una o más especies (por ejemplo, una secuencia humana y una secuencia no humana). Los polipéptidos de caspasa de la divulgación pueden ser no naturales.

[0197] En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, la región de unión a ligando de un polipéptido proapoptótico inducible de la divulgación puede incluir cualquier secuencia polipeptídica que facilite o promueva la dimerización de un primer polipéptido proapoptótico inducible de la divulgación con un segundo polipéptido proapoptótico inducible de la divulgación, del que la dimerización activa o induce la reticulación de los polipéptidos proapoptóticos y el inicio de la apoptosis en la célula.

[0199] La región ("de dimerización") de unión a ligando puede comprender cualquier polipéptido o dominio funcional del mismo que permita la inducción usando un ligando natural o no natural (es decir, un agente de inducción), por ejemplo, un ligando sintético no natural. La región de unión a ligando puede ser interna o externa a la membrana celular, dependiendo de la naturaleza del polipéptido proapoptótico inducible y de la elección del ligando (es decir, agente de inducción). Son conocidos una amplia variedad de polipéptidos de unión a ligando y dominios funcionales de los mismos, incluyendo receptores. Las regiones de unión a ligando de la divulgación pueden incluir una o más secuencias de un receptor. De particular interés son las regiones de unión a ligando para las que son conocidos o se pueden producir fácilmente ligandos (por ejemplo, ligandos orgánicos pequeños). Estas regiones de unión a ligando o receptores pueden incluir, pero no se limitan a, las FKBP y receptores de ciclofilina, los receptores de esteroides, el receptor de tetraciclina y similares, así como receptores "no naturales" que se pueden obtener de anticuerpos, en particular de la subunidad de cadena pesada o ligera, secuencias mutadas de los mismos, secuencias de aminoácidos aleatorias obtenidas mediante procedimientos estocásticos, síntesis combinatorias y similares. En determinados casos, la región de unión a ligando se selecciona del grupo que consiste en una región de unión a ligando de FKBP, una región de unión a ligando de receptor de ciclofilina, una región de unión a ligando de receptor de esteroides, una región de unión a ligando de receptores de ciclofilina y una región de unión a ligando de receptor de tetraciclina.

[0201] Las regiones de unión a ligando que comprenden uno o más dominios receptores pueden ser de al menos aproximadamente 50 aminoácidos y menos de aproximadamente 350 aminoácidos, normalmente, menos de 200 aminoácidos, como el dominio natural o bien de la porción activa truncada del mismo. La región de unión puede, por ejemplo, ser pequeña (<25 kDa, para permitir la transfección eficaz en vectores víricos), monomérica, no inmunogénica, tener ligandos no tóxicos, permeables a las células, accesibles sintéticamente que se pueden configurar para la dimerización.

[0203] Las regiones de unión a ligando que comprenden uno o más dominios receptores pueden ser intracelulares o extracelulares dependiendo del diseño del polipéptido proapoptótico inducible y de la disponibilidad de un ligando apropiado (es decir, agente de inducción). Para los ligandos hidrófobos, la región de unión puede estar en cualquier lado de la membrana, pero, para los ligandos hidrófilos, en particular los ligandos de proteínas, la región de unión será normalmente externa a la membrana celular, a menos que exista un sistema de transporte para internalizar el ligando en una forma en la que esté disponible para la unión. Para un receptor intracelular, el polipéptido proapoptótico inducible o un transposón o vector que comprende el polipéptido proapoptótico inducible puede codificar un péptido señalizador y un dominio transmembranario 5' o 3' de la secuencia de dominio receptor o puede tener una secuencia señal de unión lipídica 5' de la secuencia de dominio receptor. Cuando el dominio receptor está entre el péptido señal y el dominio transmembranario, el dominio receptor será extracelular.

[0205] Se pueden usar anticuerpos y subunidades de anticuerpos, por ejemplo, cadena pesada o ligera, en particular fragmentos, más en particular toda o parte de la región variable, o fusiones de la cadena pesada y ligera para crear una unión de alta afinidad, como una región de unión a ligando de la divulgación. Los anticuerpos que se contemplan incluyen los que son un producto humano expresado ectópicamente, tales como un dominio extracelular que no desencadenaría una respuesta inmunitaria y, en general, no se expresa en la periferia (es decir, fuera del área del SNC/cerebro). Dichos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR) y proteínas de superficie embrionarias (es decir, antígeno carcinoembrionario). Aún más, se pueden preparar anticuerpos contra moléculas hapténicas, que son fisiológicamente aceptables, y se pueden cribar las subunidades de anticuerpo individuales para determinar la afinidad de unión. Se puede aislar el ADNc que codifica las subunidades y modificar por deleción de la región constante, porciones de la región variable, mutagénesis de la región variable o similares, para obtener un dominio de proteína de unión que tenga la afinidad apropiada por el ligando. De esta manera, se puede emplear casi cualquier compuesto hapténico fisiológicamente aceptable como ligando o para proporcionar un epítopo para el ligando. En lugar de unidades de anticuerpo, se pueden emplear receptores naturales, donde es conocida la región o dominio de unión y existe un ligando útil o conocido para la unión.

[0207] Para multimerizar el receptor, el ligando para la región de unión a ligando/los dominios receptores de los polipéptidos proapoptóticos inducibles puede ser multimérico en el sentido de que el ligando puede tener al menos dos sitios de unión, pudiendo cada uno de los sitios de unión unirse a una región receptora de ligando (es decir, un ligando que tiene un primer sitio de unión que se puede unir a la región de unión a ligando de un primer polipéptido proapoptótico inducible y un segundo sitio de unión que se puede unir a la región de unión a ligando de un segundo polipéptido proapoptótico inducible, en el que las regiones de unión a ligando del primer y el segundo polipéptidos proapoptóticos inducibles son idénticas o distintas). Por tanto, como se usa en el presente documento, el término "región de unión a ligando multimérico" se refiere a una región de unión a ligando de un polipéptido proapoptótico inducible de la divulgación que se une a un ligando multimérico. Los ligandos multiméricos de la divulgación incluyen ligandos diméricos. Un ligando dimérico de la divulgación puede tener dos sitios de unión que se pueden unir al dominio receptor de ligando. En determinados modos de realización, los ligandos multiméricos de la divulgación son un dímero u oligómero de orden superior, normalmente no mayor de aproximadamente tetramérico, de moléculas orgánicas sintéticas pequeñas, siendo típicamente las moléculas individuales de al menos aproximadamente 150 Da y menos de aproximadamente 5 kDa, normalmente menos de aproximadamente 3 kDa. Se pueden emplear una variedad de pares de ligandos y receptores sintéticos. Por ejemplo, en modos de realización que implican receptores naturales, se puede usar FK506 dimérico con un receptor de FKBP12, se puede usar ciclosporina Adimerizada con el receptor de ciclofilina, estrógeno dimerizado con un receptor de estrógeno, glucocorticoides dimerizados con un receptor de glucocorticoides, tetraciclina dimerizada con el receptor de tetraciclina, vitamina D dimerizada con el receptor de vitamina D y similares. De forma alternativa, se pueden usar órdenes mayores de los ligandos, por ejemplo, triméricos. Para modos de realización que implican receptores no naturales, por ejemplo, se pueden usar subunidades de anticuerpos, subunidades de anticuerpos modificados, anticuerpos monocatenarios compuestos por regiones variables de la cadena pesada y ligera en tándem, separadas por un conector flexible, o receptores modificados, y secuencias mutadas de los mismos, y similares, cualquiera de una gran variedad de compuestos. Una característica significativa de las unidades que comprenden un ligando multimérico de la divulgación es que cada sitio de unión se puede unir al receptor con alta afinidad y, preferentemente, que se pueden dimerizar químicamente. Además, hay procedimientos disponibles para equilibrar la hidrofobia/hidrofilia de los ligandos de modo que se puedan disolver en suero a niveles funcionales, pero difundir a través de las membranas plasmáticas para la mayoría de las aplicaciones.

[0209] La activación de polipéptidos proapoptóticos inducibles de la divulgación se puede lograr a través de, por ejemplo, dimerización inducida químicamente (CID) mediada por un agente de inducción para producir una proteína o polipéptido controlado condicionalmente. Los polipéptidos proapoptóticos de la divulgación no solo son inducibles, sino que la inducción de estos polipéptidos también es reversible, debido a la degradación del agente dimerizante lábil o a la administración de un inhibidor competitivo monomérico.

[0211] En determinados modos de realización, la región de unión a ligando comprende un polipéptido de proteína 12 de unión a FK506 (FKBP12). En determinados modos de realización, la región de unión a ligando comprende un polipéptido de FKBP12 que tiene una sustitución de fenilalanina (F) por valina (V) en la posición 36 (F36V). En determinados modos de realización, en los que la región de unión a ligando comprende un polipéptido de FKBP12 que tiene una sustitución de fenilalanina (F) por valina (V) en la posición 36 (F36V), el agente de inducción puede comprender AP1903 (rimiducid), un fármaco sintético (nombre en el índice CAS: 1-[(2S)-1-oxo-2-(3,4,5-trimetoxifenil)butil]-, 1,2-etanodiilbis[imino(2-oxo-2,1-etanodiil)oxi-3,1-fenilen[(1R)-3-(3,4-dimetoxifenil)propiliden]]éster del ácido 2-piperidinocarboxílico, [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) Número de registro CAS: 195514-63-7; fórmula molecular: C78H98N4O20; peso molecular: 1411,65)). En determinados modos de realización, en los que la región de unión a ligando comprende un polipéptido de FKBP12 que tiene una sustitución de fenilalanina (F) por valina (V) en la posición 36 (F36V), el agente de inducción puede comprender AP20187 (número de registro CAS: 195514-80-8 y fórmula molecular: C82H107N5O20). En determinados modos de realización, el agente de inducción es un análogo de AP20187, tal como, por ejemplo, AP1510. Como se usa en el presente documento, los agentes de inducción AP20187, AP1903 (rimiducid) y AP1510 se pueden usar de manera intercambiable.

[0213] El IFA de AP1903 (rimiducid) se fabrica por Alphora Research Inc. y la especialidad farmacéutica inyectable de AP1903 (rimiducid) se prepara por Formatech Inc. Se formula como una solución de 5 mg/ml de AP1903 (rimiducid) en una solución al 25 % del solubilizante no iónico Solutol HS 15 (250 mg/ml, BASF). A temperatura ambiente, esta formulación es una solución transparente, ligeramente amarilla. Tras la refrigeración, esta formulación experimenta una transición de fase reversible, dando como resultado una solución lechosa. Esta transición de fase se invierte tras volver a atemperar a temperatura ambiente. El relleno es de 2,33 ml en un vial de vidrio de 3 ml (aproximadamente 10 mg de AP1903 (rimiducid) inyectable en total por vial). Tras determinar la necesidad de administrar AP1903 (rimiducid), a los pacientes se les puede administrar, por ejemplo, una dosis fija única de AP1903 (rimiducid) inyectable (0,4 mg/kg) por medio de infusión i.v. durante 2 horas, usando un equipo de infusión esterilizado sin óxido de etileno y sin DEHP. La dosis de AP1903 (rimiducid) se calcula individualmente para todos los pacientes y no se vuelve a calcular a menos que el peso corporal fluctúe en • 10 %. La dosis calculada se diluye a 100 ml en solución salina normal al 0,9 % antes de la infusión. En un estudio previo de fase I de AP1903 (rimiducid), 24 voluntarios sanos recibieron tratamiento con dosis únicas de AP1903 (rimiducid) inyectable a niveles de dosis de 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 y 1,0 mg/kg infundidos i.v. durante 2 horas. Los niveles plasmáticos de AP1903 (rimiducid) fueron directamente proporcionales a la dosis, con valores medios de Cmáx. que oscilaban de aproximadamente 10-1275 ng/ml en el intervalo de dosis de 0,01-1,0 mg/kg. Tras el periodo de infusión inicial, las concentraciones en sangre demostraron una fase de distribución rápida, con niveles plasmáticos reducidos a aproximadamente 18, 7 y 1 % de la concentración máxima 0,5, 2 y 10 horas después de la dosis, respectivamente. Se demostró que AP1903 (rimiducid) inyectable es seguro y se tolera bien en todos los niveles de dosis y demostró un perfil farmacocinético favorable. Iuliucci J D,et al.,J Clin Pharmacol.

[0214] 41: 870-9, 2001.

[0216] La dosis fija de AP1903 (rimiducid) inyectable usada, por ejemplo, puede ser de 0,4 mg/kg por infusión intravenosa durante 2 horas. La cantidad de AP1903 (rimiducid) necesariain vitropara la señalización eficaz de las células es de 10-100 nM (PM de 1600 Da). Esto equivale a 16-160 pg/l o ~0,016-1,6 pg/kg (1,6-160 pg/kg). Se toleraron bien dosis de hasta 1 mg/kg en el estudio de fase I de AP1903 (rimiducid) descrito anteriormente. Por lo tanto, 0,4 mg/kg puede ser una dosis segura y eficaz de AP1903 (rimiducid) para este estudio de fase I en combinación con las células terapéuticas.

[0218] La secuencia de aminoácidos y/o de ácido nucleico que codifica la unión a ligando de la divulgación puede contener una o más modificaciones de secuencia en comparación con una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico natural. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos y/o de ácido nucleico que codifica la región de unión a ligando de la divulgación puede ser una secuencia con codones optimizados. La una o más modificaciones pueden incrementar la afinidad de unión de un ligando (por ejemplo, un agente de inducción) por la región de unión a ligando de la divulgación en comparación con un polipéptido natural. De forma alternativa, o además, la una o más modificaciones pueden disminuir la inmunogenicidad de la región de unión a ligando de la divulgación en comparación con un polipéptido natural. Las regiones de unión a ligando de la divulgación y/o los agentes de inducción de la divulgación pueden ser no naturales.

[0220] Los polipéptidos proapoptóticos inducibles ilustrativos de la divulgación comprenden una región de unión a ligando, un conector y un péptido proapoptótico, en el que el polipéptido proapoptótico inducible no comprende una secuencia no humana. En determinados casos, la secuencia no humana comprende un sitio de restricción. El conector puede comprender cualquier material orgánico o inorgánico que permita, tras la dimerización de la región de unión a ligando, la interacción, reticulación, activación cruzada o activación de los polipéptidos proapoptóticos de modo que la interacción o activación de los polipéptidos proapoptóticos inicie la apoptosis en la célula. En determinados casos, el conector es un polipéptido. En determinados casos, el conector es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos rica en G/S (un conector "GS"). En el polipéptido proapoptótico inducible de la invención, el conector es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 5). El conector es un polipéptido y el ácido nucleico que codifica el polipéptido no contiene un sitio de restricción para una endonucleasa de restricción. Los conectores de la divulgación pueden ser no naturales.

[0221] Los polipéptidos proapoptóticos inducibles se pueden expresar en una célula bajo la regulación transcripcional de cualquier promotor que pueda iniciar y/o regular la expresión de un polipéptido proapoptótico inducible en esa célula. El término "promotor", como se usa en el presente documento, se refiere a un promotor que actúa como el sitio de unión inicial para que la ARN polimerasa transcriba un gen. Por ejemplo, los polipéptidos proapoptóticos inducibles se pueden expresar en una célula de mamífero bajo la regulación transcripcional de cualquier promotor que pueda iniciar y/o regular la expresión de un polipéptido proapoptótico inducible en una célula de mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, promotores naturales, endógenos, exógenos y heterólogos. Las células de mamífero preferentes incluyen células humanas. Por tanto, los polipéptidos proapoptóticos inducibles de la divulgación se pueden expresar en una célula humana bajo la regulación transcripcional de cualquier promotor que pueda iniciar y/o regular la expresión de un polipéptido proapoptótico inducible en una célula humana, incluyendo, pero sin limitarse a, un promotor humano o un promotor vírico. Los promotores ejemplares para la expresión en células humanas incluyen, pero no se limitan a, un promotor génico temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) humano, un promotor temprano de SV40, una repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, promotor de *-actina, un promotor de insulina de rata y un promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, de los que cada uno se puede usar para obtener una expresión de alto nivel de un polipéptido proapoptótico inducible de la divulgación. Se contempla asimismo el uso de otros promotores en fagos víricos o celulares de mamífero o bacterianos que son bien conocidos en la técnica para lograr la expresión de un polipéptido proapoptótico inducible, siempre que los niveles de expresión sean suficientes para iniciar la apoptosis en una célula. Mediante el empleo de un promotor con propiedades bien conocidas, se puede optimizar el nivel y el patrón de expresión de la proteína de interés tras la transfección o transformación.

[0223] La selección de un promotor que se regula en respuesta a señales fisiológicas o sintéticas específicas puede permitir la expresión inducible del polipéptido proapoptótico inducible de la divulgación. El sistema de ecdisona (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) es uno de dichos sistemas. Este sistema está diseñado para permitir la expresión regulada de un gen de interés en células de mamífero. Consiste en un mecanismo de expresión estrechamente regulado que prácticamente no permite la expresión a nivel basal de un transgén, sino una inducibilidad de más de 200 veces. El sistema se basa en el receptor de ecdisona heterodimérico deDrosophilay, cuando la ecdisona o un análogo tal como muristerona A se une al receptor, el receptor activa un promotor para activar la expresión del transgén en dirección 3' se alcanzan altos niveles de transcritos de ARNm. En este sistema, ambos monómeros del receptor heterodimérico se expresan constitutivamente a partir de un vector, mientras que el promotor sensible a ecdisona, que dirige la expresión del gen de interés, está en otro plásmido. Por lo tanto, la genomanipulación de este tipo de sistema en un vector de interés puede ser útil. Otro sistema inducible que puede ser útil es el sistema Tet-Off™ o Tet-On™ (Clontech, Palo Alto, Calif.), desarrollado originalmente por Gossen y Bujard (Gossen y Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992; Gossenet al.,Science, 268:1766-1769, 1995). Este sistema también permite que se regulen altos niveles de expresión génica en respuesta a tetraciclina o derivados de tetraciclina tales como doxiciclina. En el sistema Tet-On™, la expresión génica se activa en presencia de doxiciclina, mientras que en el sistema Tet-Off™, la expresión génica se activa en ausencia de doxiciclina. Estos sistemas se basan en dos elementos reguladores derivados del operón de resistencia a la tetraciclina deE. coli:la secuencia de operador de tetraciclina (a la que se une el represor de tetraciclina) y la proteína represora de tetraciclina. El gen de interés se clona en un plásmido detrás de un promotor que tiene elementos sensibles a la tetraciclina presentes en él. Un segundo plásmido contiene un elemento regulador llamado transactivador controlado por tetraciclina, que se compone, en el sistema Tet-Off™, del dominio VP16 del virus del herpes simple y el represor de tetraciclina natural. Por tanto, en ausencia de doxiciclina, la transcripción está constitutivamente activada. En el sistema Tet-On™, el represor de tetraciclina no es natural y, en presencia de doxiciclina, activa la transcripción. Para la producción de vectores de tratamiento génico, se puede usar el sistema Tet-Off™ de modo que las células productoras se puedan cultivar en presencia de tetraciclina o doxiciclina y evitar la expresión de un transgén potencialmente tóxico, pero, cuando el vector se introduce en el paciente, la expresión génica estaría constitutivamente activada.

[0225] En algunas circunstancias, es deseable regular la expresión de un transgén en un vector de tratamiento génico. Por ejemplo, se utilizan diferentes promotores víricos con intensidades de actividad variables dependiendo del nivel de expresión deseado. En células de mamífero, se usa a menudo el promotor temprano inmediato de CMV para proporcionar una fuerte activación transcripcional. El promotor de c Mv se revisa en Donnelly, J. J.,et al.,1997. Annu. Rev. Immunol. 15:617-48. También se han usado versiones modificadas del promotor de CMV que son menos potentes cuando se desean niveles reducidos de expresión del transgén. Cuando se desea la expresión de un transgén en células hematopoyéticas, a menudo se usan promotores retrovíricos tales como las LTR de MLV o MMTV. Otros promotores víricos que se usan dependiendo del efecto deseado incluyen SV40, LTR de VSR, LTR de VIH-1 y V iH-2, promotores de adenovirus tales como de la región E1A, E2Ao m Lp, LTR de AAV, HSV-TK y virus del sarcoma aviar.

[0227] En otros ejemplos, se pueden seleccionar promotores que estén regulados por el desarrollo y sean activos en células diferenciadas particulares. Por tanto, por ejemplo, un promotor puede no estar activo en una célula madre pluripotente, pero, por ejemplo, cuando la célula madre pluripotente se diferencia en una célula más madura, a continuación, el promotor se puede activar.

[0228] De forma similar, se usan promotores específicos de tejido para efectuar la transcripción en tejidos o células específicos para reducir la toxicidad potencial o los efectos indeseables para los tejidos no diana. Estos promotores pueden dar como resultado una expresión reducida en comparación con un promotor más fuerte tal como el promotor de CMV, pero también pueden dar como resultado una expresión más limitada, e inmunogenicidad (Bojak, A.,et al.,2002. Vaccine. 20:1975-79; Cazeaux., N.,et al.,2002. Vaccine 20:3322-31). Por ejemplo, se pueden usar promotores específicos de tejido tales como el promotor asociado a PSA o calicreína glandular específica de próstata, o el gen de creatina cinasa muscular, cuando sea apropiado.

[0229] Los ejemplos de promotores específicos de tejido o específicos de diferenciación incluyen, pero no se limitan a, los siguientes:<b>29 (linfocitos B); CD14 (células monocíticas); CD43 (leucocitos y plaquetas); CD45 (células hematopoyéticas); CD68 (macrófagos); desmina (músculo); elastasa-1 (células acinares pancreáticas); endoglina (células endoteliales); fibronectina (células diferenciadoras, tejidos en cicatrización); y Flt-1 (células endoteliales); GFAP (astrocitos).

[0230] En determinadas indicaciones, es deseable activar la transcripción en momentos específicos después de la administración del vector de tratamiento génico. Esto se hace con dichos promotores como los que son regulables por hormonas o citocinas. Los promotores sensibles a citocinas y proteínas inflamatorias que se pueden usar incluyen cininógeno K y T (Kageyamaet al.,(1987) J. Biol. Chem., 262, 2345-2351), c-fos, TNF-alfa, proteína C-reactiva (Arcone,et al.,(1988) Nucl. Acids Res., 16(8), 3195-3207), haptoglobina (Olivieroet al.,(1987) EMBO J., 6, 1905-1912), amiloide sérico A2, C/EBP alfa, IL-1, IL-6 (Poli y Cortese, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86, 8202-8206), complemento C3 (Wilsonet al.,(1990) Mol. Cell. Biol., 6181-6191), IL-8, alfa-1 glucoproteína ácida (Prowse y Baumann, (1988) Mol Cell Biol, 8, 42-51), alfa-1 antitripsina, lipoproteína lipasa (Zechneret al.,Mol. Cell. Biol., 2394-2401, 1988), angiotensinógeno (Ron,et al.,(1991) Mol. Cell. Biol., 2887 2895), fibrinógeno, c-jun (inducible por ésteres de forbol, TNF-alfa, radiación UV, ácido retinoico y peróxido de hidrógeno), colagenasa (inducida por ésteres de forbol y ácido retinoico), metalotioneína (inducible por metales pesados y glucocorticoides), estromelisina (inducible por éster de forbol, interleucina-1 y EGF), alfa-2 macroglobulina y alfa-1 anti-quimotripsina. Otros promotores incluyen, por ejemplo, SV40, MMTV, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de Moloney, ALV, virus de Epstein-Barr, virus del sarcoma de Rous, actina humana, miosina, hemoglobina y creatina.

[0231] Se prevé que cualquiera de los promotores anteriores, solo o en combinación con otro, puede ser útil dependiendo de la acción deseada. Los promotores y otros elementos reguladores se seleccionan de modo que sean funcionales en las células o tejido deseados. Además, esta lista de promotores no se debe interpretar como exhaustiva o limitante; otros promotores que se usan junto con los promotores y procedimientos divulgados en el presente documento.

[0232] Moléculas de ácido nucleico

[0233] Las moléculas de ácido nucleico, incluyendo las secuencias que codifican un polipéptido inducible, pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, ARNnh, ARNt o cualquier otra forma, o en forma de ADN, incluyendo, pero sin limitarse a, ADNc y ADN genómico obtenido por clonación o producido sintéticamente, o cualquier combinación de los mismos. El ADN puede ser tricatenario, bicatenario o monocatenario, o cualquier combinación de los mismos. Cualquier porción de al menos una hebra del ADN o ARN puede ser la hebra codificante, también conocida como la hebra sentido, o puede ser la hebra no codificante, también denominada la hebra antisentido. Las moléculas de ácido nucleico aisladas pueden incluir moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto (ORF), opcionalmente, con uno o más intrones, por ejemplo, pero sin limitarse a, al menos una porción especificada de al menos una secuencia que codifica un polipéptido inducible de la divulgación; moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia codificante para un polipéptido inducible de la divulgación; y moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos sustancialmente diferente de las descritas anteriormente pero que, debido a la redundancia del código genético, todavía codifican un polipéptido inducible como se describe en el presente documento y/o como es conocido en la técnica. Por supuesto, el código genético es bien conocido en la técnica. Por tanto, sería rutinario para un experto en la técnica generar dichas variantes de ácido nucleico redundantes que codifican un polipéptido inducible de la divulgación. Véase, por ejemplo, Ausubel,et al., supra,y dichas variantes de ácido nucleico se incluyen en la divulgación.

[0234] Como se indica en el presente documento, las moléculas de ácido nucleico que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido inducible pueden incluir, pero no se limitan a, aquellas que codifican la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o fragmento inducible por sí mismas; la secuencia codificante para la totalidad de un polipéptido inducible o una porción del mismo; la secuencia codificante para un polipéptido inducible de la divulgación, fragmento o porción, así como secuencias adicionales, tales como la secuencia codificante de al menos un líder de señal o péptido de fusión, con o sin las secuencias codificantes adicionales mencionadas anteriormente, tales como al menos un intrón, conjuntamente con secuencias no codificantes adicionales, que incluyen, pero no se limitan a, secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas no traducidas que desempeñan un papel en la transcripción, procesamiento de ARNm, incluyendo señales de empalme y poliadenilación (por ejemplo, unión a ribosomas y estabilidad de ARNm); una secuencia codificante adicional que codifica aminoácidos adicionales, tales como aquellas que proporcionan funcionalidades adicionales. Por tanto, la secuencia que codifica un polipéptido inducible se puede fusionar a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del armazón proteínico fusionado que comprende un fragmento o porción de armazón proteínico. El polinucleótido de la invención, que codifica un polipéptido de caspasa inducible, comprende el ácido nucleico de SEQ ID NO: 10.

[0235] Construcción de ácidos nucleicos

[0236] Los ácidos nucleicos aislados se pueden preparar usando (a) procedimientos recombinantes, (b) técnicas de síntesis, (c) técnicas de purificación y/o (d) combinaciones de los mismos, como es bien conocido en la técnica. Los ácidos nucleicos pueden comprender convenientemente secuencias además de una secuencia que codifica un polipéptido inducible de la divulgación. Por ejemplo, se puede insertar un sitio de clonación múltiple que comprende uno o más sitios de restricción de endonucleasas en el ácido nucleico para ayudar al aislamiento de la secuencia que codifica un polipéptido inducible de la divulgación. Además, se pueden insertar secuencias traducibles para ayudar al aislamiento del polinucleótido traducido de la divulgación. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un medio conveniente para purificar las proteínas caspasas de la divulgación. El ácido nucleico de la divulgación, excluyendo la secuencia codificante, es opcionalmente un vector, adaptador o conector para la clonación y/o expresión de una secuencia que codifica un polipéptido inducible. Se pueden añadir secuencias adicionales a dichas secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión, para ayudar al aislamiento de la secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido inducible, o para mejorar la introducción de la secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido inducible en una célula. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y conectores es bien conocido en la técnica. (Véase, por ejemplo, Ausubel,supra;o Sambrook,supra).

[0237] Procedimientos recombinantes para construir ácidos nucleicos

[0238] Se pueden obtener composiciones de ácido nucleico aisladas, tales como ARN, ADNc, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos, a partir de fuentes biológicas usando cualquier número de metodologías de clonación conocidas por los expertos en la técnica. En algunos modos de realización, se usan sondas oligonucleotídicas que hibridan selectivamente, en condiciones rigurosas, con los polinucleótidos de la presente invención para identificar la secuencia deseada en una colección de ADNc o ADN genómico. El aislamiento de colecciones de ARN, de construcción de ADNc y genómicas son bien conocidos por los expertos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Ausubel,supra; o Sambrook,supra).

[0239] Procedimientos de cribado y aislamiento de ácidos nucleicos

[0240] Se puede cribar una colección de ADNc o genómica usando una sonda basada en la secuencia de un polinucleótido o fragmento del mismo. Se pueden usar sondas para hibridar con secuencias de ADN genómico o ADNc para aislar genes homólogos en el mismo o en diferentes organismos. Los expertos en la técnica apreciarán que se puedan emplear diversos grados de restricción de hibridación en el ensayo; y el medio de hibridación o bien el de lavado pueden ser rigurosos. A medida que las condiciones para la hibridación se vuelven más rigurosas, debe haber un mayor grado de complementariedad entre la sonda y la diana para que se produzca la formación de dúplex. El grado de restricción se puede controlar mediante uno o más de temperatura, fuerza iónica, pH y la presencia de un disolvente parcialmente desnaturalizante, tal como formamida. Por ejemplo, la restricción de la hibridación se varía convenientemente cambiando la polaridad de la solución de reaccionante a través de, por ejemplo, la manipulación de la concentración de formamida dentro del intervalo de un 0 % a un 50 %. El grado de complementariedad (identidad de secuencia) requerido para la unión detectable variará de acuerdo con la restricción del medio de hibridación y/o medio de lavado. El grado de complementariedad será óptimamente de un 100 %, o de un 70-100 %, o cualquier intervalo o valor en el mismo. Sin embargo, se debe entender que las variaciones de secuencia menores en las sondas y cebadores se pueden compensar reduciendo la restricción del medio de hibridación y/o de lavado.

[0241] Los procedimientos de amplificación de ARN o ADN son bien conocidos en la técnica y se pueden usar de acuerdo con la divulgación sin experimentación excesiva, en base a la enseñanza y orientación presentadas en el presente documento.

[0242] Los procedimientos conocidos de amplificación de ADN o ARN incluyen, pero no se limitan a, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y procedimientos de amplificación relacionados (véanse, por ejemplo, las pat. de EE. UU. n.os 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188 de Mullis,et al.;4.795.699 y 4.921.794 de Tabor,et al.;5.142.033 de Innis; 5.122.464 de Wilson,et al.;5.091.310 de Innis; 5.066.584 de Gyllensten,et al.;4.889.818 de Gelfand,et al.;4.994.370 de Silver,et al.;4.766.067 de Biswas; 4.656.134 de Ringold) y amplificación mediada por ARN que usa ARN antisentido para la secuencia diana como molde para la síntesis de ADN bicatenario (patente de EE. UU. n.° 5.130.238 de Malek,et al.,con el nombre comercial NASBA). (Véase, por ejemplo, Ausubel,supra;o Sambrook,supra).

[0243] Por ejemplo, se puede usar la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las secuencias de polinucleótidos y genes relacionados directamente a partir de colecciones de ADN genómico o ADNc. La PCR y otros procedimientos de amplificaciónin vitrotambién pueden ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas que se van a expresar, para preparar ácidos nucleicos para su uso como sondas para detectar la presencia del ARNm deseado en muestras, para secuenciación de ácido nucleico o para otros propósitos. Se encuentran ejemplos de técnicas suficientes para dirigir a los expertos a través de procedimientos de amplificaciónin vitroen Berger,supra,Sambrook,supray Ausubel,supra,así como Mullis,et al.,patente de EE. UU. n.° 4.683.202 (1987); e Innis,et al.,PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990). Son conocidos en la técnica kits disponibles comercialmente para la amplificación por PCR genómica. Véase, por ejemplo, el kit de PCR genómica Advantage-GC (Clontech). Adicionalmente, por ejemplo, se puede usar la proteína 32 del gen T4 (Boehringer Mannheim) para mejorar el rendimiento de productos de PCR largos.

[0244] Procedimientos sintéticos para construir ácidos nucleicos

[0245] También se pueden preparar ácidos nucleicos aislados mediante síntesis química directa por procedimientos conocidos (véase, por ejemplo, Ausubel,et al., supra).En general, la síntesis química produce un oligonucleótido monocatenario, que se puede convertir en ADN bicatenario por hibridación con una secuencia complementaria o por polimerización con una ADN polimerasa usando la hebra única como molde. Un experto en la técnica reconocerá que, si bien la síntesis química de ADN se puede limitar a secuencias de aproximadamente 100, 500 y 1000 o más bases, se pueden obtener secuencias más largas mediante ligación de secuencias más cortas.Casetes de expresión recombinantes

[0246] En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulgan casetes de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la divulgación. Se puede usar una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, una secuencia de ADNc o una genómica que codifica una porción de un polipéptido inducible, para construir un casete de expresión recombinante que se puede introducir en al menos una célula huésped deseada. Un casete de expresión recombinante comprenderá típicamente un polinucleótido enlazado de forma funcional a secuencias reguladoras de inicio de la transcripción que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula huésped prevista. Se pueden emplear promotores tanto heterólogos como no heterólogos (es decir, endógenos) para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la divulgación.

[0247] En algunos modos de realización, los ácidos nucleicos aislados que sirven como promotor, potenciador u otros elementos se pueden introducir en la posición apropiada (en dirección 5', en dirección 3' o en el intrón) de una forma no heteróloga de un polinucleótido para regular por incremento o por disminución la expresión de un polinucleótido de la divulgación. Por ejemplo, se pueden alterar promotores endógenosin vivooin vitromediante mutación, deleción y/o sustitución.

[0248] Vectores y células huésped

[0249] La divulgación también se refiere a vectores que incluyen una secuencia que codifica un polipéptido inducible de la divulgación, células huésped que se genomanipulan con los vectores recombinantes y la producción de al menos un polipéptido inducible mediante técnicas recombinantes, como es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook,et al., supra;Ausubel,et al., supra.El vector y la célula huésped de la invención se definen por las reivindicaciones.

[0250] Los polinucleótidos, incluyendo una secuencia que codifica un polipéptido inducible de la divulgación, se pueden unir opcionalmente a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un huésped. En general, se introduce un vector plasmídico en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, se puede encapsidarin vitrousando una línea celular de encapsidación apropiada y, a continuación, transducir en células huésped.

[0251] En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, se divulga una composición que comprende el transposón de la divulgación. El transposón de la invención, y la célula que comprende el transposón de la invención, se definen por el conjunto de reivindicaciones. En determinados modos de realización, la composición puede comprender además un plásmido que comprende una secuencia que codifica una enzima transposasa. La secuencia que codifica una enzima transposasa puede ser una secuencia de ARNm.

[0252] Los transposones se pueden mantener episómicamente o integrar en el genoma de la célula recombinante/modificada. El transposón puede ser parte de un sistema piggyBac de dos componentes que utiliza un transposón y transposasa para potenciar la transferencia génica no vírica. En determinados modos de realización de este procedimiento, el transposón es un transposón de ADN plasmídico con una secuencia que codifica el polipéptido de caspasa inducible flanqueado por dos elementos aislantes reguladores en cis. En determinados modos de realización, el transposón es un transposón piggyBac. En determinados modos de realización, y, en particular, aquellos modos de realización en los que el transposón es un transposón piggyBac, la transposasa es una transposasa piggyBac™ o Super piggyBac™ (SPB).

[0254] Los transposones pueden comprender transposones piggyBac. En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, el transposón es un transposón de ADN plasmídico con una secuencia que codifica el polipéptido de caspasa inducible flanqueado por dos elementos aislantes reguladores en cis. En determinados modos de realización, el transposón es un transposón piggyBac. En determinados modos de realización, y, en particular, aquellos modos de realización en los que el transposón es un transposón piggyBac, la transposasa es una transposasa piggyBac™ o Super piggyBac™ (SPB). En determinados modos de realización, y, en particular, aquellos modos de realización en los que la transposasa es una transposasa Super piggyBac™ (SPB), la secuencia que codifica la transposasa es una secuencia de ARNm.

[0256] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, la enzima transposasa es una enzima transposasa piggyBac™ (PB). La enzima transposasa piggyBac (PB) puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o cualquier porcentaje intermedio a:

[0259]

[0262] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, la enzima transposasa es una enzima transposasa piggyBac™ (PB) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución aminoacídica en una o más de las posiciones 30, 165, 282 o 538 de la secuencia:

[0265]

[0267] En determinados modos de realización, la enzima transposasa es una enzima transposasa piggyBac™ (PB) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución aminoacídica en dos o más de las posiciones 30, 165, 282 o 538 de la secuencia de SEQ ID NO: 1. En determinados modos de realización, la enzima transposasa es una enzima transposasa piggyBac™ (PB) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución aminoacídica en tres o más de las posiciones 30, 165, 282 o 538 de la secuencia de SEQ ID NO: 1. En determinados modos de realización, la enzima transposasa es una enzima transposasa piggyBac™ (PB) que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una sustitución aminoacídica en cada una de las siguientes posiciones 30, 165, 282 o 538 de la secuencia de SEQ ID NO: 1. En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 30 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 es una sustitución de una isoleucina (I) por una valina (V). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 165 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 es una sustitución de una glicina (G) por una serina (S). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 282 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 es una sustitución de una metionina (M) por una valina (V). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 538 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 es una sustitución de una asparagina (N) por una lisina (K).

[0269] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, la enzima transposasa es una enzima transposasa Super piggyBac™ (SPB). En determinados modos de realización, las enzimas transposasas Super piggyBac™ (SPB) pueden comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de SEQ ID NO: 1, en la que la sustitución aminoacídica en la posición 30 es una sustitución de una isoleucina (I) por una valina (V), la sustitución aminoacídica en la posición 165 es una sustitución de una glicina (G) por una serina (S), la sustitución aminoacídica en la posición 282 es una sustitución de una metionina (M) por una valina (V) y la sustitución aminoacídica en la posición 538 es una sustitución de una asparagina (N) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la enzima transposasa Super piggyBac™ (SPB) puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o cualquier porcentaje intermedio a:

[0271]

[0273] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, incluyendo aquellos modos de realización en los que la transposasa comprende las mutaciones descritas anteriormente en las posiciones 30, 165, 282 y/o 538, la enzima transposasa piggyBac™ o Super piggyBac™ puede comprender además una sustitución aminoacídica en una o más de las posiciones 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 y 591 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinados modos de realización, incluyendo aquellos modos de realización en los que la transposasa comprende las mutaciones descritas anteriormente en las posiciones 30, 165, 282 y/o 538, la enzima transposasa piggyBac™ o Super piggyBac™ puede comprender además una sustitución aminoacídica en una o más de las posiciones 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 y 570. En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 3 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una serina (S) por una asparagina (N). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 46 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una alanina (A) por una serina (S). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 46 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una alanina (A) por una treonina (T). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 82 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una isoleucina (I) por un triptófano (W). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 103 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una serina (S) por una prolina (P). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 119 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una arginina (R) por una prolina (P). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 125 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una cisteína (C) por una alanina (A). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 125 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una cisteína (C) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 177 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una tirosina (Y) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 177 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una tirosina (Y) por una histidina (H). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 180 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una fenilalanina (F) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 180 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una fenilalanina (F) por una isoleucina (I). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 180 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una fenilalanina (F) por una valina (V). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 185 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 187 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una alanina (A) por una glicina (G). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 200 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una fenilalanina (F) por un triptófano (W). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 207 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una valina (V) por una prolina (P). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 209 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una valina (V) por una fenilalanina (F). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 226 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una fenilalanina (F). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 235 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una leucina (L) por una arginina (R). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 240 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 1 es una sustitución de una valina (V) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 241 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una fenilalanina (F) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 243 de s Eq ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una prolina (P) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 258 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una asparagina (N) por una serina (S). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 296 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una leucina (L) por un triptófano (W). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 296 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una leucina (L) por una tirosina (Y). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 296 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una leucina (L) por una fenilalanina (F). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 298 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 298 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una alanina (A). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 298 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una valina (V). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 311 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una prolina (P) por una isoleucina (I). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 311 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una prolina (P) por una valina. En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 315 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una arginina (R) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 319 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una treonina (T) por una glicina (G). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 327 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una tirosina (Y) por una arginina (R). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 328 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una tirosina (Y) por una valina (V). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 340 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una cisteína (C) por una glicina (G). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 340 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una cisteína (C) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 421 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución del ácido aspártico (D) por una histidina (H). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 436 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una valina (V) por una isoleucina (I). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 456 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una tirosina (Y). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 470 de s Eq ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una leucina (L) por una fenilalanina (F). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 485 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una serina (S) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 503 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una leucina (L). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 503 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una isoleucina (I). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 552 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una valina (V) por una lisina (K). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 570 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una alanina (A) por una treonina (T). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 591 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una glutamina (Q) por una prolina (P). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 591 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una glutamina (Q) por una arginina (R).

[0274] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, incluyendo aquellos modos de realización en los que la transposasa comprende las mutaciones descritas anteriormente en las posiciones 30, 165, 282 y/o 538, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender o la enzima transposasa Super piggyBac™ puede comprender además una sustitución aminoacídica en una o más de las posiciones 103, 194, 372, 375, 450, 509 y 570 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, incluyendo aquellos modos de realización en los que la transposasa comprende las mutaciones descritas anteriormente en las posiciones 30, 165, 282 y/o 538, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender o la enzima transposasa Super piggyBac™ puede comprender además una sustitución aminoacídica en dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de las posiciones 103, 194, 372, 375, 450, 509 y 570 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinados modos de realización, incluyendo aquellos modos de realización en los que la transposasa comprende las mutaciones descritas anteriormente en las posiciones 30, 165, 282 y/o 538, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender o la enzima transposasa Super piggyBac™ puede comprender además una sustitución aminoacídica en las posiciones 103, 194, 372, 375, 450, 509 y 570 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 103 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una serina (S) por una prolina (P). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 194 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una metionina (M) por una valina (V). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 372 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una arginina (R) por una alanina (A). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 375 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una lisina (K) por una alanina (A). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 450 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de un ácido aspártico (D) por una asparagina (N). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 509 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una serina (S) por una glicina (G). En determinados modos de realización, la sustitución aminoacídica en la posición 570 de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 es una sustitución de una asparagina (N) por una serina (S). En determinados modos de realización, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender una sustitución de una metionina (M) por una valina (V) en la posición 194 de s Eq ID NO: 1. En determinados modos de realización, incluyendo aquellos modos de realización en los que la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender una sustitución de una metionina (M) por una valina (V) en la posición 194 de SEQ ID NO: 1, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender además una sustitución aminoacídica en las posiciones 372, 375 y 450 de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinados modos de realización, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender una sustitución de una metionina (M) por una valina (V) en la posición 194 de SEQ ID NO: 1, una sustitución de una arginina (R) por una alanina (A) en la posición 372 de SEQ ID NO: 1 y una sustitución de una lisina (K) por una alanina (A) en la posición 375 de SEQ ID NO: 1. En determinados modos de realización, la enzima transposasa piggyBac™ puede comprender una sustitución de una metionina (M) por una valina (V) en la posición 194 de SEQ ID NO: 1, una sustitución de una arginina (R) por una alanina (A) en la posición 372 de SEQ ID NO: 1, una sustitución de una lisina (K) por una alanina (A) en la posición 375 de SEQ ID NO: 1 y una sustitución de un ácido aspártico (D) por una asparagina (N) en la posición 450 de SEQ ID NO: 1.

[0276] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, el transposón es un transposón Sleeping Beauty. En determinados modos de realización y, en particular, aquellos modos de realización en los que el transposón es un transposón Sleeping Beauty, la transposasa es una transposasa Sleeping Beauty o una transposasa Sleeping Beauty hiperactiva (SB100X).

[0278] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, la enzima transposasa Sleeping Beauty comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o cualquier porcentaje intermedio a:

[0280]

[0282] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, la enzima transposasa Sleeping Beauty hiperactiva (SB 100X) comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o cualquier porcentaje intermedio a:

[0284]

[0286] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, la transposasa es una transposasa Helitron. Las transposasas Helitron movilizan el transposón Hellraiser, un elemento antiguo del genoma de murciélago que estuvo activo hace aproximadamente de 30 a 36 millones de años. Un transposón Hellraiser ejemplar incluye Helibat1, que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende:

[0287]

[0288]

[0289]

[0291] A diferencia de otras transposasas, la transposasa Helitron no contiene un dominio catalítico similar a RNasa-H, sino que, en su lugar, comprende un motivo RepHel constituido por un dominio iniciador de replicación (Rep) y un dominio de ADN helicasa. El dominio Rep es un dominio de nucleasa de la superfamilia de nucleasas HUH.

[0293] Una transposasa Helitron ejemplar comprende una secuencia de aminoácidos que comprende:

[0295]

[0297] En las transposiciones Helitron, una horquilla cerca del extremo 3' del transposón funciona como un finalizador. Sin embargo, esta horquilla se puede eludir por la transposasa, dando como resultado la transducción de las secuencias flanqueantes. Además, la transposición de Hellraiser genera intermedios circulares cerrados covalentemente. Además, las transposiciones Helitron pueden carecer de duplicaciones de sitio diana. En la secuencia de Hellraiser, la transposasa está flanqueada por secuencias terminales izquierda y derecha denominadas LTS y RTS. Estas secuencias finalizan con un motivo 5'-TC/CTAG-3' conservado. Una secuencia palindrómica de 19 pb con el potencial de formar la estructura de finalización en horquilla se localiza 11 nucleótidos en dirección 5' de la RTS y consiste en la secuencia GT GCACGAATTTCGT GCACCGGGCCACTAG (SEQ ID NO: 23).

[0299] En determinados modos de realización de los procedimientos de la divulgación, la transposasa es una transposasa Tol2. Los transposones Tol2 se pueden aislar o derivar del genoma del pez medaka, y pueden ser similares a los transposones de la familia hAT. Los transposones Tol2 ejemplares se codifican por una secuencia que comprende aproximadamente 4,7 kilobases y contienen un gen que codifica la transposasa Tol2, que contiene cuatro exones. Una transposasa Tol2 ejemplar comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la siguiente:

[0300]

[0302] Un transposón Tol2 ejemplar de la divulgación, incluyendo repeticiones invertidas, secuencias subterminales y la transposasa Tol2, se codifica por una secuencia de ácido nucleico que comprende la siguiente:

[0304]

[0305]

[0306]

[0307] 408 1

[0309] El inserto de ADN se debe enlazar de forma funcional a un promotor apropiado. Las construcciones de expresión contendrán además sitios para el inicio de la transcripción, la finalización y, en la región transcrita, un sitio de unión a ribosoma para la traducción. La porción codificante de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluirá preferentemente un iniciador de la traducción al comienzo y un codón de finalización (por ejemplo, UAA, UGAo UAG) situado apropiadamente al final del ARNm que se va a traducir, siendo UAAy UAG preferentes para la expresión en células de mamífero o eucariotas.

[0311] Los vectores de expresión incluirán preferentemente, pero opcionalmente, al menos un marcador seleccionable. Dichos marcadores incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, genes de resistencia a ampicilina, zeocina (genSh bla),puromicina (genpac),higromicina B (genhygB),G418/geneticina (genneo),ácido micofenólico o glutamina sintetasa (GS, pat. de EE. UU. n.os 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739), blasticidina (genbsd)para cultivo de células eucarióticas, así como genes de resistencia a ampicilina, zeocina (genSh bla),puromicina (genpac),higromicina B (genhygB),G418/geneticina (genneo),kanamicina, espectinomicina, estreptomicina, carbenicilina, bleomicina, eritromicina, polimixina B o tetraciclina para cultivo enE. coliy otras bacterias o procariotas. Son conocidos en la técnica medios y condiciones de cultivo apropiados para las células huésped descritas anteriormente. Los vectores adecuados serán fácilmente evidentes para el experto en la técnica. La introducción de una construcción de vector en una célula huésped se puede efectuar mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros procedimientos conocidos. Dichos procedimientos se describen en la técnica, tales como Sambrook,supra,capítulos 1-4 y 16-18; Ausubel,supra,capítulos 1, 9, 13, 15, 16.

[0313] Los vectores de expresión incluirán preferentemente, pero opcionalmente, al menos un marcador de superficie celular seleccionable para el aislamiento de células modificadas por las composiciones y procedimientos de la divulgación. Los marcadores de superficie celular seleccionables comprenden proteínas de superficie, glucoproteínas o grupo de proteínas que distinguen una célula o subconjunto de células de otro subconjunto de células definido. Preferentemente, el marcador de superficie celular seleccionable distingue las células modificadas por una composición o procedimiento de las células que no se han modificado por una composición o procedimiento de la divulgación. Dichos marcadores de superficie celular incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, proteínas de "agrupación de designación" o "determinantes de clasificación" (a menudo abreviadas como "CD"), tales como una forma truncada o de longitud completa de CD19, CD271, CD34, CD22, CD20, CD33, CD52 o cualquier combinación de las mismas. Los marcadores de superficie celular incluyen además el marcador de gen suicida RQR8 (Philip Bet al.Blood. 21 ago. de 2014; 124(8):1277-87).

[0315] Los vectores de expresión incluirán preferentemente, pero opcionalmente, al menos un marcador de resistencia a fármacos seleccionable para el aislamiento de células modificadas por las composiciones y procedimientos de la divulgación. Los marcadores de resistencia a fármacos seleccionables pueden comprender neo, DHFR, TYMS, FRANCF, RAD51C, GCS, MDR1, ALDH1, NKX2.2 natural o mutante, o cualquier combinación de los mismos.

[0317] Al menos un polipéptido inducible se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir regiones funcionales heterólogas adicionales. Por ejemplo, se puede añadir una región de aminoácidos adicionales, en particular aminoácidos cargados, al extremo N de un armazón proteínico para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula huésped, durante la purificación o durante la manipulación y el almacenamiento posteriores. Además, se pueden añadir restos peptídicos a un armazón proteínico para facilitar la purificación. Dichas regiones se pueden retirar antes de la preparación final de un polipéptido inducible o al menos un fragmento del mismo. Dichos procedimientos se describen en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Sambrook,supra,capítulos 17.29-17.42 y 18.1-18.74; Ausubel,supra,capítulos 16, 17 y 18.

[0318] Los expertos en la técnica son conocedores de los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína de la divulgación. De forma alternativa, se pueden expresar ácidos nucleicos en una célula huésped mediante activación (mediante manipulación) en una célula huésped que contiene una secuencia que codifica un polipéptido inducible de la divulgación. Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en las pat. de EE. UU. n.os 5.580.734, 5.641.670, 5.733.746 y 5.733.761.

[0319] Los vectores de expresión para células modificadas pueden incluir una o más de las siguientes secuencias de control de expresión, tales como, pero sin limitarse a, un origen de replicación; un promotor (por ejemplo, promotores tardíos o tempranos de SV40, el promotor de CMV (pat. de EE. UU. n.os 5.168.062; 5.385.839), un promotor de HSV-tk, un promotor de pgk (fosfoglicerato cinasa), un promotor de EF-1 alfa (pat. de EE. UU. n.° 5.266.491), al menos un promotor humano; un potenciador y/o sitios de información de procesamiento, tales como sitios de unión a ribosoma, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición de poli A T Ag grande de SV40) y secuencias finalizadoras de la transcripción. Véase, por ejemplo, Ausubel,et al., supra;Sambrook,et al., supra.Otras células útiles para la producción de ácidos nucleicos o proteínas de la presente invención son conocidas y/o están disponibles, por ejemplo, en el American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) u otras fuentes conocidas o comerciales.

[0320] Cuando se emplean células huésped eucariotas, las secuencias finalizadoras de la transcripción o poliadenilación se incorporan típicamente en el vector. Un ejemplo de una secuencia finalizadora es la secuencia de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento bovina. También se pueden incluir secuencias para un empalme exacto del transcrito. Un ejemplo de una secuencia de empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague,et al.,J. Virol. 45:773-781 (1983)). Adicionalmente, se pueden incorporar secuencias génicas para controlar la replicación en la célula huésped en el vector, como es conocido en la técnica.

[0321] Códigos de aminoácidos

[0322] Los aminoácidos que componen los armazones proteínicos a menudo se abrevian. Las designaciones de aminoácidos se pueden indicar designando el aminoácido por su código de una sola letra, su código de tres letras, nombre o codón/codones de tres nucleótidos como se entiende bien en la técnica (véase Alberts, B.,et al.,Molecular Biology of The Cell, tercera edición, Garland Publishing, Inc., Nueva York, 1994). Un polipéptido inducible puede incluir una o más sustituciones, deleciones o adiciones aminoacídicas, de mutaciones naturales o bien de manipulación humana, como se especifica en el presente documento. Los aminoácidos de un polipéptido inducible que son esenciales para la función se pueden identificar por procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis por barrido de alanina (por ejemplo, Ausubel,supra,capítulos 8, 15; Cunningham y Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). El último procedimiento introduce mutaciones de alanina únicas en todos los residuos de la molécula. Las moléculas mutantes resultantes se someten a prueba a continuación para determinar la actividad biológica, tal como, pero sin limitarse a, al menos una actividad neutralizante. Los sitios que son críticos para la función (es decir, que inducen la apoptosis) también se pueden identificar mediante análisis estructural, tal como cristalización, resonancia magnética nuclear o marcaje por fotoafinidad (Smith,et al.,J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) y de Vos,et al.,Science 255:306-312 (1992)).

[0323] Un polipéptido inducible biológicamente activo incluye una o más proteínas o enzimas (por ejemplo, una caspasa tal como caspasa 9) que pueden inducir apoptosis en una célula con una eficacia que es al menos un 20 %, 30 % o 40 % y, preferentemente, al menos un 50 %, 60 % o 70 % y, lo más preferentemente, al menos un 80 %, 90 % o 95 %-99 % o más eficaz que la expresión o inducción de la proteína o enzima natural (no sintética), endógena o relacionada y conocida de la célula. Los procedimientos de ensayo y cuantificación de medidas de unión a proteínas y actividad enzimática son bien conocidos para los expertos en la técnica.

[0324] Infusión de células modificadas como tratamiento celular adoptivo

[0325] En un caso relacionado proporcionado con propósitos ilustrativos, la divulgación proporciona células modificadas que expresan uno o más polipéptidos inducibles que se han seleccionado para su administración a un sujeto que los necesita. Las células modificadas de la invención se definen por las reivindicaciones. Las células modificadas se pueden formular para su almacenamiento a cualquier temperatura, incluyendo temperatura ambiente y temperatura corporal. Las células modificadas se pueden formular para su crioconservación y posterior descongelación. Las células modificadas se pueden formular en un vehículo farmacéuticamente aceptable para su administración directa a un sujeto a partir de un envase estéril.

[0326] Ejemplos

[0327] Ejemplo 1: expresión y función del interruptor de seguridad iC9 integrado en piggyBac en pan-linfocitos T humanos

[0328] Se nucleofectaron pan-linfocitos T humanos usando un nucleofector Amaxa 4D con uno de cuatro transposones piggyBac. Los linfocitos T modificados que recibieron la condición "simulada" se nucleofectaron con un transposón piggyBac vacío. Los linfocitos T modificados recibieron una transposasa piggyBac que contenía un agente terapéutico solo (una secuencia que codifica una CARTirina) o bien una transposasa piggyBac que contenía una secuencia iC9 integrada y un agente terapéutico (una secuencia que codifica una CARTirina).

[0330] La figura 1 proporciona un diagrama esquemático del interruptor de seguridad iC9 que contiene una región de unión a ligando, un conector y un polipéptido de caspasa 9 truncado. Específicamente, el polipéptido iC9 contiene una región de unión a ligando que comprende un polipéptido de proteína 12 de unión a FK506 (FKBP12) que incluye una sustitución de fenilalanina (F) por valina (V) en la posición 36 (F36V). El polipéptido de FKBP12 del polipéptido ¡C9 se codifica por una secuencia de aminoácidos que comprende GVQVET ISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVI RGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAY GATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO: 3). El polipéptido de FKBP12 del polipéptido ¡C9 se codifica por una secuencia de ácido nucleico que comprende GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAA GG GGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTG GACAGCTCCAGGGATC GCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAA GTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGAT GTCAGTCGGCCAGCGGGCC AAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATC ATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 4). La región de conector del polipéptido ¡C9 se codifica por una secuencia de aminoácidos que comprende GGGGS (SEQ ID NO: 5) y una de ácido nucleico que comprende GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 6). La secuencia de aminoácidos que codifica el polipéptido ¡C9 se codifica por una de aminoácidos que comprende GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRES GLRTRTGSNIDCEKLRR RFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCV VVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGT SCPSLGGKPKLFFIQACGG EQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFP GFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFN FLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 7). La secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido iC9 se codifica por una secuencia de ácido nucleico que comprende

[0332]

[0335] Para someter a prueba el interruptor de seguridad iC9, cada uno de los cuatro linfocitos T modificados se incubó durante 24 horas con AP19030, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM o 1000 nM (un agente de inducción para AP1903, también conocido como rimiducid). Se evaluó la viabilidad por citometría de flujo usando 7-aminoactinomicina D (7-AAD), un intercalador fluorescente, como marcador para células que experimentan apoptosis.

[0337] Se evaluó la viabilidad celular el día 12 (véase la figura 2). Los datos demuestran un desplazamiento de las poblaciones celulares del cuadrante inferior derecho al superior izquierdo con concentraciones crecientes del agente de inducción en células que contienen la construcción iC9; sin embargo, este efecto no se observa en células que carecen de la construcción iC9 (las que reciben solo la CARTirina), en las que las células se distribuyen uniformemente entre estas dos áreas independientemente de la concentración del agente de inducción. Además, se evaluó la viabilidad celular el día 19 (véase la figura 3). Los datos revelan la misma tendencia que se muestra en la figura 2 (día 12 después de la nucleofección); sin embargo, el desplazamiento de las poblaciones hacia el cuadrante superior izquierdo es más pronunciado en este punto temporal posterior (día 19 después de la nucleofección).

[0338] Se realizó una cuantificación de los resultados agregados y se proporciona en la figura 4, que muestra el impacto significativo del interruptor de seguridad iC9 sobre el porcentaje de viabilidad celular en función de la concentración del agente de inducción (AP1903, también conocido como rimiducid) del interruptor iC9 para cada tipo de célula modificada el día 12 (figura 2 y gráfico izquierdo) o bien el día 19 (figura 3 y gráfico derecho). La presencia del interruptor de seguridad iC9 induce la apoptosis en una mayoría significativa de células el día 12 y el efecto es incluso más drástico el día 19.

[0339] Los resultados de este estudio muestran que el interruptor de seguridad iC9 es extremadamente eficaz para eliminar las células activas tras el contacto con un agente de inducción (por ejemplo, AP1903, también conocido como rimiducid) porque AP1903 (rimiducid) induce la apoptosis incluso a las concentraciones más bajas del estudio (0,1 nM). Además, el interruptor de seguridad iC9 se puede expresar funcionalmente como parte de un vector tricistrónico.

[0340] Ejemplo 2: destrucción altamente eficaz de células que comprenden P-BCMA-101 usando el interruptor de seguridad iC9 en ratones NGS in vivo

[0341] A ratones NSG se les inyectaron i.v. células MM.1S/luciferasa+, se estadificaron el día 8, se les inyectaron linfocitos T el día 9 y recibieron tratamiento con AP1903 (rimiducid) el día 12 a las dosis indicadas. 24 horas después, se sacrificaron los ratones y se recogieron y tiñeron células sanguíneas, de bazo y de médula ósea para detectar la presencia de células huCD45+ (figura 5). Se analizaron las células sanguíneas, de bazo y de médula ósea por citometría de flujo para detectar la presencia de células huCD45+. Se determinó la viabilidad relativa dividiendo el número de células huCD45 entre el número de células msCD45 y normalizando al promedio de huCD45/msCD45 en el grupo sin tratamiento multiplicando por 100 % por cada 1500 acontecimientos de microesferas para cada muestra. Cada punto de datos representa un ratón diferente (figura 6).

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de caspasa inducible, en el que el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 10.

2. Un polipéptido de caspasa inducible, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

3. Una composición que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 o el polipéptido de caspasa inducible de la reivindicación 2.

4. Un transposón que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 o un polinucleótido que codifica el polipéptido de caspasa inducible de la reivindicación 2.

5. El transposón de la reivindicación 4, que comprende además una secuencia que codifica una proteína terapéutica, opcionalmente en el que la proteína terapéutica comprende un receptor de antígeno, una proteína de superficie celular, una proteína unida a la membrana, una proteína unida a la membrana extracelular, una proteína unida a la membrana intracelular, una proteína intracelular, una proteína localizada nuclear, una proteína nuclear, una proteína citoplásmica, una proteína citosólica, una proteína secretada, una proteína lisosómica, una proteína endosómica, una proteína asociada a vesículas, una proteína mitocondrial, una proteína del retículo endoplásmico, una proteína citoesquelética, una proteína implicada en la señalización intracelular y/o una proteína implicada en la señalización extracelular, opcionalmente en el que el receptor de antígeno:

a) comprende un receptor de linfocitos T (TCR); o

b) es un receptor quimérico de antígeno (CAR), opcionalmente en el que el CAR comprende una o más secuencias de centirina o una o más secuencias de VHH.

6. El transposón de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que el transposón es un transposón piggyBac, un transposón Sleeping Beauty, un transposón Hellraiser o un transposón Tol2.

7. Una composición que comprende el transposón de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6.

8. La composición de la reivindicación 7, en la que:

a) el transposón es un transposón piggyBac y en la que la composición comprende además un plásmido que comprende una secuencia que codifica una enzima transposasa, opcionalmente en la que la transposasa es una transposasa piggyBac y, opcionalmente, en la que:

i) la transposasa piggyBac comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 1, o ii) la transposasa piggyBac es una variante hiperactiva y en la que la variante hiperactiva comprende una sustitución aminoacídica en una o más de las posiciones 30, 165, 282 y 538 de SEQ ID NO: 1, opcionalmente en la que la transposasa es una transposasa Super piggyBac (SPB), opcionalmente en la que la transposasa Super piggyBac comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 2;

b) el transposón es un transposón Sleeping Beauty y en la que la composición comprende además un plásmido que comprende una secuencia que codifica una enzima transposasa, opcionalmente en la que la secuencia que codifica la enzima transposasa comprende una secuencia que codifica una transposasa Sleeping Beauty o transposasa Sleeping Beauty hiperactiva (SB 100X);

c) en la que el transposón es un transposón Hellraiser y en la que la composición comprende además un plásmido que comprende una secuencia que codifica una enzima transposasa, opcionalmente en la que la secuencia que codifica la enzima transposasa comprende una secuencia que codifica una transposasa Helitron; o

d) en la que el transposón es un transposón Tol2 y en la que la composición comprende además un plásmido que comprende una secuencia que codifica una enzima transposasa, opcionalmente en la que la secuencia que codifica la enzima transposasa comprende una secuencia que codifica una transposasa Tol2.

9. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 o un polinucleótido que codifica el polipéptido de caspasa inducible de la reivindicación 2, opcionalmente en el que:

a) el vector es un vector vírico, opcionalmente en el que el vector vírico comprende una secuencia aislada o derivada de un retrovirus, un lentivirus, un adenovirus, un virus adenoasociado (AaV) o cualquier combinación de los mismos, opcionalmente en el que el vector vírico comprende:

i) una secuencia aislada o derivada de un retrovirus, opcionalmente en el que el retrovirus es un gammarretrovirus o un lentivirus; o

ii) una secuencia aislada o derivada de un virus adenoasociado (AAV), opcionalmente en el que el AAV comprende un AAV de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 o AAV11 o en el que el AAV comprende una secuencia aislada o derivada de rAAV-LK03, rAAV-NP59 o rAAV-NP84; o b) el vector es un vector de nanopartículas, en el que el vector de nanopartículas comprende un ácido nucleico, un aminoácido, un polímero, una micela, lípido, una molécula orgánica, una molécula inorgánica o cualquier combinación de los mismos.

10. Una composición que comprende el vector de la reivindicación 9.

11. Una célula que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1, el polipéptido de caspasa inducible de la reivindicación 2, el transposón de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 7, 8 y 10, o el vector de la reivindicación 9, opcionalmente en la que la célula es una célula inmunitaria, opcionalmente en la que la célula inmunitaria es un linfocito T, un linfocito citolítico natural (NK), una célula de tipo linfocito citolítico natural (NK), una célula progenitora hematopoyética, un linfocito T derivado de sangre periférica (PB) o un linfocito T derivado de sangre del cordón umbilical (UCB).

12. Una composición que comprende la célula de la reivindicación 11.

13. La composición de la reivindicación 12 para su uso en un tratamiento celular adoptivo, opcionalmente en la que la célula es autóloga o alogénica.

14. Una composición que comprende:

a) una célula que comprende un agente terapéutico y un polinucleótido de la reivindicación 1 o un polipéptido de caspasa inducible de la reivindicación 2;

b) una célula que comprende un agente terapéutico y una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 3, 7, 8 y 10;

c) una célula que comprende un agente terapéutico, un transposón de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6 y una composición que comprende una transposasa como se define en la reivindicación 8; o

d) una célula que comprende un agente terapéutico y un vector de la reivindicación 9,

para su uso en un procedimiento de modificación de un tratamiento celular para finalizar o moderar un tratamiento en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto la composición, en el que se induce selectivamente la apoptosis en la célula poniendo en contacto la célula con un agente de inducción que se une específicamente a la región de unión a ligando del polipéptido de caspasa inducible, opcionalmente en el que la célula es autóloga o alogénica.

15. La composición para el uso de la reivindicación 14, en la que el tratamiento celular es un tratamiento celular adoptivo.

16. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 14-15, en la que el agente terapéutico es una secuencia que codifica un gen endógeno modificado, un gen exógeno o una porción de los mismos.

17. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en la que la modificación es una finalización del tratamiento celular o una disminución de una porción de las células proporcionadas en el tratamiento celular.

18. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 14-17, el procedimiento de modificación de un tratamiento celular que comprende además la etapa de administrar un inhibidor del agente de inducción para inhibir la modificación del tratamiento celular, restableciendo de este modo la función y/o eficacia del tratamiento celular.

19. Una composición que comprende:

a) una célula que comprende un agente cinético y un polinucleótido de la reivindicación 1 o un polipéptido de caspasa inducible de la reivindicación 2;

b) una célula que comprende un agente cinético y una composición de una cualquiera de las reivindicaciones

3, 7, 8 y 10;

c) una célula que comprende un agente cinético, un transposón de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6 y una composición que comprende una transposasa como se define en la reivindicación 8; o

d) una célula que comprende un agente cinético y un vector de la reivindicación 9,

para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el procedimiento:

administrar al sujeto la composición, en el que se induce selectivamente la apoptosis en la célula poniendo en contacto la célula con un agente de inducción que se une específicamente a la región de unión a ligando del polipéptido de caspasa inducible, y en el que la célula que comprende el agente cinético induce toxicidad tisular local dentro de un tejido diana del sujeto, e

inducir selectivamente la apoptosis en la célula que comprende el agente cinético antes de la inducción de toxicidad significativa en un tejido no diana del sujeto,

de este modo eliminando el tejido diana, conservando el tejido no diana y tratando la enfermedad o trastorno en el sujeto,

en el que la célula que comprende el agente cinético es un linfocito T, y en el que el agente cinético comprende un receptor sintético, modificado, recombinante o quimérico no natural, opcionalmente en el que el receptor quimérico es un receptor quimérico de antígeno (CAR).

20. La composición para el uso de la reivindicación 19, en la que la enfermedad o trastorno es un trastorno proliferativo o cáncer, opcionalmente en la que el tejido diana comprende:

a) un tumor, opcionalmente en el que el tumor es maligno;

b) un tejido expuesto o margen de un tumor resecado; o

c) un sitio de metástasis probable, opcionalmente en el que el sitio de metástasis comprende uno o más de un ganglio linfático, líquido linfático, sangre circulante periférica, sangre circulante local, un hueso, una médula ósea y líquido cefalorraquídeo (LCR).

21. La composición para el uso de la reivindicación 19, en la que la enfermedad o trastorno es:

a) una enfermedad o trastorno inflamatorio, opcionalmente en la que el tejido diana comprende un sitio de inflamación;

b) una enfermedad o trastorno inmunitario o autoinmunitario, opcionalmente en la que el tejido diana comprende un sitio de tejido expuesto o infectado o en la que el tejido diana comprende un tejido quemado o uno herido;

c) una enfermedad o trastorno infeccioso, opcionalmente en el que el tejido diana comprende un tejido infectado;

d) una enfermedad o trastorno genético o epigenético, opcionalmente en la que el tejido diana comprende una o más células que comprenden la modificación genética o epigenética en comparación con una célula natural; e) un trastorno metabólico, opcionalmente en el que el tejido diana comprende una o más células con el trastorno metabólico;

f) un trastorno vascular, opcionalmente en el que el tejido diana comprende una o más células de una vena, vaso sanguíneo, capilar o un componente de sangre circulante;

g) un trastorno respiratorio, opcionalmente en el que el tejido diana comprende una o más células de una fosa nasal, esófago o pulmón; o

h) un trastorno fibrótico, opcionalmente en el que el tejido diana comprende un fibroma o una célula en proximidad del fibroma.

22. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-21, en la que el agente cinético comprende:

a) un agente antineoplásico, opcionalmente en la que el agente antineoplásico comprende un agente anti-CD19, un agente anti-BCMA, un agente anti-PSMAo un agente anti-Mucl; o

b) un agente antineoplásico, opcionalmente en la que el agente antineoplásico comprende un agente anti-CD19, un agente anti-BCMA, un agente anti-PSMAo un agente anti-Muc1, y un receptor quimérico de antígeno (CAR), en la que el CAR comprende una o más secuencias de VHH.

23. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-22, en la que el agente cinético induce una aplasia, opcionalmente en la que la aplasia no es mortal.

24. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 19-23, en la que el agente de inducción elimina la célula que comprende el agente cinético y/o elimina o reduce un signo o un síntoma de la aplasia.