ES2608321T3 - Moléculas de unión humanas capaces de neutralizar virus de la gripe A del grupo filogenético 1 y del grupo filogenético 2 y virus de la gripe B - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse específicamente a un epítopo en la región de tallo de la proteína hemaglutinina (HA) de los subtipos de virus de la gripe A del grupo filogenético 1 y los subtipos de virus de la gripe A del grupo filogenético 2, y capaz de neutralizar a al menos uno o más subtipos de virus de la gripe A del grupo 1, seleccionado entre el grupo que consiste en virus de la gripe A que comprenden HA de los subtipos H1, H2, H5, H6, H8, H9 y H11, y al menos uno o más subtipos de virus de la gripe A del grupo 2, seleccionado entre el grupo que consiste en virus de la gripe A que comprenden HA de los subtipos H3, H4, H7, y H10, caracterizado por que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo también es capaz de unirse específicamente a la proteína hemaglutinina (HA) de subtipos del virus de la gripe B.

Description

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DESCRIPCION

Moleculas de union humanas capaces de neutralizar virus de la gripe A del grupo filogenetico 1 y del grupo filogenetico 2 y virus de la gripe B

Campo de la invencion

La invencion se esta relacionada con la medicina. En particular, la invencion se refiere a moleculas de union humanas capaces de neutralizar los virus de la gripe A tanto del grupo filogenetico 1 como del grupo filogenetico 2. En particular, la invencion se refiere a moleculas de union capaces de neutralizar los virus de la gripe A tanto del grupo filogenetico 1 como del grupo filogenetico 2, as! como a virus de la gripe B. La invencion se refiere ademas al diagnostico, profilaxis y/o tratamiento de una infeccion causada por los virus de la gripe A de los grupos filogeneticos 1 y 2, y preferentemente tambien por virus de la gripe B.

Antecedentes de la invencion

La infeccion por el virus de la gripe (tambien citada como "gripe" o "la gripe") es una de las enfermedades mas comunes conocidas en el ser humano que ocasiona entre tres y cinco millones de casos de enfermedad grave y entre 250.000 y 500.000 cada ano en todo el mundo. La gripe se disemina rapidamente en epidemias estacionales que afectan a un 5-15% de la poblacion y la carga en cuanto a costes para los servicios sanitarios es elevada (Organization Mundial de la Salud (OMS)).

Existen 3 tipos de virus de la gripe (los tipos A, B y C) responsables de patologlas infecciosas en seres humanos y animales. Los virus de tipo A y de tipo B son los agentes responsables de las epidemias y pandemias estacionales de gripe observadas en seres humanos.

Los virus de la gripe A pueden clasificarse en subtipos de virus de gripe basandose en variaciones en las regiones antigenicas de dos genes que codifican las glucoprotelnas de la envuelta hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) que son necesarias para la union vlrica y la liberation en la celula. Actualmente, se conocen dieciseis subtipos de Ha (H1-H16) y nueve variantes antigenicas de NA (N1-N0) en el virus de la gripe A. Los subtipos de virus de la gripe pueden clasificarse ademas por referencia a su grupo filogenetico. El analisis filogenetico (Fouchier et al., 2005) ha demostrado una subdivision de las HA que comprende dos grupos principales (Air, 1981): entre otros, los subtipos H1, H2, H5 y H9 en el grupo filogenetico 1 (tambien citado en el presente documento como "grupo 1") y entre otros, los subtipos H3, H4 y H7 en el grupo filogenetico 2 (o "grupo 2"). Solo algunos de los subtipos de gripe A (es decir, H1N1, H1N2 y H3N2) circulan entre personas, pero en animales, se han identificado todas las combinaciones de los 16 subtipos de HA y los 9 de NA, en particular en especies aviares. Los animales infectados por gripe A a menudo actuan como reservorio para los virus de la gripe y se ha demostrado que algunos subtipos atraviesan la barrera entre especies hacia los seres humanos, tales como la cepa H5N1 de gripe A altamente patogena.

Las cepas de virus de la gripe de tipo B son estrictamente humanas. Las variaciones antigenicas en HA dentro de los virus de la gripe de tipo B son mas debiles que las observadas dentro de las cepas de tipo A. En los seres humanos circulan dos linajes genetica y antigenicamente distintos de virus de la gripe B, representados por los linajes B/Yamagata/16/88 (tambien citado como B/Yamagata) y B/Victoria/2/87 (B/Victoria) (Ferguson et al., 2003). Aunque el espectro de enfermedad causada por los virus de la gripe B es generalmente mas leve que el causado por los virus de la gripe A, se sigue observando una enfermedad grave que requiere de hospitalization con la infeccion por gripe B.

Las estrategias actuales para lidiar con las epidemias anuales de gripe incluyen vacunacion anual, preferentemente generando protection cruzada heterotlpica. Sin embargo, los virus de la gripe circulantes en seres humanos estan sometidos a cambios antigenicos permanentes que obligan a adaptar la formulation de vacuna para la gripe para asegurar la coincidencia mas exacta posible entre las cepas de vacuna de gripe y las cepas circulantes de gripe. Aunque la vacunacion anual con vacunas para la gripe es la mejor manera de prevenir la gripe, los farmacos antivlricos, tales como oseltamivir (Tamiflu®) pueden ser eficaces para la prevention y tratamiento de la infeccion por gripe. Sin embargo, el numero de cepas de virus de la gripe que muestran resistencia a los farmacos antivlricos, tales como oseltamivir, esta aumentando.

Una estrategia alternativa es el desarrollo de tratamientos profilacticos o terapeuticos basados en anticuerpos para neutralizar diversos virus de la gripe estacionales y pandemicos. La diana principal de la mayorla de los anticuerpos neutralizantes que protegen contra la infeccion por el virus de la gripe es la cabeza globular (parte HA1) de la protelna HA vlrica que contiene el sitio de union a receptor, pero que esta sometida a evolution genetica continua con sustituciones de aminoacidos en los sitios de union a anticuerpo (deriva antigenica).

Recientemente, se han identificado anticuerpos con neutralization cruzada amplia que reconocen un epltopo en la region de tallo conservada de la hemaglutinina de los virus de la gripe A del grupo filogenetico 1 (incluyendo, por ejemplo, los subtipos de gripe H1 y H5) (vease, por ejemplo, el documento WO2008/028946 y Ekiert et al., Science 324(5924): 246-251, 2009), as! como anticuerpos con neutralizacion cruzada que reconocen un epltopo altamente

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conservado en la region de tallo de HA de los virus de la gripe A del grupo filogenetico 2 (incluyendo, por ejemplo, los subtipos H3 y H7) (documento WO 2010/130636). La actividad neutralizante de estos anticuerpos esta restringida a los virus de la gripe del grupo 1 o del grupo 2. Ademas, estos anticuerpos no son capaces de unirse a, y neutralizar, los virus de la gripe B.

Ademas, el documento WO 2010/010466 divulga un anticuerpo humano FI6 que se une a hemaglutinina y que es capaz de unirse a y neutralizar a los subtipos de gripe A del grupo 1 (incluyendo los subtipos H1 y H5) y del grupo 2 (incluyendo los subtipos H3 y H7). Este anticuerpo tampoco se une a la HA de los virus de la gripe B.

Ademas, el documento US 2009/0092620 divulga un anticuerpo murino que reconoce una estructura antigenica presente en la hemaglutinina de los tipos H1 y H3 y en la hemaglutinina de los virus de la gripe B que pertenecen a los grupos B/Victoria y B/Yamagata. Los anticuerpos inhiben la actividad de hemaglutininacion de varias cepas de H3N2, lo que implica que este anticuerpo se une a un epltopo en la cabeza globular de HA.

Sui et al. (Nature Structural and Molecular Biology 16(3): 265-273, 2009) divulgaron anticuerpos que son eficaces unicamente contra los virus de la gripe del grupo 1. A la vista de la gravedad de la enfermedad respiratoria causada por los virus de la gripe A y de la gripe B, as! como del elevado impacto economico de las epidemias estacionales, y del continuo riesgo de pandemias, existe una necesidad continua de medios eficaces para la prevencion y tratamiento de los subtipos A y B de gripe. Por lo tanto, existe la necesidad de moleculas de union, preferentemente moleculas de union humanas ampliamente neutralizantes, capaces de neutralizar de manera cruzada a los virus de la gripe A tanto del grupo filogenetico 1 como del grupo filogenetico 2, y preferentemente tambien a virus de la gripe B.

Sumario de la invencion

La invencion proporciona moleculas de union capaces de unirse especlficamente a cepas de virus de la gripe A tanto del grupo filogenetico 1 (incluyendo, por ejemplo, virus de la gripe que comprenden HA de los subtipos H1 y H5) y cepas de virus de la gripe A del grupo filogenetico 2 (incluyendo, por ejemplo, virus de la gripe que comprenden HA de los subtipos H3 y H7). En una realizacion, las moleculas de union tambien tienen actividad neutralizante contra cepas del virus de la gripe A tanto del grupo filogenetico 1 como del grupo filogenetico 2. De acuerdo con la invencion, las moleculas de union son capaces ademas de unirse especlficamente a cepas de virus de la gripe B, incluyendo, por ejemplo, las cepas del virus de la gripe B de los linajes B/Yamagata y/o B/Victoria. En una realizacion, las moleculas de union son capaces ademas de neutralizar a cepas de virus de la gripe B, incluyendo, por ejemplo, las cepas del virus de la gripe B de los linajes B/Yamagata y/o B/Victoria. En una realizacion, las moleculas de union son capaces de neutralizar in vivo a las cepas del virus de la gripe A y/o B. En una realizacion, las moleculas de union se unen a un epltopo conservado en la region de tallo de la protelna HA de los virus de la gripe A y B. En una realizacion, las moleculas de union no tienen actividad inhibidora de la hemaglutininacion (HI).

Por lo tanto, la invencion proporciona moleculas de union que se unen a un epltopo en la region de tallo de la protelna hemaglutinina que esta compartido entre los subtipos del virus de la gripe A dentro del grupo filogenetico 1 y los subtipos del virus de la gripe dentro del grupo filogenetico 2, as! como subtipos de virus de la gripe B, y por lo tanto se refiere a moleculas de union que reaccionan de manera cruzada con los subtipos de virus de la gripe A tanto del grupo 1 como del grupo 2 y con virus de la gripe B. La invencion tambien se refiere a moleculas de acido nucleico que codifican al menos la region de union de las moleculas de union humanas.

Las moleculas de union y/o las moleculas de acido nucleico de la invencion son adecuadas para su uso como agente profilactico, diagnostico y/o de tratamiento universal para los virus de la gripe A y los virus de la gripe B, incluso independientemente del subtipo de gripe causante.

Se baraja la hipotesis de que las moleculas de union de acuerdo con la presente invencion se unen a epltopos hasta ahora desconocidos y altamente conservados que no son propensos o que son mucho menos propensos a la deriva o cambio antigenico. En particular, este epltopo es compartido entre virus de la gripe que pertenecen tanto al grupo filogenetico 1 como al grupo filogenetico 2, y virus de la gripe B. Tambien se contempla usar las moleculas de union de la invencion para identificar y/o caracterizar estos epltopos.

La invencion proporciona ademas el uso de las moleculas de union humanas y/o de las moleculas de acido nucleico de la invencion en el diagnostico, profilaxis y/o tratamiento de un sujeto que tiene, o esta en riesgo de desarrollar, una infeccion por el virus de la gripe. Ademas, la invencion se refiere al uso de las moleculas de union humanas y/o de las moleculas de acido nucleico de la invencion en el diagnostico/deteccion de dichas infecciones por gripe.

Descripcion de las figuras

La FIG. 1 muestra el bloqueo del cambio conformacional de las HA H1, H5, H9, H3, y H7 por CR9114. (A) Union FACS de CR9114 a diversas conformaciones - precursor no escindido (HA0); pH neutro, escindido (HA); pH de fusion, escindido (pH de fusion) - de rHA expresada superficialmente de A/New Caledonia/20/1999 (H1)

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A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Hong Kong/1073/1999 (H9), A/Wisconsin/67/2005 (H3), y A/Netherlands/219/2003 (H7).

La union se expresa como el porcentaje de union a rHA no reaccionada (HA0). (B) Union FACS de CR9114 a HA expresada en superficie como en el caso anterior, salvo por que se anadio el mAb CR9114 antes de la exposicion de las HA escindidas a un pH de 4,9.

La FIG. 2 muestra que el mAb CR9114 compite con CR6261 y CR8020 por la union a H1 y H3, respectivamente. Grado de union adicional de los mAb indicados a HA inmovilizada de A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) saturados con 100 nM de CR6261 o CR9114 (paneles A y B), o a HA inmovilizada de A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) saturados con 100 nM de CR8020 o CR9114 (paneles C y D), medido usando interferometrla de biocapas.

La FIG. 3 demuestra la eficacia profilactica de CR9114 en el modelo de exposicion letal de raton con virus de la gripe B (B/Florida/04/2006). A. Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones tratados por via intravenosa con 15 mg/kg de CR9114 o con control de vehlculo en el dla -1 antes de la exposicion, seguido de una exposicion en el dla 0 a 25 DL de B/Florida/04/2006. B. Cambio medio en el peso corporal (%) en relacion al dla 0. Las barras representan un IC del 95% de la media. En caso de muerte/eutanasia de un raton durante el estudio, se arrastro el ultimo peso corporal observado. C. Mediana de puntuaciones cllnicas. Las barras representan los intervalos intercuartil. Explicacion de la puntuacion cllnica: 0=sin signos cllnicos; 1=pelo duro; 2=pelo duro, menos reactivo durante la manipulacion; 3=pelo duro, enroscado, dificultad respiratoria, menos reactivo durante la manipulacion; 4=pelo duro, enroscado, dificultad respiratoria, respuesta inactiva a manipulaciones.

Descripcion de la invencion

A continuacion, se proporcionan definiciones de terminos empleados en la presente invencion.

El termino "incluido" o "que incluye", tal como se usa en el presente documento, se considera acompanado de las palabras "sin limitacion".

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "molecula de union" se refiere a una inmunoglobulina intacta, incluyendo anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos monoclonales quimericos, humanizados o humanos, o a un dominio de union a antlgeno y/o variable que comprende un fragmento de una inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta por la union especlfica al companero de union de la inmunoglobulina, por ejemplo, HA. Independientemente de su estructura, el fragmento de union a antlgeno se une al mismo antlgeno que el reconocido por la inmunoglobulina intacta. Un fragmento de union a antlgeno puede comprender un peptido o polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, o 250 restos de aminoacidos contiguos de la secuencia de aminoacidos de la molecula de union.

La expresion "molecula de union", tal como se usa en el presente documento, incluye todas las clases y subclases de inmunoglobulinas conocidas en la tecnica. Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las moleculas de union pueden dividirse en las cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas clases se puede subdividir en subclases (isotipos), por ejemplo, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Los fragmentos de union a antlgeno incluyen, entre otras cosas, fragmentos Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, de regiones determinantes de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos bivalentes monocatenarios, anticuerpos de fago monocatenarios, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, (poli)peptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir union a antlgeno especlfica al (poli)peptido, etc. Los fragmentos anteriores pueden producirse sinteticamente o mediante escision enzimatica o qulmica de inmunoglobulinas o pueden modificarse geneticamente mediante tecnicas de ADN recombinante. Los metodos de produccion son de sobra conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow y D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, que se incorpora al presente documento por referencia. Una molecula de union o un fragmento de union a antlgeno de la misma puede tener uno o mas sitios de union. En caso de haber mas de un sitio de union, los sitios de union pueden ser identicos entre si o pueden ser diferentes.

La molecula de union puede ser una molecula de union desnuda o no conjugada pero tambien puede formar parte de un inmunoconjugado. Una molecula de union desnuda o no conjugada pretende hacer referencia a una molecula de union que no esta conjugada, unida operativamente o de otro modo asociada flsica o funcionalmente con un resto efector o un marcador, tal como, entre otras cosas, a una sustancia toxica, una sustancia radiactiva, un liposoma, una enzima. Se entendera que las moleculas de union desnudas o no conjugadas no excluyen moleculas de union que se han estabilizado, multimerizado, humanizado o de cualquier otro modo manipulado, aparte de por la union de un resto efector o de un marcador. Por consiguiente, en el presente documento se incluyen todas las

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moleculas de union no conjugadas desnudas modificadas post-traduccionalmente, incluyendo casos donde las modificaciones se efectuan en el ambiente natural de la celula productora de la molecula de union, por una celula recombinante productora de la molecula de union, y se introducen mediante intervention humana despues de la preparation inicial de la molecula de union. Por supuesto, la expresion molecula de union desnuda o no conjugada no excluye la capacidad de la molecula de union para formar asociaciones funcionales con celulas y/o moleculas efectoras despues de su administration al organismo, ya que algunas de dichas interacciones son necesarias para producir un efecto biologico. Por lo tanto, por definition, se aplica la ausencia de grupo efector o de marcador a la molecula de union desnuda o no conjugada in vitro, no in vivo.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "muestra biologica" abarca una diversidad de tipos de muestra, incluyendo muestras de sangre y de otros fluidos de origen biologico, muestras de tejido solido, tales como especlmenes de biopsia o cultivos de tejidos, o celulas procedentes de los mismos y la descendencia de las mismas. El termino tambien incluye muestras que se han manipulado de cualquier modo despues de su obtencion, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilization, o enriquecimiento respecto de determinados componentes, tales como protelnas o polinucleotidos. El termino abarca diversos tlpicos de muestras cllnicas obtenidas de cualquier especie, y tambien incluye celulas en cultivo, sobrenadantes celulares y lisados celulares.

La expresion "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR), tal como se usa en el presente documento, significa secuencias dentro de las regiones variables de las moleculas de union, tales como las inmunoglobulinas, que normalmente contribuyen en gran medida al sitio de union a antlgeno que es complementario en cuanto a forma y distribution de carga al epltopo reconocido sobre el antlgeno. Las regiones CDR pueden ser especlficas para epltopos lineales, epltopos discontinuos, o epltopos conformacionales de protelnas o fragmentos de protelnas, ya esten presentes en la protelna en su conformation nativa o, en algunos casos, presente en las protelnas en estado desnaturalizado, por ejemplo, mediante solubilizacion en SDS. Los epltopos tambien pueden consistir en modificaciones postraduccionales de las protelnas.

El termino "elimination", tal como se usa en el presente documento, indica un cambio en la secuencia de aminoacidos o de nucleotidos en la que uno o mas restos de aminoacidos o de nucleotidos, respectivamente, estan ausentes en comparacion con la molecula de referencia, normalmente de origen natural.

La expresion "secuencia de acido nucleico reguladora de la expresion" tal como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de polinucleotidos necesarias para y/o que afectan a la expresion de una secuencia codificante unida operablemente en un organismo hospedador concreto. La expresion "secuencias de acido nucleico reguladoras de la expresion", tales como, entre otras, secuencias de inicio, termination, promotoras, potenciadoras de la transcription adecuadas; secuencias represoras o activadoras; senales eficaces de procesamiento de ARN, tales como senales de corte y empalme y de poliadenilacion; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmatico; secuencias que potencian la eficacia de la traduction (por ejemplo, sitios de union a ribosomas); secuencias que potencian la estabilidad de la protelna; y cuando se desee, secuencias que potencian la secretion de la protelna, puede ser cualquier secuencia de acido nucleico que muestre actividad en el organismo hospedador elegido y puede derivarse de genes que codifican protelnas, que son homologos o heterologos para el organismo hospedador. La identification y el empleo de secuencias reguladoras de la expresion es rutinario para el experto en la materia.

La expresion "variante funcional", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula de union que comprende una secuencia de nucleotidos y/o de aminoacidos que esta alterada en uno o mas nucleotidos y/o aminoacidos en comparacion con las secuencias de nucleotidos y/o aminoacidos de la molecula de union de referencia y que es capaz de competir por la union al companero de union, es decir, el virus de la gripe, con la molecula de union de referencia. En otras palabras, las modificaciones en la secuencia de aminoacidos y/o de nucleotidos de la molecula de union de referencia no alteran o afectan de manera significativa las caracterlsticas de union de la molecula de union codificada por la secuencia de nucleotidos o que contiene la secuencia de aminoacidos, es decir, la molecula de union sigue siendo capaz de reconocer y de unirse a su diana. La variante funcional puede tener modificaciones conservativas de secuencia, incluyendo sustituciones, adiciones y eliminaciones de nucleotidos y aminoacidos. Estas modificaciones pueden introducirse mediante tecnicas convencionales conocidas en la tecnica, tales como mutagenesis de sitio dirigido y mutagenesis aleatoria mediada por la PCR, y pueden comprender nucleotidos y aminoacidos tanto naturales como no naturales.

Las sustituciones conservativas de aminoacidos incluyen aquellas en las que el resto de aminoacido se reemplaza con un resto de aminoacido que tiene propiedades estructurales o qulmicas similares. Se han definido en la tecnica familias de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistelna, triptofano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano). Sera evidente para el experto en la materia que pueden emplearse otras clasificaciones de familias de restos de aminoacidos distintas de la empleada anteriormente. Ademas, una variante puede tener sustituciones de aminoacidos no conservativas, por ejemplo, reemplazo de un aminoacido con un resto de aminoacido que tiene propiedades estructurales o qulmicas diferentes.

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Las variaciones menores similares tambien pueden incluir eliminaciones o inserciones de aminoacidos, o ambas cosas. Puede obtenerse una orientacion para determinar que restos de aminoacido pueden sustituirse, insertarse o eliminarse sin suprimir la actividad inmunologica mediante el uso de programas informaticos de sobra conocidos en la tecnica.

Una mutacion en una secuencia de nucleotidos puede ser una sola alteracion efectuada en un locus (una mutacion puntual), tal como mutaciones de transicion o transversion, o como alternativa, pueden insertarse, eliminarse o cambiarse multiples nucleotidos en un solo locus. Ademas, se pueden efectuar una o mas alteraciones en cualquier numero de locus dentro de una secuencia de nucleotidos. Las mutaciones pueden efectuarse mediante cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica.

La expresion "subtipo de virus de la gripe", tal como se usa en el presente documento en relacion a los virus de la gripe A, se refiere a variantes del virus de la gripe A que se caracterizan por varias combinaciones de las protelnas de la superficie vlrica hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). De acuerdo con la presente invencion, puede hacerse referencia a los virus de la gripe mediante su numero de H, tal como, por ejemplo, virus de la gripe que comprende HA del subtipo H1 o H3", o "virus de la gripe H1", "virus de la gripe H3", o mediante una combinacion de un numero de H y un numero de N, tal como, por ejemplo, virus de la gripe de subtipo H3N2" o "H3N2".

El termino "subtipo" de virus de la gripe incluye especlficamente todas las "cepas" de virus de la gripe individuales dentro de cada subtipo, que normalmente son el resultado de mutaciones y muestran diferentes perfiles patogenicos. Dichas cepas pueden citarse tambien como diversos "aislados" de un subtipo vlrico. Por consiguiente, tal como se usa en el presente documento, los terminos "cepas" y "aislados" pueden usarse de manera intercambiable. La nomenclatura actual para las cepas o aislados de virus de la gripe incluyen la localizacion geografica de donde se aislo por primera vez, el numero de cepa y el ano en que se aislo, normalmente con la descripcion antigenica de HA y NA proporcionada entre parentesis, por ejemplo, A/Moscow/10/00 (H3N2). Las cepas no humanas incluyen tambien el hospedador de origen en su nomenclatura.

El termino "neutralizante", tal como se usa en el presente documento en relacion a las moleculas de union de la invencion, se refiere a moleculas de union que inhiben la infeccion replicativa a una celula diana por el virus de la gripe, independientemente del mecanismo mediante el que se consigue la neutralizacion. Por lo tanto, puede lograrse la neutralizacion, por ejemplo, inhibiendo el acoplamiento o la adhesion del virus a la superficie de la celula, o inhibiendo la fusion de las membranas vlricas y celulares despues del acoplamiento del virus a la celula diana, y similares.

Las expresiones "que neutraliza de manera cruzada" o "neutralizacion cruzada", tal como se usan en el presente documento en relacion a las moleculas de union de la invencion, se refiere a la capacidad de las moleculas de union de la invencion para neutralizar diferentes subtipos de virus de la gripe A y/o B.

El termino "hospedador", tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a un organismo o una celula en la se ha introducido un vector, tal como un vector de clonacion o un vector de expresion. El organismo o la celula puede ser procariota o eucariota. Preferentemente, las celulas hospedadoras aisladas del hospedador, por ejemplo, celulas hospedadoras en cultivo. La expresion "celulas hospedadoras" significa simplemente que las celulas se modifican para la (sobre)expresion de las moleculas de union de la invencion e incluyen celulas B que expresan originalmente estas moleculas de union, habiendose modificado estas celulas para que sobreexpresen la molecula de union mediante inmortalizacion, amplification, potenciacion de la expresion, etc. Debe entenderse que el termino hospedador pretende hacer referencia no solo al organismo o celula objeto, sino tambien a la descendencia de dicho organismo o celula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones posteriores debido a mutaciones o a influencias ambientales, dicha descendencia puede no ser, de hecho, identica al organismo o celula progenitora, pero aun as! se incluyen dentro del alcance del termino "hospedador", tal como se usa en el presente documento.

El termino "humano", cuando se aplica a moleculas de union tal como se definen en el presente documento, se refiere a moleculas que bien proceden directamente de un ser humano o que se basan en una secuencia de llnea germinal humana. Cuando una molecula de union procede o esta basada en una secuencia humana y se modifica posteriormente, aun se considera humana, tal como se usa a lo largo de la memoria descriptiva. En otras palabras, el termino humano, cuando se aplica a moleculas de union, pretende incluir moleculas de union que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de llnea germinal humana o basadas en regiones variables o constantes presentes en un ser humano o un linfocito humano y que se modifican de algun modo. Por lo tanto, las moleculas de union humanas pueden incluir restos de aminoacidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de llnea germinal humana, comprender sustituciones y/o eliminaciones (por ejemplo, mutaciones introducidas, por ejemplo, mediante mutagenesis aleatoria o de sitio especlfico in vitro o mediante mutacion somatica in vivo). "Basado en", tal como se usa en el presente documento, se refiere a aquella situation en la que un acido nucleico pueda ser una copia exacta a partir de un molde, o con mutaciones menores, tales como mediante metodos de PCR propensa a errores, o producido sinteticamente imitando de manera exacta al molde o con modificaciones menores.

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El termino "insercion", tambien conocido como el termino "adicion", indica un cambio en una secuencia de aminoacidos o de nucleotidos que da como resultado la adicion de uno o mas restos de aminoacidos o de nucleotidos, respectivamente, en comparacion con la secuencia progenitora.

El termino "aislado", cuando se aplica a moleculas de union tal como se definen en el presente documento, se refiere a moleculas de union que se encuentran sustancialmente libres de otras protelnas o polipeptidos, en particular, libres de otras moleculas de union que tengan especificidades antigenicas diferentes, y que tambien se encuentran sustancialmente libres de otros materiales celulares y/o agentes qulmicos. Por ejemplo, cuando se producen de manera recombinante las moleculas de union, preferentemente se encuentran sustancialmente libres de componentes del medio de cultivo, y cuando las moleculas de union se producen mediante slntesis qulmica, preferentemente se encuentran sustancialmente libres de precursores qulmicos u otros agentes qulmicos, es decir, se separan de los precursores qulmicos u otros agentes qulmicos que estan implicados en la slntesis de la protelna. El termino "aislado" cuando se aplica a moleculas de acido nucleico que codifican moleculas de union tal como se definen en el presente documento, pretende hacer referencia a moleculas de acido nucleico en las que secuencias de nucleotidos que codifican las moleculas de union se encuentran libres de otras secuencias de nucleotidos, en particular, secuencias de nucleotidos que codifican moleculas de union que se unen a otros companeros de union. Ademas, el termino "aislado" se refiere a moleculas de acido nucleico que se encuentran sustancialmente separadas de otros componentes que acompanan naturalmente a la molecula de acido nucleico nativa en el hospedador natural, por ejemplo, ribosomas, polimerasas, o secuencias genomicas con las que se asocia naturalmente. Ademas, las moleculas de acido nucleico "aisladas", tales como moleculas de ADNc, pueden encontrarse sustancialmente libres de otro material celular, o medio de cultivo cuando se producen mediante tecnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores qulmicos u otros compuestos qulmicos cuando se sintetizan qulmicamente.

La expresion "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una preparacion de moleculas de anticuerpo con una sola especificidad. Un anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad y afinidad de union por un epltopo particular. Por consiguiente, la expresion "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a un anticuerpo que muestra una sola especificidad de union que tiene regiones variables y constantes procedentes de o basadas en secuencias de inmunoglobulina de llnea germinal humana o que proceden de secuencias completamente sinteticas. El metodo para preparar el anticuerpo monoclonal no es relevante para la especificidad de union.

La expresion "de origen natural", tal como se usa en el presente documento aplicada a un objeto, se refiere al hecho de que el objeto o compuesto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipeptido o de polinucleotido que este presente en un organismo que pueda aislarse de una fuente natural y que no se haya modificado por el ser humano de manera intencionada en un laboratorio es de origen natural.

La expresion "molecula de acido nucleico", tal como se usa en la presente invencion, se refiere a una forma polimerica de nucleotidos e incluye hebras tanto codificantes como no codificantes de ARN, ADNc, ADN genomico, y formas sinteticas y pollmeros mixtos de las anteriores. Un nucleotido se refiere a un ribonucleotido, desoxinucleotido o a una forma modificada de cualquier tipo de nucleotido. El termino tambien incluye formas de ADN mono y bicatenario. Ademas, un polinucleotido puede incluir cualquiera de o tanto nucleotidos de origen natural como modificados unidos entre si mediante enlaces nucleotldicos de origen natural y/o de origen no natural. Las moleculas de acido nucleico pueden modificarse qulmica o bioqulmicamente o pueden contener bases de nucleotidos no naturales o derivatizadas, tal como apreciaran facilmente los expertos en la materia. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilacion, sustitucion de uno o mas de los nucleotidos de origen natural con un analogo, modificaciones internucleotido, tales como enlaces cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipeptidos), intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes, y enlaces modificados (por ejemplo, acidos nucleicos alfa-anomericos, etc.). Se pretende que el termino anterior incluya cualquier formation topologica, incluyendo conformaciones monocatenarias, bicatenarias, parcialmente bicatenarias, en horquilla, circulares y en candado. Tambien se incluyen moleculas sinteticas que imiten a los polinucleotidos en su capacidad para unirse a una secuencia designada mediante enlace de hidrogeno y otras interacciones qulmicas. Dichas moleculas se conocen en la tecnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que los enlaces fosfato se sustituyen con enlaces peptldicos en el armazon de la molecula. Una referencia a una secuencia de acido nucleico abarca su complemento, a menos que se especifique lo contrario. Por lo tanto, debe entenderse que una referencia a una molecula de acido nucleico que tiene una secuencia concreta abarca su hebra complementaria, con su secuencia complementaria. La hebra complementaria tambien es util, por ejemplo, para la terapia antisentido, sondas de hibridacion y cebadores para la PCR.

La expresion "unido operablemente" se refiere a dos o mas elementos de secuencia de acido nucleico que normalmente estan unidos flsicamente y se encuentran en una relation funcional entre si. Por ejemplo, un promotor esta unido operablemente a una secuencia codificante, si el promotor es capaz de iniciar o regular la transcription o la expresion de una secuencia codificante, en cuyo caso la secuencia codificante debe entenderse como "bajo el control" del promotor.

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Por "excipiente farmaceuticamente aceptable" se entiende cualquier sustancia inerte que se combine con una molecula activa, tal como un farmaco, agente, o molecula de union para preparar una forma de dosificacion aceptable o conveniente. El "excipiente farmaceuticamente aceptable" es un excipiente que no es toxico para los receptores a las dosis y concentraciones usadas, y que es compatible con otros ingredientes de la formulacion que comprende el farmaco, el agente o la molecula de union. Los excipientes farmaceuticamente aceptables se aplican y conocen ampliamente en la tecnica.

La expresion "se une especlficamente", tal como se usa en el presente documento, en referencia a la interaction de una molecula de union, por ejemplo, un anticuerpo, y su companero de union, por ejemplo, un antlgeno, significa que la interaccion es dependiente de la presencia de una estructura concreta, por ejemplo, un determinante antigenico o epltopo, en el companero de union. En otras palabras, el anticuerpo se une o reconoce preferencialmente al companero de union, incluso cuando el companero de union esta presente en una mezcla de otras moleculas u organismos. La union puede estar mediada por interacciones covalentes o no covalentes o por una combination de ambas. En otras palabras, la expresion "se une especlficamente" significa una union inmunoespeclfica a un determinante antigenico o epltopo y ausencia de union inmunoespeclfica a otros determinantes antigenicos o epltopos. Una molecula de union que se une inmunoespeclficamente a un antlgeno puede unirse a otros peptidos o polipeptidos con una menor afinidad segun se determina mediante, por ejemplo, radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunoadsorbentes acoplados a enzimas (ELISA), BIACORE, u otros ensayos conocidos en la tecnica. Las moleculas de union o los fragmentos de las mismas que se unen inmunoespeclficamente a un antlgeno pueden tener reactividad cruzada con antlgenos relacionados, que portan el mismo epltopo. Preferentemente, las moleculas de union o los fragmentos de las mismas que se unen inmunoespeclficamente a un antlgeno no tienen reactividad cruzada con otros antlgenos.

Una "sustitucion", tal como se usa en el presente documento, indica el reemplazo de uno o mas aminoacidos o nucleotidos con otros aminoacidos o nucleotidos diferentes, respectivamente.

La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de la molecula de union tal como se define en el presente documento que es eficaz para prevenir, mejorar y/o tratar una afeccion resultante de la infection con un virus de la gripe B. Mejora, tal como se usa en el presente documento, puede referirse a la reduction de los slntomas de la enfermedad visibles o perceptibles, de la viremia, o cualquier otra manifestation medible de la infeccion por gripe.

El termino "tratamiento" se refiere al tratamiento terapeutico, as! como a las medidas profilacticas o preventivas para curar o detener o al menos retrasar el progreso de la enfermedad. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padezcan una afeccion resultante de la infeccion por el virus de la gripe, as! como aquellos en los que se va a prevenir la infeccion por el virus de la gripe. Los sujetos que se hayan recuperado parcial o totalmente de la infeccion por el virus de la gripe tambien pueden necesitar tratamiento. La prevention abarca inhibir o reducir la diseminacion del virus de la gripe o inhibir o reducir la aparicion, el desarrollo o la progresion de uno o mas de los slntomas asociados con la infeccion por el virus de la gripe.

El termino "vector" indica una molecula de acido nucleico en la que puede insertarse una segunda secuencia de acido nucleico para su introduction en un hospedador donde se replicara, y en algunos casos expresara. En otras palabras, un vector es capaz de transportar una molecula de acido nucleico a la que se ha unido. Los vectores de donation, as! como los de expresion estan contemplados por el termino "vector", tal como se usa en el presente documento. Los vectores incluyen, pero sin limitation, plasmidos, cosmidos, cromosomas bacterianos artificiales (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC) y vectores derivados de bacteriofagos o de virus de plantas o animales (incluyendo seres humanos). Los vectores comprenden un origen de replication reconocido por el hospedador propuesto y en el caso de los vectores de expresion, un promotor y otras regiones reguladoras reconocidas por el hospedador. Un vector que contiene una segunda molecula de acido nucleico se introduce en una celula mediante transformation, transfection, o mediante el uso de los mecanismos de entrada vlrica. Determinados vectores son capaces de replicarse de manera autonoma en un hospedador en el que se introducen (por ejemplo, los vectores que tienen un origen de replicacion bacteriano pueden replicarse en bacterias). Pueden integrarse otros vectores en el genoma de un hospedador tras su introduccion en el hospedador, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador.

Description detallada

En un primer aspecto, la presente invention abarca moleculas de union capaces de unirse especlficamente a hemaglutinina (HA) de subtipos de virus de la gripe A del grupo filogenetico 1 y subtipos del virus de la gripe A del grupo filogenetico 2, tal como se define en las reivindicaciones. En una realization, las moleculas de union son capaces de neutralizar los subtipos de virus de la gripe A tanto del grupo filogenetico 1 como del grupo filogenetico 2. Por lo tanto, las moleculas de union de la invencion son unicas en tanto que son capaces de neutralizar de manera cruzada tanto a cepas de virus de la gripe A del grupo 1 como a cepas del virus de la gripe A del grupo 2. En una realizacion, las moleculas de union son capaces de neutralizar a al menos uno o mas, preferentemente a dos o mas, preferentemente a tres o mas, preferentemente a cuatro o mas, aun mas preferentemente a cinco o mas subtipos de virus de la gripe A del grupo 1 seleccionados entre el grupo que consiste en los subtipos H1, H2, H5, H6,

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H8, H9 y H11, y a al menos uno o mas, preferentemente a dos o mas, preferentemente a tres o mas subtipos de virus de la gripe A del grupo 2 seleccionados entre el grupo que consiste en los subtipos H3, H4, H7, y H10. De acuerdo con la invention, las moleculas de union son capaces de unirse especlficamente a hemaglutinina (HA) de subtipos del virus de la gripe B. En otra realization, las moleculas de union son capaces de neutralizar a virus de la gripe B. En una realizacion, las moleculas de union son capaces de neutralizar in vivo a virus de la gripe A y/o B. Las cepas de virus de la gripe A y B pueden ser cepas de virus de la gripe tanto humanas como no humanas (es decir, obtenidas de animales no humanos, por ejemplo, aves).

Preferentemente, las moleculas de union son moleculas de union humanas. En una realizacion preferida, las moleculas de union son anticuerpos humanos, o fragmentos de union a antlgeno de los mismos.

En una realizacion, las moleculas de union proceden del gen de llnea germinal VH1-69. Por lo tanto, todas las moleculas de union usan el mismo armazon codificado por la llnea germinal VH1-69.

En una realizacion, la interaction de union de las moleculas de union, preferentemente el anticuerpo, y HA esta mediada exclusivamente por secuencias variables de cadena pesada.

En una realizacion, las moleculas de union comprenden una CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 133 o SEQ ID NO: 139, una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 140 o SEQ ID NO: 151, y una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 161, y SEQ ID NO: 162. Las regiones CDR de las moleculas de union de la invencion se muestran en la tabla 7. Las regiones CDR son de acuerdo con Kabat et al., (1991) tal como se describe en Sequences of Proteins of Immunological Interest.

Los virus de la gripe infectan a las celulas uniendose a restos de acido sialico sobre la superficie de las celulas diana, y la posterior transferencia a endosomas, mediante la fusion de sus membranas con las membranas endosomicas y la liberation del complejo genoma-transcriptasa al interior de la celula. Los procesos tanto de union al receptor como de fusion de la membrana estan mediados por la glucoprotelna HA. La hA del virus de la gripe A comprende dos regiones estructuralmente distintas, es decir, una region de cabeza globular, que contiene un sitio de union a receptor que es responsable del acoplamiento del virus a la celula diana, y que esta implicada en la actividad de hemaglutininacion de la HA, y una region de tallo, que contiene un peptido de fusion que es necesario para la fusion de membrana entre la envuelta vlrica y la membrana endosomica de la celula. La protelna HA es un trlmero en el que cada monomero consiste en dos glucopeptidos enlazados por disulfuro, HA1 y HA2, que se producen durante la infection mediante la escision proteolltica de un precursor (HA0). La escision es necesaria para la infectividad del virus, ya que es necesaria para cebar la HA para la fusion de membrana, para permitir un cambio conformacional. La activation de la molecula cebada se produce a pH bajo en los endosomas, entre pH 5 y pH 6, y requiere de cambios importantes en la estructura de la HA. Cada una de las etapas en el cebado y la activacion de la Ha para que participe en el proceso de fusion de membrana, presenta una diana diferente para la inhibition, por ejemplo, mediante anticuerpos monoclonales. En una realizacion, las moleculas de union son capaces de bloquear los cambios conformacionales inducidos por pH en la HA asociados con la fusion de membrana.

Las moleculas de union de la invencion pueden ser capaces de unirse especlficamente a la subunidad HA0, HA1 y/o HA2 de la protelna HA. Pueden ser capaces de unirse especlficamente a epltopos lineales o estructurales y/o conformacionales en la subunidad HA0, HA1 y/o HA2 de la protelna HA. La molecula de HA puede purificarse de los virus o producirse de manera recombinante y opcionalmente aislarse antes de su uso. Como alternativa, la HA puede expresarse en la superficie de celulas. En una realizacion, las moleculas de union de la invencion son capaces de unirse especlficamente a un epltopo en la region de tallo de la HA. En una realizacion, las moleculas de union se unen a un epltopo que es accesible en la conformation previa a la fusion de HA.

Las moleculas de union de la invencion pueden ser capaces de unirse especlficamente a virus de la gripe que son viables, activos y/o infecciosos o que se encuentran en forma inactivada/atenuada. Los metodos para inactivar/atenuar virus, por ejemplo, virus de la gripe, son de sobra conocidos en la tecnica e incluyen, pero sin limitation, tratamiento con formalina, p-propiolactona (BPL), mertiolato, y/o luz ultravioleta.

Las moleculas de union de la invencion tambien pueden ser capaces de unirse especlficamente a uno o mas fragmentos de los virus de la gripe, tales como, entre otros, a una preparation de una o mas protelnas y/o (poli)peptidos, procedentes de subtipos de virus de la gripe A y/o B o a una o mas protelnas y/o polipeptidos de los virus de la gripe A y/o B producidos de manera recombinante. Puede encontrarse la secuencia de nucleotidos y/o aminoacidos de protelnas de diversas cepas de gripe A y B en la base de datos GenBank, la Base de Datos de Secuencias del Virus de la Gripe del NCBI, la Base de Datos de Secuencias de la Gripe (ISD), la base de datos del EMBL y/u otras bases de datos. Se encuentra dentro de las capacidades del experto la obtencion de dichas secuencias en las respectivas bases de datos.

En otra realizacion, las moleculas de union de la invencion son capaces de unirse especlficamente a un fragmento de las protelnas y/o polipeptidos anteriormente mencionados, en donde el fragmento comprende al menos un

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epltopo reconocido por las moleculas de union de la invencion. Un "epltopo", tal como se usa en el presente documento, es un resto que es capaz de unirse a una molecula de union de la invencion con una afinidad lo suficientemente elevada como para formar un complejo antlgeno-molecula de union detectable.

Las moleculas de union de la invencion pueden ser capaces o no de unirse especlficamente a la parte extracelular de la HA (tambien denominada en el presente documento HA soluble (sHA)).

Las moleculas de union de la invencion pueden ser moleculas de inmunoglobulina intactas, tales como anticuerpos policlonales o monoclonales, o las moleculas de union pueden ser fragmentos de union a antlgeno de las mismas, incluyendo, pero sin limitation, regiones variables de cadena pesada y ligera, fragmentos Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, de regiones determinantes de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos bivalentes monocatenarios, anticuerpos de fago monocatenarios, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, y (poli)peptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que sea suficiente para conferir union a antlgeno especlfica para las cepas del virus de la gripe o un fragmento de las mismas. En una realization preferida, las moleculas de union de la invencion son anticuerpos monoclonales humanos, y/o fragmentos de union a antlgeno de los mismos. Las moleculas de union tambien pueden ser nanocuerpos, alfacuerpos, affibodies, armazones de dominio FN3 y otros armazones basados en dominios en protelnas de repetition (humanas), tales como adnectinas, anticalinas, darpinas, etc., u otros armazones que comprenden secuencias de union a epltopos.

Las moleculas de union de la invencion pueden usarse en forma aislada o no aislada. Ademas, las moleculas de union de la invencion pueden usarse solas o en una mezcla que comprende la menos una molecula de union (o una variante o fragmento de la misma) de la invencion, y/o con otras moleculas de union que se unen a la gripe y que tienen un efecto inhibidor para el virus de la gripe. En otras palabras, las moleculas de union pueden usarse en combination, por ejemplo, en forma de una composition farmaceutica que comprende dos o mas moleculas de union de la invencion, variantes o fragmentos de las mismas. Por ejemplo, pueden combinarse moleculas de union que tengan actividades diferentes pero complementarias en un solo tratamiento para lograr un efecto profilactico, terapeutico o diagnostico deseado, pero como alternativa, tambien pueden combinarse moleculas de union que tengan actividades identicas en un solo tratamiento para lograr un efecto profilactico, terapeutico o diagnostico deseado. Opcionalmente, la mezcla comprende ademas al menos un agente terapeutico diferente. Preferentemente, el agente terapeutico, tal como, por ejemplo, inhibidores de M2 (por ejemplo, amantidina, rimantadina) y/o inhibidores de la neuraminidasa (por ejemplo, zanamavir, oseltamivir) es util en la profilaxis o y/o tratamiento de una infection por el virus de la gripe.

Tlpicamente, las moleculas de union de acuerdo con la invencion pueden unirse a sus companeros de union, es decir, un virus de la gripe A del grupo 1 (tal como H1N1) y un virus de la gripe A del grupo 2 (tal como H3N2), y/o a un virus de la gripe B, y/o a fragmentos de los mismos, con una constante de afinidad (valor de Kd) que es menor de 0,2 x 10-4 M, 1,0 x 10-5 M, 1,0 x 10-6 M, 1,0 x 10-7 M, preferentemente menor de 1,0 x 10-8 M, mas preferentemente

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menor de 1,0 x 10 M, mas preferentemente menor de 1,0 x 10 M, aun mas preferentemente menor de 1,0 x 10 M, y en particular, menor de 1,0 x 10-12 M. Las constantes de afinidad pueden variar para los isotipos de los anticuerpos. Por ejemplo, la afinidad de union para un isotipo IgM se refiere a una afinidad de union de al menos aproximadamente 1,0 x 10-7 M. Las constantes de afinidad pueden medirse, por ejemplo, usando resonancia de plasmon superficial, por ejemplo, usando el sistema BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia).

Las moleculas de union de la invencion muestran actividad neutralizante. La actividad neutralizante puede medirse, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento. Se describen ensayos alternativos que miden la actividad neutralizante, por ejemplo, en WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Ginebra: Organization Mundial de la Salud, 2005, version 2002.5.

Tlpicamente, las moleculas de union de acuerdo con la invencion tienen una actividad neutralizante de 50 pg/ml o menos, preferentemente de 20 pg/ml o menos, mas preferentemente, una actividad neutralizante de 10 pg/ml o menos, aun mas preferentemente de 5 pg/ml o menos, determinada en un ensayo de neutralization de virus (VNA) in vitro, tal como se describe en el ejemplo 6. Las moleculas de union de acuerdo con la invencion pueden unirse al virus de la gripe o a un fragmento del mismo en forma soluble, tal como, por ejemplo, en una muestra o en suspension o puede unirse a virus de la gripe o a fragmentos del mismo o unirse a un vehlculo o sustrato, por ejemplo, placas de microtitulacion, membranas y perlas, etc. Los vehlculos o sustratos pueden estar hechos de vidrio, plastico (por ejemplo, poliestireno), polisacaridos, nailon, nitrocelulosa, o teflon, etc. La superficie de dichos soportes puede ser solida o porosa y tener cualquier forma conveniente. Ademas, las moleculas de union pueden unirse al virus de la gripe en forma purificada/aislada o no purificada/no aislada.

Tal como se ha descrito anteriormente, la presente invencion se refiere a moleculas de union humanas aisladas que son capaces de reconocer y de unirse a un epltopo en la protelna hemaglutinina (HA) de la gripe, en donde dichas moleculas de union tienen actividad neutralizante contra virus de la gripe A del grupo filogenetico 1 y virus de la gripe A del grupo filogenetico 2. De acuerdo con la invencion, se ha demostrado, por lo tanto, que las moleculas de union de la presente invencion neutralizan de manera cruzada los subtipos de virus de la gripe que pertenecen a ambos grupos filogeneticos. El experto en la materia, basandose en los que se ha divulgado en el presente documento, puede determinar si un anticuerpo, de hecho, reacciona de manera cruzada con protelnas de HA de diferentes

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subtipos y tambien puede determinar si son capaces de neutralizar a los virus de la gripe de diferentes subtipos in vitro y/o in vivo.

En una realizacion, la molecula de union de acuerdo con la presente invencion se selecciona entre el grupo que consiste:

a) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: CDR2 de cadena pesada de SEQ iD NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID

b) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: CDR2 de cadena pesada de SEQ iD NO: 140, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID

c) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID

d) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: CDR2 de cadena pesada de SEQ iD NO: 151, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID

e) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: CDR2 de cadena pesada de SEQ iD NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID

f) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 151, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID

g) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: CDR2 de cadena pesada de SEQ iD NO: 151, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID

h) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: CDR2 de cadena pesada de SEQ iD NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID

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una region

NO:

135,

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una region

NO:

141,

139,

una region

NO:

145,

139,

una region

NO:

152,

139,

una region

NO:

152,

139,

una region

NO:

161,

139,

una region

NO:

162, y

139,

una region

NO:

141.

En una realizacion preferida, la molecula de union comprende una region CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 145 o SEQ ID NO: 152.

En otra realizacion, las moleculas de union humanas de acuerdo con la invencion se seleccionan entre el grupo que consiste en:

a) una molecula de union que tiene una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 133, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 135, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 136, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 137, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 138,

b) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 140, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 141, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 142, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 143, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 144,

c) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 145, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 146, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 174, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 147,

d) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 145, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 148, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 149, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 150,

e) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 151, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 153, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 154, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 155,

f) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CdR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 148, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 149, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 150,

g) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 156, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 157, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 158,

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h) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 148, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 159, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 160, i) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region cDr2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 151, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 161, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 142, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 143, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 144, j) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 151, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 162, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 163, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 164, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 165, k) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 166, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 167, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 168, l) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region cDr2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 169, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 149, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 150, m) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 141, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 163, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 169, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 170, n) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region cDr2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ Id NO: 171, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 164, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 172, o) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 145, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 142, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 143, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 173, y p) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CdR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 142, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 143, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 144.

En otra realizacion, las moleculas de union humanas de acuerdo con la invencion se seleccionan entre el grupo que

consiste en:

a) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 145, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 146, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 174, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 147,

b) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 171, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 164, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 172,

c) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 145, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 142, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 143, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 173, y

d) una molecula de union que comprende una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, una region CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 142, una region CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 143, y una region CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 144.

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En otra realizacion, la molecula de union de acuerdo con la invencion se selecciona entre el grupo que consiste en

a) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 2,

b) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 6,

c) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 10,

d) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14,

e) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 18,

f) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 22,

g) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 26,

h) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 30,

i) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 34,

j) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 38,

k) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 42,

l) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 46,

m) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 50,

n) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 54,

o) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 58, y

p) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 62. En una realizacion, la molecula de union de acuerdo con la invencion se selecciona entre el grupo que consiste en una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 10, una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 54, una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 58, y una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 62.

En una realizacion adicional, las moleculas de union de acuerdo con la invencion comprenden una region variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60, y SEQ ID NO: 64.

En otra realizacion mas, la molecula de union se selecciona entre el grupo que consiste en

a) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 2 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 4,

b) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 6 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 8,

c) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 12,

d) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 14 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 16,

e) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 18 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 20,

f) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 22 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 24,

g) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 26 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 28,

h) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 30 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 32,

i) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 34 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 36,

j) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 38 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 40,

k) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 42 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 44,

l) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 46 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 48,

m) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 50 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 52,

n) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 54 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 56,

o) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 58 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 60, y

p) una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 62 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 64.

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En una realizacion, las moleculas de union humanas de acuerdo con la invencion se seleccionan entre el grupo que consiste en: una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 10 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 12, una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 54 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 56, una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 58 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 60, y una molecula de union que comprende una region variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 62 y una region variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 64.

En una realizacion preferida, las moleculas de union de acuerdo con la invencion son para su uso como medicamento, y preferentemente para su uso en el tratamiento diagnostico, terapeutico y/o profilactico de la infeccion por gripe causada por virus de la gripe A y/o B. Preferentemente, el virus de la gripe que causa la infeccion por gripe y que puede tratarse usando las moleculas de union de la presente invencion es un virus de la gripe A del grupo filogenetico 1 y/o 2, y/o un virus de la gripe B. La presente invencion se refiere tambien a una composicion farmaceutica que comprende al menos una molecula de union de acuerdo con la invencion, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

En otra realizacion mas, la invencion se refiere al uso de una molecula de union de acuerdo con la invencion en la preparacion de un medicamento para el diagnostico, profilaxis, y/o tratamiento de una infeccion por el virus de la gripe. Dichas infecciones pueden producirse en pequenas poblaciones, pero tambien pueden diseminarse por todo el mundo en epidemias estacionales o, aun peor, en pandemias globales donde millones de individuos se encuentran en riesgo. La invencion proporciona moleculas de union que pueden neutralizar la infeccion por cepas de gripe que causan dichas epidemias estacionales, as! como potenciales pandemias. De manera importante, ahora puede preverse la proteccion y el tratamiento con las moleculas de union de la presente invencion en relacion a varios subtipos de la gripe ya que se ha divulgado que las moleculas de union de la presente invencion son capaces de neutralizar de manera cruzada diversos subtipos tanto del grupo filogenetico 1, que abarca los subtipos H1, H2, H5, H6, H8, H9 y H11 como del grupo filogenetico 2, que abarca los subtipos H3, H4, H7 y H10, as! como subtipos de la gripe B.

Otro aspecto de la presente invencion incluye variantes funcionales de las moleculas de union tal como se han definido en el presente documento. Se considera que las moleculas son variantes funcionales de una molecula de union de acuerdo con la invencion, en caso de que las variantes sean capaces de competir por la union especlfica a un virus de la gripe o un fragmento del mismo con las moleculas de union "parentales" o "de referenda". En otras palabras, se considera que las moleculas son variantes funcionales de una molecula de union de acuerdo con la invencion cuando las variantes funcionales siguen siendo capaces de unirse al mismo epltopo solapante del virus de la gripe o un fragmento del mismo. En lo respecta a la presente solicitud "parental" y "de referenda" se usaran como sinonimos, lo que significa que la informacion de la molecula de referencia o parental, o la molecula flsica en si, puede formar la base para la variacion. Las variantes funcionales incluyen, pero sin limitacion, derivados que son sustancialmente similares en su secuencia estructural principal, incluyendo aquellos que tienen modificaciones en el receptor Fc u otras regiones implicadas con las funciones efectoras, y/o que contienen, por ejemplo, modificaciones in vitro o in vivo, qulmicas y/o bioqulmicas, que no se encuentran en la molecula de union parental. Dichas modificaciones incluyen, entre otras, la acetilacion, acilacion, union covalente de un nucleotido o derivado de nucleotido, union covalente de un llpido o un derivado lipldico, reticulacion, formacion de enlaces disulfuro, glucosilacion, hidroxilacion, metilacion, oxidacion, pegilacion, procesamiento proteolltico, fosforilacion, y similares. Como alternativa, las variantes funcionales pueden ser moleculas de union tal como se definen en la presente invencion que comprenden una secuencia de aminoacidos que contiene sustituciones, inserciones, eliminaciones o combinaciones de las mismas de uno o mas aminoacidos en comparacion con las secuencias de aminoacidos de las moleculas de union parentales. Ademas, las variantes funcionales pueden comprender truncamientos de la secuencia de aminoacidos en uno o en ambos de los extremos amino o carboxilo. Las variantes funcionales de acuerdo con la invencion pueden tener afinidades de union iguales o diferentes, ya sean mayores o menores, en comparacion con la molecula de union parental pero que son capaces aun de unirse al virus de la gripe o a un fragmento del mismo. Por ejemplo, las variantes funcionales de acuerdo con la invencion pueden tener afinidades de union aumentadas o reducidas pro un virus de la gripe o un fragmento del mismo en comparacion con las moleculas de union parentales. Preferentemente, las secuencias de aminoacidos de las regiones variables, incluyendo, pero sin limitacion, regiones marco conservadas, regiones hipervariables, en particular regiones CDR3, se encuentran modificadas. En general, las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada comprenden tres regiones hipervariables, que comprenden tres CDR, y regiones mas conservadas, las denominadas regiones marco conservadas (FR). Las regiones hipervariables comprenden restos de aminoacidos de las CDR y restos de aminoacidos de los bucles hipervariables. Las variantes funcionales que se pretende que se encuentren dentro del alcance de la presente invencion tienen de al menos aproximadamente un 50 % a al menos aproximadamente un 99 %, preferentemente de al menos aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 99 %, mas preferentemente de al menos aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 99 %, aun mas preferentemente de al menos aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 99 %, lo mas preferentemente de al menos aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 99 %, en particular, de al menos aproximadamente un 95 % a aproximadamente un 99 %, y en particular de al menos un 97 % a al menos un 99 % de identidad y/u homologla de secuencia de aminoacidos con las moleculas de union parentales tal como se definen en el presente documento. Pueden usarse algoritmos informaticos, tales como, entre otros, Gap o Bestfit, conocidos para los expertos en la materia, para

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alinear de manera optima secuencias de aminoacidos para compararlas y para definir restos de aminoacidos similares o identicos. Pueden obtenerse variantes funcionales alterando las moleculas de union parentales o partes de las mismas mediante metodos de biologla molecular conocidos en la tecnica incluyendo, pero sin limitacion, PCR propensa a errores, mutagenesis dirigida por oligonucleotidos, mutagenesis de sitio dirigido y/o reordenamientos de cadena pesada y/o ligera. En una realizacion, las variantes funcionales de la invencion tienen actividad neutralizante contra virus de la gripe A del grupo 1 y del grupo 2, y/o virus de la gripe B. La actividad neutralizante puede ser identica, o mayor o menor en comparacion con las moleculas de union parentales. En lo sucesivo, cuando se emplee el termino molecula de union (humana), este tambien abarca variantes funcionales de la molecula de union (humana). Se conocen en la tecnica ensayos para verificar si una molecula de union variante tiene actividad neutralizante (vease WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Ginebra: Organizacion Mundial de la Salud, 2005 version 2002.5).

En otro aspecto mas, la invencion incluye inmunoconjugados, es decir, moleculas que comprenden al menos una molecula de union tal como se define en el presente documento y que ademas comprenden al menos un marcador, tal como, entre otros, un resto/agente detectable. Tambien se contemplan en la presente invencion mezclas de inmunoconjugados de acuerdo con la invencion o mezclas de al menos un inmunoconjugado de acuerdo con la invencion y otra molecula, tal como un agente terapeutico u otra molecula de union o inmunoconjugado. En una realizacion adicional, los inmunoconjugados de la invencion pueden comprender mas de un marcador. Estos marcadores pueden ser iguales o distintos entre si y pueden unirse/conjugarse de manera no covalente a las moleculas de union. Los marcadores tambien pueden unirse/conjugarse conjuntamente a las moleculas de union humanas mediante union covalente. Como alternativa, los marcadores pueden unirse/conjugarse a las moleculas de union mediante uno o mas compuestos enlazadores. Las tecnicas para conjugar marcadores a moleculas de union son de sobra conocidas para el experto en la materia.

Los marcadores de los inmunoconjugados de la presente invencion pueden ser agentes terapeuticos, pero tambien pueden ser restos/agentes detectables. Los marcadores adecuados en el tratamiento y/o prevencion pueden ser toxinas o partes funcionales de las mismas, antibioticos, enzimas, otras moleculas de union que potencian la fagocitosis o la estimulacion inmunitaria. Los inmunoconjugados que comprenden un agente detectable pueden usarse de manera diagnostica para, por ejemplo, evaluar si un sujeto se ha infectado con un virus de la gripe o para controlar el desarrollo o la progresion de una infeccion por el virus de la gripe como parte de un procedimiento de ensayo cllnico para, por ejemplo, determinar la eficacia de un regimen de tratamiento dado. Sin embargo, tambien pueden usarse con otros fines de detection y/o anallticos y/o diagnosticos. Los restos/agentes detectables incluyen, pero sin limitacion, enzimas, grupos prosteticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, metales emisores de positrones, e iones metalicos paramagneticos no radiactivos. Los marcadores usados para marcar las moleculas de union con fines de deteccion y/o anallticos y/o diagnosticos dependen de las tecnicas y/o metodos de deteccion/analisis/diagnostico especlficos empleados, tales como, entre otros, tincion inmunohistoqulmica de muestras (de tejido), deteccion por citometrla de flujo, deteccion citometrica de barrido laser, inmunoensayos de fluorescencia, ensayos inmunoadsorbentes acoplados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), bioensayos (por ejemplo, ensayos de fagocitosis), aplicaciones de transferencia de Western, etc. Los marcadores adecuados para las tecnicas y/o metodos de deteccion/analisis/diagnostico conocidos en la tecnica se encuentran dentro del alcance del experto en la materia.

Ademas, las moleculas de union humanas o los inmunoconjugados de la invencion tambien pueden unirse a soportes solidos, que son particularmente utiles para inmunoensayos in vitro o para la purification de virus de la gripe o fragmentos de los mismos. Dichos soportes solidos pueden ser porosos o no porosos, planares o no planares. Las moleculas de union de la presente invencion pueden fusionarse a secuencias marcadoras, tales como un peptido para facilitar la purificacion. Los ejemplos incluyen, pero sin limitacion, el marcador de hexa-histidina, el marcador de hemaglutinina (HA), el marcador myc o el marcador flag. Como alternativa, puede conjugarse un anticuerpo a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo. En otro aspecto, las moleculas de union de la invencion pueden conjugarse/acoplarse a uno o mas antlgenos. Preferentemente, estos antlgenos son antlgenos reconocidos por el sistema inmunitario de un sujeto al que se administra el conjugado de molecula de union-antlgeno. Los antlgenos pueden ser identicos, pero tambien pueden diferir entre si. Son de sobra conocidos los metodos de conjugation para acoplar antlgenos y moleculas de union e incluyen, pero sin limitacion, el uso de agentes reticulantes. Las moleculas de union de la invencion se uniran a la HA del virus de la gripe y los antlgenos unidos a las moleculas de union iniciaran un potente ataque de celulas T sobre el conjugado, que en ultima instancia dara lugar a la destruction del virus de la gripe.

Despues de producir inmunoconjugados qulmicamente mediante conjugacion, directa o indirectamente, mediante, por ejemplo, un enlazador, pueden producirse los inmunoconjugados en forma de protelnas de fusion que comprenden las moleculas de union de la invencion y un marcador adecuado. Las protelnas de fusion pueden producirse mediante metodos conocidos en la tecnica, tales como, por ejemplo, de manera recombinante construyendo moleculas de acido nucleico que comprenden secuencias de nucleotidos que codifican las moleculas de union en fase con secuencias de nucleotidos que codifican el marcador o los marcadores adecuados y despues expresando las moleculas de acido nucleico.

Otro aspecto de la presente invencion es proporcionar una molecula de acido nucleico que codifica al menos una

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molecula de union, una variante funcional o un inmunoconjugado de acuerdo con la invencion. Dichas moleculas de acido nucleico pueden usarse como intermedios con fines de clonacion, por ejemplo, en el proceso de maduracion por afinidad, tal como se ha descrito anteriormente. En una realization preferida, las moleculas de acido nucleico estan aisladas o purificadas.

El experto en la materia apreciara que tambien se pretende que las variantes funcionales de estas moleculas de acido nucleico formen parte de la presente invencion. Las variantes funcionales son secuencias de acido nucleico que pueden traducirse directamente, usando el codigo genetico convencional, para proporcionar una secuencia de aminoacidos identica a aquella traducida a partir de las moleculas de acido nucleico parentales.

Preferentemente, las moleculas de acido nucleico codifican moleculas de union que comprenden las regiones CDR tal como se han descrito anteriormente. En una realizacion adicional, las moleculas de acido nucleico codifican moleculas de union que comprenden dos, tres, cuatro, cinco o incluso las seis regiones CDR de las moleculas de union de la invencion.

En otra realizacion, las moleculas de acido nucleico codifican moleculas de union que comprenden una cadena pesada que comprende las secuencias de region variable de cadena pesada descritas anteriormente. En otra realizacion, las moleculas de acido nucleico codifican moleculas de union que comprenden una cadena ligera que comprende las secuencias de region variable de cadena ligera descritas anteriormente. Las secuencias de nucleotidos y las secuencias de aminoacidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de las moleculas de union de la invencion se proporcionan mas adelante.

Otro aspecto de la invencion es proporcionar vectores, es decir, construcciones de acido nucleico, que comprenden una o mas moleculas de acido nucleico de acuerdo con la presente invencion. Los vectores pueden derivarse de plasmidos, tales como, entre otros, F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti, etc; cosmidos; fagos, tales como lambda, lambdoides, M13, Mu, P1, P22, Qp, T-par, T-impar, t2, T4, T7, etc; virus de plantas. Los vectores pueden usarse para la clonacion y/o la expresion de las moleculas de union de la invencion y pueden incluso usarse con fines de terapia genica. Los vectores que comprenden una o mas moleculas de acido nucleico de acuerdo con la invencion unidas operablemente a una o mas moleculas de acido nucleico reguladoras de la expresion tambien estan abarcados por la presente invencion. La election del vector depende de los procedimientos recombinantes seguidos y del hospedador empleado. La introduction de vectores en celulas hospedadoras puede efectuarse mediante, entre otros, transfection con fosfato de calcio, infection vlrica, transfection mediada por DEAE-dextrano, transfection con lipofectamina o electroporation. Los vectores pueden tener replication autonoma o pueden replicarse junto con el cromosoma en el que se han integrado. Preferentemente, los vectores contienen uno o mas marcadores de selection. La eleccion de los marcadores puede depender de las celulas hospedadoras seleccionadas, aunque esto no es crltico para la invencion, como bien saben los expertos en la materia. Estos incluyen, pero sin limitation, kanamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeocina, el gen de timidina cinasa del virus Herpes simplex (HST- TK), y el gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) de raton. Tambien estan abarcados por la invencion los vectores que comprenden una o mas moleculas de acido nucleico que codifican las moleculas de union humanas tal como se han descrito anteriormente unidos operablemente a una o mas moleculas de acido nucleico que codifican protelnas o peptidos que pueden usarse para aislar las moleculas de union humanas. Estas protelnas o peptidos incluyen, pero sin limitacion, glutation-S-transferasa, protelna de union a maltosa, polihistidina de union a metales, protelna fluorescente verde, luciferasa y beta-galactosidasa.

Los hospedadores que contienen una o mas copias de los vectores mencionados anteriormente son un objeto adicional de la presente invencion. Preferentemente, los hospedadores son celulas hospedadoras. Las celulas hospedadoras incluyen, pero sin limitacion, celulas de origen de mamlfero, vegetal, de insecto, fungico o bacteriano. Las celulas bacterianas incluyen, pero sin limitacion, celulas de bacterias Gram-positivas o de bacterias Gram- negativas, tales como varias especies de los generos Escherichia, tales como E. coli, y Pseudomonas. Del grupo de las celulas fungicas, se usan preferentemente celulas de levadura. La expresion en levaduras puede lograrse mediante el uso de cepas de levadura tales como, entre otras, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y Hansenula polymorpha. Ademas, pueden usarse como celulas hospedadoras celulas de insecto, tales como celulas de Drosophila y Sf9. Aparte de esto, las celulas hospedadoras pueden ser celulas vegetales, tales como, entre otras, celulas de plantas de cultivo, tales como plantas forestales, o celulas vegetales que proporcionan alimento y materias primas, tales como plantas de cereal, o plantas medicinales, o celulas de plantas ornamentales, o celulas de bulbos de flor. Las plantas o celulas vegetales transformadas (transgenicas) se producen mediante metodos conocidos, por ejemplo, transferencia genica mediada por Agrobacterium, transformation de discos foliares, transformation de protoplastos o mediante transferencia de ADN inducida por polietilenglicol, electroporacion, sonicacion, microinyeccion o transferencia genica biollstica. Ademas, un sistema de expresion adecuado puede ser un sistema de baculovirus. Los sistemas de expresion que usan celulas de mamlfero, tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas COS, celulas BHK, celulas NSO o celulas de melanoma Bowes se prefieren en la presente invencion. Las celulas de mamlfero proporcionan protelnas expresadas con modificaciones postraduccionales que son lo mas similares a las moleculas naturales de origen de mamlfero. Ya que la presente invencion trata acerca de moleculas que pueden tener que administrarse a seres humanos, podrla ser particularmente preferible un sistema de expresion completamente humano. Por lo tanto, incluso mas preferentemente, las celulas hospedadoras son celulas humanas. Los ejemplos de celulas humanas son, entre

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otras, celulas HeLa, 911, AT 1080, A549, 293 y HEK293T. En realizaciones preferidas, las celulas productoras humanas comprenden al menos una parte funcional de una secuencia de acido nucleico que codifica una region E1 de adenovirus en formato expresable. En realizaciones aun mas preferidas, dichas celulas hospedadoras proceden de una retina humana y se inmortalizan con acidos nucleicos que comprenden secuencias E1 adenovlricas, tales como celulas 911 o la llnea celular depositada en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretana el 29 de febrero de 1996 con el numero 96022940 y comercializadas con el nombre comercial PER.C6® (PER.C6 es una marca registrada de Crucell Holland B.V.). Para los fines de la presente solicitud "celulas PER.C6" se refiere a las celulas depositadas con el numero 96022940 o sus ancestros, pases aguas arriba o aguas abajo, as! como descendientes de ancestros de celulas depositadas, as! como derivados de cualquiera de las anteriores. La produccion de protelnas recombinantes en celulas hospedadoras puede llevarse a cabo de acuerdo con metodos de sobra conocidos en la tecnica. El uso de las celulas comercializadas con el nombre comercial PER.C6® como plataforma de produccion para protelnas de interes se ha descrito en el documento WO 00/63403, cuya divulgacion se incorpora al presente documento por referencia en su totalidad.

En otra realizacion mas, las moleculas de union de la presente invention tambien pueden producirse en mamlferos transgenicos, no humanos, tales como, entre otros, conejos, cabras o vacas, y secretarse en, por ejemplo, la leche de los mismos.

En otra realizacion alternativa mas, las moleculas de union de acuerdo con la presente invencion pueden generarse por mamlferos transgenicos no humanos, tales como, por ejemplo, ratones o conejos transgenicos que expresan genes de inmunoglobulina humana. Preferentemente, los mamlferos transgenicos no humanos tienen un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera humana que codifica la totalidad o parte de las moleculas de union humana tal como se han definido anteriormente. Los mamlferos transgenicos no humanos pueden inmunizarse con una preparacion purificada o enriquecida del virus de la gripe o un fragmento del mismo. Los protocolos para inmunizar mamlferos no humanos estan bien establecidos en la tecnica. Vease Using Antibodies: A Laboratory Manual, Editado por: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York y Current Protocols in Immunology, Editado por: J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., Nueva York, cuyas divulgaciones quedan incorporadas a la presente memoria por referencia. Los protocolos de inmunizacion con frecuencia incluyen multiples inmunizaciones, con o sin adyuvantes, tales como adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund, pero tambien pueden incluir inmunizaciones con ADN desnudo. En otra realizacion, las moleculas de union humanas se producen por celulas B, celulas plasmaticas y/o de memoria derivadas de los animales transgenicos. En otra realizacion mas, las moleculas de union humanas se producen por hibridomas, que se preparan mediante la fusion de celulas B obtenidas de los mamlferos transgenicos no humanos anteriormente descritos a celulas inmortalizadas. Las celulas B, celulas plasmaticas e hibridomas obtenibles de los mamlferos no humanos transgenicos anteriormente descritos y las moleculas de union humanas obtenidas de los mamlferos transgenicos no humanos, celulas B, celulas plasmaticas y/o de memoria e hibridomas tambien forman parte de la presente invencion.

En otro aspecto mas, la invencion proporciona composiciones que comprenden al menos una molecula de union, preferentemente un anticuerpo monoclonal humano, de acuerdo con la invencion, al menos una variante funcional del mismo, al menos un inmunoconjugado de acuerdo con la invencion y/o una combination de los mismos. Ademas de esto, las composiciones pueden comprender, entre otras cosas, moleculas estabilizantes, tales como albumina o polietilenglicol, o sales. Preferentemente, las sales usadas son sales que mantienen la actividad biologica deseada de las moleculas de union y que no confieren efectos toxicos no deseados. En caso necesario, las moleculas de union humanas de la invencion pueden recubrirse sobre en o sobre un material para protegerlas de la action de acidos u otras condiciones naturales o no naturales que puedan inactivar las moleculas de union.

En otro aspecto mas, la invencion proporciona composiciones que comprenden al menos una molecula de acido nucleico como se define en la presente invencion. Las composiciones pueden comprender soluciones acuosas, tales como soluciones acuosas que contienen sales (por ejemplo, NaCl o sales como se han descrito anteriormente), detergentes (por ejemplo, sDs) y/u otros componentes adecuados.

Ademas, la presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden al menos una molecula de union, tal como un anticuerpo monoclonal humano de la invencion (o un fragmento funcional o variante del mismo), al menos un inmunoconjugado de acuerdo con la invencion, al menos una composition de acuerdo con la invencion, o combinaciones de los mismos. La composicion farmaceutica de la invencion comprende ademas al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable. Los excipientes farmaceuticamente aceptables son de sobra conocidos para el experto en la materia. La composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion puede comprender ademas al menos otro agente terapeutico diferente. Los agentes adecuados tambien son de sobra conocidos para el experto en la materia.

En una realizacion preferida, la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion comprende al menos una molecula de union adicional, es decir, la composicion farmaceutica puede ser un coctel o mezcla de moleculas de union. La composicion farmaceutica puede comprender al menos dos moleculas de union de acuerdo con la

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invention, o al menos una molecula de union de acuerdo con la invention y al menos una molecula de union y/o neutralizante del virus de la gripe adicional, tal como otro anticuerpo dirigido contra la protelna HA o contra otras estructuras antigenicas presentes en los virus de la gripe, tales como M2. En otra realization, la molecula de union adicional puede formularse para su administration simultanea, separada o secuencial.

En una realizacion, las composiciones farmaceuticas pueden comprender dos o mas moleculas de union que tengan actividad neutralizante contra los virus de la gripe A y/o los virus de la gripe B. En una realizacion, las moleculas de union muestran una actividad neutralizante sinergica, cuando se usan en combination. Tal como se usa en el presente documento, el termino "sinergico" significa que el efecto combinado de las moleculas de union cuando se usan en combinacion es mayor que sus efectos aditivos cuando se usan individualmente. Las moleculas de union de action sinergica pueden unirse a diferentes estructuras en los mismos fragmentos u otros distintos del virus de la gripe. Una forma de calcular la sinergia es mediante el Indice de combinacion. El concepto del Indice de combinacion (CI) ha sido descrito por Chou y Talalay (1984). Las composiciones pueden comprender, por ejemplo, una molecula de union que tenga actividad neutralizante y una molecula de union no neutralizante. Las moleculas de union no neutralizantes y neutralizantes tambien pueden actuar de manera sinergica para neutralizar al virus de la gripe.

En una realizacion, la composition farmaceutica puede comprender al menos una molecula de union de acuerdo con la invencion y al menos una molecula de union neutralizante del virus de la gripe adicional. Las moleculas de union en la composicion farmaceutica son preferentemente capaces de reaccionar con virus de la gripe de diferentes subtipos. Las moleculas de union deben ser de alta afinidad y deben tener una especificidad amplia. Preferentemente, ambas moleculas de union son moleculas con neutralization cruzada en tanto que cada una neutraliza a virus de la gripe de diferentes subtipos. Ademas, preferentemente, neutralizan tantas cepas de cada uno de los subtipos de virus de la gripe como sea posible.

Una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion puede comprender ademas al menos un agente terapeutico, profilactico y/o diagnostico diferente. Preferentemente, la composicion farmaceutica comprende al menos un agente profilactico y/o terapeutico diferente. Preferentemente, dichos agentes terapeuticos y/o profilacticos adicionales son agentes capaces de prevenir y/o tratar una infection por el virus de la gripe y/o una afeccion resultante de dicha infeccion. Los agentes terapeuticos y/o profilacticos incluyen, pero sin limitation, agentes antivlricos. Dichos agentes pueden ser moleculas de union, moleculas pequenas, compuestos organicos o inorganicos, enzimas, secuencias de polinucleotidos, peptidos antivlricos, etc. Otros agentes que se usan actualmente para tratar a pacientes infectados por los virus de la gripe son inhibidores de M2 (por ejemplo, amantidina, rimantadina) y/o inhibidores de la neuraminidasa (por ejemplo, zanamavir, oseltamivir). Estos pueden usarse en combinacion con las moleculas de union de la invencion. "En combinacion" en el presente documento significa simultaneamente, como formulaciones separadas, o como una sola formulation combinada, o de acuerdo con un regimen de administracion secuencial como formulaciones separadas, en cualquier orden. Tambien pueden usarse agentes capaces de prevenir y/o tratar una infeccion por el virus de la gripe y/o una afeccion resultante de dicha infeccion que se encuentran en fase experimental como otros agentes terapeuticos y/o profilacticos utiles en la presente invencion.

Las moleculas de union o las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden ensayarse en sistemas de modelo animal adecuados antes de su uso en seres humanos. Dichos sistemas de modelo animal incluyen, pero sin limitacion, raton, huron y mono.

Tlpicamente, las composiciones farmaceuticas tienen que ser esteriles y estables en condiciones de fabrication y almacenamiento. Las moleculas de union, inmunoconjugados, moleculas de acido nucleico o composiciones de la presente invencion pueden estar en forma de polvo para su reconstitution en el excipiente farmaceuticamente aceptable adecuado antes o en el momento de su suministro. En el caso de polvos esteriles para la preparation de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son las tecnicas secado al vaclo y criodesecacion (liofilizacion) que producen un polvo del principio activo mas cualquier otro ingrediente adicional deseado a partir de una solution previamente esterilizada por filtration del mismo.

Como alternativa, las moleculas de union, inmunoconjugados, moleculas de acido nucleico o composiciones de la presente invencion pueden estar en solucion y el excipiente farmaceuticamente aceptable puede anadirse y/o mezclarse antes o en el momento de la administracion para proporcionar una forma inyectable de dosis unitaria. Preferentemente, el excipiente farmaceuticamente aceptable usado en la presente invencion es adecuado para una elevada concentration de farmaco, puede mantener una fluidez adecuada y, en caso necesario, puede retrasar la absorcion.

La election de la ruta de administracion optima de las composiciones farmaceuticas estara influenciada por varios factores, incluyendo las propiedades fisicoqulmicas de las moleculas activas dentro de las composiciones, de la urgencia de la situation cllnica y de la relation de las concentraciones plasmaticas de las moleculas activas para el efecto terapeutico deseado. Por ejemplo, en caso necesario, las moleculas de union de la presente invencion pueden prepararse con vehlculos que las protegeran frente a la rapida liberation, tal como una formulacion de liberation controlada, incluyendo implantes, parches transdermicos, y sistemas de administracion

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microencapsulados. Entre otros, pueden usarse pollmeros biodegradables biocompatibles, tales como vinilacetato de etileno, polianhldridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, y acido polilactico. Ademas, puede ser necesario recubrir las moleculas de union con, o coadministrar las moleculas de union con, un material o compuesto que evite la inactivadion de las moleculas de union humanas. Por ejemplo, las moleculas de union pueden administrarse a un sujeto en un vehlculo adecuado, por ejemplo, liposomas o un diluyente.

Las rutas de administracion pueden dividirse en dos categorlas principales, administracion oral y parenteral. La ruta de administracion preferida es intravenosa o por inhalacion.

Entre otras, las formas de dosificacion orales pueden formularse en forma de comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o granulos dispersables, emulsiones, capsulas duras, capsulas de gelatina blanda, jarabes o elixires, plldoras, grageas, llquidos, geles, o suspensiones. Estas formulaciones pueden contener excipientes farmaceuticos incluyendo, pero sin limitacion, diluyentes inertes, agentes granulantes y disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, conservantes, agentes colorantes, aromatizantes o edulcorantes, aceites vegetales o minerales, agentes humectantes, y agentes espesantes.

Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion tambien pueden formularse para administracion parenteral. Entre otras cosas, las formulaciones para administracion parenteral pueden estar en forma de soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas, isotonicas, esteriles para inyeccion o infusion. Las soluciones o suspensiones pueden comprender agentes que no son toxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, tales como 1,3-butanodiol, solucion de Ringer, solucion de Hank, solucion isotonica de cloruro de sodio, aceites, acidos grasos, agentes anestesicos locales, conservantes, tampones, agentes aumentadores de la viscosidad o la solubilidad, antioxidantes hidrosolubles, antioxidantes liposolubles y agentes quelantes de metales.

En un aspecto adicional, las moleculas de union, tales como los anticuerpos monoclonales humanos (fragmentos funcionales y variantes de los mismos), inmunoconjugados, composiciones, o composiciones farmaceuticas de la invencion pueden usarse como medicamento. Por lo tanto, un metodo de diagnostico, tratamiento y/o prevencion de una infeccion por el virus de la gripe usando las moleculas de union, inmunoconjugados, composiciones, o composiciones farmaceuticas de la invencion es otra parte de la presente invencion. Entre otras cosas, las moleculas anteriormente mencionadas pueden usarse en el diagnostico, profilaxis, tratamiento, o una combinacion de las mismas, de una infeccion por el virus de la gripe causada por virus de la gripe que comprenden HA de los subtipos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, Hl0 y/o H11. En una realizacion, las moleculas anteriormente mencionadas tambien pueden usarse en el diagnostico, profilaxis, tratamiento o una combinacion de los mismos de una infeccion por el virus de la gripe causada por un virus de la gripe B. Estas son adecuadas para el tratamiento de pacientes aun no tratados que padecen una infeccion por el virus de la gripe y pacientes que ya se han tratado o se estan tratando para una infeccion por el virus de la gripe.

Las moleculas o composiciones anteriormente mencionadas pueden emplearse conjuntamente con otras moleculas utiles en el diagnostico, profilaxis y/o tratamiento. Estas pueden usarse in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, las moleculas de union, tales como anticuerpos monoclonales humanos (o variantes funcionales de los mismos), inmunoconjugados, composiciones o composiciones farmaceuticas de la invencion pueden coadministrarse con una vacuna contra el virus de la gripe (en caso de estar disponible). Como alternativa, tambien puede administrarse la vacuna antes o despues de la administracion de las moleculas de la invencion. En lugar de una vacuna, tambien pueden emplearse agentes antivlricos conjuntamente con las moleculas de union de la presente invencion. Los agentes antivlricos adecuados se han mencionado anteriormente.

Las moleculas se formulan tlpicamente en las composiciones y composiciones farmaceuticas de la invencion en una cantidad terapeutica o diagnosticamente eficaz. Como alternativa, estas pueden formularse y administrarse por separado. Por ejemplo, las otras moleculas, tales como los agentes antivlricos pueden aplicarse de manera sistemica, mientras que las moleculas de union de la invencion pueden administrarse por via intravenosa.

El tratamiento puede estar dirigido a grupos de pacientes que son susceptibles a la infeccion por gripe. Dichos grupos de pacientes incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, los ancianos (por ejemplo, S 50 anos de edad, S 60 anos de edad, y preferentemente S 65 anos de edad), los jovenes (por ejemplo, S 5 anos de edad, S 1 ano de edad), pacientes hospitalizados y pacientes ya infectados que se han tratado con un compuesto antivlrico pero que han mostrado una respuesta antivlrica inadecuada.

Los reglmenes de dosificacion pueden ajustarse para proporcionar la respuesta optima deseada (por ejemplo, una respuesta terapeutica). Un intervalo de dosificacion adecuado puede ser, por ejemplo, de 0,01-100 mg/kg de peso corporal, preferentemente de 0,1-50 mg/kg de peso corporal, preferentemente de 0,01-15 mg/kg de peso corporal. Ademas, por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o puede reducirse o aumentarse la dosis proporcionalmente segun este indicado por las exigencias de la situacion terapeutica. Las moleculas y composiciones de acuerdo con la presente invencion son preferentemente esteriles. Los metodos para hacer que estas moleculas y composiciones sean esteriles son de sobra conocidos en la

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tecnica. Las otras moleculas utiles para el diagnostico, profilaxis y/o tratamiento pueden administrarse en un regimen de dosificacion similar al propuesto para las moleculas de union de la invencion. En caso de administrar las otras moleculas por separado, pueden administrarse a un pacientes antes de (por ejemplo, 2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 dlas, 3 dlas, 4 dlas, 5 dlas, 7 dlas, 2 semanas, 4 semanas o 6 semanas antes), de manera concomitante con, o posteriormente a (por ejemplo, 2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas, 14 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 2 dlas, 3 dlas, 4 dlas, 5 dlas, 7 dlas, 2 semanas, 4 semanas o 6 semanas despues) de la administracion de una o mas de las moleculas de union de las composiciones farmaceuticas de la invencion. Normalmente se deduce el regimen de dosificacion exacto durante los ensayos cllnicos en pacientes humanos.

Las moleculas de union humanas y las composiciones farmaceuticas que comprenden las moleculas de union humanas son particularmente utiles, y a menudo preferidas, cuando se van a administrar a seres humanos como agentes terapeuticos in vivo, ya que la respuesta inmune del receptor al anticuerpo administrado sera normalmente sustancialmente menor que la ocasionada mediante la administracion de una molecula de union monoclonal murina, quimerica o humanizada.

En otro aspecto, la invencion se refiere al uso de moleculas de union, tales como anticuerpos monoclonales humanos neutralizantes (fragmentos funcionales y variantes de los mismos), inmunoconjugados, moleculas de acido nucleico, composiciones o composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion en la preparation de un medicamento para el diagnostico, profilaxis, tratamiento, o una combination de las mismas, de una infection por el virus de la gripe, en particular, una infeccion por el virus de la gripe causada por virus de la gripe que comprenden HA de los subtipos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, y/o H11 y/o de virus de la gripe B.

Aparte de esto, los kits que comprenden al menos una molecula de union tal como un anticuerpo monoclonal humano neutralizante (fragmentos funcionales y variantes de los mismos), al menos un inmunoconjugado, al menos una molecula de acido nucleico, al menos una composition, al menos una composition farmaceutica, al menos un vector, al menos un hospedador de acuerdo con la invencion o una combinacion de los mismos forman tambien parte de la presente invencion. Opcionalmente, los componentes anteriormente descritos de los kits de la invencion estan envasados en recipientes adecuados y etiquetados para el diagnostico, profilaxis y/o tratamiento de las afecciones indicadas. Los componentes anteriormente mencionados pueden almacenarse en recipientes mono o multidosis en forma de una solution acuosa, preferentemente esteril, o en forma de una formulation liofilizada, preferentemente esteril, para reconstitution. Los recipientes pueden estar hechos de una diversidad de materiales, tales como vidrio o plastico y pueden tener un puerto de acceso esteril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolucion intravenosa o un vial que tiene un detenedor perforable mediante una aguja de inyeccion hipodermica). El kit puede comprender ademas mas recipientes que comprenden un tampon farmaceuticamente aceptable. Puede incluir ademas otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, medio de cultivo para uno o mas hospedadores adecuados y, posiblemente, incluso al menos otro agente terapeutico, profilactico o diagnostico diferente. Puede haber instrucciones asociadas con los kits que se incluyen rutinariamente en los envases comerciales de productos terapeuticos, profilacticos o diagnosticos, que contienen information acerca de, por ejemplo, las indicaciones, uso, dosificacion, fabrication, administracion, contraindicaciones y/o advertencias relacionadas al uso de dichos productos terapeuticos, profilacticos o diagnosticos.

Las moleculas de union de acuerdo con la presente invencion tambien pueden usarse ventajosamente como un agente diagnostico en un metodo in vitro para la detection del virus de la gripe. La invencion, por lo tanto, se refiere ademas a un metodo para detectar al grupo filogenetico 1 o al grupo filogenetico 2 del virus de la gripe, o al virus de la gripe de subtipo B en una muestra, en donde el metodo comprende las etapas de (a) poner en contacto una muestra con una cantidad diagnosticamente eficaz de una molecula de union (fragmentos funcionales y variantes de la misma) o un inmunoconjugado de acuerdo con la invencion, y (b) determinar si la molecula de union o el inmunoconjugado se une especlficamente a una molecula de la muestra. La muestra puede ser una muestra biologica, incluyendo, pero sin limitation, sangre, suero, heces, esputo, aspirados nasofarlngeos, lavados bronquiales, orina, tejido u otro material biologico de sujetos (potencialmente) infectados, o una muestra no biologica, tal como agua, bebida, etc. Los sujetos (potencialmente) infectados pueden ser sujetos humanos, pero tambien animales que sean sospechosos de ser portadores del virus de la gripe a los que pueden realizarse pruebas para detectar la presencia del virus usando las moleculas de union humanas o los inmunoconjugados de la invencion. La muestra puede manipularse en primer lugar para hacerla mas adecuada para el metodo de deteccion. Manipulation significa, entre otras cosas, tratar la muestra sospechosa de contener y/o que contiene el virus de tal forma que el virus se desintegre en los componentes antigenicos, tales como protelnas, (poli)peptidos u otros fragmentos antigenicos. Preferentemente, las moleculas de union humanas o los inmunoconjugados de la invencion se ponen en contacto con la muestra en condiciones que permitan la formation de un complejo inmunologico entre las moleculas de union humanas y el virus o los componentes antigenicos de los mismos que puedan estar presentes en la muestra. La formacion de un complejo inmunologico, en caso de haberlo, que indique la presencia del virus en la muestra, se detecta y mide posteriormente por medios adecuados. Dichos metodos incluyen, entre otras cosas, inmunoensayos de union homogeneos y heterogeneos, tales como radioinmunoensayos (RlA), ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoqulmica, FACS, BlAcORE y analisis de transferencia de Western.

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Las tecnicas de ensayo preferidas, especialmente para exploracion cllnica a gran escala de sueros de paciente y productos de la sangre son las tecnicas de ELISA y de transferencia de Western. Se prefieren particularmente las pruebas ELISA. Para su uso como reactivos en estos ensayos, las moleculas de union o los inmunoconjugados de la invencion estan convenientemente unidos a la superficie interior de pocillos de microtitulacion. Las moleculas de union o los inmunoconjugados de la invencion pueden unirse directamente al pocillo de microtitulacion. Sin embargo, puede lograrse la union maxima de las moleculas de union o de los inmunoconjugados de la invencion a los pocillos pretratando los pocillos con polilisina antes de la adicion de las moleculas de union o de los inmunoconjugados de la invencion. Ademas, las moleculas de union o los inmunoconjugados de la invencion pueden unirse covalentemente por medios conocidos a los pocillos. En general, las moleculas de union o los inmunoconjugados se usan a una concentracion de 0,01 a 100 pg/ml para recubrimiento, aunque tambien pueden usarse tanto cantidades mayores como menores. Despues se anaden las muestras a los pocillos recubiertos con las moleculas de union o los inmunoconjugados de la invencion.

Ademas, las moleculas de union de la invencion pueden usarse para identificar estructuras de union especlficas del virus de la gripe. Las estructuras de union pueden ser epltopos o protelnas y/o polipeptidos. Pueden ser lineales, pero tambien pueden ser estructurales y/o conformacionales. En una realizacion, las estructuras de union pueden analizarse mediante analisis PEPSCAN (veanse, entre otros, los documentos WO 84/03564, WO 93/09872, Slootstra et al., 1996). Como alternativa, puede explorarse una biblioteca de peptidos aleatoria que comprende peptidos de una protelna del virus de la gripe en busca de peptidos capaces de unirse a las moleculas de union de la invencion.

La invencion se ilustra ademas en los siguientes ejemplos y figuras. Los ejemplos no pretenden limitar el alcance de la invencion de modo alguno.

Ejemplos

Ejemplo 1 Construccion de bibliotecas de presentacion en fagos de scFv usando ARN extrafdo de celulas mononucleares de sangre periferica

Se recogio sangre periferica de donantes sanos normales mediante venipuncion en tubos de muestra anticoagulacion con eDtA. Las bibliotecas de presentacion de fagos de scFv se obtuvieron tal como se describe en el documento WO 2008/028946, que se incorpora al presente documento por referencia. El ARN se aislo de celulas mononucleares de sangre periferica y se preparo el ADNc. Se aplico una estrategia de amplificacion PCR en dos rondas usando los conjuntos de cebadores mostrados en las tablas 1 y 2 para aislar las regiones VH y VL de inmunoglobulina del repertorio de donante respectivo.

La primera ronda de amplificacion en el ADNc respectivo usando el conjunto de cebadores mencionado en la tabla 1 produjo 7, 6 y 9 productos de aproximadamente 650 pares de bases para, respectivamente, las regiones VH, Vkappa y Vlambda. Para la amplificacion de la region VH de IgM, se uso el cebador constante OCM en combinacion con OH1 a OH7. El programa de ciclado termico para la primera ronda de amplificaciones fue: 2 min 96 °C (etapa de desnaturalizacion), 30 ciclos de 30 s 96 °C/ 30 s 60 °C/ 60 s 72 °C, 10 min 72 °C de elongacion final y refrigeracion a 6 °C. Los productos se cargaron sobre y se aislaron a partir de un gel de agarosa al 1% usando columnas de extraccion de gel (Macherey Nagel) y se eluyeron en 50 pl de Tris-HCl 5 mM, pH 8.0. Se sometio a un diez por ciento de los productos de la primera ronda (de 3 a 5 pl) a una segunda ronda de amplificacion usando los cebadores mencionados en la tabla 2. Estos cebadores se extendieron con sitios de restriction que permitlan la clonacion direccional de las respectivas regiones VL y VH en el vector de presentacion de fago PDV-C06. El programa PCR para la segunda ronda de amplificacion fue el siguiente: 2 min 96 °C (etapa de desnaturalizacion), 30 ciclos de 30 s 96 °C/ 30 s 60 °C/ 60 s 72 °C, 10 min 72 °C de elongacion final y refrigeracion a 6 °C. Los productos de la segunda ronda (~350 pares de bases) se agruparon en primer lugar segun la aparicion natural de segmentos J hallados en los productos genicos de inmunoglobulina, dando como resultado 7, 6 y 9 agrupaciones para, respectivamente, las regiones VH, Vkappa y Vlambda variables (veanse las tablas 3 y 4). Para obtener una distribucion normalizada de las secuencias de inmunoglobulina en la biblioteca inmunitaria, se mezclaron las agrupaciones de 6 Vkappa y 9 Vlambda de cadena ligera segun los porcentajes mencionados en la tabla 3. Esta agrupacion final de VL (3 pg) se digirio durante una noche con las enzimas de restriccion Sall y Notl, se cargaron en y se aislaron a partir de un gel de agarosa al 1 % (~350 pares de bases) usando columnas de extraccion de gel de Macherey Nagel y se ligaron en el vector PDV-C06 cortado con Sall-Notl (~5000 pares de bases) del modo siguiente: 10 pl de vector PDV-C06 (50 ng/pl), 7 pl de inserto de VL (10 ng/pl), 5 pl de tampon de ligamiento 10X (NEB), 2,5 ADN ligasa T4 (400 U/pl) (NEB), 25,5 pl de agua ultrapura (la relation de vector a inserto fue de 1:2). La ligadura se llevo a cabo durante una noche en un bano de agua a 16 °C. A continuation, se duplico el volumen con agua, se extrajo con un volumen igual de fenol-cloroformo-alcohol isoamllico (75:24:1) (Invitrogen) seguido de extraccion en cloroformo (Merck) y se precipito con 1 pl de Pellet Paint (Novogen), 10 pl de acetato de sodio (3 M, pH 5,0) y 100 pl de isopropanol durante 2 h a -20°C. Posteriormente se centrifugo la muestra obtenida a 20.000 x g durante 30 min a 4°C. El precipitado obtenido se lavo con etanol al 70% y se centrifugo durante 10 min a 20.000 x g a temperatura ambiente. El etanol se retiro mediante aspiration de vaclo y el sedimento se seco al aire durante varios minutos y despues se disolvio en 50 pl de tampon que contenla Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. Se usaron 2 pl de la mezcla de ligadura para la transformation de 40 pl de celulas TG-1 electro-competentes (Agilent) en una cubeta

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para electroporacion enfriada de 0,1 cm (Biorad) usando un aparato Genepulser II (Biorad) ajustado a 1,7 kV, 200 Ohm, 25 pF (tiempo constante ~4,5 ms). Directamente despues del pulso, se descargaron las bacterias de la cubeta con 1000 pl de medio SOC (Invitrogen) que contenla glucosa al 5% (p/v) (Sigma) a 37°C y se transfirieron a un tubo de cultivo de fondo redondo de 15 ml. Se usaron otros 500 pl de SOC/glucosa para descargar las bacterias residuales de la cubeta y se anadieron al tubo de cultivo. Las bacterias se recuperaron mediante cultivo durante exactamente una hora a 37 °C en un incubador con agitacion a 220 rpm. Las bacterias transformadas se emplacaron en grandes placas de Petri de 240 mm (NUNC) que contenlan 150 ml de agar 2TY (bacto-triptona 16 g/l, bacto-extracto de levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l, agar 15 g/l, pH 7,0) complementado con 50 pg/ml de ampicilina y glucosa al 5 % (p/v) (Sigma). Se emplaco una dilucion de 1 a 1000 con fines de conteo en placas de Petri de 15 cm que contenlan el mismo medio. Se repitio secuencialmente este procedimiento de transformacion diez veces y se emplaco el total de cada transformacion en una placa de Petri cuadrada individual y se cultivo durante una noche en una estufa de cultivo a 37 °C. Tlpicamente, se obtuvieron aproximadamente 1 x 107 ufc (1 x 106 por placa de Petri) usando el protocolo anterior. La biblioteca de cadena ligera VL intermedia se recogio de las bacterias raspando suavemente las bacterias en 10 ml de medio 2TY por placa. Se determino la masa celular mediante medicion de la DO600 y dos veces se uso la DO 500 de bacterias para la preparacion de ADN maxi plasmido usando dos columnas maxiprep P500 (Macherey Nager) segun las instrucciones del fabricante.

De manera analoga a las regiones variables VL, los productos de VH-JH de la segunda ronda se mezclaron en primer lugar entre si para obtener la distribucion de uso normal del segmento J (vease la tabla 4), dando como resultado 7 subgrupos de VH denominados PH1 a PH7. Se mezclaron las agrupaciones para adquirir una distribucion de secuencia normalizada usando los porcentajes ilustrados en la tabla 4, obteniendo una fraccion de VH que se digirio con las enzimas de restriccion Sfil y Xhol y se ligaron en la biblioteca intermedia de PDV-VL cortada con Sfil-Xhol obtenida tal como se ha descrito anteriormente. La configuration de la ligadura, el metodo de purification, la posterior transformacion de TG1 y la recogida de bacterias fue esencialmente como se ha descrito para la biblioteca intermedia de VL (vease lo anterior) con la exception de que se usaron 20 transformaciones y 20 placas de Petri cuadradas. Se comprobo la biblioteca final (aproximadamente 1 x 107 ufc) respecto de la frecuencia del inserto con una PCR para colonias usando un conjunto de cebadores que flanquea a las regiones VH-VL insertadas. El 90 % de las colonias mostro un inserto de longitud correcta. Los productos de la PCR para colonias se usaron para el posterior analisis de secuencia de ADN para comprobar la variation de secuencia y para evaluar el porcentaje de colonias que mostraban un ORF completo. Este fue del 76 %. Finalmente, se rescato la biblioteca y se amplifico mediante el uso de fagos colaboradores CT (vease el documento WO 02/103012) y se uso para la selection de anticuerpo de fago mediante metodos de paneo como se describen mas adelante.

Ejemplo 2

Seleccion de fagos que portan fragmentos Fv monocatenarios contra hemaglutinina de la gripe A y de la gripe B

Los fragmentos de fago se seleccionaron usando bibliotecas de presentation en fagos construidas esencialmente como se ha descrito anteriormente y la tecnologla de presentacion en fagos general y la tecnologla MABSTRACT®, esencialmente como se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.265.150 y en el documento WO 98/15833 (incorporandose ambos por referencia al presente documento). Ademas, se usaron en la presente invention los metodos y los fagos colaboradores tal como se describe en el documento WO 02/103012 (que se incorpora al presente documento por referencia).

La seleccion se efectuo contra hemaglutinina (HA) recombinante de la gripe A del subtipo H1 (A/New Caledonia/20/99), H3 (A/Wisconsin/67/2005), H4 (A/Duck/Hong Kong/24/1976), H5 (A/Chicken/Vietnam/28/2003), H7 (A/Netherlands/219/2003) y H9 (A/HongKong/1073/99). Los antlgenos de HA se diluyeron en PBS (5,0 pg/ml), se anadieron a inmunotubos MaxiSorp (Nunc) y se incubaron durante una noche a 4°C en una rueda rotatoria. Los inmunotubos se vaciaron y lavaron tres veces en tampon de bloqueo (leche deshidratada desgrasada al 2 % (ELK) en PBS). Posteriormente, se cargaron completamente los inmunotubos con tampon de bloqueo y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Se bloquearon allcuotas de la biblioteca de presentacion en fagos (5001000 pl, 0,5 x 1013-1 x 1013 ufc, amplificadas con fago colaborador CT (vease el documento WO 02/103012)) en tampon de bloqueo complementado con suero fetal bovino al 10% no inactivado por calor y suero de raton al 2 % durante 1-2 h a temperatura ambiente. La biblioteca de fago bloqueada se anadio a los inmunotubos, se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente, y se lavo con tampon de lavado (Tween-20 al 0,05 % (v/v) en PBS) para retirar los fagos no unidos. Los fagos unidos se eluyeron del antlgeno respectivo mediante incubation con 1 ml de trietilamina (TEA) 100 mM durante 10 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se mezclaron los fagos eluidos con 0,5 ml de Tris-HCl 1 M, pH 7,5, para neutralizar el pH. Esta mezcla se uso para infectar 5 ml de un cultivo de E. coli XL1-Blue que se habla cultivado a 37°C hasta una DO 600 nm de aproximadamente 0.3. Se dejo que los fagos infectasen a las bacterias XL1-Blue durante 30 min a 37 °C. Despues, se centrifugo la mezcla durante 10 min a 3000 x g a temperatura ambiente y se resuspendio el sedimento bacteriano en 0,5 ml de medio de extracto de levadura 2- triptona (2TY). La suspension bacteriana obtenida se dividio en dos placas de agar de 2TY complementadas con tetraciclina, ampicilina y glucosa. Despues de la incubacion de las placas una noche a 37 °C, se rasparon las colonias de las placas y se usaron para preparar una biblioteca de fago enriquecida, esencialmente del modo descrito por De Kruif et al. (1995) y en el documento WO 02/103012. Brevemente, se usaron las bacterias raspadas para inocular el medio 2TY que contenla ampicilina, tetraciclina y glucosa y se cultivaron a una temperatura de 37 °C

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hasta una DO 600 nm de ~0,3. Se anadieron fagos auxiliares CT y se dejaron infectar las bacterias, tras lo cual se cambio el medio a 2TY que contenla ampicilina, tetraciclina y kanamicina. Se continuo la incubacion durante una noche a 30 °C. Al dla siguiente, se retiraron las bacterias del medio 2TY mediante centrifugacion, tras lo cual se precipitaron los fagos en el medio usando polietilenglicol (PEG) 6000/NaCl. Finalmente, se disolvieron los fagos en 2 ml de PBS con albumina serica bovina (BSA) al 1 %, se esterilizaron por filtracion y se usaron para la ronda de selection siguiente. La segunda ronda de selection se lleva a cabo en el mismo subtipo de HA y/o en HA de un subtipo diferente.

Se efectuaron dos rondas de selecciones consecutivas antes del aislamiento de los anticuerpos de fago monocatenarios individuales. Despues de la segunda ronda de seleccion, se usaron colonias de E. coli individuales para preparar anticuerpos de fago monoclonales. Esencialmente, se cultivaron las colonias individuales hasta fase logarltmica en un formato de placa de 96 pocillos con fagos colaboradores VCS-M13, tras lo cual se dejo que se produjera la production de anticuerpo de fago. Se analizo la secuencia de los fagemidos y se usaron fagemidos totalmente unicos para ensayos posteriores. Se usaron los sobrenadantes que contenlan anticuerpos de fago directamente en el ELISA para la union a los antlgenos de HA. Como alternativa, los anticuerpos de fago se precipitaron con PEG/NaCl y se esterilizaron por filtracion para analisis tanto ELISA como por citometrla de flujo.

Ejemplo 3

Validacion de los anticuerpos de fago monocatenarios especfficos para HA

Los sobrenadantes seleccionados que contenlan anticuerpos de fago monocatenarios que se obtuvieron en las exploraciones descritas anteriormente fueron validados en ELISA respecto de su especificidad, es decir, union a diferentes antlgenos de HA. Para este fin, se recubrieron placas para ELISA Maxisorp con H1 (A/New Caledonia/20/99), H3 (A/Wisconsin/67/2005), H5 (A/Vietnam/1203/04) H7 (A/Netherlands/219/2003), y B (B/Ohio/01/2005) HA expresadas en baculovirus (Protein Sciences, CT, EE.UU.). Despues del recubrimiento, se lavaron las placas tres veces con PBS que contenla Tween-20 al 0,1 % v/v y se bloquearon en PBS que contenla BSA al 3 % o ELK al 2 % durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos de fago monocatenarios seleccionados se incubaron durante 1 h en un volumen igual de PBS que contenla ELK al 4 % para obtener anticuerpos de fago bloqueados. Se vaciaron las placas, se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 al 0,1 % y se anadieron los anticuerpos de fago monocatenarios bloqueados a los pocillos. Se dejo que se avanzase la incubacion durante una hora, se lavaron las placas con PBS/Tween-20 al 0,1 % y los anticuerpos de fago unidos se detectaron (usando la medicion de la DO a 492 nm) usando un anticuerpo anti-M13 conjugado a peroxidasa. Como control, se llevo a cabo el procedimiento de manera simultanea sin un anticuerpo de fago monocatenario y con un anticuerpo de fago monocatenario de control negativo no relacionado. A partir de las selecciones de los diferentes antlgenos de HA con las bibliotecas de fago, se obtuvieron 13 anticuerpos de fago monocatenarios que se unen de manera especlfica al virus de la gripe A H1, H3, H5, H7 y del virus de la gripe B (SC09-003, SC09-004, SC09-005, SC09- 006, SC09-007, SC09-008, SC09-009, SC09-010, SC09-011, SC09-030, SC09-112, SC09-113 y SC09-114). Vease la tabla 5.

Como alternativa, los anticuerpos de fago precipitados con PEG/NaCl y esterilizados por filtracion se usaron para validad la union y la especificidad mediante analisis FACS. Para este fin, se expresaron las HA de los subtipos H1 (A/New Caledonia/20/1999), H3 (A/Wisonsin/67/2005) y H7 (A/Netherlands/219/2003) de gripe A recombinantes de longitud completa en la superficie de celulas PER.C6. Las celulas se incubaron con anticuerpos de fago monocatenarios durante 1 h seguido de tres etapas de lavado con PBS+BSA al 0,1%. Los fagos unidos de detectaron usando el anticuerpo M13 conjugado a FITC. A partir de las selecciones de los diferentes antlgenos de HA con las bibliotecas de fago, se hallaron 14 anticuerpos de fago monocatenarios que se unen especlficamente a HA de los subtipos H1, H3 y H7 de gripe A (SC09-003, SC09-004, SC09-005, SC09-006, SC09-007, SC09-008, SC09-009. SC09-010, SC09-011, SC09-012, SC09-030, SC09-112, SC09-113 y SC09-114). Vease la tabla 6.

Todos los 16 anticuerpos de fago, SC09-003, SC09-004, SC09-005, SC09-006, SC09-007, SC09-008, SC09-009. SC09-010, SC09-011, SC09-012, SC09-029, SC09-030, SC09-031, SC09-112, SC09-113 y SC09-114, se usaron para la construction de inmunoglobulinas completamente humanas.

Ejemplo 4

Construccion de moleculas de inmunoglobulina completamente humanas (anticuerpos monoclonales humanos) a partir de los Fv monocatenarios seleccionados

A partir de los anticuerpos de fago monocatenarios (scFv) especlficos seleccionados, se obtuvieron clones de ADN plasmldico y se determinaron las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de acuerdo con tecnicas convencionales. Se clonaron las regiones variables de cadena pesada y ligera de los scFv directamente mediante digestion de restriction para la expresion en los vectores de expresion de IgG pIg-C911-HCgamma1 (vease la SEQ ID NO: 175), pIG-C909-Ckappa (vease la SEQ ID NO: 176), o pIg-C910-Clambda (vease la SEQ ID NO: 177). Se determino la identidad genica de VH y VL (vease Tomlinson IM et al. V-BASE Sequence Directory. Cambridge, Reino Unido: MRC Centre for Protein Engineering (1997)) de los scFv (vease la tabla 7).

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Se verificaron las secuencias de nucleotidos para todas las construcciones segun tecnicas convencionales conocidas para el experto en la materia. Las construcciones de expresion resultantes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de IgG1 se expresaron de manera transitoria en combination en celulas 293T y se obtuvieron sobrenadantes que contenlan anticuerpos IgG1 humanos y se produjeron usando procedimientos de purification convencionales.

La secuencia de aminoacidos de las CDR de las cadenas pesada y ligera de las moleculas de inmunoglobulina seleccionadas se proporcionan en la tabla 7.

El numero de diferencias de aminoacidos y el % de identidad de todos los dominios variables de las cadenas pesada y ligera se proporcionan en la tabla 8.

Ejemplo 5

Reactividad de union cruzada de las IgG

Un panel de cinco de los anticuerpos IgG descritos anteriormente, CR9005, CR9030, CR9112, CR9113 y CR9114, se valido en ELISA respecto de su especificidad de union, es decir, union a diferentes antlgenos de HA. Para este fin, se recubrieron placas para ELISA Maxisorp con H1 (A/New Caledonia/20/1999), H3 (A/Wisconsin/67/2005), H5 (A/Vietnam/1203/04) H7 (A/Netherlands/219/2003) y H9 (A/HongKong/1073/99) HA expresadas en baculovirus (Protein Sciences, CT, EE.UU.). Despues del recubrimiento, se lavaron las placas tres veces con PBS que contenla Tween-20 al 0,1 % v/v y se bloquearon en PBS que contenla BSA al 3 % o ELK al 2 % durante 1 h a temperatura ambiente. Se vaciaron las placas, se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 al 0,1 % y se anadieron los anticuerpos IgG a los pocillos. Se dejo que se avanzase la incubation durante una hora, se lavaron las placas con PBS/Tween- 20 al 0,1 % y los anticuerpos unidos se detectaron (usando la medicion de la DO a 492 nm) usando un anticuerpo anti-IgG humana conjugado a peroxidasa. Como control, se uso una IgG CR4098 no relacionada.

Se demostro que CR9005, CR9030, CR9112, CR9113 y CR9114 tienen actividad de union cruzada heterosubtlpica para todas las HA recombinantes ensayadas. Vease la tabla 9.

Ademas, se usaron los anticuerpos seleccionados para ensayar la union heterosubtlpica mediante analisis FACS. Para este fin, se expresaron las HA de los subtipos H1 (A/New Caledonia/20/1999), H3 (A/Wisonsin/67/2005) y H7 (A/Netherlands/219/2003) de gripe A recombinantes de longitud completa en la superficie de celulas PER.C6. Las celulas se incubaron con anticuerpos IgG durante 1 h seguido de tres etapas de lavado con PBS+BSA al 0,1%. Los anticuerpos unidos se detectaron usando anticuerpo anti-humano conjugado a PE. Como control, se usaron celulas PER.C6 no transfectadas. CR9005, CR9030, CR9112, CR9113 y CR9114 muestran actividad de union cruzada a los subtipos H1, H3 y H7 de HA de gripe A pero no a las celulas PER.C6 de tipo silvestre. Vease la tabla 9.

Ejemplo 6

Actividad de neutralizacion cruzada de las IgG

Para determinar si las IgG seleccionadas eran capaces de bloquear multiples cepas de gripe A, se llevaron a cabo ensayos de neutralizacion de virus in vitro (VNA) adicionales. Los VNA se llevaron a cabo en celulas MDCK (ATCC CCL-34). Las celulas MDCK se cultivaron en medio de cultivo para celulas MDCK (medio MEM complementado con antibioticos, Hepes 20 mM y bicarbonato de sodio al 0,15 % (p/v) (medio MEM completo), complementado con suero fetal bovino al 10 %(v/v). Las cepas de H1 (A/WSN/33, A/New Caledonia/20/1999, A/Solomon Islands/IVR-145 (reorganizante de alto crecimiento de A/Solomon Islands/3/2006), A/Brisbane/59/2007, A/NYMC/X-181

(reorganizante de alto crecimiento de A/California/07/2009), H2 (A/Env/MPU3156/05), H3 (A/Hong Kong/1/68, A/Johannesburg/33/94, A/Panama/2000/1999, A/Hiroshima/52/2005, A/Wisconsin/67/2005 and A/Brisbane/10/2007), H4 (A/WF/HK/MPA892/06), H5 (PR8-H5N1-HK97 (6:2 reorganizante de A/Hong Kong/156/97 and A/PR/8/34) y A/Eurasian Wigeon/MPF461/07), H6 (A/Eurasian Wigeon/MPD411/07), H7 (NIBRG-60 (6:2 reorganizante de A/Mallard/Netherlands/12/2000) and PR8-H7N7-NY (7:1 reorganizante de A/New York/107/2003 (H7N7) y A/PR/8/34)), H8 (A/Eurasian Wigeon/MPH571/08) H9 (A/Hong Kong/1073/99 y A/Chick/HK/SSP176/09), H10 (A/Chick/Germany/N/49) y H14 (PR8-H14N5 (6:2 reorganizante de A/mallard/Astrakhan/263/1982 (H14N5) and A/PR/8/34)) que se usaron en el ensayo se diluyeron a un tltulo de 5,7 x 103 TCID50/ml (50% de la dosis infecciosa para cultivo de tejidos por ml), calculandose el tltulo segun el metodo de Speaman y Karber. Las preparaciones de IgG (200 pg/ml) se diluyeron en serie 2 veces (1:2 - 1:512) en medio MEM completo en pocillos cuadruplicados. Se mezclaron 25 pl de la respectiva dilution de IgG con 25 pl de suspension de virus (100 TCID50/25 pl) y se incubo durante una hora a 37°C. Despues se transfirio la suspension por cuadruplicado a placas de 96 pocillos que contenlan cultivos confluentes de MDCK en 50 pl de medio MEM completo. Antes de su uso, se sembraron las celulas MDCK a 3 x 104 celulas por pocillo en medio de cultivo celular para MDCK, se cultivaron hasta que las celulas alcanzaron la confluencia, se lavaron con 300-350 pl de PBS, pH 7,4 y finalmente se anadieron 50 pl de medio MEM completo a cada pocillo. Las celulas inoculadas se cultivaron durante 3-4 dlas a 37°C y se observaron a diario respecto del desarrollo de efectos citopatologicos (CPE). El CPE se comparo con el control positivo.

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CR9005, CR9112, CR9113 y CR9114 muestran actividad de neutralizacion cruzada heterosubtlpica contra cepas representativas de todos los subtipos ensayados de gripe A de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9 y H10. Vease la tabla 10.

Ejemplo 7

Los anticuerpos pan-gripe se unen a la conformacion pre-fusion de HA

Para determinar si las IgG seleccionadas eran capaces de unirse a la conformacion pre- o post-fusion de la molecula de HA, se llevo a cabo un experimento de cambio de pH in vitro. Para este fin, se expresaron los subtipos recombinantes de longitud completa de H1 (A/New Caledonia/20/99), H3 (A/Wisonsin/67/2005), H5 (A/Vietnam/1203/04), H7 (A/Netherlands/219/03) y H9 (A/Hong Kong/1073/99) de HA de gripe A recombinante en la superficie de celulas PER.C6. Para medir la union de mAb a diferentes conformaciones estructurales de HA, se desprendieron las celulas del soporte plastico usando PBS-EDTA y posteriormente se trataron con tripsina (TrypLE Select, Gibco) durante 5 min a TA, se lavaron (BSA al 1% en PBS) y se incubaron durante 15 min en tampon de acido cltrico-fosfato sodico (pH 4,9). Se apartaron muestras de celulas despues de cada etapa de procesamiento (sin tripsinizar/HA0; tripsinizadas/HA1-HA2; pH 4,9/HA de fusion) y se incubaron fracciones de cada tratamiento con mAb CR9114 durante 1 hora. Entonces se incubaron las celulas durante 30 min con IgG anti- humano conjugada a ficoeritrina (Southern Biotech) en BSA al 1 %. Las celulas tenidas se analizaron usando un FACS Canto con el programa informatico FACS Diva (Becton Dickinson). La union de FACS de las IgG1 a HA expresada en la superficie se produjo despues del tratamiento secuencial con tripsina y medio tamponado a pH 4,9 y se expreso como porcentaje de union a HA no tratado (A). Vease la figura 1A.

El anticuerpo CR9114 muestra una reduccion marcada en la union despues del cambio de pH, lo que indica especificidad por un epltopo presente unicamente antes del cambio conformacional inducido por bajo pH de la molecula de HA.

Como alternativa, para ensayar si las IgG pueden bloquear el cambio conformacional inducido por bajo pH de la HA, se anadio el anticuerpo CR9117 antes de la etapa de bajo pH. Se separaron muestras de tratamientos consecutivos y se tineron con IgG anti-humano conjugada a ficoeritrina (Southern Biotech). Las celulas tenidas se analizaron usando un FACS Canto con el programa informatico FACS Diva (Becton Dickinson). Vease la fig. 1B. El anticuerpo CR9114 muestra un alto nivel de union residual a las diversas HA despues del cambio de pH, lo que indica que cuando estos anticuerpos se unen a la molecula de HA, no se produce el cambio conformacional inducido por bajo pH.

Ejemplo 8

Mediciones de afinidad de Fab en diversas HA de gripe A y B.

Se adquirieron HA solubles recombinante de A/New Caledonia/20/1999 (H1), A/Brisbane/59/2007 (H1), A/Wisconsin/67/2005 (H3), A/Brisbane/10/2007 (H3, B/Florida/4/2006 (B), B/Brisbane/60/2008 (B) y B/Malaysia/2506/2004 (B) producida usando vectores baculovlricos en celulas de insecto a traves de Protein Sciences Corpo (CT, EE.UU.) y se biotinilaron a temperatura ambiente (TA) durante 40 min usando EZ-link sulfo- NHS-LC-LC-biotina (Pierce). Se llevo a cabo la etapa de intercambio de tampon a PBS usando filtros para centrifugacion Amicon Ultra de 0,5 ml (Millipore). La Ha biotinilada se unio a sensores de estreptavidina a 37 °C durante 1200 segundos. La asociacion del fragmento Fab de CR9005, CR9112, CR9113 y CR9114 a HA se midio en Octet QK (ForteBio) durante 700 segundos a 37 °C exponiendo los sensores a 100 nM de anticuerpo en tampon cinetico 1x (ForteBio). La disociacion de los fragmentos Fab se evaluo exponiendo los sensores a tampon cinetico 1x durante 9000 segundos a 37 °C. Los fragmentos Fab de CR9005, CR9112, CR9113 y CR9114 se unen con afinidades de micro a picomolares a H1, H3 y a HA de gripe B.

Ejemplo 9

Competicion por la union con otros anticuerpos de union al tallo

Se adquirieron HA solubles recombinantes de A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) y A/Wisconsin/67/2005 (H3N2) producidas usando vectores baculovlricos en celulas de insecto a traves de Protein Sciences Corp (CT, EE.UU.) y se biotinilaron a temperatura ambiente (TA) durante 40 min usando EZ-link sulfo-NHS-LC-LC-biotina (Pierce). Se llevo a cabo la etapa de intercambio de tampon a PBS usando filtros para centrifugacion Amicon Ultra de 0,5 ml (Millipore). La HA biotinilada se unio a sensores de estreptavidina a 37 °C durante 1200 segundos. La asociacion de los anticuerpos CR9114 y CR6261 a HA H1 se midio en Octet QK (ForteBio) durante 700 segundos a 37 °C exponiendo los sensores a 100 nM de anticuerpo en tampon cinetico 1x (ForteBio) tras lo cual se evaluo el grado de union adicional exponiendo los sensores a un segundo anticuerpo (100 nM en tampon cinetico 1x) en presencia del primer anticuerpo (100 nM) durante 700 segundos a 37 °C. Como control, se empleo el mAb CR9020, que se une a la cabeza globular de H1. La asociacion de los anticuerpos CR9114 y CR8020 a HA H3 se midio en Octet QK (ForteBio) durante 900 segundos a 37 °C exponiendo los sensores a 100 nM de anticuerpo en tampon cinetico 1x

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(ForteBio) tras lo cual se evaluo el grado de union adicional exponiendo los sensores a un segundo anticuerpo (100 nM en tampon cinetico 1x) en presencia del primer anticuerpo (100 nM) durante 900 segundos a 37 °C. Como control, se empleo el mAb CR8057, que se une a la cabeza globular de H3.

CR9114 compite por la union a HA H1 con CR6261 y a HA H3 con CR8020. Por lo tanto, CR9114 se une probablemente a un epltopo solapante con los dos epltopos de CR6261 y CR8020 en la region de tallo de HA. (Vease la fig. 2).

Ejemplo 10

Actividad profilactica del anticuerpo monoclonal de IgG CR9114 contra la exposicion letal a gripe B in vivo

Se llevo a cabo un estudio para probar el efecto profilactico del anticuerpo monoclonal CR9114 contra una exposicion letal con virus de la gripe B in vivo. Se ensayo el mAb CR9114 respecto de su eficacia profilactica en un modelo de raton de exposicion letal con el virus de la gripe B/Florida/04/2006 adaptado a raton (Central Veterinary Institute (CVI), Lelystad, Palses Bajos). Se adapto el virus B/Florida/04/2006 a los ratones despues de 5 pases de pulmon a pulmon. El virus del pase 5 de gripe B adaptado a raton se propago en huevos de pollo embrionados en el laboratorio del CVI. Todos los ratones (Balb/c, hembras, 6-8 semanas de edad, n=10 por grupo) se aclimataron y mantuvieron durante un periodo de al menos 4 dlas antes del inicio del experimento. Se dosifico el mAb CR9114 a 15 mg/kg por via intravenosa en la vena caudal (vena coccygeus) en el dla -1 antes de la exposicion, asumiendo un peso medio de 18 g por raton y un volumen de dosis fijo de 0,2 ml. Al grupo de control se le dosifico con control de vehlculo. Despues se expuso a los ratones en el dla 0 con 25 DL50 de virus de la gripe B B/Florida/04/2006 mediante inoculacion intranasal. Se determinaron a diario los signos cllnicos y los pesos corporales desde el dla -1 antes de la exposicion hasta el dla 8. Los signos cllnicos se puntuaron con un sistema de puntuacion (0=sin signos cllnicos; 1=pelo duro; 2=pelo duro, menos reactivo durante la manipulacion; 3=pelo duro, enroscado, dificultad respiratoria, menos reactivo durante la manipulacion; 4=pelo duro, enroscado, dificultad respiratoria, respuesta inactiva a manipulaciones). Con una puntuacion de 4, se eutanasio al animal.

Todos los ratones permanecieron activos y pareclan sanos, sin mostrar signos de enfermedad durante el periodo de aclimatacion. La fig. 3A muestra la tasa de supervivencia de los ratones, despues de la administracion del mAb. Los ratones a los que se dosificaron 15 mg/kg de mAb CR9114 mostraron una tasa de supervivencia del 100 %, mientras que del grupo de mAb de control, sobrevivio el 50 %.

En la figura 3B se muestra el cambio medio de peso corporal de los ratones durante el periodo de estudio de 8 dlas despues de la administracion del mAb. En el grupo de mAb CR9114, los ratones no perdieron peso durante el periodo de estudio de 8 dlas, mientras que en el grupo de control de vehlculo se observo perdida de peso. La mediana de las puntuaciones cllnicas de los ratones se muestran en la fig. 3C. De os ratones tratados con 15 mg/kg de mAb CR9114 en el dla -1 antes de la exposicion, todos sobrevivieron y ninguno de los animales mostro signos cllnicos durante el periodo de observacion (desde el dla 0 hasta el dla 8 despues de la infeccion). Estos resultados demuestran que el anticuerpo humano anti-gripe CR9114, identificado y desarrollado del modo descrito en el presente documento, es capaz de proporcionar proteccion contra una dosis letal de virus de la gripe B in vivo. Cuando se administra un dla antes de la infeccion a una dosis de 15 mg/kg o mayor, el mAb CR9114 fue capaz de prevenir completamente la manifestacion cllnica de la infeccion por gripe B en ratones.

Tabla 1. Primera ronda de amplificaciones de Vkappa, Vlambda y VH

Nombre del cebador

Secuencia de nucleotidos del cebador SEQ ID NO:

OK1 (HuVK1B)

GAC ATC CAG WTG ACC CAG TCT CC 65

OK2 (HuVK2)

GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC 66

OK3 (HuVK2B2)

GAT ATT GTG ATG ACC CAG ACT CC 67

OK4 (HuVK3B)

GAA ATT GTG WTG ACR CAG TCT CC 68

OK5 (HuVK5)

GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC 69

OK6 (HuVK6)

GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC 70

OCK (HuCK)

ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT 71

OL1 (HuVL1A)*

CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CC 72

OL1 (HuVL1B)*

CAG TCT GTG YTG ACG CAG CCG CC 73

OL1 (HuVLIC)*

CAG TCT GTC GTG ACG CAG CCG CC 74

OL2 (HuVL2B)

CAG TCT GCC CTG ACT CAG CC 75

OL3 (HuVL3A)

TCC TAT GWG CTG ACT CAG CCA CC 76

OL4 (HuVL3B)

TCT TCT GAG CTG ACT CAG GAC CC 77

OL5 (HuVL4B)

CAG CYT GTG CTG ACT CAA TC 78

OL6 (HuVL5)

CAG GCT GTG CTG ACT CAG CCG TC 79

OL7 (HuVL6)

AAT TTT ATG CTG ACT CAG CCC CA 80

Nombre del cebador

Secuencia de nucleotidos del cebador SEQ ID NO:

OL8 (HuVL7/8)

CAG RCT GTG GTG ACY CAG GAG CC 81

OL9 (HuVL9)#

CWG CCT GTG CTG ACT CAG CCM CC 82

OL9 (HuVL10)#

CAG GCA GGG CTG ACT CAG 83

OCL (HuCL2)X

TGA ACA TTC TGT AGG GGC CAC TG 84

OCL (HuCL7)X

AGA GCA TTC TGC AGG GGC CAC TG 85

OH1(HuVH1B7A)+

CAG RTG CAG CTG GTG CAR TCT GG 86

OH1 (HuVH1C)+

SAG GTC CAG CTG GTR CAG TCT GG 87

OH2 (HuVH2B)

CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT GG 88

OH3 (HuVH3A)

GAG GTG CAG CTG GTG GAG 89

OH4 (HuVH3C)

GAG GTG CAG CTG GTG GAG WCY GG 90

OH5 (HuVH4B)

CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG 91

OH6 (HuVH4C)

CAG STG CAG CTG CAG GAG TCS GG 92

OH7 (HuVH6A)

CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG 93

OCM (HuCIgM)

TGG AAG AGG CAC GTT CTT TTC TTR 94

* Mezcla a una relacion 1:1:1

# Mezcla a una relacion 1:1

X Mezcla a una relacion 1:1

+ Mezcla a una relacion 1:1

Tabla 2. Segunda ronda de amplificaciones de Vkappa, Vlambda y VH

Nombre del cebador

Secuencia de nucleotidos del cebador SEQ ID NO

OK1S (HuVK1 B-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG GAC ATC CAG WTG ACC CAG TCT CC 95

OK2S (HuVK2-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC 96

OK3S (HuVK2B2-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG GAT ATT GTG ATG ACC CAG ACT CC 97

OK4S (HuVK3B-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG GAA ATT GTG WTG ACR CAG TCT CC 98

OK5S (HuVK5-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC 99

OK6S (HuVK6-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC 100

OJK1 (HuJK1-NOT)

GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC 101

OJK2 (HuJK2-NOT)

GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC 102

OJK3 (HuJK3-NOT)

GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCC 103

OJK4 (HuJK4-NOT)

GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAC CTT GGT CCC 104

OJK5 (HuJK5-NOT)

GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT AAT CTC CAG TCG TGT CCC 105

OL1S (HuVL1A-SAL)*

TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CC 106

OL1S (HuVLIB-SAL)*

TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG TCT GTG YTG ACG CAG CCG CC 107

OL1S (HuVL1C-SAL)*

TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG TCT GTC GTG ACG CAG CCG CC 108

OL2S (HuVL2B-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG TCT GCC CTG ACT CAG CC 109

OL3S (HuVL3A-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG TCC TAT GWG CTG ACT CAG CCA CC 110

OL4S (HuVL3B-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG TCT TCT GAG CTG ACT CAG GAC CC 111

Nombre del cebador

Secuencia de nucleotidos del cebador SEQ ID NO

OL5S (HuVL4B-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG CYT GTG CTG ACT CAA TC 112

OL6S (HuVL5-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG GCT GTG CTG ACT CAG CCG TC 113

OL7S (HuVL6-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG AAT TTT ATG CTG ACT CAG CCC CA 114

OL8S (HuVL7/8-SAL)

TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG RCT GTG GTG ACY CAG GAG CC 115

OL9S (HuVL9-SAL)#

TGA GCA CAC AGG TCG ACG CWG CCT GTG CTG ACT CAG CCM CC 116

OL9S (HuVL10-SAL)#

TGA GCA CAC AGG TCG ACG CAG GCA GGG CTG ACT CAG 117

OJL1 (HuJL1-NOT)

GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT GAC CTT GGT CCC 118

OJL2 (HuJL2/3-NOT)

GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC 119

OJL3 (HuJL7-NOT)

GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC GAG GAC GGT CAG CTG GGT GCC 120

OH1S (HuVH1B-SFI)+

GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG RTG CAG CTG GTG CAR TCT GG 121

OH1S (HuVH1C-SFI)+

GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC SAG GTC CAG CTG GTR CAG TCT GG 122

OH2S (HuVH2B-SFI)

GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT GG 123

OH3S (HuVH3A-SFI)

GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAG 124

OH4S (HuVH3C-SFI)

GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAG WCY GG 125

OH5S (HuVH4B-SFI)

GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG 126

OH6S (HuVH4C-SFI)

GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG STG CAG CTG CAG GAG TCS GG 127

OH7S (HuVH6A-SFI)

GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG 128

OJH1 (HuJH1/2-XHO)

GAG TCA TTC TCG ACT CGA GAC RGT GAC CAG GGT GCC 129

OJH2 (HuJH3-XHO)

GAG TCA TTC TCG ACT CGA GAC GGT GAC CAT TGT CCC 130

OJH3 (HuJH4/5-XHO)

GAG TCA TTC TCG ACT CGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC 131

OJH4 (HuJH6-XHO)

GAG TCA TTC TCG ACT CGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC 132

* Mezcla a una relacion 1:1:1 # Mezcla a una relacion 1:1 + Mezcla a una relacion 1:1

Tabla 3. Resumen de segunda ronda de amplificacion de regiones VL

Molde

Cebador 5' Cebador 3' Producto Aportacion en PK/PL (%) Agrupacion Aportacion en VL (%)

K1

OK1S OJK1 K1J1 25 PK1 30

OK1S

OJK2 K1J2 25

OK1S

OJK3 K1J3 10

OK1S

OJK4 K1J4 25

OK1S

OJK5 K1J5 15

K2

OK2S OJK1 K2J1 25 PK2 4

OK2S

OJK2 K2J2 25

OK2S

OJK3 K2J3 10

OK2S

OJK4 K2J4 25

OK2S

OJK5 K2J5 15

K3

OK3S OJK1 K3J1 25 PK3 1

OK3S

OJK2 K3J2 25

OK3S

OJK3 K3J3 10

OK3S

OJK4 K3J4 25

OK3S

OJK5 K3J5 15

K4

OK4S OJK1 K4 J1 25 PK4 19

OK4S

OJK2 K4 J2 25

OK4S

OJK3 K4 J3 10

OK4S

OJK4 K4 J4 25

OK4S

OJK5 K4 J5 15

K5

OK5S OJK1 K5J1 25 PK5 1

OK5S

OJK2 K5J2 25

OK5S

OJK3 K5J3 10

OK5S

OJK4 K5J4 25

OK5S

OJK5 K5J5 15

K6

OK6S OJK1 K6J1 25 PK6 5

OK6S

OJK2 K6J2 25

OK6S

OJK3 K6J3 10

OK6S

OJK4 K6J4 25

OK6S

OJK5 K6J5 15

L1

OL1S OJL1 L1J1 30 PL1 14

OL1S

OJL2 L1J2 60

OL1S

OJL3 L1J3 10

L2

OL2S OJL1 L2J1 30 PL2 10

OL2S

OJL2 L2J2 60

OL2S

OJL3 L2J3 10

L3

OL3S OJL1 L3J1 30 PL3 10

OL3S

OJL2 L3J2 60

OL3S

OJL3 L3J3 10

L4

OL4S OJL1 L4J1 30 PL4 1

OL4S

OJL2 L4J2 60

OL4S

OJL3 L4J3 10

L5

OL5S OJL1 L5J1 30 PL5 1

OL5S

OJL2 L5J2 60

OL5S

OJL3 L5J3 10

L6

OL6S OJL1 L6J1 30 PL6 1

OL6S

OJL2 L6J2 60

OL6S

OJL3 L6J3 10

L7

OL7S OJL1 L7J1 30 PL7 1

OL7S

OJL2 L7J2 60

OL7S

OJL3 L7J3 10

Molde

Cebador 5' Cebador 3' Producto Aportacion en PK/PL (%) Agrupacion Aportacion en VL (%)

L8

OL8S OJL1 L8J1 30 PL8 1

OL8S

OJL2 L8J2 60

OL8S

OJL3 L8J3 10

L9

OL9S OJL1 L9J1 30 PL9 1

OL9S

OJL2 L9J2 60

OL9S

OJL3 L9J3 10

VL 100%

Tabla 4. Resumen de segunda ronda de amplificacion de regiones VH

Molde

Cebador 5' Cebador 3' Producto Aportacion en PK/PL (%) Agrupacion Aportacion en VH (%)

H1

OH1S OJH1 H1J1 10 PH1 25

OH1S

OJH2 H1J2 10

OH1S

OJH3 H1J3 60

OH1S

OJH4 H1J4 20

H2

OH2S OJH1 H2J1 10 PH2 2

OH2S

OJH2 H2J2 10

OH2S

OJH3 H2J3 60

OH2S

OJH4 H2J4 20

H3

OH3S OJH1 H3J1 10 PH3 25

OH3S

OJH2 H3J2 10

OH3S

OJH3 H3J3 60

OH3S

OJH4 H3J4 20

H4

OH4S OJH1 H4J1 10 PH4 25

OH4S

OJH2 H4 J2 10

OH4S

OJH3 H4 J3 60

OH4S

OJH4 H4 J4 20

H5

OH5S OJH1 H5J1 10 PH5 2

OH5S

OJH2 H5J2 10

OH5S

OJH3 H5J3 60

OH5S

OJH4 H5J4 20

H6

OH6S OJH1 H6J1 10 PH6 20

OH6S

OJH2 H6J2 10

OH6S

OJH3 H6J3 60

OH6S

OJH4 H6J4 20

H7

OH7S OJH1 H7J1 10 PH7 1

OH7S

OJH2 H7J2 10

OH7S

OJH3 H7J3 60

OH7S

OJH4 H7J4 20

VH 100 %

Tabla 5: Actividad de union cruzada de anticuerpos de fago monocatenarios precipitados con PEG/NaCl y 5 esterilizados por filtracion para HA de diferentes subtipos, medida por ELISA. + = union (>4x fondo); +/- = union baja

(2-4x fondo) - = union no detectable; H1 = HA de gripe A subtipo H1; H3 = HA de gripe A subtipo H3; H5 = HA de gripe A subtipo H5; H7 = HA de gripe A subtipo H7; B= HA de virus de la gripe B; Rabia=glucoprotelna del virus de la ___________________________________rabia (control negativo).___________________________________

Fago ELISA midi

H1 H3 H5 H7 B Rabia

sc09-003

+ + + + + -

sc09-004

+ + + + + -

sc09-005

+ + + + + -

sc09-006

+ + + + + -

sc09-007

+ +/- + + +/- -

sc09-008

+ +/- + + +/- -

sc09-009

+ +/- + + +/- -

sc09-010

+ + + + +/- -

Fago ELISA midi

H1 H3 H5 H7 B Rabia

sc09-011

+ + + + + -

sc09-012

+ + + + - -

sc09-029

+ +/- + + - -

sc09-030

+ + + + + -

sc09-031

+ +/- + + - -

sc09-112

+ + + + + -

sc09-113

+ + + + + -

sc09-114

+ + + + + -

Tabla 6. Analisis FACS de anticuerpos de fago precipitados con PEG/NaCI y esterilizados por filtracion. + = union (>4x fondo); +/- = union baja (2-4x fondo) - = union no detectable; PER.c6=celulas PER.C6 no transfectadas ____(control); mH1, mH3, mH7= HA unida a membrana de los subtipos H1, H3 y H7, respectivamente.______

Fago Facs midi (% UL clasificado)

PerC6 mH1 mH3 mH7

sc09-003

- + + +

sc09-004

- + + +

sc09-005

- + + +

sc09-006

- + + +

sc09-007

- + +/- +

sc09-008

- + +/- +

sc09-009

- + +/- +

sc09-010

- + + +

sc09-011

- + + +

sc09-012

- + + +

sc09-029

- + - +/-

sc09-030

- + + +

sc09-031

- + - +/-

sc09-112

- + + +

sc09-113

- + + +

sc09-114

- + + +

5

32

Tabla 7. Datos de las regiones CDR de las inmunoglobulinas especlficas para HA. La SEQ ID NO se proporciona entre parentesis.

IgG n.°

VH CDR1 de HC CDR2 de HC CDR3 de HC VL CDR1 de LC CDR2 de LC CDR3de LC

CR9003

IGHV1-69*06 GGTSNNFG (133) ISPIFGST (134) ARHGNYYFYSGMDL (135) IGLV3-21*02 NVGSNS (136) DDR (137) QVWDSSSDHRV (138)

CR9004

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) VSPIFGST (140) ARHGNYYYNSGMDV (141) IGLV1-44*01 DSNIGRRS (142) SND (143) AAWDDSLKGAV (144)

CR9005

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGST (134) ARHGNYYYYSGMDL (145) IGLV2-14*01 SSDVGGYN Y (146) DVS (174) CSYAGSAKGV (147)

CR9006

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGST (134) ARHGNYYYYSGMDL (145) IGLV3-21*02 NIGSKT (148) GDS (149) QVWDSSSDHPGAV (150)

CR9007

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGSA (151) ARHGNYYYYSGMDV (152) IGLV1-44*01 SSNIGSNT (153) GDD (154) ATWDDSLNGHV (155)

CR9008

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGST (134) ARHGNYYYYSGMDV (152) IGLV3-21*02 NIGSKT (148) GDS (149) QVWDSSSDHPGAV (150)

CR9009

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGST (134) ARHGNYYYYSGMDV (152) IGKV1-12*01 QHISSW (156) SAS (157) QQANSFPLT (158)

CR9010

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGST (134) ARHGNYYYYSGMDV (152) IGLV3-21*02 NIGSKT (148) VDS (159) QVWDSNSDHPGAV (160)

CR9011

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGSA (151) ARHGNYYYYSGTDV (161) IGLV1-44*01 DSNIGRRS (142) SND (143) AAWDDSLKGAV (144)

CR9012

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGSA (151) ARHGTYYYYSGMDV (162) IGLV1-40*02 SSNIGAGYD (163) GNN (164) QSYDQNLSEGV (165)

CR9029

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGST (134) ARHGNYYYYSGMDV (152) IGKV3-20*01 QSVSSY (166) GAS (167) QQYGSSPFA (168)

CR9030

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGST (134) ARHGNYYYYSGMDV (152) IGLV3-21*02 NIGSKS (169) GDS (149) QVWDSSSDHPGAV (150)

CR9031

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGST (134) ARHGNYYYNSGMDV (141) IGLV1-40*01 SSNIGAGYD (163) DNN (169) QSYDSGLSASPYV (170)

CR9112

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGST (134) ARHGNYYYYSGMDV (152) IGLV1-40*01 SANIGAGYD (171) GNN (164) QSYDSSLSGAL (172)

CR9113

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGST (134) ARHGNYYYYSGMDL (145) IGLV1-44*01 DSNIGRRS (142) SND (143) AAWDASLSGPV (173)

CR9114

IGHV1-69*06 GGTSNNYA (139) ISPIFGST (134) ARHGNYYYYSGMDV (152) IGLV1-44*01 DSNIGRRS (142) SND (143) AAWDDSLKGAV (144)

Claims (7)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de union a antlgeno del mismo, capaz de unirse especlficamente a un epltopo en la region de tallo de la protelna hemaglutinina (HA) de los subtipos de virus de la gripe A del grupo filogenetico 1 y los subtipos de virus de la gripe A del grupo filogenetico 2, y capaz de neutralizar a al menos uno o mas subtipos de virus de la gripe A del grupo 1, seleccionado entre el grupo que consiste en virus de la gripe A que comprenden HA de los subtipos H1, H2, H5, H6, H8, H9 y H11, y al menos uno o mas subtipos de virus de la gripe A del grupo 2, seleccionado entre el grupo que consiste en virus de la gripe A que comprenden HA de los subtipos H3, H4, H7, y H10, caracterizado por que el anticuerpo o el fragmento de union a antlgeno del mismo tambien es capaz de unirse especlficamente a la protelna hemaglutinina (HA) de subtipos del virus de la gripe B.
2. 2. Un anticuerpo o fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo o el fragmento de union a antlgeno del mismo no tiene actividad inhibidora de la hemaglutininacion.
3. 3. Un anticuerpo o fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo o el fragmento de union a antlgeno del mismo se selecciona entre el grupo que consiste en:

   un anticuerpo o fragmento de union a antlgeno del mismo que comprende una region CDR1 de cadena pesada

   de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena

   pesada de SEQ ID NO: 145, y una region CDR1 de cadena ligera de SEQ ID No: 146, una region CDR2 de

   cadena ligera de SEQ ID NO: 174, y una region CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 147,

   una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO:

   134,

   y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 145, y una region CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO: 148, una region CDR2 de cadena ligera de SEQ ID NO: 149, y una region CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 150,

   una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134,

   y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 145, y una region CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO: 142, una region CDR2 de cadena ligera de SEQ ID NO: 143, y una region CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 173;

   un anticuerpo o fragmento de union a antlgeno del mismo que comprende una region CDR1 de cadena pesada

   de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, y una region CDR3 de cadena

   pesada de SEQ ID NO: 152, y una region CDR1 de cadena ligera de SEQ ID No: 148, una region CDR2 de

   cadena ligera de SEQ ID NO: 149, y una region CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 150,

   una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO:

   134,

   y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, y una region CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO: 156, una region CDR2 de cadena ligera de SEQ ID NO: 157, y una region CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 158,

   una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 130 y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, y una region CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO: 171, una region CDR2 de cadena ligera de SEQ ID NO: 164, y una region CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 172, y

   una region CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 139, una region CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 134,

   y una region CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 152, y una region CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO: 142, una region CDR2 de cadena ligera de SEQ ID NO: 143, y una region CDR3 de cadena ligera de SEQ ID NO: 144.
4. 4. Una molecula de acido nucleico que codifica un anticuerpo o un fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. 5. Un anticuerpo o un fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y/o una molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 4, para su uso como medicamento.
6. 6. Un anticuerpo o un fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con la reivindicacion 5 para su uso en el tratamiento profilactico y/o terapeutico de la infeccion por el virus de la gripe.
7. 7. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de union a antlgeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y/o una molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 4, y un excipiente farmaceuticamente aceptable.

   imagen1

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   Competicion con CR8020

   CR8020

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   Competicion con CR9114

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