ES2561216T3

ES2561216T3 - Inhibidores de cinasas dependientes de ciclina y procedimientos de uso

Info

Publication number: ES2561216T3
Application number: ES10775575.3T
Authority: ES
Inventors: Norman E. Sharpless; Patrick J. Roberts; Kwok-Kin Wong; Yan Liu; Soren Johnson
Original assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Current assignee: University of North Carolina at Chapel Hill
Priority date: 2009-05-13
Filing date: 2010-05-13
Publication date: 2016-02-25
Anticipated expiration: 2030-05-13
Also published as: EP2429566A2; CA2761896A1; EP3025724A1; EP3406260A2; US20120100100A1; CN102458443A; AU2010248886A1; WO2010132725A2; EP3406260A3; IL216315A0; WO2010132725A3; JP2012526850A; US9616062B2; EP2429566B1; EP3718560A3; EP3718560A2; EP3406260B1; EP3025724B1; US20140227222A1; EP2429566A4

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un compuesto inhibidor que inhibe selectivamente la cinasa dependiente de ciclina 4 (CDK4) y/o la cinasa dependiente de ciclina 6 (CDK6) para uso en un procedimiento para aumentar la eficacia de los factores de crecimiento para el rescate y apoyo de las poblaciones de células hematopoyéticas en un sujeto que recibe un tratamiento contra el cáncer para un cáncer que no depende de las actividades de CDK4/6 para su proliferación, en que dicho procedimiento comprende (i) la administración a un sujeto de una cantidad farmacéuticamente eficaz del compuesto inhibidor, (ii) la exposición de dicho sujeto a un agente que daña el ADN para el tratamiento del cáncer y (iii) la administración de un factor de crecimiento para el rescate y apoyo de la población de células hematopoyéticas.

Description

DESCRIPCION

Inhibidores de cinasas dependientes de ciclina y procedimientos de uso 5 CAMPO TECNICO

[0001] La materia presentemente desvelada se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden inhibidores de las cinasas dependientes de ciclina 4/6 (CDK4/6) para inducir quiescencia farmacologica en ciertas poblaciones de celulas madre y progenitoras en un sujeto mamlfero y, de este modo, mejorar el desenlace cllnico de

10 este sujeto.

ABREVIACIONES

[0002]

15

% = porcentaje pg = microgramo 20 pl = microlitro pM = micromolar

2BrlC = 2-bromo-12,13-dihidro-5H-indol[2,3-a]pirrol[3,4]carbazol-5,6-diona 25

MO = medula osea

CMN-MO = celulas mononucleares de medula osea

30 BrdU = 5-bromo-2-desoxiuridina

NUS = nitrogeno ureico sangulneo

CAFC = celulas formadoras de areas en empedrado 35

HgC = hemograma completo CDK = cinasa dependiente de ciclina

40 CDK4/6 = cinasa dependiente de ciclina 4 y/o cinasa dependiente de ciclina 6

CLP = progenitores linfoides comunes

CMP = progenitores mieloides comunes 45

SNC = sistema nervioso central

DMEM = medio de Eagle modificado por Dulbecco

50 DMSO = dimetilsulfoxido

ADN = acido desoxirribonucleico

DOX = doxorrubicina 55

EPO = eritropoyetina Etop = etoposido

FACS = clasificacion de celulas activada por fluorescencia SBF = suero bovino fetal 5 g = gramo

CG = centro germinal

G-CSF = factor estimulante de colonias de granulocitos

10

GEMM = modelo murino manipulado por ingenierla genetica GM-CSF = factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos 15 GMP = progenitores de granulocitos y monocitos Gy = gray h = horas

20

HPLC = cromatografla llquida de alto rendimiento

HSC = celulas madre hematopoyeticas

25 HSPC = celulas madre y progenitoras hematopoyeticas

CI50 = concentracion inhibitoria del 50 %

IHC = inmunohistoqulmica 30

IL = interleucina

IP = intraperitoneal

35 RI = radiacion ionizante

PTI = purpura trombocitopenica idiopatica

kg = kilogramo 40

LT-HSC = celula madre hematopoyetica a largo plazo

MEP = progenitores de megacariocitos y eritrocitos

45 mg = miligramo

MPP = progenitor multipotente

nM = nanomolar 50

NP-CGG = nitrofenilacetil-gammaglobulina de pollo

PD = 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-(5-piperazin-1 -ilpiridi n-2-ilamino)-8H-pi rido[2,3d]pirimidin-7-ona 55 (tambien denominada PD 0332991)

AR = artritis reumatoide

RB = protelna supresora tumoral del retinoblastoma

ULR = unidades lumlnicas relativas

EEM = error estandar de la media 5

LES = lupus eritematoso sistemico ST-HSC = celula madre hematopoyetica a corto plazo 10 Sv = sieved

tHDF = fibroblasto diploide humano telomerizado

PTT = purpura trombocitopenica trombotica 15

ANTECEDENTES

[0003] El tratamiento del cancer incluye a menudo el uso de farmacos que danan el ADN y/u otros agentes que danan el ADN, como la radiacion ionizante. Estos tratamientos pueden ser inespeclficos y, en particular en dosis

20 altas, toxicos para las celulas normales, de division rapida. Con frecuencia, esto ocasiona diversos efectos secundarios en los pacientes que reciben tratamiento contra el cancer.

[0004] Por ejemplo, la depresion de la medula osea, una fuerte reduccion de la produccion de celulas sangulneas en la medula osea, es uno de tales efectos secundarios. Se caracteriza por mielodepresion (anemia,

25 neutropenia, agranulocitosis y trombocitopenia) y linfopenia. La neutropenia se caracteriza por una disminucion selectiva del numero de neutrofilos circulantes y un aumento de la predisposicion a infecciones bacterianas. La anemia, una reduccion del numero de globulos rojos o eritrocitos, de la cantidad de hemoglobina o del volumen concentrado de globulos rojos (caracterizado por la determinacion del hematocrito), afecta aproximadamente al 67 % de los pacientes de cancer que reciben quimioterapia en los Estados Unidos. Vease BioWorld Today, pagina 4, 23 30 de julio de 2002. La trombocitopenia es una reduccion del numero de plaquetas con aumento de la propension a hemorragias. La linfopenia es un efecto secundario comun de la quimioterapia, caracterizado por la reduccion del numero de linfocitos circulantes (tambien denominados linfocitos T y B). Los pacientes linfopenicos tienen predisposicion a una serie de tipos de infecciones.

35 [0005] Por lo tanto, el profesional medico tlpicamente tiene que sopesar la eficacia de las tecnicas quimioterapeuticas y radioterapeuticas para destruir las celulas de proliferacion anormal frente a los efectos citotoxicos asociados sobre las celulas normales. A causa de ello, el Indice terapeutico de las tecnicas de quimioterapia y radioterapia disminuye, lo que a menudo resulta en una reduccion incompleta del tumor, una recidiva tumoral, un aumento de la carga tumoral y la induccion de tumores resistentes a quimioterapia y/o radiacion.

40

[0006] Se han disenado numerosos procedimientos en un esfuerzo para reducir el dano a los tejidos normales mientras todavla se administran dosis terapeuticamente eficaces de los agentes que danan el ADN. Con respecto a la RI, estas tecnicas incluyen la braquiterapia, la dosificacion fraccionada y hiperfraccionada, complicados sistemas de programacion y administracion de las dosis y un tratamiento de alta tension con un acelerador lineal. Sin

45 embargo, tales tecnicas solo intentan alcanzar un equilibrio entre los efectos terapeuticos y los efectos indeseados de la radiacion y no se ha conseguido una eficacia plena.

[0007] Para reducir algunos de los efectos secundarios de ciertos compuestos quimioterapeuticos, se han usado moleculas pequenas. Por ejemplo, se ha usado leucovorina para mitigar los efectos del metotrexato sobre las

50 celulas de la medula osea y las celulas de la mucosa gastrointestinal. Asimismo, se ha usado amifostina para reducir la incidencia de fiebre y mucositis relacionadas con la neutropenia en pacientes que reciben farmacos quimioterapeuticos alquilantes o con platino. Ademas, se ha usado dexrazoxano para proporcionar cardioproteccion frente a compuestos contra el cancer antracicllnicos. Desafortunadamente, es motivo de preocupacion que muchos farmacos quimioprotectores, como dexrazoxano y amifostina, puedan disminuir la eficacia de la quimioterapia si se 55 administran simultaneamente.

[0008] Otros tratamientos quimioprotectores adicionales incluyen el uso de factores de crecimiento. Hay factores de crecimiento hematopoyeticos disponibles en el mercado como protelnas recombinantes. Estas protelnas incluyen el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y el factor estimulante de colonias de granulocitos

y macrofagos (GM-CSF) y sus derivados para el tratamiento de la neutropenia y la eritropoyetina (EPO) y sus derivados para el tratamiento de la anemia. Sin embargo, aunque los factores de crecimiento pueden apresurar la recuperacion de algunos linajes de celulas sangulneas, no tratan la reduccion de las plaquetas, macrofagos ni linfocitos T o B.

5

[0009] Se ha demostrado que el inhibidor de cinasas no selectivo estaurosporina ofrece proteccion contra los agentes que danan el ADN en algunos tipos de celulas cultivadas. Vease Chen y col., J. Natl. Cancer Inst., 92, 19992008 (2000); y Ojeda y col., Int. J. Radiat. Biol., 61, 663-667 (1992). La estaurosporina es un producto de origen natural y un inhibidor de cinasas no selectivo que se une a la mayorla de las cinasas con gran afinidad. Vease 10 Karaman y col., Nat. Biotechnol., 26, 127-132 (2008). El tratamiento con estaurosporina puede desencadenar un conjunto de respuestas celulares, incluida la apoptosis, la parada del ciclo celular y el compromiso de los puntos de control del ciclo celular, dependiendo del tipo celular, la concentration del farmaco y la duration de la exposition. Por ejemplo, se ha demostrado que la estaurosporina sensibiliza las celulas a agentes que danan el ADN como la radiation ionizante y la quimioterapia (vease Bernhard y col., Int. J. Radiat. Biol., 69, 575-584 (1996); Teyssier y col., 15 Bull. Cancer, 86, 345-357 (1999); Hallahan y col., Radiat. Res., 129, 345-350 (1992); Zhang y col., J. Neurooncol., 15, 1-7 (1993); Guo y col., Int. J. Radiat. Biol., 82, 97-109 (2006); Bucher y Britten, Br. J. Cancer, 98, 523-528 (2008); Laredo y col., Blood, 84, 229-237 (1994); Luo y col., Neoplasia, 3, 411-419 (2001); Wang y col., Yao Xue Xue Bao, 31, 411-415 (1996); Chen y col., J. Natl. Cancer Inst., 92, 1999-2008 (2000); e Hirose y col., Cancer Res., 61, 58435849 (2001)) a traves de varios mecanismos propuestos que incluyen la anulacion de una respuesta del punto de 20 control de G2. El mecanismo por el que el tratamiento con estaurosporina ofrece proteccion frente a los agentes que danan el ADN en algunos tipos de celulas cultivadas no esta claro, habiendose sugerido algunos mecanismos posibles que incluyen la inhibition de la protelna-cinasa C o la disminucion de los niveles protelnicos de CDK4. Vease Chen y col., J. Natl. Cancer Inst., 92, 1999-2008 (2000); y Ojeda y col., Int. J. Radiat. Biol., 61, 663-667 (1992). No se ha observado ningun efecto de la estaurosporina sobre los progenitores hematopoyeticos, ni tampoco 25 se ha demostrado que el uso de la estaurosporina bastante despues de la exposicion a los agentes que danan el ADN ofrezca proteccion. Ademas, la inhibicion de cinasas no selectiva de la estaurosporina ha dado lugar a toxicidades significativas, con independencia de sus efectos sobre el ciclo celular (por ejemplo, hiperglucemia), despues de su administration in vivo a mamlferos, y estas toxicidades han descartado su uso cllnico.

30 [0010] Por consiguiente, existe una necesidad permanente de procedimientos practicos para proteger a los sujetos para los que esta previsto que experimenten, presentan riesgo de experimentar o han experimentado ya una exposicion a agentes que danan el ADN, as! como de procedimientos para aumentar la eficacia de los agentes reductores de la toxicidad.

35 RESUMEN

[0011] Un objetivo de la materia presentemente desvelada es proporcionar una composition farmaceutica para uso en un procedimiento para aumentar la eficacia de los factores de crecimiento para el rescate y apoyo de las poblaciones de celulas hematopoyeticas en sujetos frente a los efectos de los agentes que danan el ADN mediante

40 la administracion al sujeto de una cantidad eficaz de un compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6.

[0012] Habiendo expuesto anteriormente en este documento un objetivo de la materia presentemente desvelada, el cual se consigue mediante la materia presentemente desvelada, otros objetivos seran evidentes a medida que proceda la description, tomada en conjunto con los dibujos acompanantes mejor descritos a

45 continuation.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0013]

50

Figura 1: La inhibicion de CDK4/6 potencia la eficacia de la recuperacion mediada por eritropoyetina del linaje celular eritrocltico despues del dano en el ADN. Se administra a cohortes (ocho ratones por cohorte) de ratones de tipo natural (FVB/n) irradiados (6,5 Gy) placebo, eritropoyetina (EPO), un inhibidor de CDK4/6 (PD0332991) o una combination del inhibidor de CDK4/6 y EPO (PD0332991 + ePo). El dla 17 despues del tratamiento se llevan a 55 cabo extracciones de sangre seriadas y hemogramas completos para determinar el numero de globulos rojos, de las diversas subpoblaciones de leucocitos y de plaquetas. El efecto del tratamiento sobre las plaquetas se muestra en el panel superior izquierdo, los globulos rojos (GR) en el panel superior derecho, la hemoglobina (Hb) en el panel inferior izquierdo y el hematocrito (HCT) en el panel inferior derecho. Las barras de error representan +/- EEM.

Figura 2A: La inhibicion de CDK4/6 induce una parada en G1 en celulas epiteliales primarias de los tubulos proximales de rinon humano. Histogramas representativos del analisis del ciclo celular de celulas epiteliales primarias de los tubulos proximales de rinon humano tratadas con concentraciones variables de PD0332991 durante 16 horas. Las celulas se recogieron, se fijaron, se tineron y se analizaron por citometrla de flujo. Los datos se 5 ajustaron mediante el software Mod-FitTM de Verity (Verity Software House, Topsham, Maine, Estados Unidos). Unas concentraciones crecientes del inhibidor de CDK4/6 producen una parada “limpia” en G1, sin evidencia de citotoxicidad.

Figura 2B: La inhibicion de CDK4/6 induce una parada en G1 en celulas epiteliales primarias de los tubulos 10 proximales de rinon humano. Analisis del ciclo celular de celulas epiteliales primarias de los tubulos proximales de rinon humano tratadas con concentraciones variables de PD0332991 durante 16 horas. Las celulas se recogieron, se fijaron, se tineron y se analizaron por citometrla de flujo. Los datos se ajustaron mediante el software Mod-FitTM de Verity (Verity Software House, Topsham, Maine, Estados Unidos). En el grafico se muestran los correspondientes % de celulas en G1 (rombos), G2/M (cuadrados) y S (triangulos).

15

Figura 3: La inhibicion de CDK4/6 bloquea la proliferacion de las celulas primarias del epitelio tubular proximal de rinon humano. Las celulas se trataron con concentraciones variables de PD0332991 durante 72 horas. La proliferacion celular se cuantifico despues de la incubacion con CellTiter-Glo® (Promega, Madison, Wisconsin, Estados Unidos). Los datos representan la media de cuatro replicas (unidades lumlnicas relativas, ULR) +/- la 20 desviacion estandar.

Figura 4: La inhibicion de CDK4/6 anula el dano en el ADN inducido por etoposido en celulas epiteliales primarias de los tubulos proximales de rinon humano. Las celulas se pretrataron con concentraciones variables de PD0332991 durante 16 horas y despues con etoposido (Etop) durante 8 horas. Las celulas se recogieron, se fijaron y se tineron 25 con anti-YH2AX-FITC y se analizaron por citometrla de flujo. Los datos se analizaron mediante el software FlowJo (Treestar, Inc., Ashland, Oregon, Estados Unidos). El % de celulas positivas para yH2AX se muestra en el grafico acompanante.

Figura 5: La inhibicion de CDK4/6 protege las celulas epiteliales primarias de los tubulos proximales de rinon 30 humano frente a la muerte celular inducida por etoposido. PD0332991 inhibe la citotoxicidad inducida por la quimioterapia de manera dependiente de CDK4/6. Las celulas epiteliales primarias de los tubulos proximales de rinon humano se incubaron con PD0332991 30 nM o 100 nM durante 16 horas. Se anadio etoposido (Etop 2,5 pM) durante 8 horas. Despues de la incubacion, el medio se sustituyo por medio fresco y las celulas se incubaron durante 7 dlas mas. La proliferacion celular se evaluo el dla 7 con CellTiter-Glo® (Promega, Madison, Wisconsin, 35 Estados Unidos). Las barras de error indican +/- la desviacion estandar.

Figura 6: La inhibicion de CDK4/6 bloquea la incorporacion de EdU en el rinon entero de ratones tratados con cisplatino. Los ratones se trataron con PD0332991 (150 mg/kg) administrado por via oral una hora antes de la inyeccion intraperitoneal (IP) de cisplatino (10 mg/kg). Se administro EdU (100 pg/raton) por via IP 24 horas antes 40 del sacrificio. Se extirparon los rinones y se prepararon aislamientos de celulas individuales que se tineron para determinar la incorporacion de EdU. La proliferacion se evaluo por citometrla de flujo. Los datos representan el % de tincion de EdU en celulas sin tratar, celulas tratadas con cisplatino y celulas tratadas con cisplatino y PD0332991.

Figura 7: La inhibicion de CDK4/6 protege la funcion renal en ratones tratados con cisplatino. Se trataron cohortes 45 de ratones con cisplatino (10 mg/kg, IP) solamente (cuadrados), PD0332991 (150 mg/kg, por via oral) solamente (rombos) o inmediatamente antes del cisplatino (10 mg/kg) (triangulos). La funcion renal se midio el dla 7 por cuantificacion del nitrogeno ureico sangulneo (NUS) en mg/dl y la creatinina serica (Cr suero) en mg/dl. Los datos representan la media de seis animales por cohorte +/- el error estandar de la media.

50 Figura 8: La inhibicion de CDK4/6 potencia la proliferacion de celulas deficientes en RB. Llneas celulares de cancer de pulmon microcltico nulas para RB (H69, H82, H209, H345) o con RB intacta (H417) se incubaron con PD0332991 durante 24 horas. Despues de la incubacion, se sustituyo el medio y las celulas se cultivaron durante siete dlas. La proliferacion celular se evaluo por medio del reactivo WST-1. Cada punto de datos representa la media de cuatro replicas +/- EEM. La inhibicion de CDK4/6 aumenta la proliferacion celular de las llneas celulares deficientes en RB. 55

Figura 9: La inhibicion de CDK4/6 potencia la eficacia de la quimioterapia en un modelo de raton de cancer de mama deficiente en RB. Se trataron ratones cada siete dlas durante tres semanas con PD0332991 (150 mg/kg por via oral) solamente, carboplatino (90 mg/kg IP) solamente o en combinacion con PD0332991 (carboplatino + PD0332991). Los datos son el % de variacion del volumen tumoral y representan la media de al menos 15 animales

por cohorte +/- EEM.

Figura 10: La inhibicion de CDK4/6 potencia la eficacia de la quimioterapia en un modelo de raton de cancer de mama deficiente en RB. Se trataron ratones cada siete dlas durante tres semanas con carboplatino (90 mg/kg IP) 5 solamente (cuadrados oscuros) o en combinacion con PD0332991 (150 mg/kg por via oral; cuadrados claros). Los datos son el % de variacion del volumen tumoral y representan la media de al menos 15 animales por cohorte +/- EEM.

Figura 11A: La inhibicion aguda de CDK4/6 inhibe selectivamente la proliferacion homeostatica de linfocitos T de 10 memoria. Los ratones se trataron con PD0332991 (150 mg/kg por via oral). La proliferacion de los linfocitos T se evaluo mediante BrdU y citometrla de flujo.

Figura 11B: Muestra graficos de los datos de proliferacion de linfocitos T mostrados en la figura 11A.

15 Figura 11C: La inhibicion aguda de CDK4/6 inhibe selectivamente la formacion de centros germinales en ratones. Los ratones se trataron con PD0332991 (150 mg/kg por via oral). La formacion de centros germinales se evaluo mediante inmunohistoqulmica con Ki67.

Figura 12: Los inhibidores de CDK4/6 como inmunodepresores humanos. Diseno experimental para probar los 20 inhibidores de CDK4/6 como inmunodepresores humanos.

Figura 13: Los inhibidores de CDK4/6 inhiben la proliferacion de linfocitos T tras su estimulacion a traves de la ruta de los receptores de linfocitos T (TCR) en ambos compartimentos, de memoria y virgen. Se purificaron linfocitos T de sangre periferica humana mediante el separador Automacs por seleccion positiva con CD3 antes de su tratamiento 25 con los inhibidores de CDK4/6 y se estimularon con PMA e ionomicina durante 48 horas. La proliferacion de los linfocitos T de memoria (CD45RA+) o virgen (CD45RA-) despues de la estimulacion con PMA e ionomicina se midio mediante tincion FACS de las celulas BrdU+ o Ki67+. Se muestran los porcentajes de inhibicion, que indican mayor inhibicion del compartimento de memoria que del compartimento virgen.

30 Figura 14: Los inhibidores de CDK4/6 inhiben la proliferacion de linfocitos T tras su estimulacion a traves de la ruta de los TCR. Los linfocitos T tienen una proliferacion mas activa despues de su estimulacion a traves de la ruta de los TCR, que se anula por la inhibicion de CDK4/6. Una inhibicion similar se observo tambien en el compartimento de CD8+. La proliferacion se determino por la incorporacion de BrdU o Ki67. L4D = 2BrIC, las barras de error indican +/- EEM.

35

Figura 15: Cambios en la composition de los linfocitos T CD4 despues de la inhibicion de CDK4/6. Los inhibidores de CDK4/6 inhiben la proliferacion de linfocitos T tras su estimulacion a traves de la ruta de los TCR. Se muestran los linfocitos T de memoria centrales (CCR7- CD45RA-), efectores (CCR7+ CD45RA+), vlrgenes (CCR7+ CD45RA+) y terminalmente diferenciados (CCR7- CD45RA+). Las fracciones de linfocitos T de memoria y terminalmente 40 diferenciados, segun se determinan por la incorporacion de BrdU, se reducen despues de la inhibicion de CDK4/6. LD4 = 2BrIC. Resultados similares en el compartimento de CD8+.

Figura 16: Cambios en la composicion de los linfocitos T CD4 despues de la inhibicion de CDK4/6. Los inhibidores de CDK4/6 inhiben la proliferacion de linfocitos T tras su estimulacion a traves de la ruta de los TCR. Se muestran 45 los linfocitos T de memoria centrales (CCR7- CD45RA-), efectores (CCR7+ CD45RA+), vlrgenes (CCR7+ CD45RA+) y terminalmente diferenciados (CCR7- CD45RA+). Las fracciones de linfocitos T de memoria y terminalmente diferenciados, segun se determinan por la incorporacion de Ki67, se reducen despues de la inhibicion de CDK4/6. LD4 = 2BrIC.

50 Figura 17A: Inhibicion preferente de la proliferacion de los linfocitos T de memoria y TD en linfocitos T CD4+. Se muestran los linfocitos T de memoria centrales (CCR7- CD45RA-), efectores (CCR7+ CD45RA+), vlrgenes (CCR7+ CD45RA+) y terminalmente diferenciados (CCR7- CD45RA+). Diagramas de puntos representativos del flujo con el tratamiento indicado: vehlculo (DMSO), PD0332991 o 2BrIC.

55 Figura 17B: Inhibicion preferente de la proliferacion de los linfocitos T de memoria y TD en linfocitos T CD4+. El grafico muestra la relation entre los linfocitos T de memoria y los linfocitos T vlrgenes para los datos mostrados en la figura 17A. Las fracciones de linfocitos T de memoria y terminalmente diferenciados se reducen despues de la inhibicion de CDK4/6. LD4 = 2BrIC. Las barras de error indican +/- EEM.

Figura 17C: Inhibicion preferente de la proliferation de los linfocitos T de memoria y TD en linfocitos T CD4+. El grafico cuantifica el % de linfocitos T para los datos mostrados en la figura 17A. Las fracciones de linfocitos T de memoria y terminalmente diferenciados se reducen despues de la inhibicion de CDK4/6. Las barras de error indican +/- EEM.

5

Figura 18: Inhibicion preferente de la proliferacion de los linfocitos T de memoria y TD en linfocitos T CD8+. Se muestran los linfocitos T de memoria centrales (CCR7- CD45RA-), efectores (CCR7+ CD45RA+), vlrgenes (CCR7+ CD45RA+) y terminalmente diferenciados (CCR7- CD45RA+). Las fracciones de linfocitos T de memoria y terminalmente diferenciados se reducen despues de la inhibicion de CDK4/6. L4D = 2BrIC.

10

Figura 19: Inhibicion preferente de la proliferacion de los linfocitos T de memoria y TD. Los inhibidores de CDK4/6 inhiben la activation de los linfocitos T por PMA e ionomicina. Se estimularon linfocitos T de sangre periferica humana con PMA e ionomicina con o sin tratamiento con inhibidores de CDK4/6. La fraction de linfocitos T activados (CD25+) tras la estimulacion se midio mediante FACS. Se observo que la activacion de los linfocitos T disminula 15 despues del tratamiento con los inhibidores de CDK4/6. LD4 = 2BrIC.

Figura 20: Los inhibidores de CDK4/6 inhiben la proliferacion de linfocitos B despues de su estimulacion a traves de receptores de linfocitos B (BCR). Los linfocitos B se purificaron por selection mediante Automacs de los linfocitos CD19+. Se determino la incorporation de BrdU en linfocitos B perifericos humanos purificados despues de su 20 estimulacion con anti-IgM con o sin tratamiento con inhibidores de CDK4/6. La fraccion de linfocitos B proliferantes disminuyo 10 veces despues de la inhibicion con L4D. L4D = 2BrIC.

Figura 21: La inhibicion de CDK4/6 bloquea la proliferacion de los linfocitos T y B. Los animales se trataron con el inhibidor de CDK4/6 (PD0332991, barras blancas) o vehlculo (barras negras) durante 24 horas y despues se 25 sacrificaron. Se aislaron los esplenocitos, que se tineron para detectar marcadores de linfocitos B y T. Despues de seleccionar las poblaciones adecuadas se llevo a cabo una tincion con Ki67 como indicador de proliferacion y de la fase S. Las barras de error indican +/- EEM.

Figura 22: Los inhibidores de CDK4/6 bloquean la proliferacion de los linfocitos B. Los animales se trataron con el 30 inhibidor de CDK4/6 (150 mg/kg, en administration diaria por via oral) o vehlculo durante cuatro dlas y con BrdU en el agua de beber durante tres dlas. Despues del tratamiento con BrdU, los animales se sacrificaron. Se aislaron los esplenocitos, que se tineron para detectar marcadores de linfocitos B. Despues de seleccionar las poblaciones adecuadas se llevo a cabo una tincion con BrdU como indicador de proliferacion.

35 Figura 23: Los inhibidores de CDK4/6 bloquean la timopoyesis. Los animales se trataron con el inhibidor de CDK4/6 (150 mg/kg, en administracion diaria por via oral) o vehlculo durante cuatro dlas y entonces se evaluo el numero de timocitos por citometrla de flujo con la detection de celulas doblemente negativas (DN: CD4- CD8-), doblemente positivas (DP: CD4+ CD8+) o celulas simplemente positivas (SP) para CD4 o CD8. La inhibicion de CDK4/6 produjo una disminucion pronunciada de la production de nuevas celulas DP, con efectos moderados en las fracciones de 40 celulas DN y SP

DESCRIPCION DETALLADA

[0014] La materia presentemente desvelada se describira mas detalladamente a continuation, con referencia 45 a los ejemplos acompanantes, en los que se muestran realizaciones representativas. Sin embargo, la materia presentemente desvelada puede realizarse de formas diferentes y no debe interpretarse como limitada por las realizaciones expuestas en este documento. Mas bien, se proporcionan estas realizaciones para que la description sea minuciosa y completa y transmita plenamente el alcance de las realizaciones a los expertos en la tecnica.

50 [0015] A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientlficos usados en este documento tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la tecnica a la que corresponde la materia presentemente descrita.

[0016] A lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones, una formula qulmica o nombre dados 55 abarcan todos los isomeros opticamente activos y estereoisomeros, as! como las mezclas racemicas, en caso de que dichos isomeros y mezclas existan.

I. Definiciones

[0017] Aunque se piensa que un experto en la tecnica entiende bien los terminos siguientes, se exponen las definiciones siguientes para facilitar la explicacion de la materia presentemente desvelada.

[0018] Siguiendo una convention tradicional de la ley de patentes, los terminos “un”, “uno/a” y “el/la” se 5 refieren a “uno o mas” cuando se usan en esta solicitud, incluidas las reivindicaciones. As! por ejemplo, la referencia

a “un compuesto” o “una celula” incluye una pluralidad de tales compuestos o celulas, etc.

[0019] El termino “comprende”, que es sinonimo de “incluye”, “contiene” o “caracterizado por” es inclusivo o abierto y no excluye elementos o etapas de procedimiento adicionales no enumerados. “Comprende” es un termino

10 de la tecnica usado en el lenguaje de las reivindicaciones que significa que los elementos mencionados son esenciales, pero que pueden anadirse otros elementos y formar aun una construction dentro del alcance de la reivindicacion.

[0020] Segun se usa en este documento, la expresion “consta de” excluye cualquier elemento, etapa o 15 ingrediente no especificado en la reivindicacion. Cuando la expresion “consta de” aparece en una clausula del

cuerpo de una reivindicacion, mas bien que inmediatamente despues del preambulo, solamente limita el elemento expuesto en esa clausula; otros elementos no se excluyen de la reivindicacion en general.

[0021] Segun se usa en este documento, la expresion “consta esencialmente de” limita el alcance de una 20 reivindicacion a los materiales o etapas especificados, mas aquellos que no afectan materialmente las

caracterlsticas basicas y novedosas del objeto reivindicado.

[0022] Con respecto a los terminos “comprende”, “consta de” y “consta esencialmente de”, cuando uno de los tres terminos se usa en este documento, la materia presentemente desvelada y reivindicada puede incluir el uso de

25 cualquiera de los otros dos terminos.

[0023] El termino “y/o”, cuando se usa para describir dos elementos o condiciones, por ejemplo, CDK4 y/o CDK6, se refiere a situaciones en las que ambos elementos o condiciones estan presentes o son aplicables y a situaciones en las que solo uno de los elementos o condiciones esta presente o es aplicable. Por lo tanto, un

30 inhibidor de CDK4 y/o CDK6 puede ser un compuesto que inhibe CDK4 y CDK6, un compuesto que inhibe solo CDK4 o un compuesto que inhibe solo CDK6.

[0024] Por “celula sana” o “celula normal” se indica cualquier celula en un sujeto que no muestra caracterlsticas, slntomas y/o marcadores de una enfermedad (tal como, pero sin limitarse a cancer u otra

35 enfermedad proliferativa). En algunas realizaciones, la celula sana es una celula madre. En algunas realizaciones, la celula sana es una celula madre o progenitora hematopoyetica (HSPC). Las celulas progenitoras incluyen, pero no se limitan a celulas madre hematopoyeticas a largo plazo (LT-HSC), celulas madre hematopoyeticas a corto plazo (ST-HSC), progenitores multipotentes (MPP), progenitores mieloides comunes (CMP), progenitores linfoides comunes (CLP), progenitores de granulocitos y monocitos (GMP) y progenitores de megacariocitos y eritrocitos 40 (MEP). Las celulas progenitoras tambien incluyen celulas efectoras maduras derivadas de celulas madre hematopoyeticas, incluidos, pero sin limitarse a eritrocitos, plaquetas, granulocitos, macrofagos, linfocitos T y linfocitos B.

[0025] En algunas realizaciones, la celula sana es una celula en un tejido no hematopoyetico, tal como, pero 45 sin limitarse al hlgado, rinon, pancreas, cerebro, pulmon, glandulas suprarrenales, intestino, estomago, piel, sistema

auditivo, huesos, vejiga, ovarios, utero, testlculos, veslcula biliar, tiroides, corazon, islotes pancreaticos, vasos sangulneos y similares.

[0026] Por “agentes que danan el ADN” se entienden en este documento compuestos qulmicos que danan el 50 ADN y otros efectores de dano para el ADN (por ejemplo, radiation ionizante). Por lo tanto, un agente que dana el

ADN puede incluir un tratamiento quimioterapeutico y de radiacion proporcionado para un fin concreto, tal como, pero sin limitarse a un fin medico (por ejemplo, para tratar el cancer u otras enfermedades relacionadas con la hiperproliferacion celular). Los agentes que danan el ADN pueden referirse tambien a la exposition accidental a compuestos qulmicos y/o otros agentes que danan el ADN que puede tener lugar, por ejemplo, debido a una 55 exposicion ambiental inesperada (por ejemplo, en el puesto de trabajo o en otro ambiente, debido, por ejemplo, a un vertido qulmico, el desecho inapropiado u otro manejo inapropiado de residuos qulmicos o radiologicos, un fallo de las medidas de seguridad y/o del equipo de seguridad personal durante el uso de compuestos qulmicos que danan el ADN o radiacion, un ataque terrorista, guerra o un accidente en una planta industrial y/o de energla nuclear).

[0027] Segun se usa en este documento, el termino “radiacion ionizante” se refiere a radiacion de energla suficiente que, cuando es absorbida por celulas y tejidos, tlpicamente induce la formacion de especies reactivas de oxlgeno y dano en el ADN. La radiacion ionizante puede incluir rayos X, rayos y y el bombardeo de partlculas (por ejemplo, haces de neutrones, haces de electrones, protones, mesones y otros) y se usa para fines que incluyen,

5 pero no se limitan a pruebas y tratamientos medicos, fines cientlficos, pruebas industriales, fabrication y esterilizacion, as! como para armas y el desarrollo de armas. generalmente, la radiacion se mide en unidades de dosis absorbida, como rad o gray (Gy) o en unidades de dosis equivalente, como rem o sievert (Sv).

[0028] El termino “cancer”, segun se usa en este documento, se refiere a enfermedades causadas por la 10 division celular incontrolada y la capacidad de las celulas para producir metastasis o establecer nuevos crecimientos

en sitios adicionales. Los terminos “maligno”, “neoplasia”, “tumor” y variaciones de los mismos se refieren a celulas cancerosas o grupos de celulas cancerosas.

[0029] Algunos tipos especlficos de cancer incluyen, pero no se limitan a canceres de piel, canceres del tejido 15 conectivo, canceres adiposos, canceres de mama, canceres de pulmon, canceres de estomago, canceres

pancreaticos, canceres ovaricos, canceres cervicales, canceres uterinos, canceres anogenitales, canceres de rinon, canceres de vejiga, canceres de colon, canceres de prostata, canceres de cabeza y cuello, canceres cerebrales, canceres del sistema nervioso centras (SNC), canceres de retina, canceres sangulneos y linfaticos.

20 [0030] En algunas realizaciones, el termino cancer se refiere a un cancer que puede caracterizarse por (por ejemplo, que tiene celulas que muestran) un aumento del nivel de actividad de CDK2 o una reduction de la expresion de la protelna supresora tumoral del retinoblastoma o de protelnas de la familia del retinoblastoma, tales como, pero sin limitarse a p107 y p130. El aumento del nivel de actividad de CDK2 o la reduccion de la expresion de la protelna supresora tumoral del retinoblastoma o de protelnas de la familia del retinoblastoma pueden ser, por 25 ejemplo, con respecto a las celulas normales.

[0031] En algunas realizaciones, el aumento del nivel de actividad de CDK2 puede estar asociado con (por ejemplo, puede resultar de u observarse junto con) la amplification o sobreexpresion del protooncogen MYC. En algunas realizaciones, el aumento del nivel de actividad de CDK2 puede estar asociado con la sobreexpresion de la

30 ciclina E1, la ciclina E2 o la ciclina A.

[0032] Segun se usa en este documento, el termino “quimioterapia” se refiere al tratamiento con un compuesto citotoxico (tal como, pero sin limitarse a un compuesto que dana el ADN) para reducir o eliminar el crecimiento o la proliferation de celulas no deseables, tales como, pero sin limitarse a celulas cancerosas. Por

35 consiguiente, segun se usa en este documento, un “compuesto quimioterapeutico” se refiere a un compuesto citotoxico usado para el tratamiento del cancer. El efecto citotoxico del compuesto puede ser, pero no necesariamente, el resultado de uno o mas de entre la intercalation o la union a acidos nucleicos, la alquilacion de ADN o ARN, la inhibition de la slntesis de ARN o ADN, la inhibition de otra actividad relacionada con los acidos nucleicos (por ejemplo, la slntesis de protelnas) o cualquier otro efecto citotoxico.

40

[0033] Por lo tanto, un “compuesto citotoxico” puede ser cualquier compuesto o cualquier combinacion de compuestos tambien descritos como agentes “antineoplasicos” o agentes “quimioterapeuticos”. Tales compuestos incluyen, pero no se limitan a compuestos que danan el ADN y otros compuestos que pueden destruir celulas. Los “compuestos que danan el ADN” incluyen, pero no se limitan a agentes alquilantes, intercalantes de ADN,

45 inhibidores de la slntesis de protelnas, inhibidores de la slntesis de ADN o ARN, analogos de bases de ADN, inhibidores de topoisomerasa e inhibidores de telomerasa o compuestos de union a ADN telomerico. Por ejemplo, los agentes alquilantes incluyen alquilsulfonatos, como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas, como benzodepa, carbocuona, meturedepa y uredepa; etileniminas y metilmelaminas como altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; mostazas nitrogenadas como clorambucilo, 50 clornafazina, ciclofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida y mostaza de uracilo; y nitrosoureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina.

[0034] Los antibioticos usados en el tratamiento del cancer incluyen dactinomicina, daunorrubicina, 55 doxorrubicina, idarrubicina, sulfato de bleomicina, mitomicina, plicamicina, y estreptozocina. Los antimetabolitos

quimioterapeuticos incluyen mercaptopurina, tioguanina, cladribina, fosfato de fludarabina, fuorouracilo (5-FU), floxuridina, citarabina, pentostatina, metotrexato y azatioprina, aciclovir, p-1-D-arabinosido de adenina, ametopterina, aminopterina, 2-aminopurina, afidicolina, 8-azaguanina, azaserina, 6-azauracilo, 2'-azido-2'-desoxinucleosidos, 5- bromodesoxicitidina, p-1-D-arabinosido de citosina, diazooxinorleucina, didesoxinucleosidos, 5-fluorodesoxicitidina,

5-fluorodesoxiuridina e hidroxiurea.

[0035] Los inhibidores quimioterapeuticos de la slntesis de protelnas incluyen abrina, acido aurintricarboxllico, cloranfenicol, colicina E3, cicloheximida, toxina difterica, edelna A, emetina, eritromicina, etionina, fluoruro, 55 fluorotriptofano, acido fusldico, metilendifosfonato de guanililo e imidodifosfonato de guanililo, kanamicina,

kasugamicina, kirromicina y o-metiltreonina. Otros inhibidores de la slntesis de protelnas incluyen modecina, neomicina, norvalina, pactamicina, paromomicina, puromicina, ricina, toxina de Shiga, showdomicina, esparsomicina, espectinomicina, estreptomicina, tetraciclina, tioestreptona y trimetoprima. Los inhibidores de la slntesis de ADN incluyen agentes alquilantes como sulfato de dimetilo, mitomicina C, mostazas de nitrogeno y azufre; agentes 10 intercalantes como colorantes de acridina, actinomicinas, adriamicina, antracenos, benzopireno, bromuro de etidio, intercalante de diyoduro de propidio; y otros agentes como distamicina y netropsina. Tambien pueden usarse como el compuesto que dana el AdN inhibidores de topoisomerasa como cumermicina, acido nalidlxico, novobiocina y acido oxollnico; inhibidores de la division celular, incluidas colcemida, colchicina, vimblastina y vincristina; e inhibidores de la slntesis de ARN, incluidas actinomicina D, a-amantina y otras amatoxinas fungicas, cordicepina (3'15 desoxiadenosina), diclororribofuranosilbencimidazol, rifampicina, estreptovaricina y estreptolidigina.

[0036] Por lo tanto, los actuales compuestos quimioterapeuticos cuyos efectos toxicos pueden mitigarse mediante los inhibidores selectivos de CDK4/6 presentemente desvelados incluyen, pero no se limitan a adrimicina, 5-fluorouracilo (5-FU), etoposido, camptotecina, actinomicina D, mitomicina, cisplatino, peroxido de hidrogeno,

20 carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan, clorambucilo, busulfano, nitrosourea, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomicina, tamoxifeno, taxol, transplatino, vimblastina, metotraxato y similares.

[0037] Con “agente reductor de la toxicidad” se indica un compuesto u otro agente que se usa para reducir los 25 efectos citotoxicos de un agente que dana el ADN. El agente reductor de la toxicidad es un agente que puede

prevenir o reducir el dano al ADN en una celula, tejido o sujeto tratado con un agente que dana el ADN o expuesto de otro modo al mismo. La prevencion o reduccion del dano al ADN efectuada por el agente reductor de la toxicidad puede afectar a ciertas celulas (por ejemplo, ciertas celulas sanas) en un sujeto, mientras no ejerce ningun efecto en otras celulas (por ejemplo, en celulas enfermas y/o tumorales) del sujeto. Por lo tanto, el uso del agente reductor de 30 la toxicidad puede proteger ciertas celulas en un sujeto con el fin de permitir una dosis mas frecuente o mas alta de los agentes que danan el ADN durante un regimen de tratamiento de una enfermedad. En algunas realizaciones, el agente reductor de la toxicidad reduce la citotoxicidad no deseada debida al uso de un agente quimioterapeutico. En algunas realizaciones, el agente reductor de la toxicidad puede reducir la citotoxicidad no deseada resultante de radiacion.

35

[0038] El agente reductor de la toxicidad es un factor de crecimiento. En algunas realizaciones, el agente reductor de la toxicidad se selecciona del grupo que comprende, pero no se limita a un factor de crecimiento, un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), un G-CSF pegilado, un factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF), trombopoyetina, eritropoyetina, eritropoyetina pegilada, interleucina (IL) 12, el

40 factor acero y un factor de crecimiento de queratinocitos. “Aumentar la eficacia de un agente reductor de la toxicidad” se refiere a la capacidad de un inhibidor selectivo de CDK4 y/o CDK6 de aumentar la eficacia de un agente reductor de la toxicidad. Por lo tanto, el termino puede referirse al uso beneficioso de la combinacion de un agente reductor de la toxicidad y un inhibidor selectivo de CDK4 y/o CDK6. Por ejemplo, el uso de la combinacion puede resultar en una mayor tolerancia del sujeto a una cantidad dada o a una frecuencia de administracion dada de un agente que 45 dana el ADN con respecto a la tolerancia que el sujeto hubiera tenido si se le hubiera administrado solamente el agente reductor de la toxicidad (o el inhibidor selectivo de CDK4 y/o CDK6). El uso de la combinacion tambien puede ofrecer proteccion frente a una gama mas amplia de efectos secundarios debidos a la exposicion al agente que dana el ADN y/o proteccion en una mayor diversidad de tipos de celulas y/o tejidos en el sujeto. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un inhibidor selectivo de CDK4 y/o CDK6 puede proporcionar efectos sinergicos al usarlo en 50 combinacion con un factor de crecimiento para el rescate y apoyo de las diversas poblaciones hematopoyeticas frente a un agente que dana el ADN.

[0039] Con “cantidad farmaceuticamente eficaz de un compuesto” se indica una cantidad eficaz para proporcionar un resultado beneficioso en el sujeto. Por ejemplo, puede ser la cantidad eficaz para reducir o eliminar

55 la toxicidad asociada con el agente que dana el ADN (por ejemplo, la quimioterapia u otra exposicion a un compuesto citotoxico en HSPC sanas del sujeto o a RI). En algunas realizaciones, la cantidad eficaz es la cantidad requerida para inhibir temporalmente (por ejemplo por unas pocas horas o dlas) la proliferacion de las celulas madre hematopoyeticas (es decir, para inducir un estado quiescente en las celulas madre hematopoyeticas) en el sujeto.

[0040] En algunas realizaciones, el compuesto que inhibe selectivamente CDK4 y/o CDK6 no tiene efectos fuera de la diana. “No tiene” puede referirse a un inhibidor selectivo de CDK4/6 que no tiene un efecto no deseado fuera de la diana, en particular, cuando se usa in vivo o se evalua por medio de un ensayo a base de celulas. Por lo tanto, “no tiene” puede referirse a un inhibidor selectivo de CDK4/6 que no tiene efectos fuera de la diana tales

5 como, pero sin limitarse a toxicidad a largo plazo, efectos antioxidantes, efectos estrogenos, efectos inhibidores de tirosina-cinasas, efectos inhibidores sobre otras CDK distintas de CDK4/6; y/o paradas del ciclo celular en celulas independientes de CDK4/6.

[0041] Un inhibidor selectivo de CDK4/6 que “sustancialmente no tiene” efectos fuera de la diana es un 10 inhibidor de CDK4/6 que puede tener efectos de menor importancia fuera de la diana, que no interfieren con la

capacidad del inhibidor de ofrecer proteccion frente a compuestos citotoxicos en celulas dependientes de CDK4/6. Por ejemplo, un inhibidor de CDK4/6 que “sustancialmente no tiene” efectos fuera de la diana puede tener efectos de menor importancia sobre otras CDK (por ejemplo, con CI50 para CDK1 o CDK2 que son > 0,5 pM, > 1,0 pM o > 5,0 pM), siempre que el inhibidor produzca una parada en G1 selectiva en las celulas dependientes de CDK4/6.

15

[0042] Con “reducido” o “prevenido” o sus variaciones gramaticales se indica, respectivamente, la disminucion de los efectos o la evitacion de que se produzcan efectos en absoluto. “Mitigar” puede referirse a reducir y/o prevenir.

20 [0043] Con “quiescencia farmacologica” se indica una parada temporal del ciclo celular.

[0044] “Con riesgo de padecer una enfermedad autoinmunitaria” se refiere a un sujeto del que se sospecha que tiene probabilidad de padecer una enfermedad autoinmunitaria por razones que incluyen, pero no se limitan, por ejemplo, a tener uno o mas marcadores geneticos asociados con una enfermedad autoinmunitaria, tener 25 antecedentes familiares de enfermedades autoinmunitarias y/o haber estado expuesto a un agente ambiental del que se sospecha que provoca la aparicion de una enfermedad autoinmunitaria. La expresion puede aplicarse tambien a sujetos a los que se ha diagnosticado una enfermedad autoinmunitaria con anterioridad pero que estan en remision y/o actualmente no presentan slntomas.

30 [0045] En algunas realizaciones, el sujeto tratado en la materia presentemente desvelada es deseablemente un sujeto humano, aunque ha de entenderse que los procedimientos descritos en este documento son eficaces en relacion con todas las especies de vertebrados (por ejemplo, mamlferos, aves, etc.), las cuales se pretende incluir en el termino “sujeto”.

35 [0046] Mas en particular, en este documento se proporciona el tratamiento de mamlferos tales como humanos, as! como aquellos mamlferos de importancia debido a estar en peligro de extincion (como los tigres siberianos), de importancia economica (animales criados en granjas para el consumo humano) y/o importancia social (animales de companla o en zoos) para los humanos, por ejemplo, otros carnlvoros distintos de los humanos (como perros y gatos), animales porcinos (cerdos y jaballes), rumiantes (como las vacas, bueyes, ovejas, jirafas, ciervos, 40 cabras, bisontes y camellos) y caballos. Por lo tanto, las realizaciones de los procedimientos descritos en este documento incluyen el tratamiento de ganado, incluido, pero sin limitarse a animales porcinos domesticados (cerdos), rumiantes, caballos y similares.

[0047] Segun se usa en este documento, el termino “alquilo” se refiere a cadenas de hidrocarburo C1-20, 45 incluidas cadenas lineales (es decir, “cadenas rectas”), ramificadas o clclicas, saturadas o al menos parcialmente y

en algunos casos totalmente insaturadas (es decir, alquenilo y alquinilo) que incluyen, por ejemplo, grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, ferc-butilo, pentilo, hexilo, octilo, etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, octenilo, butadienilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, heptinilo y alenilo. “Ramificado” se refiere a un grupo alquilo en el que un grupo alquilo inferior, como metilo, etilo o propilo, esta unido a una cadena de alquilo 50 lineal. “Alquilo inferior” se refiere a un grupo alquilo con 1 a aproximadamente 8 atomos de carbono (es decir, un alquilo C1-8), por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 atomos de carbono. “Alquilo superior” se refiere a un grupo alquilo con de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 atomos de carbono, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 atomos de carbono. En ciertas realizaciones, “alquilo” se refiere en particular a cadenas lineales de alquilo C1-8. En otras realizaciones, “alquilo” se refiere en particular a cadenas ramificadas de alquilo C1-8.

55

[0048] Opcionalmente, los grupos alquilo pueden estar sustituidos (un “alquilo sustituido”) con uno o mas sustituyentes de grupos alquilo que pueden ser iguales o diferentes. El termino “sustituyente de grupo alquilo” incluye, pero no se limita a alquilo, alquilo sustituido, halo, arilamino, acilo, hidroxilo, ariloxilo, alcoxilo, alquiltio, ariltio, aralquiloxilo, aralquiltio, carboxilo, alcoxicarbonilo, oxo y cicloalquilo. Opcionalmente, en la cadena de alquilo puede

haber insertados uno o mas atomos de oxlgeno, azufre o nitrogeno sustituido o sin sustituir, en que el sustituyente del nitrogeno es hidrogeno, alquilo inferior (tambien denominado en este documento “alquilaminoalquilo”) o arilo.

[0049] Por lo tanto, segun se usa en este documento, el termino “alquilo sustituido” incluye grupos alquilo, 5 segun se definen en este documento, en los que uno o mas atomos o grupos funcionales del grupo alquilo se

reemplazan por otro atomo o grupo funcional, incluidos, por ejemplo, alquilo, alquilo sustituido, halogeno, arilo, arilo sustituido, alcoxilo, hidroxilo, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, sulfato y mercapto.

[0050] El termino “arilo” se usa en este documento para referirse a una fraccion aromatica que puede ser un 10 solo anillo aromatico o anillos aromaticos multiples fusionados entre si, enlazados covalentemente o enlazados a un

grupo comun como, pero sin limitarse a una fraccion de metileno o etileno. El grupo enlazante comun puede ser tambien un carbonilo como en benzofenona, oxlgeno como en difenileter o nitrogeno como en difenilamina. El termino “arilo” abarca especlficamente compuestos aromaticos heteroclclicos. El o los anillos aromaticos pueden comprender fenilo, naftilo, bifenilo, difenileter, difenilamina y benzofenona, entre otros. En realizaciones concretas, el 15 termino “arilo” indica un compuesto aromatico clclico que comprende de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 atomos de carbono, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 atomos de carbono e incluye anillos de hidrocarburo y anillos aromaticos heteroclclicos de cinco y seis miembros.

[0051] Opcionalmente, el grupo arilo puede estar sustituido (un “arilo sustituido”) con uno o mas sustituyentes 20 de grupos arilo que pueden ser iguales, en que el “sustituyente de grupos arilo” incluye alquilo, alquilo sustituido,

arilo, arilo sustituido, aralquilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo aralquiloxilo, carboxilo, carbonilo, acilo, halo, nitro, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, aralcoxicarbonilo, aciloxilo, acilamino, aroilamino, carbamoilo, alquilcarbamoilo, dialquilcarbamoilo, ariltio, alquiltio, alquileno y -NR’R”, en que R' y R” puede ser cada uno independientemente hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido y aralquilo.

25

[0052] Por lo tanto, segun se usa en este documento, el termino “arilo sustituido” incluye grupos arilo, segun se definen en este documento, en los que uno o mas atomos o grupos funcionales del grupo arilo se reemplazan por otro atomo o grupo funcional incluidos, por ejemplo, alquilo, alquilo sustituido, halogeno, arilo, arilo sustituido, alcoxilo, hidroxilo, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, sulfato y mercapto.

30

[0053] Algunos ejemplos especlficos de grupos arilo incluyen, pero no se limitan a ciclopentadienilo, fenilo, furano, tiofeno, pirrol, pirano, piridina, imidazol, bencimidazol, isotiazol, isoxazol, pirazol, pirazina, triazina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, indol, carbazol y similares.

35 [0054] El termino “heteroarilo” se refiere a grupos arilo en los que al menos un atomo del esqueleto del anillo o los anillos aromaticos es un atomo distinto de carbono. Por lo tanto, los grupos heteroarilo tienen uno o mas atomos que no son de carbono seleccionados del grupo que incluye, pero no se limita a nitrogeno, oxlgeno y azufre.

[0055] Segun se usa en este documento, el termino “acilo” se refiere a un grupo de acido carboxllico organico 40 en el que el -OH del grupo carboxilo ha sido reemplazado por otro sustituyente (es decir, segun se representa por RCO-, en que R es un grupo alquilo o arilo segun se definen en este documento). Como tal, el termino “acilo” incluye especlficamente grupos arilacilo, tales como un grupo acetilfurano y un grupo fenacilo. Algunos ejemplos especlficos de grupos acilo incluyen acetilo y benzollo.

45 [0056] “Clclico” y “cicloalquilo” se refieren a sistemas de anillos no aromaticos mono o multiclclicos de aproximadamente 3 a aproximadamente 10 atomos de carbono, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 atomos de carbono. El grupo cicloalquilo puede estar opcionalmente parcialmente insaturado. Ademas, el grupo cicloalquilo puede estar opcionalmente sustituido con un sustituyente de grupos alquilo segun se define en este documento, oxo y/o alquileno. Opcionalmente, en la cadena de cicloalquilo puede haber insertados uno o mas atomos de oxlgeno, 50 azufre o nitrogeno sustituido o sin sustituir, en que el sustituyente del nitrogeno es hidrogeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, lo que proporciona un grupo heteroclclico. Algunos anillos de cicloalquilo monoclclicos representativos incluyen ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo. Los anillos de cicloalquilo multiclclicos incluyen adamantilo, octahidronaftilo, decalina, canfor, canfano y noradamantilo.

55 [0057] Los terminos “heterociclo” o “heteroclclico” se refieren a grupos cicloalquilo (es decir, grupos clclicos no aromaticos segun se describen anteriormente) en los que uno o mas de los atomos de carbono del esqueleto de un anillo clclico esta reemplazado por un heteroatomo (por ejemplo, nitrogeno, azufre u oxlgeno). Algunos ejemplos de heterociclos incluyen, pero no se limitan a tetrahidrofurano, tetrahidropirano, morfolina, dioxano, piperidina, piperazina y pirrolidina.

[0058] “Alcoxilo” o “alcoxi” se refieren a un grupo alquilo-O- en el que alquilo es segun se describe previamente. El termino “alcoxilo”, segun se usa en este documento, puede referirse, por ejemplo, a metoxilo, etoxilo, propoxilo, isopropoxilo, butoxilo, f-butoxilo y pentoxilo. El termino “oxialquilo” puede usarse de manera

5 intercambiable con “alcoxilo”.

[0059] “Ariloxilo” o “ariloxi” se refieren a un grupo arilo-O- en el que el grupo arilo es segun se describe previamente, incluido un arilo sustituido. El termino “ariloxilo”, segun se usa en este documento, puede referirse a feniloxilo o hexiloxilo y feniloxilo o hexiloxilo sustituidos con alquilo, alquilo sustituido, halo o alcoxilo.

10

[0060] “Aralquilo” se refiere a un grupo arilalquilo en el que arilo y alquilo son segun se describen previamente y que incluye arilo sustituido y alquilo sustituido. Algunos grupos aralquilo ejemplares incluyen bencilo, feniletilo y naftilmetilo.

15 [0061] “Aralquiloxilo” o “aralquiloxi” se refieren a un grupo aralquilo-O- en el que el grupo aralquilo es segun se describe previamente. Un grupo aralquiloxilo ejemplar es benciloxilo.

[0062] El termino “amino” se refiere al grupo -NR’R”, en el que R' y R” se seleccionan cada uno independientemente del grupo que incluye H y alquilo, cicloalquilo, heterociclo, aralquilo, arilo y heteroalquilo

20 sustituido o sin sustituir. En algunas realizaciones, el grupo amino es -NH2. “Aminoalquilo” y “aminoarilo” se refieren al grupo -NR’R”, en el que R’ es segun se define anteriormente para amino y R” es alquilo o arilo sustituido o sin sustituir, respectivamente.

[0063] “Acilamino” se refiere a un grupo acilo-NH- en el que acilo es segun se describe previamente.

25

[0064] El termino “carbonilo” se refiere a -(C=O)- o a un sustituyente de oxlgeno con enlace doble unido a un atomo de carbono de un grupo parental mencionado previamente.

[0065] El termino “carboxilo” se refiere al grupo -COOH.

30

[0066] Los terminos “halo”, “haluro” o “halogeno”, segun se usan en este documento, se refieren a grupos de fluor, cloro, bromo y yodo.

[0067] Los terminos “hidroxilo” e “hidroxi” se refieren al grupo -OH.

35

[0068] El termino “oxo” se refiere a un compuesto descrito anteriormente en este documento en el que un atomo de carbono se reemplaza por un atomo de oxlgeno.

[0069] El termino “ciano” se refiere al grupo -CN.

40

[0070] El termino “nitro” se refiere al grupo -NO2.

[0071] El termino “tio” se refiere a un compuesto descrito previamente en este documento en el que un atomo de carbono o de oxlgeno se reemplaza por un atomo de azufre.

45

II. Compuestos y procedimientos para la proteccion frente a agentes que danan el ADN

[0072] Las celulas madre especlficas de tejidos y subconjuntos de otras celulas proliferantes residentes son capaces de autorrenovacion, lo que significa que son capaces de reemplazarse a si mismas a lo largo de la vida de

50 un mamlfero adulto mediante replicacion regulada. Adicionalmente, las celulas madre se dividen asimetricamente para producir celulas “descendientes” o “progenitoras” que a su vez producen los diversos componentes de un organo dado. Por ejemplo, en el sistema hematopoyetico, las celulas madre hematopoyeticas dan lugar a celulas progenitoras que a su vez dan lugar a todos los componentes diferenciados de la sangre (por ejemplo, globulos blancos, globulos rojos, linfocitos y plaquetas).

55

[0073] La materia presentemente desvelada se refiere, en parte, a requisitos bioqulmicos concretos de las celulas madre/progenitoras hematopoyeticas tempranas (HSPC) y otras celulas proliferantes en el mamlfero adulto. En particular, se ha encontrado que ciertas celulas proliferantes especlficas, como las HSPC, requieren la actividad enzimatica de las cinasas proliferativas cinasa dependiente de ciclina 4 (CDK4) y/o cinasa dependiente de ciclina 6

(CDK6) para la replication celular. Por el contrario, la gran mayorla de las celulas proliferantes en mamlferos adultos no requiere la actividad de CDK4 y/o CDK6 (es decir, CDK4/6). Estas celulas diferenciadas pueden proliferar en ausencia de actividad de CDK4/6 usando otras cinasas proliferativas, como la cinasa dependiente de ciclina 2 (CDK2) o la cinasa dependiente de ciclina 1 (CDK1). Por lo tanto, se piensa que el tratamiento de mamlferos con un 5 inhibidor selectivo de CDK4/6 puede conducir a la inhibition de la proliferation (es decir, quiescencia farmacologica) en compartimentos celulares muy restringidos, como el de HSPC. Por ejemplo, el tratamiento transitorio (tal como, pero sin limitarse a un periodo de 48, 24, 20, 16, 12, 10, 8, 6, 4, 2 o 1 horas) con PD0332991, un inhibidor selectivo de CDK4/6, hace quiescentes a las celulas madre hematopoyeticas y a sus celulas progenitoras hematopoyeticas asociadas. Se piensa que las celulas que son quiescentes son mas resistentes a los efectos citotoxicos de los 10 agentes que danan el ADN que las celulas proliferantes.

[0074] Por consiguiente, la materia presentemente desvelada proporciona una composition farmaceutica para usar en un procedimiento para la protection de mamlferos frente a los efectos toxicos agudos y cronicos de los compuestos quimioterapeuticos imponiendo un estado quiescente en las celulas madre y progenitoras

15 hematopoyeticas (HSPC) mediante el tratamiento transitorio (tal como, pero sin limitarse a un periodo inferior a 48, 24, 20, 16, 12, 10, 8, 6, 4, 2 o 1 horas) con un inhibidor selectivo de CDK4/6 no toxico (tal como, pero sin limitarse a un inhibidor de CDK4/6 no toxico disponible por via oral). Durante el periodo de quiescencia, las HSPC del sujeto son mas resistentes a ciertos efectos del compuesto quimioterapeutico. Las HSPC se recuperan de este periodo de quiescencia transitoria y funcionan normalmente despues de finalizar el tratamiento con el inhibidor. Por lo tanto, el 20 tratamiento con inhibidores selectivos de CDK4/6 puede proporcionar una notable proteccion de la medula osea y puede conducir a una recuperation mas rapida de los recuentos de celulas de sangre periferica (hematocrito, plaquetas, linfocitos y celulas mieloides) despues de la quimioterapia y/o la radioterapia.

[0075] La patente de los EE. UU. n.° 6.369.086 de Davis y col. (en adelante, “la patente 086”) describe que los 25 inhibidores selectivos de CDK pueden ser utiles para limitar la toxicidad de los agentes citotoxicos y pueden usarse

para proteger de la alopecia inducida por la quimioterapia. En particular, la patente 086 describe compuestos de oxindol como inhibidores especlficos de CDK2. Una referencia relacionada en una revista especializada (vease Davis y col., Science, 291, 134-137 (2001)) describe que la inhibicion de CDK2 produce una parada del ciclo celular, lo que reduce la sensibilidad del epitelio a agentes antitumorales activos en el ciclo celular y puede prevenir la 30 alopecia inducida por la quimioterapia. Sin embargo, esta referencia se retiro posteriormente debido a la falta de reproducibilidad de los resultados. En contraste con estos supuestos efectos protectores de los inhibidores selectivos de CDK2, que se cuestionan por la retirada del artlculo de la revista, la materia presentemente desvelada se refiere en algunas realizaciones a la proteccion de las HSPC y a la proteccion frente a la toxicidad hematica.

35 [0076] La capacidad para proteger las celulas madre/progenitoras es deseable tanto en el tratamiento del cancer como en la mitigation de los efectos de la exposition accidental a, o la sobredosis de compuestos qulmicos citotoxicos, radiation u otros agentes que danan el ADN. Los efectos protectores de los inhibidores selectivos de CDK4/6 pueden proporcionarse al sujeto a traves del pretratamiento con el inhibidor (es decir, un tratamiento previo con el inhibidor de CDK4/6 de un sujeto para el que se ha previsto un tratamiento con o que presenta riesgo de 40 exposicion a un agente que dana el ADN), el tratamiento simultaneo con el inhibidor de CDK4/6 y el agente que dana el ADN o el postratamiento con el inhibidor de CDK4/6 (es decir, el tratamiento con el inhibidor de CDK4/6 despues de la exposicion al agente que dana el ADN). Por lo tanto, en algunas realizaciones, los procedimientos presentemente desvelados se refieren al uso de compuestos inhibidores selectivos de CDK4/6 para ofrecer proteccion a sujetos que reciben o van a recibir un tratamiento con compuestos quimioterapeuticos o radiacion y 45 para proteger a sujetos frente a otra exposicion a compuestos citotoxicos y/o radiacion.

[0077] Segun se usa en este documento, el termino “compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6” se refiere a un compuesto que inhibe selectivamente al menos uno de CDK4 y CDK6 o cuyo modo de action predominante es a traves de la inhibicion de CDK4 y/o CDK6. Por lo tanto, los inhibidores selectivos de CDK4/6 son compuestos que 50 generalmente tienen una concentration inhibitoria del 50 % (CI50) menor para CDK4 y/o CDK6 que para otras cinasas. En algunas realizaciones, el inhibidor selectivo de CDK4/6 puede tener una CI50 para CDK4 o CDK6 que es al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces menor que las CI50 del compuesto para otras CDK (por ejemplo, cDK1 y CDK2). En algunas realizaciones, el inhibidor selectivo de CDK4/6 puede tener una CI50 para CDK4 o CDK6 que es al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 veces menor que las CI50 del compuesto para otras CDK. En algunas 55 realizaciones, el inhibidor selectivo de CDK4/6 puede tener una CI50 que es mas de 100 veces o mas de 1.000 veces menor que las CI50 del compuesto para otras CDK. En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6 es un compuesto que inhibe selectivamente ambas CDK4 y CDK6. En algunas realizaciones, el inhibidor selectivo de CDK4/6 no es un compuesto de origen natural (por ejemplo, una isoflavona). En algunas realizaciones, el inhibidor de CDK4/6 es un inhibidor deficiente (por ejemplo, CI50 > 1 pM in vitro) de una o mas tirosina-cinasas. En

algunas realizaciones, el inhibidor de CDK4/6 es un inhibidor muy potente de serina y/o treonina-cinasas. En algunas realizaciones, el inhibidor de CDK4/6 es un inhibidor deficiente de CDK1 (por ejemplo, CI50 > 1 pM in vitro). En algunas realizaciones, el inhibidor de CDK4/6 se caracteriza por tener una potencia relativa 10 veces, 50 veces o 100 veces mayor para la inhibicion de CDK4 o CDK6 en comparacion con CDK1.

5

[0078] En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6 es un compuesto que induce selectivamente una parada del ciclo celular en G1 en las celulas dependientes de CDK4/6. Por lo tanto, cuando se tratan con el compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6 de acuerdo con los procedimientos presentemente desvelados, el porcentaje de celulas dependientes de CDK4/6 en la fase G1 aumenta, mientras que el porcentaje de

10 celulas dependientes de CDK4/6 en la fase G2/M y la fase S disminuye. En algunas realizaciones, el inhibidor selectivo de CDK4/6 es un compuesto que induce una parada del ciclo celular sustancialmente pura (es decir, “limpia”) en G1 en las celulas dependientes de CDK4/6 (por ejemplo, en que el tratamiento con el inhibidor selectivo de CDK4/6 induce una parada del ciclo celular de manera que la mayorla de las celulas se detienen en G1 segun se define por procedimientos estandar (por ejemplo, tincion con yoduro de propidio u otros) y la poblacion de celulas en 15 las fases G2/M y S combinada es del 20 %, 15 %, 12 %, 10%, 8 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos de la poblacion celular total).

[0079] Aunque se ha descrito que la estaurosporina, un inhibidor de cinasas inespeclfico, induce indirectamente una parada en G1 en algunos tipos celulares (vease Chen y col., J. Nat. Cancer Inst., 92, 1999-2008

20 (2000)), los inhibidores selectivos de CDK4/6 pueden inducir de manera directa y selectiva la parada del ciclo celular en G1 en celulas tales como fracciones especlficas de las HSPC para ofrecer quimioproteccion y radioproteccion con menos toxicidad a largo plazo y sin la necesidad de un tratamiento prolongado (por ejemplo, de 48 horas o mas) con el inhibidor antes de la exposicion al agente que dana el ADN. En particular, aunque algunos inhibidores de cinasa no selectivos pueden causar una parada del ciclo celular en G1 en algunos tipos celulares al disminuir los 25 niveles protelnicos de CDK4, se piensa que los beneficios de los procedimientos presentemente desvelados, sin limitarse a una teorla, se deben al menos en parte a la capacidad de los inhibidores selectivos de CDK4/6 de inhibir directamente la actividad cinasica de CDK4/6 en las HSPC sin disminuir su concentration celular.

[0080] En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6 es un compuesto que 30 sustancialmente no tiene efectos fuera de la diana, en particular relacionados con la inhibicion de cinasas distintas

de CDK4 y/o CDK6. En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6 es un inhibidor deficiente (por ejemplo CI50 > 1 pM) de otras CDK distintas de CDK4/6 (por ejemplo, CDK1 y CDK2). En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor de CDK4/6 no induce la parada del ciclo celular en celulas independientes de CDK4/6. En algunas realizaciones, el compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6 es un inhibidor deficiente (por ejemplo CI50 > 1 35 pM) de tirosina-cinasas. Los efectos no deseados adicionales fuera de la diana incluyen, pero no se limitan a toxicidad a largo plazo, efectos antioxidantes y efectos estrogenos.

[0081] Los efectos antioxidantes pueden determinarse mediante ensayos estandar conocidos en la tecnica. Por ejemplo, un compuesto sin efectos antioxidantes significativos es un compuesto que no se combina facilmente

40 con radicales libres, como radicales de oxlgeno. Los efectos antioxidantes de un compuesto pueden compararse con los de un compuesto con una actividad antioxidante conocida, como genistelna. Por lo tanto, un compuesto sin actividad antioxidante significativa puede ser uno que tiene aproximadamente 2, 3, 5, 10, 30 o 100 veces menos actividad antioxidante que la genistelna. Las actividades estrogenas pueden determinarse tambien por medio de ensayos conocidos. Por ejemplo, un compuesto no estrogeno es uno de no se une ni activa significativamente el 45 receptor de estrogeno. Un compuesto que carece sustancialmente de efectos estrogenos puede ser uno que tiene aproximadamente 2, 3, 5, 10, 20 o 100 veces menos actividad estrogena que un compuesto con actividad estrogena, por ejemplo, genistelna.

[0082] Los inhibidores selectivos de CDK4/6 que pueden usarse de acuerdo con los procedimientos 50 presentemente desvelados incluyen cualquier molecula pequena conocida (por ejemplo, < 1.000 Da, < 750 Da o <

500 Da) inhibidora selectiva de CDK4/6 o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma. En algunas realizaciones, el inhibidor es un compuesto que no es de origen natural (es decir, un compuesto que no se encuentra en la naturaleza). Se han descrito varias clases de compuestos qulmicos con capacidad de inhibicion de CDK4/6 (por ejemplo, en ensayos acelulares). Los inhibidores selectivos de CDK4/6 utiles en la invention presentemente 55 desvelada pueden incluir, pero no se limitan a pirido[2,3-d]pirimidinas, (por ejemplo, pirido[2,3-d]pirimidin-7-onas y 2- amino-6-cianopirido[2,3-d]pirimidin-4-onas), triaminopirimidinas, aril[a]pirrol[3,4-d]carbazoles, ureas sustituidas con heteroarilo que contiene nitrogeno, 5-pirimidinil-2-aminotiazoles, benzotiadiazinas, acridinationas e isoquinolonas.

[0083] En algunas realizaciones, la pirido[2,3-d]pirimidina es una pirido[2,3-d]pirimidinona. En algunas

realizaciones, la pirido[2,3-d]pirimidinona es pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona. En algunas realizaciones, la pirido[2,3- d]pirimidin-7-ona esta sustituida con un grupo aminoarilo o aminoheteroarilo. En algunas realizaciones, la pirido[2,3- d]pirimidin-7-ona esta sustituida con un grupo aminopiridina. En algunas realizaciones, la pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona es una 2-(2-piridinil)aminopirido[2,3-d]pirimidin-7-ona. Por ejemplo, el compuesto pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona puede 5 tener la estructura de la formula (II) segun se describe en la publicacion de patente de los EE. UU. n.° 2007/0179118 de Barvian y col.

[0084] En algunas realizaciones, el compuesto pirido[2,3-d]pirimidina es 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-(5- piperazin-1-ilpiridin-2-ilamino)-8H-pirido[2,3-d]pirimidin-7-ona (es decir, PD0332991) o una sal farmaceuticamente

10 aceptable del mismo. Vease Toogood y col., J. Med. Chem., 2005, 48, 2388-2406.

[0085] En algunas realizaciones, la pirido[2,3-d]pirimidinona es una 2-amino-6-cianopirido[2,3-d]pirimidin-4- ona. Por ejemplo, Tu y col. describen inhibidores selectivos de CDK4/6 que comprenden 2-amino-6-cianopirido[2,3- d]pirimidin-4-ona. Vease Tu y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006, 16, 3578-3581.

15

[0086] Segun se usa en este documento, “triaminopirimidinas” son compuestos de pirimidina en los que al menos tres carbonos en el anillo de pirimidina estan sustituidos con grupos de la formula -NR1R2, en que R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consta de H, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, heterociclo, arilo y heteroarilo. Cada uno de los grupos alquilo, aralquilo, cicloalquilo, heterociclo, arilo y heteroarilo de R1 y R2 pueden

20 estar adicionalmente sustituidos con uno o mas grupos hidroxilo, halo, amino, alquilo, aralquilo, cicloalquilo, heteroclclico, arilo o heteroarilo. En algunas realizaciones, al menos uno de los grupos amino es un grupo alquilamino con la estructura -NHR, en la que R es alquilo C1-C6. En algunas realizaciones, al menos un grupo amino es un grupo cicloalquilamino o un grupo cicloalquilamino sustituido con hidroxilo con la formula -NHR, en la que R es cicloalquilo C3-C7, sustituido o sin sustituir con un grupo hidroxilo. En algunas realizaciones, al menos un

25 grupo amino es un grupo aminoalquilo sustituido con heteroarilo, en que el grupo heteroarilo puede estar sustituido ademas con un sustituyente de grupos arilo.

[0087] Los aril[a]pirrol[3,4-d]carbazoles incluyen, pero no se limitan a naftil[a]pirrol[3,4-c]carbazoles, indol[a]pirrol[3,4-c]carbazoles, quinolinil[a]pirrol[3,4-c]carbazoles e isoquinolinil[a]pirrol[3,4-c]carbazoles. Vease, por

30 ejemplo, Engler y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 2261-2267; Sanchez-Martinez y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 3835-3839; Sanchez-Martinez y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 3841-3846; Zhu y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 1231-1235; y Zhu y col., J. Med Chem., 2003, 46, 2027-2030. En las publicaciones de patente de los EE. UU. n.° 2003/0229026 y 2004/0048915 tambien se desvelan aril[a]pirrol[3,4- d]carbazoles adecuados.

35

[0088] Las ureas sustituidas con heteroarilo que contiene nitrogeno son compuestos que comprenden una fraccion de urea en la que uno de los atomos de nitrogeno esta sustituido con un grupo heteroarilo que contiene nitrogeno. Los grupos heteroarilo que contienen nitrogeno incluyen, pero no se limitan a grupos arilo de cinco a siete miembros que incluyen al menos un atomo de nitrogeno. Por lo tanto, los grupos heteroarilo que contienen nitrogeno

40 incluyen, por ejemplo, piridina, pirrol, indol, carbazol, imidazol, tiazol, isoxazol, pirazol, isotiazol, pirazina, triazol, tetrazol, pirimidina, piridazina, purina, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, cinolina, quinazolina, bencimidazol, ftalimida y similares. En algunas realizaciones, el grupo heteroarilo que contiene nitrogeno puede estar sustituido con uno o mas grupos alquilo, cicloalquilo, heteroclclico, aralquilo, arilo, heteroarilo, hidroxilo, halo, carbonilo, carboxilo, nitro, ciano, alcoxilo o amino. En algunas realizaciones, la urea sustituida con un heteroarilo que contiene

45 nitrogeno es una pirazol-3-ilurea. El pirazol puede estar sustituido adicionalmente con un grupo cicloalquilo o heteroclclico. En algunas realizaciones, la pirazol-3-ilurea es:

imagen1

[0089] Vease Ikuta y col., J. Biol. Chem., 2001, 276, 27548-27554. Otras ureas adicionales que pueden usarse de acuerdo con la materia presentemente desvelada incluyen los compuestos bianlicos de urea de la formula

5 (I) descrita en la publicacion de patente de los EE. UU. n.° 2007/0024147. Vease tambien Honma y col., J. Med. Chem., 2001, 44, 4615-4627; y Honma y col., J. Med. Chem., 2001, 44, 4628-4640.

[0090] Shimamura y col. describen inhibidores 5-pirimidinil-2-aminotiaz6licos adecuados de CDK4/6. Vease Shimamura y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2006, 16, 3751-3754. En algunas realizaciones, el 5-pirimidinil-2-

10 aminotiazol tiene la estructura:

imagen2

[0091] Los compuestos utiles de benzotiadiazina y acridinationa incluyen, por ejemplo, los desvelados por 15 Kubo y col. Vease Kubo y col., Clin. Cancer Res. 1999, 5, 4279-4286 y la publicacion de patente de los EE. UU. n.°

2004/0006074.

[0092] En algunas realizaciones, la benzotiadiazina esta sustituida con uno o mas grupos halo, haloarilo o alquilo. En algunas realizaciones, la benzotiadiazina se selecciona del grupo que consta de 1,1-dioxido de 4-(4-

20 fluorobencilamino)-1,2,3-benzotiadiazina, 1,1-dioxido de 3-cloro-4-metil-4H-benzo[e][1,2,4]tiadiazina y 1,1-dioxido de 3-cloro-4-etil-4H-benzo[e][1,2,4]tiadiazina. En algunas realizaciones, la acridinationa esta sustituida con uno o mas grupos amino o alcoxi. En algunas realizaciones, la acridinationa se selecciona del grupo que consta de 3-amino- 10H-acridona--9-tiona (3ATA), 9(10H)-acridinationa, 1,4-dimetoxi-10H-acridina-9-tiona y 2,2’-difenilamino-bis-[N,N’- (3-amido-N-metilamino)-10H-acridina-9-tiona].

25

[0093] En algunas realizaciones, el sujeto de la invencion presentemente desvelada sera un sujeto que ha estado expuesto, esta expuesto o se preve que este expuesto a un agente que dana el ADN mientras recibe un tratamiento terapeutico contra una enfermedad proliferativa. Tales enfermedades proliferativas incluyen enfermedades cancerosas. Por ejemplo, se piensa que los compuestos presentemente desvelados son eficaces

30 para la protection de las HSPC sanas durante el tratamiento quimioterapeutico de una amplia gama de tipos tumorales, incluidos, pero sin limitarse a los siguientes: de mama, prostata, ovarico, de piel, pulmon, colorrectal, cerebro (es decir, glioma) y renal.

[0094] Idealmente, es preferible que el inhibidor selectivo de CDK4/6 no afecte a la eficacia del agente que dana el ADN por si mismo en la detencion del crecimiento de las celulas cancerosas. La mayoria de los canceres no parecen depender de las actividades de CDK4/6 para su proliferacion, ya que pueden usar las cinasas proliferativas promiscuamente (por ejemplo, pueden usar CDK1/2/4 o 6) o carecen de la funcion de la proteina supresora tumoral

5 del retinoblastoma (RB) que es inactivada por las CDK. Por consiguiente, la inhibition aislada de CDK4/6 no debe perjudicar la respuesta al agente que dana el ADN en la mayoria de los canceres. Como entendera un experto en la tecnica al revisar la presente description, la sensibilidad potencial de ciertos tumores a la inhibicion de CDK4/6 puede deducirse a partir del tipo de tumor y la genetica molecular. Los canceres que no se espera que sean afectados por la inhibicion de CDK4/6 son aquellos que pueden caracterizarse por uno o mas del grupo que incluye, 10 pero no se limita a un aumento de la actividad de CDK1 o CDK2, perdida o ausencia de la proteina supresora tumoral del retinoblastoma (RB), altos niveles de expresion de MYC, aumento de la ciclina E (por ejemplo, E1 o E2) y aumento de la ciclina A o expresion de una proteina inactivadora de RB (como E7, codificada por el VPH). Tales canceres incluyen, pero no se limitan al cancer de pulmon microcitico, retinoblastoma, canceres positivos para VPH como el cancer cervical y ciertos canceres de cabeza y cuello, tumores con MYC amplificado como el linfoma de 15 Burkitts y el cancer de mama triple negativo; ciertas clases de sarcoma, ciertas clases de carcinoma de pulmon no microcitico, ciertas clases de melanoma, ciertas clases de cancer pancreatico, ciertas clases de leucemia, ciertas clases de linfoma, ciertas clases de cancer cerebral, ciertas clases de cancer de colon, ciertas clases de cancer de prostata, ciertas clases de cancer ovarico, ciertas clases de cancer uterino, ciertas clases de cancer de tiroides y otros canceres de tejido endocrino, ciertas clases de canceres salivales, ciertas clases de carcinomas timicos, 20 ciertas clases de canceres de rinon, ciertas clases de canceres de vejiga y ciertas clases de canceres testiculares.

[0095] Por ejemplo, en algunas realizaciones, el cancer se selecciona entre cancer de pulmon microcitico, retinoblastoma y cancer de mama triple negativo (negativo para ER/PR/Her2) o “de tipo basal”. El cancer de pulmon microcitico y el retinoblastoma casi siempre inactivan la proteina supresora tumoral del retinoblastoma (RB) y, por

25 consiguiente, no requieren la actividad de CDK4/6 para su proliferacion. Por tanto, el tratamiento con un inhibidor de CDK4/6 producira quiescencia farmacologica en la medula osea y otras celulas normales del huesped, pero no en el tumor. El cancer de mama triple negativo (de tipo basal) tambien es casi siempre genetica o funcionalmente nulo para RB. Ademas, ciertos canceres inducidos por virus (por ejemplo, el cancer cervical y algunos canceres de cabeza y cuello) expresan una proteina virica (E7) que inactiva RB, lo que hace que estos tumores sean 30 funcionalmente nulos para RB. Tambien se piensa que algunos canceres de pulmon estan causados por el VPH. Como entendera un experto en la tecnica, los canceres de los que no se espera que sean afectados por los inhibidores de CDK4/6 (por ejemplo, aquellos que son nulos para RB, que expresan la proteina virica E7 o que sobreexpresan MYC) pueden determinarse por procedimientos que incluyen, pero no se limitan al analisis de aDn, inmunotincion, analisis de inmunotransferencia y determination de perfiles de expresion genica.

35

[0096] De acuerdo con la materia presentemente desvelada, el agente que dana el ADN puede administrarse a un sujeto con cualquier programacion y en cualquier dosis conforme con el curso prescrito del tratamiento, siempre que el compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6 se administre antes, durante o despues de la administration del agente que dana el ADN. Generalmente, el compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6 puede administrarse al sujeto

40 durante el periodo de tiempo que se extiende desde 24 horas antes de la exposition al agente que dana el ADN hasta 24 horas despues de la exposicion. Sin embargo, este periodo de tiempo puede extenderse a un momento anterior a las 24 horas antes de la exposicion al agente que dana el ADN (por ejemplo, basado en el tiempo que necesita el compuesto quimico cualquiera que dana el ADN usado para alcanzar las concentraciones plasmaticas adecuadas y/o en la semivida plasmatica del compuesto que dana el ADN). Ademas, el periodo de tiempo puede 45 extenderse mas alla de las 24 horas despues de la exposicion al agente que dana el ADN, siempre que la administracion tardia del inhibidor de CDK4/6 produzca al menos algun efecto protector. Este tratamiento posexposicion puede ser especialmente util en casos de exposicion accidental o sobredosis.

[0097] En algunas realizaciones, el inhibidor selectivo de CDK4/6 puede administrarse al sujeto en un periodo 50 de tiempo anterior a la administracion del agente que dana el ADN, de manera que los niveles plasmaticos del

inhibidor selectivo de CDK4/6 alcancen el maximo en el momento de la administracion del agente que dana el ADN. Si es conveniente, el inhibidor selectivo de CDK4/6 puede administrarse al mismo tiempo que el agente que dana el ADN, con el fin de simplificar el regimen de tratamiento. En algunas realizaciones, el quimioprotector y el agente o agentes que danan el ADN pueden administrarse en una unica formulation.

55

[0098] Si se desea, pueden administrarse al sujeto multiples dosis del compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6. Alternativamente, puede administrarse una sola dosis del inhibidor selectivo de CDK4/6 al sujeto.

[0099] La materia presentemente desvelada se refiere a composiciones farmaceuticas para usar en

procedimientos para aumentar la eficacia de un agente reductor de la toxicidad en un sujeto que necesita un tratamiento del mismo, en que el procedimiento comprende: proporcionar un sujeto que ha estado expuesto, esta expuesto o presenta riesgo de exposicion a un agente que dana el ADN; administrar a dicho sujeto un agente reductor de la toxicidad que es un factor de crecimiento; y administrar a dicho sujeto una cantidad 5 farmaceuticamente eficaz de un compuesto que inhibe selectivamente CDK4 y/o CDK6.

[0100] Idealmente, el agente reductor de la toxicidad no presenta actividad inhibidora selectiva de CDK4/6.

[0101] El agente reductor de la toxicidad es un agente que se usa para, o del que se sabe que tiene la 10 capacidad de reducir la citotoxicidad o efectos secundarios no deseados relacionados con el uso de (o exposicion a)

una sustancia quimioterapeutica. En algunas realizaciones, el agente reductor de la toxicidad es una agente que se usa para, o del que se sabe que tiene la capacidad de reducir la citotoxicidad o efectos secundarios no deseados relacionados con el uso de (o exposicion a) radiacion. Por lo tanto, el agente reductor de la toxicidad es un quimioprotector o un radioprotector.

15

[0102] El agente reductor de la toxicidad es un agente que se usa de manera que un sujeto que esta siendo tratado contra el cancer u otra enfermedad proliferativa pueda tolerar una dosis mayor de una sustancia quimioterapeutica o de radiacion. En algunas realizaciones, el agente reductor de la toxicidad se usa de manera que un sujeto que esta siendo tratado contra el cancer pueda tratarse mas frecuentemente con una sustancia

20 quimioterapeutica o con radiacion. En algunas realizaciones, el agente reductor de la toxicidad se usa para reducir o prevenir efectos secundarios asociados con el uso del agente que dana el ADN tales como, pero sin limitarse a nausea, vomitos, perdida del cabello, anemia, fatiga, neuropatla periferica, problemas hemorragicos, diarrea, estrenimiento y similares.

25 [0103] El agente reductor de la toxicidad usado de acuerdo con la invencion es un factor de crecimiento o un

derivado del mismo. En algunas realizaciones, el agente reductor de la toxicidad se selecciona del grupo que

comprende factores de crecimiento, un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), un G-CSF pegilado, un factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-CSF), trombopoyetina, eritropoyetina (EPO), eritropoyetina pegilada, interleucina (IL) 12, el factor acero, un factor de crecimiento de queratinocitos o derivados 30 (por ejemplo, compuestos modificados qulmicamente con estructuras basadas en uno de los agentes reductores de la toxicidad mencionados anteriormente, tales como derivados alquilados o esterificados) o combinaciones de los mismos.

[0104] En algunas realizaciones, el uso del agente reductor de la toxicidad y el inhibidor selectivo de CDK4/6

35 pueden resultar en efectos protectores sinergicos frente al agente que dana el ADN. En algunas realizaciones el

compuesto que inhibe selectivamente CDK4 o CDK6 induce quiescencia farmacologica en una o mas celulas del sujeto. Por ejemplo, el tratamiento transitorio (por ejemplo, durante un periodo de aproximadamente 48 horas o menos) con el compuesto que selectivamente inhibe CDK4 y/o CDK6 puede inducir temporalmente quiescencia farmacologica en una o mas celulas en el sujeto. En algunas realizaciones, las una o mas celulas en las que se 40 induce la quiescencia farmacologica son, por ejemplo, celulas hematicas, celulas madre hematicas y/o celulas precursoras hematicas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, pueden usarse un factor de crecimiento y un compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6 en un procedimiento para proporcionar efectos sinergicos en el rescate y apoyo de diversas poblaciones hematopoyeticas frente a un agente que dana el ADN.

45 [0105] El agente reductor de la toxicidad y el compuesto que inhibe selectivamente CDK4 y/o CDK6 pueden administrarse conjuntamente (por ejemplo, en la misma formulacion o al mismo tiempo en formulaciones independientes) o en momentos diferentes. El agente reductor de la toxicidad o el inhibidor de CDK46 o ambos pueden administrarse como dosis unica o en dosis multiples. En algunas realizaciones, el agente reductor de la toxicidad o el inhibidor de CDK46 pueden administrarse antes de la exposicion al agente que dana el ADN, mientras 50 que el otro de entre el inhibidor de CDK4/6 y el agente reductor de la toxicidad puede administrarse durante o despues de la exposicion al agente que dana el ADN. En algunas realizaciones, tanto el inhibidor de CDK4/6 como el agente reductor de la toxicidad pueden administrarse durante la exposicion al agente que dana el ADN (por ejemplo, durante la administracion de la quimio o radioterapia). Alternativamente, ambos pueden administrarse antes o despues de la exposicion al agente que dana el ADN. En algunas realizaciones, el compuesto que inhibe 55 selectivamente CDK4 y/o CDK6 se administra al sujeto entre aproximadamente 24 y aproximadamente 48 horas (por ejemplo, aproximadamente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 o 48 horas) despues de la exposicion del sujeto al agente que dana el ADN.

[0106] El compuesto que inhibe selectivamente CDK4/6 puede administrarse en cualquier momento adecuado

antes, durante o despues de la exposition del sujeto al agente que dana el ADN. En algunas realizaciones, el inhibidor selectivo de CDK4/6 se administra al sujeto entre aproximadamente 24 y aproximadamente 48 horas (por ejemplo, aproximadamente 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 o 48 horas) despues de la exposicion del sujeto al agente que dana el ADN.

5

III. Compuestos activos, sales y formulaciones

[0107] Segun se usa en este documento, el termino “compuesto activo” se refiere a un compuesto inhibidor selectivo de CDK4/6 o a un profarmaco (tal como, pero sin limitarse a diversos esteres y otros derivados que pueden

10 formar el inhibidor selectivo de CDK4/6 in vitro o in vivo), un solvato (tal como, pero sin limitarse a un hidrato) y/o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo. El compuesto activo puede administrarse al sujeto mediante cualquier estrategia adecuada. Por supuesto, la cantidad y el momento en que puede administrarse el compuesto activo pueden depender del sujeto que se trate, de la dosis del agente que dana el ADN al que el sujeto ha estado, esta o se anticipa que estara expuesto, del modo de administration, de las propiedades farmacocineticas del compuesto 15 activo y del criterio del medico a cargo. Por lo tanto, debido a la variabilidad entre sujetos, las dosis indicadas a continuation son una orientation y el medico puede valorar las dosis del compuesto para conseguir el tratamiento que considera apropiado para el sujeto. Al considerar el grado de tratamiento deseado, el medico puede sopesar una serie de factores como la edad y el peso del sujeto, la presencia de una enfermedad preexistente, as! como la presencia de otras enfermedades. Pueden prepararse formulaciones farmaceuticas para cualquier via de 20 administracion deseada, incluidas pero sin limitarse a la administracion por via oral, intravenosa o en aerosol, segun se expone mas detalladamente a continuacion.

[0108] La dosis terapeutica eficaz de cualquier compuesto activo especlfico, cuyo uso se encuentra dentro del alcance de las realizaciones descritas en este documento, puede variar en cierta medida de un compuesto a otro y

25 de un sujeto a otro y puede depender del estado del sujeto y de la via de administracion. Como proposition general, una dosis de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 200 mg/kg puede tener eficacia terapeutica, con todos los pesos calculados con respecto al peso del compuesto activo, incluidos los casos en los que se emplea una sal. En algunas realizaciones, la dosis puede ser la cantidad de compuesto necesaria para proporcionar una concentration serica del compuesto activo de hasta aproximadamente 1 a 5 pM o mayor. Los problemas de toxicidad en el nivel 30 superior pueden restringir las dosis intravenosas a un nivel inferior, como de hasta aproximadamente 10 mg/kg, con todos los pesos calculados con respecto al peso de la base activa, incluidos los casos en los que se emplea una sal. Para la administracion por via oral puede emplearse una dosis de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. Tlpicamente, para una inyeccion intramuscular puede emplearse una dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg a 5 mg/kg. En algunas realizaciones, las dosis pueden ser de aproximadamente 1 pmol/kg a 35 aproximadamente 50 pmol/kg u, opcionalmente, de entre aproximadamente 22 pmol/kg y aproximadamente 33 pmol/kg del compuesto para administracion por via intravenosa u oral.

[0109] De acuerdo con la invention presentemente desvelada, los compuestos farmaceuticamente activos segun se describen en este documento pueden administrarse por via oral como solido o como llquido o pueden

40 administrarse por via intramuscular, intravenosa o por inhalation como disolucion, suspension o emulsion. En algunas realizaciones, los compuestos o sales tambien pueden administrarse por inhalacion, por via intravenosa o intramuscular como suspension de liposomas. Cuando se administran por inhalacion, el compuesto activo o sal puede estar en forma de una pluralidad de partlculas solidas o pequenas gotas con un tamano de partlcula de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 pm y opcionalmente de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 pm. 45

[0110] Las formulaciones farmaceuticas pueden comprender un compuesto activo descrito en este documento o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo en cualquier vehlculo farmaceuticamente aceptable. Si se desea una disolucion, el vehlculo elegido es agua para los compuestos o sales solubles en agua. Para los compuestos o sales solubles en agua, puede ser adecuado un vehlculo organico como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol o

50 mezclas de los mismos. En el ultimo caso, el vehlculo organico puede contener una cantidad sustancial de agua. En cada caso, la disolucion puede esterilizarse despues de manera adecuada conocida por los expertos en la tecnica y, tlpicamente por filtration a traves de un filtro de 0,22 pm. Despues de la esterilizacion, la disolucion puede distribuirse en recipientes apropiados como viales de vidrio despirogenados. La distribution se hace opcionalmente por un procedimiento aseptico. Despues, pueden colocarse cierres esterilizados en los viales y, si se desea, el 55 contenido de los viales puede liofilizarse.

[0111] Ademas de los compuestos activos o sus sales, las formulaciones farmaceuticas pueden contener otros aditivos como aditivos de ajuste del pH. En particular, los agentes utiles para ajuste del pH incluyen acidos como acido clorhldrico, bases o tampones como lactato de sodio, acetato de sodio, fosfato de sodio, citrato de sodio,

borato de sodio o gluconato de sodio. Ademas, las formulaciones pueden contener conservantes antimicrobianos. Los conservantes antimicrobianos utiles incluyen metilparabeno, propilparabeno y alcohol bencllico. Tlpicamente se emplea un conservante antimicrobiano cuando la formulacion se pone en un vial disenado para uso en dosis multiples. Las formulaciones farmaceuticas descritas en este documento pueden liofilizarse mediante procedimientos 5 bien conocidos en la tecnica.

[0112] Para su administracion por via oral, una composicion puede estar en forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, pastillas, capsulas, polvos y similares. Se emplean comprimidos que contienen diversos excipientes como citrato de sodio, carbonato de calcio y fosfato de calcio, junto con diversos disgregantes como 10 almidon (por ejemplo, de patata o tapioca) y ciertos silicatos complejos, y con aglutinantes como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y goma arabiga. Adicionalmente, los agentes lubricantes como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco a menudo son muy utiles para la preparacion de los comprimidos. Tambien se emplean composiciones solidas de un tipo similar como relleno de capsulas de gelatina blanda y dura. Los materiales relacionados con lo anterior tambien incluyen lactosa o azucar de leche, as! como polietilenglicoles de alto peso 15 molecular. Cuando se desean suspensiones acuosas y/o elixires para administracion por via oral, los compuestos de la materia presentemente desvelada pueden combinarse con diversos edulcorantes, aromas, colorantes, emulsionantes y/o agentes de suspension, as! como con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y diversas combinaciones de los mismos.

20 [0113] En otra realizacion mas del objeto descrito en este documento, se proporciona una formulacion inyectable esteril y estable que comprende un compuesto activo segun se describe en este documento o una sal del mismo en una forma de dosificacion unitaria en un envase cerrado hermeticamente. El compuesto o la sal se proporcionan en forma liofilizada, la cual puede reconstituirse con un vehlculo farmaceuticamente aceptable adecuado para formar una formulacion llquida adecuada para su inyeccion en un sujeto. Si el compuesto o sal es 25 sustancialmente insoluble en agua, puede emplearse un emulsionante fisiologicamente aceptable en cantidad suficiente para emulsionar el compuesto o la sal en un vehlculo acuoso. Los emulsionantes especialmente utiles incluyen fosfatidilcolinas y lecitina.

[0114] Otras realizaciones adicionales proporcionadas en este documento incluyen formulaciones liposomicas 30 de los compuestos activos desvelados en dicho documento. La tecnologla para la formacion de las suspensiones

liposomicas es bien conocida en la tecnica. Cuando el compuesto es una sal soluble en agua, esta puede incorporarse en veslculas lipldicas mediante la tecnologla de liposomas convencional. En tal caso, debido a la solubilidad en agua del compuesto activo, este puede estar sustancialmente atrapado dentro del centro o nucleo hidrofilo de los liposomas. La capa lipldica empleada puede ser de cualquier composicion convencional y puede 35 contener colesterol o no contenerlo. Cuando el compuesto activo de interes es insoluble en agua, de nuevo mediante el empleo de la tecnologla convencional de formacion de liposomas, la sal puede atraparse sustancialmente dentro de la bicapa lipldica hidrofoba que forma la estructura del liposoma. En cualquier caso, los liposomas que se producen reducirse de tamano, por ejemplo, mediante el uso de tecnicas estandar de sonicacion y homogeneizacion. Las formulaciones liposomicas que comprenden los compuestos activos desvelados en este 40 documento pueden liofilizarse para producir un liofilizado, el cual puede reconstituirse con un vehlculo farmaceuticamente aceptable, como agua, para regenerar una suspension liposomica.

[0115] Tambien se proporcionan formulaciones farmaceuticas que son adecuadas para su administracion como aerosol por inhalacion. Estas formulaciones comprenden una disolucion o suspension de un compuesto

45 deseado descrito en este documento o una sal del mismo, o una pluralidad de partlculas solidas del compuesto o la sal. La formulacion deseada puede colocarse en una pequena camara y nebulizarse. La nebulizacion puede conseguirse mediante aire comprimido o energla ultrasonica para formar una pluralidad de pequenas gotas de llquido o de partlculas solidas que comprenden los compuestos o las sales. Las pequenas gotas de llquido o las partlculas solidas deben tener un tamano de partlcula en el intervalo de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 10 pm y opcionalmente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 pm. Las partlculas solidas pueden obtenerse mediante el procesamiento del compuesto solido o una sal del mismo de cualquier manera apropiada en la tecnica, por ejemplo, por micronizacion. Opcionalmente, el tamano de las partlculas solidas o las pequenas gotas puede ser de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 pm. A este respecto, hay nebulizadores disponibles comercialmente para conseguir este fin. Los compuestos pueden administrarse por medio de una suspension en aerosol de 55 partlculas respirables, de la manera expuesta en la patente de los eE. UU n° 5.628.984.

[0116] Cuando la formulacion farmaceutica adecuada para su administracion como aerosol esta en forma llquida, dicha formulacion puede comprender un compuesto activo soluble en agua en un vehlculo que comprende agua. Puede haber presente un tensioactivo que disminuye la tension superficial de la formulacion suficientemente

para dar lugar a la formacion de pequenas gotas en el intervalo de tamanos deseado cuando se someten a nebulizacion.

[0117] Segun se indica, se proporcionan compuestos activos tanto solubles en agua como insolubles en agua.

5 Segun se usa en este documento, el termino “soluble en agua” pretende definir cualquier composition que es

soluble en agua en una cantidad de aproximadamente 50 mg/ml o superior. Asimismo, segun se usa en este documento, el termino “insoluble en agua” pretende definir cualquier composicion que tiene una solubilidad en agua inferior a aproximadamente 20 mg/ml. En algunas realizaciones, pueden ser deseables compuestos o sales solubles en agua mientras que en otras realizaciones pueden ser igualmente deseables compuestos o sales insolubles en

10 agua.

[0118] El termino “sales farmaceuticamente aceptables”, segun se usa en este documento, se refiere a aquellas sales que, dentro del alcance del criterio medico razonable, son adecuadas para uso en contacto con sujetos (por ejemplo, sujetos humanos) sin excesiva toxicidad, irritation, respuesta alergica y similares, en

15 proportion con una relation beneficio/riesgo razonable y eficaces para el uso destinado, as! como las formas dipolares, en caso de que sea posible, de los compuestos de la materia presentemente desvelada.

[0119] Por lo tanto, el termino “sales” se refiere a las sales de adicion de acido organicas e inorganicas relativamente no toxicas de los compuestos de la materia presentemente desvelada. Estas sales pueden prepararse

20 in situ durante el aislamiento y purification final de los compuestos o haciendo reaccionar separadamente el compuesto purificado en su forma de base libre con un acido organico o inorganico adecuado y aislando la sal as! formada. En la medida en que los compuestos de la materia presentemente desvelada son compuestos basicos, son capaces de formar una amplia diversidad de sales diferentes con diversos acidos organicos e inorganicos. Aunque tales sales deben ser farmaceuticamente aceptables para su administration a animales, a menudo en la practica es

25 deseable aislar inicialmente el compuesto basico de la mezcla de reaction como sal farmaceuticamente inaceptable para despues convertirlo simplemente en la base libre por tratamiento con un reactivo alcalino y a continuation convertir la base libre en una sal de adicion de acido farmaceuticamente aceptable. Las sales de adicion de acido de los compuestos basicos se preparan poniendo en contacto la forma de base libre con una cantidad suficiente del acido deseado para producir la sal de la manera convencional. La forma de base libre puede regenerarse poniendo

30 la forma de sal en contacto con una base y aislando la base libre de la manera convencional. Las formas de base libre difieren en cierto modo de sus formas de sal respectivas en algunas propiedades flsicas como la solubilidad en disolventes polares, pero, por lo demas, las sales son equivalentes a sus formas de base libre respectivas para los fines de la materia presentemente desvelada.

35 [0120] Las sales de adicion de base farmaceuticamente aceptables se forman con metales o aminas, como hidroxidos de metales alcalinos y alcalinoterreos o aminas organicas. Algunos ejemplos de metales usados como cationes incluyen, pero no se limitan a sodio, potasio, magnesio, calcio y similares. Algunos ejemplos de aminas adecuadas incluyen, pero no se limitan a N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocalna, colina, dietanolamina, etilendiamina, N-metilglucamina y procalna.

40

[0121] Las sales de adicion de base de compuestos acidos se preparan poniendo en contacto la forma de acido libre con una cantidad suficiente de la base deseada para producir la sal de la manera convencional. La forma de acido libre puede regenerarse poniendo la forma de sal en contacto con un acido y aislando el acido libre de la manera convencional. Las formas de acido libre difieren en cierto modo de sus formas de sal respectivas en algunas

45 propiedades flsicas como la solubilidad en disolventes polares, pero, por lo demas, las sales son equivalentes a sus formas de acido libre respectivas para los fines de la materia presentemente desvelada.

[0122] Las sales pueden prepararse a partir de los acidos inorganicos sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, nitrato, fosfato, monohidrogenofosfato, dihidrogenofosfato, metafosfato, pirofosfato, cloruro, bromuro,

50 yoduro, as! como clorhldrico, nltrico, fosforico, sulfurico, bromhldrico, yodhldrico, fosforoso y similares. Algunas sales representativas incluyen las sales de bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, nitrato, acetato, oxalato, valerato, oleato, palmitato, estearato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactobionato, laurilsulfonato e isetionato. Las sales tambien pueden prepararse a partir de acidos organicos, como acidos mono y dicarboxllicos alifaticos, acidos alcanoicos sustituidos

55 con fenilo, acidos hidroxialcanoicos, acidos alcanodioicos, acidos aromaticos y acidos sulfonicos alifaticos y aromaticos, etc. y similares. Algunas sales representativas incluyen acetato, propionato, caprilato, isobutirato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, mandelato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, ftalato, bencenosulfonato, toluenosulfonato, fenilacetato, citrato, lactato, maleato, tartrato, metanosulfonato y similares. Las sales farmaceuticamente aceptables pueden incluir cationes basados en

los metales alcalinos y alcalinoterreos como sodio, litio, potasio, calcio, magnesio y similares, as! como amonio no toxico, amonio cuaternario y cationes amlnicos incluidos, pero sin limitarse a amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares. Tambien se contemplan las sales de aminoacidos como arginato, gluconato, galacturonato y similares. Vease, por ejemplo, Berge y col., J. 5 Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19.

EJEMPLOS

[0123] Los ejemplos siguientes proporcionan realizaciones ilustrativas y no pretenden limitar de ningun modo 10 el alcance de la materia presentemente desvelada. A la luz de la presente description y del nivel general de conocimiento de la tecnica, los expertos apreciaran que los ejemplos siguientes pretenden solamente ser ejemplares y que pueden emplearse numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin salirse del alcance de la materia presentemente desvelada.

15 [0124] A menos que se indique lo contrario, la practica de la materia presentemente desvelada puede emplear procedimientos convencionales de qulmica de protelnas, bioqulmica, tecnicas de ADN recombinante y farmacologla, dentro del conocimiento de la tecnica. Tales tecnicas se explican por completo en la bibliografla. Vease, por ejemplo, T. E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman y Cla., 1993); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., edition actual); Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a 20 edicion, 1989); Methods in Enzymology (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutial Sciences, 18.a edicion (Easton, Pensilvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey y Sundberg, Advanced Organic Chemistry 3.a edicion (Plenum Press) volumenes A y B (1992).

Ejemplo 1

25

Sintesis de PD

[0125]

imagen3

NBoc

N^55sr^C02Et CVNH2 NX^'C02Et L1AIH4 n^YCH2°H MnQ2 ^

N 2 ^ " 'T r l| --------J|

A,A, Et3N.CH2CI2 "An^NH THF 'SsAAnH CHCI3 NH

6 “ ,6 “ .6

100%

THFyD98% ^ l^0(E10)2p[0)cH2C02B NBS. DMF, Aj^^O

.Mn02, CHCI3 S N j^H NaH, THF n'" N^O £ I

(J 67% A 78% Q

1. MeMgBr

88%

1. HN^__^NH

2. (Boc)20

64%

67%

o2n

N

h2n

10% Pd 1C. H2 N j)

MeOH

88%

BocN^i

kj

tolueno, reflujo 28-35%

Bu3SrV^OEt BocN"^|

(PPh3)4Pd

80%

O 1 11 hO I U

H | 91% H 1

. 6 _ o

Esquema 1: Sintesis de PD.

[0126] PD se sintetizo segun se muestra anteriormente en el esquema 1. Las reacciones mostradas en el esquema 1 siguieron en general procedimientos descritos previamente (vease VandelWel y col., J. Med Chem., 48, 5 2371-2387 (2005); y Toogood y col., J. Med. Chem., 48, 2388-2406 (2005)), con las excepciones de la reaccion de conversion del compuesto D en el compuesto E y la reaccion de conversion del compuesto F en el compuesto G.

Conversion del compuesto D en el compuesto E:

10 [0127]

imagen4

[0128] El compuesto D (40 g, 169 mmol) se disolvio en THF anhidro (800 ml) en atmosfera de nitrogeno y la disolucion se enfriO en un bano de hielo, se le anadio lentamente MeMgBr (160 ml, 480 mmol, 3 M en eter) y se agito

5 durante 1 h. La reaccion se detuvo con NhUCl acuoso saturado y se repartio entre agua y EtOAc. La fase organica se separo y la fase acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases organicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre MgSO4. La concentracion dio un producto intermedio como un aceite (41,9 g, 98 %).

[0129] El intermedio anterior (40 g, 158 mmol) se disolvio en CHCb seco (700 ml). Se anadio MnO2 (96 g, 1,11 10 mmol) y la mezcla se calento a reflujo con agitacion durante 18 h, en que se anadio mas MnO2 (34 g, 395 mmol) y se

continuo el reflujo durante 4 h. El solido se filtro a traves de una almohadilla de Celite y se lavo con CHCb. El filtrado se concentro para dar un compuesto solido amarillo E (35 g, 88 %), pf: 75,8-76,6 °C.

Conversion del compuesto F en el compuesto G:

15

[0130]

imagen5

20 [0131] El compuesto F (5 g, 18,2 mmol) se disolvio en DMF anhidra (150 ml) y se le anadio NBS (11,3 g, 63,6 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 3,5 h y despues se vertio sobre H2O (500 ml). El precipitado se filtro y se lavo con H2O. El solido se recristalizo a partir de EtOH para dar el compuesto G como un solido blanco (5,42 g, 80,7 %), pf: 210,6-211,3 °C.

25 Datos de caracterizacion de PD:

[0132] CL-EM: 448,5 (ESI, M+H). Pureza: ~ 99 %.

[0133] RMN 1H (300 MHz, D2O): 9,00 (s, 1H); 8,12 (dd, J = 9,3 Hz, 2,1 Hz, 1H); 7,81 (d, J = 2,4 Hz, 1H); 7,46 30 (d, J = 9,6 Hz, 1H); 5,80-5,74 (m, 1H); 3,57-3,48 (m, 8H); 2,48 (s, 3H); 2,37 (s, 3H); 2,13-1,94 (m, 6H); 1,73-1,71 (m,

2H).

[0134] RMN 13C (75 MHz, D2O): 203,6; 159,0; 153,5; 153,3; 152,2; 139,9; 139,4; 139,2; 133,1; 129,0; 118,7; 113,8; 107,4; 51,8; 42,2; 40,0; 28,0; 25,2; 22,6; 10,8.

35

Ejemplo 2

Procedimientos generales para los estudios in vitro e in vivo

40 [0135] Compuestos: PD0332991 se sintetizo segun se describe en el ejemplo 1.

[0136] Celulas, analisis del ciclo celular, vH2AX por citometrla de flujo, analisis de proliferacion celular y toxicidad celular: Las celulas epiteliales proximales primarias de rinon humano normales (Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Manassas, Virginia, Estados Unidos) se cultivaron en medio basico para celulas epiteliales

renales enriquecido con un kit de crecimiento para celulas epiteliales renales de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El analisis del ciclo celular se llevo a cabo con BrdU (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, California, EE. UU.) o EdU (Invitrogen Corporation, Carslbad, California, EE. UU.) y yoduro de propidio, siguiendo los protocolos de los fabricantes. Para el ensayo de yH2AX, las celulas se fijaron, se permeabilizaron y tineron con anti- 5 yH2AX mediante un kit de flujo para yH2AX (Millipore, Billerica, Massachusetts, Estados Unidos). Los niveles de YH2AX se determinaron por citometrla de flujo. La proliferacion celular se evaluo sembrando 1 x 103 celulas por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos en 100 pl de medio de cultivo. Las celulas se trataron segun se indica con los inhibidores de CDK4/6 y etoposido. Despues del tratamiento, se permitio la recuperacion de las celulas durante siete dlas en medio de cultivo normal. Al final del periodo de recuperacion, las celulas se 10 cuantificaron con CellTiter-Glo® (Promega, Fitchburg, Wisconsin, Estados Unidos) o el reactivo WST-1 (TaKaRa Bio USA, Madison, Wisconsin, Estados Unidos). La toxicidad celular se evaluo con el kit para bioensayos TOXILIGHTtm (Lonza, Basilea, Suiza) que mide la citolisis cuantificando la liberation de adenilato-cinasa al medio de cultivo. Brevemente, se aspiraron 20 pl de cada pocillo en placas de 96 pocillos de celulas tratadas con concentraciones variables de PD0332991. Se anadieron 100 pl del reactivo TOXILIGHTtm, se incubo durante cinco minutos y se llevo 15 a cabo la lectura en un luminometro a 1 segundo/pocillo.

[0137] Animates: Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de conformidad con el Comite Institucional para al Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Norte. Se irradiaron ratones adultos jovenes C57BI/6 y FVB con un irradiador de 137Cs AECL GammaGell 40 (Atomic Energy of Canada Ltd.,

20 Mississauga, Ontario, Canada). A menos que se especifique lo contrario, los ratones analizados fueron hembras adultas jovenes (8-12 semanas de edad) vlrgenes C57BI/6 o FVB adquiridas de Jackson Labs (Bar Harbor, Maine, Estados Unidos).

[0138] Los ratones C3-TAg son un modelo de cancer de mama de tipo basal. Los ratones C3-TAg contienen 25 un gen recombinante que expresa la secuencia transformante de la region temprana del virus del simio 40 (antlgeno

T mayor de SV40), que se ha demostrado que inactiva p53 y RB. El modelo MMTV-c-neu expresa c-neu (el gen ortologo en raton del HER2 humano) bajo el control del promotor del virus tumoral mamario de raton (MMTV) y es un modelo de cancer de mama HER2+. Al observar un tamano de los tumores de ~ 0,2 cm2, los animales se trataron segun se ha descrito y la respuesta tumoral se evaluo mediante medidas diarias con el calibrador.

30

[0139] Preparacion y dosificacion del farmaco: PD0332991 se disolvio en tampon de lactato de sodio (pH 4,0) hasta una concentration final de 15 mg/ml. Los ratones se trataron con una dosis de 150 mg/kg de PD0332991. 2BrIC (tambien denominado L4D en este documento) se solubilizo en DMSO y se anadio a las celulas en las que la concentracion final de DMSO fue <0,1 %.

35

[0140] Analisis de la incorporacion de BrdU: Para los ensayos de proliferacion en rinon, los ratones se trataron con una unica dosis de PD0332991 (150 mg/kg, administration por via oral) o de vehlculo como control seguida de cisplatino (10 mg/kg IP). La proliferacion se evaluo con BrdU (1 mg, inyeccion IP) cada seis horas durante 24 horas antes del sacrificio o 100 pg de EdU (0,1 mg IP) cada 24 horas durante tres dlas antes del sacrificio.

40

[0141] Analisis de la incorporacion de EdU por citometrla de flujo: Se extirparon los rinones de los ratones y se aislaron celulas individuales mediante un disociador de tejidos gentleMACS™ (Miltinyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Brevemente, los rinones se cortaron en trozos pequenos que se colocaron en 10 ml de colagenasa (1 mg/ml) en un tubo C de gentleMACS™ (Miltinyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). El tejido se disocio segun las

45 recomendaciones del fabricante (Miltinyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). A continuation, las celulas se incubaron durante cinco minutos en tampon ACK para lisar los globulos rojos, se filtraron y se sedimentaron. Las celulas se resuspendieron en paraformaldehldo al 4 % y se almacenaron durante la noche a 4 °C. Para cuantificar la incorporacion de EdU, las celulas se fijaron, se permeabilizaron y se tineron con in kit de flujo con APC para EdU de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, Estados Unidos). El 50 analisis de citometrla de flujo se llevo a cabo con un aparato CyAn ADP (Dako, Glostrup, Dinamarca). Para cada muestra se analizaron un mlnimo de 500.000 celulas y los datos se procesaron con el software FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, Oregon, Estados Unidos).

[0142] Ensayo de mielodepresion: hemogramas completos semanales: En los experimentos de 55 radioproteccion, los ratones se trataron con 150 mg/kg de PD0332991 administrado por via oral o con el vehlculo

como control una hora antes de su exposition a la radiation (6,5 Gy). La eritropoyetina (4.000 unidades/dla) se administro a partir del dla 3 despues de la exposicion a la radiacion y se continuo durante tres dlas consecutivos.

[0143] En un subconjunto de ratones se llevo a cabo un analisis de hemograma completo (HgC) inicial antes

de la administracion del farmaco. Despues de la administration del farmaco (quimioterapia/radiacion +/- inhibidor de CDK4/6/eritropoyetina o control), el analisis de HgC se realizo en los dlas 10 y 17 despues del tratamiento. Mediante un corte en la vena de la cola, se recogieron 40 pl de sangre en tubos BD Microtainer con K2E (K2EDTA). La sangre se analizo mediante un sistema de hematologla veterinaria Hevamet CBC-Diff (Drew Scientific Inc., Dallas, Texas, 5 Estados Unidos). El analisis de HgC incluyo la determination de los globulos blancos, linfocitos, granulocitos, monocitos, hematocrito, globulos rojos, hemoglobina, plaquetas y otros parametros hematicos comunes.

[0144] Analisis estadfstico: A menos que se indique lo contrario, las comparaciones se llevan a cabo mediante ANOVA de una via con la correction de Bonferroni para comparaciones multiples en caso apropiado. Las barras de

10 error representan +/- el error estandar de la media (EEM) o la desviacion estandar segun se indica.

Ejemplo 3

Aumento de la eficacia del factor de crecimiento por la inhibition de CDK4/6 15

[0145] A cohortes de ratones FVB de tipo natural se les administro placebo o un inhibidor de CDK4/6 (PD0332991, 150 mg/kg por via oral) inmediatamente antes de recibir una dosis subletal de irradiation (6,5 Gy). A las 72, 96 y 120 horas despues de la irradiacion, se les administraron tres dosis de disolucion salina normal (control) o 100 unidades de eritropoyetina (EPO) por inyeccion subcutanea. En total, hubo cuatro cohortes de tratamiento

20 (PD0332991 + disolucion salina, PD0332991 + EPO, disolucion salina + EPO, disolucion salina + disolucion salina). El tamano de la muestra para cada cohorte fue: control = 7; EPO = 8; PD0332991 = 8, PD/EPO = 6. Se llevaron a cabo extracciones de sangre sucesivas en el momento inicial, 10 despues de la irradiacion y 17 dlas despues de la irradiacion. Se obtuvieron los hemogramas completos (HgC) para determinar el numero de globulos rojos, de las diversas subpoblaciones de leucocitos y de plaquetas.

25

[0146] La EPO sola o en combination con PD0332991 no tuvo efecto sobre las plaquetas (figura 1) ni sobre otros linajes celulares no eritroclticos, mientras que las dos cohortes de tratamiento que recibieron PD0332991 mostraron un aumento del recuento de plaquetas (figura 1), as! como de otros linajes celulares no eritroclticos. La EPO sola no fue capaz de aumentar el linaje celular eritrocltico. Sin limitarse a una teorla, se piensa que esto es

30 debido a que el tratamiento con EPO estimula la entrada en el ciclo celular de los progenitores eritroclticos con dano en el ADN, lo que resulta en la subsiguiente apoptosis. Sin embargo, el tratamiento de los ratones con PD0332991 en combinacion con EPO mostro un aumento notable de la funcion eritrocltica, como indican las mediciones aumentadas de GR, Hb y HCT. De nuevo, sin limitarse a ninguna teorla, se piensa que PD0332991 permite a los progenitores eritroclticos reparar el dano en el ADN producido por la radiation y se piensa que el tratamiento 35 subsiguiente con EPO estimula a los progenitores a acelerar la sustitucion de los eritrocitos. En conclusion, los inhibidores de CDK4/6 parecen aumentar la eficacia de los factores de crecimiento para el rescate y apoyo de las diversas poblaciones hematopoyeticas despues de la exposition a agentes que danan el ADN como la radiacion o la quimioterapia. As! por ejemplo, como parte de los reglmenes de tratamiento contra el cancer a base de quimioterapia, puede usarse la inhibicion de CDK4/6 aproximadamente en el momento del dano al ADN para 40 aumentar el apoyo del factor de crecimiento en la depresion de la medula osea al permitir a las celulas madre y progenitoras de la medula osea reparar el dano en el ADN antes de comenzar la administracion del factor de crecimiento. Ademas, la inhibicion de CDK4/6 mitigara a largo plazo (por ejemplo tres o mas anos despues de la quimioterapia) las toxicidades para la medula osea (por ejemplo, mielodisplasia) relacionadas con el uso de factores de crecimiento en pacientes de cancer que sobreviven a la enfermedad.

45

[0147] La inhibicion de CDK4/6 aproximadamente en el momento de la exposicion que dana el ADN puede aumentar la eficacia de los factores de crecimiento tales como (pero sin limitarse a) G-CSF y derivados (por ejemplo, G-CSF pegilado), GM-CSF y derivados, trombopoyetina y derivados, eritropoyetina y derivados (por ejemplo, eritropoyetina pegilada), IL12, factor acero o factores de crecimiento de queratinocitos. Estos agentes,

50 especialmente G-CSF, GM-CSF y eritropoyetina y derivados se usan cllnicamente para reducir la toxicidad de la quimioterapia y la radiacion en el tratamiento de los pacientes de cancer. La induction de quiescencia farmacologica a traves de la inhibicion de CDK4/6 aproximadamente en el momento de la exposicion que dana el ADN puede aumentar la eficacia de estos agentes en un momento posterior (por ejemplo, la administracion de los factores de crecimiento se inicia normalmente 24-72 horas despues del agente terapeutico que dana el ADN).

55

Ejemplo 4 (ejemplo de referenda)

Protection de tejidos y celulas no hematicos por la inhibicion de CDK4/6

[0148] El uso de un inhibidor de CDK4/6 potente y selectivo como PD0332991 induce una parada en G1 en celulas epiteliales primarias de los tubulos proximales de rinon humano normales. Veanse las figuras 2A y 2B. Se observo un aumento dependiente de la dosis en la fraccion G0/G1 del ciclo celular con un descenso consumado en las fracciones G2/M y fase S. En ello, las celulas entran en quiescencia farmacologica y se mantienen en este

5 estado hasta que se liberan de la parada.

[0149] Las celulas epiteliales primarias de los tubulos proximales de rinon humano normales se sembraron y se expusieron 24 horas despues a PD0332991 en concentraciones de 0,10 mM, 30 nM, 100 nM, 300 nM o 1 pM. A las 16 horas del tratamiento, las celulas se recogieron por procedimientos estandar y se fijaron en metanol enfriado

10 en hielo hasta el momento de la tincion del ADN. Las muestras se procesaron y el ADN se tino con una disolucion de yoduro de propidio (PI) y se analizaron por citometrla de flujo. Los archivos fCs del citometro de flujo se analizaron posteriormente mediante el software para analisis del ciclo celular Mod-FitTM de Verity (Verity Software House, Topsham, Maine, Estados Unidos), en que las fracciones del ciclo celular se calcularon como porcentaje de la poblacion total.

15

[0150] La inhibicion de CDK4/6 bloquea la proliferation de las celulas epiteliales primarias de los tubulos proximales de rinon humano normales. Estas celulas se sembraron a una densidad apropiada en placas de 96 pocillos que se incubaron durante 24 horas a 37 °C en un incubador humificado con CO2 al 5 %. Las celulas se expusieron a continuation a un inhibidor potente y selectivo de CDK4/6, en este caso PD0332991, en un amplio

20 intervalo de dosis 24 horas despues. El intervalo de dosis de PD0332991 explorado fue 0, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 pM o 3 pM. A las 72 horas despues de la exposition, las celulas en las que se habla inhibido CDK4/6 se trataron con CellTiter-Glo® (Promega, Madison, Wisconsin, Estados Unidos) siguiendo las especificaciones del fabricante. La placa se leyo en un luminometro a 1 segundo/pocillo. Los resultados se analizaron en Microsoft Excel. En la figura 3 se observa una clara inhibicion de la proliferacion celular dependiente de la dosis en presencia de este 25 inhibidor en comparacion con el control de DMSO a las 72 horas despues del tratamiento. Este resultado, junto con las figuras 2A y 2b, demuestra que las celulas no hematicas dependientes de CDK4/6 pueden entrar en quiescencia farmacologica y de este modo se inhibe su proliferacion.

[0151] La inhibicion de CDK4/6 anula el dano en el ADN inducido por etoposido en celulas epiteliales 30 primarias de los tubulos proximales de rinon humano normales. En cultivos celulares expuestos a moleculas

pequenas que danan el ADN o a radiation ionizante, se generan rapidamente roturas en el ADN bicatenario que conducen a la fosforilacion de H2AX. La fosforilacion de H2AX se corresponde con roturas del ADN bicatenario. En la figura 4, se sembraron celulas epiteliales primarias de los tubulos proximales de rinon humano normales y se trataron 24 horas despues con PD0332991 0, 100 nM, 300 nM o 1 pM. A las 16 horas, estas muestras se expusieron 35 a etoposido 2,5 pM durante ocho horas. A continuacion, las muestras se recogieron, se fijaron y se tineron para detectar yH2AX mediante el kit de ensayos de fosforilacion de H2AXx de Millipore Corporation para citometrla de flujo (Millipore, Billerica, Massachusetts, Estados Unidos). Las muestras se analizaron con nuestro citometro de flujo y los resultados se procesaron con el software analltico para citometrla de flujo FlowJo (Treestar, Inc., Ashland, Oregon, Estados Unidos). Estos resultados demuestran que la quiescencia farmacologica ofrece protection frente al 40 dano en el ADN inducido quimioterapeuticamente a traves de farmacoquiescencia de manera dependiente de la dosis.

[0152] La inhibicion de CDK4/6 protege las celulas epiteliales primarias de los tubulos proximales de rinon humano normales frente a la muerte celular inducida por etoposido. En la figura 5 se demuestra que el uso de un

45 inhibidor potente y selectivo de CDK4/6 en celulas no hematicas dependientes de CDK4/6 puede ofrecer proteccion frente a agentes que danan el ADN tales como, pero sin limitarse a etoposido. Las celulas epiteliales primarias de los tubulos proximales de rinon humano normales se sembraron y se trataron con dosis crecientes del inhibidor de CDK4/6 PD0332991, 24 horas despues de la siembra. A las 16 horas del tratamiento, estas celulas recibieron una dosis de etoposido 2,5 pM durante ocho horas. El medio se retiro y se sustituyo por medio fresco. Las celulas se 50 mantuvieron en el cultivo durante siete dlas al cabo de los cuales se evaluaron con CellTiter-Glo® (Promega, Madison, Wisconsin, Estados Unidos), usando las especificaciones del fabricante, para determinar los efectos sobre la proliferacion celular. La placa se leyo en un luminometro a 1 segundo/pocillo. Los resultados se analizaron en Microsoft Excel. Las celulas tratadas con dosis crecientes de PD0332991 mostraron proteccion frente a la muerte celular inducida por etoposido de manera dependiente de la dosis.

55

[0153] El rinon es relativamente quiescente hasta que se estimula por una lesion renal. Por lo tanto, para determinar si la proliferacion de celulas renales era dependiente de la actividad de CDK4/6 in vivo, se estimulo la proliferacion de celulas renales tratando ratones hembra FVB de tipo natural con cisplatino, un agente quimioterapeutico conocido como nefrotoxico. En el momento de 0 horas, los ratones comenzaron a recibir el

alimento con 100 mg/kg de PD0332991 por dla o el alimento estandar, sin el farmaco. A las 24 horas, los ratones recibieron una unica dosis de cisplatino de 15 mg/kg por inyeccion IP y una inyeccion IP de 100 pg de EdU. A las 48 horas, todos los ratones recibieron una segunda dosis de 100 pg de EdU por inyeccion IP. Despues de 72 horas, los ratones se sacrificaron y se extirparon los rinones. Se prepararon suspensiones de celulas renales individuales 5 moliendo suavemente los rinones con el disociador de tejidos gentleMACS™ (Miltinyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). A continuacion, las suspensiones de celulas individuales se usaron para medir la incorporacion de EdU por analisis de citometrla de flujo. Los ratones tratados con cisplatino y el vehlculo como control mostraron aproximadamente el 17 % de las celulas marcadas con EdU, mientras que los ratones tratados con cisplatino y PD0332991 solo tenlan aproximadamente el 2 % de celulas con tincion positiva para la incorporacion de EdU. Vease

10 la figura 6. Por lo tanto, la inhibicion de CDK4/6 resulto en una reduccion de la proliferacion celular del 88 %, lo que confirma el analisis in vitro de que la proliferacion celular depende de la actividad de CDK4/6.

[0154] Para determinar si la inhibicion de CDK4/6 aproximadamente en el momento del dano al ADN protegerla la funcion renal, los ratones se trataron con cisplatino, un agente conocido causante de dano en los

15 tubulos renales en humanos. Los ratones se trataron con 150 mg/kg de PD0332991 o con el vehlculo como control por via oral y despues recibieron una dosis unica de 15 mg/kg de cisplatino por inyeccion IP. A las 72 horas despues del tratamiento, los ratones se sacrificaron y se extrajo sangre por puncion cardlaca para analizar el NUS (nitrogeno ureico sangulneo) y la creatinina serica (CrSr). El NUS serico y la CrSr son marcadores comunes de la funcion renal y los niveles sericos aumentan rapidamente cuando dicha funcion renal esta gravemente afectada. La figura 7

20 muestra un aumento considerable de NUS y CrSr despues de la administracion de cisplatino y una dosis unica de PD0332991 coadministrada con el cisplatino fue capaz de anular la nefrotoxicidad inducida por el cisplatino.

[0155] CDK4/6 parece desempenar un papel en la proliferacion celular de ciertos tejidos no hematicos como el rinon. Asl, los inhibidores de CDK4/6 pueden usarse para proteger tejidos no hematicos, tales como, pero sin

25 limitarse al rinon, intestino, corazon, hlgado, cerebro, tiroides, piel, mucosa intestinal, sistema auditivo, pulmon, vejiga, ovarios, utero, testlculos, glandulas suprarrenales, veslcula biliar, pancreas e islotes pancreaticos, estomago, vasos sangulneos y hueso frente a los agentes que danan el ADN como la radiacion y la quimioterapia.

Ejemplo 5 (ejemplo de referenda)

30

Aumento de la eficacia del agente que dana el ADN por la inhibicion de CDK4/6

[0156] Se evaluaron los efectos proliferativos de la inhibicion de CDK4/6 sobre un panel de llneas celulares de cancer de pulmon microcltico (CPM) con RB intacta (H417) o deficientes en RB (H69, H82, H209, H345). Las celulas

35 se trataron con DMSO o PD0332991 100 nM durante 48 horas y entonces se estimo el numero de celulas mediante el ensayo de WST-1, una medida de la respiracion celular. Vease la figura 8. En la llnea celular de CPM con RB intacta (H417), la proliferacion celular disminuyo, mientras que en las cuatro llneas deficientes en RB, la proliferacion celular aumento de hecho por la inhibicion de CDK4/6.

40 [0157] Tambien se evaluaron los efectos de la inhibicion de CDK4/6 en el modelo de ratones transgenicos C3- TAg de cancer de mama de tipo basal. El modelo C3-TAg contiene un gen recombinante que expresa la secuencia transformante de la region temprana del virus del simio 40 (antlgeno T mayor de SV40), que se ha demostrado que inactiva p53 y RB. Los ratones se alojaron a una densidad de cinco por jaula con acceso a voluntad al alimento estandar y el agua. El volumen tumoral se midio semanalmente con un calibrador. El volumen tumoral se calculo con

45 la formula siguiente: volumen = [(ancho)2 x largo]/2. Despues de haberse establecido un volumen suficiente (50-60 mm3), los ratones se estratificaron por el tamano tumoral y se asignaron aleatoriamente a cada una de las cohortes del estudio (sin tratar, 100 mg/kg de PD0332991 diarios en el alimento estandar, quimioterapia mas el vehlculo como control una vez a la semana durante tres semanas o quimioterapia y PD0332991 una vez a la semana durante tres semanas). En las cohortes de tratamiento una vez a la semana durante tres semanas, la quimioterapia se administro

50 por inyeccion IP y los 150 mg/kg de PD0332991 o el vehlculo como control se administraron por via oral. El regimen de quimioterapia consto de 75 mg/kg de carboplatino una vez a la semana durante tres semanas. Los tratamientos se administraron los dlas 0, 7 y 14 y los volumenes tumorales se midieron semanalmente hasta que los ratones murieron o se sacrificaron debido a la toxicidad o a la carga tumoral.

55 [0158] La administracion diaria del inhibidor de CDK4/6, PD0332991, no tuvo efecto sobre el crecimiento tumoral en el modelo C3-TAg el dla 21 (vease la figura 9), mientras que la coadministracion de 150 mg/kg de PD0332991 con 75 mg/kg de carboplatino una vez a la semana durante tres semanas resulto en un aumento de la respuesta tumoral en los ratones C3-TAg (figura 9). Ademas, el seguimiento a largo plazo de los ratones C3-TAg mostro que la progresion tumoral se retraso en la cohorte de PD0332991/carboplatino en comparacion con la

cohorte de control/carboplatino (figura 10). En conjunto, estos datos sugieren que, en el tratamiento de tumores con graves trastornos del ciclo celular, la inhibicion de CDK4/6 puede aumentar la eficacia de la quimioterapia.

[0159] Por consiguiente, parece que la inhibicion de CDK4/6 puede aumentar la eficacia de los agentes que 5 danan el ADN en el tratamiento de ciertos canceres con graves alteraciones del ciclo celular, por ejemplo, canceres

caracterizados por niveles muy altos de actividad de CDK2 (por ejemplo, como resultado de la amplificacion del protooncogen MYC) o perdidas de la protelna supresora tumoral RB. En tales tumores, los inhibidores de CDK4/6 no inducen quiescencia farmacologica en las celulas tumorales, sino que mas bien aumentan la sensibilidad del cancer a los agentes que danan el ADN, con lo que aumentan la destruccion tumoral. El tratamiento con inhibidores de 10 CDK4/6 previene a la vez la toxicidad hematica en el huesped de los agentes que danan el ADN (a traves de la induction de quiescencia en ciertas otras celulas). Este aumento de la destruccion tumoral en canceres nulos para RB o con MYC amplificado, combinado con la disminucion de la toxicidad en el huesped significa una ampliation de la ventana terapeutica de tales tumores, lo que permite curar mas facilmente estos tumores con menos toxicidad para el paciente.

15

[0160] Se espera que un subconjunto de tipos tumorales, como los canceres de mama con Her2 amplificado, sean sensibles a la inhibicion de CDK4/6 y, por tanto, la coadministracion de inhibidores de CDK4/6 con la quimioterapia resulte probablemente en protection frente a los tumores. Sin embargo, la mayorla de los canceres usan las cinasas proliferativas promiscuamente (por ejemplo, pueden usar CDK1/2/4 o 6). Por consiguiente, la

20 inhibicion aislada de CDK4/6 no debe afectar al crecimiento tumoral en la mayorla de los canceres y la inhibicion de CDK4/6 no afectara negativamente a la eficacia de la quimioterapia en estos tipos tumorales. De hecho, segun se senala anteriormente, se espera que la inhibicion de CDK4/6 con moleculas pequenas inhibidoras selectivas aumente la eficacia de los agentes quimioterapeuticos en ciertos tumores que no dependen de CDK4/6. Como entendera un experto en la tecnica, tales tumores pueden deducirse a partir del tipo de tumor y la genetica molecular 25 y, por ejemplo, pueden ser canceres caracterizados por uno o mas del grupo que incluye, pero no se limita a un aumento de la actividad de CDK1 o CDK2, perdida o ausencia de la protelna supresora tumoral del retinoblastoma (RB), altos niveles de expresion de MYC, aumento de la ciclina E y aumento de la ciclina A. Tales canceres pueden incluir, pero no se limitan al cancer de pulmon microcltico, retinoblastoma, canceres positivos para VPH como el cancer cervical y ciertos canceres de cabeza y cuello, tumores con MYC amplificado como el linfoma de Burkitts y el 30 cancer de mama triple negativo; ciertas clases de sarcoma, ciertas clases de carcinoma de pulmon no microcltico, ciertas clases de melanoma, ciertas clases de cancer pancreatico, ciertas clases de leucemia, ciertas clases de linfoma, ciertas clases de cancer cerebral, ciertas clases de cancer de colon, ciertas clases de cancer de prostata, ciertas clases de cancer ovarico, ciertas clases de cancer uterino, ciertas clases de cancer de tiroides y otros canceres de tejido endocrino, ciertas clases de canceres salivales, ciertas clases de carcinomas tlmicos, ciertas 35 clases de canceres de rinon, ciertas clases de canceres de vejiga y ciertas clases de canceres testiculares.

[0161] En ejemplos no limitantes, el cancer se selecciona entre cancer de pulmon microcltico, retinoblastoma y cancer de mama triple negativo (negativo para ER/PR/Her2) o “de tipo basal”. El cancer de pulmon microcltico y el retinoblastoma casi siempre inactivan la protelna supresora tumoral del retinoblastoma (RB) y, por consiguiente, no

40 requieren la actividad de CDK4/6 para su proliferation. Por tanto, el tratamiento con un inhibidor de CDK4/6 producira quiescencia farmacologica en la medula osea y otras celulas normales del huesped, pero no en el tumor. El cancer de mama triple negativo (de tipo basal) tambien es casi siempre nulo para RB. Ademas, ciertos canceres inducidos por virus (por ejemplo, el cancer cervical y algunos canceres de cabeza y cuello) expresan una protelna vlrica (E7) que inactiva rB, lo que hace que estos tumores sean funcionalmente nulos para RB. Tambien se piensa 45 que algunos canceres de pulmon estan causados por el VPH. Como entendera un experto en la tecnica, los canceres de los que no se espera que sean afectados por los inhibidores de CDK4/6 (por ejemplo, aquellos que son nulos para RB, que expresan la protelna vlrica E7 o que sobreexpresan MYC) pueden determinarse por procedimientos que incluyen, pero no se limitan al analisis de ADN, inmunotincion, analisis de inmunotransferencia y determination de perfiles de expresion genica.

50

Ejemplo 6 (ejemplo de referenda)

Bloqueo de la proliferacion de linfocitos T por la inhibicion de CDK4/6

55 [0162] La inhibicion farmacologica aguda de CDK4/6 inhibe la proliferacion de linfocitos con el efecto mas pronunciado sobre la proliferacion homeostatica de linfocitos T de memoria y la formation de centros germinales en ratones. Para determinar si la inhibicion de CDK4/6 afecta a la generation y mantenimiento de los linfocitos de memoria, se trataron ratones con inhibidores selectivos de CDK4/6, PD0332991 o un inhibidor selectivo de CDK4/6 no relacionado, 2BrIC. El compuesto 2BrIC fue sintetizado por OTAVA Chemicals (Kiev, Ucrania) y puede

prepararse de acuerdo con los procedimientos descritos en Zhu y col., J. Med. Chem. 46, 2027-2030 (2003). La inhibicion aguda de CDK4/6 por PD0332991 o 2BrIC resulto en una disminucion mas significativa de la proliferacion homeostatica de los linfocitos T de memoria que de los linfocitos T vlrgenes, segun se determina por la incorporacion de BrdU y la expresion de Ki67 en celulas humanas y murinas. Veanse las figuras 11, 17, 18 y 21. En la figura 11A, 5 un efecto de PD0332991 en la incorporacion de BrdU in vivo en linfocitos T murinos CD4+ y CD8+, en que los mayores efectos se observan en los linfocitos de memoria CD44+ CD25+ (cuantificado en la figura 11B). Un efecto similar sobre la proliferacion homeostatica in vivo se observo en linfocitos T esplenicos no estimulados mediante tincion con Ki67 (figura 21). La disminucion de la actividad de CDK4/6 tambien inhibio la formation de centros germinales, lo que es importante para la generation de linfocitos B de memoria. Vease la figura 11C. Estos datos

10 revelan un papel para CDK4/6 en la homeostasis de los linfocitos de memoria.

[0163] Usando linfocitos humanos se observaron resultados similares. La figura 12 muestra un esquema experimental para estudiar aspectos similares en humanos. Los linfocitos humanos se separan en linfocitos T(CD3+) y B(CD19+) y se tratan in vitro con un inhibidor de CDK4/6 antes de su estimulacion con PMA e ionomicina (P+I) +

15 celulas OKT3 (linfocitos T) o IgM (linfocitos B), en que la proliferacion se determina por la incorporacion de BrdU y la expresion de Ki67 y la activation se determina por la expresion de CD25. La figura 13 muestra que, al igual que en celulas murinas, los inhibidores de CDK4/6 bloquean la proliferacion en respuesta a la estimulacion (P+I) de los receptores de linfocitos T (TCR), con un efecto mayor en los linfocitos de memoria CD45RAlow. Estos datos se representan en la figura 14. En la figura 15, se evaluan los efectos de la inhibicion de CDK4/6 sobre fracciones de

20 linfocitos T especlficas, con y sin TCR, y se muestra que la inhibicion de CDK4/6 tiene un efecto mayor sobre la proliferacion de los linfocitos de memoria en relation con los linfocitos vlrgenes. Un efecto similar se observo en los linfocitos CD8+. La figura 16 muestra datos similares a los de la figura 15, pero con el uso de Ki67 como marcador de proliferacion en lugar de BrdU. Estos efectos sobre la proliferacion cambian las frecuencias relativas de los linfocitos CD4+ (veanse las figuras 17A, 17B y 17C) y cD8+ (vease la figura 18). Los inhibidores de CDK4/6

25 disminuyen la frecuencia de linfocitos de memoria efectores (ME) CD4+ en mayor medida que los linfocitos vlrgenes. Veanse las figuras 17A y 17C. Un resultado similar se observa en los linfocitos CD8+. Como resultados de estos efectos sobre la proliferacion, la relacion memoria/virgen disminuyo a la mitad en los dos compartimentos de CD4+ y CD8+. Veanse las figuras 17B y 20. Estas alteraciones de la proliferacion estan asociadas con una disminucion de la activacion de los linfocitos T, segun se determina por la expresion de CD25. Vease la figura 19.

30

[0164] Esta capacidad de inhibir la proliferacion de los linfocitos T puede usarse en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y alergicas. Actualmente, estas enfermedades se tratan con diversos agentes citotoxicos y esteroides de toxicidad significativa. Ha resultado diflcil dirigirse especlficamente al compartimento de linfocitos T de memoria para atenuar las respuestas inmunitarias de recuerdo y el uso de los inhibidores de CDK4/6

35 para reducir la proliferacion de esta fraction sera especialmente util para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias y alergicas.

[0165] Diferenciacion de timocitos: Se evaluo el efecto de la inhibicion de CDK4/6 sobre el desarrollo de los timocitos mediante la determination de los porcentajes y los numeros absolutos de timocitos en los diferentes

40 estados (doble negativo (DN): CD4- CD8-; doble positivo (Dp): CD4+ CD8+; simple positivo (SP); CD4+ o CD8+) por FACS. Las celulas DN se convierten en celulas Dp que a su vez se convierten en celulas solo positivas para CD4 o CD8. La inhibicion transitoria de CDK4/6 produjo una reduction considerable de las celulas DP y SP, sin afectar relativamente a las celulas DN. Este resultado sugiere que se requiere la activacion de CDK4/6 durante la timopoyesis para la production de nuevos linfocitos T vlrgenes. Vease la figura 23.

45

Ejemplo 7 (ejemplo de referenda)

Bloqueo de la proliferacion de linfocitos B por la inhibicion de CDK4/6

50 [0166] Se trataron cohortes de ratones de tipo natural con el vehlculo o con un inhibidor de CDK4/6 como en la figura 11. La tincion mediante Ki67 de un centro germinal en un ganglio linfatico muestra una notable disminucion de la proliferacion con la inhibicion de CDK4/6. Un resultado similar se observo en linfocitos B CD45R+ esplenicos. Vease la figura 21. Los ratones no estimulados se trataron durante 24 horas con PD0332991 y la proliferacion homeostatica de los linfocitos B se determino por tincion con Ki67, despues de la separation apropiada. Al usar la

55 incorporacion de BrdU para medir la proliferacion de linfocitos B esplenicos se obtuvieron resultados similares. Vease la figura 22. Se llevaron a cabo experimentos similares en celulas humanas con estimulacion de receptores de linfocitos B, segun se describe en la figura 12. La figura 20 muestra que la inhibicion de CDK4/6 bloquea la estimulacion de linfocitos B por P+I. Estos resultados demuestran que la proliferacion homeostatica del centro germinal y de linfocitos B inducida por BCR requiere la actividad de CDK4/6 en ratones y en humanos.

Ejemplo 8 (ejemplo de referenda)

Inhibicion de la aparicion de enfermedades inmunitarias por la inhibicion de CDK4/6 5

[0167] Se han desarrollado varias lineas de modelos de ratones autoinmunes, incluidos los ratones NOD (diabetes autoinmunitaria espontanea) y Lyn-/- (enfermedad autoinmunitaria similar al lupus). Vease, por ejemplo Anderson y Bluestone, Annual Review of Immunology 23, 447-485 (2005); y Hibbs y col., Cell 83, 301-311 (1995). Se tratan cohortes de animales jovenes (aproximadamente 4-6 semanas) y viejos (> 30 semanas) con placebo o con 10 un inhibidor de CDK4/6 durante periodos definidos de tiempo antes de analizar la presencia de fenotipos autoinmunes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composition farmaceutica que comprende un compuesto inhibidor que inhibe selectivamente la cinasa dependiente de ciclina 4 (CDK4) y/o la cinasa dependiente de ciclina 6 (CDK6) para uso en un procedimiento

5 para aumentar la eficacia de los factores de crecimiento para el rescate y apoyo de las poblaciones de celulas hematopoyeticas en un sujeto que recibe un tratamiento contra el cancer para un cancer que no depende de las actividades de CDK4/6 para su proliferation, en que dicho procedimiento comprende (i) la administration a un sujeto de una cantidad farmaceuticamente eficaz del compuesto inhibidor, (ii) la exposition de dicho sujeto a un agente que dana el ADN para el tratamiento del cancer y (iii) la administration de un factor de crecimiento para el rescate y 10 apoyo de la poblacion de celulas hematopoyeticas.
2. La composition farmaceutica para uso en un procedimiento de la revindication 1, en que el factor de crecimiento comprende uno o mas agentes seleccionados del grupo que consta de un factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), un G-CSF pegilado, un factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos (GM-

15 CSF), trombopoyetina, eritropoyetina, eritropoyetina pegilada, interleucina (IL) 12, el factor acero y un factor de crecimiento de queratinocitos
3. La composition farmaceutica para uso en un procedimiento de la revindication 1, que dana el ADN es un agente quimioterapeutico.

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4. La composition farmaceutica para uso en un procedimiento de la revindication 1, que dana el ADN es radiacion ionizante.
5. La composicion farmaceutica para uso en un procedimiento de la reivindicacion 2, en que el factor de 25 crecimiento se selecciona del grupo que consta de eritropoyetina y eritropoyetina pegilada.
6. La composition farmaceutica para uso en un procedimiento de la revindication 2, en que el factor de crecimiento se selecciona del grupo que consta del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) pegilado.

30
7. La composition farmaceutica para uso en un procedimiento de la revindication 2, en que el factor de crecimiento es el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrofagos.
8. La composition farmaceutica para uso en un procedimiento de la revindication 1, en que el factor de 35 crecimiento se administra al menos aproximadamente 24 horas despues de la administration del agente que dana el

ADN o en que el factor de crecimiento se administra al menos 72 horas despues de la administration del agente que dana el ADN.
9. La composition farmaceutica para uso en un procedimiento de la revindication 1, en que dicho sujeto 40 (i) recibe una cantidad farmaceuticamente eficaz del compuesto inhibidor, despues de la administration del

compuesto inhibidor, el sujeto (ii) se expone a un agente que dana el ADN para el tratamiento del cancer y, despues de la administration del compuesto inhibidor, el sujeto (iii) recibe un factor de crecimiento para el rescate y apoyo de la poblacion de la poblacion de celulas hematopoyeticas.

45 10. La composition farmaceutica para uso en un procedimiento de la revindication 1, en que la poblacion

de celulas hematopoyeticas son globulos rojos.
11. La composition farmaceutica para uso en un procedimiento de la revindication 1, en de celulas hematopoyeticas son globulos blancos.

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12. La composition farmaceutica para uso en un procedimiento de la revindication globulos blancos son linfocitos.
13. La composition farmaceutica para uso en un procedimiento de la revindication 1, en que la poblacion 55 de celulas hematopoyeticas son plaquetas.
14. La composition farmaceutica para uso en un procedimiento de la revindication 1, en que el compuesto inhibidor se selecciona del grupo que consta de pirido[2,3-d]pirimidinas, aril[a]pirrol[3,4-d]carbazoles, ureas sustituidas con heteroarilo que contiene nitrogeno, 5-pirimidinil-2-aminotiazoles, benzotiadiazinas,

que la poblacion 11, en que los

en que el agente en que el agente

acridinationas e isoquinolonas.
15. La composicion farmaceutica para uso en un procedimiento de la reivindicacion 14, en que la pirido[2,3-d]pirimidina es 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-(5-piperazin-1-ilpiridin-2-ilamino)-8H-pirido[2,3d]pirimidin-7-

5 ona.
16. La composicion farmaceutica para uso en un procedimiento de la reivindicacion 14, en que el aril[a]pirrol[3,4-c]carbazol es 2-bromo-12,13-dihidro-5H-indol[2,3-a]pirrol[3,4]carbazol-5,6-diona.