ES2387661B1

ES2387661B1 - Proceso de purificación y estabilización de la enzima gluconato deshidrogenasa (gadh, ec 1.1.99.3); enzima gluconato deshidrogenasa (gadh, ec 1.1.99.3); y uso de la enzima gluconato deshidrogenasa (gadh, ec 1.1.99.3).

Info

Publication number: ES2387661B1
Application number: ES201031819A
Authority: ES
Inventors: Pablo Alonso Rodríguez; Luis Manuel Quirós Fernández; Sonia Castañón de la Torre; Ainara Crespo Susperregui; Sonia Maza del Rio
Original assignee: Biolan Microbiosensores SL
Current assignee: Biolan Microbiosensores SL
Priority date: 2010-12-10
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2013-10-31
Anticipated expiration: 2030-12-10
Also published as: ES2387661A1; EP2650363A4; EP2650363A1; CL2013001596A1; US20130260407A1; WO2012076738A1

Abstract

Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, a partir de varios microorganismos como por ejemplo: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter industrius, Serratia marcescens Klebsiella pneumoniae y Eschericia coli y su uso como elemento de reconocimiento biológico en biosensores para la determinación del ácido glucónico en muestras de interés.#Biosensor bío-catalítico con transducción electroquímica libre de interferentes gracias a la alta selectividad de la enzima obtenida mediante el método detallado y estabilizada con los agentes químicos optimizados.

Description

PROCESO DE PURIFICACiÓN Y ESTABILIZACiÓN DE LA ENZIMA

GLUCONATO DESHIDROGENASA (GADH , EC 1.1.99.3); ENZIMA

GLUCONATO DESHIDROGENASA (GADH , EC 1.1.99.3); Y USO DE LA

ENZIMA GLUCONATO DESHIDROGENASA (GADH, EC 1.1.99.3)

S: ESTADO DEL ARTE

Frente a los métodos analíticos convencionales (HPLC con varios detectores,

espectrofotometría de absorción atómica, polarografía ... etc.) los métodos bio

analíticos han experimentado un gran interés gracias a la alta selectividad de los

elementos de reconocimiento biológico. El ejemplo más revelante de este

10: aumento de interés es la invención revolucionaria de los biosensores desde

1962 gracias a los trabajo de Clark y Lyon [L.C. Clark and C. Lyons, Ann. NY.

Acad. Sci 120 (1962) 29]. Son dispositivos compactos que se basan en la

integración intima de elementos de reconocimiento biológico en un sistema de

transducci6n de la señal física [O.R Thévenot el al Pureo Appl. Chem

15: 71(1999)2333]. El desarrollo de estos dispositivos pasa de forma genérica por

tres líneas de investigación: la elección del sistema de transducción de la señal

física adecuado, la inmovilización y/ o la integración de este elemento en la

superlicie sensora, y la correlación de la señal generada con la presencia del

analito de interés. Estos dispositivos compactos sufren la presencia de

20: interlerentes presentes en la matriz. , lo que se puede paliar mediante desarrollos

quimiométricos o aplicando al biosensor materiales compatibles con el ERB.

En el bagaje bibliográfico actual se pueden encontrar muchas invenciones

centradas en esta última aproximación, la aplicación de capas protectoras que

sirven tanto para proteger los ERBs de los posibles inhibidores como al sistema

25: de transducción de la señal de los interlerentes. De hecho se ha usado con

abundancia y con mucho éxito polímeros biocompatibles como son el acetato de

celulosa [H. Gunasingham et al, Biosensors 4 (1989)349; X. Ren et al Colloids

Sur! B Biointer!aces 72 (2009)188; R. Vaidya and E. Wilkins, Electroanalysis 6

(1994) 617; L.N. Wu et al Electrochim. Acta 51 (2006) 1208J, el chitosano [J. Lin

30: et al Sensors Actuators B: Chem 137 (2009) 768; S. Hikima et al , Fereseniu's. J.

Anal. Chem 345 (1993) 607; H. Yu et al, Anal. Biochem 331 (2004) 98; G. Wang

el al Biosens. Bioe/eclron 18 (2003) 335; X. Kang el al Biosens. Bioe/eclron 25

(2009) 901; J. Chem, E/eclroanafisis 18 (2006) 670] Yel Nafion [M. EIKaoulil and

Col WO/2009/022035; M. EIKaoulil and Col WO/2009/034200; J . Wang el al, J.

Am. Chem. Soc 125(2003) 2408; S. H. Lim, Biosens. Bioe/eclron 20 (2005) 2341;

5: Y-C. Tsai el al Langmuir 21 (2005) 3653; A. A Karyakin et al, Anal. Chem 72

(2000) 1720; M. EIKaoutit et al J. Agrie. Food. Chem 55 (2007)8011 ; M. EIKaoutit

et al, Ta/anla 75 (2008) 1348; M. EIKaoutit et al, Biosens. Bioe/eclron 22 (2007)

2958].

La presente in vención se ha centrado en una aproximación totalmente novedosa

JO: para evitar problemas de inhibición de la enzima Gluconato Deshidrogenasa

(GADH , 1.1.99.3), protegerla y darle cierta durabilidad a temperatura ambiente

en una matriz típicamente compleja como es el vino o el mosto de uva. Es

destacable el hecho de que la sensibilidad a ciertos inhibidores e interferentes

de las enzima puede depender del organismo de donde se extrae este elemento

15: de reconocimiento biológico, de su proceso de purificación e incluso de los

estabilizantes necesarios para mantener una cierta conformación estructural de

la proteína. Se ha conseguido la purificación de la enzima GADH (1.1.99.3) a

partir de varios microorganismos, mediante métodos muy novedosos y su

estabilización en una disolución especifica. Como aplicación se han fabricado

20: biosensores con simple retención física sobre una base conductora de una

alícuota liquida de esta enzima mediante una membrana de diálisis junto con el

mediador químico; sin aplicación de ninguna matriz de inmovilización ni un

protector. El dispositivo resultante ha demostrado satisfactoria selectividad y

estabilidad al acido glucónico como sustrato en matrices típicamente complejas

25: como son el vino (muy rico en taninos y sulfitos) o/y el mosto de uva (con

elevado grado de glucosa yacido ascórbico por ejemplo).

El presente invento preconiza un proceso de purificación y estabilización de la

enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, en

la que la purificación de GADH se realiza a partir de células de SerraNa

30: marcescens, Kleibsella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas

fluorescens, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter industrius o Eschericia coli

o mezcla de ellas, y en el que la rotura celular se produce mediante sonicación u otro tipo de rotura física, procediéndose a obtener sus membranas, en el que:

a) las membranas se resuspenden por exlrusión y

b) se realiza la solubilización de la enzima GADH de la membrana mediante la adicción de detergentes como n-Octyl-~-D-tioglucósido, Zwittergent 3-12, Twenn 80, Brij 58 o Triton X-100 en porcentajes v/v entre el 0,1% y el 3 %, se ultracentrifuga la suspensión y se recoge el sobrenadante,

e) se somete al sobrenadante a una cromatografía de intercambio jónico a un pH entre 4 y 8,5.

También se caracteriza porque a la enzima GADH así purificada se le añade:

acido glucónico a una concentración entre 5 y 20 mM;

una concentración v/v de glicerol entre ellO Yel 50%;

detergentes como n-Octyl-¡3~D-tioglucósido, Zwittergent 3·12, Twenn 80, Brij 58 o Triton X-lOO a una concentración v/v entre el 0.05 y 2%;

un catión divalente que puede ser MgCI2, CaCI2 o BaCI2 a una concentración entre 1 y 10 mM; y

uno o varios de los siguientes hidratos de carbono en una concentración v/v entre el 1 y el 20%; trehalosa, malitol, manitol, sorbitol, dextran y Ficoll™.

También es objeto de la invención la Enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH) obtenida de acuerdo con este proceso.

Así mismo, es objeto de la invención el uso de la enzima, obtenida de acuerdo con el proceso anteriormente descrito, como elemento de reconocimiento biológico para el desarrollo de dispositivos de medida del sustrato enzimático ácido glucónico.

También es objeto del invento el uso de la enzima, obtenida de acuerdo con el proceso anteriormente descrito, para medir los valores de ácido gluc6nico en muestras alimentarias, por ejemplo, mostos y vinos.

EXPLICACiÓN DE UNA FORMA DE REALIZACiÓN PREFERENTE

5: Para una mejor comprensión de la presente invención, se exponen los siguientes ejemplos, descritos en detalle, que deben entenderse sin carácter limitativo del alcance de la presente invención.

Ejemplo 1. Purificación de gluconato 2-deshidrogenasa (GADH, 1.1.99.3) a partir de Pseudomonas aeruginosa

10: La cepa bacteriana utilizada para esta in vención , Pseudomonas aeruginosa CECT 108, puede ser cultivada en cualquier medio que induzca el ciclo de las pentosas fosfato.

J5: En el paso de producción se emplearon 2 matraces Erlenmeyer de 2 litros, cada uno conteniendo 600 mi de medio, que habían sido inoculados con un 10% de volumen de cultivo crecido en el mismo medio hasta obtener una 00500=2,5. Los cultivos fueron incubados a 28!? C hasta su fase exponencial tardía (aproximadamenle 12 horas).

20: Los cultivos fueron centrifugados durante 45 minutos a 9000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se recogió el precipitado. La masa celular fue conservada en congelación a -80ºC hasta el momento de su ruptura.

25: Para comenzar la ruptura de las células, se descongelaron y se resuspendieron en 5 veces su volumen en tampón acetato 50 mM y un pH=4.5 de ruptura. Se añadieron 5 mg/ml de lisozima e inhibidor de proteasas y se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. En este momento, se añadió 0,5 mi de DNAsa 111 mg/ml en NaCI 0,15 M Y se mantuvieron las células en agitación en el tampón descrito a 4ºC hasta el día siguiente.

Más tarde las células se sometieron a 6 pulSOS de sonicación, con un 50% de amplitud. Se centrifugaron, para separar las células no rotas y las paredes celulares (precipitado) del sobrenadante, que contenía las proteínas

citoplasmáticas y las membranas celulares en suspensión. Se evitó recoger el sobrenadante de mayor densidad, que quedaba sobre el precipitado, por la dificultad que suponía la separación de las proteínas citoplasmáticas de las proteínas de membrana.

El sobrenadante se ultracentrifugó a 20000 rpm, tras lo cual se desechó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado nuevamente en tampón acetato 50 mM pH=4,5 para eliminar la mayor cantidad posible de proteínas citoplasmáticas retenidas en las membranas precipitadas. Se ultracentrifugó a 20000 rpm y se desechó nuevamente el sobrenadante.

Las membranas se resuspendieron esta vez en tampón acetato 20 mM pH=4,5 aproximadamente 2 mI. Para homogeneizar la suspensión se sometieron a baño de ultrasonidos, evitando el calentamiento de la muestra mediante la introducción del tubo de vidrio que la contenía en hielo en escamas.

En este momento, se cuantificó proteína mediante reactivo de Bradford en espectrofotómetro a 595 nm de longitud de onda y actividad enzimática, también en espectrofotómetro, a 600 nm durante 5 minutos. Los reactivos empleados para el ensayo enzimático fueron 700 ¡JI de tampón fosfato 135 mM pH=4.5, 100 ~I de gluconato 165 mM en el mismo tampón fosfato, 100 ~I de DCPIP 2,2 mM y 100 ~I de PMS 13 mM.

Se incrementó el volumen de tampón de resuspensión hasta obtener una concentración de proteína 10 mg/ml. Se añadió detergente Triton X-100 al 0,5% para solubilizar las proteínas de membrana y se mantuvo en agitación a 4ºC durante la noche.

Al día siguiente, se ultracentrifugó a 35000 rpm la suspensión. Se desechó el precipitado, se recogió el sobrenadante y se midió nuevamente la actividad enzimática.

El sobrenadante se sometió a cromatografía de intercambio iónico en un equipo FPLC, utilizando como tampón A: acetato 20 mM pH=4,5 y Triton Xl00 al 0,1% y, como tampón B, el mismo, añadiendo KCI 1M. Se eluyó la muestra con un gradiente de O a 50%, con un flujo de 1 ml/min. Se realizó ensayo enzimático y

cuantificación de proteína de las fracciones eluídas, para realizar una selección de aquellas fracciones que tuviesen mayor actividad específica.

Se concentró la enzima mediante ultrafiltración en membrana de 50000 MWCO de diámetro de corte hasta obtener una concentración aproximada de 0,2 UE/IJI.

5: Para su conservación , se añadió como agente solovofóbico 15% de glicerol y detergente 1% de Triton X-100, un agente crioprotector 1% de Trehalosa y estabilizantes a base de cationes diva lentes y/o sustratos naturales de la enzima.

Ejemplo 2. Purificación de gluconato 2-deshidrogenasa (GADH, 1.1.99.3) a partir de Gluconobacter Oxydans.

10: La cepa bacteriana utilizada para esta invención, Gluconobacter oxydans CECT 360, puede ser cultivada en cualquier medio que induzca el ciclo de las pentosas fosfato.

J5: En el paso de producción se emplearon 6 matraces Erlenmeyer de 2 litros, cada uno conteniendo 600 mi de medio, que habían sido inoculados con un 10% de volumen de cultivo crecido en el mismo medio hasta obtener una OD600 =2. Los cultivos fueron incubados a 30!? C hasta su fase exponencial tardía (aproximadamente 48 horas).

20: Los cultivos fueron centrifugados durante 45 minutos a 9000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se recogió el precipitado. La masa celular fue conservada en congelación a -80 "C hasta el momento de su ruptura.

25: Para comenzar la ruptura de las células, se descongelaron y se resuspendieron en 5 veces su vo lumen en tampón fosfato 100 mM pH=6. Se añadieron 5 mg/ml de lisozima e inhibidor de proteasas y se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. En este momento, se añadió 0,5 mi de DNAsa II 1 mg/ml en NaCI 0,15 M Y se mantuvieron las células en agitación en el tampón descrito a 4ºC hasta el día siguiente.

Más tarde las células se descongelaron y se sometieron a dos pasos por prensa French a 1000 Kg/cm2• Se centrifugaron, para separar las células no rotas y las paredes celulares (precipitado) del sobrenadante, que contenía las proteínas

El sobrenadante se ultracentrifugó a 20000 rpm, tras lo cual se desechó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado nuevamente en tampón fosfato 50 mM pH=6 para eliminar la mayor cantidad posible de proteínas citoplasmáticas retenidas en las membranas precipitadas. Se ultracentrifugó a 20000 rpm y se desechó nuevamente el sobrenadante.

Las membranas se resuspendieron esta vez en tampón fosfato 20 mM pH=7, aproximadamente 6 mI. Para homogeneizar la suspensión se sometieron a baño de ultrasonidos, evitando el calentamiento de la muestra mediante la introducción del tubo de vidrio que la contenía en hielo en escamas.

En este momento, se cuantificó proteína mediante reactivo de Bradford en espectrofotómetro a 595 nm de longitud de onda y actividad enzimática, también en espectrofotómetro, a 600 nm durante 5 minutos. Los reactivos empleados para el ensayo enzimático fueron 700 ~I de tampón fosfato 135 mM pH~5, 100 ~I de gluconato 165 mM en el mismo tampón fosfato, 100 ¡JI de DCPIP 2,2 mM y 100 ~I de PMS 13 mM.

Se incrementó el volumen de tampón de resuspensión hasta obtener una concentración de proteína 10 mglml. Se añadió detergente Twenn 80 al 0.5% para solubilizar las proteínas de membrana y se mantuvo en agitación a 4 QC durante la noche.

El sobrenadante se sometió a cromatografía de intercambio iónico en un equipo FPLC, utilizando como tampón A: fosfato 20 mM pH~7 y Twenn 80 ala, 1% y, como tampón B, el mismo, añadiendo KCI 1M. Se eluyó la muestra con un gradiente de O a 50%, con un flujo de 1 ml/min. Se realizó ensayo enzimático y

cuantificación de proteína de las fracciones eluídas, para realizar una selección de aquellas fracciones que tuviesen mayor actividad específica.

Se concentró la enzima mediante ultrafiltración en membrana de 50000 MWCO de diámetro de corte hasta obtener una concentración aproximada de 0,2 UE/IJI.

Para su conservación, se añadió como agente solvofóbico 15% de glicerol y detergente 1% de Twenn 80, un agente crioprotector 3% de Dextran 40 y estabilizantes a base de cationes diva lentes y/o sustratos naturales de la enzima.

Ejemplo 3. Purificación de gluconato 2-deshidrogenasa (GADH, 1.1.99.3) a partir de Serratia marcescens.

La cepa bacteriana utilizada para esta invención, Serratia marcescens IFO 3054, fue cultivada en un medio que contenía 0,1% de polipeptona, 0,1% de extracto de levadura, 0,1% de NaCI, 0,3% de KH,P04, 0,04% Na,S04 y 0,04 de MgS04 x

7H,O.

En el paso de producción se emplearon 2 matraces Erlenmeyer de 2 litros, cada uno conteniendo 600 mi de medio, que habían sido inoculados con un 10% de volumen de cultivo crecido en el mismo medio hasta obtener una OD600 =3. Los cultivos fueron incubados a 26 ºC hasta su fase exponencial tardía (aproximadamente 48 horas).

Los cultivos fueron centrifugados durante 45 minutos a 9000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se recogió el precipitado. La masa celular fue conservada en congelación a-80 ºC hasta el momento de su ruptura.

Para comenzar la ruptura de las células, se descongelaron y se resuspendieron en 5 veces su volumen en tampón fosfato 100 mM pH=6. Se añadieron 5 mg/ml de lisozima e inhibidor de proteasas y se mantuvo en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos. En este momento, se añadió 0,5 mi de DNAsa II 1 mg/ml en NaCI 0,15 M Y se mantuvieron las células en agitación en el tampón descrito a 4ºC hasta el día siguiente.

Más tarde las células se descongelaron y se sometieron a dos pasos por prensa

French a 1000 Kg/cm• Se centrifugaron, para separar las células no rotas y las

5: paredes celulares (precipitado) del sobrenadante, que contenía las proteínas citoplasmáticas y las membranas celulares en suspensión. Se evitó recoger el sobrenadante de mayor densidad, que quedaba sobre el precipitado, por la dificultad que suponía la separación de las proteínas citoplasmáticas de las proteínas de membrana.

JO: El sobrenadante se ultracentrifug6 a 20000 rpm , tras lo cual se desechó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado nuevamente en tampón fosfato 50 mM pH=6 para eliminar la mayor cantidad posible de proteínas citoplasmáticas retenidas en las membranas precipitadas. Se ultracentrifugó a 20000 rpm y se desechó nuevamente el sobrenadante.

Las membranas se resuspendieron esta vez en tampón acetato 20 mM pH=5, aproximadamente 2 mI. Para homogeneizar la suspensión se sometieron las membranas a extrusión a través de una jeringa.

15: En este momento, se cuantificó proteína mediante reactivo de Bradford en espectrofotómetro a 595 nm de longitud de onda y actividad enzimática, también en espectrofotómetro, a 600 nm durante 5 minutos. Los reactivos empleados para el ensayo enzimático fueron 700 ¡JI de tampón fosfato 135 mM pH=4.5, 100 ~I de gluconato 165 mM en el mismo tampón fosfato, 100 ~I de DCPIP 2,2 mM y 100 ~I de PMS 13 mM.

20: Se incrementó el volumen de tampón de resuspensión hasta obtener una concentración de proteína 15 mg/ml. Se añadió detergente n-Octyl-¡3-Dtioglucósido al 2% para solubilizar las proteínas de membrana y se mantuvo en agitación a 4ºC durante la noche.

25: Al día siguiente, se ultracentrifugó a 35000 rpm la suspensión. Se desechó el precipitado, se recogió el sobrenadante y se midió nuevamente la actividad enzimática.

30: El sobrenadante se sometió a cromatografía de intercambio iónico en un equipo FPLC, utilizando como tampón A: fosfato 20 mM pH=7 y n-Octyl-P-D-tioglucósido al 0,1% y, como tampón B, el mismo, añadiendo KCI1M. Se eluyó la muestra con un gradiente de O a 50%, con un flujo de 1 ml/min. Se realizó ensayo

enzimático y cuantificación de proteína de las fracciones eluídas, para realizar una selección de aquellas fracciones que tuviesen mayor actividad específica.

5: Finalmente se concentró la enzima mediante ultrafiltración en 50000 MWCO de diámetro de corte hasta obtener una aproximada de 0,2 UE/~I. membrana de concentración

Para su conservación, se añadió como agente solvofóbico 15% de glicerol y detergente 1% de n-Octyl-P-D-tioglucósido, un agente crioprotector 10% de Ficoll y estabilizantes a base de cationes divalentes y/o sustratos naturales de la enzima.

10: Abreviaturas:

ONAsa: deoxiribonucleasa

oosoo : densidad óptica a 600 nm.

r.p.m.: revoluciones por minuto

DCPIP: diclorofenol indofenol

J 5: PMS: metosulfato de Jenazina

MWCO: peso molecular de corte

FPLC: cromatografía líquida para proteínas

Aplicación

20: La enzima así obtenida se ha ensayado en el desarrollo de un biosensor electrobio-electrocatalítico de segunda generación en vinos y mostos de uva en modo amperométrico y los resultados han sido satisfactorios.

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, en la que la purificación de GADH se realiza a partir de células de Serratia marcescens, Kleibsella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Gluconobacter oxydans, Gluconobacter industrius o Eschericia coli o mezcla de ellas, y en el que la rotura celular se produce mediante sonicaci6n u otro tipo de rotura física, procediéndose a obtener sus membranas, caracterizado porque:

a) las membranas se resuspenden por exlrusión y

b) se realiza la solubilización de la enzima GADH de la membrana mediante la adicción de detergentes como n-Octyl-~-D-tioglucósido, Zwittergent 3-12, Twenn 80, Brij 58 o Triton X-lOO en porcentajes v/v entre el 0,1 % Y el 3 %, se ultracentrifuga la suspensión y se recoge el sobrenadante,

c) se somete al sobrenadante a una cromatografia de intercambio iónico a un pH enlre 4 y 8,5.
2.-Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, según reivindicación 1, caracterizado porque a la enzima GADH así purificada se le añade acido glucónico a una concentración entre 5 y 20 mM.
3.-Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, según reivindicación 2, caracterizado porque a la enzima GADH así purificada se le añade una concentración v/v de glicerol entre el 10 Y el 50%.
4.-Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque a la enzima GADH así purificada se le añade delergentes como n-Oclyl-~-D-lioglucósido, Zwitlergent 3-12, Twenn 80, Brij 58 o Triton X-lOO a una concentración v/v entre el 0.05 y 2%.

5

5.Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH , EC 1.1.99.3) recombinante o no, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque a la enzima GADH así purificada se le añade un catíon divalente que puede ser MgCI2, CaCI2 o BaCI2 a una concentración entre 1 y 10 mM

JO

6.Proceso de purificación y estabilización de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH , EC 1.1.99.3) recombinante o no, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque a la enzima GADH así purificada se le añade uno o varios de los siguientes hidratos de carbono en una concentración v/v entre el 1 y el 20%; trehalosa, malitol, manitol, sorbitol, dextran y Ficoll™.
7.-Enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, obtenida de acuerdo con el proceso de las anteriores reivindicaciones.

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8.Uso de la enzima Gluconato Deshidrogenasa (GADH, EC 1.1.99.3) recombinante o no, obtenida de acuerdo con el proceso de las anteriores reivindicaciones, para medir los valores de acido glucónico en muestras alimentarias.