[go: up one dir, main page]

EE05844B1 - Mikroorganismi tüvi Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest kui antimikroobne ja antioksüdatiivne probiootikum - Google Patents

Mikroorganismi tüvi Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest kui antimikroobne ja antioksüdatiivne probiootikum

Info

Publication number
EE05844B1
EE05844B1 EEP202000014A EEP202000014A EE05844B1 EE 05844 B1 EE05844 B1 EE 05844B1 EE P202000014 A EEP202000014 A EE P202000014A EE P202000014 A EEP202000014 A EE P202000014A EE 05844 B1 EE05844 B1 EE 05844B1
Authority
EE
Estonia
Prior art keywords
coccobest
tak
pediococcus acidilactici
strain
probiotic
Prior art date
Application number
EEP202000014A
Other languages
English (en)
Inventor
Pille PALUMAA
Tanel Kaart
Kristiina MÄRS
Meelis OTS
Eve RIHMA
Jaan VIHALEMM
Epp Songisepp
Liina Kuus
Heili SADAM
Original Assignee
Biocc Oü
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biocc Oü filed Critical Biocc Oü
Priority to EEP202000014A priority Critical patent/EE05844B1/et
Priority to CN202180077725.9A priority patent/CN116583193A/zh
Priority to US18/026,904 priority patent/US12491219B2/en
Priority to PCT/IB2021/000739 priority patent/WO2022058798A2/en
Priority to EP21834863.9A priority patent/EP4213642B1/en
Priority to JP2023518073A priority patent/JP7761638B2/ja
Publication of EE202000014A publication Critical patent/EE202000014A/et
Publication of EE05844B1 publication Critical patent/EE05844B1/et

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/10—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for ruminants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/60—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for weanlings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L19/00—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof
    • A23L19/20—Products from fruits or vegetables; Preparation or treatment thereof by pickling, e.g. sauerkraut or pickles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

Mikroorganismi tüvi Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest deponeerimisnumbriga DSM 32372 on uus antimikroobne ja antioksüdatiivne probiootikum. Coccobest inhibeerib enteropatogeenide L. monocytogenes, E. coli, S. enteritidis, S. typhimurium, S. sonne i, S. aureus, E. faecalis ja C. sakazakii kasvu, kuid ei inhibeeri soolestiku loomuliku mikrobioota laktobatsille. Tüve antimikroobseid omadusi soodustavad proteolüütilise aktiivsusega periplasmaatilise peptidoglükaani hüdrolaasid. Coccobesti kasutatakse zootehnilise söödalisandina põllumajandus- ja lemmikloomade seedekulgla bakteriaalsetesse infektsioonidesse nakatumisevältimiseks ning kõhulahtisuse ennetamiseks ja vähendamiseks. Coccobestil on kõrge aktiivsusega antioksüdatiivne kaitsesüsteem, tõstes glutatiooni redoksaktiivsust ning vähendades oksüdatiivset stressi rakkudes. Seetõttu leiab Coccobest kasutust inimeste probiootilise toidulisandina või funktsionaalse toiduna seedekulgla bakteriaalsetesse infektsioonidesse nakatumisevältimiseks ning oksüdatiivsestressi ennetamiseks ja vähendamiseks. Lisaks on Coccobesti tüvi kasutatav juuretisena köögiviljade fermenteerimisel.

Description

 TEHNIKAVALDKOND
Käesolev leiutis kuulub biotehnoloogia valdkonda. Leiutisekohane probiootiline piimhappebakter leiab kasutust organismi loomuliku kaitsevõime tõstmiseks ning mitmesuguste haiguste ennetamiseks ja leevendamiseks.
TEHNIKA TASE
Probiootikumid on ÜRO Toidu- ja Põllumajandusorganisatsiooni (FAO) ja Maailma Terviseorganisatsioon (WHO) määratletud kui elavad mikroorganismid, mis piisavas koguses manustatuna - toidulisandina või funktsionaalses toidus - mõjutavad soodustavalt seedetrakti mikrobioloogilist tasakaalu ning on seeläbi kasulikud peremeesorganismi tervisele. Funktsionaalne toit või kompositsioon sisaldab tervist soodsalt mõjutavaid või haigusriske vähendavaid lisakomponente või bioloogiliselt aktiivseid preparaate, sh probiootikume.
Liikide ja isendite seas märkimisväärselt eristuvad soolestiku mikrobioota ning peremeesorganismi vahelised vastastikmõjud muutuvad sõltuvalt geneetilistest ja keskkondlikest teguritest ning haigustest. Soolestiku mikrobioota tasakaalu soovitud suunas mõjutades on võimalik soodustada vastupanuvõimet immuun-, psüühika- ja metaboolsetele haigustele ning nende allumist ravimitele. Probiootikumide manustamine soodustab soolestiku mikrobioota kolonisatsiooniresistentsust ning vastupanuvõimet stressile ja enterogeensetele infektsioonidele (Sassone-Corsi et al., 2015. How Beneficial Microbes Cooperate with Immunity To Provide Colonization Resistance to Pathogens. J Immunol. 194: 40814087).
Enamik probiootikumidest on piimhappebakterid ehk piimhappekääritajad. Nende hulka kuulub ka tetraade moodustavate homofermentatiivsete pediokokkide perekond - nad on kohastunud elutegevuseks laias pH, temperatuuri ja osmootse rõhu vahemikus ning seetõttu võimelised koloniseerima seedetrakti.
Inimestele ning loomadele manustamiseks sobivate probiootikumide selekteerimisel lähtutakse ohutuse, funktsionaalsuse ja tehnoloogilisuse kriteeriumitest (FAO/WHO, 2001. Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria; EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed, 2011. Technical guidance: Tolerance and efficacy studies in target animals. EFSA J. 9:2175).
Ohutuse aspektist on oluline välistada antibiootikumiresistentsed, patogeensed või nakkushaigusega seostatud bakteritüved. Seejuures on isoleeritud tüve päritolust olulisem funktsionaalsus ehk soolestiku kolonisatsiooni võime ning bioloogiline aktiivsus (Saarela et ai., 2000. Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. J Biotechnol.
84:197215). Tehnoloogiliste kriteeriumite alla kuuluvad probiootilise tüve bioloogilise aktiivsuse ning sensoorsete omaduste püsimine tootmis- ja säilitamisprotsesside käigus, seejuures peab olema tagatud probiootikumide elujõulisus pärast seedekulgla läbimist.
Antibiootikumide manustamisest loomadel tekkivad probleemid
Vabas looduses sündinud loomad omandavad soolestiku mikrobioota oma emalt. Kaasaegsed loomakasvatusmeetodid ei lase aga emasloomal järglastega piisavalt koos viibida ning seetõttu ei pruugi noore looma soolestiku mikrobioota piisavalt kiiresti või täielikult välja areneda. See ei paku vastsündinud loomale piisavat kaitset patogeenide vastu ning füüsilise ja emotsionaalse keskkonna muutusest - emast lahutamisel või võõrutamisel - tekkiv stress muudab noore looma organismi infektsioonidele eriti tundlikuks (Corcionivoschi et al., 2010. The Effect of Probiotics on Animal Health. A rewiew. J Anim Sci Biotechnol.43:1).
Infektsioonide ennetamiseks, aga ka kasvu stimuleerimiseks on loomakasvatuses aastakümneid levinud antibiootikumide manustamine. Selle tagajärjel on loodusliku valiku ning geneetiliste mutatsioonide koosmõjul oluliselt suurenenud antibiootikumiresistentsete patogeenide väljaselekteerumine ja resistentsusgeenide horisontaalne levik farmiloomade vahel ning farmimaadelt põhjavette (FAO, 2016. Probiotics in animal nutrition -Production, impact and regulation by Y.S.Bajagai et al. FAO Animal Production and Health Paper No.179. Rome; Chee-Sanford et al., 2001. Occurrence and Diversity of Tetracycline Resistance Genes in Lagoons and Groundwater Underlying Two Swine Production Facilities. Appl Environ Microbiol. 67:1494-1502).
Antibiootikumiresistentsete patogeenide levik farmiloomade seas kujutab endast ohtu ka inimeste tervisele, levides mööda toiduahelat ning põhjustades tõsiseid haiguspuhanguid — 90ndatelndatel aset leidnud haiguspuhangud Taanis ja USA-s olid otseselt seotud vastavalt multiresistentse Salmonella enterica serovari Typhimurium DT104 levikuga sealihas ja kinoloonide suhtes resistentse Campylobacter jejuni levikuga linnulihas (Molbak et al., 1999. An outbreak of multidrug-resistant, quinolone-resistant S. enterica Typhimurium DT104. N Engl J Med.341:1420-1425; Smith et al., 1999. Quinolone-resistant Campylobacter jejuni infections in Minnesota, 1992-1998 Investigation team. N Engl J Med.340:1525-1532).
Probiootikumide manustamine veterinaarmeditsiinis
Vastavalt Euroopa Parlamendi ja Nõukogu (EÜ) määrusele nr 1831/2003 on Euroopa Liidus alates 2006. aastast keelatud loomasööta lisada antibiootikume haigusi (sh seede-infektsioone) ennetavatel ning kasvu stimuleerivatel eesmärkidel. Sama määruse raames klassifitseeritakse probiootikume kui seedefloora tasakaalustajad eri loomaliikidele mõeldud zootehnilistes söödalisandites.
Probiootilised söödalisandid vähendavad kolibakterite arvukust vasikate soolestikus ja sellest põhjustatud kõhulahtisust ning suurendavad vasikate sõõmust, stimuleerides kasvu ja vähendades suremust (Wallace ja Newbold, 1995. Bacteriology in Animal Feed and Animal Feeding. VCH Verlagsgesellschaft mbH). Lisaks soodustavad probiootikumid soolestiku kolonisatsiooniresistentsust (Jatkauskas ja Vrotniakien, 2010. Effects of probiotic dietary supplementation on diarrhoea patterns, faecal microbiota and performance of early weaned calves. Vet Med Praha.55:494-503).
Probiootikumid on efektiivsemad vasika sünnijärgse arengu varases staadiumis (7.-10. päev), mil haigusnähud avalduvad tihedamalt ning tüsistused võivad olla tõsisemad (Kawakami et al.
2010. Feeding of Lactic Acid Bacteria and Yeast on Growth and Diarrhea of Holstein Calves. J Anim Vet Adv.9:1112-1114). Seetõttu on oluline võimalikult varakult peale looma sündi pärssida patogeenide levikut soolestikus.
Pediokokkide manustamine probiootikumidena põllumajandusloomadele
Euroopa Liidus kvalifitseerunud seedefloora stabiliseerijate hulka kuulub põrsaste ja kanade kaaluiibe suurendamiseks manustatav Pediococcus acidilactici CNCM MA 18/5M (Komisjoni rakendusmäärus (EL) nr 413/2013, 6. mai 2013).
Kõnealuse tüve manustamine põrsastele esimese 42 elupäeva jooksul mõjub positiivselt nende juurdekasvule ning kaitseb peensoole limaskesta, soodustades põrsaste kolonisatsiooniresistentsust ning vastupanuvõimet stressile võõrutusperioodil (Di Giancamillo et al., 2008. Effects of orally administered probiotic Pediococcus acidilactici on the small and large intestine of weaning piglets. A qualitative and quantitative micro-anatomical study. Histol. Histopathol.23:651-664).
Kanadele manustades mõjutas Pediococcus acidilactici CNCM MA 18/5M soodustavalt munade kaalu, koore paksust, sööda efektiivsust, munakollase rasvhappelist koostist ja kolesteroolisisaldust ning vähendas praakmunade arvukust (Mikulski et al., 2012. Effects of dietary probiotic Pediococcus acidilactici supplementation on performance, nutrient
digestibility, egg traits, egg yolk cholesterol, and fatty acid profile in laying hens. Poultry Science, 91:2691-2700).
Mõnele Pediococcus acidilactici probiootilistele tüvele on omistatud võime reguleerida valguliste signaalmolekulide sünteesi, leevendades seeläbi põletikulist reaktsiooni organismis. Korea rahvustoidust isoleeritud Pediococcus acidilactici LDTM 5201 manustamine inhibeerib IL-8 tsütokiinide transkriptsiooni, mis indutseerivad põletikulist reaktsiooni infektsioonipiirkonnas. Seejuures võimendab sama tüvi IL-10 tsütokiinide, põletikuvastase reaktsiooni mediaatorite transkriptsiooni organismis, manustatuna fermenteeritud piimatoodetes või söödalisandina (KR 20180117761, Seoul National University R&DB Foundation, 2018). Sarnane põletikulise reaktsiooni kujunemist inhibeeriv toime avaldub Pediococcus acidilactici NRRL B-50517 manustamisel, mille tulemusel võimendub organismis IL-10 tsütokiinide ja M2 makrofaagide ning väheneb tsütokiinide IL-6 ja IL-23 transkriptsioon organismis (US 201916266397, Imagilin Technology LLC, 2019).
Pediococcus acidilactici leiab rakendust ka mitmest probiootilisest bakteriliigist koosnevas kompositsioonis - see sisaldab täiendavaid seedetegevust mõjutavaid komponente nagu inuliini, adsorbente ning soolemotoorika inhibiitoreid-vasikate kõhulahtisuse vähendamiseks ja ennetamiseks (EP 20110711323, Technische Universität München, 2011).
Pediokokkide kasutamine taimse materjali fermenteerimisel
Hapendamine on üheks lihtsaimaks köögiviljade säilitamise viisiks. Peenestatud köögiviljale keedusoola lisamine soodustab mahla eraldumist, mis on arenevale mikrobiootale toitekeskkonnaks. Hapendamine nõuab anaeroobseid tingimusi, vältimaks ebasoovitava mikrobioota vohamist, vead köögiviljade hapendamise tehnoloogias ning köögiviljade looduslikus mikrobiootas esinevate mikroobiliikide domineerimise mõjul võib lõpp-produkt jääda pehmeks, limaseks või esineda värvimuutusi (Pudnir ja Jäin, 2010. Changes inmircoflora of sauerkraut during fermentation and storage. World J Dairy Food Sci 5:221-225).
Juuretisekultuuride kasutamist köögivilja hapendamisel limiteerivad mitmed tegurid -köögiviljade indigeenne mikrofloora, 1-2% keedusoolakontsentratsioon, temperatuuride kõikumine. Lisaks ei tohi juuretis negatiivselt mõjutada lõpp-produkti sensoorseid omadusi.
Köögiviljade hapendamisel on domineerivateks piimhappebakterite liikideks Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus brevis, Pediococcus pentosaceus ja Lactobacillus plantarum (Applications of Biotechnology to Traditional Fermented foods.1992. Report of an ad hoc panel of the board on science and technology for international development.National Academy
Press, Washington, D.C.; Plengvidhya et ai.2007.DNA Fingerprinting of Lactic Acid Bacteria in Sauerkraut Fermentations. Appl. Environ. Microbiol.73:7697-7702).
Seejuures on teada, et Pediococcus acidilactici IOB701 ning teiste probiootiliste tüvede abil fermenteeritud funktsionaalse toidu - valmistatud sojaubadest, kollajuurest ja rosinapuu viljadest - manustamine leevendab alkoholi tarbimisest tingitud järelnähtusid ning toetab maksa elutegevust alkoholi lagundamisel, vähendades muuhulgas maksakahjustuse riske (CN 201910930726, Tianjin Chuangyuan Biotechnology Co., LTD, 2019).
Eeltoodust nähtub, et on uuritud ja kasutatud mitmeid eri omadustega Pediococcus acidilactici tüvesid. Siiski ei ole sama liigi eritüved identsete omadustega, kuna neil esinevad geneetilistest variatsioonidest tingitud liigisisesed erinevused ehk tüvespetsiifilised omadused.
Eri keskkondadest - silost, roojast, piimast ning fermenteeritud köögiviljadest ja mahladest -isoleeritud pediokokkide tüvespetsiifiline tundlikkus antibiootikumide suhtes varieerub tugevalt (Singla et al., 2018. Antibiotic susceptibility profile oi Pediococcus spp. from diverse sources.3 Biotech.8:489). Näiteks on mitme Pediococcus acidilactici tüve testimisel leitud laiapõhjalist resistentsust levinud antibiootikumide vastu (Daniels et ai., 2007.Susceptibility of Pediococcus spp. to antimicrobial agents. J Appi Microbiol.102:384-389). Seega võivad lähedalt suguluses olevad probiootilised bakteritüved erineda nii genotüübi, fenotüübi kui funktsionaalsuse poolest (Barros et al., 2001. Phenotypic and Genotypic Characterization of Pediococcus Strains Isolated from Human Clinical Sources. J. Clin. Microbiol.39:1241-1246). Probiootikumide konkreetse tüvespetsiifilise omaduse ilmnemise peamiseks eelduseks on seda põhjustavate geenide olemasolu mikroobirakus (Marteau, 2011. Evidence of Probiotic Strain Specificity Makes Extrapolation of Results Impossible From a Strain to Another, Even From the Same Species. Annals of Gastroenterology & Hepatology).
Seega on olemas vajadus Pediococcus acidilactici tüve järgi, millel oleksid soovitud omadused, ja mis sobiks kasutamiseks nii inim- kui loomatoidus ning taimse materjali fermenteerimiseks.
LEIUTISE OLEMUS
Käesolev leiutis käsitleb isoleeritud bakteritüve Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest, seda tüve lüofiliseeritud kujul, nimetatud tüve sisaldavat kompositsiooni ning tüve kasutamist probiootilise toidu- või joogilisandina, põllumajandus- ja lemmikloomade zootehnilise söödalisandina ning inimeste funktsionaalse toidu või joogi lisandina. Leiutise eesmärgiks on pakkuda välja uus probiootiline bakteritüvi, mille antimikroobne ja antioksüdatiivne toime
sobib seedetrakti mikrobioota korrigeerimiseks ja stabiliseerimiseks ning seeläbi bakteriaalsetesse infektsioonidesse nakatumise vältimiseks ja oksüdatiivse stressi ennetamiseks ja/või vähendamiseks organismis. Lisaks on Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest sobilik kasutamiseks tehnoloogilise juuretisena taimse materjali fermenteerimisel.
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest sobib lüofiliseeritud mikroobikultuuri kujul toidulisandina manustamiseks ning funktsionaalse toidu valmistamisek inimestele ja/või põllumajandus- ja lemmikloomadele (sh kalad ja linnud). Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest sisaldava kompositsiooni teisteks koostisosadeks võivad olla täispiimaasendajad, piim, starterkultuur, jõusöödad, eelsegud ja muud komponendid.
Leiutisekohane tüvi on kasutatav inimeste, põllumajandus- ja lemmikloomade seedekulgla bakteriaalsetesse infektsioonidesse nakatumise vältimiseks ja seeläbi kõhulahtisuse ennetamiseks ja/või vähendamiseks. Eelnimetatud bakteriaalseid infektsioone põhjustavateks mikroobideks on Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Shigella sonnei, Enterococcus faecalis ja Cronobacter sakazakii.
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest antibakteriaalseid ning antioksüdatiivseid omadusi saab kasutada ohutult mitmes biotehnoloogiavaldkonnas, sealhulgas taimse materjali fermenteerimisel või inimeste probiootilistes toidulisandites.
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest on deponeeritud mikroorganismide patendiekspertiisiks deponeerimise rahvusvahelise tunnustamise Budapesti lepingu kohaselt Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH-s registreerimisnumbriga DSM 32372 (23.09.2016).
Morfoloogilised tunnused
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest tüvi isoleeriti terve vasika roojaproovist seedetrakti mikrobioota uuringu käigus, külvates vasika rooja lahjendusi (10“ 2-10"7) füsioloogilises lahuses (0,9% NaCl) ning teostati väljakülvid de Man-Rogosa-Shape (MRS) agarile (OXOID, UK), mida inkubeeriti termostaadis IG 150 (Jõuan, Prantsusmaa) mikroaeroobses keskkonnas (10/5/85 CO2/O2/N2) 48 tundi 37 °C juures. Väljakasvanud mikroobipesasid kirjeldati, loendati ning määrati mikroobide üldhulk. Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest on Gram-positiivne kokk, mille rakud asetsevad paariti või tetraadidena.
Füsioloogilis-biokeemilised tunnused
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest kultiveerimiseks sobib inkubeerimine MRS-puljongis 24-48 tundi mikroaeroobses keskkonnas, mille järel ilmneb ühtlaselt hägune kasv. Pärast 48 tunnist MRS-agarsöötmel kultiveerimist 37 °C juures mikroaeroobses keskkonnas (10/5/85 CO2/O2/N2) on mikroobipesad 1,5-2,5 mm läbimõõduga, hallikasvalged, kumerad, korrapärase äärisega. Tüve optimaalne kasvutemperatuur on 37-45 °C; tüvi paljuneb ka 7 °C ja 15 °C juures. Optimaalse kasvukeskkonna pH on 6,5.
TAK 589 Coccobest tüvi identifitseeriti kui Pediococcus acidilactici biokeemilise aktiivsuse alusel, kasutades süsivesikute fermentatsiooniprofiili API CHL 50 (bioMerieux, Prantsusmaa) ning massispektromeetrit Maldi Biotyper (Bruker Daltonik, Saksamaa). Tüvi fermenteerib: L-arabinoosi, riboosi, D-ksüloos, D-galaktoosi, D-glükoosi, D-fruktoosi, D-mannoosi, L-ramnoosi, N-atsetüülglükosamiini, amigdaliini, arbutiini, eskuliini, salitsiini, tsellobioosi, D-trehhaloosi, gentibioosi, tagatoosi, naatriumglükonaati.
Genoomsed ja molekulaarsed tunnused
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest genoomi täissekveneerimisel (Omega Bioservices, USA) saadud lugemitest sorteerid välja DNA lõigud vastavalt Phredi kvaliteediskoorile (väiksem kui 20) ning pikkusele (väiksem kui 40 bp), kasutades PRINSEQi veebitarkvara (Schmieder ja Edwards, 2011. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics, 27:863— 864.). Kvaliteedikontrolli läbinud lugemitest genoomi täielikuks assambleerimiseks ning annoteerimiseks kasutati RAST-serveril baseeruvat PATRICi tarkvara (Brettin et al., 2015. RASTtk: a modular and extensible implementation of the RAST algorithm for building custom annotation pipelines and annotating batches of genomes. Sci Rep.5:8365).
Saadud tulemuste põhjal määrati Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest genoomi nukleotiidne struktuur ning tuvastati 1947 valku kodeerivat DNA-järjestust (tabel 1).
Tabel 1. TAK 589 Coccobest nukleotiidsed tunnused
Genoomi annoteerimisel leitud 1947 valku kodeerivat järjestust joondati COG-serveril põhineva andmebaasi ortoloogsete geenide vastu (Tatusov, 2000.The COG database: a tool for genome-scale analysis of protein functions and evolution.Nucleic Acids Res.28:33-36), 1677 järjestust liigitati vastavalt funktsioonile 19 suuremasse kategooriasse (tabel 2).
Tabel 2. TAK 589 Coccobest kodeerivate järjestuse klassifikatsioon
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest genoomis tuvastati periplasmaatilise peptidoglükaani hüdrolaasi (PGH) geenijärjestused, mille proteolüütilise aktiivsusega ensüümisaidid inhibeerivad laia spektriga mikroorganismide kasvu in vitro (Sharma et al., 2016. Prediction of peptidoglycan hydrolases-a new class of antibacterial proteins. BMC Genomics.
17:1; Garcia-Cano et al., 2011. Detection, cellular localization and antibacterial activity of two lytic enzymes of Pediococcus acidilactici ATCC 8042. J Appl Microbiol. 111: 607-615). Tuvastatud PGH (GenBank AKD44141.1) järjestus joondati NCBI konserveerunud domeenide andmebaasi vastu ning tuvastati kaks varasemate uuringute käigus kindlaks määratud aktiivsaiti. Esimene neist kuulub peptidoglükaankihti ära tundvate valkude perekonda-mis on võimelised rakuväliselt peptidoglükaani hüdrolüüsima, lõhkudes rakukesta amiidide vahelisi sidemeid. Teine aktiivsait kuulub analoogse toimega glükoosaminidaaside super-perekonda
(Marchler-Bauer et al., 2016. CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily domain architectures. Nucleic Acids Res.45:D200-D203).
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest sisaldab seega vähemalt kahte lüütilise aktiivsusega saitidega ensüümi, mis soodustavad kõnealuse tüve antibakteriaalset aktiivsust. Kirjeldatud PGH-ensüümidele omistatud mikroorganismide kasvu inhibeerivat toimet on demonstreeritud in vitro ning käesoleva leiutise antimikroobseid omadusi in vivo. Mõlemal juhul on demonstreeritud antibakteriaalse toime kandumist mitme levinud patogeeni vastu, sh Listeria monocytogenes, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis ja Escherichia coli.
Tundlikkus antibiootikumidele
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest antibakteriaalset tundlikkust antibiootikumidele testiti vastavalt ISO 10932 standardile VetMIC plaatide abil (SVE, Rootsi). Minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon määrati vastavalt Euroopa Toiduohutusameti (EFSA) soovitatud epidemioloogilistele murdepunktidele ja võrreldi teiste loomset päritolu pediokokkidega BioCC kultuurikollektsioonist (Tabel 3). Mikroobitüvi loetakse tundlikuks, kui selle kasv inhibeerub võrdsel või madalamal kontsentratsioonil konkreetse antimikroobse ühendi murdepunktist (S ≤ x mg/L). Mikroobitüvi loetakse resistentseks, kui selle kasv inhibeerub kõrgemal kontsentratsioonil konkreetse antimikroobse ühendi murdepunktist (R
suurem kui x mg/L). Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti tüvel ei esinenud resistentsust uuritud antibiootikumide suhtes. Seda võib käsitleda suure ohutuse kriteeriumina mitmete P. acidilactici tüvede ees, mille testimise käigus on leitud laiapõhjalist resistentsust levinud antibiootikumide vastu (Daniels et al., 2007.Susceptibility of Pediococcus spp. to antimicrobial agents. J Appi Microbiol.102: 384-389).
Tabel 3. TAK 589 Coccobest antibakteriaalne tundlikkus võrreldes kahe pediokokiga
“ Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance. EFSA Journal, 2012.10(6):2740
Antibakteriaalsed omadused
P. acidilactici eri tüvede antimikroobne mõju patogeenide vastu võib oluliselt varieeruda. Näiteks on demonstreeritud QC38 tüve puhul nõrka inhibeerivat toimet E. coli ja S. enterica serovari Typhimuriumi vastu ning keskmist inhibeerivat toimet S. aureus kasvule (Morales-Estrada et ai. 2016. Partial Characterization of Bacteriocin Produced by Halotolerant Pediococcus acidilactici Strain QC38 Isolated from Traditional Cotija Cheese. Pol J Microbiol.
65: 279-285). Samas on käesoleva leiutise tüve allasuruv toime nimetatud patogeenide vastu tugev.
In vivo uuringute tulemuste põhjal inhibeerib Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest patogeensete mikroorganismide kasvu. Nimetatud enteropatogeenideks on Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis Cronobacter sakazakii (Näide 1).
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti antimikroobsete omaduste hindamiseks patogeenide vastu kasutati joonkülvitehnikat (Hütt et ai., 2006. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens. J Appl Microbiol.
100:1324-32). Sihtmikroobide inhibitsiooni määramiseks mõõdeti kasvuvaba tsoon millimeetrites, arvutati kasutatud valimi tulemuste põhjal aritmeetiline keskmine ning standardviga ja sellest lähtuvalt hinnati tüvede antagonistlikku aktiivsust.
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti tüvel avaldusid tugevad antagonistlikud omadused valitud patogeenide suhtes peale 24 ja 48 tundi inkubeerimist, kuid tüvi ei suru alla soolestiku loomuliku mikrobioota kooslusesse kuuluvaid laktobatsille (tabel 4; 5).
Tabel 4. TAK 589 Coccobest antibakteriaalne aktiivsus*
a Modifitseeritud MRS-agarsöötmel mikroaeroobses (10% CO2) ja anaeroobses (5/90/5 CO2/O2/N2) keskkonnas peale 24 tundi inkubeerimist.
Kasvupidurdustsoon mikroaeroobses keskkonnas: nõrk väiksem kui 9,9; keskmine 10,0-12,9; tugev suurem kui 13 (mm).
Kasvupidurdustsoon anaeroobses keskkonnas:nõrk väiksem kui 4,9; keskmine 5,0-5,9; tugev >6 (mm).
Tabel 5. TAK 589 Coccobesti antibakteriaalne aktiivsus13
b Modifitseeritud MRS-agarsöötmel mikroaeroobses (10% CO2) ja anaeroobses (5/90/5 CO2/O2/N2) keskkonnas peale 48 tundi inkubeerimist.
Kasvupidurdustsoon mikroaeroobses keskkonnas: nõrk väiksem kui 9,9; keskmine 10,0-12,9; tugev >13 (mm).
Kasvupidurdustsoon anaeroobses keskkonnas: nõrk väiksem kui 7,9; keskmine 8,0-12,9; tugev >13 (mm).
Antioksüdatiivsed omadused
Oksüdatiivset stressi organismis põhjustavad vabaradikaalseid ahelreaktsioone soodustavad faktorid ehk oksüdatiivsed stressorid. Kestev kontrollimatu oksüdatiivsete stressorite teke ja mõju põhjustab lipiidide, valkude, nukleiinhapete ja süsivesikute oksü-kahjustusi, olles paljude haiguste (infarkt, insult, ateroskleroos, vähk) üheks põhjuseks. Oksüdatiivsete stressorite hulka kuuluvad muuhulgas ka hapniku reaktiivsed vormid, mille kuhjumine on üks peamine rakukahjustuste põhjus.
Antioksüdandid on ensüümid või ained, mis juba väga madalas kontsentratsioonis on suutelised takistama või likvideerima oksüdatiivsete stressorite teket ning ahelreaktsioone. Organismis töötavad nii spetsiifilised antioksüdantsed ensüümid kui antioksüdantsed ühendid (nt glutatioon). Lisaks omastatakse antioksüdantseid ühendeid toidust. Saastatud ja stressirohkes keskkonnas vajab antioksüdantne kaitse lisatuge. Antioksüdante eraldub vereringlusesse ka soolestikus elutsevate probiootikumide elutegevuse käigus.
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti genoomis tuvastati antioksüdatiivse toimega ensüümide ning transkriptsioonifaktorite geenijärjestused, nende seas NADH peroksidaas (EC
1.11.1.1), vesinikperoksiidi stressi regulaator (PerP), tioredoksiin (Trx), tioredoksiini reduktaas (EC 1.8.1.9), glutatiooni reduktaas (EC 1.8.1.7), tiooli peroksidaas (EC 1.11.1.15), metioniinsulfoksüdi reduktaasid A ja B (EC 1.8.4.11 jaEC 1.8.4.12), koensüüm A disulfiidi reduktaas (EC 1,8.1.1), mangaani kataiaas (EC 1.11.1.6) jms.
Tuvastatud antioksüdatiivsete ensüümide mõju hindamiseks viidi läbi in vitro katsed võrdluses teiste loomset päritolu pediokokkidega BioCC kultuurikollektsioonist (tabel 6).
Selleks kasvatati Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti tüve MRS-puljongis 24 tundi ja tsentrifuugid 5 minutit 10000 x G 4 °C juures, eemaldati supernatant ning suspendeeriti 1 ml MQ-vees. Suspensiooni tiheduseks oli OD6001,1 juures 109 bakterirakku milliliitris. Lüsaatide saamiseks lisati suspensioonile SDS-i (CAS# 151-21-3) sisaldavat lüüsimispuhvrit (Qiagen, Holland) ning bakterirakud purustati mehaaniliselt toatemperatuuril 15 minuti jooksul.
TAA (ingl Total antioxidant activity) määramine viidi läbi kommertsiaalse kitiga (Cayman Chemicals, USA). Meetod põhineb ABTSi (CAS# 28752-68-3) oksüdeerimisel methmüoglobiinide poolt ning seda inhibeerivate antioksüdantide kvantifitseerimisel proovis. Proovide ning standardite neelduvus mõõdeti Synergy HTX spektrofotomeetriga (BioTek, USA) lainepikkusel 750 nm.
Oksüdeeritud (GSSG) ja redutseeritud (GSH) glutatiooni määramine viidi läbi kolorimeetrilise kitiga (Invitrogen, USA). Valkude eemaldamiseks lüsaadist töödeldi proove 5% bensoehappega (CAS# 97-05-2). Oksüdeeritud glutatiooni kvantifitseerimiseks blokeeriti vaba glutatioon ja teised tioolid 2-vinüülpüridiiniga (CAS# 100-69-6). Proovide ja standardite neelduvus mõõdeti Synergy HTX spektrofotomeetriga lainepikkusel 405 nm.
Vesinikperoksiidi määramine viidi läbi kolorimeetrilise kitiga (Thermo Scientific, USA). Meetod põhineb Mohri soola (CAS# 24389-93-3) oksüdeerimisel vesinikperoksiidi poolt sorbitooli (CAS# 50-70-4) vahendusel. Oksüdeerunud Mohri soolad seonduvad proovis sisalduva ksülenooliga (CAS# 1611-35-4). Proovide ja standardite neelduvus mõõdeti Synergy HTX spektrofotomeetriga lainepikkusel 595 nm.
Tulemustest avaldub madal vesinikperoksiidi sisaldus Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti tüve proovides nii elusrakkude ning rakuvabas keskkonnas (tabel 6). H2O2 on prekursoriks aktiivsete radikaalide tekkel organismis, difundeerudes läbi raku struktuuride, olles happelises keskonnas tugev oksüdeerija.
Rakuvabas keskkonnas määratud redutseeritud glutatiooni tase oli suurim Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest tüve puhul, olles üks oluliseim hapniku reaktiivsete vormide
püüdja. Glutatiooni redoksaktiivsus, autooksüdatsiooni inhibeeriv aktiivsus ning võime säilitatada redutseeritud vormi on tähtsaim redokspuhver rakkudes. Muutused glutatiooni vormide vahel mõjutavad otseselt raku antioksüdatiivset aktiivsust (Smirnova ja Oktyabrsky, 2005. Glutathione in Bacteria. Biokhimiya 70:1199-211). Seejuures on GSSG/GSH suhe -oksüdatiivse stressi indikaator rakus-madalaim Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti tüve puhul, võrreldes teiste loomset päritolu pediokokkidega BioCC kultuurikollektsioonist.
Lisaks sellele on määratud totaalne antioksüdatiivne aktiivsus kõrgeim Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest rakulüsaadis (tabel 6)
Tabel 6. TAK 589 Coccobest antioksüdatiivsus võrreldes pediokokkidega
a TAA — totaalne antioksüdatiivne aktiivsus
b GSH--redutseeritud glutatioon
c GSSGoksüüdeeritud glutatioon
d GSSG/GSH-glutatiooni redokssuhe
Bioloogilise aktiivsuse säilimine
Vasikate täispiimaasendaja (TPA-pulbrist) piimajoogi valmistamisel lahustatakse see veega temperatuuril 40-50 °C, mistõttu on oluline probiootilise tüve võime säilitada bioloogiline aktiivsus kõrgematel temperatuuridel.
Selle demonstreerimiseks viidi läbi katse lüofiliseeritud Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti kultuuriga lahustatuna petilahuses, mida kuumutati vastavalt 20 minuti vältel kuni 85 °C juures. Peale kuumutamist teostati koheselt väljaküivid MRS-agarile ning inkubeeriti neid 48 tunni vältel 37 °C juures, seejärel mikroobipesad loendati. Katse käigus selgus, et Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti arvukus 10-20 minutit 60 °C juures kuumutades ei muutu ning 70 °C juures langeb ühe logaritmi võrra (joonis fig 1).
Lisaks toidu töötlemisel kasutatavale temperatuurile on probiootilise piimhappebakteri tüve säilitamise seisukohalt vajalik bioloogilise aktiivsuse tagamine pikema ajaperioodi jooksul eri temperatuuridel. Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti kultuuri säilivuskatsel kasutatud lüofiliseeritud pulbri kujul 36 kuu vältel (tabel 7)
Tabel 7. TAK 589 Coccobest bioloogilise aktiivsuse säilivuse katsea
a ISO 15214:1998 standardi järgi (modifikatsioonidega)
Lisaks testiti Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti tüve bioloogilist aktiivsust mao happelises keskkonnas ning kokkupuutel sapphappega. Selleks kasvatati tüve MRS-puljongis mikroaeroobses keskkonnas (10/5/85 CO2/O2/N2) 24 tundi 37 °C juures. Seejuures valmistati sapphappe ja maomahla resistentsuse määramiseks veel kolm MRS-puljongit: esimesele lisati 3 g/L sapiekstrakti (Sigma, USA), teisele 1M HCl-lahust kuni keskkonna pH-väärtuseni 3 ning kolmandale 3 g/L pepsiini (EC 3.4.23.1; Sigma, USA) ning IM HCL lahust kuni keskkonna pH-väärtuseni 2. Modifitseeritud MRS-puljongitele lisati ettekasvatatud bakterikultuuri ning inkubeeriti neid 37 °C juures mikroaeroobses keskkonnas.
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti tüve ellujäävust demonstreeriti iga tunni järel väljakülvi tehes (tabel 8).
Tabel 8.TAK 589 Coccobest sapphappe ja happelise keskkonna resistentsuse katse
Soolestiku kolonisatsiooni võime
Pediococcus acidüactici TAK 589 Coccobesti võimekust läbida seedetrakti demonstreeriti 32 Eesti holsteini tõugu lehmvasikaga läbiviidud katse (Näide 3) osana. Vastsündinud vasikad jaotati katse- ja kontrollrühmadesse ning toideti 4-16. elupäevani kuue liitri kohaliku farmi piima ja täispiimaasendajast valmistatud piimajoogiseguga. Katserühma vasikatele antud TPA-piimajoogile lisati probiootilist bakteritüve Pediococcus acidüactici TAK 589 Coccobest. Seejuures koguti esimese ja teise elunädala lõpus vasikatelt kinnastatud käega otse pärasoolest steriilsesse topsi roojaproov, mida säilitati temperatuuril -20 °C ning hiljem -80 °C.
Vasikatelt kogutud roojaproovidest määrati Pediococcus acidüactici TAK 589 Coccobesti olemasolu qPCR meetodil, kasutades tüvespetsiifilisi praimereid ja geeniproovi (probe). Roojaproovidest DNA eraldamine viidi läbi QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Saksamaa) protokolli järgi. DNA kontsentratsiooni kontrolliti Synergy HTX spektrofoto-meetriga (BioTek, USA). Pediococcus acidüactici TAK 589 Coccobesti tüve määramiseks valmistati iga vasika DNA-proovist alikvoot kontsentratsiooniga 10 ng/ul ning lõppruumalaga 35 pl. DNA amplifitseerimiseks disainiti tüvespetsiifilised praimerid ja TaqMan diagnostiline geeniproov bakteri elutegevuseks hädavajaliku geeni-biotiini biosünteesi ahelasse kuuluv transportervalk BioY (WP_002832434.1) - järjestuse piirkonda, mis on Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest tüvespetsiifiline (tabel 9).
Tabel 9.Tüvespetsiifiliste praimerite ja TaqMan geeniproovi molekulaarsed tunnused
Oligonukleotiidid on disainitud tarkvaraga PrimerQuest Tool (Integrated DNA Technologies, USA) a Nukleiinhappe dupleksi stabiilsust peegeldav sulamistemperatuur
b Sisemiste komplementaarsete lõikude paardumine iseendaga
c Sisemiste komplementaarsete lõikude paardumine dimeerideks
qPCR reaktsiooniks kulunud 2 μl DNA alikvooti (~ 20 ng) kuivatati Dry-down meetodil ehk mikroplaadile pipeteeritud DNA kuivas üleöö steriilsetes tingimustes. Seejärel lisati 20 μl eelnevalt valmis segatud reaktsioonisegu iga proovi kohta. Plaadile kanti kaks nullproovi, kontrollimaks analüüsi puhtust ja võimalikku valepositiivsust. Reaktsioonisegu ühes proovis sisaldas järgmisi komponente:
4 μl PrimeTime® Mini qPCR Assay (Integrated DNA Technologies, USA)
4 μl 5x HOT FIREPol® Probe qPCR Mix (Solis BioDyne, Eesti)
12 μl MQ deioniseeritud H2O
qPCR reaktsiooni läbiviimiseks kasutati reaalaja termotsiiklerit QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, USA). PCR plaadi lugemiseks ja tulemuste analüüsimiseks kasutati tarkvara QuantStudio Design and Analysis Software (Thermo Fisher Scientific, USA). qPCR-reaktsiooni tingimused olid järgmised:
Vasikatelt kogutud roojaproovidest Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti määramine toimus TaqMan tüvespetsiifilise geeniproovi poolt tekitatava fluorestsentskiirguse abil. PCR-i käigus seonduvad praimerid ja geeniproovid tüvespetsiifiliselt, paardudes või mittepaardudes kindla järjestusega. Geeniproov on seotud 5’ otsast fluorofooriga ning 3’ otsast kustutava fluorofooriga (ingl quencher).Quencher on aktiivne vaid seni, kuni asub fluorofoori läheduses. Uue DNA-ahela sünteesimisel vabaneb geeniproovi 5’ otsast fluorofoor. Iga uue tsükliga vabaneb fluorofoori proportsionaalselt amplikonide arvuga. Tulemuseks on üha tugevam fluorestsentskiirgus, mille abil on võimalik määrata tüvespetsfifiliste amplikonide hulka reaktsioonisegus. Lävitsükkel fikseeritakse fluorestsentskiirguse läviväärtuse ületamisel. Diagnostilise geeniproovi spetsiifilisust Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti tüve suhtes hinnati genoomset DNA-d ning reaktsioonisegu sisaldavas kontrollproovis.
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti tüve olemasolu määrati katserühma vasikate roojaproovides I ja II elunädalal vastavalt üheksas proovis 10-st ning seitsmes proovis 11-st (tabel 10). Kontrollrühma vasikate roojaproovides määrati tüve olemasolu ühes proovis I ja II elunädalal vastavalt 13 ning 7 proovist. Seega saab väita, et Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest on võimeline edukalt koloniseerima vasikate soolestiku.
Tabel 10. Tüvespetsiifilise praimeriga qPCR-reaktsiooni tulemused
a Lävitsükkel, millal reaktsiooni fluorestseeruv signaal ületab läviväärtuse
b Amplifitseeritud/kõikide proovide arv valimis
c, d Tulemuste aritmeetiline keskmine ja mediaan
JOONISTE LOETELU
Joonis fig 1. Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti elulemus log10 süsteemis peti lahuses kõrgetel temperatuuridel inkubeerides 10 minuti ja 20 minuti vältel.
Joonis fig 2. Pidurdus anaeroobses keskkonnas. Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti antimikroobne aktiivsus patogeenidele võrreldes soolestikust isoleeritud Pediococcus spp. kontrolltüvedega.
Modifitseeritud MRS-agarsöötmel joonkülvi meetodil anaeroobses (5/90/5 CO2/O2/N2) keskkonnas peale 24 tundi inkubeerimist (sihtmikroobi kasvupidurdus mm).
Joonis fig 3. Pidurdus mikroaeroobses keskkonnas. Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti antimikroobne aktiivsus patogeenidele, võrreldes soolestikust isoleeritud Pediococcus spp. kontrolltüvedega.
Modifitseeritud MRS-agarsöötmel joonkülvi meetodil mikroaeroobses (10% CO2) keskkonnas peale 24 tundi inkubeerimist (sihtmikroobi kasvupidurdus mm).
LEIUTISE TEOSTAMISE NÄITED
Näide 1. Antagonistlik toime patogeensetele mikroorganismidele
Eesmärk: Testida Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti antagonistlike omadusi enamlevinud patogeensete mikroorganismide vastu.
Metoodika: Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti antagonistlike omaduste hindamiseks patogeenide vastu kasutati joonkülvitehnikat, mille käigus mõõdeti TAK 589 Coccobesti ja Pediococcus spp. kontrolltüvede põhjustatud patogeeni kasvuinhibitsiooni tsooni millimeetrites (Hütt et al.2006. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens. J Appl Microbiol.100: 1324-32).
Pediococcus spp. tüvede antagonistliku aktiivsuse avaldumist erinevates keskkondades hinnati kaheksa patogeeni tüve vastu: Listeria monocytogenes ATCC 51774; Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella enteritidis ATCC 13076; Salmonella enterica serovar Typhimurium; Shigella sonnei ATCC 25931; Staphylococcus aureus ATCC 25923 ja Enterococcus faecalis ATCC 29212.
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti kasvatati eelnevalt termostaadis IG 150 (Jouan, Prantsusmaa) 24 tundi MRS-söötmes (Oxoid, U.K) mikroaeroobses (10% CO2) keskkonnas 37 °C juures. Patogeenseid tüvesid kasvatati 24 tundi veriagaril aeroobses keskkonnas 37 °C juures. Antimikroobsete omaduste hindamiseks külvati 20 pl 24 tunni vanust viite erinevat pediokokikultuuri modifitseeritud MRS agarsöötme (ei sisalda triammooniumtsitraati C6H17O7N3 ning naatriumatsetaati C2H9O5Na) keskjoonele ning kasvatati 24 tundi paralleelselt mikro- ja anaeroobses (5/90/5 CO2/O2/N2) keskkonnas 37 °C juures. Testitavad patogeenide tüved külvati kahe vastassuunalise ristipidise külvina ning inkubeeriti 24 tundi mikro- või anaeroobses keskkonnas 37 °C juures. Patogeenide inhibitsiooni määramiseks mõõdeti kasvuvaba tsoon. Võrdlusena kasutati BioCC kultuurikollektsiooni kuuluvaid soolestikust isoleeritud Pediococcus spp. kontrolltüvesid.
Tulemused: Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest inhibeeris kõige tugevamini patogeenide kasvu mikro- ja anaeroobses keskkonnas, teiste tüvede toime jäi keskpäraseks või nõrgaks (Joonis fig 2; fig 3).
Näide 2. Manustamise mõju vasikatele (katse 1)
Eesmärk: Uurida Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti mõju vasikate soolestiku mikrobiootale ning kõhulahtisuste esinemisele.
Metoodika: Katse viidi läbi 8 Eesti holsteini tõugu pullvasikaga. Vastsündinud vasikad jaotati katse- ja kontrollrühma (mõlemas rühmas n=4). Katserühma vasikatele manustati lüofiliseeritud pulbrist valmistatud vesilahusena Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti päevase doosina lxlOi0 PMÜ vasikate 1.-5. elupäevani. Seejuures koguti vasikatelt
roojaproovid 2.-5. elupäevadel ning täiendavalt veel 8. elupäeval järelmõju hindamiseks. Roojaproovid koguti kinnastatud käega otse pärasoolest steriilsesse topsi, mida säilitati temperatuuril -20 °C ning hiljem -80 °C. Proovidest määrati laktobatsillide üldhulk, E.coli ja coli-laadsete mikroobide arvukus. Lisaks hinnati kõhulahtisuste esinemist ning tervise üldnäitajaid vastavalt tervise hindamise kriteeriumitele (University of Wisconsin-Madison, School of Veterinary Medicine, Calf Health Scoring Chart and Calf Health Scoring Criteria).
Tulemused: Kontrollgrupis esines kõhulahtisusega proove seitsmel korral 16-st (44%) ja katsegrupis kolmel korral 16-st (19%). Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti manustamine vähendas E. coli arvukust katserühma roojaproovides viiendaks elupäevaks 1,6 logaritmi võrra ning kaheksandaks päevaks 2,5 logaritmi võrra. Coli-laadsete mikroobide arvukus vähenes katserühma roojaproovides viiendaks päevaks 0,3 logaritmi võrra ning kaheksandaks 0,8 logaritmi võrra. Samas ei vähenenud katserühma roojaproovides laktobatsillide arvukus.
Näide 3. Manustamise mõju vasikatele (katse 2)
Eesmärk: Uurida Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest mõju vasikate soolestiku enterobakteriaalsele mikrobiootale ning kõhulahtisuste esinemisele.
Metoodika: Katse viidi läbi 32 Eesti holsteini tõugu lehmvasikaga. Vastsündinud vasikad jaotati katse- ja kontrollrühmadesse (mõlemas rühmas n=16) ning joodeti esimesel kolmel elupäeval ternespiimaga. Peale kolmandat elupäeva kuni 16. elupäevani joodeti vasikaid kohaliku farmi piima ja täispiimaasendajast valmistatud piimajoogiseguga, mida valmistati TPA-puibrist (20% rasv, 22% valk, 47,6% laktoos ja 16,4% kaseiin) arvestusega 140 g 890 ml sooja vee (40 °C) kohta. Alates 17. elupäevast joodeti vasikaid ainult TPA piimajoogiga. Katserühma vasikate TPA-piimajoogile lisati alates kolmandast elupäevast Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest (1,2-3,2 x 107 PMÜ/ml).
4.-10. elupäevani joodeti vasikatele 6 liitrit TPA-piimajooki päevas ning edaspidi kuni võõrutamiseni (-70. elupäeval) 8 liitrit päevast. Katse käigus registreeriti veterinaari poolt igapäevaselt vasikate rooja konsistents vastavalt rooja hindamise kriteeriumile (University of Wisconsin-Madison, School of Veterinary Medicine, Calf Health Scoring Chart and Calf Health Scoring Criteria). Katse- ja kontollrühma vahel puudus erinevus vasikate sünnimasside ning lg sisalduse vahel (tabel 11). Seejuures koguti vasikatelt roojaproovid 2., 7., 18. ning 30. elupäevadel kinnastatud käega otse pärasoolest steriilsesse topsi, mida säilitati temperatuuril 20 °C ning hiljem -80 °C. Proovidest määrati E. coli, coli-laasete mikroobide ja enterobakterite üldarv vastavalt ISO standarditele.
Tabel 11. Katse- ja kontrollrühma vasikate sünnijärgsed tervisenäitajad
Tulemused: Ajavahemikus 15.-56. elupäev esines kõhulahtisus vaid ühel katserühma vasikal 16-st (6,3%) ning seitsmel kontrollrühma vasikal 16-st (43,8%). Seejuures suri kontrollrühmas kaks vasikat
Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti manustamine vähendas E. coli arvukust katserühma roojaproovides 30. elupäevaks ühe logaritmi võrra. Coli-laadsete mikroobide ning enterobakterite arvukus vähenes katserühma roojaproovides 30. elupäevaks vastavalt 1,1 ja 1,3 logaritmi võrra.
Seejuures E. coli arvukus kontrollrühma roojaproovides suurenes 30. elupäevaks 0,5 logaritmi võrra. Coli-laadsete mikroobide ning enterobakterite arvukus kontrollühma roojaproovides suurenesid 30. elupäevaks 0,4 logaritmi võrra.
Näide 4. Köögivilja hapendamine tüvega TAK 589 Coccobest (katse 1)
Eesmärk: Testida Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti sobivust köögivilja, nt sügisese valge peakapsa Brassica oleracea var. capitata f. alba hapendamisel.
Metoodika: kapsas riiviti köögikombainiga peenteks ribadeks, lisati keedusool (1,7%) ning segati hoolikalt. Seejärel segati kapsale juurde 24 tunni vanust Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti tüvekultuuri lõpptihedusega 107 PMÜ/g. Kapsaid hapendati 9 päeva 18 °C juures. Kontrolliks valiti spontaanselt käärinud kapsas. Fermenteerimise 2., 5. ja 9. päeval mõõdeti kapsamahlade pH-d.
Tulemused: Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest lisamine aitas kapsa käärimist kiirendada. Ribastatud kapsamassi algne pH oli 5,60. Võrreldes spontaanse käärimisega langes ribastatud kapsamassi pH kiiremini (Tabel 12). pH kiire langus aitab maha suruda kapsa
soovimatut indigeenset mikrofloorat, sh lima tekitavaid piimhappebaktereid (n. Leuconostoc mesenteroides).
Tabel 12. Ribastatud kapsamassi pH langus käärimisaja jooksul
Mõlema proovi puhul oli fermenteeritud kapsas defektideta välimusega, maitselt hapukas ning krõmpsuva tekstuuriga. Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest sobib kasutamiseks fermenteerimisel tehnoloogilise juuretisena kapsa hapendamise suunamiseks.
Näide 5. Köögivilja hapendamine tüvega TAK 589 Coccobest (katse 2)
Eesmärk: Testida Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti sobivust köögivilja, nt avamaakurkide Cucumis sativus L. hapendamisel.
Metoodika: Eesti avamaakurkide hapendamiseks vamistati lahus, mis sisaldas 1 supilusikatäir keedusoola ja 1 supilusikatäit suhkrut 1 L vee kohta.24 tunni vanust Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti kultuuri lisati lahusele lõpptihedusega 107 PMÜ/g. Kurke (4-5 kurki, vedelikku 400 ml) hapendati 30 kraadi juures 24 tunni jooksul. Käärimise lõpus mõõdeti pH-d ja seejärel jahutati kurgid temperatuurini 4 °C.
Tulemused: Käärimise lõpus oli spontaanselt käärinud kurkide pH 4,34. Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti abil kääritatud kurkide pH oli 3,85.
Nii kontrollkurgid kui Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti abil hapendatud kurgid olid defektideta välimusega. Maitselt hapukad. Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobesti abil hapendatud kurkidel puudus spontaanselt käärinud kurkide kibe järelmaitse. Seega sobib Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest kasutamiseks tehnoloogilise juuretisena hapendamise suunamiseks kurkide hapendamisel.

Claims (8)

  1. 1. Isoleeritud probiootiline mikroorganism Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest DSM 32372.
  2. 2. Mikroorganism vastavalt punktile 1 lüofiliseeritud kujul.
  3. 3. Kompositsioon, mis sisaldab punktile 1 või 2 vastavat mikroorganismi.
  4. 4. Mistahes punktile 1-2 vastava mikroorganismi kasutamine probiootilise toidu- ja joogilisandina,
  5. 5. Mistahes punktile 1-2 vastava mikroorganismi kasutamine zootehnilise söödalisandina põllumajandus- ja lemmikloomade seedekulgla bakteriaalsetesse infektsioonidesse nakatumise vältimiseks ning kõhulahtisuse ennetamiseks ja/või vähendamiseks.
  6. 6. Mistahes punktile 1-2 vastava mikroorganismi kasutamine funktsionaalse toidu või joogi lisandina inimeste seedekulgla bakteriaalsetesse infektsioonidesse nakatumise vältimiseks ning oksüdatiivse stressi ennetamiseks ja/või vähendamiseks.
  7. 7. Mistahes punktile 1-2 vastava mikroorganismi kasutamine vastavalt punktile 5 või 6, kus bakteriaalseid infektsioone põhjustavateks mikroobideks on Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis ja Cronobacter sakazakii.
  8. 8. Mistahes punktile 1-2 vastava mikroorganismi kasutamine tehnoloogilise juuretisena köögivilja fermenteerimisel.
EEP202000014A 2020-09-18 2020-09-18 Mikroorganismi tüvi Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest kui antimikroobne ja antioksüdatiivne probiootikum EE05844B1 (et)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EEP202000014A EE05844B1 (et) 2020-09-18 2020-09-18 Mikroorganismi tüvi Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest kui antimikroobne ja antioksüdatiivne probiootikum
CN202180077725.9A CN116583193A (zh) 2020-09-18 2021-09-17 作为抗菌剂和抗氧化剂益生菌的微生物菌株乳酸片球菌tak 589 coccobest
US18/026,904 US12491219B2 (en) 2020-09-18 2021-09-17 Microorganism strain Pediococcus acidilactici tak 589 coccobest as an antimicrobial and antioxidant probiotic
PCT/IB2021/000739 WO2022058798A2 (en) 2020-09-18 2021-09-17 Microorganism strain pediococcus acidilactici tak 589 coccobest as an antimicrobial and antioxidant probiotic
EP21834863.9A EP4213642B1 (en) 2020-09-18 2021-09-17 Microorganism strain pediococcus acidilactici tak 589 coccobest as an antimicrobial and antioxidant probiotic
JP2023518073A JP7761638B2 (ja) 2020-09-18 2021-09-17 抗菌剤および抗酸化剤プロバイオティクスとしての微生物株ペディオコッカス アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）ｔａｋ ５８９ ｃｏｃｃｏｂｅｓｔ

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EEP202000014A EE05844B1 (et) 2020-09-18 2020-09-18 Mikroorganismi tüvi Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest kui antimikroobne ja antioksüdatiivne probiootikum

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EE202000014A EE202000014A (et) 2022-04-18
EE05844B1 true EE05844B1 (et) 2022-06-15

Family

ID=80776668

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EEP202000014A EE05844B1 (et) 2020-09-18 2020-09-18 Mikroorganismi tüvi Pediococcus acidilactici TAK 589 Coccobest kui antimikroobne ja antioksüdatiivne probiootikum

Country Status (6)

Country Link
US (1) US12491219B2 (et)
EP (1) EP4213642B1 (et)
JP (1) JP7761638B2 (et)
CN (1) CN116583193A (et)
EE (1) EE05844B1 (et)
WO (1) WO2022058798A2 (et)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114437967B (zh) * 2022-01-06 2023-07-18 中国农业科学院农产品加工研究所 乳酸片球菌AUd2101及在制备治疗犬腹泻制剂中的应用
JP7121867B1 (ja) 2022-03-28 2022-08-18 エバラ食品工業株式会社 乳酸菌
CN116875513B (zh) * 2023-08-18 2024-01-23 山东宝来利来生物工程股份有限公司 一株乳酸片球菌及其在调控脂质代谢和保护肝脏中的应用
CN116948920A (zh) * 2023-09-18 2023-10-27 小宠爱(北京)科技有限公司 一株修复抗生素相关性腹泻导致的肠道菌群紊乱的乳酸片球菌及其应用
KR102733203B1 (ko) * 2024-09-09 2024-11-22 서울대학교산학협력단 항암 활성, 항산화 활성 및 항염 활성 가지는 페디오코커스 애시디락티시 균주 및 이의 용도

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009030040A1 (en) * 2007-09-05 2009-03-12 Institut National De La Recherche Scientifique Antimicrobial activity of bacteriocin-producing lactic acid bacteria
CN107034163A (zh) * 2017-05-23 2017-08-11 北京市农林科学院 一种新型乳酸片球菌及其应用
KR102001990B1 (ko) * 2018-06-20 2019-07-19 재단법인 발효미생물산업진흥원 면역 활성, 항바이러스 활성 및 프로바이오틱스 특성을 갖는 페디오코커스 애시디락티시 srcm102615 균주 및 이의 용도

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104388345B (zh) * 2014-11-05 2017-09-29 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 一株乳酸片球菌菌株及其用途
KR20170087258A (ko) * 2016-01-20 2017-07-28 서울여자대학교 산학협력단 오메기술에서 선별 분리한 유산균 균주 및 이를 이용한 프로바이오틱스
KR102353894B1 (ko) 2017-04-19 2022-01-21 삼성디스플레이 주식회사 유기발광 표시장치
CN107227279B (zh) * 2017-07-18 2019-09-03 江南大学 一株乳酸片球菌及其应用
JP7102170B2 (ja) 2018-02-28 2022-07-19 キヤノン株式会社 画像処理装置、および画像処理装置の制御方法とプログラム
KR102036275B1 (ko) * 2018-10-02 2019-10-24 서울대학교 산학협력단 항-염증 활성이 우수한 페디오코커스 악시딜락티시 ldtm 5201 신균주(kctc 13563bp)
CN111109359B (zh) * 2019-12-29 2022-09-02 江南大学 多功能乳酸片球菌ccfm1105、其发酵食品及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009030040A1 (en) * 2007-09-05 2009-03-12 Institut National De La Recherche Scientifique Antimicrobial activity of bacteriocin-producing lactic acid bacteria
CN107034163A (zh) * 2017-05-23 2017-08-11 北京市农林科学院 一种新型乳酸片球菌及其应用
KR102001990B1 (ko) * 2018-06-20 2019-07-19 재단법인 발효미생물산업진흥원 면역 활성, 항바이러스 활성 및 프로바이오틱스 특성을 갖는 페디오코커스 애시디락티시 srcm102615 균주 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
EP4213642C0 (en) 2024-12-11
WO2022058798A2 (en) 2022-03-24
US20230330161A1 (en) 2023-10-19
CN116583193A (zh) 2023-08-11
EP4213642B1 (en) 2024-12-11
EP4213642A2 (en) 2023-07-26
US12491219B2 (en) 2025-12-09
JP2023542335A (ja) 2023-10-06
JP7761638B2 (ja) 2025-10-28
WO2022058798A3 (en) 2022-04-28
EE202000014A (et) 2022-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7761638B2 (ja) 抗菌剤および抗酸化剤プロバイオティクスとしての微生物株ペディオコッカス アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）ｔａｋ ５８９ ｃｏｃｃｏｂｅｓｔ
Alonso et al. Isolation and partial characterization of lactic acid bacteria from the gut microbiota of marine fishes for potential application as probiotics in aquaculture
Mohammadian et al. Administrations of autochthonous probiotics altered juvenile rainbow trout Oncorhynchus mykiss health status, growth performance and resistance to Lactococcus garvieae, an experimental infection
Missotten et al. Fermented liquid feed for pigs: an ancient technique for the future
Diez-Gonzalez Applications of bacteriocins in livestock
Bucio et al. Presence of lactobacilli in the intestinal content of freshwater fish from a river and from a farm with a recirculation system
EP1874917B1 (en) Probiotic composition suitable for animals
EP2753687B1 (en) Strains of lactic acid bacteria and/or bifidobacteria inhibiting/reducing the growth of different biotypes of e. coli and different biotypes of clostridia
EP3209307B1 (en) Probiotic and prebiotic compositions
Marchwińska et al. Isolation and probiotic potential of lactic acid bacteria from swine feces for feed additive composition
Huang et al. Metabolic properties, functional characteristics, and practical application of Streptococcus thermophilus
WO2016120405A1 (en) Composition for use in preventing and/or treating diarrhea in animals
Phianphak et al. Probiotic use of Lactobacillus spp. for black tiger shrimp, Penaeus monodon
Galindo Lactobacillus plantarum 44A as a live feed supplement for freshwater fish
KR20160039097A (ko) 페디오코커스 펜토사세우스 ｗｉｋｉｍ20 및 이를 포함하는 조성물
Ali " Probiotics feed supplement" to improve quality of broiler chicken carcasses.
Krungleviciute et al. Applicability of Pediococcus strains for fermentation of cereal bran and its influence on the milk yield of dairy cattle.
US10166262B2 (en) Strain of bacteria and composition comprising the same
JPH05146260A (ja) 鳥類飼料添加用腸内有害細菌抑制剤
KR20160007964A (ko) 락토바실러스플란타룸 ｗｉｋｉｍ１８ 및 이를 포함하는 조성물
EP3168292A1 (en) New lactobacillus plantarum strain amt14 and composition containing the strain of lactobacillus plantarum amt14
Bhaheerathan et al. Growth and survival promotion of a probiotic bacterium Enterococcus durans enriched Artemia nauplii on the prawn Macrobrachium rosenbergii
KR20200015173A (ko) 뱀장어 사료내 항생제 대체를 위한 신바이오틱스 개발
Alysha et al. Isolation and characterisation of probiotic lactic acid bacteria from Malaysian fermented shrimp product pekasam senek
Akther et al. Optimizing the fermentation condition of low salted squid jeotgal by lactic acid bacteria with enhanced antioxidant activity