CN107034163A - 一种新型乳酸片球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)新菌株ZPA017，其保藏号为CGMCC No.9040，其具有耐酸、耐胆盐、黏附性强、抑菌性好的特点。本发明还公开了含有乳酸片球菌ZPA017的制剂。该制剂作为饲料添加剂饲喂断奶仔猪，能够抑制有害菌繁殖，调节肠道微生态平衡，具有增强机体免疫力、提高生产性能的作用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种新型乳酸片球菌及其应用。
背景技术
断奶仔猪由于消化系统和生理机能尚未发育完全，容易受断奶、饲料营养和饲养管理等应激因素的影响发生肠道菌群紊乱，引起仔猪腹泻，进而导致采食量下降、生长受阻，严重时甚至死亡，给养猪生产带来极大的损失。
乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)是片球菌属中的一种乳酸菌，常用于肉品、乳品、蔬菜和青贮饲料的发酵等，其优势主要是：生长迅速，能够产生大量乳酸等有机酸，快速降低pH值；产生有机酸及抑菌物质，能够抑制腐败菌和致病菌的生长繁殖，提高发酵产品的安全性；提升发酵产品的风味。乳酸片球菌应用于青贮饲料，还可降解纤维素并转化为乳酸，提高饲料的利用率和适口性。
目前，有关乳酸片球菌在饲料中应用申请的专利有：“一种乳酸片球菌CCFM7902及其用途”(授权公告号CN 102559563 B)，该菌对单核细胞增生李斯特菌生长具有抑制作用，可用于制备生产青贮饲料、发酵香肠等食品；“一株高抑菌活性的乳酸片球菌及应用”(授权公告号CN 103173373 B)，该菌对大肠杆菌、沙门氏菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用；“一株乳酸片球菌新菌株及其用途”(申请号201410619374.)，该菌具有吸附新城疫病毒、抗病原沙门菌、抗病原大肠杆菌及抗金黄色葡萄球菌感染的特性，可用作益生菌株用于食品、饲料和药物的添加剂。以上专利没有涉及猪源乳酸片球菌对上皮细胞的黏附性，也没有涉及动物试验等验证效果等方面的内容。
发明内容
本发明的一个目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的乳酸片球菌，该乳酸片球菌耐酸、耐胆盐、黏附性强，对猪常见致病菌具有一定的抑制作用。
本发明的另一个目的在于提供由该乳酸片球菌制备得到的乳酸片球菌制剂及其制备方法。
本发明的又一个目的在于提供所述乳酸片球菌制剂在猪饲料中的应用。
为实现本发明第一个目的提供一种乳酸片球菌，从健康仔猪中筛选出一株性能优良的乳酸片球菌菌株，将该乳酸菌菌株于2014年04月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)进行保藏，菌株名称为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZPA017，保藏编号为：CGMCC No.9040。
所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZPA017(CGMCC No.9040)为革兰氏阳性球菌，无芽孢。在MRS平板培养基上菌落为乳白色，表面湿润，光滑，液滴状，圆形，凸起，不透明，边缘整齐。
本发明提供的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZPA017(CGMCC No.9040)除具有上述特征之外，还具有耐酸、耐胆盐、黏附性强、抑菌性好等生物学特性：
1)该乳酸片球菌在pH＝2的环境中作用2小时的存活率为98.45％，4小时时的存活率为82.17％，6小时时的存活率为77.91％；在pH＝3的环境中，在2小时时的存活率为100.78％，6小时时的存活率为80.23％。
2)该乳酸片球菌在0.1％和0.2％的胆盐环境中，37℃孵育3小时，乳酸菌片球菌的存活率分别为85.95％和40.98％。
3)该乳酸片球菌对caco-2细胞具有较强的黏附作用。猪源乳酸片球菌与caco-2细胞共同培养2小时，黏附指数为50cfu/cell。
4)该乳酸片球菌对3种猪常见致病菌有较强的抑制作用。本发明的乳酸片球菌对三种猪源大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用，可以有效控制动物疾病的发生。
本发明的第二个目的提供一种乳酸片球菌制剂，采用所述乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZPA017，保藏号为：CGMCC No.9040。
其中，优选地，所述ZPA017的活菌数可为1×1011cfu/g及以上。如上所述的猪源乳酸片球菌制剂，可作为一种饲料添加剂使用。
本发明还提供所述猪源乳酸片球菌制剂的制备方法，其为在液体发酵培养基中发酵乳酸片球菌ZPA017，将所述发酵液进行离心、乳化冻干，制备成的冻干粉为猪源乳酸片球菌制剂。
优选地，所述的制备方法可具体包括如下步骤：
(1)发酵培养：以1％的接种量将所述乳酸片球菌ZPA017接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时，如此活化2代后得到种子培养物；
将种子培养物以5％的接种量接种于装有液体培养基的发酵罐中，设定温度37℃、转速100rpm，维持恒定pH 4.8，当发酵至16小时时开始补料，之后每隔2小时进行一次，共补料5次；
当发酵液pH不再降低时，终止发酵，得到发酵液；
(2)发酵液离心：将上述得到的发酵液在19000rpm离心，得到菌泥；
(3)乳化冻干：将上述得到的菌泥与1/3所述发酵液体积的冻干保护剂混合，高剪切分散乳化机3000r/min乳化30min，分装于冷冻盘中，厚度2cm左右，预冻3小时，设置真空冷冻干燥机冷凝温度-60℃、真空度17Pa，冻干24小时后，即得含乳酸片球菌的冻干制剂。优选地，所述液体培养基由如下浓度的物质组成：葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，乙酸钠5g/L，酵母浸粉2.5g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，MgSO4·7H2O0.58g/L，MnSO4 0.19g/L，吐温-80 1ml/L，pH 6.5；
所述补料液为葡萄糖溶液，浓度为500g/L。
优选地，所述冻干保护剂为含有质量百分比浓度分别为8％的海藻糖、16％的脱脂乳、1.5％的L-半胱氨酸、4％的乳糖、1％的谷氨酸钠、0.5％的L-赖氨酸、5％的糊精和1％的甘油。
本发明还提供了上述制备的乳酸片球菌制剂作为添加剂在饲料中的应用。
优选地，应用于猪饲料中，更优选地，用于断奶仔猪的饲料中。
进一步，所述猪饲料中含乳酸片球菌ZPA017的活菌数为1.2×108cfu/kg。
进一步，所述应用为在基础日粮中添加乳酸片球菌ZPA017制剂，所述乳酸片球菌在每千克全价仔猪料中的活菌数为1.2×108CFU。
本发明还提供了一种冻干保护剂，其含有质量百分比浓度分别为8％的海藻糖、16％的脱脂乳、1.5％的L-半胱氨酸、4％的乳糖、1％的谷氨酸钠、0.5％的L-赖氨酸、5％的糊精和1％的甘油。
本发明的有益效果为：
本发明的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZPA017(CGMCC No.9040)是一株具有耐酸、耐胆盐、黏附性强、抑菌性好的菌种。由该乳酸片球菌制成的冻干制剂添加到断奶仔猪饲料中(活菌终浓度为1.2×108CFU/Kg全价料)，断奶仔猪日增重提高8.27％，料重比降低了3.43％，腹泻率下降了5.45个百分点；粪便中乳酸菌活菌数量升高了87.13％，大肠杆菌数下降了60％，金黄色葡萄球菌数下降了42.82％；断奶仔猪血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量显著降低，总蛋白、球蛋白含量显著升高。由此可见，乳酸片球菌ZPA017作为饲料添加剂饲喂断奶仔猪，能够抑制有害菌繁殖，调节肠道微生态平衡，具有增强机体免疫力、提高生产性能的作用。
附图说明
图1为乳酸片球菌ZPA017的菌落形态。
具体实施方式
乳酸菌益生功能的有效发挥与菌株特性密切相关。乳酸菌有效性的筛选评估主要基于体外和动物实验两个方面：体外评价主要包括对胃酸和胆盐的耐受性、对致病菌的抑制能力、对上皮细胞的黏附能力，动物实验主要评估益生菌对动物的抗感染、免疫调节、肠道菌群等的生理功能。
本发明人经过大量实验，筛选获得的新的乳酸片球菌Pediococcusacidilactici)ZPA017(CGMCC No.9040)为革兰氏阳性球菌，无芽孢。在MRS平板培养基上菌落为乳白色，表面湿润，光滑，液滴状，圆形，凸起，不透明，边缘整齐,还具有耐酸、耐胆盐、黏附性强、抑菌性好等生物学特性。
下面结合实施例详细介绍本发明，应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方案的限制，本发明提供的具体实施例仅作为进一步说明本发明的例子，本领域技术人员参照本案说明书的描述可以很容易对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 乳酸片球菌的分离筛选与鉴定
从健康的北京黑猪断奶仔猪新鲜粪便中，无菌操作，称取适量加于无菌生理盐水中，振荡均匀并作十倍梯度稀释，涂布于MRS培养基平板上，厌氧罐法37℃培养24～48小时。从中挑取乳白色菌落进行初步筛选，凡是革兰氏染色阳性、H2O2酶试验阴性、接触酶阴性的菌株可初步确定为乳酸菌，将初筛得到的菌株进行耐酸耐胆盐、抑菌等试验，最终筛选出一株性能优良的乳酸菌菌株ZPA017，送至中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)进行鉴定，经细胞形态学特征、生理生化鉴定和16S rRNA序列分析表明，该菌鉴定为Pediococcusacidilactici，其鉴定结果见表1和序列表中SEQ ID No.1。乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)ZPA017主要生物学特性为革兰氏阳性球菌，无芽孢。在MRS平板培养基上菌落为乳白色，表面湿润，光滑，液滴状，圆形，凸起，不透明，边缘整齐。ZPA017的菌落特征如图1所示。
表1 乳酸片球菌ZPA017的生理生化特征
注：:“+”，呈阳性；“-”，呈阴性。
将该乳酸菌菌株于2014年04月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)进行保藏，菌株名称为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZPA017，保藏编号为CGMCC No.9040。
其中，MRS固体培养基配方：蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，柠檬酸氢二胺0.2g，葡萄糖2g，KH2P040.2g，乙酸钠0.2g，吐温-80 0.1ml，硫酸镁0.058g，硫酸锰0.02g，琼脂2g，水100m1，pH 6-6.5，121℃高压灭菌15min。
实施例2 乳酸片球菌的特性研究
1、耐酸性能测定
将活化的实施例1获得的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZPA017以1％的接种量分别接入到pH为2、3和4的液体MRS培养基中，分别37℃保温2、4和6小时，以0小时为对照，测定活菌数，计算存活率。试验结果见表2。
表2 乳酸片球菌耐酸性能(％)
由结果可知，此乳酸片球菌在pH＝2的酸性环境中作用2小时，其存活率为98.45％，4小时时的存活率为82.17％，6小时时的存活率为77.91％；在pH＝3的环境中，在2小时时的存活率为100.78％，4小时时的存活率为88.33％，6小时时的存活率为80.23％。以上结果说明此乳酸片球菌具有很强的耐酸性，能够很好的耐受动物的胃酸环境。
2、耐胆盐性能测定
将活化的乳酸片球菌ZPA017以1％接种量分别接入到含有0.1％、0.2％、0.3％猪胆盐的液体MRS培养基中，37℃保温3小时，以0小时为对照，计算存活率，试验结果见表3。
表3 乳酸片球菌耐胆盐性能测定
由结果可知，此乳酸片球菌ZPA017对0.2％胆盐的耐受性较高，保温3小时的存活率仍达到40.98％，但在0.3％的胆盐浓度下存活率急剧下降。
3、黏附试验
将活化的ZPA017发酵液离心(4000rpm，10min)，收集菌体，用无菌PBS缓冲液洗涤3次后重悬，制成浓度为1×108CFU/mL的菌悬液备用。将传代3次的caco-2细胞取适量接到24孔培养板中培养，待细胞达到80％融合时进行黏附试验。将孔中培养液吸出，加入同体积乳酸片球菌ZPA017菌悬液，在二氧化碳培养箱中培养2小时后，涂板测定活菌数，以空白不加菌组计算细胞数为对照。结果显示，乳酸片球菌ZPA017的黏附指数为50CFU/cell。
4、抑菌试验
采用牛津杯法，检测乳酸片球菌ZPA017发酵液对3种常见的猪致病菌的抑菌效果，结果见表4。
表4 乳酸片球菌抑菌试验
由结果可以看出，该乳酸片球菌ZPA017对这3种猪源大肠杆菌、霍乱沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用。
5、药敏试验
对乳酸片球菌ZPA017进行了14类29种抗生素(OXOID药敏纸片)的药敏试验，结果见表5。
表5 乳酸片球菌药敏试验
注：S为敏感；I为中度敏感；R为耐药。
由表5可以看出，该乳酸片球菌对青霉素、美洛西林、阿奇霉素、罗红霉素、氯霉素、阿莫西林、头孢噻吩、头孢氨噻肟、先锋霉素Ⅳ、氯洁霉素、利福平等抗生素敏感，对洁霉素中度敏感，对丁胺卡那、链霉素、庆大霉素、红霉素、吉他霉素、多粘菌素B、杆菌肽、诺氟沙星、氧氟沙星、先锋霉素Ⅵ、头孢克肟、甲氧苄啶、复方新诺明、万古霉素、痢特灵、呋喃唑酮、四环素等抗生素耐药。
6、最佳碳氮源的优化筛选
以MRS培养基为基础，分别选择12种不同的碳源(葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、木糖、核糖、阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、半乳糖、乳糖、蔗糖和纤维二糖)和10种不同的氮源(蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、酪蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸铵、尿素和硝酸钠)代替MRS培养基中的碳源和氮源，并固定其它成分，测定乳酸片球菌ZPA017活菌数以确定最佳碳源和氮源；根据氮源、碳源筛选结果，对碳氮总量和碳氮比进行筛选。试验结果显示：乳酸片球菌ZPA017生长的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为蛋白胨，最佳碳氮总量为3％，最佳碳氮比为1:1，其他成分同MRS培养基。乳酸片球菌ZPA017在优化后的液体培养基中，37℃培养24小时，活菌数为8.8×109cfu/mL，比优化前(2.15×109cfu/mL)提高4倍以上，且生长速度加快。
其优化后的液体培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，乙酸钠5g/L，酵母浸粉2.5g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4 0.19g/L，吐温-80 1ml/L，pH 6.5，121℃灭菌15min备用。
实施例3、乳酸片球菌制剂的制备
1、乳酸片球菌的发酵培养
将实施例1得到的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)ZPA017(保藏号：CGMCC No.9040)以1％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时，如此活化2代后得到种子培养物；将种子培养物以5％的接种量接种于装有30L优化后的液体培养基的50L发酵罐中，设定温度37℃、转速100rpm，维持恒定pH 4.8，当发酵至16小时时开始补料，向发酵罐中一次加入200mL补料液，之后每隔2小时进行一次补料，共补料5次；当发酵液pH不再降低时，终止发酵。
其中，优化后的液体培养基为实施例2中所述。补料液为葡萄糖溶液，浓度为500g/L，115℃灭菌15min备用。
2、发酵液离心
将所述步骤1得到的发酵液在19000rpm条件下以管式离心机分离菌体，得到菌泥；
3、冻干制剂的制备
将菌泥与1/3发酵液体积的冻干保护剂混合，采用高剪切分散乳化机3000r/min乳化30min后进行冻干，即得乳酸片球菌冻干制剂。
其中，冻干条件为将乳化后的菌悬液分装于冷冻盘中，厚度2cm左右，预冻3小时，冷凝温度-60℃、真空度17Pa，冻干时间24小时。冻干保护剂由如下质量百分比浓度的物质组成：海藻糖8％、脱脂乳16％、L-半胱氨酸1.5％、乳糖4％、谷氨酸钠1％、L-赖氨酸0.5％、糊精5％、甘油1％，其余为水。用此配方，乳酸片球菌的冻干保护率可达81.0％。
取制备好的乳酸片球菌冻干制剂，用无菌生理盐水进行梯度稀释后，采用MRS培养基培养测活菌数，测得冻干粉中ZPA017的活菌数为1.01×1011cfu/g。
4、乳酸片球菌冻干制剂贮存稳定性测定
将上述制备的乳酸片球菌冻干制剂用铝箔袋真空包装，-18℃保存1个月、6个月、12个月后，取菌粉用无菌生理盐水进行梯度稀释后，采用MRS培养基培养测活菌数。由结果表6可知，乳酸片球菌冻干制剂低温保存12个月后，活菌存活率仍可达到81.67％。
表6 乳酸片球菌冻干制剂贮存性能测定
实施例4 乳酸片球菌制剂在断奶仔猪生产中的应用效果
1、试验动物与分组
选取初始体重相近(9.26±0.57Kg)的健康断奶仔猪(杜×长×大)120头，随机分成对照组和试验组2组，每组设3个重复，每个重复20头。对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂基础日粮+上述实施例3中制备的乳酸片球菌制剂(其中，每千克全价仔猪料中含乳酸片球菌的活菌数为1.2×108CFU)。试验期间，仔猪自由采食，自由饮水，常规免疫。试验期为30天。
2、基础日粮
基础日粮由玉米、豆粕、膨化大豆、鱼粉、麦麸、磷酸氢钙、石粉、氨基酸、维生素、微量元素等组成，营养水平参照《猪饲养标准》(NY/T 65-2004)和美国NRC(2012)标准配制。基础日粮的营养成分实测值见表7。
表7 基础日粮营养成分实测值(％)
3、试验管理
试验开始和结束时，个体空腹称重；试验期间，每日观察猪群生长情况，记录饲料消耗和仔猪腹泻情况；试验结束后每组采取18份新鲜粪样，测定粪中乳酸菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等的活菌数；从每组随机挑选18头猪进行采血，测定血清中生化指标。数据统计采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析，结果以平均值±标准差表示。
4、结果与分析
4.1乳酸片球菌制剂对断奶仔猪生产性能的影响结果见表8。
表8 乳酸片球菌对断奶仔猪生长性能的影响
注：同肩标注不同代表差异显著，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
由表8可知，与对照组相比，试验组的平均日增重提高了8.27％(P<0.05)，料重比降低了3.43％(P<0.05)，腹泻率下降了5.45个百分点。可见，在断奶仔猪日粮中添加一定剂量的乳酸片球菌，能够促进断奶仔猪的生长速度和饲料效率，降低腹泻率，从而提高养猪效益。
4.2乳酸片球菌制剂对断奶仔猪粪中微生物数量的影响结果见表9。
表9 乳酸片球菌对断奶仔猪粪中微生物数量的影响
注：同肩标注不同代表差异显著，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
由表9可知，添加乳酸片球菌后，与对照组相比，试验组的猪粪中乳酸菌数升高了87.13％(P<0.05)，大肠杆菌数下降了60％(P<0.05)，金黄色葡萄球菌数下降了42.82％(P<0.05)，由此可见，乳酸片球菌能够增加断奶仔猪肠道中的有益菌含量，降低有害菌含量，从而维持猪肠道微生态环境的平衡。
4.3乳酸片球菌制剂对断奶仔猪血清生化指标的影响结果见表10。
表10 乳酸片球菌对断奶仔猪血清生化指标的影响
注：同肩标注不同代表差异显著，小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
由表10可知，日粮中添加乳酸片球菌能够降低断奶仔猪血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量，提高总蛋白、球蛋白含量，差异显著(P<0.05)。谷丙转氨酶和谷草转氨酶是检测肝功能的2个指标，这2种酶活性升高程度越高，表明肝细胞损伤程度越大；血清中总蛋白由白蛋白和球蛋白组成，其高低可反映机体蛋白质合成代谢的强弱，球蛋白是B细胞转化为浆细胞后分泌而成的，能反映机体的抵抗力。由此可见，乳酸片球菌ZPA017在断奶仔猪中应用，能够保护肝脏，提高机体抵抗力，促进动物健康。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京市农林科学院
<120> 一种新型乳酸片球菌及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1478
<212> DNA
<213> 乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）ZPA017
<400> 1
gtggcggcct gctatacatg cagtcgaacg aacttccgtt aattgatcat gacgtgcttg 60
cactgaatga gattttaaca cgaagtgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc 120
tgcccagaag caggggataa cacctggaaa cagatgctaa taccgtataa cagagaaaac 180
cgcctggttt tcttttaaaa gatggctctg ctatcacttc tggatggacc cgcggcgcat 240
tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgatgatg cgtagccgac ctgagagggt 300
aatcggccac attgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtagggaa 360
tcttccacaa tggacgcaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga agggtttcgg 420
ctcgtaaagc tctgttgtta aagaagaacg tgggtgagag taactgttca cccagtgacg 480
gtatttaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg 540
caagcgttat ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtctttt aagtctaatg 600
tgaaagcctt cggctcaacc gaagaagtgc attggaaact gggagacttg agtgcagaag 660
aggacagtgg aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg 720
gcgaaggcgg ctgtctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagcatgg gtagcgaaca 780
ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgatt actaagtgtt ggagggtttc 840
cgcccttcag tgctgcagct aacgcattaa gtaatccgcc tggggagtac gaccgcaagg 900
ttgaaactca aaagaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 960
aagctacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcttctg ccaacctaag agattaggcg 1020
ttcccttcgg ggacagaatg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080
gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttattacta gttgccagca ttcagttggg 1140
cactctagtg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggacgacgt caaatcatca 1200
tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggat ggtacaacga gtcgcgaaac 1260
cgcgaggttt agctaatctc ttaaaaccat tctcagttcg gactgtaggc tgcaactcgc 1320
ctacacgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc 1380
gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gccggtgggg 1440
taacctttta ggagctagcc gtctaaggtg gacccgga 1478
Claims (10)
1.一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)新菌株ZPA017，其保藏号为CGMCCNo.9040。
2.一种猪源乳酸片球菌制剂，其特征在于，含有如权利要求1所述的乳酸片球菌ZPA017。
3.一种饲料添加剂，其特征在于，含有如权利要求2所述的猪源乳酸片球菌制剂。
4.一种猪源乳酸片球菌制剂的制备方法，其特征在于，在液体发酵培养基中发酵权利要求1所述的乳酸片球菌ZPA017，得到发酵液，将所述发酵液进行离心、乳化冻干，制备成的冻干粉为猪源乳酸片球菌制剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1).发酵培养：以1％的接种量将所述乳酸片球菌ZPA017接种于MRS液体培养基中，37℃培养24小时，如此活化2代后得到种子培养物；
将种子培养物以5％的接种量接种于装有液体培养基的发酵罐中，设定温度37℃、转速100rpm，维持恒定pH 4.8，当发酵至16小时时开始补料，之后每隔2小时进行一次，共补料5次；
当发酵液pH不再降低时，终止发酵，得到发酵液；
(2).发酵液离心：将所述步骤(1)得到的发酵液在19000rpm离心，得到菌泥；
(3).乳化冻干：将所述步骤(2)得到的菌泥与1/3所述发酵液体积的冻干保护剂混合，高剪切分散乳化机3000r/min乳化30min，分装于冷冻盘中，厚度2cm左右，预冻3小时，设置真空冷冻干燥机冷凝温度-60℃、真空度17Pa，冻干24小时后，即得乳酸片球菌制剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
所述的液体培养基由如下浓度的物质组成：葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，牛肉膏5g/L，乙酸钠5g/L，酵母浸粉2.5g/L，K2HPO4·3H2O 2g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，MgSO4·7H2O 0.58g/L，MnSO4 0.19g/L，吐温-80 1ml/L，pH 6.5；
所述补料液为葡萄糖溶液，浓度为500g/L；
所述冻干保护剂为含有质量百分比浓度分别为8％的海藻糖、16％的脱脂乳、1.5％的L-半胱氨酸、4％的乳糖、1％的谷氨酸钠、0.5％的L-赖氨酸、5％的糊精和1％的甘油。
7.权利要求2所述乳酸片球菌制剂在饲料中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述饲料为猪饲料。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在基础日粮中添加所述乳酸片球菌制剂，使所述乳酸片球菌在每千克全价仔猪料中的活菌数为1.2×108CFU。
10.一种冻干保护剂，其含有质量百分比浓度分别为8％的海藻糖、16％的脱脂乳、1.5％的L-半胱氨酸、4％的乳糖、1％的谷氨酸钠、0.5％的L-赖氨酸、5％的糊精和1％的甘油。
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