[go: up one dir, main page]

EE05799B1 - Hüpokolestereemilist probiootilist mikroorganismi tüve Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 sisaldav kompositsioon kasutamiseks südame-veresoonkonnahaiguste ennetamiseks - Google Patents

Hüpokolestereemilist probiootilist mikroorganismi tüve Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 sisaldav kompositsioon kasutamiseks südame-veresoonkonnahaiguste ennetamiseks

Info

Publication number
EE05799B1
EE05799B1 EEP201400038A EEP201400038A EE05799B1 EE 05799 B1 EE05799 B1 EE 05799B1 EE P201400038 A EEP201400038 A EE P201400038A EE P201400038 A EEP201400038 A EE P201400038A EE 05799 B1 EE05799 B1 EE 05799B1
Authority
EE
Estonia
Prior art keywords
plantarum inducia
difficile
inducia dsm
dsm
xylitol
Prior art date
Application number
EEP201400038A
Other languages
English (en)
Inventor
Marika Mikelsaar
Epp Songisepp
Merle Rätsep
Pirje Hütt
Imbi Smidt
Kai Truusalu
Epp Sepp
Raik-Hiio Mikelsaar
Kalle Kilk
Jelena Stsepetova
Siiri Kõljalg
Mirjam Vallas
Original Assignee
Biocc Oü
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US14/244,284 external-priority patent/US20140335066A1/en
Application filed by Biocc Oü filed Critical Biocc Oü
Priority to EEP201800005A priority Critical patent/EE05809B1/et
Publication of EE201400038A publication Critical patent/EE201400038A/et
Publication of EE05799B1 publication Critical patent/EE05799B1/et

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/25—Lactobacillus plantarum

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

Leiutis käsitleb Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 kasutamist hüpokolestereemilise, antimikroobse ja antioksüdatiivse agendina. Nimetatud tüve sisaldavatel toiduainetel ja toidulisanditel on südant kaitsev toime. Mikroorganismi L. plantarum Inducia kasutatakse kolesterooli metabolismi häirete ja südameveresoonkonnahaiguste ennetamiseks, kuna ta vähendab LDL-kolesterooli taset ja samaaegselt tõstab organismi antioksüdatiivset aktiivsust, mõjutades oksüdatiivse stressi markereid soovitud suunas - oksüdeeritud madala tihedusega lipoproteiinide (ox-LDL) tase ja oksüdatiivse stressi indeks (OSI) vähenevad.

Description

TEHNIKAVALDKOND
Käesolev leiutis kuulub mikrobioloogia ja toitumise valdkonda ning käsitleb tüve Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, millel on mitmeid biotehnoloogilisi rakendusi.
TEHNIKA TASE LDL-kolesterool
Kõrgenenud kolesteroolitase on südame-veresoonkonna haiguste väljakujunemisel üheks oluliseks teguriks. Kõrge kolesteroolitaseme kahjulik mõju on tingitud kolesterooli erinevatest partiklitest, eelkõige madala tihedusega lipoproteiinidest (LDL-kolesteroolist, low density lipoprotein - cholesterol) ja apolipoproteiinist B (ApoB). LDL-kolesterool moodustab 60-70 protsenti kogu üldkolesteroolist ja transpordib kolesterooli, triglütseriide, rasvlahustuvaid vitamiine ja antioksüdante. LDL-kolesterool on oluline modulaator ateroskleroosi ennetamisel ja südame-veresoonkonna tervise säilitamisel. Oksüdeeritud madala tihedusega lipoproteiinid (ox-LDL) on LDL-partiklite oksüdatiivse stressi markeriks. Ox-LDL-i võib pidada koronaarsete südamehaiguste riski biokeemiliseks markeriks. LDL-kolesterool on laialdaselt tuntud kui südame-veresoonkonna riski marker. Arvukate kliiniliste katsete tulemused kinnitavad LDL-kolesterooli sõltumatut rolli südame isheemiatõve tekkimisel ja kujunemisel (http://www.mayomedicallaboratories.com/articles/communique/2011/11 .html). Probiootiliste mikroobide hüpokolestereemilise mõju üheks peamiseks mehhanismiks on sapisoolade hüdrolaasne aktiivsus (Pereira, D. I., McCartney, A. L., Gibson, G. R. An in vitro study of the probiotic potential of a bile-salt-hydrolyzing Lactobacillus fermentum strain, and determination of its cholesterol-Iowering properties. Appi Environ Microbiol. 2003: 69: 4743-4752; Liong, M. T., Shah, N. P. Bile salt deconjugation ability, bile salt hydrolase activity and cholesterol co-precipitation ability of lactobacilli strains. Int Dairy J. 2005: 15: 391-398; Lye, H. S., Rahmat-Ali, G. R., Liong, M. T. Mechanisms of cholesterol removal by lactobacilli under conditions that hüdrolaas (BSH, bile salt hydrolase) (EC 3.5.1.24; cholylglycine/kolüülglütsiin-hüdrolaas) on ensüüm, mis katalüüsib glütsiini ja/või tauriinkonjugeeritud sapisoolade hüdrolüüsi vabadeks sapisooladeks ja aminohappe jääkideks. Piimhappebakterite, kaasa arvatud Lactobacillus sp hulgas on BSH aktiivsus tugevalt seotud mikroobi loomuliku kasvukeskkonnaga ning on enam täheldatud inimese soolestiku koloniseerivate mikroobide korral, kuid BSH aktiivsus on siiski tüvespetsiifiline omadus. Tervise seisukohast on äärmiselt oluline soole limaskesta epiteelirakkude ja seedekulgla mikrofloora omavaheline tihe interaktsioon. Loomulikku mikrofloorasse kuuluvad laktobatsillid assimileerivad toiduainetest kolesterooli (Gilliland, S. E., Nelson, C. R., Maxwell, C, 1985. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus. Appi Environ Microbiol, 49, 377-381). In patent of Cune Castellana, 2009 (EP2485743B1; AB Probiotics S.A.). Lactobacillus plantarum tüved CECT 7528, CECT 7526 ja CECT 7529 üksikult või koos kompositsioonina alandavad kolesterooli nii in vitro kui in vivo tingimustes. Nimetatud tüvedel on sapisoolade hüdrolaasi BSH aktiivsus, samuti antagonistlik aktiivsus patogeensete tüvede (Salmonella enterica Enteritidis, Salmonella enterica Typhimurium, Yersinia pseudotuberculosis, Clostridium perfringens, Clostridium ramnosus, Enterococcus faecalis) suhtes ja neid tüvesid saab kasutada probiootiliste bakteritena.
Pereira koos oma kaastöötajatega on demonstreerinud lühikese ahelaga rasvhapete kontsentratsiooni, eriti propionaadi molaarse proportsiooni ja/või sapisoolade dekonjugatsiooni olulist rolli Lactobacillus fermentum'i kolesterooli langetamise mehhanismis (Pereira, D. L, McCartney, A. L., Gibson, G. R., 2003. An in vitro study of the probiotic potential of a bile-salt-hydrolyzing Lactobacillus fermentum strain, and determination of its cholesterol-lowering properties. Appi Environ Microbiol, 69, 4743-4752).
Siiski on Lactobacillus sp tüvede mõju seerumi kolesterooli tasemele tüvespetsiifiline ja sõltub tüve päritolust ning konkreetsetest omadustest (Tanaka, H., K. Doesburg, T. Iwasaki and I. Mireau, (1999) Screening of lactic acid bacteria for bile salt hydrolase activity. J. Dairy Sci., 82: 2530-2535).
Probiootikum
Probiootikum on elus mikrobiaalne toidu komponent, millel on piisavates doosides manustatuna kasulikud omadused inimese tervisele (Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/009/a0512e/a0512e00.pdfRetrievedl4.03.2014). Probiootilise tootena mõistetakse kindlat tüve sisaldavat preparaati, mis toimib peremeesorganismi mitmetele funktsioonidele (antiinfektsioossed, morfoloogilised, immunoloogilised, metaboolsed) eesmärgiga soodsalt mõjutada tervist kas füsioloogilise aktiivsuse toetamise või haiguste riski vähendamise kaudu. On üldtunnustatud, et sama liigi piires võivad erinevatel tüvedel olla erinevad probiootilised omadused (Ouwehand, A. C, Salminen, S., Isolauri, E., Probiotics: an overview of beneficial effects. Antonie Van Leeuwenhoek. 2002: 82, 279-289; Ljungh, A., Wadström, T., Lactic acid bacteria as probiotics. Curr Issues Intest Microbiol. 2006: 7, 73-89).
Levinumad probiootilised mikroobid kuuluvad perekondadesse Bifidobacteria ja Lactobacillus. Probiootilisi mikroobe manustatakse tavapäraselt fermenteeritud piimatoodetega, nagu jogurt, keefir, juust, või toidulisanditena. Käärsoole mikrofloora on tasakaalustatud ja soole limaskesta mikrofloora ei muutu kergesti. Siiski, piisavates doosides (päevane doos vähemalt 109 PMÜ) manustamine võimaldab demonstreerida probiootikumi toimet.
Probiootikumide terapeutiline eesmärk on vähendada või elimineerida potentsiaalseid patogeene ja toksiine, sünteesida toitaineid, antioksüdante, kasvufaktoreid, stimuleerida soole motoorikat ja moduleerida kaasasündinud ja adaptiivset immuunsust. Lactobacillus plantarum on looduses laialt levinud, leidudes fermenteeritud taimsel materjalil, piima-ja lihatoodetes ja samuti inimese soolestikus (Hammes, W. P., Weiss, N. and Hertel, K. The genera Lactobacillus and Carnobacterium. Prokaryotes. 2006: 4:320^03).
Liigi L. plantrum tüved on saadaval probiootilise toidulisandina (L. plantarum 299v, DSM 9843, Probi AB, Sweden) ja kuuluvad samuti eri tüvesid sisaldava toidulisandi VSL#3 koostisesse (L. plantarum 299v, DSM 9843, Probi AB, Sweden). Tüve Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 on kirjeldatud kui antimikroobset peptiidi plantariitsini tootva, tsütokiin IL-6 indutseeriva, putressiini tootva ja soole lümfikudet, loomuliku rakulist immuunsust ja soole limaskesta kaitsebarjääri parandava probiootikumina (Mikelsaar et ai, EP2288360B1, 2009, Tervisliku Piima Biotehnoloogiate Arenduskeskus OÜ). Soolestiku häiritud mikrobiaalökoloogia Seedetrakti mikrofloorat võivad tugevasti tasakaalust välja viia laia toimespektriga antibiootikumide kasutamine infektsioonide raviks ja põletiku komplikatsioonid.
Clostridium difficile infektsioon
Clostridium difficile tuvastati 1970-ndatel aastatel kui antibiootikumi-seoselise kõhulahtisuse tekitaja. Eoseid moodustav, anaeroobne soolestiku patogeen Clostridium difficile on levinud haiglates ja vanadekodudes (Britton, R. A., Young, V. B., Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends Microbiol. 2012: 20, 313-319). Eksogeenset päritolu C. difficile infektsiooni põhjuseks on nakatumine C difficile eostega. Haiguse põhjustavad mitte eosed, vaid vegetatiivsete rakkude toodetud toksiinid. Endospooride moodustamine on oluline mikroobi põhjustatud haiguse levikul. Haiguse esile kutsumiseks on vajalik spooride germinatsioon ja vegetatiivsete rakkude kasv (Burns D. A, Heap J. T. Minton N. P. Clostridium difficile spore germination: an update. Res Microbiol. 2010;161(9):730-4).
C. difficile infektsiooniga patsientidest veerandil (25 protsendil) kujuneb välja pseudomembranoosne koliit (PMK). Clostridium difficile põhjustatud kõhulahtisus (CDAD, Clostridium difficile associated diarrhed) suurendab suremust, voodipäevade arvu ja suurendab oluliselt kulutusi üldistele tervishoiuteenustele. Tänaseni rõhutavad ravijuhised vankomütsiini kasutust mõõduka ja raske pseudomembranoosse koliidi puhul (http://www.uptodate.com/contents/clostridium-difficile-in-adults-treatment, alla laaditud 14.03.2014).
Clostridium difficile infektsioon kordub umbes 20 protsendil patsientidest ja tõuseb 40 kuni 60 protsendini järgnevate retsidiivide korral (Kelly, C. P., LaMont, J. T., Clostridium difficile - more difficult than ever. N Engl J Med. 2008: 359, 1932-1940). Antibiootikumravi rikub kompleksse ja tasakaalustatud mikroorganismide mitmekesisuse, mis on peamine faktor haiguse patogeneesis, Clostridium difficile kolonisatsioonis ja endogeenset päritolu haigestumisel. Korduvate C. difficile infektsioonidega CDI (Clostridium difficile infection) patsientide soolefloora mitmekesisus on oluliselt vähenenud võrreldes kontrollgrupiga (Chang, J. Y., Antonopoulos, D. A., Kalra, A., Tonelli, A., Khalife, W. T., Schmidt, T. M., Young, V. B. Decreased diversity of the fecal Microbiome in recurrent C. Difficile-associated diarrhea. J Infect Dis. 2008: 197, 435-438). Mikroobide mitmekesisuse säilitamine ja taastamine võimaldaks luua uusi strateegiaid. Otsustava tähtsusega selle haiguse ennetamises ja ravis on leida võimalus antibiootikumravi käigus ja foonil teisenenud mikrofloora taastamiseks eri raviskeemide abil, sh probiootikumide manustamisega. Enamik probiootikume koloniseerivad soolestiku ajutiselt, toodavad bakteritsiidseid happeid ja peptiide ning edendavad mikroobide omavahelist võitlust, võideldes toitainete ja epiteelile kinnitumise eest. Need mõjutused tunduvad vähendavat keskkonna sobilikkust C. difficile jaoks. Eelnevad uuringud soovitavad CDI ennetamiseks kasutada probiootikumide kombinatsioone, mis sisaldavad liike L. acidophilus ja L. casei, S. boulardii või L. rhamnosus. Doosid, mis on suuremad kui 109 PMÜ/päevas, on efektiivsemad kui madalamad doosid.
Probiootikumide antimikroobset aktiivsust on pakutud üheks mehhanismiks C. difficile-ga võitlemisel. Piimhappebakterid toodavad lühikese ahelaga rasvhappeid, mis alandavad soolestiku pH-d ja takistavad C. difficile kinnitumist (McFarland, L. V., Beneda, H. W., Clarridge, J. E., Raugi, G. J. Implications of the changing face of C. difficile disease for health care practitioners. Am J Infect Control. 2007: 35, 237-253). Probiootikumide teine võimalus kaitsta soolestiku barjäärifunktsiooni võib olla C. difficile A ja B toksiinide seondumise takistamine ja seeläbi soole epiteelile pseudomembraanide tekke takistamine.
Samas ei oma kõik probiootikumid eelpoolmainitud mehhanisme. Laktobatsillide tüvespetsiifilisus on oluline faktor, mida tuleb arvestada C. difficile infektsiooni profülaktikaks ja raviks uute potentsiaalsete probiootikumide otsimisel (Tejero-Sarinena S., Barlow J., Costabile A, Gibson G. R., Rowland I. Antipathogenic activity of probiotics against Salmonella Typhimurium and Clostridium difficile in anaerobic batch culture systems: Is it due to synergies in probiotic mixtures or the specificity of single strains? Anaerobe. 2013: 24; 60-65).
Veelgi enam, mõned kliinilised uuringud pole suutnud anda statistiliselt piisavaid tõendeid tõestamaks teatud probiootikumide efektiivsust CDAD ennetamiseks. Suures randomiseeritud kliinilises katses, mis hõlmas 2941 antibiootikumravi saavat eakat, ei leidnud katse läbiviijad CDI riski vähenemist probiootikumi (Lactobacillus acidophilus ja Bifidobacterium bifidum segu) saavate eakate hulgas võrreldes kontrollgrupiga (RR 0.71; 95% CI 0.34-1.47; p =0.35) (Allen, S. J., Wareham, K., Wang, D., Bradley, C, Hutchings, H., Harris, W., Dhar, A., Brown, H., Foden, A., Gravenor, M. B., Mack, D. Lactobacilli and bifidobacteria in the prevention of antibiotic-associated diarrhoea and Clostridium difficile diarrhoea in older inpatients (PLACIDE): a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. Lancet. 2013: 382, 1249-1257). Pärast aastaid kestnud kliinilistes uuringutes erinevate probiootikumide toime uurimist CDI ravis on endiselt arutluse all probiootikumi tüve, doosi ja toime kasutamine raviskeemis (Naaber, P., Mikelsaar, M., Interactions between Lactobacilli and antibiotic-associated diarrhea. Adv Appi Microbiol. 2004: 54 231-260).
Ksülitooli kasutamine
Ksülitool on 5-C suhkrualkohol, pentitool ja seda leidub taimedes, seentes ja algloomades. Ksülitool on oluline imetajate süsivesikute metabolismi vaheprodukt, näiteks inimveri sisaldab kuni 8x10-5M ksülitooli.
Manustatud ksülitool ei absorbeeru täielikult ja imendumata osa saab kasutada kiudainena bakteriaalsel fermentatsioonil muutes ksülitooli lühikese ahelaga rasvhapeteks, mida kasutatakse energeetilistes radades. Ksülitool mõjutab mõnede mikrofloora liikide kasvu jämesooles, soodustades indigeense mikrofloora kasvu ja aktiivsust. Üks gramm ksülitooli sisaldab 2,4 kcal, võrreldes glükoosiga, mis sisaldab 3,87 kcal ühes grammis. Ksülitooli reklaamitakse kui "ohutut" diabeetikutele ja hüperglükeemiat põdevatele isikutele (Talbot J. M., Fisher K. P., The Need for Special Foods and Sugar Substitutes by Individuals with Diabetes Mellitus. Diabetes Care 1978: 1; 231-240).
Varasemates uuringutes oleme leidnud, et 1 protsendi ksülitooli lisamine kasvukeskkonda takistas Clostridium difficile VPI 10463 vegetatiivsete rakkude kinnitumist CACO-2 rakkudele, tõenäoliselt blokeerides rakul olevad retseptorid. Hamstri mudelisse kohaldatuna (Naaber, P., Lehto, E., Salminen, S., Mikelsaar, M., Inhibition of adhesion of Clostridium difficile to Caco-2 eelis. FEMS Immunol Med Microbiol. 1996: 14, 205-209) kaitses 1 ml 20 protsendilise ksülitooli ja Lactobacillus rhamnosus GG lahuse manustamine loomi raske enterokoliidi tekkimise vastu (Naaber, P., Lehto, E., Salminen, S., Mikelsaar, M., Inhibition of adhesion of Clostridium difficile to Caco-2 eelis. FEMS Immunol Med Microbiol. 1996: 14, 205-209). Nendes katsetes, kus kasutati ksülitooli ja probiootikumi Lactobacillus rhamnosus GG kombinatsiooni, nakatati rakukultuuri ja hamstreid eelnevalt anaeroobsetes tingimustes kultiveeritud Clostridium difficile vegetatiivsete rakkudega.
Kliinilises praktikas (meditsiiniasutustes) või vanadekodudes aga areneb haigus nakatumisel aeroobsetele tingimustele ülimalt vastupidavate C. difficile eostega. Eoste germinatsioon toimub peremeesorganismis.
Mõned autorid on väitnud, et loommudelites võivad mõningad suhkrud sarnaselt glükoosile blokeerida C difficile A ja B toksiinide ekspressiooni (Karlsson, S., Burman, L. G., Akerlund, T. Induction of toxins in Clostridium difficile is associated with dramatic changes of its metabolism. Microbiology. 2008: 154, 3430-3436).
Seega on endiselt vajadus leida probiootilisi tüvesid, mis efektiivselt vähendavad LDL-kolesterooli, eriti ox-LDL-i ning vähendavad ka Clostridium difficile nakatumise riski.
LEIUTISE OLEMUS
Käesolev leiutis pakub mikroobikollektsioonis Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 16.04.2008 registreerimisnumbriga DSM 21379 deponeeritud tüve L. plantarum Inducia DSM 21379 sisaldava kompositsiooni kasutamiseks hüpokolestereemilise agendina kolesterooli metabolismi häirete ja nendest lähtuvate südame-veresoonkonnahaiguste ennetamiseks LDL-kolesterooli taseme vähendamise teel veres ja samaaegseks kasutamiseks antioksüdatiivse agendina inimkeha antioksüdatiivse aktiivsuse tõstmiseks oksüdatiivse stressi markeri -oksüdeeritud madala tihedusega lipoproteiinide (ox-LDL) taseme ning oksüdatiivse stressi indeksi (OSI) ja peroksiidide üldhulga (TPX) vähendamise abil. Seega omavad Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 sisaldavad kompositsioonid ja toidutooted südant kaitsvat toimet.
Leiutise teine eesmärk on pakkuda tüve Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 sisaldav kompositsioon kasutamiseks antimikroobse agendina endogeenset ja/või eksogeenset päritolu Clostridium difficile põhjustatud kõhulahtisuse (CDAD) riski vähendamiseks Clostridium difficile eoste germinatsiooni takistamise ja Clostridium difficile vegetatiivsete rakkude paljunemise allasurumise teel. L. plantarum Inducia on kasutatav samaaegselt antibiootikumraviga.
Clostridium difficile vastased kompositsioonid võivad lisaks sisaldada ka ksülitooli.
L. plantarum Inducia sisaldavaid kompositsioone saab kasutada toiduainete, toidulisandite, farmaatsia- või veterinaartoodete tootmiseks. Toiduained võivad olla piima- või lihatooted, maiustused jne. Piimatooted võivad olla hapendatud piimatooted, juust, jogurt jne.
Toidulisandit võib kasutada pulbrina (kapslid, pastillid, tabletid, pulbrikotikesed jne) või vedelal (ampullid) kujul. Tüve võib kasutada ka külmkuivatatuna.
Tüve L. plantarum Inducia DSM 21379 efektiivne doos on vahemikus lxl09 PMÜ kuni lx1010 PMÜ, soovitavalt 5x109 PMÜ päevas.
JOONISTE LOETELU
Fig 1 keskkonna pH väärtused tüve L. plantarum Inducia sisaldavas ksülitooli lisandiga ja modifitseeritud MRS kontrollsöötmes mikroaeroobses ja anaeroobses keskkonnas.
Fig 2 toksiinide A ja B geenide olemasolu tüvel C. difficile VPI 10643 määratuna pöördtranskriptsiooni (RT) ja reaalaja PCR amplifikatsiooniga (qPCR).
Fig 3 toksiin B geeni esinemine ampitsilliini ja C. difficile mõjutatud hamstri peensooles ja maksas määratuna pöördtranskriptsiooni (RT) ja reaalaja PCR amplifikatsiooni (qPCR) meetodiga.
Fig 4a jämesoole normaalne limaskest pärast probiootikumi manustamist.
Fig 4b jämesoole C. difficile infektsiooniga limaskest.
Fig 5a eksperimentaalse CDAD infektsiooni morfoloogilised muutused. Mõõdukas hüpereemia peensooles.
Fig 5b eksperimentaalse CDAD infektsiooni morfoloogilised muutused. Mõõdukas hüpereemia jämesooles ja intensiivne punetus.
Fig 5c eksperimentaalse CDAD infektsiooni morfoloogilised muutused. Mõõdukas hüpereemia kõhunäärmes.
Fig 5d eksperimentaalse CDAD infektsiooni morfoloogilised muutused. Mõõdukas hüpereemia põrnas.
Fig 5e eksperimentaalse CDAD infektsiooni morfoloogilised muutused Pseudomembraanid peensooles.
Fig 5f eksperimentaalse CDAD infektsiooni morfoloogilised muutused. PMN infiltratsioon pseudomembraanidega jämesooles.
LEIUTISE TEOSTAMISE NÄITED
Leiutist illustreerivad järgnevad näited, mis ei piira leiutise ulatust.
I. L. plantarum Inducia DSM 21379 kasutamine hüpokolestereemilise agendina LDL-kolesterooli taseme vähendamise teel veres
Näide 1. L. plantarum Inducia DSM 21379 sapphapete hüdrolaasi aktiivsus
Järgneva in vitro testi eesmärk oli hinnata L. plantarum Inducia DSM 21379 sapphappe soolade hüdrolaasi aktiivsust.
Meetodid. L. plantarum Inducia DSM 21379 sapisoolade hüdrolaasi BSH aktiivsust hinnati analoogselt Cune Castellana, 2009 kasutatud meetodiga (EP 2 485743 Bl; AB Probiootikumid SA).
Kolme Lactobacillus spp tüve kasvatati mikroaeroobsetes tingimustes üleöö MRS agaril temperatuuril 37°C. Pärast inkubeerimist kultuuride suspensioon standardiseeriti McFarland standardi 3,0 järgi. BSH aktiivsust hinnati monokultuuridel. Steriliseeritud paberdiskid immutati vastava kultuuriga ning inkubeeriti MRS söötmel, millele oli lisatud 4% taurodeoksükoolhappe Na soola (taurodeoxycholic acid TDCA, Sigma, USA) ja 0,37 g/l CaCl2 (w/v). Petri tasse inkubeeriti anaeroobselt 37 °C juures 72 h ja mõõdeti diskide ümber olev pretsipitatsiooni tsoon. BSH aktiivsuse arvutamiseks lahutati paberdiski diameetrist (DD, mm) pretsipitatsiooni diameeter (IZD, mm) ja jagati tulemus kahega, BSH aktiivsus = (IZD-DD) / 2 (Tabel 1).
L. plantarum Inducia BSH aktiivsus oli kõrgem kui referentstüvedel L. plantarum L. plantarum Inducia BSH aktiivsus oli kõrgem kui referentstüvedel L. plantarum BAA793 ja L. gasseri DSM 23882 (tabel 1).
Näide 2. L. plantarum Inducia DSM 21379 LDL-kolesterooli vähendamise võime
Kliinilise mõjutuskatse ISRCTN79645828 "Probiootilise jogurti toime tervete vabatahtlike verenäitajatele ja soolestiku mikrofloorale" eesmärk oli hinnata tüve L. plantarum Inducia sisaldava jogurti LDL-kolesterooli taseme alandamise võimet veres lühiajalise manustamise (3 nädalat) järel.
Jogurti valmistamine. Probiootiline jogurt valmistati normaliseeritud ja pastöriseeritud (+92 ... + 95 °C 5 min) lehmapiimast, kasutades L. plantarum Inducia DSM 21379 (2xl011 CFU/g) lisajuuretisena (lg/t piimale). Pastöriseeritud piim jahutati 35 ... + 43 °C enne segamist starterkultuuride ja probiootilise tüvega. Piima fermenteeriti kuni happesuseni pH 4,2 ... 4,5 ja jahutati + 23 ... + 27 °C. Jogurt magustati 5% suhkruga, pakendati plastikust topsidesse ja jahutati +2 ... + 6 °C. Kontrolliks kasutati ilma probiootilise lisandita jogurtit.
Kliinilise uuringu disain. Topeltpime platseebo-kontrollitud (DBPC) cross-over uuring viidi läbi vastavalt Helsinki deklaratsiooni juhistele. Kliiniline uuring kiideti heaks Tartu Ülikooli Inimuuringute eetika komitee poolt (protokoll number 190T-11, 2010). Uuringusse lülitumisel kirjutasid kõik osalejad alla kirjalikule nõusoleku vormile ja neil oli võimalus uuringust igal ajal taganeda. Uuringu eesmärk oli hinnata L. plantarum Inducia DSM 21379 sisaldava jogurti toimet tervete vabatahtlike (n=49) tervise biomarkeritele. Osalejatel paluti loobuda probiootilistest toodetest (nt toidulisandid, jogurtid, juust, keefir jne) üks kuu enne uuringu algust, kuid jätkata oma tavapärast toitumist.
Kaks osalejate gruppi alustasid samaaegselt 3 nädala pikkust vastavalt ilma probiootilise lisandita kontrolljogurti või L. plantarum Inducia DSM 21379 (4x107 PMÜ/g) sisaldava testjogurti tarbimist 150 g päevas. Probiootilise tüve L. plantarum Inducia päevane doos oli 6x109 PMÜ. Pärast kahe nädala pikkust vaheperioodi (wash out) lülitusid osalejad ümber teise kolme nädala pikkuse probiootilise või kontroll- jogurti tarbimise perioodile.
Kliinilised uuringud. Osalejaid uuriti kliiniliselt, vereplasma proovid koguti hommikul tühja kõhuga ja enne ravimite, tubaka, alkoholi ja kohvi või tee tarvitamist. Iga osaleja kohta koguti antropomeetrilised näitajad. Kehamassiindeks (KMI) arvutati kehakaalu (kg) jagamisel pikkuse ruuduga (m2). KMI alusel liigitati terved vabatahtlikud katses osalejad järgmiselt: normaalne kaal (18,5-24,9 kg/m2), ülekaalulisus (≥25.0 kg/m2) ja rasvumine (≥30.0 kg/m2) (WHO. The International Task Force. Obesity: Preventing and Managing the Global Epidemic. Report of a WHO Consultation on Obesity. Geneva, Switzerland. WHO/Nut/NCD/98. 1998;1).
Paastuvere proovid koguti neli korda: katsesse sisenemisel, pärast testtoote (probiootiline või kontrolljogurt) tarbimist, pärast kahe nädalast vaheperioodi ning teise testtoote tarbimise perioodi lõpus.
Hematoloogilised näitajad, plasma lipiidid: üldkolesterooli, LDL-kolesterooli, HDL-kolesterooli ja triglütseriidid määrati kohalikus kliinikumi laboris, sertifitseeritud ja standardiseeritud laboratoorsete meetodite abil (Tartu Ülikooli Kliinikumi Ühendlabor, Eesti). Tavapäraste laborimõõtmiste referentsväärtustena kasutati Nordic Reference Interval Project poolt pakutud referentsintervalle (NORIP, Rustard P., Felding P., Franszon L., Kairisto V., Lahti A., Martensson A., Hyltoft Petersen P., Simonsson P., Steensland H,. Uldall A. The Nordic Reference Interval Project 2000: recommended reference intervals for 25 common biochemical properties. Scand J Clin Lab Invest. 2004:64:271-284).
Statistilised analüüsid
Statistiliste analüüside läbiviimiseks kasutati R 2.10.1 (http://www.r-project.org, allalaaditud 25.03.2014) ja GraphPad Prism versiooni 4.00 Windowsile (GraphPad Software, San Diego, CA). Kõiki tulemusi väljendati keskmise väärtusena ja lisati standardhälve (keskmised ± SD). Algväärtuste ja mõjutuse tulemuste võrdlemiseks kasutati paaris t-testi või Wilcoxon testi, olenevalt normaaljaotusest.
Erinevused loeti statistiliselt oluliseks, kui väärtus oli p väiksem kui 0,05.
Läbiviidud cross-over uuringus tervete vabatahtlike kaks gruppi oma kliiniliste andmete poolest ei erinenud (tabel 2).
Tabel
Pärast L. plantarum Inducia DSM 21379 tarbimist ilmnesid muutused LDL-kolesterooli hulgas. LDL-kolesterooli sisaldus vähenes pärast L. plantarum Inducia DSM 21379 sisaldava jogurti tarbimist (tabel 3).
Seega L. plantarum Inducia DSM 21379 sisaldava jogurti tarbimine 3 nädala jooksul vähendas LDL-kolesterooli taset veres 9,1%.
Näide 3. L. plantarum Inducia DSM 21379 sisaldava jogurti toime oksüdatiivse stressi markeritele, oksüdeeritud madala tihedusega lipoproteiinile (oxLDL), oksüdatiivse stress indeksile (OSI, oxidative stress index) ja peroksiidide üldhulgale (TPX, total peroxide count)
Topeltpimedas kahe paralleelse õlaga uuringus ISRCTN26344255 tarbisid kergelt hüperkolestereemilised (≥3.0 mmol / L LDL-kolesterooli tase) täiskasvanud (n = 136) 8 nädala jooksul päevas 150 g probiootilist jogurtit (L. plantarum Inducia DSM 21379 päevane doos oli 5x109 PMÜ) või kontrolljogurtit. Probiootilise toote lühiajaline mõju mõõdeti pärast 4-nädalast mõjutamist ja püsivat mõju mõõdeti uuringu lõpus, st pärast 8 nädalast mõjutust.
Uuring oli heaks kiidetud Tartu Ülikooli Inimuuringute eetika komitee poolt (protokoll number 207/M-11 19.09.2011).
150 g L. plantarum Inducia DSM 21379 (keskmine päevane doos 5xl09 PMÜ) sisaldava jogurti igapäevane tarbimine põhjustas pideva LDL-kolesterooli taseme languse probiootilises grupis 4 ja 8 nädalase tarbimise järel (-0.12mmol/l; p = 0,04) ja peale 8 nädalat jogurti tarbimist võrreldes algtasemega (-0,09 mmol/1; p = 0,029) (tabel 4a ja 4b).
Ox-LDL on LDL-kolesterooli partiklite-spetsiifiline oksüdatiivse stressi marker, mida võib pidada üheks südame- ja veresoonkonnahaiguste biokeemilise riski markeriks. L. plantarum Inducia DSM 21379 sisaldava jogurti manustamise tulemuseks oli püsiv ox-LDL taseme vähenemine probiootilise jogurti grupis 8 nädalase mõjutuse järel (tabel 5a ja 5b). Muutus 8 nädala ja algtaseme näitude vahel oli statistiliselt oluline (-4.10U / L; p=0,003). Muutus oli ülimuslik ka platseebogrupi suhtes (p=0,026). Platseeborühmas muutust ei täheldatud.
L. plantarum Inducia DSM 21379 sisaldava jogurti manustamine põhjustas ka oksüdatiivse stressi indeksi (OSI) olulise alanemise (-5,37; p väikem kui 0,001) peale 8 nädalast tarbimist (tabel 6a ja 6b). Muutus oli oluline ka võrreldes platseebogrupiga (p = 0,04). Platseeborühmas muutust ei täheldatud.
aWilcoxon test; bWilcoxon test; W0: visiit 2, mõjutuse algus; W4: visiit 3, peale 4-nädalast mõjutust; W8: visiit 4, peale 8-nädalast mõjutust; p-väärtusa: gruppidevaheline (platseebo ja probiootilise grupi vaheline) olulisus, p-väärtusb: grupi sisene olulisus.
aWilcoxon test; bWilcoxon test; W0: visiit 2, mõjutuse algus; W4: visiit 3, peale 4-nädalast mõjutust; W8: visiit 4, peale 8-nädalast mõjutust; p-väärtusa: gruppidevaheline (platseebo ja probiootilise grupi vaheline) olulisus, p-väärtusb: grupisisene olulisus.
Probiootilise (L. plantrum Inducia sisaldav jogurt) grupi sees oli stabiilne peroksiidide üldhulga langus kogu uuringu vältel (tabel 7a ja 7b). Platseebogrupis mingit efekti ei täheldatud. Olulist antioksüdatiivse kogumahtuvus muutust (total antioxidative capacity) ei täheldatud (tabel 8a ja 8b).
aWilcoxon test; bWilcoxon test; W0: visiit 2, mõjutuse algus; W4: visiit 3, peale 4-nädalast mõjutust; W8: visiit 4, peale 8-nädalast mõjutust; p-väärtusa: gruppidevaheline (platseebo ja probiootilise grupi vaheline) olulisus, p-väärtusb: grupisisene olulisus.
Järeldus. L. plantarum Inducia DSM 21379 sisaldav jogurt omab südame-veresoonkonnahaiguste eest kaitsvat toimet alandades LDL-kolesterooli taset veres, lisaks kaitseb inimkeha oksüdatiivsete kahjustuste eest ja tõstab antioksüdatiivset aktiivsust, alandades oksüdatiivse stressi markereid ox-LDL, OSI ja TPX.
II. Tüve L. plantarum Inducia DSM 21379 kasutamine antimikroobse agendina, C. difficile spooride germinatsiooni ja vegetatiivsete rakkude proliferatsiooni takistajana
Näide 4. L. plantarum Inducia DSM 21379 antagonistlik aktiivsus C. difficile vegetatiivsete rakkude vastu anaeroobses keskkonnas in vitro
Uuringu eesmärk oli hinnata L. plantarum Inducia DSM 21379 antagonistlikku aktiivsust C. difficile tüvede vastu anaeroobses keskkonnas.
Meetodid. Testitud tüved: L. plantarum Inducia DSM 21379 ja C. difficile VPI 10463 (ATCC 43255), hüpervirulentne tüvi M 13042.
Mikroobitüved külvati tahkele söötmele ning inkubeeriti anaeroobses keskkonnas. Füsioloogilises lahuses tehti mikroobide suspensiooni vastavalt MacFarlandi standardile 3 (108 PMÜ/ml). 200 ml BHI söödet inokuleeriti nimetatud suspensiooniga (0,2 ml) saavutamaks lõpp-kontsentratsiooni 105 PMÜ/ml.
Eri ajahetkedel tehti bakterioloogilised väljakülvid (0,1 ml) MRS ja LAB160 söötmetele. Väljakülve inkubeeriti paralleelselt anaeroobses ja mikroaeroobses keskkonnas. Kasvu hinnati 2-5 päeva pärast ja tulemused väljendati log10 PMÜ/ml.
C. difficile vegetatiivsete rakkude täielik inhibeerimine BHI söötmes L. plantarum Inducia DSM 21379 poolt ilmnes pärast 48-tunnist inkubatsiooni mikroobide elulemuse kontrollväljakülvide selektiivsetele söötmetele MRS ja LAB160. Suurim L. plantarum Inducia DSM 21379 tihedus BHI söötmes oli pärast 24-tunnist inkubatsiooni. L. plantrum Inducia DSM 21379 hulk pärast 48-tunnist inkubatsiooni mõnevõrra langes nii monoklutuuris (6.3 log PMÜ/g) kui kombinatsioonis C. difficile 'ga (7.3 ja 6.0 log PMÜ/g) (tabel 9).
Näide 5. Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 supernatandi mõju Clostridium difficile referents- ja kliiniliste tüvede vegetatiivsetele rakkudele
Antud in vitro katse eesmärk oli hinnata L. plantarum Inducia DSM 21379 antimikroobset toimet C. difficile referents- ja kliinilisest materjalist isoleeritud tüvede (kliiniliste tüvede) vegetatiivsetele rakkudele. Naturaalse (happelise) ja neutraliseeritud (antimikroobsed ained, nt peptiidid) supernatandi toime eristamine võimaldab hinnata L. plantarum Inducia DSM 21379 antagonistliku aktiivsuse erinevaid mehhanisme - kas toimivad pigem orgaanilised happed või bakteriotsiinid.
Materjal (tüved) (tabel 10)
L. plantarum Inducia DSM 21379
Clostridium difficile referentstüved VPI 10463 ja M 13042
Clostridium difficile kliinilised isolaadid (11 tüve)
Meetodid. L. plantarum Inducia DSM 21379 supernatandi antimikroobset toimet testiti C. difficile referents- ja kliiniliste tüvede suhtes mikrotiiterplaatidel (MTP). L. plantarum Inducia DSM 21379 säilitati -80 °C klaaskuulikestega mikrokatsutites ja aktiveerimiseks kultiveeriti 3x0,15 protsendilise agari lisandiga MRS puljongis ning inkubeeriti mikroaeroobses keskkonnas (10-protsendiline CO2) temperatuuril 37 °C 24 tundi. BHI puljongi inokuleerimiseks kasutati üleöö kasvanud L. plantarum Inducia DSM 21379, mida lisati BHI puljongile 1 protsent v/v ja suspensiooni inkubeeriti mikroaeroobsetes tingimustes 24 tundi. Supernatandi antimikroobse aktiivsuse hindamiseks tsentrifuugiti 24 tunni vanust suspensiooni ning eraldati supernatant.
Mõõdeti supernatandi pH ja supernatant jagati kaheks osaks. Üks osa supernatandist jäeti naturaalselt happeliseks ja teine osa neutraliseeriti 6N NaOH-ga kuni pH väärtuseni 6,0 ning mõlemad supernatandid filtersteriliseeriti.
C. difficile tüvesid säilitati -80 °C klaaskuulikestega mikrokatsutites ja aktiveerimiseks külvati 3x hobusevere lisandiga Fastidious Anaerobe Agar (FAA) söötmele ja inkubeeriti anaeroobses keskkonnas (anaeroobne käsiboks, gaasisegu 90% N:5% CO2:5% H2) 24 tundi. Üleöö kasvanud C. difficile kultuuri kasutati suspensiooni tegemiseks, mis vastas tihedusele Mac Farland 3,0. L. plantarum Inducia DSM 21379 antimikroobse aktiivsuse hindamiseks tehti järgmised katsesegud: 20 μl C. difficile rakususpensioonile lisati 180 μl: (1) steriilne BHI puljong (kontroll), (2) rakuvaba BHI supernatant, (3) rakuvaba neutraliseeritud supernatant, (4) lahjendatud rakuvaba supernatant (1:1 steriilses BHI puljongis) ja (5) lahjendatud neutraliseeritud rakuvaba supernatant (1:1 steriilses BHI puljongis).
C. difficile kasvu (optilise tiheduse väärtuse muutus) hinnati pärast 48 tunni inkubatsiooni, optiline tihedus mõõdeti MTP lugejaga OD620nm juures ning seejärel arvutati kasvumuutus.
L. plantarum Inducia DSM 2137 inhibeerivat toimet hinnati Kruskal-Wallise testiga, kus C. difficile kasvutihedust (OD620nm) kontrollsöötmes võrreldi C. difficile kasvu tihedusega loodusliku ja neutraliseeritud supernatandis. Statistiliste andmete analüüsiks kasutati PAST Statistics veebipõhist programmi.
Kliinilisest materjalist isoleeritud tüved: C. difficile CDE, CDP 1-9; referentstüved: C. difficile VPI 10463 (ATCC 43255) ja C. difficile M13042 (Kanadas isoleeritud ribotüübi O27 pandeemiline tüvi).
Seega, L. plantarum Inducia DSM 21379 antimikroobne aktiivsus on tingitud nii happe produktsioonist naturaalses tootes (pH alandamine) ja väiksemas hulgas antimikroobsete peptiidsete ühendite tootmisest, mis on aktiivsed ka peale supernatandi neutraliseerimist (tabel 10).
Näide 6. L. plantarum Inducia DSM 21379 kasvu ja pH väärtuste testimine ksülitooliga söötmes kultiveerimisel
Katse eesmärk oli hinnata, kas ksülitool mõjutab L. plantarum Inducia DSM 21379 antagonistlikku aktiivsust C. difficile vastu.
L. plantarum Inducia (105 CFU/ml) inkubeeriti MRS söötmes, milles glükoos oli asendatud 5 protsendilise ksülitooliga või ei kasutatud suhkrut üldse, mikroaeroobses või anaeroobses keskkonnas. Laktobatsillide hulk loendati ja avaldati PMÜ/ml söötme kohta. L. plantarum Inducia DSM 21379 ksülitooli kasutamist kontrolliti 2-, 6-, 24- ja 48-tunnise inkubatsiooni järel.
L. plantarum Inducia DSM 21379 kasvas 24 tunni jooksul võrdselt nii 5-protsendilise ksülitooli lisandiga kui ilma ksülitoolita söötmes. 5-protsendilise ksülitooli lisandiga söötmes oli L. plantarum Inducia DSM 21379 kasv tihedam mikroaeroobses keskkonnas võrreldes anaeroobse keskkonnaga, milles oli kasv 2 log madalam (tabel 11).
See katse tõestas, et L. plantarum Inducia DSM 21379 ei kasuta MRS söötmesse lisatud ksülitooli efektiivselt. L. plantarum Inducia DSM 21379 kasvatamisel modifitseeritud
MRS söötmes mõõdeti pH langust. Glükoosiga kontrollsöötmes oli orgaaniliste hapete tootmisest tingitud pH madalam anaeroobses keskkonnas. pH langes ksülitooli sisaldavas söötmes väärtuselt 6,2 väärtuseni 5,0 nii mikroaeroobses kui anaaeroobses keskkonnas, kuid jäi tunduvalt madalamaks võrreldes glükoosi sisaldava kontrollsöötmega, milles pH langes väärtuselt 7,5 väärtuseni 3,2 (joonis fig 1).
Ksülitooli metaboliseerimine L. plantarum Inducia DSM 21379 poolt.
Uuringu eesmärk oli mõõta ksülitooli kasutamist L. plantarum Inducia DSM 21379 mikroaeroobses ja anaeroobses keskkonnas.
Meetodid: L. plantarum Inducia DSM 21379 kasvatati mikroaeroobses ja anaeroobses keskkonnas 5% ksülitooli lisandiga söötmes 2 kuni 120 tundi. Viidi läbi kaks paralleelkatset. Ksülitooli detekteerimiseks kasutati mass-spektromeetrit QTRAP 3200 (Applied Biosystems, USA). Proove tsentrifuugiti 3 minutit 10 000 g, tehti l00x lahjendus ja 50 μl segati 50 μl sisemise standardiga (5 mM D4 merevaikhape atsetonitriilis, 50 μl). Mass-spektromeetrisse süstiti 5 μl lahjendust, milles kasutati 50-protsendilist atsetonitriil/vee segu. Substraadid, ioonipaarid 151/101 (ksülitool) ja 121/77 (sisemine standard) tuvastati mitmekordse reaktsiooni monitoorimisel (MRM).
Kontsentratsioon arvutati kaubandusliku ksülitooli (Sigma-Aldrich, Saksamaa) kindla kontsentratsiooniga lahuste kalibreerimiskõvera alusel.
Korduskatsetes selgus, et L. plantarum Inducia kasutas ksülitooli väga väikeses koguses, suhkru hulk söötmes püsis algväärtuse lähedane, muutus oli 0-0,6 mM (tabel 12).
Seega mass-spektomeetri analüüs kinnitas, et L. plantarum Inducia kasutab ksülitooli väga väheses koguses.
C. difficile referentstüvede kasv ksülitooli ja ampitsilliini sisaldavas söötmes.
Uuringu eesmärgiks oli jäljendada soolestiku keskkonda in vitro katses Süüria hamstritel välja töötatud C. difficile infektsiooni mudeliga sarnaselt.
Ksülitooli ja ampitsilliini mõju L. plantarum Inducia DSM 21379 ja C. Difficile referentstüvede (VPI 10463 ja hüpertoksiline tüvi M 13042, ribotüüp 027) kasvule testiti BHI söötmes in vitro.
L. plantarum Inducia DSM 21379 ja kahe C. difficile referentstüve hulk tõusis BHI puljongis (kontroll) peaaegu 2 kuni 4 logaritmi 48 tunni pikkuse inkubatsiooni järel.
Ksülitooli ja ampitsilliini lisamine ei mõjutanud C. difficile tüvede elulemust (Tabel 13).
L. plantarum Inducia DSM 21379 kasv oli alla surutud ca 2 logaritmi võrra nii 5-protsendilise ksülitooli kui 0,75 μl/ml ampitsilliini lisamisel. Seega antibiootikumi ja kuni 5-protsendilise ksülitooli lahuse manustamisel on L. plantarum Inducia elulemus soolestiku mikrokeskkonnas tagatud.
Näide 7. L. plantarum Inducia DSM 21379 ja C. difficile referentstüvede elulemus kooskultiveerimisel, ksülitooli ja ampitsilliini erinevatel kontsentratsioonidel.
Uuringu eesmärk oli hinnata L. plantarum Inducia DSM 21379 ja C. Difficile referentstüvede elulemust kooskultiveerimisel ksülitooli ja ampitsilliini erinevate kontsentratsioonide juures.
L. plantarum Inducia DSM 21379 ja C. difficile referentstüvedega inokuleeriti 5-protsendilise ksülitooli ja 0,75 μl/ml ampitsilliini lisandiga BHI sööde ja inkubeeriti anaeroobses keskkonnas (aneroobne box Concept 400, UK) 24 ja 48 tundi. L. plantarum Inducia DSM 21379, C. difficile referentstüvede VPI ja M elulemust peale kooskultiveerimist kontrolliti monokultuurina 5 protsendilise ksülitooli ja ampitsilliini lisandiga BHI söötmes (1, 2a, 2b).
Uuritavate mikroobide hulga määramiseks tehti kümnendlahjendused. L. plantarum Inducia DSM 21379 külvati MRS söötmele ja inkubeeriti mikroaeroobses keskkonnas ning C. difficile külvati LAB160 söötmele ja inkubeeriti anaeroobses keskkonnas.
L. plantarum Inducia DSM 21379 (3) C. difficile referentstüvede (4, 5) ko-kultiveerimisel ksülitooli ja ampitilliini lisandiga BHI söötmes (hamstri mudeli jäljendamine) oli C. difficile vegetatiivsete rakkude kasv inhibeeritud. VPI tüve puhul oli täielik kasv täielikult inhibeeritud ja M tüve puhul osaline kasvu inhibitsioon 5 logaritmi võrra (5,0-2,0 log PMÜ/ml).
Seega, hamstri mudelit jäljendav in vitro katse tõestas C. difficile täielikku või osalist inhibeerimist, kui manustada loomadele ainult L. plantarum Inducia DSM 21379 (tabel 5) või selle kombinatsiooni ksülitooliga (tabel 14).
Näide 8. Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 ja ksülitooli kombinatsioon inhibeerivad Clostridium difficile referentstüve VPI eoste germinatsiooni Katse eesmärgiks oli hinnata L. plantarum Inducia DSM 21379 võimet takistada Clostridium difficile eoste germinatsiooni L. plantarum Inducia DSM 21379 eelneval preinkubeerimisel söötmes. Kontrolliti ka ksülitooli ja taurokolaadi mõju Clostridium difficile eoste germinatsioonile. Taurokolaat on peensooles leiduv aine, mis soodustab Clostridium difficile eoste germinatsiooni.
L. plantarum Inducia DSM 21379 inkubeeriti erinevaid lisandeid sisaldavas BHI puljongis, anaeroobses keskkonnas 24 tundi. Pärast L. plantarum Inducia DSM 21379 inkubeerimist lisati Clostridium difficile eosed ning lisati kontsentreeritud BHI söödet vahekorras 1:10.
Kontrolli ja katsesegusid inkubeeriti anaeroobses keskkonnas 48 tundi. Kontroll ja katsesegud külvati Fastiodious Anaeroobne Agar söötmele (FAA) ja MRS söötmele, katse alguses, 24 tunni möödudes ja 48 tunni möödudes. Arvutati L. plantarum Inducia DSM 21379 ja Clostridium difficile hulgad.
L. plantarum Inducia DSM 21379 preinkubeerimine ksülitooli või ksülitooli ja taurokolaadi kombinatsiooniga BHI söötmes inhibeerib Clostridium difficile germinatasiooni (tabel 15). Ksülitooli ja/või taurokolaadi lisamine BHI söötmele ei mõjutanud L. plantarum Inducia DSM 21379 kasvu. Antud tulemused toetavad loomkatse tulemusi.
Näide 9. Loomkatse
Uuringu eesmärk oli hinnata L. plantarum Inducia DSM 21379 mõju referentstüve Clostridium difficile VPI 10463 eostega nakatud infektsiooniga hamstritel.
Süüria hamstrid (Mesocricetus auratus) sobivad hästi Clostridium difficile infektsiooni mudeliks. Rikkudes hamstrite käärsoole mikrofloora antibiootikumide manustamisega ja seejärel manustades loomadele C. difficile eoseid, kujuneb loomadel C. difficile kõhulahtisus vähem kui 48 tunni jooksul ja annab 100 protsendilise suremuse. Toetudes meie in vitro katsete tulemustele uurisime, kas L. plantarum Inducia DSM 21379 manustamine aitab vähendada C. difficile 'ga nakatatud hamstrite suremust. Enne ampitsilliini manustamist (30 mg/kg) manustasime hamstritele sondiga 5-1 järjestikusel päeval L. plantarum Inducia DSM 21379 suspensiooni 1010 PMÜ/ml kas 5-protsendilise ksülitooli lisandiga või ilma. L. plantarum Inducia DSM 21379 manustamist jätkasime kogu katse vältel. Hamstrid nakatad 10-30 C. difficile VPI 10463 eosega katse 7. päeval. Hamstreid jälgiti järgnevad 5 päeva ja C. difficile infektsiooni sümptomite ilmnedes: märg saba - tehti C. difficile A/B toksiini test X/pect Remel test). Kontrollgrupina kasutati C. difficile VPI tüvega nakatud hamstreid.
Seega, C. difficele eostega nakatatute seas kõrgeim ellujäämise määr oli L. plantarum Inducia DSM 21379 ja ksülitooli lahusega ette toidetud loomade grupis (tabel 16). Antud juhul olid kõik ellu jäänud hamstrite (7/9) toksiini testid negatiivsed, st C. difficile eoste germinatsioon oli alla surutud. Ainult ksülitooli manustamisel oli toksiinitest negatiivne neljal loomal ellujäänud viiest ja ainult ühel ellujäänud loomadest oli test positiivne. Seega. L. plantarum Inducia DSM 21379 ja ksülitooli kombinatsioon surub alla eoste germinatsiooni toksiini tootvateks vegetatiivseteks rakkudeks. A ja B toksiini leidumise korral kontrollisime ka C. difficile kasvu olemasolu peale Inducia ja ksülitooliga mõjutamist (Tabel 17). L. plantarum Inducia DSM 21379 ja ksülitooliga ettetoidetud ellujäänud kuuel hamstril seitsmest ei tuvastatud C. difficile vegetatiivseid rakke (ainult ühel juhul leiti C. difficile kasv) peen-ja jämesooles. Nii anaeroobide kui indigeensete laktobatsillide hulka asendav L. plantarum Inducia DSM 21379 hulk oli peen- ja jämesooles kõrge. See näitab L. plantarum Inducia DSM 21379 ja ksülitooli manustamise kasulikkust soole mikrofloora stabiliseermisel ja taastamisel peale ampitsilliini manustamist ja C. difficile eostega nakatumisel.
Hamstrite ellujäämismäär oli 22 protsenti suurem tänu L. plantarum Inducia DSM 21379 manustamisele (tabel 16). Seda tõestas ka toksiini puudumine jämesoole sisus (tabel 17).
L. plantarum Inducia DSM 21379 hulk oli kõrge tühisooles (vahemikus 0-6,0, mediaan 4,0 PMÜ logi0/g) ja niudesooles (6,0-7,6, mediaan 6,7). Tõenäoliselt toimis L. plantarum Inducia DSM 21379 happe produtseerimise ja SCFA profiil kaudu.
C. difficile 'ga nakatatud hamstrite morfoloogilised uuringud Clostridium difficile infektsiooni moduleerimiseks kasutati tüüpilist hamstri mudelit, kuna patogeneesi peamine modulaator on toksiinide poolt põhjustatud organite kahjustus. Meie katses kasutatav C. difficile VPI 10643 omab nii A kui B toksiini ning need toksiinid esinesid ka maksas ja peensooles (joonised fig 2 ja fig 3).
C. difficile infektsioonist ellujäänud hamstritel ei leitud lahkamisel ulatuslikke limaskesta kahjustusi, pseudomembraane ega polümorfonukleaarsete rakkude infiltratsiooni (joonis fig 4a).
C. difficile infektsioonist kahjustatud hamstrite surmaeelseteks iseloomulikeks leidudeks oli põletik koos polümorfonukleaaride infiltratsiooniga limaskesta ja pseudomembraanide olemasolu. Raske enterokoliit põhjustas punaliblede ja polümorfonukleaarsete leukotsüütide infiltratsiooni soole limaskesta, maksa ja põrna, põhjustades loomade surma. Elundites esines hüpereemia (joonis fig 5f).

Claims (10)

  1. 1. Probiootilist mikroorganismi tüve Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 sisaldav kompositsioon kasutamiseks kolesterooli metabolismi häirete ja nendest lähtuvate südame-veresoonkonnahaiguste ennetamiseks LDL-kolesterooli taseme vähendamise teel veres ja samaaegseks inimkeha antioksüdatiivse aktiivsuse tõstmiseks oksüdeeritud madala tihedusega lipoproteiinide (ox-LDL) taseme ning oksüdatiivse stressi indeksi (OSI) vähendamise abil.
  2. 2. Kompositsioon vastavalt punktile 1, mis on valitud rühmast, mis sisaldab farmaatsia-, toidu- või veterinaarset kompositsiooni.
  3. 3. Toiduaine, mis sisaldab kompositsiooni vastavalt punktile 1.
  4. 4. Toiduaine vastavalt punktile 3, milleks on piimatoode.
  5. 5. Toiduaine vastavalt punktile 4, milleks on fermenteeritud piimatoode.
  6. 6. Toiduaine vastavalt punktile 5, milleks on juust.
  7. 7. Toiduaine vastavalt punktile 6, milleks on jogurt.
  8. 8. Toidulisand, mis sisaldab kompositsiooni vastavalt punktile 1.
  9. 9. Farmaatsia- või veterinaariatoode, mis sisaldab kompositsiooni vastavalt punktile 1.
  10. 10. Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 kasutamiseks hüpokolestereemilise agendina kolesterooli metabolismi häirete ja südame-veresoonkonnahaiguste ennetamiseks veres LDL-kolesterooli taseme alandamise abil.
EEP201400038A 2008-05-13 2014-10-31 Hüpokolestereemilist probiootilist mikroorganismi tüve Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 sisaldav kompositsioon kasutamiseks südame-veresoonkonnahaiguste ennetamiseks EE05799B1 (et)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EEP201800005A EE05809B1 (et) 2008-05-13 2014-10-31 Probiootilist mikroorganismi tüve Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 sisaldav kompositsioon kasutamiseks Clostridium difficile põhjustatud kõhulahtisuse (CDAD) riski vähendamiseks

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/244,284 US20140335066A1 (en) 2008-05-13 2014-04-03 Lactobacillus plantarum inducia dsm 21379 as enhancer of cellular immunity, hypocholesterolemic and anti-oxidative agent and antimicrobial agent against clostridium difficile

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EE201400038A EE201400038A (et) 2015-11-16
EE05799B1 true EE05799B1 (et) 2017-10-16

Family

ID=51932160

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EEP201400038A EE05799B1 (et) 2008-05-13 2014-10-31 Hüpokolestereemilist probiootilist mikroorganismi tüve Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 sisaldav kompositsioon kasutamiseks südame-veresoonkonnahaiguste ennetamiseks

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JP2017515799A (et)
EE (1) EE05799B1 (et)
WO (1) WO2015149818A1 (et)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201519326D0 (en) * 2015-11-02 2015-12-16 Optibiotix Health Ltd Composition`
GB201611782D0 (en) * 2016-07-06 2016-08-17 Optibiotix Ltd Composition
WO2020026247A1 (en) * 2018-08-01 2020-02-06 N.M.B. Medical Applications Ltd. Orally administered supplements and methods of reducing absorption of calories and modifying the nutritional values of consumed nutrients
CN109234189A (zh) * 2018-08-17 2019-01-18 甘肃普诺贝康生物科技有限责任公司 一株具有抗氧化能力的植物乳杆菌菌株bx62及其应用
WO2020171256A1 (ko) * 2019-02-21 2020-08-27 서울대학교산학협력단 클로스트리디움 디피실레(clostridium difficile) 성장 억제효과를 갖는 락토바실러스 균주
WO2023132628A1 (ko) * 2022-01-04 2023-07-13 주식회사 바이오뱅크힐링 신규 균주, 및 그의 유래의 소포체 및 그의 항염증 및 항균 용도
KR102365420B1 (ko) * 2022-01-04 2022-02-23 주식회사 바이오뱅크힐링 로제부리아 인테스티날리스 균주, 및 그의 유래의 소포체 및 그의 항염증 및 항균 용도
CN116676239B (zh) * 2023-07-26 2023-10-27 杭州微致生物科技有限公司 一种植物乳杆菌vb165及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2080519A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-22 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Peptides having binding affinity to an antibody which recognizes an epitope on an alpha1 loop 2 or beta 2 loop 1 of an adrenoreceptor
EE05341B1 (et) * 2008-05-13 2010-08-16 O� Tervisliku Piima Biotehnoloogiate Arenduskeskus Isoleeritud mikroorganismi tvi Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 kui organismi loomulikku kaitsev?imet t?stev probiootik, seda sisaldav toiduaine ja kompositsioon ning mikroorganismi kasutamine rakulist immuunsust t?stva ravimi valmistamisek
EP2311473A1 (en) * 2009-10-09 2011-04-20 AB-Biotics Producciones Industriales De Microbiotas, S.L. Lactobacillus plantarum strains as probiotics

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017515799A (ja) 2017-06-15
EE201400038A (et) 2015-11-16
WO2015149818A1 (en) 2015-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3193895B1 (en) Lactobacillus plantarum inducia strain dsm 21379 as hypocholesterolemic agent and antimicrobial agent against clostridium difficile
EP3639834B1 (en) Use of microbial communities for human and animal health
Kondepudi et al. Prebiotic-non-digestible oligosaccharides preference of probiotic bifidobacteria and antimicrobial activity against Clostridium difficile
EE05799B1 (et) Hüpokolestereemilist probiootilist mikroorganismi tüve Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379 sisaldav kompositsioon kasutamiseks südame-veresoonkonnahaiguste ennetamiseks
Timmerman et al. Monostrain, multistrain and multispecies probiotics—A comparison of functionality and efficacy
JP4455333B2 (ja) プロバイオティック細菌：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｍｅｎｔｕｍ
Victor et al. Probiotic properties of lactobacilli strains isolated from raw cow milk in the western highlands of Cameroon
Lee Effects of diet on gut microbiota profile and the implications for health and disease
Klayraung et al. Antibacterial and antioxidant activities of acid and bile resistant strains of Lactobacillus fermentum isolated from miang
CN103491969A (zh) 恢复和重建肠道微生物群的合生素组合物
Sirilun et al. Characterisation of non human origin probiotic Lactobacillus plantarum with cholesterol-lowering property
Ashraf et al. Commercial lactic acid bacteria and probiotic strains-tolerance to bile, pepsin and antibiotics
EP3645026A1 (en) New strain of lactobacillus reuteri
US20230338441A1 (en) Lactic acid bacteria, methods and uses thereof
Bendali et al. Beneficial effects of a strain of Lactobacillus paracasei subsp. paracasei in Staphylococcus aureus-induced intestinal and colonic injury
KR101164512B1 (ko) 비피도박테리움 슈도카테눌라튬 ｓｐｍ１２０４ 유산균 또는 이의 배양물을 유효성분으로 하는 가축용 생균제 조성물
WO2024223885A1 (en) Compositions comprising bacteria consortia
WO2016060539A1 (es) Cepas de lactobacillus brevis aisladas del aguamiel con actividad sal biliar hidrolasa y metodo de aislamiento y seleccion de las mismas
KR101809616B1 (ko) 항비만효과를 가지는 케피어 유래 프로바이오틱 균주
WO2023108080A1 (en) Bacillus coagulans strain, compositions thereof, and methods of use
Zafar et al. Lacticaseibacillus rhamnosus FM9 and Limosilactobacillus fermentum Y57 Are as Effective as Statins at Improving Blood Lipid Profile in High Cholesterol, High-Fat Diet Model in Male Wistar Rats. Nutrients. 2022 Apr 15; 14 (8): 1654
Lim et al. Synergy effects by combination with lactic acid bacteria and frutooligosaccharides on the cell growth and antimicrobial activity
Abdel-Moniem et al. A Potential Probiotic Lactiplantibacillus Plantarum Isolate from Egyptian Cottage Cheese Alleviates Metabolic Syndrome Manifestations: In Vitro and In Vivo Characterization
El-Dalatony et al. Metabolized by the Host, but Would Be Harmful to Humans (eg, Causing Cancers
Narakaew et al. Preliminary characterization of Lactobacillus salivarius K7 for probiotic properties

Legal Events

Date Code Title Description
HC1A Change of owner name
GB1A Change in the ownership or in the address of the owner