[go: up one dir, main page]

EA030211B1 - Соединения на основе микрорнк и способы модулирования активности mir-21 - Google Patents

Соединения на основе микрорнк и способы модулирования активности mir-21 Download PDF

Info

Publication number
EA030211B1
EA030211B1 EA201491953A EA201491953A EA030211B1 EA 030211 B1 EA030211 B1 EA 030211B1 EA 201491953 A EA201491953 A EA 201491953A EA 201491953 A EA201491953 A EA 201491953A EA 030211 B1 EA030211 B1 EA 030211B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
nucleoside
nucleosides
modified oligonucleotide
certain embodiments
modified
Prior art date
Application number
EA201491953A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491953A1 (ru
Inventor
Балкришен Бхат
Эрик Маркуссон
Original Assignee
Регьюлэс Терапьютикс Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48289681&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA030211(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Регьюлэс Терапьютикс Инк. filed Critical Регьюлэс Терапьютикс Инк.
Publication of EA201491953A1 publication Critical patent/EA201491953A1/ru
Publication of EA030211B1 publication Critical patent/EA030211B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/343—Spatial arrangement of the modifications having patterns, e.g. ==--==--==--
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity
    • C12N2320/51—Methods for regulating/modulating their activity modulating the chemical stability, e.g. nuclease-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

В изобретении представлены композиции и способы для ингибирования активности miR-21. Композиции имеют определенные паттерны модификаций нуклеозидов, позволяющие получать сильные ингибиторы активности miR-21. Композиции можно применять для ингибирования miR-21, а также для лечения заболеваний, ассоциированных с аномальной экспрессией miR-21, таких как фиброз и рак.

Description

настоящее изобретение предусматривает способы уменьшения или предупреждения метастазирования, включающие введение субъекту соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, где модифицированный олигонуклеотид комплементарен Ш1К-21, и введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства, являющегося средством противораковой терапии.
В определенных вариантах осуществления противораковая терапия представляет собой химиотерапию. Подходящие химиотерапевтические средства включают доцетаксел, циклофосфамид, ифосфамид, метотрексат, винбластин, цисплатин, 5-фторурацил, гемцитабин, доксорубицин, митомицин С, сорафениб, этопозид, карбоплатин, эпирубицин, иринотекан и оксалиплатин. Дополнительное подходящее химиотерапевтическое средство включает олигомерное соединение, отличное от композиции, нацеленной на Ш1К-21, предусмотренной в данном документе, которое применяют для лечения рака.
В определенных вариантах осуществления противораковая терапия представляет собой радиотерапию. В определенных вариантах осуществления противораковая терапия представляет собой хирургическое удаление опухоли. В определенных вариантах осуществления средство противораковой терапии представляет собой средство, вызывающее повреждение ДНК, ингибитор пролиферации, антифолат, ингибитор рецепторов факторов роста, антиангиогенное средство, ингибитор рецепторных тирозинкиназ, ингибитор киназ, ингибитор факторов роста или цитотоксическое средство.
В определенных вариантах осуществления средство, вызывающее повреждение ДНК, представляет собой 1,3-бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевину, бусульфан, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, дакарбазин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, ломустин, мехлорэтамин, мельфалан, митомицин С, митоксантрон, оксалиплатин, темозоломид или топотекан.
В определенных вариантах осуществления антифолат представляет собой метотрексат, аминоптерин, тимидилатсинтазу, серингидроксиметилтрансферазу, фолилполиглутамилсинтетазу, гаммаглутамилгидролазу, глицинамидрибонуклеотидтрансформилазу, лейковорин, аминоимидазолкарбоксамидрибонуклеотидтрансформилазу, 5-фторурацил или переносчик фолатов.
В определенных вариантах осуществления ингибитор рецепторов факторов роста представляет собой эрлотиниб или гефитиниб.
В определенных вариантах осуществления ингибитор ангиогенеза представляет собой бевацизумаб, талидомид, карбоксиамидотриазол, ΤΝΡ-470, СМ101, ШЛ-а, тромбоцитарный фактор-4, сурамин, 8И5416, тромбоспондин, антагонист УЕОРК, ингибиторный фактор ангиогенеза, получаемый из хрящевой ткани, ингибитор матриксных металлопротеиназ, ангиостатин, эндостатин, 2-метоксиэстрадиол, текогалан, тетратиомолибдат, пролактин или линомид.
В определенных вариантах осуществления ингибитор киназ представляет собой бевацизумаб, БШХУ 2992, цетуксимаб, иматиниб, трастузумаб, гефитиниб, ранибизумаб, пегаптаниб, сорафениб, дазатиниб, сунитиниб, эрлотиниб, нилотиниб, лапатиниб, панитумумаб, вандетаниб, Е7080, пазопаниб, мубритиниб или фостаматиниб.
Некоторые последовательности микроРНК, состоящие из нуклеиновых оснований.
Модифицированные олигонуклеотиды, имеющие нуклеозидный паттерн, описанный в данном документе, имеют нуклеотидную последовательность, которая комплементарна ш1К-21 (8ЕЦ ГО ΝΟ:1) или ее предшественнику (8ЕЦ ГО ΝΟ:2). В определенных вариантах осуществления каждое нуклеиновое основание модифицированного олигонуклеотида способно подвергаться спариванию оснований с нуклеиновым основанием в каждом соответствующем положении в нуклеотидной последовательности Ш1К-21. В определенных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида может иметь одну или несколько несовпадающих пар оснований по отношению к нуклеотидной последовательности Ш1К-21 или последовательности предшественника и остается способной гибридизироваться с ее целевой последовательностью.
Поскольку последовательность ш1К-21 содержится в последовательности предшественника Ш1К-21, модифицированный олигонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную Ш1К-21, также комплементарен области предшественника Ш1К-21.
- 38 030211
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из числа связанных нуклеозидов, которое равно длине Ш1К-21.
В определенных вариантах осуществления число связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида меньше длины Ш1К-21. Модифицированный олигонуклеотид с числом связанных нуклеозидов, которое меньше длины Ш1К-21, где каждое нуклеиновое основание модифицированного олигонуклеотида является комплементарным каждому нуклеиновому основанию при соответствующем положении Ш1К-21, считается модифицированным олигонуклеотидом с нуклеотидной последовательностью, которая полностью комплементарна области последовательности ιηιΚ-21. Например, модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 19 связанных нуклеозидов, где каждое нуклеиновое основание комплементарно соответствующему положению Ш1К-21, которая состоит из 22 нуклеиновых оснований в длину, является полностью комплементарным области Ш1К-21 длиной 19 нуклеиновых оснований. Такой модифицированный олигонуклеотид имеет 100% комплементарность к части ιηίΚ-21 из 19 нуклеиновых оснований и считается, что он на 100% комплементарен ιηίΗ-21.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной затравочной последовательности, т.е. модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность, соответствующую затравочной. В определенных вариантах осуществления затравочная последовательность представляет собой затравочную последовательность из шести нуклеиновых оснований. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность является нуклеиновыми основаниями 1-6 Ш1К-21. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность является нуклеиновыми основаниями 2-7 Ш1К-21. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность является нуклеиновыми основаниями 3-8 Ш1К-21. В определенных вариантах осуществления затравочная последовательность представляет собой затравочную последовательность из семи нуклеиновых оснований. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность из семи нуклеиновых оснований является нуклеиновыми основаниями 1-7 ιηίΚ-21. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность из семи нуклеиновых оснований является нуклеиновыми основаниями 2-8 Ш1К-21. В определенных вариантах осуществления затравочная последовательность представляет собой затравочную последовательность из восьми нуклеиновых оснований. В таких определенных вариантах осуществления затравочная последовательность из восьми нуклеиновых оснований является нуклеиновыми основаниями 1-8 ιηίΚ-21. В определенных вариантах осуществления затравочная последовательность из восьми нуклеиновых оснований является нуклеиновыми основаниями 2-9 Ш1К-21.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность с одним несовпадением по отношению к нуклеотидной последовательности Ш1К-21 или ее предшественнику. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность с двумя несовпадениями по отношению к нуклеотидной последовательности ιηίΚ-21 или ее предшественнику. В таких определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность с не более двумя несовпадениями по отношению к нуклеотидной последовательности Ш1К-21 или ее предшественнику. В таких определенных вариантах осуществления несовпадающие нуклеиновые основания являются смежными. В таких определенных вариантах осуществления несовпадающие нуклеиновые основания не являются смежными.
В определенных вариантах осуществления число связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида больше длины Ш1К-21. В таких определенных вариантах осуществления нуклеиновое основание дополнительного нуклеозида является комплементарным нуклеиновому основанию последовательности Ш1К-21 со структурой типа стебель-петля. В определенных вариантах осуществления число связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида на одну единицу больше длины Ш1К-21. В таких определенных вариантах осуществления дополнительный нуклеозид находится на 5'-конце олигонуклеотида. В таких определенных вариантах осуществления дополнительный нуклеозид находится на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления число связанных нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида на две единицы больше длины Ш1К-21. В таких определенных вариантах осуществления два дополнительных нуклеозида находятся на 5'-конце олигонуклеотида. В таких определенных вариантах осуществления два дополнительных нуклеозида находятся на 3'-конце олигонуклеотида. В таких определенных вариантах осуществления один дополнительный нуклеозид расположен на 5'-конце, и один дополнительный нуклеозид расположен на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления область олигонуклеотида может быть полностью комплементарна нуклеотидной последовательности Ш1К-21, но весь модифицированный олигонуклеотид не полностью комплементарен Ш1К-21. Например, модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 24 связанных нуклеозидов, где каждое нуклеиновое основание нуклеозидов 1-22 комплементарно соответствующему положению Ш1К-21, которая состоит из 22 нуклеиновых оснований в длину, имеет часть из 22 нуклеозидов, которая полностью комплементарна нуклеотидной последовательности Ш1К-21, и приблизительно 92% общую комплементарность нуклеотидной последовательности Ш1К-21.
Некоторые модифицированные олигонуклеотиды.
- 39 030211
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 8-30 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-30 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-25 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-25 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-19 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-19 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-16 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-16 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 19-24 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 21-24 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 8 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 9 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 10 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 11 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 12 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 13 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 14 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 18 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 21 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 22 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 23 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 24 связанных нуклеозидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 25 связанных нуклеозидов.
Нуклеотидные последовательности, изложенные в данном документе, включающие без ограничения те, которые находятся в примерах и в перечне последовательностей, не зависят от любой модификации нуклеиновой кислоты. Поэтому нуклеиновые кислоты, определенные в 8ЕЦ ГО N0, могут независимо содержать одну или несколько модификаций одного или нескольких остатков сахара, одну или несколько межнуклеозидных связей и/или одного или нескольких нуклеиновых оснований.
Хотя в перечне последовательностей, прилагаемом к данной заявке, каждая нуклеотидная последовательность указывается либо как "РНК", либо "ДНК", в соответствии с требованием, на практике эти последовательности могут быть модифицированы с помощью любой комбинации химических модификаций. Специалист в данной области техники легко поймет, что такое обозначение как "РНК" или "ДНК" для описания модифицированных олигонуклеотидов носит несколько условный характер. Например, модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеозид, содержащий фрагмент сахара 2'-ОН и тиминовое основание, может быть описан как ДНК с модифицированным сахаром (2'-ОН для природного 2'-Н ДНК) или как РНК с модифицированным основанием (тимин (метилированный урацил) для природного урацила РНК).
Соответственно нуклеотидные последовательности, предусмотренные в данном документе, включая без ограничения те, которые находятся в перечне последовательностей, предназначены охватить нуклеиновые кислоты, содержащие какую-либо комбинацию природной или модифицированной РНК и/или ДНК, включая без ограничения такие нуклеиновые кислоты с модифицированными нуклеиновыми основаниями. В качестве дополнительного примера и без ограничения олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью "АТСОАТСО" охватывает любой олигонуклеотид с такой нуклеотидной последовательностью, либо модифицированной, либо немодифицированной, включая без ограничения такие соединения, содержащие РНК-основания, такие как те, которые имеют последовательность "АиСоАиСо", и те, которые имеют несколько ДНК-оснований и несколько РНК-оснований, таких как "АиСОАТСО", и олигонуклеотиды с другими модифицированными основаниями, такими как "АТтеСОАиСО," где шеС обозначает 5-метилцитозин. Подобным образом, олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью "АиСОАиСО" охватывает любые олигонуклеотиды с такой нуклеотидной последовательностью, либо модифицированной, либо немодифицированной, включая без ограничения такие соединения, содержащие ДНК-основания, такие как те, которые имеют последовательность "АТСОАТСО", и те, которые
- 40 030211
имеют несколько ДНК-оснований и несколько РНК-оснований, таких как "АИСОАТСО", и олигонуклеотиды с другими модифицированными основаниями, такими как "АТтеСОАИСО," где шеС обозначает 5метилцитозин.
Некоторые модификации.
В определенных вариантах осуществления олигонуклеотиды, предусмотренные в данном документе, могут содержать одну или несколько модификаций нуклеинового основания, сахара и/или межнуклеозидной связи, и поэтому представляют собой модифицированный олигонуклеотид. Модифицированное нуклеиновое основание, сахар и/или межнуклеозидная связь могут быть выбраны среди немодифицированных форм из-за необходимых свойств, таких как, например, повышенное клеточное поглощение, повышенное сродство в отношении других мишеней олигонуклеотидов или нуклеиновой кислоты и повышенная стабильность в присутствии нуклеазы.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит один или несколько модифицированных нуклеозидов. В таких определенных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид представляет собой стабилизирующий нуклеозид. Примером стабилизирующего нуклеозида является нуклеозид с модифицированным сахаром.
В определенных вариантах осуществления модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид с модифицированным сахаром. В таких определенных вариантах осуществления нуклеозиды с модифицированным сахаром могут дополнительно содержать природный или модифицированный фрагмент гетероциклического основания и/или природную или модифицированную межнуклеозидную связь и могут включать дополнительные модификации независимо от модификации сахара. В определенных вариантах осуществления нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 2'модифицированный нуклеозид, где сахарное кольцо модифицировано при 2' атоме углерода природной рибозы или 2'-дезоксирибозы.
В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит фрагмент бициклического сахара. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара представляет собой Ό-сахар в альфа-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара представляет собой Ό-сахар в бета-конфигурации. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара представляет собой Ь-сахар в альфаконфигурации. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара представляет собой Ь-сахар в бета-конфигурации.
В определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара содержит мостиковую группу между 2'- и 4' атомами углерода. В таких определенных вариантах осуществления мостиковая группа содержит от 1 до 8 связанных бирадикальных групп. В определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара содержит от 1 до 4 связанных бирадикальных групп. В определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара содержит 2 или 3 связанные бирадикальные группы. В определенных вариантах осуществления фрагмент бициклического сахара содержит 2 связанные бирадикальные группы. Примеры таких заместителей сахаров по 4'-2' включают без ограничения -[С(Ка)(Кь)]и-, -[С(Ка)(Кь)]и-О-, -С(КЛьЖК)-О- или -С(КаКь)-О-ЖК)-; 4'-СН2-2', 4'-(СН2)2-2', 4'-(СЩ)3-2'; 4'-(СН2)-О-2' (Ьт); 4'-(СН2)-8-2'; 4'-(СН2)2-О-2' (Ет); 4'-СН(СН3)-О-2' (сЕ!) и 4'-СН(СН2ОСНэ)-О-2', а также их аналоги (см., например, патент США № 7399845, выданный 15 июля 2008 г.); 4'-С(СН3)(СН3)-О2' и его аналоги (см., например, \УО 2009/006478, опубликованную 8 января 2009 г.); 4'-СН2-Ы(ОСН3)-2' и его аналоги (см., например, \УО 2008/150729, опубликованную 11 декабря 2008 г.); 4'-СН2-О-Ы(СН3)-2' (см., например, И8 2004/0171570, опубликованную 2 сентября 2004 г.); 4'-СН2-О-Ы(К)-2' и 4'-СН2-Ы(К)О-2'-, где каждый К независимо представляет собой Н, защитную группу или С1-С12алкил; 4'-СН2-Ы(К)О-2', где К представляет собой Н, С1-С12алкил или защитную группу (см., патент США № 7427672, выданный 23 сентября 2008 г.); 4'-СН2-С(Н)(СН3)-2' (см., например, СЬайорабЬуауа, е! а1., 1. Огд. СЬет., 2009, 74, 118-134) и 4'-СН2-С(=СН2)-2', а также его аналоги (см. опубликованную международную заявку РСТ \УО 2008/154401, опубликованную 8 декабря 2008 г.).
В определенных вариантах осуществления такие 4'-2' мостики независимо содержат 1 или 2-4 связанные группы, независимо выбранные из -[С(Ка)(КЬ)]и-, -С(Ка)=С(КЬ)-, -С(Ка)=^, -С(=^Ка)-, -С(=О)-, -С(=8)-, -О-, -81(Ка)2-, -8(=О)х- и -Ы(Ка)-;
где
х равен 0, 1 или 2; и равен 1, 2, 3 или 4;
каждый Ка и Кь независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, С1-С12алкил, замещенный С1-С12алкил, С2-С12алкенил, замещенный С2-С12алкенил, С2-С12алкинил, замещенный С2С12алкинил, С5-С20арил, замещенный С5-С20арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, С5-С7алициклический радикал, замещенный С5С7алициклический радикал, галоген, О® Μ®, 81ι, Ν3, СОО® ацил (С(=О)-Н), замещенный ацил, ΟΝ, сульфонил (8(=О)2Э1) или сульфоксил (8(=О)-Э1); и
каждый 1! и И независимо представляет собой Н, С^С^алкил, замещенный С^С^алкил, С2С12алкенил, замещенный С2-С12алкенил, С2-С12алкинил, замещенный С2-С12алкинил, С5-С20арил, заме- 41 030211
щенный С5-С20арил, ацил (С(=О)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, С1-С12аминоалкил, замещенный С1-С12аминоалкил или защитную группу.
Нуклеозиды, содержащие такие фрагменты бициклического сахара, называют бициклическими нуклеозидами или ΒΝΑ. В определенных вариантах осуществления бициклические нуклеозиды включают без ограничения (А) α-Ь-метиленокси (4'-СН2-О-2') ΒΝΑ; (В) β-Ό-метиленокси (4'-СН2-О-2') ΒΝΑ; (С) этиленокси (4'-(СН2)2-О-2') ΒΝΑ; (Ό) аминоокси (4'-СН2-О^(К)-2') ΒΝΑ; (Е) оксиамино (4'-СН2-Х(К)-О2') ΒΝΑ; (Р) метил(метиленокси) (4'-СН(СН3)-О-2') ΒΝΑ (также называемый связанный этил или сЕД (О) метилен-тио (4'-СН2-8-2') ΒΝΑ; (Н) метилен-амино (4'-СН2^(К)-2') ΒΝΑ; (I) метил-карбоциклический (4'-СН2-СН (СН3)-2') ΒΝΑ; (I) с-МОЕ (4'-СН2-ОМе-2') ΒΝΑ и (К) пропилен-карбоциклический (4'-(СН2)3-
где Вх представляет собой фрагмент нуклеинового основания, и К независимо представляет собой Н, защитную группу или С1-С12алкил.
В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'замещающую группу, выбранную из галогена, аллила, амино, азидо, 8Н, СК, ОСН СР3, ОСР3, О-, 8- или ^Кт)-алкила; О-, 8- или ^КД-алкенила; О-, 8- или Ν (Кт)-алкинила; О-алкиленил-О-алкила, алкинила, алкарила, аралкила, О-алкарила, О-аралкила, О(СН2)28СН3, О-ДНД-О-^КД^) или О-СН2-С(=О)ЖКт)(Кп), где каждый Кт и Кп независимо представляет собой Н, защитную аминогруппу или замещенный или незамещенный С1-С10алкил. Такие 2'-замещающие группы могут быть дополнительно замещены одной или несколькими замещающими группами, независимо выбранными из гидроксила, амино, алкокси, карбокси, бензила, фенила, нитро ^ОД тиола, тиоалкокси (8-алкила), галогена, алкила, арила, алкенила и алкинила.
В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'замещающую группу, выбранную из Р, ΝΙΙ2, Ν3, ОСР3, О-СН3, О(СН2)^Н2, СН2-СН=СН2, О-СН2СН=СН2, ОСН2СН2ОСН3, О(СН2)28СН3, О-(СН2)2-О-ЬГ(Кт)(Кп), О(СН2)2О(СН2)2Ы(СН3)2 и Ν-замещенного ацетамида (О-СН^СДОХ^К^КД где каждый Кт и Кп независимо представляет собой Н, защитную аминогруппу или замещенный или незамещенный С1-С10алкил.
В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'замещающую группу, выбранную из Р, ОСР3, О-СН3, ОСН2СН2ОСН3, 2'-О(СН2)28СН3, О-(СН2)2-ОО(СН2)2О(СН2)2Ы(СН3)2 и О-СН2-С(=ОЖН)СН3.
В определенных вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'замещающую группу, выбранную из Р, О-СН3 и ОСН2СН2ОСН3.
В определенных вариантах осуществления нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 4'-тио-модифицированный нуклеозид. В определенных вариантах осуществления нуклеозид с модифицированным сахаром представляет собой 4'-тио-2'-модифицированный нуклеозид. 4'-Тиомодифицированный нуклеозид содержит β-Ό-рибонуклеозид, где 4'-О заменен на 4'-8. 4'-Тио-2'модифицированный нуклеозид представляет собой 4'-тио-модифицированный нуклеозид, содержащий 2'-ОН, замененный 2'-замещающей группой. Подходящие 2'-замещающие группы включают 2'-ОСН3, 2'О-(СН2) 2-ОСН3 и 2'-Р.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит одну или несколько межнуклеозидных модификаций. В таких определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь содержит атом фосфора.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит по мень- 42 030211
шей мере одну фосфотиоатную межнуклеозидную связь. В определенных вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
В определенных вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь не содержит атом фосфора. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется межнуклеозидной связью на основе короткоцепочечного алкила. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется межнуклеозидной связью на основе циклоалкила. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется смешанной межнуклеозидной связью на основе гетероатома и алкила. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется смешанной межнуклеозидной связью на основе гетероатома и циклоалкила. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными межнуклеозидными связями. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь образуется одной или несколькими гетероциклическими межнуклеозидными связями. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь имеет амидный скелет. В таких определенных вариантах осуществления межнуклеозидная связь содержит смешанные составные части на основе Ν, О, 8 и СН2.
В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит одно или несколько модифицированных нуклеиновых оснований. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит один или несколько 5-метилцитозинов. В определенных вариантах осуществления каждый цитозин модифицированного олигонуклеотида содержит 5метилцитозин.
В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 5-гидроксиметил-цитозина, 7-деазагуанина и 7-деазааденина. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 7-деазааденина, 7-деазагуанозина, 2аминопиридина и 2-пиридона. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 5-замещенных пиримидинов, 6-азапиримидинов и Ν-2, Ν-6 и О-6 замещенных пуринов, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.
В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание содержит полициклический гетероцикл. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание содержит трициклический гетероцикл. В определенных вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание содержит производное феноксазина. В определенных вариантах осуществления феноксазин может быть дополнительно модифицирован с образованием нуклеинового основания, известного из уровня техники как О-с1атр.
Некоторые фармацевтические композиции.
В данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие олигонуклеотиды. В определенных вариантах осуществления такие фармацевтические композиции применяют для лечения фиброза, заболевания почек и рака. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предусмотренная в данном документе, содержит соединение, описанное в данном документе.
Подходящие пути введения включают без ограничения пероральный, ректальный, чресслизистый, интестинальный, энтеральный, местный, в виде суппозиториев, посредством ингаляции, интратекальный, интракардиальный, интравентрикулярный, интраперитонеальный, интраназальный, интраокулярный, внутриопухолевый и парентеральный (например, внутривенный, внутримышечный, внутримозговой и подкожный). В определенных вариантах осуществления фармацевтические препараты для интратекального введения применяют для достижения локальных, а не системных воздействий. Например, фармацевтические композиции могут вводить непосредственно на участок необходимого эффекта (например, в печень или почку).
В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию вводят в форме единицы дозирования (например, таблетки, капсулы, болюса и т.п.). В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат модифицированный олигонуклеотид при дозе в пределах диапазона, выбранного из 25-800 мг, 25-700 мг, 25-600 мг, 25-500 мг, 25-400 мг, 25-300 мг, 25-200 мг, 25-100 мг, 100-800 мг, 200-800 мг, 300-800 мг, 400-800 мг, 500-800 мг, 600-800 мг, 100-700 мг, 150-650 мг, 200600 мг, 250-550 мг, 300-500 мг, 300-400 мг и 400-600 мг. В определенных вариантах осуществления такие фармацевтические композиции содержат модифицированный олигонуклеотид в дозе, выбранной из 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265,
270, 270, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375,
380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485,
490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595,
600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705,
710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795 и 800 мг. В таких определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит дозу модифицированно- 43 030211
го олигонуклеотида, выбранную из 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700 и 800 мг.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическим средством является стерильный лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид, который перерастворяют подходящим растворителем, например стерильной водой для инъекций или стерильным солевым раствором для инъекций. Перерастворенный продукт вводят в виде подкожной инъекции или в виде внутривенной инфузии после разбавления в солевом растворе. Продукт лиофилизированного лекарственного средства состоит из модифицированного олигонуклеотида, который был приготовлен в воде для инъекций или в солевом растворе для инъекций, доведенный до рН 7,0-9,0 с помощью кислоты или основания во время приготовления, и затем лиофилизирован. Лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид может составлять 25-800 мг олигонуклеотида. Понятно, что диапазон включает 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775 и 800 мг
модифицированного лиофилизированного олигонуклеотида. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид представляет собой количество олигонуклеотида в пределах диапазона, выбранного из 25-800 мг, 25-700 мг, 25-600 мг, 25-500 мг, 25-400 мг, 25-300 мг, 25-200 мг, 25-100 мг, 100-800 мг, 200-800 мг, 300-800 мг, 400-800 мг, 500-800 мг, 600-800 мг, 100-700 мг, 150-650 мг, 200-600 мг, 250-550 мг, 300-500 мг, 300-400 мг и 400-600 мг. Продукт лиофилизированного лекарственного средства может быть упакован в 2 мл флакон типа I из прозрачного стекла (обработанный сульфатом аммония), закрытый пробкой из бромбутиловой резины и уплотненный алюминиевой крышкой РЫР-ОЕЕ®.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, обеспеченные в данном документе, могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, традиционно находящиеся в фармацевтических композициях, при их уровнях применения, установленных в области техники. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически-активные материалы, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, или может содержать дополнительные материалы, применяемые при физическом составлении различных лекарственных форм композиций согласно настоящему изобретению, такие как красители, ароматизирующие средства, консерванты, антиоксиданты, замутняющие средства, загустители и стабилизаторы. Однако такие материалы при добавлении не должны чрезмерно препятствовать биологическим активностям компонентов композиции настоящего изобретения. Составы могут стерилизовать и при необходимости смешивать с вспомогательными средствами, например смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими средствами, эмульгаторами, солями, влияющими на осмотическое давление, буферами, красящими веществами, отдушками и/или ароматическими веществами и т.п., которые не оказывают вредного воздействия на олигонуклеотид(ы) состава.
Липидные фрагменты применялись при различных видах терапии нуклеиновыми кислотами в разнообразных способах. В одном способе нуклеиновую кислоту вводят в предварительно сформированные липосомы или липоплексы, полученные из смесей катионных липидов и нейтральных липидов. В другом способе ДНК-комплексы с моно- или поликатионными липидами образуются без присутствия нейтральных липидов. В определенных вариантах осуществления липидный фрагмент выбирают для повышения распределения фармацевтического средства в определенной клетке или ткани. В определенных вариантах осуществления липидный фрагмент выбирают для повышения распределения фармацевтического средства в жировой ткани. В определенных вариантах осуществления липидный фрагмент выбирают для повышения распределения фармацевтического средства в мышечной ткани.
В определенных вариантах осуществления ЮТКАЫРГО применяют для получения фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотид. ШгаНрШ является жировой эмульсией, полученной для внутривенного введения. В ее составе содержится 10% соевого масла, 1,2% фосфолипидов яичного желтка, 2,25% глицерина и вода для инъекций. К тому же гидроксид натрия добавляли для доведения рН так, чтобы конечный рН продукт находился в диапазоне 6-8,9.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит соединение полиамина или липидный фрагмент, образующий комплекс с нуклеиновой кислотой. В определенных вариантах осуществления такие препараты содержат одно или несколько соединений, каждое в отдельности имеющее структуру, определенную формулой (Ζ), или их фармацевтически приемлемую соль
где каждый Ха и Хь для каждого случая независимо представляют собой С1-6алкилен; η равно 0, 1, 2, 3, 4 или 5; каждый К независимо представляет собой Н, где по меньшей мере п+2 К-фрагментов по меньшей мере в приблизительно 80% молекул соединения формулы (Ζ) в препарате не является Н; т равно 1, 2, 3 или 4; Υ представляет собой О, ΝΚ2 или 8; К1 представляет собой алкил, алкенил или алкинил; каждый из которых необязательно замещен один или несколькими заместителями; и К2 представля- 44 030211
ет собой Н, алкил, алкенил или алкинил; каждый из которых необязательно замещен одним или несколькими заместителями; при условии, что если η=0, тогда по меньшей мере η+3 К-фрагментов не являются Н. Такие препараты описаны в публикации РСТ \УО 2008/042973, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме для раскрытия липидных препаратов. Некоторые дополнительные препараты описаны в Акте с1 а1., ΝαΙιιΐΌ Βίοίοαίιηοίοβν 26, 561-569 (1 мая 2008 г.), которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме для раскрытия липидных препаратов.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции, обеспеченные в данном документе, содержат один или несколько модифицированных олигонуклеотидов и один или несколько наполнителей. В таких определенных вариантах осуществления наполнители выбирают из воды, солевых растворов, спирта, полиэтиленгликолей, желатина, лактозы, амилазы, стеарата магния, талька, кремниевой кислоты, вязкого парафина, гидроксиметилцеллюлозы и поливинилпирролидона.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию, предусмотренную в данном документе, получают с использованием известных способов, включая без ограничения способы смешивания, растворения, гранулирования, получения драже, отмучивания, эмульгирования, помещения в капсулы, захватывания или таблетирования.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предусмотренная в данном документе, представляет собой жидкость (например, суспензию, крепкий настой и/или раствор). В таких определенных вариантах осуществления жидкую фармацевтическую композицию получают с использованием ингредиентов, известных из уровня техники, включая без ограничения воду, гликоли, масла, спирты, ароматизирующие средства, консерванты и красящие вещества.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предусмотренная в данном документе, представляет собой твердое вещество (например, порошок, таблетку и/или капсулу). В таких определенных вариантах осуществления твердую фармацевтическую композицию, содержащую один или несколько олигонуклеотидов, получают с использованием ингредиентов, известных из уровня техники, включая без ограничения крахмалы, сахара, разбавители, гранулирующие средства, смазывающие вещества, связующие и средство для улучшения распадаемости таблеток.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предусмотренная в данном документе, составлена в виде депо-препарата. Некоторые такие депо-препараты, как правило, являются длительно действующими по сравнению с препаратами, не относящимися к депо-препаратам. В определенных вариантах осуществления такие препараты вводят путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. В определенных вариантах осуществления депо-препараты получают с использованием подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, эмульсия в подходящем масле), или ионообменных смол, или в виде труднорастворимых производных, например в виде труднорастворимой соли.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, обеспеченная в данном документе, содержит систему доставки. Примеры систем доставки включают без ограничения липосомы и эмульсии. Некоторые системы доставки применяют для получения некоторых фармацевтических композиций, включая такие, которые содержат гидрофобные соединения. В определенных вариантах осуществления используют некоторые органические растворители, например диметилсульфоксид.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предусмотренная в данном документе, содержит одну или несколько тканеспецифических молекул для доставки, разработанных для доставки одного или нескольких фармацевтических средств согласно настоящему изобретению к конкретному типу ткани или клетки. Например, в определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции включают липосомы, покрытые тканеспецифическим антителом.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предусмотренная в данном документе, содержит систему сорастворителей. Некоторые такие системы сорастворителей содержат, например, бензиловый спирт, неполярное поверхностно-активное вещество, водорастворимый органический полимер и водную фазу. В определенных вариантах осуществления такую систему сорастворителей применяют для гидрофобных соединений. Неограничивающим примером такой системы сорастворителей является система сорастворителей ΥΡΌ, которая представляет собой раствор абсолютного этанола, содержащего 3% вес./об. бензилового спирта, 8% вес./об. неполярного поверхностно-активного вещества Ро1у8ОгЬа!е 80™ и 65% вес./об. полиэтиленгликоля 300. Пропорции таких систем сорастворителей можно существенно варьировать без значительного изменения их характеристик растворимости и токсичности. Кроме того, можно варьировать вид компонентов сорастворителей, например вместо Ро1у5ОгЬа1е 80™ можно применять другие поверхностно-активные вещества; можно варьировать размер фракции полиэтиленгликоля; полиэтиленгликоль можно заменять другими биосовместимыми полимерами, например поливинилпирролидоном; а также декстрозу можно заменять на другие сахара или полисахариды.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предусмотренная в данном документе, содержит систему замедленного высвобождения. Неограничивающий пример такой системы замедленного высвобождения представляет собой полупроницаемую матрицу из твердых гидро- 45 030211
фобных полимеров. В определенных вариантах осуществления системы замедленного высвобождения могут в зависимости от их химической природы высвобождать фармацевтические средства в течение часов, дней, недель или месяцев.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию, предусмотренную в данном документе, получают для перорального введения. В таких определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию составляют путем комбинирования одного или нескольких соединений, содержащих модифицированный олигонуклеотид, с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Такие определенные носители позволяют составлять фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, паст, суспензий и т.п. для перорального приема внутрь субъектом. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального применения получают путем смешивания олигонуклеотида и одной или нескольких сред. Подходящие среды включают без ограничения наполнитель, такой как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы, такие как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовую камедь, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, натрий карбоксиметилцеллюлозу и/или поливинилпирролидон (ΡνΡ). В определенных вариантах осуществления такая смесь необязательно является измельченной, и необязательно добавляют вспомогательное средство. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции образуют с получением таблеток или ядер драже. В определенных вариантах осуществления добавляют средства для улучшения распадаемости таблеток (например, поперечносшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновую кислоту или ее соль, такую как альгинат натрия).
В определенных вариантах осуществления на ядрах драже предусматривается покрытие. В таких определенных вариантах осуществления могут применять концентрированные сахарные растворы, которые необязательно могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, карбопол-гель, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы глазури и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В таблетки или покрытия драже могут добавлять красящие вещества или пигменты.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального введения находятся в твердых капсулах, изготовленных из желатина. Некоторые такие твердые капсулы содержат одно или несколько фармацевтических средств согласно настоящему изобретению в смеси с одной или несколькими средами для лекарства, такими как лактоза, связующими, такими как крахмалы, и/или смазывающими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно стабилизаторами. В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального введения находятся в мягких герметизированных капсулах, изготовленных из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. В некоторых мягких капсулах одно или несколько фармацевтических средств согласно настоящему изобретению растворяют или суспендируют в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, вазелиновое масло или жидкие полиэтиленгликоли. К тому же можно добавлять стабилизаторы.
В определенных вариантах осуществления, фармацевтические композиции получают для буккального введения. Некоторые такие фармацевтические композиции представляют собой таблетки или пастилки, составленные традиционным способом.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическую композицию получают для введения путем инъекции (например, внутривенный, подкожный, внутримышечный и т.д.). В таких определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит носитель и составлена в водном растворе, таком как вода или физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хенкса, раствор Рингера, или физиологический солевой буфер. В определенных вариантах осуществления включают другие ингредиенты (например, ингредиенты, которые способствуют растворимости или служат в качестве консервантов). В определенных вариантах осуществления инъецируемые суспензии получают с применением подходящих жидких носителей, суспендирующих средств и т.п. Некоторые фармацевтические композиции для инъекций представлены в стандартной лекарственной форме, например в ампулах или в многодозовых контейнерах. Некоторые фармацевтические композиции для инъекций являются суспензиями, растворами или эмульсиями в масляных или водных средах и могут содержать средства для составления, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. Некоторые растворители, подходящие для применения в фармацевтической композиции для инъекций включают без ограничения липофильные растворители и жирные масла, такие как кунжутное масло, сложные эфиры синтетической жирной кислоты, такие как этилолеат или триглицериды, и липосомы. Водная суспензии для инъекции может содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как натрий карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно такие суспензии могут также содержать подходящие стабилизаторы или средства, которые повышают растворимость фармацевтических средств, что позволяет получение высококонцентрированных растворов.
В определенных вариантах осуществления получают фармацевтическую композицию для чресслизистого введения. В таких определенных вариантах осуществления применяют в составе смачивающие средства, соответствующие барьеру, через который они проходят. Такие смачивающие средства, как
- 46 030211
правило, известны из уровня техники.
В определенных вариантах осуществления получают фармацевтическую композицию для введения путем ингаляции. Некоторые из таких фармацевтических композиций для ингаляции получают в форме аэрозоля в упаковке, находящейся под давлением, или распылителя. Некоторые из таких фармацевтических композиций содержат распыляющее средство, например дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, диоксид углерода или другой подходящий газ. В определенных вариантах осуществления при применении аэрозоля, находящегося под давлением, единица дозирования может определяться с помощью клапана, который доставляет измеренное количество. В определенных вариантах осуществления могут быть составлены капсулы и гильзы для применения в ингаляторе или инсуффляторе. Некоторые из таких составов содержат порошкообразную смесь фармацевтического средства согласно настоящему изобретению и подходящий порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.
В определенных вариантах осуществления получают фармацевтическую композицию для ректального введения, например суппозиторий или удерживающую клизму. Некоторые из таких фармацевтических композиций содержат известные ингредиенты, такие как масло какао и/или другие глицериды.
В определенных вариантах осуществления получают фармацевтическую композицию для местного применения. Некоторые из таких фармацевтических композиций содержат мягкие увлажняющие основы, такие как мази или кремы. Иллюстративный пример подходящих мазевых основ включает без ограничения вазелин, вазелин с летучими силиконами, а также ланолин и воду в масляных эмульсиях. Иллюстративный пример подходящих основ на основе крема включает без ограничения кольдкрем и гидрофильную мазь.
В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предусмотренная в данном документе, содержит модифицированный олигонуклеотид в терапевтически эффективном количестве. В определенных вариантах осуществления терапевтически эффективное количество является достаточным для предупреждения, облегчения или улучшения течения симптомов заболевания или для продления выживания субъекта, подвергающегося лечению. Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах возможности специалистов в данной области техники.
В определенных вариантах осуществления один или несколько модифицированных олигонуклеотидов, предусмотренных в данном документе, составляют в виде пролекарства. В определенных вариантах осуществления при введении ίη νίνο пролекарства химически превращаются в биологически, фармацевтически или терапевтически более активную форму олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления применяют пролекарства, поскольку они являются более простыми для введения, чем соответствующая активная форма. Например, в некоторых случаях пролекарство может быть более биодоступным (например, посредством перорального введения), чем соответствующая активная форма. В некоторых случаях пролекарство может обладать улучшенной растворимостью по сравнению с соответствующей активной формой. В определенных вариантах осуществления пролекарства менее водорастворимы, чем соответствующая активная форма. В некоторых случаях такие пролекарства обладают превосходной передачей через клеточные мембраны, где водорастворимость пагубно воздействует на подвижность. В определенных вариантах осуществления пролекарство представляет собой сложный эфир. В таких определенных вариантах осуществления сложный эфир метаболически гидролизуется в карбоновую кислоту при введении. В определенных случаях карбоновая кислота, содержащаяся в соединении, находится в соответствующей активной форме. В определенных вариантах осуществления пролекарство содержит короткий пептид (полиаминокислоту), связанный с кислотной группой. В таких определенных вариантах осуществления пептид расщепляется при введении с образованием соответствующей активной формы.
В определенных вариантах осуществления пролекарство получают путем модифицирования фармацевтически активного соединения так, чтобы активное соединение образовывалось при введении ίη νίνο. Пролекарство может быть разработано, чтобы изменять метаболическую стабильность или транспортные характеристики лекарственного средства, защитить от побочных эффектов или токсичности, для улучшения аромата лекарственного средства или изменения других характеристик или свойств лекарственного средства. В силу знания фармакодинамических процессов и метаболизма лекарственного средства ίη νίνο специалист в данной области техники, как только фармацевтически активное соединение стало известно, может разработать пролекарства соединения (см., например, №дгабу (1985) Μеά^с^ηа1 СЬет181гу А БюсНетюа! АрргоасН, ОхГогб Иптуегейу Рге88, №\ν Уогк, радек 388-392).
Некоторые пути введения.
В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает парентеральное введение. В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает внутривенное введение. В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает подкожное введение.
В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает внутриартериальное введение. В определенных вариантах осуществления введение субъекту включает интракардиальное введение. Подходящие средства для интракардиального введения включают применение катетера или введение во время операции на открытом сердце. В определенных вариантах осуществления введение включает применение стента.
В определенных вариантах осуществления введение включает легочное введение. В определенных
- 47 030211
вариантах осуществления легочное введение включает доставку олигонуклеотида в виде аэрозоля в легкое субъекта путем ингаляции. После ингаляции субъектом олигонуклеотида в виде аэрозоля олигонуклеотид распределяется в клетках как нормальной, так и воспаленной легочных тканей, включая альвеолярные макрофаги, эозинофилы, эпителий, эндотелий кровеносных сосудов и эпителий бронхиолы. Подходящее устройство для доставки фармацевтической композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, включает без ограничения стандартное распылительное устройство. Составы и способы модуляции размера капель при применении распылительных устройств для нацеливания на конкретные участки дыхательного пути и легких хорошо известны специалистам в данной области техники. Дополнительные подходящие устройства включают ингаляторы сухого порошка или ингаляторы отмеренных доз.
В определенных вариантах осуществления фармацевтические композиции вводят для достижения локальных, а не системных воздействий. Например, при легочном введении фармацевтическую композицию доставляют в легкое с минимальным системным воздействием.
Дополнительные подходящие пути введения включают без ограничения пероральный, ректальный, чресслизистый, интестинальный, энтеральный, местный, трансдермальный, посредством суппозиториев, интратекальный, интравентрикулярный, интраперитонеальный, интраназальный, интраокулярный, внутримышечный, внутримозговой и внутриопухолевый.
Некоторые соединения.
В данном документе предусмотрены соединения, содержащие модифицированный олигонуклеотид с определенными нуклеозидными паттернами, и применения таких соединений для модуляции активности, уровня или экспрессии целевой нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах осуществления соединение содержит олигонуклеотид. В таких определенных вариантах осуществления соединение состоит из олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид. В определенных вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид является комплементарным небольшой некодирующей РНК. В определенных вариантах осуществления небольшая некодирующая РНК представляет собой ιηίΚ-21.
В таких определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, гибридизированный с комплементарной цепью, т. е. соединение содержит двухцепочечное олигомерное соединение. В определенных вариантах осуществления при гибридизации модифицированного олигонуклеотида с комплементарной цепью образуется по меньшей мере один тупой конец. В таких определенных вариантах осуществления гибридизация модифицированного олигонуклеотида с комплементарной цепью образует тупой конец на каждом конце двухцепочечного олигомерного соединения. В определенных вариантах осуществления конец модифицированного олигонуклеотида содержит один или несколько дополнительных связанных нуклеозидов по отношению к количеству связанных нуклеозидов комплементарной цепи. В определенных вариантах осуществления один или несколько дополнительных нуклеозидов находятся на 5'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления один или несколько дополнительных нуклеозидов находятся на 3'-конце олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одно нуклеиновое основание нуклеозида одного или нескольких дополнительных нуклеозидов комплементарно целевой РНК. В определенных вариантах осуществления каждое нуклеиновое основание каждого одного или нескольких дополнительных нуклеозидов комплементарно целевой РНК. В определенных вариантах осуществления конец комплементарной цепи содержит один или несколько дополнительных связанных нуклеозидов по отношению к количеству связанных нуклеозидов олигонуклеотида. В определенных вариантах осуществления один или несколько дополнительных связанных нуклеозидов находятся на 3'-конце комплементарной цепи. В определенных вариантах осуществления один или несколько дополнительных связанных нуклеозидов находятся на 5'конце комплементарной цепи. В определенных вариантах осуществления два дополнительных связанных нуклеозида являются связанными с концом. В определенных вариантах осуществления один дополнительный нуклеозид является связанным с концом.
В определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, сопряженный с одним или несколькими фрагментами, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение полученных в результате антисмысловых олигонуклеотидов. В таких определенных вариантах осуществления фрагмент представляет собой фрагмент холестерина. В определенных вариантах осуществления фрагмент представляет собой липидный фрагмент. Дополнительные фрагменты для конъюгации включают карбогидраты, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флюоресцеины, родамины, кумарины и красители. В определенных вариантах осуществления сопряженная группа присоединена непосредственно к олигонуклеотиду. В определенных вариантах осуществления сопряженная группа присоединена к модифицированному олигонуклеотиду с помощью связывающего фрагмента, выбранного из амино, гидроксила, карбоновой кислоты, тиола, ненасыщенностей (например, двойных или тройных связей), 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты (ΑΌ0), сукцинимидил-4-Щ-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (8МСС), 6аминогексановой кислоты (АНЕХ или ΑΗΑ), замещенного С^С^алкила, замещенного или незамещенного С2-С10алкенила и замещенного или незамещенного С2-С10алкинила. В таких определенных вариантах
- 48 030211
осуществления замещающая группа выбрана из гидроксила, амино, алкокси, карбокси, бензила, фенила, нитро, тиола, тиоалкокси, галогена, алкила, арила, алкенила и алкинила.
В таких определенных вариантах осуществления соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, содержащий одну или несколько стабилизирующих групп, которые присоединены к одному или обоим концам модифицированного олигонуклеотида, для улучшения свойств, таких как, например, стабильность по отношению к воздействию нуклеазы. Включенные стабилизирующие группы являются сар-структурами. Такие концевые модификации защищают модифицированный олигонуклеотид от экзонуклеазного разрушения и могут помочь при доставке и/или локализации в пределах клетки. Сар может присутствовать на 5'-конце (5'-сар) или на 3'-конце (3'-сар) или может присутствовать на обоих концах. Сар-структуры включают, например, инвертированные деоксиабазические сар.
Подходящие сар-структуры включают 4',5'-метилен-нуклеотид, 1-(бета-Э-еритрофуранозил)нуклеотид, 4'-тио-нуклеотид, карбоциклический аналог нуклеотида, 1,5-ангидрогекситол-нуклеотид, Ьнуклеотид, альфа-нуклеотид, нуклеотид с модифицированным основанием, фосфородитиоатную связь, трео-пентафуранозил-нуклеотид, ациклический 3',4'-секонуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутилнуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентил-нуклеотид, 3'-3'-инвертированный фрагмент нуклеотида, 3'-3'-инвертированный абазический фрагмент, 3'-2'-инвертированный фрагмент нуклеотида, 3'-2'инвертированный абазический фрагмент, 1,4-бутандиолфосфат, 3'-фосфорамидат, гексилфосфат, аминогексилфосфат, 3'-фосфат, 3'-фосфотиоат, фосфородитиоат, образующий мостик фрагмент метилфосфоната и необразующий мостик фрагмент метилфосфоната, 5'-аминоалкилфосфат, 1,3-диамино-2пропилфосфат, 3-аминопропилфосфат, 6-аминогексилфосфат, 1,2-аминододецилфосфат, гидроксипропилфосфат, 5'-5'-инвертированный фрагмент нуклеотида, 5'-5'-инвертированный абазический фрагмент, 5'-фосфорамидат, 5'-фосфотиоат, 5'-амино, образующий мостик и/или необразующий мостик 5'фосфорамидат, фосфотиоат и фрагмент 5'-меркапто.
Некоторые наборы.
Настоящее изобретение также предусматривает наборы. В некоторых вариантах осуществления наборы содержат одно или несколько соединений согласно настоящему изобретению, содержащих модифицированный олигонуклеотид, где нуклеотидная последовательность олигонуклеотида комплементарна нуклеотидной последовательности т!К-21. Соединения, комплементарные шкК-21, могут содержать любой из нуклеозидных паттернов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления соединения, комплементарные шгК-21, могут находиться во флаконе. Несколько флаконов, например 10, могут находиться в, например, распределительных упаковках. В некоторых вариантах осуществления флакон изготовлен так, чтобы он был доступным для шприца. Набор также может содержать инструкции для применения соединений, комплементарных шкК-21.
В некоторых вариантах осуществления наборы могут применять для введения субъекту соединения, комплементарного шгК-21. В таких случаях дополнительно к соединению, комплементарному шгК-21, набор может дополнительно содержать одно или несколько из следующего: шприц, тампон, пропитанный спиртом, ватный шарик и/или марлевую прокладку. В некоторых вариантах осуществления соединения, комплементарные шгК-21, могут находиться в предварительно наполненном шприце (например, шприцах с разовой дозой, например, с калибром иглы 27, иглой 1/2 дюйма с колпачком иглы), вместо флакона. Несколько предварительно наполненных шприцов, например 10, могут находиться, например, в распределительных упаковках. Набор также может содержать инструкции для введения соединений, комплементарных шгК-21.
Некоторые экспериментальные модели.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает способы применения и/или тестирования модифицированных олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению на экспериментальной модели. Специалисты в данной области техники имеют возможность выбирать и модифицировать протоколы для таких экспериментальных моделей для оценки фармацевтического средства согласно настоящему изобретению.
Обычно модифицированные олигонуклеотиды сначала тестируют на культивируемых клетках. Подходящие типы клеток включают те, которые относятся к типу клеток, для которого необходима доставка модифицированного олигонуклеотида ίη νίνο. Например, подходящие типы клеток для изучения способов, описанных в данном документе, включают эмбриональные или культивируемые клетки.
В определенных вариантах осуществления степень, в которой модифицированный олигонуклеотид препятствует активности шгК-21, оценивают на культивируемых клетках. В определенных вариантах осуществления ингибирование активности микроРНК можно оценивать путем измерения уровней микроРНК. Альтернативно, можно измерять уровень предсказанного или подтвержденного микроРНКрегулируемого транскрипта. Ингибирование активности микроРНК может приводить в результате к повышению количества ш1Р-21-регулируемого транскрипта и/или белка, кодируемого ш1Р-21регулируемым транскриптом. Кроме того, в определенных вариантах осуществления можно измерять некоторые фенотипические результаты.
Несколько животных моделей доступны специалистам в данной области техники для изучения ш1К21 на моделях заболевания человека. Например, ингибиторы штК^ можно изучать на моделях рака,
- 49 030211
таких как модели ортотопического ксенотрансплантата, модели токсининдуцированного рака или модели генетически индуцированного рака. В таких моделях рака исследования могут быть проведены для оценки эффектов ингибиторов тЖ-21 в отношении размера опухоли, числа опухолей, общего выживания и/или выживания без прогрессирования заболевания.
Эффекты ингибиторов шЖ-21 в отношении сердечной функции и фиброза можно изучать на моделях зажимания дуги аорты или инфаркта миокарда, каждый из которых индуцирует отклонения сердечной функции и фиброз. Модели фиброза почек включают одностороннюю обструкцию мочеточника и ишемическое/реперфузионное повреждение. В течение ранних моментов времени модель ишемическиреперфузионного повреждения почек можно применять в качестве модели острого повреждения почек, в то время как поздние моменты времени служат в качестве модели фиброза почек. Дополнительной моделью фиброза почек является модель фиброза, индуцированного аристолохиевой кислотой. Модели фиброза печени индуцируют с помощью, например, интоксикации четыреххлористым углеродом или перевязки желчного протока. Фиброз печени также можно индуцировать при помощи диеты с дефицитом метионина и холина, которая приводит в результате к жировой дегенерации печени с ассоциированным фиброзом. Эффекты шЖ-21 в отношении фиброза легкого можно изучать, например, на модели блеомицин-индуцированного легочного фиброза или на мышах, у которых происходит сверхэкспрессия ТОР-β в легком. Модели заживления ран также доступны специалистам в данной области техники, например мыши С57В1/К81-ДЬ/ДЬ, которые проявляют несколько характеристик видов диабета зрелого возраста, таких как значительно отсроченное закрытие раны.
Дополнительная модель на животных включает модель синдрома Альпорта на мыши или собаке. Примером модели синдрома Альпорта на мыши является мыши с нокаутом гена Со14а3.
Некоторые количественные анализы.
Эффекты антисмыслового ингибирования тЖ-21 после введения модифицированных олигонуклеотидов можно оценивать с помощью разнообразных способов, известных в данной области техники. В определенных вариантах осуществления такие способы применяют для проведения количественного анализа уровней микроРНК в клетках или тканях ίη νίΐΓΟ или ίη νίνο. В определенных вариантах осуществления изменения уровней микроРНК измеряют с помощью микроматричного анализа. В определенных вариантах осуществления изменения уровней микроРНК измеряют с помощью одного из нескольких коммерчески доступных ПЦР-анализов, таких как анализ микроРНК ТацМап® (АррНеД ВюууДепъ). В определенных вариантах осуществления антисмысловое ингибирование шЖ-21 оценивают путем измерения уровня мРНК и/или белка мишени шЖ-21. Антисмысловое ингибирование шЖ-21, как правило, приводит в результате к повышению уровня мРНК и/или белка мишени микроРНК.
Анализ захвата мишени.
Модуляцию активности микроРНК с помощью анти-тЖ или имитатора микроРНК можно оценивать путем измерения захвата мишени. В определенных вариантах осуществления захват мишени измеряют с помощью определения профиля мРНК с помощью микроматричного анализа. В последовательностях мРНК, которые модулируются (активность либо повышается, либо понижается) с помощью антитЖ или имитатора микроРНК, выполняется поиск на предмет затравочных последовательностей микроРНК для сравнения модуляции мРНК, которые являются мишенями микроРНК, с модуляцией мРНК, которые не являются мишенями микроРНК. Таким образом, можно оценивать взаимодействие анти-тЖ с тЖ-21 или имитатора тЖ-21 с его мишенями. В случае анти-тЖ проводится скрининг мРНК, уровни экспрессии которых повышены, на последовательности мРНК, которые содержат затравочную последовательность, соответствующую микроРНК, с которой комплементарна анти-тЖ.
Примеры
Следующие примеры представлены для того, чтобы более полно проиллюстрировать некоторые варианты осуществления настоящего изобретения. Однако их не следует рассматривать как ограничивающие широкий объем настоящего изобретения.
Специалистам в данной области техники будет легко позаимствовать основополагающие принципы данного открытия для разработки различных соединений без отклонения от сущности настоящего изобретения.
Пример 1. Соединения на основе анти-тЖ-21.
Разрабатывали различные анти-тЖ, нацеленные на тЖ-21 и содержащие сЕРнуклеозиды, с вариациями по длине и комплементарности к тЖ-21. а также по количеству, типу и расположению модифицированных сахарных фрагментов. Соединения оценивали в отношении их ингибирующих эффектов на активность тЖ-21 в ίη νίΐΓΟ анализе с применением люциферазы.
Анализ с применением люциферазы.
Соединения оценивали в отношении ингибирующей активности шЖ-21 в анализе с применением люциферазы.
Конструкт с люциферазой в качестве датчика для выявления микроРНК сконструировали с применением рОЬ3-МС82 (Рготеда). Конструкт вводили в клетки Не1а для тестирования способности соединений на основе анти-тЖ ингибировать активность шЖ-21. В данном анализе шЖ-21, присутствующая
- 50 030211
в клетках Не1а, связывалась с распознаваемым ею сайтом(ми) в конструкте с люциферазой в качестве датчика и подавляла экспрессию люциферазы. Когда соответствующую анти-ш1К вводили в клетки, она связывалась с ш1К-21 и ослабляла подавление экспрессии люциферазы. Таким образом, в данном анализе анти-ш1К, которые являются эффективными ингибиторами экспрессии ш1К-21, будут вызывать повышение экспрессии люциферазы.
День 1.
Клетки Не1а (АТСС), стабильно трансфицированные конструктом с люциферазой, сконструированным так, что он содержал последовательность, комплементарную ш1К-21, высевали в матрасы Т-170 (ΒΓ) Та1соп) из расчета 3,5* 106 клеток/матрас. Клетки Не1а выращивали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы ^пуНгодеп).
День 2.
В каждом матрасе клетки Не1а трансфицировали при помощи 0,5 мкг плазмиды рНКЬ, применяемой для выявления (Рготеда), экспрессирующей ген КепШа, для применения при нормализации. Клетки Не1а трансфицировали с применением 20 мкл липофектамина 2000/матрас ^пуНгодеп). После 4 ч трансфекции клетки промывали с помощью ΡΒ8 и трипсинизировали. Клетки Не1а помещали из расчета 40к/лунка в 24-луночные планшеты (ΒΓ) Та1соп) и оставляли на ночь.
День 3.
Клетки Не1а трансфицировали с помощью анти-т1К с применением липофектина ^пуйгодеп) из расчета 2,5 мкл липофектина/100 нМ ΑδΟ/мл среды с пониженным содержанием сыворотки Орй-МЕМ I ^пуНгодеп) в течение 4 ч. После ΑδΟ-трансфекции клетки Не1а снова подпитывали модифицированной по способу Дульбекко средой Игла с высоким содержанием глюкозы ^пуйгодеп).
День 4.
Клетки Не1а пассивно лизировали и измеряли активность люциферазы с применением системы для анализа ПиаТЬисНегазе Керог1ег (Рготеда).
Активность люциферазы в клетках, обработанных анти-т1К-21, сравнивали с "фиктивным" лечением, при котором клетки не получали лечение анти-т1К.
Некоторые активные соединения показаны в табл. А. Модификации нуклеозидов обозначаются следующим образом: нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Ώдезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕнуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "8" означают 8-сЕ1-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь. Верхний индекс "Ме" означает 5-метильную группу при основании нуклеозида.
Таблица А
Соединения на основе анти-т1К-21
№ соединения Последовательность и химический состав (затенение указывает на 3-сЕб-нуклеозид) 3Εζ) Ю N0
36328 Мег А3 Сз ТЕ С3 и3 СЕ ае и3 А3 ае СЕ С3 ТЕ А3 5
36232 с А3 Сз Т С3 и3 С А и3 А3 А С С3 Т А3 5
36234 с Ад С3 Т С3 и3 6 А и3 А Ад с3 с Т Ад 5
36235 с А3 Сз т С3 и3 С А и3 А А3 С Сз т А3 5
36237 с А3 Сз т С3 и3 С А и3 А А с3 С3 т А3 5
Таблица В
Ингибирующая . активность соединений на основе анти-т1К-21
Обработка Концентрация олигонуклеотида (мкМ)
50 16, 7 5, 6 1,9 0, 6 0,2
36328 1,1 4,36 1,05 0, 93 0, 94 0, 98
36232 1,1 4,2 5, 22 2,37 0, 9 0,76
36234 1,02 4,4 4,96 1, 67 1,03 0,79
36235 2 6, 17 7,57 3, 01 1, 1 1, 01
36237 1,49 6, 2 4,35 1,14 0, 93 0, 99
Как показано в табл. В соединения на основе анти-т1К-21 из табл. А ингибировали активность т1К21 1п У11го в анализе с применением люциферазы. Эти активные соединения отбирали для дальнейшего тестирования на т У1уо модели фиброза почки.
Модель ииО фиброза.
Односторонняя обструкция мочеточника (ϋϋΟ) представляет собой устойчивую экспериментальную модель повреждения почек, приводящую к интерстициальному фиброзу, и, таким образом, ее применяют в качестве экспериментальной модели, которая отражает заболевание почек человека. ϋϋΟ индуцируют при помощи хирургического лигирования одного мочеточника. Поскольку фиброз характеризуется повышением уровня коллагена, наличие и степень фиброза почек можно определять путем измерения содержания коллагена. Для оценки содержания коллагена измеряют как уровень коллагена 1А1
- 51 030211
(Со1 1А1), так и уровень коллагена 3А1 (Со1 3А1). Дополнительным индикатором фиброза является процентная доля ткани почек, которая проявляет экспрессию коллагена, после процедуры ϋϋΟ. Эту 'долю площади коллагена' измеряют гистологически при помощи количественного анализа площади ткани почек при обработке изображения, которую окрашивают в красный цвет с помощью окрашивающего средства пикросириуса красного; процент окрашенной красным нормализовали к площади среза почки. Фиброз почек может также наблюдаться путем измерения в образце количества гидроксипролина, который является основным компонентом коллагена.
сЕ!-содержащие соединения на основе анти-ш1К-21 36232, 36234, 36235, 36237 и 36328 тестировали на модели ϋϋΟ фиброза почек. Группу из животных обрабатывали следующим образом: только ϋϋΟ (η=4), ϋϋΟ с РВВ (η=8) или ϋϋΟ с соединением на основе анти-ш1К-21 (п=7-8). Что касается дня процедуры ϋϋΟ, РВВ или соединение на основе анти-ш1К-21 вводили в день -4, -2, 0 и +3. Соединения на основе анти-ш1К-21 вводили при дозе 20 мг/кг. Поскольку соединения на основе анти-ш1К вводили до процедуры ϋϋΟ, данный режим дозирования считается профилактическим лечением. В день 11 животных умерщвляли и извлекали почку для измерения экспрессии коллагена. Экспрессию коллагена измеряли с помощью ПЦР в реальном времени и нормализовали сперва относительно ОАРИИ, а затем относительно контрольных животных с обработкой плацебо. Статистическую значимость определяли согласно однофакторному дисперсионному анализу. Как показано на фиг. 1, обработка с помощью 36232 и 36328 снижала экспрессию коллагена 1А1 (фиг. 1А) и коллагена 3А1 (фиг. 1В) статистически значимым образом относительно животных, обработанных плацебо. Несмотря на то, что они были активными ингибиторами Ш1К-21 ΐη νίΐΓο, соединения 36234, 36235 и 36237 не приводили в результате к статистически значимому снижению экспрессии коллагена ιη νΐνο.
Эти результаты демонстрируют, что 36328 и 36232 являются средствами-кандидатами для лечения или предупреждения фиброза, включая фиброз почек.
Хотя соединения 36328 и 36232 имеют идентичное расположение В-сЕ!-нуклеозида и ингибируют Ш1К-21 ΐη νίΐΓο и ΐη νΐνο, они проявляют весьма отличающуюся вязкость в растворе. 36328 является высоковязким в солевом растворе, тогда как 36232 не является. Раствор с высокой вязкостью может не подходить для введения, например, путем подкожной инъекции, поскольку для помещения необходимого количества анти-ш1К будет требоваться больший объем, и большие объемы труднее вводить подкожно. Для облегчения введения средства может быть необходим раствор с малой вязкостью. С целью изменить вязкость 36328 разрабатывали варианты, показанные в табл. С. Каждое соединение тестировали в отношении активности в анализе с применением люциферазы, вязкости в воде и активности в модели ϋϋΟ.
Таблица С
36328 и родственные соединения
№ соединения Последовательность и химический состав (затенение указывает на сЕР-сахар; подчеркивание указывает на несовпадение) ЗЕО ΙΌ N0
36328 Ме^ А5 с3 ТЕ с3 и3 6Е ае и3 А3 Ае 6е С3 ТЕ А3 5
36282 Ме^, Ое А3 % Те А3 и3 Се ае и3 А3 ае сЕ С3 Те А3 11
36283 Ме^ <-Е А3 С3 Те А3 и3 А_е Ае и3 Аз Ае СЕ С3 Те А3 12
36284 Мег СЕ А3 А3 Те Сз и3 Ае ае и3 А3 ае сЕ С3 Те А3 7
36285 Мер ‘-Е А3 А3 Те С3 А3 А_е ае и3 А3 ае сЕ С3 Те А3 13
Результаты анализа с применением люциферазы показаны в табл. □ и показаны как кратное увеличение активности люциферазы относительно фиктивной трансфекции. Как показано в табл. Ό, 36283, 36284 и 36328 ингибировали активность Ш1К-21. 36282 и 36285 не были эффективными ингибиторами Ш1К-21 ΐη νίΐΓο. Ингибирующая активность 36328 из отдельного эксперимента (выше) показана для сравнения.
Таблица □
Активность анти-ш1К-21 ΐη νίΐΓο
Обработка Концентрация олигонуклеотида (мкМ)
50 16, 7 5, 6 1,9 0, 6
36282 1, 67 1,33 1,10 1,13 0,77
36283 5, 90 5, 50 3,57 2,30 0, 60
36284 5, 00 5, 03 3, 67 2,13 1,10
36285 1,27 0, 90 0,97 1,03 0, 87
36328 1, 1 4,36 1,05 0, 93 0, 94
Соединения растворяли в воде. С применением стандартных способов концентрацию олигонуклеотида рассчитывали гравиметрически (мг/г), а вязкость (сП) измеряли при помощи вискозиметра. Результаты показаны в табл. Е.
- 52 030211
ТаблицаЕ
Вязкость соединения на основе анти-т1К-21
Введение в соединение № 36382 одного несовпадения лишь незначительно снижало вязкость и значительно снижало ингибирующую активность т1К-21 в анализе с применением люциферазы. Введение в соединение 36285 трех несовпадений значительно снижало вязкость, но приводило в результате к очень слабой ингибирующей активности т1К-21 в анализе с применением люциферазы. Каждое из соединений 36283 и 36284 ингибировало тРК-21 в анализе с применением люциферазы, но они проявляли сильно отличающуюся вязкость. Соединение 36284 имело одно несовпадение в положении нуклеинового основания 3 и одно несовпадение в положении нуклеинового основания 7 и проявляло очень низкую вязкость. Соединение 36283 имело одно несовпадение в положении нуклеинового основания 3 и одно несовпадение в положении нуклеинового основания 5 и, как было обнаружено, имело высокую вязкость.
Для оценки ΐη νΐνο активности каждое соединение тестировали на модели ϋϋΟ. Группы животных обрабатывали следующим образом: плацебо-операция (η=4), ϋϋΟ с ΡΒ8 (η=8) или ϋϋΟ с соединением на основе анти-т1К-21 (η=7-8). Что касается дня процедуры ϋϋΟ, ΡΒ8 или соединение на основе антит1К-21 вводили в день -3, -1 и +5. Соединения на основе анти-т1К-21 вводили при дозе 20 мг/кг. Поскольку соединения на основе анти-тГК вводили до процедуры ϋϋΟ, данный режим дозирования считается профилактическим лечением. В день 11 животных умерщвляли, и извлекали почку для измерения экспрессии коллагена. Экспрессию коллагена измеряли с помощью ПЦР в реальном времени и нормализовали сперва относительно ΟΑΡΌΗ, а затем относительно контрольных животных с обработкой плацебо. Статистическую значимость определяли согласно однофакторному дисперсионному анализу. Как показано на фиг. 2, обработка с помощью 36283 и 36284 снижала экспрессию коллагена 1А1 (фиг. 2А) и коллагена 3А1 (фиг. 2В) статистически значимым образом относительно животных, обработанных плацебо. Соединения 36282 и 36285 не приводили в результате к статистически значимому снижению экспрессии коллагена ΐη νΐνο.
Эти результаты демонстрируют, что 36284 значительно снижало экспрессию как ^11А1, так и €/ο11Α3 и проявляло низкую вязкость в растворе.
Пример 2. Метаболическая стабильность соединения на основе анти-т1К-21.
Было обнаружено, что определенные соединения на основе анти-т1К-21 особенно чувствительны к метаболизму при участии эндонуклеазы и/или активности экзонуклеазы. Для облегчения распределения анти-тГК и продления периода полужизни необходимым свойством может оказаться повышенная стабильность ΐη νΐνο соединения на основе апй-т1К-21 в присутствии нуклеаз, и поэтому соединения с различной структурой тестировали в отношении метаболической стабильности. Тестируемые соединения включали 25923, которое, как было обнаружено, чувствительно к активности нуклеазы, и структурные варианты 25220 и 25221. Структура каждого соединения показана в табл. Ρ. Модификации нуклеозидов обозначаются следующим образом: нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Όдезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕнуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "8" означают 8-сЕГнуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
Таблица Ρ
Соединения на основе анти-тГК-21
№ соединения Последовательность и химический состав ( 5'-3' ) ЗЕ<2 ΙΌ ΝΟ
25923 С3 А Т С3 А 6 т Сд Т с А и3 А А 6 Сд Т Ад 3
25220 Сд А Т Сз Ад 6 т Сд и3 с А и3 Ад А 6 Сд из ае 3
25221 -Д-Е Сд А Т Сд А 6 т Сд т с А и3 А А 6 Сд из Ад 3
В анализе ех νΐνο 5 мкМ олигонуклеотида инкубировали в гомогенате печени (50 мг ткани на мл) в течение 24 ч при 37°С. После данной инкубации олигонуклеотид экстрагировали с помощью экстракции жидкости жидкостью (ЬЬЕ) с последующей твердофазной экстракцией (8ΡΕ). Длину и количества олигонуклеотида измеряли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии-времяпролетной масс-спектрометрии (IΙΡΓΟΤΟΡ М8). Активность нуклеазы в гомогенате ткани печени подтверждали с применением эталонных олигонуклеотидов, которые включали соединение с известной устойчивостью к активности нуклеазы, соединение, чувствительное к активности 3'-экзонуклеазы, и соединение, чувствительное к активности эндонуклеазы. Соединение внутреннего стандарта применяли для контроля эффективности экстракции. Для тестирования в отношении метаболической стабильности ΐη νΐνο соединения вводили мышам, выделяли почечную ткань, а также проводили экстракцию и обнаружение соединения,
- 53 030211
как для анализа ех νίνο. В табл. О показаны структуры соединений 25923, 25220 и 25221, а также результаты измерений стабильности.
Таблица О
Ех νίνο и ίη νίνο стабильность 25923, 25220 и 25221
Соединение 5Е<2 Ю ΝΟ Структура ех νίνο (печень) ίη νίνο (почка)
7 % Ν-1 о чЗ С ы Й Ν-1 (%)
25923 3 АЕС3АТС3АСТС3ТСАи3ААСС3ТА3 17 13 2-3 58±3 14±5
25220 3 аес 3ат с 3а3 ст с Зи 3 САи 3а3асс Зи з ае 3 0 3 67±1б 1б±б
25221 3 АЕС3АТС3АСТС3ТСАи3ААСС3изА3 3 0 3 7б±4 4±1
Как показано в табл. О, соединения 25220 и 25221 проявляли повышенную устойчивость к активности нуклеазы в обоих ех νίνο и ίη νίνο анализах.
Для оценки эффектов соединений в отношении фиброза соединения 25220 и 25221, а также 25923, тестировали на модели ииО. Каждую группу из 8 животных обрабатывали следующим образом: плацебо-операция, ииО с РВ8, ИИО с 25220, ииО с 25221 или ииО с 25923. Что касается дня процедуры ИИО, РВ8 или соединение на основе анти-ш1К-21 вводили в день -5, -3 и +3. Соединения на основе антиШ1К-21 вводили при дозе 20 мг/кг. Поскольку соединения на основе анти-ш1К вводили до процедуры ИИО, данный режим дозирования считается профилактическим лечением. В день 10 животных умерщвляли и извлекали почку для измерения экспрессии коллагена. Экспрессию коллагена измеряли с помощью ПЦР в режиме реального времени и нормализовали относительно ОАРИН.
Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 3. Экспрессия коллагена 1А1 и коллагена 3А1 показана на фиг. 3А и 3В соответственно. Введение соединения 25220 или 25221 снижало экспрессию коллагена 1А1 и коллагена 3А1 на статистически значимую величину (* - р<0,05; ** - р<0,01; *** р<0,001), также как и введение соединения 25923.
Эти результаты демонстрируют, что 25220 и 25221 значительно снижают экспрессию как Οο11Α1, так и Οο13Α1, и проявляют устойчивость к метаболизму при помощи нуклеаз.
Также тестировали метаболическую стабильность 25284. В ех νίνο анализе обнаружили только соединение полной длины. Ιη νίνο 96% обнаруженных соединений составляли соединения полной длины. Эти результаты демонстрируют, что 25284 является высокоустойчивым к активности нуклеазы.
Пример 3. Ингибирование ш1К-21 в модели ишемического/реперфузионного повреждения.
Модель одностороннего ишемического/реперфузионного повреждения (ΙΚΙ) является хорошо изученной моделью повреждения почки, которое приводит в результате к прогрессирующему интерстициальному фиброзу. Повреждение создают у мыши посредством пережатия почечной артерии на короткий период времени с последующим возобновлением кровотока. Реперфузия приводит в результате к тяжелому повреждению почки, за которым следует хроническое повреждение с фиброзом. ΙΚΙ, приводящее к хроническому повреждению, часто наблюдают у людей, таким образом модель ΙΚΙ на мышах можно применять для тестирования средств-кандидатов для лечения и/или предупреждения фиброза в случае повреждения почки.
Соединения на основе анти-ш1К-21 тестировали на модели одностороннего ΙΚΙ. Одностороннее ΙΚΙ индуцировали в течение периода времени 30 мин (день 0). Группы обработки были следующими: плацебо-процедура ΙΚΙ; ΙΚΙ с РВ8, вводимым подкожно; ΙΚΙ с соединением на основе анти-ш1К-21, вводимым внутрибрюшинно при дозе 20 мг/кг. РВ8 или соединение на основе анти-шЖ вводили в дни 5, 6 и 7 после ΙΚΙ, и животных умерщвляли в день 13. Поскольку соединение на основе анти-шЖ вводили через 5 дней после повреждения почки или позже, когда фиброз уже проявился в некоторой степени, данная схема обработки считается лечебной схемой, а не профилактической схемой.
Ткань почки собирали для анализа экспрессии коллагена 1 А1 и коллагена 3А1 и доли площади коллагена (как описано в предыдущем примере). Статистическую значимость определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Результаты показаны на фиг. 4. В данном исследовании обработка анти-шЖ-21 с использованием 36328 или 36232 давала статистически значимое снижение экспрессии Οο11α1 (фиг. 4А; * - р<0,05) и доли площади коллагена (фиг. 4С; *** - р<0,0001). Соединение 36232 снижало экспрессию Οο13α1 статистически значимым образом (фиг. 4В). Соединение 36328 снижало экспрессию Οο13α1, однако снижение не было статистически значимым (фиг. 4В).
Эти исследования демонстрируют снижение содержания коллагена после ингибирования шЖ-21 на модели острого повреждения почки. Таким образом, соединения 36232 и 36328 на основе анти-шЖ-21 представляют собой терапевтические средства для лечения фиброза в случае острого повреждения почки. Например, предупреждение или отсрочка начала развития фиброза после острого повреждения почки может предупреждать или отсрочивать начало развития фиброза и хронического заболевания почек.
Пример 4. Ингибирование шЖ-21 в модели ишемически-реперфузионного повреждения/нефрэктомии.
Модель ишемически-реперфузионного повреждения/нефрэктомии (ΙΚ/Νχ) создают у мыши посред- 54 030211
ством временного одностороннего пережатия артерии у одной почки, которое приводит к повреждению канальцев, воспалению и фиброзу, с последующим удалением второй почки в более поздний момент времени. В данной модели фаза острой почечной дисфункции пригодна для тестирования средствкандидатов для лечения острого повреждения почек (т.е. вплоть до приблизительно первых 5 дней), а более поздние фазы почечной дисфункции пригодны для модели хронического фиброза (т.е. после приблизительно первых 5 дней).
Соединения на основе анти-т1К-21 тестировали на модели IК/Nx. В качестве контрольного соединения использовали 25109 с несовпадениями 6 оснований относительно т1К-21 (АЕА8АТС8ТОТС8ТСАи8ААТА8ААЕ; 8ЕР ГО НО:14; где нуклеозиды без последующего нижнего индекса обозначают βдезоксинуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" обозначают 2'-МОЕ-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим индексом "8" обозначают 8-сЕ1-нуклеозиды; и все межнуклеозидные связи являются фосфотиоатными межнуклеозидными связями).
Односторонний ПК индуцировали в течение периода 30 мин. Группы обработки были следующими: плацебо-процедура ПК (п=8); ПК с РΒ8, вводимым подкожно (п=16); ПК с контролем с несовпадениями 25109, вводимым подкожно при дозе 20 мг/кг (п=16), и ПК с соединением 36328 на основе анти-т1К-21, вводимым подкожно при дозе 20 мг/кг (п=16). РΒ8 или анти-т1К вводили на 2, 3, 4 и 8 день после ПК. В день 8 здоровую почку извлекали с помощью нефрэктомии из каждого животного, и животных умерщвляли в день 9. Непосредственно перед умерщвлением собирали мочу путем прямой пункции мочевого пузыря.
Для оценки альбуминурии в моче от каждой мыши измеряли соотношение альбумина к креатинину в моче. Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 5 А. В данном исследовании 36328 обеспечивало статистически значимое снижение соотношения альбумина к креатинину в моче (фиг. 5А). Геометрическое среднее соотношения альбумина к креатинину в каждой группе мышей составляло 16 мкг А1Ь/мг Сг (контроль только с нефрэктомией), 127 мкг А1Ь/мг Сг ДКЖх, контроль РΒ8), 140 мкг А1Ь/мг Сг (ПК/Νχ, контроль 25109) и 30 мкг А1Ь/мг Сг (Ш/Νχ, 36328). Уровни остаточного азота мочевины и сывороточного креатинина были аналогичными у всех мышей IК/Nχ и были повышены относительно контрольных мышей только с нефрэктомией (данные не показаны).
В аналогично разработанном эксперименте соединение 36284 также тестировали в модели IК/Nχ. Односторонний ПК индуцировали в течение периода 30 мин. Группы обработки были следующими: плацебо-процедура ПК (п=7); ПК с РΒ8, вводимым подкожно (п=13), и ПК с соединением 36284 на основе анти-т1К-21, вводимым подкожно при дозе 20 мг/кг (п=19). РΒ8 или апти-тПК вводили на 2, 3, 4 и 8 день после ПК. В день 8 здоровую почку извлекали с помощью нефрэктомии из каждого животного, и животных умерщвляли в день 9. Непосредственно перед умерщвлением собирали мочу путем прямой пункции мочевого пузыря. Для оценки альбуминурии в моче от каждой мыши измеряли соотношение альбумина к креатинину в моче. Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 5В. В данном исследовании 36284 обеспечивало статистически значимое снижение соотношения альбумина к креатинину в моче.
Соединение 25220 также тестировали на модели Ш/Νχ. Односторонний Ш индуцировали в течение периода 30 мин. Группы обработки были следующими: плацебо-процедура Ш (п=7); Ш с РΒ8, вводимым подкожно (п=13), и Ш с соединением 25220 на основе анти-тШ-21, вводимым подкожно при дозе 20 мг/кг (п=19). РΒ8 или анти-тШ вводили на 2, 3, 4 и 8 день после Ш. В день 8 здоровую почку извлекали с помощью нефрэктомии из каждого животного, и животных умерщвляли в день 9. Непосредственно перед умерщвлением собирали мочу путем прямой пункции мочевого пузыря. Для оценки альбуминурии в моче от каждой мыши измеряли соотношение альбумина к креатинину в моче. Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 5С. В данном исследовании 25220 обеспечивало статистически значимое снижение соотношения альбумина к креатинину в моче.
Пример 5. Выживание мышей модели Ш/Νχ после введения соединений на основе анти-тШ-21.
Уровень выживаемости мышей модели IК/Nχ через два дня после нефрэктомии определяли в шести различных экспериментах для определения, повышает ли выживание введение соединений на основе анти-тШ-21. В первых трех экспериментах соединение на основе анти-тШ-21 вводили в дни 5, 6 и 7 после ишемически-реперфузионного повреждения, а нефрэктомию проводили в день 10 или день 11. Во вторых трех экспериментах соединение на основе анти-тШ-21 вводили в дни 2, 3 и 4, а нефрэктомию проводили в день 7. Уровни выживаемости мышей с IК/Nχ в каждом эксперименте показаны в табл. Н.
Таблица Н
Повышение уровня выживаемости мышей с IК/Nχ через два дня после нефрэктомии при помощи 36328
День Νχ Уровень выживаемости Доза анти-т1К-21
через 2 дня после Νχ
РВЗ 36328
День 10 50% 75% 20 мг/кг
День 7 бб, 7% 91,7% 20 мг/кг
В первом эксперименте, в котором нефрэктомию проводили в день 10, уровень выживаемости мышей, обработанных с помощью РΒ8, составлял 55%, в то время как уровень выживаемости мышей, обра- 55 030211
ботанных 36328, составлял 75% (р=0,02 с использованием одностороннего точного критерия Фишера) . Во втором эксперименте, в котором нефрэктомию проводили в день 7, уровень выживаемости мышей, обработанных с помощью ΡΒδ, составлял 52%, в то время как уровень выживаемости мышей, обработанных 36328, составлял 69% (р=0,11 с использованием одностороннего точного критерия Фишера).
Пример 6. Соединения на основе анти-т1К-21.
Разрабатывали дополнительные соединения на основе анти-т1К, нацеленные на т1К-21 и содержащие 8-еЕ1-нуклеозиды, с вариациями по длине, а также по количеству, типу и расположению модифицированных сахарных фрагментов. Эти соединения на основе анти-т1К показаны в табл. I. Модификации нуклеозидов обозначаются следующим образом: нуклеозиды без последующего нижнего индекса означают β-Ό-дезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" означают 2'-МОЕнуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "М" означают 2'-О-метилнуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "δ" означают δ-сΕί-нуклеозиды. Каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
Таблица I
Соединения на основе анти-т1К-21
56
030211
Соединения, выбранные из табл. I, оценивали в отношении их ингибирующих эффектов на активность т1К-21 в т νΐΐτο анализе с применением люциферазы. Анализ проводили, как описано в данном документе, и результаты показаны в табл. I и на фиг. 6А.
Таблица I
Данные анализа с применением люциферазы в отношении соединения на основе анти-т1К-21
Концентрация антиттК нМ 36731 36842 36843 36844 36845 36846 36847 36039
300 7,63 5,34 6, 43 26, 07 21,90 13,64 8,08 28,53
100 9, 72 10,87 5,71 19,33 13,36 26, 13 39,10 28,85
33,33 10,76 4,50 6, 52 22,11 16, 35 20,54 19,46 23,44
11,11 9, 38 5,06 5,21 25,46 25,83 21,08 27,84 28,51
3,7 8,53 2,45 5,62 18,61 27,05 29,88 18,21 15,93
1,23 4,49 1,20 2,84 9,28 20,86 17,41 22,11 16, 05
0,41 3, 51 0,75 1,41 5,04 9,64 12,64 3,44 15,12
0,14 2,60 0,65 6, 50 3,24 6,89 5,69 3,71 7,46
0,05 1, 52 0,67 0,90 2,66 7,18 5,33 1,74 4,66
0 0, 33 0,36 4,34 1,21 1,07 1,19 0,85 0,90
Исходя из данных в табл. I и данных из повторных экспериментов наблюдали, что соединения 36731, 36039, 36846 и 36847 постоянно ингибировали ттК-21 в анализе с применением люциферазы.
Некоторые соединения на основе анти-ттК-21 дополнительно тестировали в отношении их эффектов на пролиферацию клетки в т νΐΐΓο анализе. Применяли два контроля анти-ттК с несовпадениями (36965 СЕ05АЕАЕи/^ТЕТЕА3АСТА50АСи3Ас;С5, щ N0:15; 36967
СЕА3АЕТЕА5АЕТЕАЕи5ААСС5ССТС5С3и5, §Е(3 ГО N0:16). В данном эксперименте использовали клеточную линию 8К-Нер1 аденокарциномы человека. 8К-Нер1 помещали на 96-луночные планшеты, покрытые коллагеном, при плотности 500 клеток на лунку. На следующий день клетки обрабатывали соединением на основе анти-ттК при концентрации в диапазоне от 50 нМ до 20 мкМ (п=6 лунок для каждой обработки). Не применяли никакой реагент для трансфекции. Жизнеспособность клеток измеряли с применением люминесцентного анализа жизнеспособности клеток Се11Ткег-О1о®. Результаты рассчитывали как процент жизнеспособных клеток относительно необработанного контроля. Как показано в табл. К и на фиг. 6В, соединения 36731, 36846, 36847 и 25220 снижали жизнеспособность клеток зависимым от концентрации образом.
Таблица К
Концентрация анти-ттК
№ соединения 5 0 нМ 100 нМ 250 нМ 500 нМ 1 мкМ 2 мкМ 5 мкМ 10 мкМ 2 0 мкМ
36965 103,87 97,48 97,64 81,87 38,01 0 0 0 0
36967 98,50 97,10 95,93 94,11 84,90 47,72 0 0 0
36731 96, 92 95,53 51,74 0 0 0 0 0 0
36846 96, 95 90, 07 0 0 0 0 0 0 0
25220 95,54 91,35 21,37 0 0 0 0 0 0
36847 93,61 93, 98 4,41 0 0 0 0 0 0
- 57 030211
Соединения, которые снижают жизнеспособность клеток, представляют собой терапевтические средства-кандидаты для лечения рака.
Для оценки ΐη νίνο активности на модели фиброза некоторые соединения тестировали на модели ииО. Группы животных обрабатывали следующим образом: плацебо-операция (η=4), ИИО с ΡΒ8 (η=8) или иио с соединением на основе анти-ппК-21 (η=8). Что касается дня процедуры ИИО, ΡΒ8 или соединение на основе анти-т£К-21 вводили в день -5, -3 и +3. Соединения на основе анти-т£К-21 вводили при дозе 20 мг/кг. Поскольку соединения на основе анти-т£К вводили до процедуры ИИО, данный режим дозирования считается профилактическим лечением. В день 10 после процедуры ИИО животных умерщвляли и извлекали почку для измерения экспрессии коллагена. Экспрессию коллагена измеряли с помощью ПЦР в реальном времени и нормализовали сперва относительно ΘΑΡΌΗ, а затем относительно контрольных животных с обработкой плацебо. Статистическую значимость определяли согласно однофакторному дисперсионному анализу. Как показано на фиг. 7, обработка с помощью 36731 и 36055 снижала экспрессию коллагена 1А1 (фиг. 7 А) и коллагена 3А1 (фиг. 7В) статистически значимым образом относительно животных, обработанных плацебо (* - р<0,05; ** - р<0,01). В данном исследовании соединение 36847 снижало экспрессию коллагена 1А1 и коллагена 3А1, хотя не статистически значимым образом.
Также определяли вязкость некоторых соединений. Соединения растворяли в воде. С применением стандартных способов концентрацию олигонуклеотида рассчитывали гравиметрически (мг/г), а вязкость (сП) измеряли при помощи вискозиметра.
Результаты показаны в табл. Г.
ТаблицаГ
Вязкость соединения на основе анти-ппК-21
№ Вязкость Концентрация
соединения сП мг/г
36731 81 153
36847 128 130
36846 66 150
Соединения 36731 и 36846 проявляли относительно низкую вязкость по сравнению с 36847 и другими соединениями, описанными в данном документе.
Определяли метаболическую стабильность некоторых соединений. В ех νίνο анализе, проводимом как описано выше, в конце анализа обнаруживали приблизительно 89% соединения 36731 полной длины. Таким образом, 36731 является высоко стабильным соединением в присутствии нуклеаз.
Пример 7. Модели ксенотрансплантата.
Для измерения ΐη νίνο эффективности потенциальных противораковых терапевтических средств часто используют модели человеческого ксенотрансплантата.
Модели ксенотрансплантата на основе клеточной линии получали посредством инъекции раковых клеток человека в иммунодефицитных мышей. Инъецированные клетки формируют опухоли, и эффекты потенциальных противораковых средств можно оценивать в отношении влияния на параметры, включая размер опухоли, число опухолей, структуры опухоли и потенциал метастазирования. Клетки выращивали в культуре и затем собирали для инъекции в мышь. Клетки происходят из раковой клеточной линии (например, 8К-Нер1, НиН7, НеЬа293, Нер3В, 8Νυ). Для инициирования роста опухоли приблизительно 5х106 клеток инъецировали подкожно в боковую часть иммунодефицитной мыши (например, 8СГОмыши или бестимусной гладкой мыши). Клеткам давали возможность формировать опухоли со средним объемом до 75 мм2.
Модели ксенотрансплантата из ткани опухоли, полученной от пациента (ксенотрансплантат, полученный от пациента, или ΡΌΧ-модели), получают посредством трансплантации эксплантата опухоли человека в иммунодефицитную мышь. Для сохранения как можно большего числа характеристик исходной опухоли эксплантат можно пересаживать от одной мыши к другой, но, как правило, его не размножали в клеточной культуре.
Соединения на основе анти-ппК-21 тестировали в отношении их противораковых эффектов на модели человеческого ксенотрансплантата. Когда опухоли достигали подходящего размера, мышей обрабатывали следующим образом: ΡΒ8 (η=5-10); анти-т!К-21 (η=5-10) или анти-т£К-21 с несовпадением (необязательно; η=5-10). Средства обработки вводили подкожно, до 3 раз в неделю в течение до 12 недель.
Размер опухоли измеряли один-два раза в неделю, например, с применением штангенциркуля. Вес тела измеряли два-три раза в неделю. Кровь собирали ежедневно и в конце исследования. Опухоль и другие ткани собирали в конце исследования.
Уменьшение размера опухоли наблюдали у мышей, обработанных анти-ппК-21, относительно мышей, обработанных ΡΒ8, что позволяет предположить, что анти-ппК-21 представляет собой терапевтическое средство, которое можно применять для лечения рака.
Различные модификации настоящего изобретения в дополнение к таким, описанным в данном до- 58 030211
кументе, будут очевидны специалистам в данной области техники из приведенного выше описания. Такие модификации также предназначены для попадания в пределы объема приложенной формулы изобретения. Каждая ссылка (включая без ограничения журнальные статьи, патенты США и не США, публикации патентных заявок, публикации международных патентных заявок, номера доступа ΟΒΝΒΑΝΚ® и т.п.), приведенная в настоящей заявке, в частности, включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Регулюс Терапевтике Инк.
<120> СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ МИКРОРНК И СПОСОБЫ МОДУЛИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ МТК-21
<130> КЕОиЬ-32818/ИО-1/ОКБ
<150> <151> из 61/741783 2012-04-25
<150> <151> из 61/717927 2012-10-24
<150> <151> из 61/779913 2012-03-13
<160> 55
<170> РаЬепЫп версия 3.5
<210> <211> <212> <213> 1 22 РНК Ното зарЧепз
<400> 1
иадсииаиса дасидаидии да 22
<210> <211> <212> <213> 2 72 РНК Ното зарЧепз
<400> 2
идисдддиад сииаисадас идаидиидас идиидааиси саиддсааса ссадисдаид 60
ддсидисида са 72
<210> <211> <212> <213> 3 19 ДНК Синтетическая
<400> 3
асаЬсадЬсЬ даЬаадсЬа 19
<210> <211> <212> <213> 4 22 ДНК Синтетическая
- 59 030211
<400> 4
ГсаасаГсад ГсГдаГаадс Га
22
<210> 5
<211> 15
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 5
садГсГдаГа адсГа
15
<210> 6
<211> 16
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 6
ГсадГсГдаГ аадсГа
16
<210> 7
<211> 15
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 7
сааГсГааГа адсГа
15
<210> 8
<211> 19
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 8
асаГсадГсГ даГаадсГГ
19
<210> 9
<211> 18
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 9
саГсадГсГд аГаадсГа
18
<210> 10
<211> 18
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 10
асаГсадГсГ даГаадсГ
18
<210> 11
<211> 15
<212> ДНК
<213> Синтетическая
- 60 030211
<400> 11
садЕаЕдаЕа адсЕа
15
<210> 12
<211> 15
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 12
садЕаЕааЕа адсЕа
15
<210> 13
<211> 15
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 13
сааЕсаааЕа адсЕа
15
<210> 14
<211> 19
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 14
аааЕсЕдЕсЕ саЕааЕааа
19
<210> 15
<211> 19
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 15
ддааЕсЕЕаа сЕадасЕас
19
<210> 16
<211> 19
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 16
дааЕааЕаЕа ассссЕддЕ
19
<210> 17
<211> 17
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 17
аЕсадЕсЕда ЕаадсЕа
17
<210> 18
<211> 16
<212> ДНК
<213> Синтетическая
- 61 030211
<400> 18
ЕсадЕсЕдаЕ аадсЕа
16
<210> 19
<211> 15
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 19
садЕсЕдаЕа адсЕа
15
<210> 20
<211> 14
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 20
адЕсЕдаЕаа дсЕа
14
<210> 21
<211> 13
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 21
дЕсЕдаЕаад сЕа
13
<210> 22
<211> 12
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 22
ЕсЕдаЕаадс Еа
12
<210> 23
<211> 11
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 23
сЕдаЕаадсЕ а
11
<210> 24
<211> 10
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 24
ЕдаЕаадсЕа
10
<210> 25
<211> 18
<212> ДНК
<213> Синтетическая
- 62 030211
<400> 25
асаЕсадЕсЕ даЕаадсЕ
18
<210> 26
<211> 17
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 26
асаЕсадЕсЕ даЕаадс
17
<210> 27
<211> 17
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 27
саЕсадЕсЕд аЕаадсЕ
17
<210> 28
<211> 16
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 28
саЕсадЕсЕд аЕаадс
16
<210> 29
<211> 16
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 29
аЕсадЕсЕда ЕаадсЕ
16
<210> 30
<211> 15
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 30
аЕсадЕсЕда Еаадс
15
<210> 31
<211> 15
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 31
ЕсадЕсЕдаЕ аадсЕ
15
<210> 32
<211> 14
<212> ДНК
<213> Синтетическая
- 63 030211
<400> 32
ЕсадЕсЕдаЕ аадс
14
<210> 33
<211> 14
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 33
садЕсЕдаЕа адсЕ
14
<210> 34
<211> 13
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 34
садЕсЕдаЕа адс
13
<210> 35
<211> 13
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 35
адЕсЕдаЕаа дсЕ
13
<210> 36
<211> 12
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 36
адЕсЕдаЕаа дс
12
<210> 37
<211> 12
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 37
дЕсЕдаЕаад сЕ
12
<210> 38
<211> 11
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 38
дЕсЕдаЕаад с
11
<210> 39
<211> 11
<212> ДНК
<213> Синтетическая
- 64 030211
<400> 39
ЕсЕдаЕаадс Е
11
<210> 40
<211> 10
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 40
ЕсЕдаЕаадс
10
<210> 41
<211> 10
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 41
сЕдаЕаадсЕ
10
<210> 42
<211> 14
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 42
ааЕсЕааЕаа дсЕа
14
<210> 43
<211> 13
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 43
аЕсЕааЕаад сЕа
13
<210> 44
<211> 12
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 44
ЕсЕааЕаадс Еа
12
<210> 45
<211> 11
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 45
сЕааЕаадсЕ а
11
<210> 46
<211> 10
<212> ДНК
<213> Синтетическая
- 65 030211
<400> 46
СааСаадсСа
10
<210> 47
<211> 14
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 47
сааСсСааСа адсС
14
<210> 48
<211> 13
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 48
сааСсСааСа аде
13
<210> 49
<211> 13
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 49
ааСсСааСаа дсС
13
<210> 50
<211> 12
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 50
ааСсСааСаа дс
12
<210> 51
<211> 12
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 51
аСсСааСаад сС
12
<210> 52
<211> 11
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 52
аСсСааСаад с
11
<210> 53
<211> 11
<212> ДНК
<213> Синтетическая
- 66 030211
<400> 53
ЕсЕааЕаадс Е 11
<210> 54
<211> 10
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 54
ЕсЕааЕаадс 10
<210> 55
<211> 10
<212> ДНК
<213> Синтетическая
<400> 55
сЕааЕаадсЕ 10

Claims (16)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, комплементарный пнК-21 (8Е0 ГО N0: 1), и где модифицированный олигонуклеотид:
    a) состоит из 18 или 19 связанных нуклеозидов и содержит по меньшей мере 18 смежных нуклеозидов из паттерна VII в ориентации 5'-3':
    νμ-(νβ-νμ-νμ)2-νμ-(νβ-№-№-№)2-νβ-νβ-νζ,
    где каждый ΝΜ независимо представляет собой модифицированный нуклеозид, который не является бициклическим нуклеозидом;
    каждый ΝΒ независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № независимо представляет собой небициклический нуклеозид; и Νζ представляет собой модифицированный нуклеозид; или
    b) состоит из 21 или 22 связанных нуклеозидов и содержит по меньшей мере 21 смежный нуклеозид из паттерна ΙΙΙ в направлении 5'-3':
    ЙЛ'УХЛ'-Х -\<νΛΊ,-Ν -Ν', где каждый К независимо представляет собой небициклический нуклеозид;
    X равен от 1 до 4;
    каждый ΝΒ независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № независимо представляет собой небициклический нуклеозид;
    ΝΥ представляет собой бициклический нуклеозид; и
    Νζ представляет собой модифицированный нуклеозид; или
    c) состоит из 18 или 19 связанных нуклеозидов и содержит по меньшей мере 18 смежных нуклеозидов из паттерна IV в направлении 5'-3':
    νμ-νβ-№-№-νβ-(№-№-№-νβ)3-νυ-νζ,
    где ΝΜ представляет собой модифицированный нуклеозид, который не является бициклическим нуклеозидом;
    каждый ΝΒ независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № независимо представляет собой небициклический нуклеозид;
    ΝΥ представляет собой бициклический нуклеозид; и
    Νζ представляет собой модифицированный нуклеозид; или
    ά) состоит из 10-19 связанных нуклеозидов и содержит по меньшей мере 10 смежных нуклеозидов из паттерна V в направлении 5'-3':
    νμ-νβ-(№-№-νβ-νβ)4-νζ,
    где ΝΜ представляет собой модифицированный нуклеозид, который не является бициклическим нуклеозидом;
    каждый ΝΒ независимо представляет собой бициклический нуклеозид; каждый № независимо представляет собой небициклический нуклеозид; и Νζ представляет собой модифицированный нуклеозид; или
    е) состоит из 11-15 связанных нуклеозидов и содержит по меньшей мере 11 смежных нуклеозидов
    - 67 030211
    из паттерна У! в направлении 5'-3':
    №-νβ-νβ-№-(Νβ-νβ-№-№)2-νβ-№-νβ,
    где каждый № представляет собой небициклический нуклеозид; каждый ΝΒ представляет собой бициклический нуклеозид.
  2. 2. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где каждый бициклический нуклеозид независимо выбран из ^NА-нуклеозида, сЕ!-нуклеозида и ΕNА-нуклеозида.
  3. 3. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где каждый небициклический нуклеозид независимо выбран из β-Ό-дезоксирибонуклеозида, 2'-О-метил- и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида.
  4. 4. Соединение по п.1, где
    a) модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид по п.1(а), где:
    (ί) каждый ΝΜ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый ΝΒ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид;
    каждый № независимо выбирают из 2'-О-метилнуклеозида и β-Ό-дезоксирибонуклеозида; и Νζ выбирают из 8-сЕ!-нуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида; или (ίί) каждый ΝΜ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый ΝΒ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид;
    каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Νζ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; или (ίίί) каждый ΝΜ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый ΝΒ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид;
    каждый № независимо выбирают из 2'-О-метилнуклеозида и β-Ό-дезоксирибонуклеозида; и
    Νζ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; или
    (ίν) каждый ΝΜ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;
    каждый ΝΒ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид;
    каждый № независимо выбирают из 2'-О-метилнуклеозида и β-Ό-дезоксирибонуклеозида; и Νζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; или
    b) модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид по п.1(Ь), где:
    (ί) каждый К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;
    X равен 1;
    каждый ΝΒ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;
    Νγ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; и
    Νζ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; или
    (ίί) каждый К представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;
    X равен 1;
    каждый ΝΒ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид;
    каждый № независимо выбирают из β-Ό-дезоксирибонуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида;
    Νγ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; и Νζ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; или
    c) модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид по п.1(с), где:
    (ί) ΝΜ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый ΝΒ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид;
    Νγ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; и
    Νζ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; или
    (ίί) ΝΜ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид;
    каждый ΝΒ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид;
    каждый № независимо выбирают из β-Ό-дезоксирибонуклеозида и 2'-О-метоксиэтилнуклеозида;
    Νγ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; и Νζ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; или
    б) модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид по п.1(б), где
    ΝΜ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; каждый ΝΒ представляет собой 8-сЕ!-нуклеозид; каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид; и Νζ представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; или
    е) модифицированный олигонуклеотид представляет собой модифицированный олигонуклеотид по п.1(е), где:
    - 68 030211
    (ί) каждый ΝΒ представляет собой 3-сЕ1-нуклеозид; и каждый № представляет собой 2'-О-метоксиэтилнуклеозид; или (и) каждый ΝΒ представляет собой 3-сЕ1-нуклеозид; и каждый № представляет собой β-Ό-дезоксирибонуклеозид.
  5. 5. Соединение по п.1, имеющее структуру
    ЛЕС3ЛЕТЕС3ЛЕСЕТЕС3тсли3ААСс3и3А3 ено го Ν0: 3), ЛЕС3ЛЕТЕС3ЛЕСЕТЕС3ТСЛи3ЛЛСС3ТЛ3 ЕНО Го Ν0: 3); АЕС3АТС3А3СТС3и3САи3А3АСС3и3АЕ ЕНО ГО Ν0: 8); МеСЕЛ3Л3ТЕС3и3ЛЕЛЕи3Л3ЛЕСЕС3ТЕЛ3 (3Н0 Ш Ν0: 7);
    где нуклеозиды без последующего нижнего индекса представляют собой β-Όдезоксирибонуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "Е" представляют собой 2'МОЕ-нуклеозиды; нуклеозиды с последующим нижним индексом "3" представляют собой 3-сЕ1нуклеозиды; и МеС представляет собой 5-метилцитозин.
  6. 6. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% комплементарна нуклеотидной последовательности т!К-21 (3НЦ ГО Ν0:1).
  7. 7. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где модифицированный олигонуклеотид содержит 18 или 19 связанных нуклеозидов паттерна VII, 21 или 22 связанных нуклеозидов паттерна III, 18 или 19 связанных нуклеозидов паттерна IV или состоит из них, или где модифицированный олигонуклеотид содержит 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 связанных нуклеозидов паттерна V или 11, 12, 13, 14 или 15 связанных нуклеозидов паттерна VI или состоит из них.
  8. 8. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь и необязательно представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
  9. 9. Соединение по любому из пп.1-7, где каждая межнуклеозидная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь и необязательно представляет собой фосфотиоатную межнуклеозидную связь.
  10. 10. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где по меньшей мере один цитозин представляет собой 5-метилцитозин, или где каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
  11. 11. Соединение по любому из предыдущих пунктов, где нуклеотидная последовательность модифицированного олигонуклеотида выбрана из 3НЦ ГО Ν0: 3-10, где каждый Т независимо выбран из Т и и.
  12. 12. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-22 связанных нуклеозидов, где модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 смежных нуклеозидов структуры, выбранной из структур в табл. 1.
  13. 13. Способ лечения, предупреждения или отсрочки начала развития заболевания, ассоциированного с тгК-21, включающий введение субъекту, имеющему заболевание, ассоциированное с ιηίΚ-21. соединения по любому из пп.1-12, где субъект предпочтительно является человеком.
  14. 14. Способ по п.13, где заболевание выбирают из фиброза почек, фиброза легких, фиброза печени, фиброза сердца, фиброза кожи, возрастного фиброза, фиброза селезенки, склеродермии, посттрансплантационного фиброза и рака.
  15. 15. Способ по п.14, в котором:
    a) у субъекта, имеющего заболевание, выбранное из гломерулосклероза, тубулоинтерстициального фиброза, ^Л-нефропатии, интерстициального фиброза/тубулярной атрофии; хронического повреждения почек, поражения нефронов, гломерулонефрита, синдрома Альпорта, сахарного диабета, идиопатического фокально-сегментарного гломерулосклероза, мембранозной нефропатии, коллабирующей гломерулопатии, хронической рецидивирующей инфекции почек и терминальной стадии почечной недостаточности, присутствует фиброз почек;
    b) фиброз почек возникает в результате острой или повторной травмы почки;
    c) у субъекта, имеющего заболевание, выбранное из хронического повреждения печени, инфекционного гепатита, неалкогольного стеатогепатита и цирроза, присутствует фиброз печени; легочный фиброз представляет собой идиопатический легочный фиброз;
    ά) субъект имеет хроническое обструктивное заболевание легких; и/или
    е) рак представляет собой рак печени, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак толстой кишки, рак легких, рак головного мозга, гемобластоз, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак языка, рак желудка, рак кожи или рак щитовидной железы.
  16. 16. Способ по любому из пп.13-15, дополнительно включающий введение по меньшей мере одного
    - 69 030211
    терапевтического средства, выбранного из противовоспалительного средства, иммуносупрессивного средства, противодиабетического средства, дигоксина, вазодилататора, ингибиторов ангиотензин-11превращающего фермента (АСЕ), блокаторов рецепторов ангиотензина II (ΆΚΒ), блокатора кальциевых каналов, динитрата изосорбида, гидралазина, нитрата, гидралазина, бета-блокатора, натрийуретических пептидов, гепариноида, ингибитора фактора роста соединительной ткани и антираковой терапии.
EA201491953A 2012-04-25 2013-04-24 Соединения на основе микрорнк и способы модулирования активности mir-21 EA030211B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261741783P 2012-04-25 2012-04-25
US201261717927P 2012-10-24 2012-10-24
US201361779913P 2013-03-13 2013-03-13
PCT/US2013/037913 WO2013163258A1 (en) 2012-04-25 2013-04-24 Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491953A1 EA201491953A1 (ru) 2015-06-30
EA030211B1 true EA030211B1 (ru) 2018-07-31

Family

ID=48289681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491953A EA030211B1 (ru) 2012-04-25 2013-04-24 Соединения на основе микрорнк и способы модулирования активности mir-21

Country Status (28)

Country Link
US (5) US8969317B2 (ru)
EP (1) EP2841579B1 (ru)
JP (1) JP6322189B2 (ru)
KR (4) KR20220028183A (ru)
CN (1) CN104254607B (ru)
AR (1) AR090825A1 (ru)
AU (1) AU2013251696B2 (ru)
BR (1) BR112014026639A8 (ru)
CA (1) CA2869639A1 (ru)
CL (3) CL2014002844A1 (ru)
CO (1) CO7111303A2 (ru)
CR (1) CR20140524A (ru)
DO (1) DOP2014000233A (ru)
EA (1) EA030211B1 (ru)
EC (1) ECSP14028612A (ru)
GT (1) GT201400221A (ru)
IL (1) IL234904B (ru)
IN (1) IN2014DN09134A (ru)
MX (1) MX353562B (ru)
MY (1) MY173600A (ru)
NZ (1) NZ630591A (ru)
PE (1) PE20142404A1 (ru)
PH (2) PH12023550488A1 (ru)
SG (1) SG11201406931XA (ru)
TW (1) TWI647235B (ru)
UA (1) UA117098C2 (ru)
WO (1) WO2013163258A1 (ru)
ZA (1) ZA201407228B (ru)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2534248T3 (en) 2010-02-08 2018-11-19 Ionis Pharmaceuticals Inc SELECTIVE REDUCTION OF ALLELVARIANS
CA2807552A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
MX2013003681A (es) 2010-10-01 2013-11-20 Moderna Therapeutics Inc Ácidos nucleicos manipulados y métodos de uso de los mismos.
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
ES2621863T3 (es) 2011-04-25 2017-07-05 Regulus Therapeutics Inc. Compuestos de microARN y métodos para modular la actividad de miR-21
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
SI3682905T1 (sl) 2011-10-03 2022-04-29 Modernatx, Inc. Modificirani nukleozidi, nukleotidi in nukleinske kisline ter njihove uporabe
US20130156849A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
HK1206601A1 (en) 2012-04-02 2016-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
WO2013153082A1 (en) * 2012-04-10 2013-10-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for the treatment of nonalcoholic steatohepatitis
AU2013251696B2 (en) 2012-04-25 2018-11-15 Sanofi MicroRNA compounds and methods for modulating miR-21 activity
UA116639C2 (uk) 2012-10-09 2018-04-25 Рег'Юлес Терап'Ютікс Інк. Способи лікування синдрому альпорта
EP3459549B1 (en) * 2012-10-12 2022-04-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Selective antisense compounds and uses thereof
SI2922554T1 (sl) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx, Inc. Terminalno modificirana RNA
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
SG11201602503TA (en) 2013-10-03 2016-04-28 Moderna Therapeutics Inc Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
WO2015061536A1 (en) * 2013-10-25 2015-04-30 Regulus Therapeutics Inc. Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
CN106459970A (zh) * 2013-11-22 2017-02-22 俞松良 微rna146‑a及其于诊断、治疗及预防小核醣核酸病毒感染的用途及微rna146‑a拮抗剂
WO2015123449A2 (en) * 2014-02-12 2015-08-20 Thomas Jefferson University Compositions and methods of using microrna inhibitors
WO2015154002A1 (en) * 2014-04-04 2015-10-08 Ohio State Innovation Foundation Oligonucleotide lipid nanoparticle compositions, methods of making and methods of using the same
CN105087477A (zh) * 2015-05-21 2015-11-25 王松灵 miR-21反义核苷酸修饰的骨髓间充质干细胞的用途
US11236337B2 (en) 2016-11-01 2022-02-01 The Research Foundation For The State University Of New York 5-halouracil-modified microRNAs and their use in the treatment of cancer
WO2018102397A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
AU2018261792A1 (en) * 2017-05-04 2020-01-02 Sanofi Methods for treatment of alport syndrome
CN112585280A (zh) 2018-08-23 2021-03-30 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 微小rna-134生物标志物
CN112996568A (zh) * 2018-11-13 2021-06-18 莱古路斯治疗法股份有限公司 用于调节mir-10b活性的微小rna化合物和方法
US20220267778A1 (en) 2019-07-30 2022-08-25 Shionogi & Co., Ltd. Nucleic acid drug targeting murf1
KR102293777B1 (ko) * 2019-12-31 2021-08-25 연세대학교 산학협력단 신규한 UQCRB-관련 순환 miRNA 바이오 마커 및 이를 이용한 대장암의 진단 방법
BR112022017215A2 (pt) * 2020-04-09 2022-10-18 Univ Muenchen Tech Liberação direcionada de um inibidor de mir-21 aos macrófagos para o tratamento de fibrose pulmonar
US11965162B2 (en) 2020-04-16 2024-04-23 The Johns Hopkins University MicroRNA and inhibitors thereof and methods of treatment
KR102328770B1 (ko) * 2020-06-01 2021-11-19 고려대학교 산학협력단 비알코올 지방간염 진단용 바이오마커 miRNA-4449
WO2021262919A2 (en) 2020-06-26 2021-12-30 The Research Foundation For The State University Of New York 5-halouracil-modified micrornas and their use in the treatment of cancer
KR20220014004A (ko) * 2020-07-28 2022-02-04 고려대학교 산학협력단 microRNA조합을 이용한 비알코올 지방간염 진단용 바이오마커
WO2022072336A1 (en) * 2020-10-01 2022-04-07 University Of Washington Drug-like molecules and methods for the therapeutic targeting of microrna-21
WO2025110217A1 (ja) * 2023-11-22 2025-05-30 国立大学法人東海国立大学機構 嚢胞性腎疾患の予防及び／又は治療剤

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007027894A2 (en) * 2005-08-29 2007-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds having enhanced anti-microrna activity
WO2007112753A2 (en) * 2006-04-03 2007-10-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotides
WO2009043353A2 (en) * 2007-10-04 2009-04-09 Santaris Pharma A/S Micromirs
WO2009058907A2 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeting micrornas for the treatment of liver cancer
WO2009106367A1 (en) * 2008-02-27 2009-09-03 Julius Maximilians-Universität Würzburg Microrna (mirna) and downstream targets for diagnostic and therapeutic purposes
WO2010099161A1 (en) * 2009-02-26 2010-09-02 The Ohio State University Research Foundation Micrornas in never-smokers and related materials and methods
WO2010144485A1 (en) * 2009-06-08 2010-12-16 Miragen Therapeutics CHEMICAL MODIFICATION MOTIFS FOR miRNA INHIBITORS AND MIMETICS
WO2012148952A1 (en) * 2011-04-25 2012-11-01 Regulus Therapeutics Inc Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG117434A1 (en) 1998-05-22 2005-12-29 Boys Town Nat Res Hospital Use of alpha1beta1 integrin receptor inhibitors and tgf-beta1 inhibitors in the treatment of kidney disease
US20060008817A1 (en) 2000-12-08 2006-01-12 Invitrogen Corporation Methods and compositions for generating recombinant nucleic acid molecules
CA2937159C (en) 2001-09-28 2017-11-28 Thomas Tuschl Microrna molecules
EP1562971B1 (en) 2002-11-05 2014-02-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US20050124591A1 (en) 2003-07-29 2005-06-09 Jin Tian Use of vitamin Ds to treat kidney disease
CA2533701A1 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
ES2382807T3 (es) 2003-08-28 2012-06-13 Takeshi Imanishi Nuevos ácidos nucleicos artificiales del tipo de enlace N-O con reticulación
CA2572450A1 (en) 2004-05-28 2005-12-15 Ambion, Inc. Methods and compositions involving microrna
CA2576233C (en) 2004-08-10 2016-03-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conjugate comprising an antagomir and a ligand
EP1802331A2 (en) 2004-09-08 2007-07-04 Boys Town National Research Hospital Treatment of glomerular basement membrane disease involving matrix metalloproteinase-12
EP2281888B1 (en) 2004-11-12 2015-01-07 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules
US20070099196A1 (en) 2004-12-29 2007-05-03 Sakari Kauppinen Novel oligonucleotide compositions and probe sequences useful for detection and analysis of micrornas and their target mRNAs
US6995235B1 (en) 2005-05-02 2006-02-07 Univation Technologies, Llc Methods of producing polyolefins and films therefrom
WO2007090073A2 (en) 2006-01-27 2007-08-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for the use in modulation of micrornas
ES2516815T3 (es) 2006-01-27 2014-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en la posición 6
EP2261333B1 (en) 2006-04-03 2016-03-30 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Pharmaceutical composition comprising anti-miRNA antisense oligonucleotides
CA2848238C (en) 2006-10-03 2016-07-19 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid containing formulations
EP2489742A1 (de) 2006-10-09 2012-08-22 Julius-Maximilians-Universität Würzburg MicroRNA (MIRNA) zur Diagnose und Therapie von Herzerkrankungen
EP2104735A2 (en) 2006-12-08 2009-09-30 Asuragen, INC. Mir-21 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2008086807A2 (en) 2007-01-19 2008-07-24 Exiqon A/S Mediated cellular delivery of lna oligonucleotides
AU2008260277C1 (en) 2007-05-30 2014-04-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
WO2008154401A2 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
US20100261175A1 (en) 2007-06-15 2010-10-14 Exiqon A/S Use of short oligonucleotides for reagent redundancy experiments in rna functional analysis
EP2176280B2 (en) 2007-07-05 2015-06-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
WO2009091972A2 (en) 2008-01-18 2009-07-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides and small molecules for use in reducing micro rna activity levels and uses thereof
NZ587178A (en) 2008-02-08 2011-11-25 Prosensa Holding Bv Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders
EP2268811A1 (en) 2008-03-07 2011-01-05 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of microrna related diseases
WO2011126842A2 (en) 2010-03-30 2011-10-13 Regulus Therapeutics Inc. Targeting micrornas for the treatment of cardiac disorders
WO2013013165A2 (en) 2011-07-21 2013-01-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of lna compounds for therapeutic inhibition of mir-21 in systemic lupus erythematosus
AU2013251696B2 (en) 2012-04-25 2018-11-15 Sanofi MicroRNA compounds and methods for modulating miR-21 activity
AU2013278011B2 (en) 2012-06-21 2018-09-20 MiRagen Therapeutics, Inc. Oligonucleotide-based inhibitors comprising locked nucleic acid motif
CN104955950B (zh) 2012-09-26 2019-04-26 米尔克斯治疗学公司 具有改善的脱靶特征谱的寡核苷酸
UA116639C2 (uk) 2012-10-09 2018-04-25 Рег'Юлес Терап'Ютікс Інк. Способи лікування синдрому альпорта

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007027894A2 (en) * 2005-08-29 2007-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds having enhanced anti-microrna activity
WO2007112753A2 (en) * 2006-04-03 2007-10-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotides
WO2009043353A2 (en) * 2007-10-04 2009-04-09 Santaris Pharma A/S Micromirs
WO2009058907A2 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeting micrornas for the treatment of liver cancer
WO2009106367A1 (en) * 2008-02-27 2009-09-03 Julius Maximilians-Universität Würzburg Microrna (mirna) and downstream targets for diagnostic and therapeutic purposes
WO2010099161A1 (en) * 2009-02-26 2010-09-02 The Ohio State University Research Foundation Micrornas in never-smokers and related materials and methods
WO2010144485A1 (en) * 2009-06-08 2010-12-16 Miragen Therapeutics CHEMICAL MODIFICATION MOTIFS FOR miRNA INHIBITORS AND MIMETICS
WO2012148952A1 (en) * 2011-04-25 2012-11-01 Regulus Therapeutics Inc Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity

Also Published As

Publication number Publication date
ECSP14028612A (es) 2015-09-30
JP6322189B2 (ja) 2018-05-09
CA2869639A1 (en) 2013-10-31
TWI647235B (zh) 2019-01-11
US9267137B2 (en) 2016-02-23
US20150218558A1 (en) 2015-08-06
IL234904B (en) 2019-10-31
KR102118429B1 (ko) 2020-06-03
CL2019001878A1 (es) 2019-12-06
JP2015519891A (ja) 2015-07-16
IN2014DN09134A (ru) 2015-05-22
US9970009B2 (en) 2018-05-15
US20170240891A1 (en) 2017-08-24
CL2014002844A1 (es) 2015-02-13
CN104254607B (zh) 2020-10-27
AU2013251696B2 (en) 2018-11-15
US8969317B2 (en) 2015-03-03
EP2841579B1 (en) 2018-10-10
SG11201406931XA (en) 2014-11-27
AR090825A1 (es) 2014-12-10
US9688985B2 (en) 2017-06-27
CL2017001195A1 (es) 2018-01-26
PH12023550488A1 (en) 2024-06-24
WO2013163258A1 (en) 2013-10-31
EA201491953A1 (ru) 2015-06-30
KR20230037703A (ko) 2023-03-16
US20130289093A1 (en) 2013-10-31
DOP2014000233A (es) 2014-12-31
ZA201407228B (en) 2017-05-31
PE20142404A1 (es) 2015-02-02
MX2014012476A (es) 2014-12-08
HK1207115A1 (en) 2016-01-22
EP2841579A1 (en) 2015-03-04
US20180305691A1 (en) 2018-10-25
UA117098C2 (uk) 2018-06-25
CN104254607A (zh) 2014-12-31
NZ630591A (en) 2017-02-24
CO7111303A2 (es) 2014-11-10
IL234904A0 (en) 2014-12-31
PH12014502387A1 (en) 2014-12-22
BR112014026639A2 (pt) 2017-06-27
TW201345918A (zh) 2013-11-16
KR20200064164A (ko) 2020-06-05
GT201400221A (es) 2018-01-17
KR20220028183A (ko) 2022-03-08
MX353562B (es) 2018-01-17
KR20150003846A (ko) 2015-01-09
MY173600A (en) 2020-02-08
CR20140524A (es) 2015-02-12
US20160244753A1 (en) 2016-08-25
BR112014026639A8 (pt) 2018-01-16
AU2013251696A1 (en) 2014-10-16
KR102369722B1 (ko) 2022-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA030211B1 (ru) Соединения на основе микрорнк и способы модулирования активности mir-21
TWI698445B (zh) 微型ｒｎａ化合物及調控ｍｉｒ－２１活性之方法
TWI680767B (zh) 用於增強的細胞攝取之化合物及方法
WO2019086626A1 (en) MIRNAs AND COMBINATIONS THEREOF FOR USE IN THE TREATMENT OF HUMAN B CELL NEOPLASIAS
HK40065959A (en) Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
NZ616748B2 (en) Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
HK1207115B (en) Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
HK1195585A (en) Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
HK1195585B (en) Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG TJ TM