EA009216B1

EA009216B1 - Способы идентификации средств, модулирующих активность аспартилпротеазы asp2 человека

Info

Publication number: EA009216B1
Application number: EA200100387A
Authority: EA
Inventors: Марк Е. Герни; Майкл Джером Бенковски; Роберт Лерой Хайнриксон; Луис А. Пароди; Риквианг Йан
Original assignee: Фармация Энд Апджон Компани
Priority date: 1998-09-24
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2007-12-28
Also published as: DK1115874T3; HUP0103838A2; KR20070013361A; CA2343004A1; TR200200662T2; AU772812B2; KR100839284B1; HUP0103838A3; JP2009201517A; CY1111006T1; KR20040093193A; ZA200102387B; TR200601231T2; NZ510708A; CN1339066A; JP2008113665A; WO2000017369B1; KR20060126626A; NO20011505L; KR20040097216A

Abstract

Настоящее изобретение относится к способам идентификации средства, модулирующего активность аспартилпротеазы Asp2 человека, вовлеченной в процессинг предшественника амилоидного белка (APP) до бета-амилоида, а также к связанным нуклеиновым кислотам, пептидам, векторам и клеткам.

Description

Изобретение относится к любому выделенному или очищенному пептиду или белку, содержащему аминокислотный полипептид, кодирующий протеазу, способную расщеплять сайт расщепления АРР бета-секретазой, который содержит два или более наборов специальных аминокислот, разделенных положениями примерно 100-300 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты, из которых первый набор специальных аминокислот состоит из аминокислот ΌΤΟ, причем первая аминокислота первого специального набора аминокислот является первой специальной аминокислотой Ό, и второй набор аминокислот представляет собой ΌδΟ или ΌΤΟ, причем последняя аминокислота второго набора специальных аминокислот является последней специальной аминокислотой С и первая специальная аминокислота функционально связана с аминокислотами, кодирующими любое число положений из 0-81 аминокислоты, в которых могут находиться любые аминокислоты. В одном из вариантов осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с пептидом, имеющим положения примерно 64-77 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты. В конкретном варианте осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим из 71 аминокислоты. Еще в одном частном варианте осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с 71 аминокислотой и первая из этих 71 аминокислоты является аминокислотой Τ. Например, полипептид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична последовательности аспартилпротеазы, описанной в настоящем описании. Еще в одном варианте осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с любым числом аминокислот, от 40 до 54, в которых могут находиться любые аминокислоты. В частном варианте осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с аминокислотами, кодирующими пептид, состоящий из 47 аминокислот. Еще в одном конкретном варианте осуществления первая специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим из 47 аминокислот, причем первая из этих 47 аминокислот является аминокислотой Е. Например, полипептид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична 8ЕО ΙΌ N0: 3, описанной в примере 10, или полноразмерной полипептидной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 30, описанной в примере 10.

Еще в одном связанном аспекте любой выделенный или очищенный аминокислотный полипептид представляет собой протеазу, способную расщеплять сайт расщепления АРР бета(в)-секретазой, который содержит два или более наборов специальных аминокислот, разделенных положениями примерно 100300 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты, из которых первый набор специальных аминокислот состоит из аминокислот, кодирующих ЭТС. причем первая аминокислота первого специального набора аминокислот является первой специальной аминокислотой Ό, и второй набор аминокислот представляет собой Э8С или ЭТС, причем последняя аминокислота второго набора специальных аминокислот является последней специальной аминокислотой С, которая функционально связана с любым числом из 50-170 аминокислот, которые могут быть любыми аминокислотами. В частном варианте осуществления последняя специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим примерно из 100-170 аминокислот. Еще в одном варианте осуществления последняя специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим примерно из 142-163 аминокислот. В одном из конкретных вариантов осуществления последняя специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим примерно из 142 аминокислот. Например, полипептид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична 8ЕО ΙΌ N0: 22, описанной в примере 9, или 8Е0 ΙΌ N0: 30, описанной в примере 10. В одном из конкретных вариантов осуществления последняя специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим примерно из 163 аминокислот. Например, полипептид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична 8Е0 ΙΌ N0: 22, описанной в примере 9, или 8Е0 ΙΌ N0: 30, описанной в примере 10, или полноразмерной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 22, описанной в примере 9, или последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 30, описанной в примере 10. В одном из вариантов осуществления последняя специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим примерно из 170 аминокислот. В частном варианте осуществления второй набор специальных аминокислот включает пептид, имеющий аминокислотную последовательность Э8С. Необязательно, аминокислотный полипептид функционально связан с меткой очистки пептида, например с меткой очистки пептида, состоящей из шести остатков гистидина. В одном из вариантов осуществления первый набор специальных аминокислот относится к одному полипептиду и второй набор специальных аминокислот относится ко второму полипептиду, причем как первый, так и второй полипептиды имеют по крайней мере 50 аминокислот, которые могут быть любыми аминокислотами. В другом варианте осуществления первый набор специальных аминокислот относится к одному полипептиду и второй набор специальных аминокислот относится ко второму полипептиду, причем как первый, так и второй полипептиды имеют по крайней мере 50 аминокислот и оба указанных полипептида находятся в одном сосуде. Изобретение также относится к вектору, содержащему полипептид, описанный в настоящем описании. Изобретение, кроме того, относится к клетке или линии клеток, содержащей полинуклеотид, описанный в настоящем описании. Изобретение также относится к способу получения любых полинуклеотидов, векторов или клеток, описанных здесь, и к процессу получения полипептидов, описанных здесь.

Любой выделенный или очищенный пептид или белок включает аминокислотный полипептид, кодирующий протеазу, способную расщеплять сайт расщепления АРР бета-секретазой, который содержит два

- 4 009216 или более наборов специальных аминокислот, разделенных положениями примерно 100-300 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты, из которых первый набор специальных аминокислот состоит из аминокислот ΌΤΟ, причем первая аминокислота первого специального набора аминокислот является первой специальной аминокислотой Ό, и второй набор аминокислот представляет собой Ό8Ο или ΌΤΟ, последняя аминокислота второго набора специальных аминокислот является последней специальной аминокислотой С и первая специальная аминокислота функционально связана с аминокислотами, кодирующими положения любого числа из 0-81 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты.

Настоящее изобретение относится к аминокислотному полипептиду, описанному в настоящем описании, в котором первая специальная аминокислота функционально связана с пептидом, включающим положения примерно 30-77 аминокислот, в которых могут находиться любые аминокислоты. Изобретение также относится к аминокислотному полипептиду, описанному здесь, где первая специальная аминокислота функционально связана с пептидом, состоящим из 35, 47, 71 или 77 аминокислот.

Изобретение относится к аминокислотному полипептиду, описанному в настоящем описании, в котором первая специальная аминокислота функционально связана с соответствующими пептидами 8ЕО ΙΌ N0: 3, состоящими из 35, 47, 71 или 77 аминокислот, при отсчете от аминокислот в первой специальной последовательности ΌΤΟ в направлении Ν-конца 8ЕЦ ΙΌ N0: 3.

Изобретение относится к аминокислотному полипептиду, описанному в настоящем описании, включающему последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична соответствующим аминокислотам в 8Е0 ΙΌ N0: 4, то есть идентична части последовательностей в 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, включая все последовательности от первой и/или второй специальных нуклеиновых кислот в направлении №конца до 71, 47, 35 аминокислот включительно перед первыми специальными аминокислотами (примеры 10 и 11).

Изобретение относится к аминокислотному полипептиду, описанному в настоящем описании, включающему полный пептид из 71 аминокислоты, где первая аминокислота является Τ и вторая аминокислота является О. Также изобретение относится к полинуклеотиду нуклеиновых кислот, описанному здесь, где полинуклеотид содержит последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична соответствующим аминокислотам в 8Е0 ΙΌ N0: 3, то есть идентична последовательностям в 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, включая последовательности от первой и/или второй специальных нуклеиновых кислот в направлении №конца до 71 аминокислоты включительно, см. пример 10, начиная от сайта ΌΤΟ и включая нуклеотиды из этого кода для 71 аминокислоты.

Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду нуклеиновых кислот, описанному в настоящем описании, который содержит полную последовательность, идентичную соответствующим аминокислотам в 8Е0 ΙΌ N0: 3, то есть идентичную последовательностям в 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, включая последовательности от первой и/или второй специальных нуклеиновых кислот в направлении №конца до 71 аминокислоты включительно (см. пример 10), начиная от сайта ΌΤΟ и включая нуклеотиды из этого кода для 71 аминокислоты.

Изобретение относится к полинуклеотиду нуклеиновых кислот, описанному в настоящем описании, в котором первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с нуклеиновыми кислотами, кодирующими любое число из 30-54 аминокислот, где каждый кодон может кодировать любую аминокислоту.

Изобретение относится к полинуклеотиду нуклеиновых кислот, описанному в настоящем описании, в котором первая специальная нуклеиновая кислота функционально связана с 47 кодонами, где первая из этих 35 или 47 аминокислот является аминокислотой Е или С.

Изобретение относится к полинуклеотиду нуклеиновых кислот, описанному в настоящем описании, включающему последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична соответствующим аминокислотам в 8Е0 ΙΌ N0: 3, то есть идентична этой части последовательностей в 8ЕЦ ΙΌ N0: 3, включая последовательности от первой и/или второй специальных нуклеиновых кислот в направлении Оконца до 35 или 47 аминокислот включительно (см. пример 11 для 47 аминокислот, начиная от сайта ΌΤΟ и включая нуклеотиды из этого кода для предыдущих 35 или 47 аминокислот до сайта ΌΤΟ). Полинуклеотид нуклеиновых кислот по настоящему изобретению идентичен соответствующим аминокислотам в 8Е0 ΙΌ N0: 3, то есть идентичен последовательностям в 8Е0 ΙΌ N0: 3, включая последовательности от первой и/или второй специальных нуклеиновых кислот в направлении №конца до 35 или 47 аминокислот включительно, см. пример 11 для 47 аминокислот, начиная от сайта ΌΤΟ и включая нуклеотиды из этого кода для предыдущих 35 или 47 аминокислот до сайта ΌΤΟ.

Выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает полинуклеотид, кодирующий полипептид Ни-Лкр и имеющий нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична последовательности, выбираемой из группы, состоящей из:

(a) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид Ни-Лкр, выбираемый из группы, состоящей из Ни-Л8р1, Ни-Л8р2(а) и Ни-Л8р2(Ь), где указанные полипептиды Ни-Л8р1, Ни-Л8р2(а) и Ни-Л8р2(Ь) имеют соответственно полную аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, 8ЕЦ ΙΌ N0: 4 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 6; и (b) нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности по п.(а).

Изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, в которой указанный полипептид Ни-Лкр является Ни-Л8р1 и указанная молекула полинуклеотида включает нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 1; и к молекуле нуклеиновой кислоты, в которой указанный полипептид Ни-Лкр является Ни-Л8р2(а) и указанная молекула полинуклеотида включает нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ΙΌ

- 5 009216

N0: 3; и к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид Ни-Акр, который является НиАкр2(Ь) и указанная молекула полинуклеотида включает нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 5. Настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, включающей полинуклеотид, который гибридизирует в строгих условиях с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность, описанную выше. Изобретение также относится к вектору, включающему молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в настоящем описании. Необязательно, вектор по п.97 содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая функционально связана с промотором для экспрессии полипептида Ни-Акр, такого как Ни-Акр1, Ни-Акр2(а) или Ни-Акр2(Ь). Настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей вектор, описанный выше. Изобретение относится к способу получения полипептида Ни-Акр, предусматривающему культивирование клетки-хозяина, описанной выше, и выделение указанного полипептида Ни-Акр. Изобретение относится к выделенному полипептиду Ни-Акр1, содержащему аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична последовательности, включающей аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, к выделенному полипептиду Ни-Акр2(а), содержащему аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична последовательности, включающей аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, к выделенному полипептиду Ни-Акр2(а), содержащему аминокислотную последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична последовательности, содержащей аминокислотную последовательность 8ЕЦ Ш N0: 8. Изобретение также относится к выделенному антителу, которое специфически связывается с полипептидом Ни-Акр, описанным здесь.

Далее приведено несколько способов анализа этого фермента.

Изобретение относится к способу идентификации клетки, предназначенный для скрининга ингибиторов активности β-секретазы, который включает:

(а) идентификацию клетки, экспрессирующей протеазу, способную расщеплять АРР на сайте βсекретазы, в процессе которой производят:

ί) сбор клеток или супернатанта с идентифицируемых клеток;

ίί) измерение продуцирования требуемого пептида, который выбирают из группы, состоящей из Сконцевого пептида АРР или растворимого АРР;

ϊϊΐ) отбор клеток, продуцирующих требуемый пептид.

В одном из вариантов осуществления собирают клетки и требуемый пептид определяют как С-концевой пептид АРР, полученный в результате расщепления β-секретазой. В другом варианте осуществления, собирают супернатант и требуемый пептид представляет собой растворимый С-концевой АРР, полученный в результате расщепления β-секретазой. В одном из вариантов осуществления клетки содержат любые нуклеиновые кислоты или полипептиды, описанные выше, и было показано, что клетки могут расщеплеплять сайт β-секретазы любого пептида со следующей структурой Р2, Р1, Р1', Р2' , где Р2 обозначает К или N Р1 обозначает М или Ь, Р1' обозначает Ό и Р2' обозначает А. Еще в одном варианте осуществления Р2 обозначает К и Р1 обозначает М или Р2 обозначает N и Р1 обозначает Ь.

Изобретение относится к любой бактериальной клетке, содержащей любые нуклеиновые кислоты или пептиды, описанные в настоящем описании, например к бактериальной клетке, такой как Е. со11. Изобретение также отнсоится к любой эукариотической клетке, содержащей любые нуклеиновые кислоты или полипептиды, описанные в настоящем описании.

Настоящее изобретение относится к клеткам насекомых, содержащим любые нуклеиновые кислоты или полипептиды, описанные в настоящем описании. Эти клетки насекомых включают в себя кГ9 и Н1дй 5. Изобретение также относится к клеткам млекопитающих, содержащим любые нуклеиновые кислоты или полипептиды, описанные здесь. Примеры клеток млекопитающих могут быть выбраны из группы, состоящей из человека, грызуна, лагоморфа и примата. Характерная клетка человека может быть выбрана из группы, состоящей из НЕК293 и ΙΜΚ32. Характерной клеткой примата может быть клетка С08-7. Клетка грызуна может быть выбрана из клеток СН0-К1, №иго-2А и 3Т3. Изобретение также относится к дрожжевой клетке или клетке птицы, содержащей любые нуклеиновые кислоты или полипептиды, описанные в настоящем описании.

Изобретение относится к изоформе АРР, в которой две последние аминокислоты карбоксильного конца являются остатками лизина. Изоформой является любой полипептид АРР, включая варианты АРР (в том числе мутации) и фрагменты АРР, существующие в организме человека, которые аналогичны описанным в патенте США № 57 6684 6, столбец 7, строки 45-67, включенном в это описание изобретения в качестве ссылки. В одном из вариантов осуществления изоформа АРР включает изоформу, известную как АРР695, модифицированную так, что две ее последние аминокислоты имеют два остатка лизина аналогично двум ее последним аминокислотам карбоксильного конца. Например, изоформа АРР включает 8ЕЦ ΙΌ N0: 16 или вариант изоформы АРР включает 8ЕЦ ΙΌ N0: 18 или 20. Изобретение также относится к любой линии эукариотических клеток, содержащих нуклеиновые кислоты, кодируемые модифицированной изоформой АРР, или полипептидам, содержащим модифицированные изоформы АРР. Линией клеток может быть любая линия клеток млекопитающего (НЕК293, №иго2а). Изобретение также относится к способу идентификации ингибиторов фермента, расщепляющего сайт АРР, расщепляемый бета-секретазой, в котором предусмотрено:

- 6 009216

a) культивирование клеток в культуральной среде в условиях, в которых фермент вызывает процессинг АРР и высвобождение амилоидного бета-пептида в среду, а также вызывает накопление фрагментов СТР99 АРР в клеточных лизатах;

b) подвергание культивируемых клеток воздействию испытуемого соединения и специфическое определение способности испытуемого соединения ингибировать функцию этого фермента, измеряя количество амилоидного бета-пептида, высвобождаемого в среду, или количество фрагментов СТР99 АРР в клеточных лизатах;

c) идентификацию испытуемых соединений, уменьшающих количество растворимого амилоидного бета-пептида в культуральной среде и уменьшающих количество фрагментов СТР99 АРР в клеточных лизатах, в качестве ингибиторов Акр2.

В характерном варианте осуществления культивируемыми клетками являются клетки линии человека, грызуна или насекомого. Также в рамках настоящего изобретения предусмотрена линия клеток человека или грызуна, которая характеризуется активностью β-секретазы, вызывающей процессинг АРР с высвобождением амилоидного бета-пептида в культуральную среду и накоплением СТР99 в клеточных лизатах. Также среди рассматриваемых исследуемых соединений находятся антисмысловые олигомеры, направленные на фермент, обладающий активностью β-секретазы, уменьшающие высвобождение растворимого амилоидного бета-пептида в культуральную среду и накопление СТР99 в клеточных лизатах. Способ идентификации агента, уменьшающего активность полипептида Ни-Акр, выбираемого из группы, включающей Ни-Акр1, Ни-Акр2(а) и Ни-Акр2(Ь), включает:

a) определение активности указанного полипептида Ни-Акр в присутствии и в отсутствие испытуемого агента и

b) сравнение активности указанного полипептида Ни-Акр, определенной в присутствии и в отсутствие указанного испытуемого агента;

при этом более низкая активность в присутствии или в отсутствие указанного испытуемого агента свидетельствует о том, что указанный испытуемый агент уменьшает активность указанного полипептида Ни-Акр. Далее описаны нуклеиновые кислоты, пептиды, белки, векторы, клетки, линии клеток и анализы.

Настоящее изобретение представляет выделенные молекулы нуклеиновых кислот, включающие полинуклеотид, кодирующие полипептид, выбираемый из группы, включающей аспарагилпротеазы человека, в частности аспарагилпротеазу человека 1 (Ни-Акр1) и два альтернативных сплайсированных варианта аспарагилпротеазы человека 2 (Ни-Акр2), именуемых здесь Ни-Акр2(а) и Ни-Акр2(Ь). В используемом здесь значении все ссылки на Ни-Акр относятся ко всем Ни-Акр1, Ни-Акр2(а) и Ни-Акр2(Ь). Кроме того, в используемом здесь значении все ссылки на Ни-Акр2 относятся как к Ни-Акр2(а), так и к НиАкр2(Ь). Ни-Акр1 наиболее широко экспрессирована в тканях поджелудочной и предстательной железы, в то время как Ни-Акр2(а) и Ни-Акр2(Ь) наиболее широко экспрессированы в тканях поджелудочной железы и головного мозга. Изобретение также представляет выделенные полипептиды Ни-Акр1, Ни-Акр2(а) и Ни-Акр2(Ь), а также их фрагменты, обладающие активностью аспарагилпротеазы.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновой кислоты включают полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из остатков 1-1554 8ЕС ГО N0: 1, кодирующих Ни-Акр1, остатков 1-1503 8ЕЦ ГО N0: 3, кодирующих Ни-Акр2(а), и остатков 1-1428 8ЕЦ ГО N0: 5, кодирующих Ни-Акр2(Ь). Другим объектом этого изобретения является выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая полинуклеотид, гибридизирующий в строгих условиях с полинуклеотидом, кодирующим Ни-Акр1, Ни-Акр2(а), Ни-Акр2(Ь) или их фрагменты. В европейской патентной заявке ЕР 0848062 описан полипептид, именуемый Акр1, который характеризуется значительной гомологией с Ни-Акр1, и в международной заявке \¥0 98/22597 описан полипептид, именуемый Акр2, который характеризуется значительной гомологией с Ни-Акр2(а).

Настоящее изобретение относится также к векторам, содержащим выделенные молекулы нуклеиновой кислоты по этому изобретению, к клеткам-хозяевам, в которые вводят такие векторы, и к методам рекомбинантных ДНК для получения полипептида Ни-Акр1, Ни-Акр2(а) или Ни-Акр2(Ь), которые включают культивирование вышеописанной клетки-хозяина и выделение требуемого полипептида.

Другим объектом этого изобретения являются выделенные полипептиды Ни-Акр 1, Ни-Акр2(а) и Ни-Акр2(Ь), а также их фрагменты. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептиды Ни-Акр1, Ни-Акр2(а) и Ни-Акр2(Ь) имеют аминокислотную последовательность, приведенную соответственно в 8ЕС ГО N0: 2, 8ЕЦ ГО N0: 4 или 8ЕЦ ГО N0: 6. Настоящее изобретение относится также к активным формам Ни-Акр2, способам получения таких активных форм, способам получения растворимых форм, способам измерения активности Ни-Акр2 и субстратам для расщепления Ни-Акр2. Изобретение относится также к антисмысловым олигомерам, нацеленным на транскрипты мРНК Ни-Акр1, НиАкр2(а) и Ни-Акр2(Ь), и к применению таких антисмысловых реагентов для уменьшения такой мРНК и последующего получения соответствующего полипептида. Это изобретение относится также к выделенным антителам, как поликлональным, так и моноклональным, которые специфически связываются с любыми полипептидами Ни-Акр1, Ни-Акр2(а) и Ни-Акр2(Ь) по изобретению.

Изобретение относится также к способу идентификации агента, модулирующего активность любого Ни-Акр1, Ни-Акр2(а) и Ни-Акр2(Ь). В этом изобретении описаны способы испытания таких агентов при

- 7 009216 помощи бесклеточных анализов, к которым добавляют полипептид Ни-А§р2, а также способы испытания таких агентов в клетках человека или других млекопитающих, в которых присутствует Ни-А§р2.

Краткое описание последовательностей

Последовательность ГО N0: 1 - А§р1 человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ГО N0: 2 - А§р1 человека, предполагаемая аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 3 - А§р2(а) человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ГО N0: 4 - А§р2(а) человека, предполагаемая аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 5 - А§р2(Ь) человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ГО N0: 6 - А§р2(Ь) человека, предполагаемая аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 7 - А§р2(а) мыши, нуклеотидная последовательность. Последовательность ГО N0: 8 - А§р2(а) мыши, предполагаемая аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 9 - АРР695 человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ГО N0: 10 - АРР695 человека, предполагаемая аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 11 - АРР695-8те человека, нуклеотидная последовательность.

Последовательность ГО N0: 12 - АРР695-5>\у человека, предполагаемая аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 13 - АРР695-УГ человека, нуклеотидная последовательность.

Последовательность ГО N0: 14 - АРР695-УЕ человека, предполагаемая аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 15 - АРР695-КК человека, нуклеотидная последовательность.

Последовательность ГО N0: 16 - АРР695-КК человека, предполагаемая аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 17 - АРР695-8^-КК человека, нуклеотидная последовательность.

Последовательность ГО N0: 18 - АРР695-Бет-КК человека, предполагаемая аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 19 - АРР695-УР-КК человека, нуклеотидная последовательность.

Последовательность ГО N0: 20 - АРР695-УЕ-КК человека, предполагаемая аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 21 - Т7-пре-А§р2(а)ДТМ человека, нуклеотидная последовательность. Последовательность ГО N0: 22 - Т7-пре-А§р2(а)ДТМ человека, аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 23 - Т7-Са8ра8е-пре-А8р2(а)ДТМ человека, нуклеотидная последовательность.

Последовательность ГО N0: 24 - Т7-Са8ра8е-пре-А8р2(а)ДТМ человека, аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 25 - пре-А§р2(а)ДТМ человека (нижний СС), нуклеотидная последовательность.

Последовательность ГО N0: 26 - пре-А§р2(а)ДТМ человека (нижний СС), аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 27 - Т7-Са5ра5е-Са8ра8е-8 расщепление-пре-А§р2(а)ДТМ человека, нуклеотидная последовательность.

Последовательность ГО N0: 28 - Т7-Са5ра5е-Са8ра8е-8 расщепление-пре-А§р2(а)ДТМ человека, аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 29 - А§р2(а)ДТМ человека, нуклеотидная последовательность.

Последовательность ГО N0: 30 - А§р2(а)ДТМ человека, аминокислотная последовательность.

Последовательность ГО N0: 31 - А8р2(а)ДТМ(Нщ)₆ человека, нуклеотидная последовательность.

Последовательность ГО N0: 32 - А8р2(а)ДТМ(Нщ)₆ человека, аминокислотная последовательность. Последовательности ГО N0: 33-46 описаны ниже в разделе Подробное описание изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. На фиг. 1 показаны нуклеотидная последовательность (8Е0 ГО N0: 1) и предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 2) А§р1 человека.

Фиг. 2. На фиг. 2 показаны нуклеотидная последовательность (8Е0 ГО N0: 5) и предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 6) А§р2(Ь) человека.

Фиг. 3. На фиг. 3 показаны нуклеотидная последовательность (8Е0 ГО N0: 3) и предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 4) А§р2(а) человека.

Фиг. 4. На фиг. 4 показаны нуклеотидная последовательность (8Е0 ГО N0: 7) и предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 8) А§р2(а) мыши.

Фиг. 5. На фиг. 5 показан сравнительный анализ по программе ВейРй предполагаемых аминокислотных последовательностей Ни-А§р2(а) (8ЕЦ ГО N0: 4) человека и А§р2(а) (8ЕЦ ГО N0: 8) мыши.

Фиг. 6. На фиг. 6 показаны нуклеотидная последовательность (8Е0 ГО N0: 21) и предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 22) Т7-пре-А§р2(а)ДТМ человека.

Фиг. 7. На фиг. 7 показаны нуклеотидная последовательность (8Е0 ГО N0: 23) и предполагаемая

- 8 009216 аминокислотная последовательность (8ЕО ΙΌ N0: 24) Т7-каспаз-пре-Акр2(а)ДТМ человека.

Фиг. 8. На фиг. 8 показаны нуклеотидная последовательность (8Е0 ГО N0: 25) и предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 26) пре-Акр2(а)ДТМ человека (нижний ОС).

Фиг. 9. Вестерн-блот, показывающий уменьшение продуцирования СТЕ99 клетками НЕК125.3, трансфецированными антисмысловыми олигомерами, нацеленными на Ни-Акр2 Мгла.

Фиг. 10. Вестерн-блот, показывающий, что увеличение продуцирования СТР99 в клетках №иго-2а мыши, котрансфецированных АРР-КК с Ни-Акр2 и без Ни-Акр2, наблюдается только в клетках, котрансфецированных Ни-Акр2. Дальнейшее увеличение продуцирования СТР99 в клетках, котрансфецированных АРР-8\г-КК с Ни-Акр2 и без Ни-Акр2, наблюдается только в клетках, котрансфецированных Ни-Акр2.

Фиг. 11. На фиг. 11 показана предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 30) Акр2(а)ДТМ человека.

Фиг. 12. На фиг. 12 показана предполагаемая аминокислотная последовательность (8Е0 ГО N0: 30) Акр2(а)ДТМ(Н1к)₆ человека.

Подробное описание изобретения

Далее дано определение нескольких терминов, используемых в этом описании изобретения, причем большинство используемых терминов имеют обычное значение, известное специалистам в этой области.

Термин β-амилоидный пептид означает любой пептид, получаемый в результате расщепления АРР бета-секретазой. Этот термин относится к пептидам, состоящим из 39, 40, 41, 42 и 43 аминокислот, которые расположены от сайта расщепления β-секретазой и включают 39, 40, 41, 42 и 43 аминокислоты. В определение β-амилоидного пептида входят также последовательности 1-6, 8Е0 ГО N0: 1-6, описанные в патенте США № 575034 9, выданном 12 мая 1998г. (включен в это описание изобретения в качестве ссылки). Рассматриваемый здесь фрагмент расщепления β-секретазой именуется СТЕ-99 и расположен от сайта расщепления β-секретазой до карбоксильного конца АРР.

Термин изоформа АРР означает любой полипептид АРР, включая варианты АРР (в том числе мутации) и фрагменты АРР, имеющиеся в организме человека, аналогичные описанным в патенте США № 5766846, столбец 7, строки 45-67, который включен в это описание изобретения в качестве ссылки (см. ниже).

Термин предшественник β-амилоидного белка (АРР) в используемом здесь значении означает полипептид, кодируемый геном того же названия, локализованным в организме человека на длинном плече хромосомы 21, и включающий βАР, именуемый здесь β-амилоидный белок (см. выше) в своей карбоксильной трети. АРР является гликозилированным, одномембранным соединяющим белком, экспрессированным в целом ряде клеток во многих тканях млекопитающего. Примерами специфических изотипов АРР, обнаруженных у человека, являются полипептид, состоящий из 695 аминокислот, описанный Капд с1 а1. (1987) №1Шгс 325: 733-736, который назван нормальным АРР; полипептид, состоящий из 751 аминокислоты, описанный Роп1с с1 а1. (1988) №1Шгс 331: 525-527 анб Тан/ί с1 а1. (1988) №1Шгс 331: 528530; и полипептид, состоящий из 770 аминокислот, описанный КйадисЫ е1 а1. (1988) №11игс 331: 530-532. Примерами специфических вариантов АРР являются точковая мутация, которая может быть различной в обоих положениях, и фенотип (для ознакомления с известной вариантной мутацией см. Нагбу (1992) №1Шгс СспсЕ 1: 233-234). Все приведенные материалы включены в это описание изобретения в качестве ссылки. Термин фрагменты АРР в используемом здесь значении означает любые фрагменты АРР кроме тех, которые состоят только из βАР или фрагментов βАР. То есть фрагменты АРР включают дополнительные аминокислотные последовательности АРР помимо тех, которые образуют интактный 3АР или фрагмент βАР.

Термин любая аминокислота означает аминокислоты, выбираемые из нижеследующего списка, сопровождаемого трехбуквенными и однобуквенными аббревиатурами: алании, А1а, А; аргинин, Агд, К; аспарагин, Акп, N аспарагиновая кислота, Акр, Ό; цистеин, Сук, С; глутамин, С1п. О; глутаминовая кислота, О1и, Е; глицин, О1у, О; гистидин, Н1к, Н; изолейцин, 11с, I; лейцин, Ьси, Ь; лизин, Ьук, К; метионин, МсЕ М; фенилаланин, Рйс, Е; пролин, Рго, Р; серии, 8сг, 8; треонин, Тйг, Т; триптофан, Тгр, ^; тирозин, Туг, Υ; валин, Уа1, V; аспарагиновая кислота или аспарагин, Акх, В; глутаминовая кислота или глутамин, О1х, Ζ; любая аминокислота, Хаа, X.

Настоящее изобретение относится к методу поиска в базе данных по структуре гена простого мотива активного сайта, характерного для аспарагилпротеаз. Эукариотические аспарагилпротеазы, такие как пепсин и ренин, имеют двухдоменную структуру цепи, при укладке которой два остатка аспарагила располагаются рядом друг с другом на активном сайте. Они образуют короткий трипептидный мотив ЭТО или более редко Э8С. Большая часть аспарагилпротеаз существуют в виде профермента, для активации которого необходимо расщепить его №конец. Мотив активного сайта ЭТО или Ό8Ο находится примерно около остатка 65-70 в проферменте (проренин, пепсиноген) и примерно около остатка 25-30 в активном ферменте после расщепления ^концевого продомена. Ограниченная длина мотива активного сайта затрудняет его поиск в коллекциях меток коротких экспрессированных последовательностей (Е8Т) для получения новых аспарагилпротеаз. Последовательности Е8Т обычно имеют, в среднем, 250 нуклеотидов или меньше и таким образом кодируют остатки 80-90 аминокислот или меньше. Такая последовательность должна быть очень короткой, чтобы можно было соединять элементы двух активных сайтов. Предпочтительным методом является поиск в базах данных гипотетических или собранных последова

- 9 009216 тельностей, кодирующих белок. Настоящее изобретение относится к компьютерному методу идентификации предполагаемых аспарагилпротеаз в базах данных белковых последовательностей. Этот метод использован для идентификации семи предполагаемых последовательностей аспарагилпротеазы в геноме СаепогйаЬбйщ с1сдап5. Эти последовательности затем были использованы для идентификации путем выявления гомологии между Ни-А§р1 и двумя альтернативными сплайсированными вариантами Ηιι-ΛφΣ. именуемыми здесь Ни-А§р2(а) и Ни-А§р2(Ь).

Основным объектом этого изобретения является получение новых данных о процессинге АРР. Патогенный процессинг предшественника амилоидного белка (АРР) по пути образования Αβ требует последовательного действия двух протеаз. именуемых β-секретазой и γ-секретазой. Расщепление АРР βсекретазой и γ-секретазой вызывает образование соответственно Ν-конца и С-конца Λβ-пептида. Поскольку избыточное продуцирование Αβ-пептида, в частности Αβ_1-42, ведет к возникновению болезни Альцгеймера, то ингибиторы β-секретазы и/или γ-секретазы могут оказаться полезными для лечения болезни Альцгеймера. Несмотря на важное значение β-секретазы и γ-секретазы в патогенном процессинге АРР, до сих пор не была изучена молекулярная структура этих ферментов. То есть не было известно, какие ферменты необходимы для расщепления по сайту расщепления β-секретазы или γ-секретазы. Сами эти сайты были известны, поскольку были известны АРР и пептид Αβ_1-42 (см. патенты США №№ 5766846 и 5837672, которые включены в это описание изобретения в качестве ссылки за исключением определения растворимые пептиды). Но не было известно, какой фермент участвует в образовании пептида Αβ_1-42.

Настоящее изобретение относится к определению молекулярной структуры нескольких новых аспарагилпротеаз человека, причем одна из них, именуемая Ни-А§р2(а) и Ни-А8р2(Ь), подробно рассмотрена в этом описании изобретения. Предшествующие формы Акр1 и Акр2 описаны в ЕР 0848062 А1 и ЕР 0855444 Λ2, авторы изобретения Όπνίά Ро\ге1 е1 а1., право на патент принадлежит компании 8тйй К11пе Веесйат Согр. (включены в это описание изобретения в качестве ссылки). В этом описании изобретения рассмотрены старые и новые формы Ни-А§р2. Они впервые экспрессированы в активной форме, описаны их субстраты и выявлены их специфические особенности. Если раньше для расщепления сайта β-секретазы были необходимые клетки или клеточные экстракты, то теперь при выполнении анализов, которые также рассмотрены в этом описании изобретения, можно использовать очищенный белок. На основании результатов (1) экспериментов по обработке антисмысловыми олигомерами, (2) экспериментов по временной трансфекции и (3) биохимических экспериментов с использованием очищенной рекомбинантной НиАкр2 авторы этого изобретения продемонстрировали, что Ни-А§р2 является β-секретазой, участвующей в процессинге АРР. Несмотря на то, что была обнаружена нуклеотидная и предполагаемая аминокислотная последовательность Ни-А§р2(а) (см. ЕР 0848062 Λ2 и ЕР 0855444 Λ2), не было выполнено функциональное исследование этого фермента. Авторы этого изобретения всесторонне описывают фермент Ни-А§р2 и объясняют, почему он существенен и необходим для образования пептида Αβ_1-42 и, по-видимому, представляет собой существенный фактор в возникновении болезни Альцгеймера.

В другом варианте осуществления изобретения описан также новый сплайсированный вариант НиАкр2, именуемый Ни-А8р2(Ь), который ранее не был исследован.

Другой вариант осуществления изобретения относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим полинуклеотид, кодирующий полипептид, выбираемый из группы, состоящей из аспарагилпротеазы 1 человека (Ни-А§р1) и двух альтернативных сплайсированных вариантов аспарагилпротеазы человека 2 (Ни-А8р2), именуемых здесь Ни-А§р2(а) и Ни-А§р2(Ь). В используемом здесь значении все определения Ни-А§р2 относятся как к Ни-А8р2(а), так и к Ни-А§р2(Ь). Ни-А§р1 наиболее широко экспрессирована в тканях поджелудочной и предстательной железы, в то время как Ни-А§р2(а) и НиАкр2(Ь) наиболее широко экспрессированы в тканях поджелудочной железы и головного мозга. Это изобретение относится также к выделенным полипептидам Ни-А8р1, Ни-А§р2(а) и Ни-А8р2(Ь), а также к их фрагментам, которые обладают активностью аспарагилпротеазы.

Предполагаемые аминокислотные последовательности Ни-А8р1, Ни-А§р2(а) и Ни-А§р2(Ь) обладают значительной гомологией с ранее идентифицированными аспарагилпротеазами млекопитающих, такими как пепсиноген А, пепсиноген В, катепсин Ό, катепсин Е и ренин. Р.В. Зхесх 8сапб. 1. С1ш. ЬаЬ. 1пуе51. 52 (8ирр1. 210 5-22 (1992)). Эти ферменты характеризуются наличием двух мотивов последовательностей ΌΤΟ/ϋδΟ. Описанные здесь полипептиды Ни-А§р1 и Ни-А§р2 обладают также исключительно высокой гомологией с консенсусными мотивами Рго8йе для аспарагилпротеаз, полученных из базы данных 8М§&Рго1.

Нуклеотидная последовательность, выраженная остатками 1-1554 8ЕО Ш ΝΟ: 1, соответствует нуклеотидной последовательности, кодирующей Нп-АкрЕ нуклеотидная последовательность, выраженная остатками 1-1503 8ЕО Ш ΝΟ: 3, соответствует нуклеотидной последовательности, кодирующей НиАкр2(а), и нуклеотидная последовательность, выраженная остатками 1-1428 8ЕО Ш ΝΟ: 5, соответствует нуклеотидной последовательности, кодирующей Ни-А§р2(Ь). Выделение и секвенирование ДНК, кодирующей Нп-АкрЕ Ни-А§р2(а) и Ни-А8р2(Ь), описано ниже в примерах 1 и 2.

Как указано в примерах 1 и 2, для получения нуклеотидной последовательности Нп-АкрЕ НиАкр2(а) и Ни-А§р2(Ь) использованы автоматические методы секвенирования. Нуклеотидные последовательности Ни-Акр по настоящему изобретению получены для обеих цепей ДНК и, предположительно,

- 10 009216 совпадают на 100%. Однако, как известно в этой области, нуклеотидная последовательность, полученная при помощи таких автоматических методов, может содержать некоторые ошибки. Нуклеотидные последовательности, полученные автоматическими методами, идентичны действительной нуклеотидной последовательности данной молекулы нуклеиновой кислоты обычно по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95%-99,9%. Действительная последовательность может быть определена с большей степенью точности при помощи ручных методов секвенирования, которые хорошо известны в этой области. Ошибка в последовательности, ведущая к инсерции или делеции одного или нескольких нуклеотидов, может вызвать сдвиг рамки считывания в процессе трансляции, так что предполагаемая аминокислотная последовательность будет отличаться от последовательности, созданной из действительной нуклеотидной последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, начиная с точки мутации. ДНК НиАкр по настоящему изобретению включает кДНК, химически синтезированную ДНК, ДНК, выделенную с помощью ПЦР, геномную ДНК и их комбинации. Геномную ДНК Ни-Акр можно получить путем скрининга геномной библиотеки с использованием описанной здесь кДНК Ни-Акр2 при помощи методов, известных в этой области, или с использованием олигонуклеотидов, выбираемых из последовательности Ни-Акр2, которые служат в качестве затравка для полимеразной цепной реакции (РСК.). В объем настоящего изобретения входит также РНК, транскрибированная из ДНК Ни-Акр.

Вследствие вырожденности генетического кода две последовательности ДНК могут отличаться друг от друга и при этом кодировать одинаковые аминокислотные последовательности. Таким образом, настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, имеющим полинуклеотидную последовательность, кодирующую любые полипептиды Ни-Акр по этому изобретению, причем указанная полинуклеотидная последовательность кодирует полипептид Ни-Акр, имеющий полную аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2, 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, 8ЕЦ ΙΌ N0: 6 или их фрагменты.

Это изобретение относится также к очищенным полипептидам Ни-Акр, как рекомбинантным, так и нерекомбинантным. Важнейшей особенностью этого изобретения является то, что оно относится к способам получения полипептидов Ни-Акр2 в активной форме. Эти способы включают получение полипептидов Ни-Акр2 и их вариантов в бактериальных клетках, клетках насекомого и клетках млекопитающего, а также в формах, которые позволяют секретировать полипептид Ни-Акр2 из бактериальных клеток и клеток насекомого или млекопитающего в культуральную среду, а также к получению вариантов полипептида Ни-Акр2, содержащих аминокислотные метки, облегчающие последующую очистку. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид Ни-Акр2 превращают в протеолитически активную форму или в трансформированных клетках, или после очистки и расщепления второй протеазой в бесклеточной системе, причем такие активные формы полипептида Ни-Акр2 начинаются Νконцевой последовательностью Т0НС1К (8ЕЦ ΙΌ N0: 56) или ЕТЭЕЕР (8ЕЦ ΙΌ N0: 57). В объем этого изобретения входят также варианты и производные, в том числе фрагменты белков Ни-Акр, имеющие нативные аминокислотные последовательности, приведенные в 8Е0 ΙΌ N0: 2, 4 и 6, которые сохраняют биологическую активность Ни-Акр. Специалисты в этой области могут легко определить, обладает ли вариант, производное или фрагмент белка Ни-Акр активностью Ни-Акр, подвергая указанный вариант, производное или фрагмент стандартному анализу на аспарагилпротеазу. В объем этого изобретения входят фрагменты Ни-Акр, имеющие домен активного сайта аминокислотной последовательности ЭТО, фрагменты, имеющие домен активного сайта аминокислотной последовательности Ό80, фрагменты, содержащие обе последовательности активного сайта ЭТО и Ό80, фрагменты, в которых увеличено пространство, занимаемое последовательностями активного сайта ЭТО и Ό80, и фрагменты, в которых указанное пространство укорочено. Кроме того, в объем этого изобретения входят фрагменты Ни-Акр, в которых удален трансмембранный домен, что позволяет получить Ни-Акр2 в растворимой форме. В другом варианте осуществления изобретения две половины Ни-Акр2, каждая из которых содержит одну последовательность активного сайта ЭТО или Ό80, можно получить отдельно в виде рекомбинантных полипептидов и затем соединить их в растворе, в котором они восстанавливаются в виде активной протеазы.

Варианты Ни-Акр можно получить, например, мутацией нативных нуклеотидных последовательностей, кодирующих Ни-Акр. Вариант Ни-Акр в используемом здесь значении представляет собой полипептид, по существу, гомологичный нативному полипептиду Ни-Акр, но имеющий аминокислотную последовательность, которая отличается от такой же последовательности в нативном Ни-Акр благодаря наличию одной или нескольких делеций, инсерций или замен в аминокислотной последовательности. Вариант аминокислотной или нуклеотидной последовательности предпочтительно идентичен нативной последовательности Ни-Акр по крайней мере на 80%, более предпочтительно на 90% и наиболее предпочтительно на 95%. Таким образом, вариант нуклеотидной последовательности, который содержит, например, пять точковых мутаций на каждые сто нуклеотидов по сравнению с геном нативной Ни-Акр, будет на 95% идентичен нативному белку. Процентное значение идентичности последовательности, определяемой также термином гомология, между нативной и вариантной последовательностью Ни-Акр можно определить, например, сравнивая две последовательности при помощи компьютерных программ, обычно используемых для этой цели, таких как программа Оар (\У|ксопкш 8ес.|иепсе Апа1ук1к Раскаде, Уегкюп 8 Гог Ишх, Сепебск Сопрц1ег Огоир, Ищуегкйу Кекеагсй Рагк, Маб1коп, \У|ксопкт). в которой использован алгоритм Смита и Уотермена (Абу. Арр1. Ма1й. 2: 482-489 (1981)).

- 11 009216

Нативную аминокислотную последовательность можно изменить любыми известными методами. Например, мутации в определенных местах можно произвести при помощи хорошо известных методов, такие как олигонуклеотиднаправленный мутагенез, который описан \Уа1бсг с! а1. (Сепс 42: 133 (1986)); Ваиег с! а1. (Оспе 37: 73 (1985)); Сга1к (ВюТсс11пк|исз. 1апиагу 1985, рр. 12-19); 8тИй с! а1. (СепсИс Епдтссгтд: Ргтс1р1сз апб МеШобз, Р1спит Ргезз (1981)) и в патентах США №№ 4518584 и 4737462.

Варианты Ни-Азр, входящие в объем этого изобретения, могут содержать консервативно замещенные последовательности, т.е. в которых один или несколько аминокислотных остатков полипептида НиАзр заменены другими остатками, не изменяющими вторичную и/или третичную структуру полипептида Ни-Азр. Такие замещения могут включать замену аминокислоты остатком, имеющим аналогичные физико-химические свойства, например замещение одного алифатического остатка (11с, Уа1, Ьеи или А1а) другим или попарную замену основных остатков Ьуз и Агд, кислотных остатков С1и и Азр, амидных остатков С1п и Азп, гидроксильных остатков 8сг и Туг или ароматических остатков Рйс и Туг. Другая информация, касающаяся выполнения фенотипически молчащих замен аминокислот, приведена в работе Во\\1с с! а1., 8с1сисс 247: 1306-1310 (1990). Другими вариантами Ни-Азр, способными сохранять биологическую активность Ни-Азр, являются такие варианты, в которых замещения аминокислот произведены на участках за пределами функциональных областей белка.

Другим объектом этого изобретения является выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид, который гибридизирует в строгих условиях с частью вышеописанных молекул нуклеиновых кислот, например примерно с 15 нуклеотидами, предпочтительно примерно с 20 нуклеотидами, более предпочтительно примерно с 30 нуклеотидами и еще более предпочтительно примерно с 30100 нуклеотидами одной из вышеописанных молекул нуклеиновых кислот. Такие части молекул нуклеиновых кислот, имеющие указанную длину, состоят по крайней мере из 15 смежных нуклеотидов эталонной молекулы нуклеиновой кислоты. Строгие условия гибридизации означают инкубацию примерно при 42°С в течение 2,5 ч в 6-кратном объеме 88С/0,1% 8Ό8 и последующую промывку фильтров в однократном объеме 88С при 65°С, 0,1% 8Ό8.

Рассмотренные в этом описании изобретения фрагменты молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей Ни-Азр, а также полинуклеотиды, способные гибридизировать с такими молекулами нуклеиновой кислоты, можно использовать в качестве зонда или затравок в полимеразной цепной реакции (РСК.). Такие зонды можно использовать, например, для обнаружения наличия нуклеиновых кислот Ни-Азр при выполнении анализов ш νίίτο, а также саузерн- и нозерн-блоттинга. При помощи таких зондов можно также идентифицировать типы клеток, экспрессирующих Ни-Азр. Такие методы хорошо известны, и специалист в этой области может легко выбрать зонд требуемой длины для конкретного применения. При осуществлении ПЦР для выделения и амплификации последовательности известными методами используют 5'- и 3'-концевые затравки, соответствующие концам описанной молекулы нуклеиновой кислоты Ни-Азр.

Другими полезными фрагментами молекул нуклеиновой кислоты Ни-Азр являются антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды, содержащие одноцепочечную последовательность нуклеиновых кислот, способную связываться с целевой мРНК Ни-Азр (с использованием смысловой цепи) или ДНК Ни-Азр (с использованием антисмысловой цепи). В предпочтительном варианте осуществления изобретения эти антисмысловые олигонуклеотиды Ни-Азр уменьшают длину мРНК Ни-Азр и продуцируют полипептиды Ни-Азр.

Другим объектом этого изобретения являются полипептиды Ни-Азр с сопутствующим гликозилированием нативной структуры или без него. Как Ни-Азр1, так и Ни-Азр2 имеют обязательные акцепторные сайты для Азп-связанных сахаров, причем Ни-Азр1 имеет два таких сайта и Ни-Азр2 имеет четыре сайта. Ни-Азр, экспрессированная в экспрессирующих системах дрожжей или млекопитающего (описанных ниже), может быть аналогична нативному полипептиду Ни-Азр или существенно отличаться от него молекулярной массой и параметрами гликозилирования. Экспрессия Ни-Азр в бактериальных экспрессирующих системах позволяет получить негликозилированную Ни-Азр.

Полипептиды по настоящему изобретению предпочтительно получают в выделенной форме и предпочтительно очищают. Полипептиды Ни-Азр можно выделить и очистить от тканей, культивируемых клеток или культур рекомбинантных клеток хорошо известными методами, включая осаждение сульфатом аммония или этанолом, анионо- или катионообменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, гидроксилапатитную хроматографию, лектинную хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). В предпочтительном варианте осуществления изобретения аминокислотную метку вводят в полипептид Ни-Азр при помощи генноинженерных методов, хорошо известных специалистам в этой области, которые включают добавление шести аминокислотных остатков гистидина для очистки путем связывания с никелем, иммобилизованным на приемлемой подложке, эпитопами для поликлональных или моноклональных антител, которые включают, но не ограничиваются ими, эпитоп Т7, тус-эпитоп и эпитоп У5а, и слияния Ни-Азр2 с приемлемыми белковыми партнерами, которые включают, но не ограничиваются ими, глутатион-8-трансферазу или мальтозасвязывающий белок. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эти дополнительные аминокислотные последовательности присоединяют к С-концу Ни-Азр, но их можно присоединить и к Ν-концу или в промежуточных положениях полипептида Ни-Азр2.

Настоящее изобретение относится также к векторам, содержащим полинуклеотидные молекулы по

- 12 009216 этому изобретению, а также к клетке-хозяину, трансформированной такими векторами. Любые полинуклеотидные молекулы по этому изобретению можно присоединить к вектору, который обычно содержит селектируемый маркер и точку начала репликации для пролиферации в хозяине. Так как это изобретение относится также к полипептидам Ни-Акр, экспрессированным из вышеописанных полинуклеотидных молекул, желательно использовать векторы, предназначенные для экспрессии Ни-Акр. Векторы содержат ДНК, кодирующую любые выше- или нижеописанные полипептиды Ни-Акр, функционально связанные с приемлемыми транскрипционными или трансляционными регуляторными последовательностями, получаемыми из гена млекопитающего или насекомого, микробного или вирусного гена. Примерами регуляторных последовательностей являются транскрипционные промоторы, операторы, энхансеры, мРНК, рибосомасвязывающие сайты и приемлемые последовательности, которые регулируют транскрипцию и трансляцию. Нуклеотидные последовательности функционально связаны тогда, когда регуляторная последовательность находится в функциональной зависимости от ДНК, кодирующей Ни-Акр. Таким образом, промотор, представляющий собой нуклеотидную последовательность, функционально связан с последовательностью ДНК Ни-Акр, если этот промотор в виде нуклеотидной последовательности управляет транскрипцией последовательности Ни-Акр.

Выбор приемлемых векторов, используемых для клонирования полинуклеотидных молекул, кодирующих Ни-Акр, или для экспрессии полипептидов Ни-Акр, несомненно, зависит от клетки-хозяина, в которую переносят вектор, и в приемлемых случаях от клетки-хозяина, в которой должен быть экспрессирован полипептид Ни-Акр. Приемлемыми клетками-хозяевами для экспрессии полипептидов Ни-Акр являются прокариотические, дрожжевые и высшие эукариотические клетки, которые описаны ниже.

Полипептиды Ни-Акр, предназначенные для экспрессии в таких клетках-хозяевах, могут быть также слитыми белками, имеющими области из гетерологичных белков. Такие области могут быть введены, например, для обеспечения секреции, улучшенной стабильности или более легкой очистки полипептида. Например, в экспрессирующие векторы можно ввести последовательность, кодирующую соответствующий сигнальный пептид. Последовательность ДНК для сигнального пептида (секреторная лидерная последовательность) может быть слита в рамке считывания с последовательностью Ни-Акр так, что Ни-Акр будет транслироваться как слитый белок, содержащий сигнальный пептид. Сигнальный пептид, который является функционально активным в предполагаемой клетке-хозяине, стимулирует внеклеточную секрецию полипептида Ни-Акр. Сигнальная последовательность предпочтительно отщепляется от полипептида Ни-Акр во время секреции Ни-Акр из клетки. Неограничивающими примерами сигнальных последовательностей, которые можно использовать при осуществлении этого изобретения, являются дрожжевой Iфактор и лидерная последовательность пчелиного мелатина в клетках насекомого кГ9.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид Ни-Акр является слитым белком, который имеет гетерологичную область, используемую для облегчения очистки этого полипептида. Многие приемлемые пептиды, используемые для этой цели, обеспечивают избирательное связывание слитого белка с партнером связывания. Например, полипептид Ни-Акр можно модифицировать для получения пептида, образующего слитый белок, который специфически связывается с партнером связывания или пептидной меткой. Неограничивающими примерами таких пептидных меток являются метка 6-Н1к, тиоредоксиновая метка, гемаглутининовая метка, С8Т-метка и метка сигнальной последовательности ОтрА. Как должно быть понятно специалистам в этой области, партнер связывания, который распознает и связывается с пептидом, может быть любой молекулой или соединением, включающим ионы металла (например, аффинные колонки с металлом), антитела или их фрагменты и любой белок или пептид, который связывает такой пептид, как метка РЬАС.

Приемлемыми клетками-хозяевами для экспрессии полипептидов Ни-Акр являются прокариотические, дрожжевые и высшие эукариотические клетки. Приемлемыми прокариотическими клетками-хозяевами, предназначенными для экспрессии Ни-Акр, являются бактерии родов ЕксйепсЫа, ВасШик и 8а1топе11а, а также члены родов Ркеиботопак, 81гер!отусек и 8!арйу1ососсик. Для экспрессии, например, в Е. сой полипептид Ни-Акр может содержать Ν-концевой остаток метионина для облегчения экспрессии рекомбинантного полипептида в прокариотическом хозяине. Ν-концевой Ме! затем необязательно отщепляют от экспрессированного полипептида Ни-Акр. Для облегчения экспрессии в ЕксйепсЫа сой можно ввести другие Ν-концевые аминокислотные остатки, которые включают, но не ограничивают ими, лидерную последовательность Т7, лидерную последовательность Т7-каспазы 8, а также другие лидерные последовательности, содержащие метки для очистки, такие как метка 6-Н1к (пример 9). Полипептиды Ни-Акр, экспрессированные в Е. сой, можно укоротить, удаляя цитоплазматический конец, трансмембранный домен или область, прилегающую к мембране. Полипептиды Ни-Акр, экспрессированные в Е. сой, можно получить в растворимой или нерастворимой форме, которая может быть представлена, а может и не быть представлена тельцами включения. Нерастворимый полипептид можно сделать растворимым при помощи гуанидина-НС1, мочевины или других белковых денатурантов с последующей укладкой цепи в растворимой форме до или после очистки разведением или диализом в приемлемом водном буфере. Если при помощи методов рекомбинантных ДНК получена неактивная проформа Ни-Акр, ее можно сделать активной, отщепляя просегмент второй приемлемой протеазой, такой как протеаза вируса иммунодефицита человека.

Экспрессирующие векторы, предназначенные для использования в прокариотических хозяевах,

- 13 009216 обычно содержат один или более фенотипически селектируемых маркерных генов. Такие гены обычно кодируют, например, белок, который придает устойчивость к антибиотикам или соответствует ауксотрофным требованиям. Целый ряд таких векторов можно приобрести коммерческим путем. Примерами таких векторов являются векторы р8РОКТ, векторы рСЕМ (Рготеда), векторы рРКОЕХ (ЪТ1, ВеШекба, МО), векторы В1иекспр1 (81та1адеие), векторы рЕТ Щоуадеи) и векторы рЦЕ (фадеи).

Ни-Акр можно также экспрессировать в дрожжевых клетках-хозяевах из родов, включая 8ассйатотусек, Р1сЫа и К1иуеготусек. Предпочтительными дрожжевыми клетками-хозяевами являются 8. сетеуШае и Р. рак!опк. Дрожжевые векторы часто содержат последовательность начала репликации из дрожжевой плазмиды 2Т, автономно реплицирующую последовательность (АКБ), промоторную область, последовательности полиаденилирования, последовательности терминации транскрипции и селектируемый маркерный ген. Можно также использовать векторы, которые реплицируются как в дрожжевых клетках, так и в Е. сой (так называемые шаттл-векторы). Помимо вышеуказанных признаков дрожжевых векторов, шаттл-вектор содержит также последовательности для репликации и селекции в Е. сой. Прямую секрецию полипептидов Ни-Акр, экспрессированных в дрожжевых клетках-хозяевах, можно производить путем введения нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерную последовательность дрожжевого 1-фактора у 5'-конца нуклеотидной последовательности, кодирующей Ни-Акр.

Системы культур клеток-хозяев насекомого можно также использовать для экспрессии полипептидов Ни-Акр. В предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептиды Ни-Акр экспрессируют с использованием экспрессирующей системы на основе клеток насекомого (см. пример 10). Кроме того, для экспрессии в клетках насекомого можно использовать бакуловирусную экспресирующую систему, описанную Ьискоте и 8иттегк, Вю/Тес1то1оду 6: 47 (1988).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептид Ни-Акр экспрессируют в клетках-хозяевах млекопитающего. Неограничивающими примерами приемлемых линий клеток млекопитающего являются линия СО8-7 клеток почки макаки (С1ихтап е! а1., Се11 23: 175 (1981)), линия клеток 293 почки эмбриона человека и клетки яичника китайского хомячка (СНО). Для экспрессии белков Ни-Акр предпочтительно используют клетки яичника китайского хомячка (СНО) (пример 11).

Выбор приемлемого экспрессирующего вектора для экспрессии полипептидов Ни-Акр по этому изобретению безусловно зависит от конкретной используемой клетки-хозяина млекопитающего, что должно быть известно специалисту в этой области. Примерами приемлемых экспрессирующих векторов являются рсОЫАЗ Цпуйтодеи) и р8УЪ (Рйатташа Вю!есй.). Предпочтительным вектором для экспрессии полипептидов Ни-Акр является рсОХА3.1-Нудго Цпуйгодеп). Экспрессирующими векторами для использования в клетках-хозяевах млекопитающего могут быть транскрипционные и трансляционные регулирующие последовательности, полученные из вирусных геномов. Обычно используемыми промоторными и энхансерными последовательностями по настоящему изобретению являются, но не ограничиваются ими, последовательности, полученные из цитомегаловируса человека (СМУ), аденовируса 2, вируса полиомы и вируса обезьян 40 (8У40). Методы конструирования экспрессирующих векторов млекопитающих описаны, например, в статьях Окауата аиб Вегд (Мо1. Се11. Вю1. 3: 280 (1983); Соктап е! а1. (Мо1. 1ттипо1. 23: 935 (1986)); Соктап е! а1. (Уинге 312: 768 (1984); в ЕР-А-0367566 и в АО 91/18982.

Полипептиды по настоящему изобретению можно также использовать для индуцирования поликлональных и моноклональных антител, которые являются полезными в диагностических анализах для детектирования экспрессии полипептида Ни-Акр. Такие антитела можно получить известными методами. См., например, АийЬоб1ек: А ЬаЬота!огу Мапиа1, Нат1оте аиб Ьаиб (ебк.), Со1б 8рпид НатЬот ЬаЬота!огу Ргекк. Со1б 8рпид НагЬог, Ν.Υ., (1988); Мопос1опа1 АпйЬоб1ек, НуЬпботак: А Ыете Эппепкюп т Вю1од1са1 Апа1укек, Кеппе! е! а1. (ебк.), Р1епит Ргекк, №\ν Υо^к (1980). Синтетические пептиды, включающие части Ни-Акр из 5-20 аминокислот, можно также использовать для продуцирования поликлональных или моноклональных антител после связывания с приемлемыми белками-носителями, которые включают, но не ограничиваются ими, гемацианин блюдечка (КЬН), куриный овальбумин или бычий сывороточный альбумин, при использовании разных сшивающих реагентов, включающих карбодиимиды, глутаральдегид или в том случае, если пептид содержит цитеин, Ν-метилмалеимид. Предпочтительный пептид для иммунизации, полученный после конъюгации с КЬН, содержит С-конец Ни-Акр1 или Ни-Акр2, включающий, соответственно, ОРИРИЭРЕУУ\'ЭЕ88РУИНИАК (8ЕО ΙΌ ^: 50) или Р1ЮО111ГОРА1ГО18РРК (8ЕО ГО 51).

Молекулы нуклеиновой кислоты Ни-Акр по настоящему изобретению также пригодны для идентификации хромосом, так как они могут гибридизировать с конкретным местом в хромосоме человека. НиАкр1 локализован в хромосоме 21, в то время как Ни-Акр локализован в хромосоме 11с.|23.3-24.1. Существует насущная необходимость в идентификации конкретных участков хромосомы, так как в настоящее время имеется мало реагентов, маркирующих хромосомы, на основе фактических данных о последовательностях (полиморфизм повторов), предназначенных для мечения участков хромосомы. После того, как последовательность картирована для точного участка хромосомы, физическое положение этой последовательности в хромосоме можно коррелировать с данными генетической карты. Взаимосвязь между генами и болезнями, установленную благодаря картированию одной и той же области хромосомы, затем можно идентифицировать при помощи анализа связывания, в результате которого определяют совместное наследование физически смежных генов. Является ли ген, имеющий отношение к данной болезни,

- 14 009216 действительной причиной ее возникновения, можно определить, сравнивая последовательность нуклеиновых кислот у субъектов, страдающих и не страдающих этим заболеванием.

В соответствии с другим вариантом осуществления это изобретение относится к способу анализа функции Ни-Акр, в частности функции Ни-Акр2, который заключается в том, что полипептид Ни-Акр инкубируют в растворе с приемлемым субстратом, который включает, но не ограничивается ими, синтетический пептид, содержащий сайт расщепления АРР β-секретазой, предпочтительно пептид, имеющий мутацию, обнаруженную у большой группы населения Швеции с наследственной болезнью Альцгеймера, при которой КМ заменяется ΝΣ, причем такой пептид содержит последовательность δΕνΝΣΌΑΕΡΚ. (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 54), в растворе с кислотным буфером, предпочтительно в растворе с кислотным буфером, имеющем рН 5,5 (см. пример 12), после чего данный пептид расщепляют, что служит мерой протеолитической активности Ни-Акр, контролируемой при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии. В предпочтительных анализах протеолитической активности используют внутренне погашенные субстраты для анализа пептида. Такими приемлемыми субстратами являются пептиды с присоединными к ним флуорофором и гасителем, которыми являются, но не ограничиваются ими, кумарин и динитрофенол, в результате расщепление пептида Ни-Акр вызывает увеличение флуоресценции вследствие физического разделения флуорофора и гасителя. При выполнении предпочтительных колориметрических анализов протеолитической активности Ни-Акр используют другие приемлемые субстраты, которые включают аминокислоты Р2 и Р1, включающие сайт узнавания для расщепления в положении о-нитрофенола, связанного амидной связью, в результате чего расщепление под действием Ни-Акр вызывает увеличение оптической плотности после доведения буфера до щелочного рН.

В соответствии с другим вариантом осуществления это изобретение относится к способу идентификации агента, увеличивающего активность полипептида Ни-Акр, выбираемого из группы, включающей Ни-Акр1, Ни-Акр2(а) и Ни-Акр2(Ь), который включает:

(a) определение активности указанного полипептида Ни-Акр в присутствии и в отсутствие испытуемого агента и (b) сравнение активности указанного полипептида Ни-Акр, определяемой в присутствии указанного испытуемого агента, с активностью указанного полипептида Ни-Акр, определяемой в отсутствие указанного испытуемого агента;

при этом более высокая активность полипептида Ни-Акр в присутствии испытуемого агента свидетельствует о том, что указанный испытуемый агент увеличивает активность указанного полипептида. Такие испытания можно выполнять с использованием полипептида Ни-Акр в бесклеточной системе и культивируемых клеток, экспрессирующих Ни-Акр, его варианты или изоформы.

В соответствии с другим вариантом осуществления это изобретение относится к способу идентификации агента, уменьшающего активность полипептида Ни-Акр, выбираемого из группы, включающей Ни-Акр1, Ни-Акр2(а) и Ни-Акр2(Ь) , который включает:

при этом более низкая активность полипептида Ни-Акр в присутствии испытуемого агента свидетельствует о том, что указанный испытуемый агент снижает активность указанного полипептида. Такие испытания можно выполнять с использованием полипептида Ни-Акр в бесклеточной системе и культивируемых клеток, экспрессирующих Ни-Акр, его варианты или изоформы.

В соответствии с другим вариантом осуществления это изобретение относится к новой линии клеток (клетки НЕК125.3), используемой для измерения амилоидного β-пептида (Ав), процессированного из предшественника амилоидного белка (АРР). Эти клетки являются стабильными трансформантами клеток почки эмбриона человека 293 (НЕК293) с бицистронным вектором, полученным из рШЕ8-Е6РР (С1ои1есй) и содержащим модифицированную кДНК АРР человека, внутренний сайт вхождения рибосомы внутрь клетки и кДНК усиленного зеленого флуоресцирующего белка (Е6РР) во втором цистроне. кДНК АРР модифицируют добавлением двух кодонов лизина к карбоксильному концу кодирующей последовательности АРР. Это увеличивает процессинг Λβ-пептида из АРР человека в 2-4 раза. Этот уровень процессинга Λβ-пептида в 60 раз выше, чем у ^трансформированных клеток НЕК293. Клетки НЕК125.3 можно использовать для анализа соединений, ингибирующих процессинг Ав-пептида. Это изобретение относится также к добавлению двух остатков лизина к С-концу других изоформ АРР, включая изоформы, состоящие из 751 и 770 аминокислот, изоформы АРР, имеющие мутации, обнаруженные в случае болезни Альцгеймера у человека, в том числе шведские мутации ИМ^УЬ и ν717^Ρ, к С-концевым фрагментам АРР, начинающимся с сайта расщепления β-секретазой, к С-концевым фрагментам АРР, имеющим сайт расщепления β-секретазой, которые функционально связаны с Ν-концевым сигнальным пептидом для вставки и секреции через мембрану, и к С-концевым фрагментам АРР, которые функционально связаны с Ν-концевым сигнальным пептидом для вставки и секреции через мембрану и репортерной после

- 15 009216 довательностью, которая включает, но не ограничивается ими, зеленый флуоресцирующий белок или щелочную фосфатазу, так, что расщепление β-секретазой вызывает освобождение репортерного белка с поверхности клеток, экспрессирующих полипептид.

Существо этого изобретения, изложенное в этом описании изобретения, будет более понятно со ссылкой на нижеследующие примеры, которые приведены только с целью иллюстрации и не ограничивают объем изобретения.

Примеры

Пример 1. Разработка алгоритма поиска, пригодного для идентификации аспарагилпротеаз и генов аспарагилпротеазы из С. Е1едап§ в базе данных ХУогтрср 12.

Материалы и методы

Классические аспарагилпротеазы, такие как пепсин и ренин, имеют двухдоменную структуру цепи, при укладке которой два остатка аспарагила располагаются рядом с активным сайтом. Они образуют короткий трипептидный элемент ΌΤΟ или более редко Ό8Ο. Мотив ΌΤΟ или Ό8Ο активного сайта находится рядом с остатками 25-30 в ферменте и рядом с остатками 65-70 в проферменте (проренин, пепсиноген). Этот мотив снова появляется около остатков 150-200 в нижней области. Профермент активируется в результате расщепления ^концевого продомена. Эта схема характерна для двухдоменной структуры современных аспарагиловых ферментов, которые, очевидно, образуются вследствие дупликации и дивергенции генов. Таким образом,

ХН₂........................X--------------Ό²⁵ΤΟ..........................Υ--------------Ό^υ+25ΤΟ------------------С где X обозначает начало фермента после ^концевого продомена и Υ обозначает центр молекулы, где снова начинается повтор гена.

В случае ретровирусных ферментов, таких как ВИЧ-протеаза, они представляют только половину двухдоменных структур хорошо известных ферментов, подобных пепсину, катепсину Ό, ренину и т.д. Они не имеют просегмента, но из них выделен предшественник полипротеина, содержащий белки вируса дад- и ро1. Их можно представить

ХН₂........................Ό²⁵ΤΟ.........................................С100

Этот мономер содержит примерно 100 аминокислот, поэтому он является исключительно бедным по сравнению с другими димерами аспарагилпротеаз, которые имеют порядка 330 или около того аминокислот, не считая ^концевого продомена.

Ограниченная длина мотива активного сайта эукариотической аспарагилпротеазы затрудняет поиск новых последовательностей в коллекциях Ε8Τ. Последовательности Ε8Τ обычно имеют, в среднем, 250 нуклеотидов, и в этом случае крайне затруднительно найти оба мотива активного сайта аспарагилпротеазы. Вместо этого авторы изобретения обратились к геному С. е1едаи8. Установлено, что геном С. е1едап8 имеет примерно 13000 генов. Из них секвенированы примерно 12000, и соответствующая гипотетическая открытая рамка считывания (0РР) помещена в базу данных \Уогтрер12. Авторы изобретения использовали эту базу данных в качестве основы для сканирования всего генома высшего эукариота с целью обнаружения новых аспарагилпротеаз при помощи алгоритма, специально разработанного для этой цели авторами. Для поиска использовали нижеследующую программу ΛνΚ, позволяющую локализовать белки, содержащие два мотива ΌΤΟ или Ό8Ο, которую выполняли 4 раза для выделения всех парных комбинаций этого мотива аспарагила.

ВЕ6ГЫ{К8=>} /*определяет > в качестве разделителя записей для формата ΡΛ8ΤΛ*/ { ро8=шбех($0, ΌΤΟ') /*находит ΌΤΟ в записи*/

1£(ро§>0) { ге81=8иЬйг($0, ро§+3) /*получает остальную часть записи после первого ΌΤΟ*/ ро82=шбех(ге81, ΌΤΟ) /*находит второй ΌΤΟ*/ |Г(ро52>0)рпи1Г /*число совпадений в отчете*/ (%8%8\И, >, $0) } }

Вышеуказанную программу ΛνΚ, загружаемую из йр.8апдег.ас.ик/риЬ/ба1аЬа8е8/теогтрер, использовали для поиска в базе данных Vо^трер12 последовательностей, содержащих по крайней мере два мотива ΌΤΟ или Ό8Ο. При помощи программы ΛνΚ каждую запись ограничивали 3000 или меньшим числом символов. Так, записи, состоящие из 35 или большего числа символов, вручную удаляли из базы данных Vо^трер12, так как в любом случае маловероятно, что они могут кодировать аспарагилпротеазы.

Результаты и выводы

База данных Vо^трер12 содержит 12178 данных, хотя некоторые из них (<10%) представляют альтернативно сплайсированные транскрипты из одного из того же гена. Число генов, кодированных в геноме С. е1едап8, составляет порядка 13000 генов, поэтому база данных Vо^трер12 содержит более 90% генома С. е1едап§.

Эукариотические аспарагилпротеазы имеют двухдоменную структуру, которая, по-видимому, образуется в результате дупликации гена-предшественника. Каждый домен содержит мотив активного сайта

- 16 009216

Ό(8/Τ)0, расположенный на расстоянии 20-25 аминокислотных остатков в каждом домене. Протеазы ретровирусов (например, ВИЧ-протеаза) или ретротранспозонов являются гомодимерами субъединиц, которые гомологичны одному домену эукариотической аспарагилпротеазы. Программу Л\УК использовали для поиска в базе данных \Уогтрер12 белков, в которых элемент Ό(8/Τ)Ο встречается по крайней мере дважды. Было идентифицировано >60 белков с двумя элементами ЭТО или Э8С. Была произведена визуальная проверка для выбора белков, в которых положение доменов аспарагила свидетельствует о том, что двухдоменная структура соответствует вышеописанным критериям.

Кроме того, для поиска в базе данных \Уогшрср12 предполагаемых аспарагилпротеаз были использованы параметры активного сайта эукариотической и вирусной аспарагилпротеазы РК081ТЕ Р80014 (Вапосб А., Висбег Р., НоЕтапп К., Тбе РКО81ТЕ ба1аЬаке: ίΐ8 ЧаЦ.15 ίη 1997, Νηοίοίο Аабк Кек. 24: 217-221 (1997)). В базе данных \Уогтрер12 был обнаружен перекрывающийся набор последовательностей. Из них семь последовательностей содержали два мотива ОТО или Э8С и имели параметры активного сайта аспарагилпротеазы РКО81ТЕ. Из этих семи последовательностей три были обнаружены в одном космидном клоне (Е21Е8.3, Е21Е8.4 и Е21Е8.7), на основании чего можно предположить, что они представляют собой семейство белков, которые образуются в результате дупликации гена-предшественника. Две другие последовательности ОКЕ, обладающие значительной гомологией с Е21Е8.3, Е21Е8.4 и Е21Е8.7, находятся в том же кластере генов (Е21Е8.2 и Е21Е8.6), однако, они содержат только один мотив ОТО. Обширный поиск при помощи программы ВЬА8Т с использованием этих семи последовательностей в базе данных \Уогтрер12 не позволил обнаружить дополнительные предполагаемые аспарагилпротеазы в геноме С.е1едап8, содержащие два повтора элемента ОТО или Ό8Ο.

Поиск при помощи программы ВЬА8ТХ с использованием каждой последовательности С. е1едап8 в базе данных 8^188-РКОТ, ОепРер и ТКЕМВЬ позволил обнаружить, что К12Н7.2 является ближайшим гомологом известных аспарагилпротеаз млекопитающего и Т18Н9.2 обладает более отдаленным родством, в то время как СЕА§р1, Е21Е8.3, Е21Е8.4 и Е21Е8.7 образуют субкластер, который обладает наименьшей гомологией последовательностей с последовательностями млекопитающего.

Обсуждение

АРР, презенилины и р35, активатор сбк5 подвергаются внутриклеточному протеолитическому процессингу на сайтах, которые соответствуют специфичности субстрата ВИЧ-протеазы. Неправильная регуляция клеточной аспарагилпротеазы с такой же специфичностью субстрата создает объединяющий механизм, определяющий причинную связь между патологией бляшек и сплетений в случае болезни Альцгеймера. Поэтому авторы изобретения пытались идентифицировать новые аспарагилпротеазы человека. Сканирование всего генома в С. е1едап8 позволило обнаружить семь открытых рамок считывания, относящихся к характеристике аспарагилпротеазы. Эти семь аспарагилпротеаз, вероятно, включают полный набор таких протеаз в простом многоклеточном эукариотическом организме. Они включают четыре близкородственные аспарагилпротеазы, уникальные для С. е1едап8, которые, по-видимому, образуются в результате дупликации гена-предшественника. Были обнаружены три другие предполагаемые аспарагилпротеазы (Т18Н9.2, К12Н7.2 и С1РО2.2), обладающие гомологией с генными последовательностями млекопитающего.

Пример 2. Идентификация новых аспарагилпротеаз человека в базе данных путем установления связи между геномами.

Материалы и методы

Компьютерный анализ баз данных Е8Т, кДНК и предполагаемых полипептидных последовательностей.

Обширный поиск гомологии в базах данных Е8Т с использованием последовательностей СЕА§р1, Е21Е8.3, Е21Е8.4 и Е21Е8.7 не позволил обнаружить новые гомологи млекопитающего. В результате поиска при помощи программы ΤВ^А8ΤN с использованием К12Н7.2 обнаружена гомология с катепсином Ό, катепсином Е, пепсиногеном А, пепсиногеном С и ренином, в частности рядом с мотивом ОТО на активном сайте, но при этом не были найдены какие-либо дополнительные новые аспарагилпротеазы млекопитающего. Это указывает на то, что геном С. е1едап8, по-видимому, содержит только одну лизосомную аспарагилпротеазу, представленную в организме млекопитающего семейством генов, образующихся в результате дупликации и последующей модификации гена-предшественника.

Поиск при помощи программы ΤВ^А8ΤN с использованием Т18Н9.2, оставшейся последовательности С. е1едап8, позволил идентифицировать несколько Е8Т, которые образуют набор смежных последовательностей, кодирующих новую аспарагилпротеазу человека (Ни-А8р1). Как описано выше в примере 1, в результате поиска при помощи программы ВЬА8ТХ с использованием набора смежных последовательностей Ни-А8р1 в базе данных 8^188-РКОТ установлено, что мотивы активного сайта в последовательности упорядочены в соответствии с активными сайтами других аспарагилпротеаз. Обширный повторный поиск при помощи программы В^А8ΤN в базах данных Ь1Ее8ед, ЫГе8ес.|ЕЕ и в доступных коллекциях Е8Т позволил выявить 102 Е8Т из множества библиотек кДНК, образующих один набор смежных последовательностей. Из 51 последовательности в наборе, обнаруженном в публичных коллекциях Е8Т, был также собран один набор (ТНС213329) в Институте исследования геномов (Т1ОК). В аннотации, представленной Т1ОК, указано, что сотрудники этого института не нашли каких-либо признаков такого набора в базе данных. Следует отметить, что набор смежных последовательностей, полученный Т1ОК, представляет собой набор с обратным расположением последовательностей по сравнению с набором Ь1Ее8ед, полу

- 17 009216 ченным авторами этого изобретения. Поиск Ни-Акр1 при помощи программы ВЙА8ТН в последовательностях Е8Т крыс и мышей в базе данных Ζοοδος позволил выявить одну гомологичную Е8Т в каждой базе данных (соответственно клон ΙηονΙο 700311523 и клон ИМЛСЕ 313341, СепВапк, № доступа \У10530).

Поиск при помощи программы ТВЕ-ААХ с использованием собранной последовательности ДНК Ни-Акр1 в базе данных ЫРеЗедРЬ и в доступных базах данных Е8Т позволил идентифицировать вторую родственную последовательность человека (Ни-А8р2), выраженную одной Е8Т (2696295). В результате трансляции этой частичной последовательности кДНК был обнаружен один мотив ЭТС, обладающий гомологией с элементом активного сайта бычьей аспарагилпротеазы, NΜ1.

Поиск при помощи ВБА8Т наборов смежных последовательностей и сравнительный анализ первичных структур нескольких последовательностей выполняли при помощи программных средств по биоинформатике, предоставленных вместе с базами данных Ь1Ре8ед, Ь1Ге8едРЬ и Ь1Ре8ед АккетЫей фирмой Iηсуΐе. Мотивы предполагаемых белков идентифицированы при помощи словаря Рто8йе (элементы в ССС 9) или базы данных РГат.

Клонирование полноразмерной кДНК Ни-Акр1.

Для работы в базах данных ЫГе8ес.| и Ь1Ре8ед-РЬ фирмы Тпсу1е использовали открытую рамку считывания гена Т18Н9.2СЕ С. е1едапк, при этом была обнаружена одна электронная упорядоченная структура, определяемая как 1863920СЕ1. Фирма Iηсуΐе предоставила клон 5'-концевых кДНК в наборе 1863920 с полным секвенированием обеих цепей. В результате трансляции открытой рамки считывания, имеющейся в клоне 1863920, обнаружен двойной мотив активного сайта аспарагилпротеазы (ЭТС/П8С), но 5'-конец был неполным. Остальная часть кодирующей последовательности Ни-Акр1 определена в результате анализа 5'-конца методом МатаШоп ВАСЕ с использованием готовой матричной кДНК плаценты человека МатаШоп (С1опе1есй). 3'-концевую антисмысловую олигонуклеотидную затравку, специфическую для 5'-конца клона 1863920, соединяли с 5'-концевой смысловой затравкой, специфической для синтетического адаптера готовой кДНК фирмы МагаШоп при выполнении РСК. Специфические продукты РСК сразу же секвенировали путем циклического секвенирования и полученную последовательность соединяли с последовательностью клона 1863920 для получения полной кодирующей последовательности Ни-Акр1 (АО ΙΌ N0: 1).

Первичная аминокислотная последовательность Ни-Акр1 (фиг. 1, 8Е0 ΙΌ N0: 2) имеет несколько интересных особенностей. Эта последовательность содержит сигнальный пептид (остатки 1-20 в АО ΙΌ N0: 2), просегмент и каталитический домен, содержащий две копии элемента активного сайта аспарагилпротеазы (ОТС/О8С). Расстояние между первым и вторым мотивами активного сайта составляет около 200 остатков, которые должны соответствовать предполагаемой длине одного домена эукариотической аспарагилпротеазы. Более интересной особенностью является то, что эта последовательность содержит предполагаемый трансмембранный домен (остатки 469-492 в АО ΙΌ N0: 2) рядом с С-концом, из чего следует, что эта протеаза связана с мембраной. Эта особенность не обнаружена у ни у каких других других аспарагилпротеаз.

Клонирование полноразмерной кДНК Ни-Акр2.

Как описано выше в примере 1, обширное сканирование генома в базе данных ^огтРер12 СаепотйаЬФйк е1едапк с целью обнаружения предполагаемых аспарагилпротеаз и последующий поиск в базах данных Е8Т человека позволили выявить ортогональный аналог гена С. е1едапк Т18Н9.2, определяемый как НиАкр1. Собранный набор смежных последовательностей Ни-Акр1 использовали для поиска параллельных аналогов с использованием программы ВЬА8Т в базах данных Е8Т человека, при этом в базе данных Ь1Ге8едРЬ было обнаружено одно существенное соответствие (2696295СЕ1), характеризующееся примерно 60% общей идентичностью. Аналогичный поиск в базе данных дЬ105РиЬЕ8Т или в нескольких базах данных человека, предоставленных фирмой ТЮК, не позволил идентифицировать подобные клоны Е8Т. Клон кДНК 2696295, идентифицированный в результате однократного анализа последовательностей из библиотеки кДНК матки человека, предоставлен фирмой Тпсу1е с полностью секвенированными обеими цепями. Этот клон содержал неполную открытую рамку считывания, включающую 1266 п.о., которая кодировала полипептид, состоящий из 422 аминокислот, но не имела инициатора АТС у 5'конца. В результате проверки предполагаемой последовательности выявлены два элемента активного сайта аспарагилпротеазы ЭТС/О8С, разделенные 194 аминокислотными остатками. Последующие поиски в более поздних выпусках баз данных Е8Т Б|Ге8ед позволили обнаружить дополнительные Е8Т, секвенированные из библиотеки кДНК астроцитов человека (4386993), которые содержали дополнительную 5'-концевую последовательность по сравнению с клоном 2696295. Клон 4386993 предоставлен фирмой Iηсуΐе с полностью секвенированными обеими цепями. Сравнительный анализ клонов 4386993 и 2696295 подтвердил, что клон 4386993 имеет открытую рамку считывания из 31 аминокислотного остатка, включая два внутрирамочных кодона инициации трансляции. Несмотря на наличие двух внутрирамочных элементов АТС, вверху от АТС не было обнаружено ни одного внутрирамочного терминирующего кодона, что свидетельствует о том, что клон 4386993 не может быть полноразмерным. Кроме того, сравнительный анализ последовательностей клонов 2696295 и 4386993 позволил выявить вставку из 75 пар оснований в клоне 2696295 по сравнению с клоном 4386993, что указывает на наличие вставки из 25 дополнительных аминокислотных остатков в клоне 2696295. Остальная часть кодирующей последователь

- 18 009216 ности Ни-А§р2 определена анализом 5'-конца методом МагаГйоп КАСЕ с использованием готовой матричной кДНК из гиппокаппа человека МагаГйоп (С1опеГесй). З'-Концевую антисмысловую олигонуклеотидную затравку. специфическую для общей 5'-концевой области клонов 2696295 и 4386993. соединяли с 5'-концевой смысловой затравкой. специфической для синтетического адаптера готовой кДНК МагаГйоп. при выполнении РСК. Специфические продукты РСК сразу же секвенировали путем циклического секвенирования и полученную последовательность соединяли с последовательностью клонов 2696295 и 4386993 для получения полной кодирующей последовательности. соответственно. Ни-А§р2(а) (8ЕО ΙΌ N0: 3) и Ни-А§р2(Ь) (8ЕО ΙΌ N0: 5).

Первичные аминокислотные последовательности Ни-А§р2(а) (фиг. 3. 8Е0 ΙΌ N0: 4) и Ни-А§р2(Ь) (фиг. 2. 8Е0 ΙΌ N0: 6) имеют несколько интересных особенностей. Обе последовательности содержат сигнальный пептид (остатки 1-21 в 8Е0 ΙΌ N0: 4 и 8Е0 ΙΌ N0: 6). просегмент и каталитический домен. содержащий две копии мотива активного сайта аспарагилпротеазы (ΌΤ0/Ώ80). Расстояние между первым и вторым мотивами активного сайта изменяется из-за делеции 25 аминокислотных остатков в НиАкр2(Ь) и составляет. соответственно. 168 и 194 аминокислотных остатка для Ни-А§р2(Ь) и Ни-А§р2(а). Более интересной особенностью является то. что обе последовательности имеют предполагаемый трансмембранный домен (остатки 455-477 в 8Е0 ΙΌ N0: 4 и 430-452 в 8Е0 ΙΌ N0: 6) около С-концов. что свидетельствует о том. что эта протеаза связана с мембраной. Эта особенность не обнаружена ни у каких других аспарагилпротеаз. за исключением Ни-АкрЕ

Пример 3. Молекулярное клонирование кДНК Акр2 мыши и геномной ДНК.

Клонирование и исследование кДНК Акр2 мыши

Ортологический аналог Ни-А§р2 мыши клонирован с использованием ряда методов. включающих скрининг бибилиотеки кДНК. РСК и геномное клонирование. Исследовано примерно 500000 независимых клонов из библиотеки кДНК головного мозга мышей с использованием ³²Р-меченого зонда кодирующей последовательности. полученного из Ни-А§р2. В положительных репликах анализировали последовательности ДНК. при этом установлено. что самая длинная кДНК имеет полную 3'-концевую нетранслированную область и 47 аминокислот в кодирующей области. Амплификации при помощи РСК той же библиотеки кДНК головного мозга мышей при помощи антисмысловой олигонуклеотидной затравки. специфической для вышеуказанной 5'-концевой последовательности кДНК. и смысловой затравки. специфической для 5'-концевой области последовательности Акр2 человека. с последующим анализом последовательности ДНК позволили получить еще 980 п.о. кодирующей последовательности. Остальная часть 5'-концевой последовательности Акр2 мыши получена из геномной последовательности (см. ниже).

Выделение и анализ последовательности гена Акр2 мыши

Последовательность Е8Т мыши. кодирующую часть кДНК Акр2 мыши. идентифицировали в базе данных Е8Т ОепБапк при помощи программы поиска ВБА8Т и кодирующей последовательности Ни-А§р2 в качестве эталона. Клон §3160898 характеризовался 88% общей идентичностью с указанной последовательностью человека на протяжении 352 п.о. Затем синтезировали пары олигонуклеотидных затравок. специфических для этой области Акр2 мыши. и использовали для амплификации областей гена мыши. Геномную ДНК мыши. полученную из штамма 129/δν.Τ. амплифицировали. выполняя РСК (25 циклов) с использованием разных наборов затравок. специфических для Акр2 мыши. и продукты анализировали электрофорезом в агарозном геле. При помощи набора затравок 2оо-1 и 2оо-4 амплифицировали фрагмент длиной 750 п.о.. который содержал последовательность интрона длиной около 600 п.о.. выявленную в результате сравнения с известной последовательностью кДНК. Этот набор затравок затем использовали для скрининга библиотеки ВАС мыши путем выполнения РСК. при этом был выделен один геномный клон и при помощи анализа последовательности ДНК было подтверждено. что этот клон содержит ген Акр2 мыши. В результате секвенирования ДНК этого геномного клона Акр2 методом дробовика и сравнения с последовательностями кДНК Ни-А§р2 и частичными последовательностями кДНК мыши была определена полноразмерная последовательность Акр2 мыши (8Е0 ΙΌ N0: 7). Предполагаемая аминокислотная последовательность Акр2 мыши (8Е0 ΙΌ N0: 8) характеризуется 96.4% общей идентичностью (алгоритм ОСО ВейЕй) с заменами 18/501 аминокислотного остатка по сравнению с последовательностью человека (фиг. 4).

Пример 4. Распределение в тканях экспрессии транскриптов Ни-А§р2.

Материалы и методы

Распределение в тканях экспрессии Ни-А§р2 определяли при помощи нозерн-блотов множества тканей. предоставленных фирмой С1опе1есй (Ра1о Айо. СА). Клон 2696295 фирмы ШсуГе в векторе рШС’У полностью расщепляли ЕсоШ/ЫоП и вставку кДНК длиной 1.8 т.п.о. очищали препаративным электрофорезом в агарозном геле. Этот фрагмент метили радиоактивными изотопами до достижения удельной активности >1х10⁹ распадов/мин/мкг с использованием произвольной затравки в присутствии [а-³²Р6АТР](>3000 С1/ммоль. Атегайат. АгйпдГоп НещйК ГЬ) и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы Ι. Найлоновые фильтры. содержащие денатурированную. фракционированную поли-А+ РНК. выделенную из разных тканей человека. гибридизировали с зондом. обеспечивающим 2х10⁶ распадов/мин/мл в буфере ЕхргеккНуЬ (С1опеГесй. Ра1о Айо. СА) в течение 1 ч при 68°С и промывали в соответствии с указаниями производителя. Сигналы гибридизации визуализировали при помощи авторадиографии с использовани

- 19 009216 ем пленки ВюМах ХК (Кобак, Косйейет, УУ) и усилением яркости изображения при -80°С.

Результаты обсуждения

В результате анализа базы данных получена ограниченная информация о распределении в тканях экспрессии транскриптов Ни-Акр2 из-за относительно небольшого числа Е8Т, обнаруженных при помощи вышеописанных способов (<5). Чтобы получить дополнительную информацию об экспрессии гена Ни-Акр2, выполняли нозерн-блоттинг для определения размеров и количества транскриптов Ни-Акр2. Поли-А⁺ РНК, выделенную из нескольких периферических тканей и областей головного мозга, помещали на твердую подложку после отделения в денатурирующих условиях и транскрипты Ни-Акр2 визуализировали путем гибридизации в очень строгих условиях с меченой радиоактивными изотопами вставкой из клона 2696295. При помощи зонда кДНК 2696295 был визуализирован набор мигрирующих транскриптов размером 3,0, 4,4 и 8,0 т.п.о., причем два последних транскрипта встречались наиболее часто.

Из исследованных тканей транскрипты Ни-Акр2 в наибольшем количестве обнаружены в поджелудочной железе и головном мозге, при этом более низкие, но детектируемые количества присутствовали во всех других изученных тканях, за исключением тимуса и РВЬ. Наряду с определением относительного содержания транскриптов Ни-Акр2 в головном мозге были также исследованы степени экспрессии на разных участках мозга. Одинаковые уровни транскриптов были обнаружены на всех исследованных участках головного мозга (мозжечок, кора головного мозга, затылочная область, лобная доля, височная доля и путамен), при этом наибольшая концентрация характерна для костного и спинного мозга.

Пример 5. Обнаружение транскриптов Ни-Акр 1 и Ни-Акр2 в линиях клеток человека при помощи нозерн-блоттинга.

Разные линии клеток человека испытывали в отношении их способности продуцировать мРНК НиАкр1 и Ни-Акр2. Клетки почки эмбриона человека (НЕК293), клетки зеленой мартышки (Сок-7), клетки яичника китайского хомячка (СН0), клетки НЕЬА и линия клеток нейробластомы 1МК32 были получены АТСС. Клетки культивировали в среде ΌΜΕ, содержащей 10% РС8, за исключением клеток СН0, которые культивировали в среде а-МЕМ/10% РС8 при 37°С в 5% СО₂ почти до полного слияния. Промытые монослои клеток (3х10⁷) лизировали на планшетах и экстрагировали поли-А⁺ РНК, используя набор для прямого получения мРНК Οίη^οη 01що1сх. Образцы, содержащие 2 мкг поли-А⁺ РНК из каждой линии клеток, фракционировали в денатурирующих условиях (обработка глиоксалем), переносили капиллярным путем на твердую подложку из найлоновой мембраны и транскрипты визуализировали гибридизацией с зондами кодирующей последовательности, меченными радиоактивными изотопами (³²Р), с использованием произвольной затравки, которые выделяли из Ни-Акр1 или Ни-Акр2.

Радиоактивные сигналы детектировали на рентгеновской пленке и производили анализ изображения при помощи Рйокрйойтадег.

При помощи кДНК-зонда Ни-Акр1 обнаружен аналогичный набор транскриптов (2,6 и 3,5 т.п.о.), которые ранее были детектированы в тканях человека. Относительное содержание, установленное количественным подсчетом радиактивных сигналов, составило Сок-7>НЕК292=НЕЬА>1МК32.

При помощи кДНК-зонда Ни-Акр2 обнаружен такой же набор транскриптов, что и в тканях (3,0, 4,4 и 8,0 т.п.о.), при наличии следующего относительного содержания: НЕК293>Сок-7>1МК32>НЕЬА.

Пример 6. Модификация АРР с целью увеличения процессинга Λβ-пептида для выполнения скрининга ίη уйто.

Линии клеток человека, способные процессировать Λβ-пептид из АРР, использованы в качестве средства для скрининга ингибиторов β- и γ-секретазы при выполнении клеточных анализов.

Продуцирование и высвобождение Λβ-пептида в культуральный супернатант контролируют твердофазным иммуноферментным анализом (Е1А). Хотя АРР широко экспрессирован в разных тканях и Аβ-пептид процессируют и высвобождают как нейроны, так и другие линии клеток, уровни процессинга эндогенного АРР являются низкими и могут быть с трудом обнаружены Е1А. Процессинг Аβ-пептида можно увеличить, экспрессируя в трансформированных линиях клеток мутации АРР, которые усиливают процессинг Аβ-пептида. Авторы этого изобретения установили, что добавление двух остатков лизина к карбоксильному концу АРР695 еще больше увеличивает процессинг Λβ-пептида. Это позволило создать трансформированную линию клеток, которая высвобождает Λβ-пептид в культуральную среду в значительном количестве 20000 пг/мл.

Материалы и методы

Материалы.

Линия клеток почки эмбриона человека 293 (клетки НЕК293) получена в лаборатории. Вектор р1КЕ8-ЕОРР предоставлен фирмой С1оп1ее11. Олигонуклеотиды для мутации при помощи полимеразной цепной реакции (РСК) приобретены в фирме Оепокук. Плазмида, содержащая АРР695 человека (8ЕО ΙΌ N0: 9 [нуклеотидная последовательность] и 8ЕО ГО N0: 10 [аминокислотная последовательность]) предоставлена медицинским факультетом северо-западного университета. Эту плазмиду субклонировали в р8К (81та1адепе) на сайте №11 с получением плазмиды рАРР695.

Выполнение мутагенеза.

Шведскую мутацию (К670М М671Ь) вводят в рАРР695 с использованием набора для быстрого мутагенеза 81га1адепе с целью получения плазмиды рАРР695№· (8Е0 ГО N0: 11 [нуклеотидная последовательность] и

- 20 009216

8ЕЦ ΙΌ N0: 12 [аминокислотная последовательность]). Чтобы ввести мотив из двух остатков лизина в С-конец АРР695, используют верхнюю затравку № 276 5'-САСТСАССАСТССАССАССТТС (8ЕЦ ΙΌ N0: 47), соединяющую затравку № 274 5'-С0ААТТАААТТССА0САСАСТ00СТАСТТСТТ0ТТСТ0САТСТСААА0ААС (8ЕС) ΙΌ N0: 48) и фланкирующую затравку № 275 С0ААТТАААТТССЛ0САСАСТ00СТА (8ЕС) ΙΌ N0: 49) для модификации 3'-конца кДНК АРР695 (8ЕЦ ΙΌ N0: 15 [нуклеотидная последовательность] и 8Е0 ΙΌ N0: 16 [аминокислотная последовательность]). В результате выполнения вышеуказанной операции вводят также сайт рестрикции Вк1ХЕ который совместим с сайтом Вк(Х 1 в сайте множественного клонирования рЖЕЗ-ЕОРР. Амплификацию РСК. выполняют при помощи набора для РСК кДНК С1оп1ес11 НР АбуагИаде с использованием полимеразной смеси и буферов, предоставленных производителем. Для выполнения связывания при помощи РСК используют соединяющую затравку в количестве 1/20 молярной концентрации фланкирующих затравок. Продукты амплификации РСК очищают с использованием набора для очистки РСК рТЛцшск (Ц1адеп). Продукты, полученные в результате расщепления рестрикционными ферментами, разделяют на 0,8% агарозных гелях и вырезанные фрагменты ДНК очищают с использованием набора для экстракции в геле Ц^дшск (Ц1адеп).

Для повторной сборки модифицированной кДНК АРР695-8те 5'-концевой фрагмент N011 -Вд12 кДНК АРР695-8\г и 3'-концевой фрагмент кДНК АРР695 Вд12-Вк1Х1, полученные при помощи РСК, лигируют в ДНК плазмиды рГКЕЗ-ЕСРР, открытой на сайтах N011 и Вк1Х1. Лигирования производят в течение 5 мин при комнатной температуре, используя набор для быстрого лигирования ДНК (ВоеЬппдег МаппНеип) и производя трансформацию в компетентных клетках из библиотеки ЭН5а (С1ЬсоВКЬ-Ь1£е Тес11по1од1е8). В бактериальных колониях производят скрининг инсерций, выполняя амплификацию при помощи РСК с использованием затравок № 276 и № 275. Плазмидную ДНК очищают для трансфекции клеток млекопитающего с использованием набора 0ΙАргер 8рт М1шргер (Ц1адеп). Полученная конструкция названа рМС125.3 (АРР8^-КК, 8ЕЦ ΙΌ N0: 17 [нуклеотидная последовательность] и 8ЕЦ ΙΌ N0: 18 [аминокислотная последовательность]).

Трансфекция клеток млекопитающего.

Клетки НЕК293, используемые для трансфекции, выращивают до 80% слияния в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ЭМЕМ) с 10% фетальной телячьей сывороткой (РВ8). Котрансфекцию выполняют с использованием ЫроГайАтте (01Ьсо-ВКЬ) в 3 мкг ДНК рМС125.3 и 9 мкг ДНК рсОХА3.1 на 10х10⁶ клеток. В течение 3 дней после трансфекции клетки пассируют в среде, содержащей 0418 в концентрации 400 мкг/мл. Клетки выращивают в течение 3 дней в селективной среде и сортируют на основе их флуоресценции.

Клональная селекция клеток 125.3 при помощи клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (РАС8).

Образцы клеток анализируют в проточном цитометре ЕРГС8 Е1йе Е8Р (СоиИег, Н1а1еаД РЬ), оснащенном линией возбуждения 488 нм, питание которой обеспечивает аргоновый лазер с воздушным охлаждением. Излучение Е0РР измеряют через полосовой фильтр 525 нм и интенсивность флуоресценции определяют по 4-разрядной логарифмической шкале после селекции жизнеспособных клеток с учетом рассеяния света в прямом направлении и под прямым углом. Отдельные зеленые клетки отделяют во всех лунках одного 96-луночного планшета, содержащего питательную среду без 0418. По истечении четырехдневного периода выделения к питательной среде добавляют 0418 до конечной концентрации 400 мкг/мл. После селекции установлено, что в 32% лунок находятся увеличивающиеся в объеме клоны. Лунки с клонами переносят из 96-луночного планшета на 24-луночный планшет и затем на 6-луночный планшет, причем при каждом пассировании для дальнейшего роста выбирают наиболее быстро растущие колонии. Последняя выбранная линия клеток представляет собой наиболее быстро растущую линию клеток на протяжении последних шести пассирований. Этот клон, обозначенный 125.3, выдерживают в 0418 в количестве 400 мкг/мл и через каждые 4 дня переносят в свежую среду. На протяжении 23 пассирований не отмечено уменьшения флуоресценции Е0РР при продуцировании Аβ-пептида.

Твердофазный иммуноферментный анализ (Е^) Аβ-пептида (двойной иммуносэндвич 1ιΛβ 1-40/42 для ЕЫ8А).

Супернатанты культур клеток, собранные через 48 ч после трансфекции, анализируют, выполняя стандартный твердофазный иммуноферментный анализ (Е^) Аβ-пептида. Количество Аβ-пептида человека 1-40 или 1-42 измеряют с использованием моноклонального антитела (тАЬ) 6Е10 (8епе1ек, 81.Ьои18, М0) и биотинилированной антисыворотки кролика 162 или 164 (Яете Уогк 81а1е ОткШгЧе Гог Вакю Кекеагск, 81а1еп Ыапб, ΧΥ) в двойном иммуносэндвиче для ЕЬЖА. Иммобилизованное антитело 6Е10 является специфическим к эпитопу, имеющемуся в ^концевых аминокислотных остатках 1-16 Аβ-пептида человека (1Αβ). Конъюгированные детектирующие антитела 162 и 164 являются специфическими соответственно к 1Αβ 1-40 и 1-42. Этот способ можно кратко охарактеризовать следующим образом: 96-луночный планшет для проведения реакции иммунодиффузии Мшс Мах1когр покрывают 100 мкл/лунку тАЬ 6Е10 (5 мкг/мл), разведенного в 0,1М растворе карбонатбикарбонатного буфера, рН 9,6, и инкубируют в течение ночи при 4°С. Планшет трижды промывают 0,01М 0РВ8 (модифицированная среда Дульбекко, содержащая физиологический раствор с фосфатным буфером (0,008М фосфата натрия, 0,002М фосфата калия, 0,14М хлорида натрия, 0,01М хлорида калия, рН 7,4) фирмы Р1егсе, КоскГогб, Ι1) и 0,05% Т\гееп-20

- 21 009216 (ЭРВ8Т) и блокируют в течение 60 мин 200 мкл 10% нормальной овечьей сыворотки (81дта) в 0,01М ЭРВ8 во избежание неспецифического связывания. В культуральную среду после промывки планшета добавляют эталоны Άβ-пептида человека 1-40 или 1-42 в количестве 100 мкл/лунку (Васйет, Тоггапсе, СА), разведенные из 1 мг/мл маточного раствора в ДМСО, и образец в количестве 100 мкл/лунку, например кондиционированную среду трансфецированных клеток. Планшет инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре и в течение ночи при 4°С. На следующий день после промывки планшета добавляют 100 мкл/лунку биотинилированной антисыворотки кролика 162 1:400 или 164 1:50, разведенной в ΌΡΒδΤ+0,5% В8А, и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч 15 мин. После выполнения промывки вводят 100 мкл/лунку нейтравидинапероксидазы хрена (Р1егсе, ЯоскГотб, 11), разведенного в отношении 1:10000 в ЭРВ8Т, и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. После выполнения последней промывки в качестве субстрата добавляют 100 мкл/лунку дигидрохлорида о-фенилендиамина (81дта Сйет1са1к, 8ΐ. Ьошк, МО) в буфере, содержащем 50 мМ лимонной кислоты/100 мМ фосфата натрия (8щта Сйет1са1к, 8ΐ. Ьошк, МО), рН 5,0, и контролируют изменение цвета при 450 нм в кинетическом спектрофотометре для считывания микропланшетов в течение 20 мин при помощи программы 8оГ( тах Рго. Все эталоны и образцы исследуют в трех копиях. Образцы, у которых значения оптической плотности соответствуют стандартной кривой, экстраполируют из стандартных кривых при помощи программы 8оГ( тах Рго и выражают в пг/мл культуральной среды.

Результаты

Добавление двух остатков лизина к карбоксильному концу ΆΡΡ695 значительно увеличивает процессинг Άβ-пептида в клетках НЕК293, о чем свидетельствуют результаты временной экспрессии (табл. 1). Добавление к ΆΡΡ695 мотива из двух остатков лизина увеличивает процессинг Άβ-пептида по сравнению с процессингом ΆΡΡ695, содержащего шведскую мутацию. Объединение мотива из двух остатков лизина со шведской мутацией увеличивает процессинг еще в 2,8 раза.

Котрансфекция клеток НЕК293 векторами рМО125.3 и рс^NА3.1 делает возможной двойную селекцию трансформированных клеток, характеризующихся устойчивостью к С418 и высоким уровнем экспрессии ЕОРР. Благодаря клональной селекции при помощи РАС8 полученная линия клеток позволяет получить 20000 пг Άβ-пептида на мл культуральной среды после выращивания в течение 36 ч на 24луночных планшетах. Продуцирование Άβ-пептида в разных условиях выращивания суммировано в табл. 2.

Таблица 1

Высвобождение Άβ-пептида в культуральную среду через 48 ч после временной трансфекции клеток НЕК293 указанными векторами, содержащими дикий или модифицированный АР Р

Конструкция АРРА	Αβ-пептид 1-40 (пг/мл)	Увеличение (число раз)	Р-значение
вектор р1НЕЗ-Е6ГР	147 + 28	1,0
АРР695 (142,3) дикого типа	194 + 15	1,3	0,051
АРР695-КК (124,1) дикого типа	424 + 34	2,8	3 х 10-5
АРР695-ЗН (143,3)	457 + 65	3,1	2 х 10-3
ΑΡΡ695-5νΚΚ(125, 3)	1308 + 98	8,9	3 х 10-4

Приведенные в таблице значения представляют собой средние значения + стандартное отклонение и β-значение для попарного сранения с использованием 1-критерия Стьюдента с учетом неравных дисперсий.

Таблица 2

Выделение Άβ-пептида из клеток НЕК125.3 в разных условиях выращивания

Тип культурального планшета	Объем среды	Продолжительность культивирования	АЬ 1-40 (пг/мл)	АЬ 1-42 (пг/мл)
24-луночный планшет	400 мкл	36 час	28036	1439

Пример 7. Ингибирование антисмысловым олигомером процессинга Άбета в клетках НЕК125.3.

Последовательности Ни-Акр1 и Ни-Акр2 предоставлены фирмой Зецийит, 1пс. ЩаБск, МА) для отбора целевых последовательностей и конструирования химерных антисмысловых олигомеров 2-го поколения патентованным методом (находящийся на рассмотрении патент на имя 8ес.|шЦ1г Ует. Ό № 3002). Άнтисмысловые олигомеры №№ 8644, 8645, 8646 и 8647 обладают целенаправленным действием против Акр1. Άнтисмысловые олигомеры №№ 8648, 8649, 8650 и 8651 обладают целенаправленным действием против Акр2. Контрольные антисмысловые олигомеры №№ 8652, 8653, 8655 и 8674 обладают целенаправленным действием против постороннего гена, и антисмысловые олигомеры №№ 8656, 8657, 8658 и 8659 обладают целенаправленным действием против второго постороннего гена.

Для трансфекции антисмысловыми олигомерами клетки НЕК125.3 выращивают примерно до 50% слияния на 6-луночных планшетах в минимальной поддерживающей среде (МЕМ), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку. Исходный раствор олигофектина О (8ес.|шЦ1г 1пс., №йск, МА) с концентрацией 2 мг/мл разводят до 50 мкг/мл в бессывороточной МЕМ. Исходный раствор антисмыслового

- 22 009216 олигомера с концентрацией 100 мкМ отдельно разводят до 800 нМ в оптимальной МЕМ (С1ВС0-ВКЕ, Сгапб 1з1апб, ΝΥ). Разведенные исходные растворы олигофектина С и антисмыслового олигомера смешивают в отношении 1:1 и инкубируют при комнатной температуре. Инкубацию продолжают в течение 15 мин, после чего 10-кратный объем реагента разводят в МЕМ, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, и после первого удаления старой среды в каждую лунку 6-луночного планшета добавляют 2 мл полученной смеси. После трансфекции клетки выращивают при постоянном присутствии олигофектина С/антисмыслового олигомера. Для контроля за высвобождением АЬ пептида из лунки с культурой периодически удаляют 400 мкл кондиционированной среды и заменяют свежей средой, начиная выполнять эту операцию через 24 ч после трансфекции. Приведенные данные получены из культуральных супернатантов, собранных через 48 ч после трансфекции.

Результаты

Клетки НЕК125.3 по отдельности трансфецируют 16 разными антисмысловыми олигомерами, предоставленными фирмой 8сс|иИиг 1пс., чтобы определить их влияние на процессинг Ав-пептида. Только антисмысловые олигомеры, направленные на Азр1 и Азр2, уменьшают процессинг Ав-пептида в клетках НЕК125.3, причем более эффективное ингибирующее действие направлено против Азр2. Процессинг Ав-пептида (1-40) и Ав-пептида (1-42) ингибируется в одинаковой степени. В табл. 3 приведены процентные значения ингибирования, высчитанные по сравнению с нетрансфецированными клетками. Реагенты на основе антисмысловых олигомеров, обеспечивающие более чем 50% ингибирование, отмечены звездочкой. Из всех испытанных реагентов 3 из 4 антисмысловых олигомеров, направленных на Азр1, обеспечивают, в среднем, 52% ингибирование процессинга Ав-пептида 1-40 и 47% ингибирование процессинга Ав-пептида 1-42. В случае Азр2 4 из 4 антисмысловых олигомеров характеризуются более чем 50% ингибированием, при этом среднее ингибирование процессинга Ав-пептида 1-40 составляет 62% и Ав-пептида 1-42 составляет 60%.

Таблица 3 Ингибирование высвобождения Ав-пептида из клеток НЕК125.3, обработанных антисмысловыми олигомерами

Ген-мишень	Антисмысловой олигомер	Αβ-пептид (1-40)	Αβ-пептид (1-42)
Азр1-1	£644	62%*	5б%*
Азр1-2	5645	41%*	38%*
Азр1-3	5646	52%*	46%*
Азр1-4	5647	6%	25%
Азр2-1	3648	71%*	67%*
Азр2-2	5649	83%*	76%*
Азр2-3	3650	4б%*	50%*
Азр2-4	5651	47%*	46%*
Соп1-1	5652	13%	18%
Соп1-2	5653	35%	30%
Соп1-3	5655	9%	18%
Соп1-4	5674	29%	18%
Соп2-1	5656	12%	18%
СОП2-2	5657	16%	19%
Соп2-3	5658	8%	35%
Соп2-4	8659	3%	18%

Пример 8. Демонстрация активности в-секретазы Ни-Азр2 в культивируемых клетках.

Установлено, что несколько мутаций в АРР, происходящих в начале возникновения болезни Альцгеймера, изменяют процессинг Ав-пептида. Они фланкируют Ν- и С-концевые сайты расщепления, в результате чего происходит выделение Ав-пептида из АРР. Эти сайты расщепления определяются соответственно как сайты расщепления в-секретазой и γ-секретазой. Расщепление АРР на сайте в-секретазы вызывает образование С-концевого фрагмента АРР, содержащего 99 аминокислот с молекулярной массой 11145 Да. Шведская мутация КМ^-ИЬ, находящаяся вверху рядом с сайтом расщепления всекретазой, вызывает общее увеличение продуцирования аминокислотных форм 1-40 и 1-42 Ав-пептида. Лондонская мутация УР (У717^Е в изоформе АРР770) не оказывает значительного влияния на общее продуцирование Ав-пептида, но, по-видимому, увеличивает процентное содержание более длинной аминокислотной формы 1-42 Ав-пептида, влияя на выбор сайта расщепления γ-секретазой во время процессинга АРР. Таким образом, авторы этого изобретения поставили целью определить, изменяют ли эти му

- 23 009216 тации количество и тип Ав-пептида, продуцируемого культивируемыми клетками, котрансфецированными конструкцией, направляющей экспрессию Ни-А§р2.

Были выполнены два эксперимента, которые демонстрируют активность β-секретазы Ни-А§р2 в культивируемых клетках. В первом эксперименте клетки НЕК125.3 обрабатывали антисмысловыми олигомерами, направленными против транскриптов Ни-А8р2, как описано в примере 7, в результате чего было установлено, что такая обработка уменьшает величину С-концевого фрагмента АРР, образованного вследствие расщепления β-секретазой (СТЕ99) (фиг. 9). Это показывает, что Ни-А§р2 прямо или косвенно облегчает процесс расщепления β-секретазой. Во втором эксперименте было установлено, что повышенная экспрессия Ни-А§р2 в трансфецированных клетках №иго2А мыши увеличивает накопление фрагмента, полученного вследствие расщепления β-секретазой СТЕ99 (фиг. 10). Это увеличение особенно хорошо видно, когда для трансфекции использован мутантный клон АРР-КК, содержащий мотив из двух остатков лизина у С-конца. Дальнейшее увеличение наблюдается в том случае, когда Ни-А8р2 котрансфецируют вместе с ЛРР-8^-КК, содержащим шведскую мутацию КМЖНБ. Известно, что шведская мутация увеличивает расщепление ЛРР β-секретазой.

Вторая серия экспериментов показывает, что Ни-А8р2 облегчает активность γ-секретазы в экспериментах по котрансфекции клеток почки эмбриона человека НЕК293. Котрансфекция Ни-А8р2 вместе с клоном ЛРР-КК значительно увеличивает продуцирование и высвобождение растворимых Аβ-пептидов 1-40 и 1-42 из клеток НЕК293. При этом наблюдается значительно большее в пропорциональном отношении высвобождение Аβ-пептида 1-42. Дальнейшее увеличение продуцирования Аβ-пептида 1-42 наблюдается тогда, когда Ни-А8р2 котрансфецируют вместе с клоном ЛРР-УЕ (8Е0 ГО N0: 13 [нуклеотидная последовательность] и 8Е0 ГО N0: 14 [аминокислотная последовательность]) или клоном ЛРР-УЕКК (8Е0 ГО N0: 19 [нуклеотидная последовательность] и 8Е0 ГО N0: 20[аминокислотная последовательность], содержащими лондонскую мутацию У717^Е. Известно, что мутация У717^Е изменяет специфичность расщепления АРР γ-секретазой так, что увеличивается расщепление на сайте Аβ42. Таким образом, А§р2 прямо или косвенно облегчает процессинг ЛРР γ-секретазой на сайте расщепления β42.

Материалы

Антитела 6Е10 и 4С8 предоставлены фирмой 8еие1ек (81. Боищ, М0). Антитело 369 получено из лаборатории Пауля Грингарда в Рокфеллеровском университете. Антитело С8 получено из лаборатории Денниса Селкое в Гарвардском медицинском институте и больницы Вгщйап аиб Аотеи'к Но§рйа1.

Используемые конструкции АРР.

В экспериментах по трансфекции использованы нижеследующие конструкции ЛРР.

АРР

ЛРР-8\\

ЛРР-УЕ АРР-КК ЛРР-8\\-КК ЛРР-УЕ-КК

АРР695 дикого типа (8Е0 ГО N0: 9 и N0: 10)

АРР695, содержащий шведскую мутацию КМЖНБ (8Е0 ГО N0: 11 и N0: 12) АРР695, содержащий лондонскую мутацию У^Е (8Е0 ГО N0: 13 и N0: 14) АРР695, содержащий С-концевой мотив КК (8Е0 ГО N0: 15 и N0: 16) ЛРР695-8\\\ содержащий С-концевой мотив КК (8Е0 ГО N0: 17 и N0: 18) АРР695-УЕ, содержащий С-концевой мотив КК (8Е0 ГО N0: 19 и N0: 20)

Эти конструкции вставляли в вектор р1КЕ8-ЕСЕР (С1ои1есй, Ра1о А11о, СА) между сайтами N011 и В§1Х1, используя соответствующие линкерные последовательности, вводимые при помощи РСК.

Трансфекции клеток НЕК293, клеток НЕК125.3 и клеток Деиго-2Л конструкциями антисмысловых олигомеров или плазмидной ДНК.

Клетки почки эмбриона человека НЕК293 и клетки Деиго-2а мыши трансфецируют экспрессирующими конструкциями с использованием реагента липофектамина Р1и5 фирмы С1Ьсо/ВКБ. Клетки высевают на 24-луночные планшеты для культуры ткани с плотностью до 70-80% слияния. Четыре лунки на планшете трансфецируют 2 мкг ДНК (3:1, ЛРР:котрансфектант), 8 мкл реагента Р1и§ и 4 мкл липофектамина в оптимальной минимальной поддерживающей среде (0рбМЕМ). 0р11МЕМ добавляют до общего объема 1 мл, распределяют по 200 мкл/лунку и инкубируют в течение 3 ч. Особое внимание уделяют сохранению постоянных соотношений двух плазмид, используемых для котрансфекции, а также общего количества ДНК, используемой для трансфекции.

Среды для трансфекции заменяют БМЕМ, 10% ЕВ8, пируватом натрия с антибиотиком/противогрибковым средством и клетки инкубируют в нормальных условиях (37°С, 5% СО₂) в течение 48 ч. Кондиционированную среду переносят в полипропиленовые пробирки и хранят при -80°С до анализа на содержание Аβ-пептида 1-40 и Аβ-пептида 1-42 при помощи Е1А, как это описано в предшествующих примерах. Трансфекцию клеток НЕК125.3 антисмысловыми олигомерами производят аналогично описанию в примере 7.

Получение клеточных экстрактов, выполнение вестерн-блоттинга.

Клетки собирают после их трансфекции плазмидной дНК в течение примерно 60 ч. Сначала клетки переносят с планшета в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют со скоростью 1500 об./мин, чтобы удалить среду. Клеточный осадок 1 раз промывают РВ8. Затем клетки лизируют с использованием буфера для лизиса (10 мМ НЕРЕ8, рН 7,9, 150 мМ ЫаС1, 10% глицерина, 1 мМ ЕСТА, 1 мМ ЕБТА, 0,1 мМ ванадата натрия и 1% №-40). Смеси лизированных клеток центрифугируют со скоростью 5000 об./мин и

- 24 009216 супернатанты хранят при -20°С в виде клеточных экстрактов. Равные количества экстрактов из клеток НЕК125.3, трансфецированных антисмысловыми олигомерами Акр2, и контрольные образцы осаждают антителом 369, который распознает С-конец АРР, и детектируют СТЕ99 в иммунопреципитате при помощи антитела 6Е10. Этот эксперимент повторяют с использованием С8, второго осаждающего антитела, которое также распознает С-конец АРР. Для выполнения вестерн-блоттинга экстрактов из клеток №ито-2а мыши, котрансфецированных Ни-Акр2 и АРР-КК, АРР-8^-КК, АРРАЕ-КК или АРР-νΕ, равные количества клеточных экстрактов подвергают электрофорезу в градиенте гелей с 4-10% или 10-20% трицина (N0VЕX, 8ап Оюдо, СА). Полимеразный АРР и продукт расщепления β-секретазой СТЕ99 определяют при помощи антитела 6Е10.

Результаты

Трансфекция клеток НЕК125.3 антисмысловыми олигомерами Акр2-1 или Акр2-2 уменьшает продуцирование продукта расщепления β-секретазой СТЕ по сравнению с клетками, которые аналогичным образом трансфецированы контрольными олигомерами, имеющими обратную последовательность (обратная последовательность Акр2-1 и Акр2-2). В экспериментах по котрансфекции введение Ни-Акр2 в клетки №иго-2а мыши вместе с конструкцией АРР-КК увеличивает образование СТЕ99. Продуцирование этого продукта еще больше увеличивается в случае экспрессии Ни-Акр2 вместе с АРР-8^-КК, мутантной формой АРР, содержащей шведскую мутацию КМАНЬ, которая усиливает процессинг β-секретазой.

Котрансфекция Ни-Акр2 с АРР не оказывает существенного влияния на продуцирование Аβ40, но увеличивает продуцирование Аβ42 по сравнению с фоновым значением (табл. 4). Добавление мотива из двух остатков лизина к С-концу АРР увеличивает процессинг Аβ-пептида почти в 2 раза, хотя продуцирование Аβ40 и Аβ42 остается достаточно низким (соответственно, 352 и 21 пг/мл). Котрансфекция Акр2 с АРР-КК еще больше увеличивает продуцирование Аβ40 и Аβ42. Продуцирование Аβ40 под действием Ни-Акр2 увеличивается более чем в 3 раза, в то время как продуцирование Аβ42 возрастает более чем в 10 раз. Таким образом, котрансфекция Ни-Акр2 с конструкциями АРР-КК предпочтительно увеличивает продуцирование Аβ42.

Установлено, что мутация АРР ν717^Ε увеличивает процессинг γ-секретазой на сайте расщепления Аβ42. Котрансфекция Ни-Акр2 с конструкциями АРР-νΕ или АРР-VΕ-КК увеличивает продуцирование Аβ42 (двухкратное увеличение при использовании АРР-νΕ и четырехкратное увеличение при использовании АРР-VΕ-КК, табл. 4), но оказывает смешанное действие на продуцирование Аβ40 (незначительное уменьшение при использовании АРР-νΕ и двукратное увеличение при использовании АРР-νΕКК по сравнению с контрольным образцом, котрансфецированным пкДНК). Таким образом, влияние Акр2 на продуцирование Аβ42 в пропорциональном отношении больше, что ведет к увеличению соотношения Аβ42/общего Аβ. Действительно, соотношение Аβ42/общего Аβ достигает очень высокого значения, равного 42%, в клетках НЕК293, котрансфецированных Ни-Акр2 и АРР-VΕ-КК.

Вестерн-блот, показывающий уменьшение продуцирования С1Е99 клетками НЕК125.3, трансфецированными антисмысловыми олигомерами, направленными на мРНК Ни-Акр2. (справа) Вестерн-блот, показывающий увеличение продуцирования С1Е99 в клетках №ито-2а мыши, котрансфецированных НиАкр2 и АРР-КК. Дальнейшее увеличение продуцирования СТΕ99 имеет место в клетках, котрансфецированных Ни-Акр2 и АРР-8\\-1<К.

Таблица 4 Результаты котрансфекции плазмидной ДНК Ни-Акр2 или пкДНК разными конструкциями АРР, содержащими мутацию ν717^Ε, модифицирующую процессинг γ-секретазой

	Котрансфекция пкДНК	Котрансфекция Азр2А
	Αβ4 0	Αβ42	Αβ42/06ωρΜ Αβ	Αβ4 0	Αβ42	Αβ42/ΟΟΐφΦί Αβ
АРР	192+18	<4	<2%	188+40	8±10	3, 9%
ΑΡΡ-νΡ	118+15	15±19	11,5%	85±7	24±12	22,4%
АРР-КК	352+24	21±6	5,5%	1062±101	226±49	17,5%
АРР-УР-КК	230+31	88±24	27,7%	491±35	355±36	42%

Котрансфекция Акр2 значительно увеличивает соотношение Аβ42/общего Аβ. Приведенные в таблице значения представляют собой количество пептида Аβ (пг/мг).

Пример 9. Экспрессия Акр2Ь человека в бактериальных клетках. Экспрессия рекомбинантного НиАкр2Ь в Е. со11.

Ни-Акр2Ь можно экспрессировать в Е. сой после добавления ^концевых последовательностей, таких как метка Т7 (8ЕО ΙΌ N0: 21 и N0: 22) или метка Т7, с последующим введением лидерной последовательности каспазы 8 (8Е0 ΙΌ N0: 23 и N0: 24). Альтернативно уменьшение числа ОС 5'-концевой последовательности при помощи сайтнаправленного мутагенеза можно использовать для увеличения выхода Ни-Акр2 (8Е0 ΙΌ N0: 25 и N0: 26). Кроме того, Акр2 можно сконструировать, используя сайт протеолити

- 25 009216 ческого расщепления (8Е0 ΙΌ N0: 27 и N0: 28). Чтобы получить растворимый белок после экспрессии и повторной укладки цепи, желательно удалить трансмембранный домен и цитоплазматический конец или удалить мембранную проксимальную область, трансмембранный домен и цитоплазматический конец.

Методы

Для слияния кодирующей последовательности Акр2 с модификациями ^концевой последовательности, включающими метку Т7 (8Е0 ΙΌ N0: 21 и 22) или лидерную последовательность Т7-сакраке 8 (8Е0 ΙΌ N0: 23 и 24), выполняют РСК с использованием затравок, содержащих соответствующие линкерные последовательности. Эти конструкции клонируют в экспрессирующем векторе ре(23а(+) Щоуедеп], в котором промотор Т7 направляет экспрессию метки Т7, предшествующей последовательности сайтов множественного клонирования. Чтобы клонировать последовательности Ни-Акр2 позади лидерной последовательности Т7 в векторе ре(23а+, используют нижеследующие олигонуклеотиды для амплификации выбранной последовательности Ни-Акр2:

№ 553=СΤССАΤССАСССАССАССССАΤСССССΤС (8ЕО ΙΌ N0: 35) № 554=САААССΤΤΤСАΤСАСΤСАΤСΤСΤСΤСΤССААΤСΤΤС (8ЕО ΙΌ N0:36) которые располагают сайты ВатНЧ и НшбШ, фланкирующие, соответственно, 5'- и 3'-концы вставки. Последовательность Акр2 амплифицируют из полноразмерной кДНК Акр2(Ь), клонированной в рс^NА3.1, с использованием набора для РСК. кДНК Абуав1аде-СС |С1оп1ес11| в соответствии с инструкциями производителя, производя отжиг и удлинение при 68°С в результате выполнения двухстадийной РСК на протяжении 25 циклов. Вставку и вектор разрезают ВатНЧ и НшбШ, очищают электрофорезом в агарозном геле и лигируют с использованием набора для быстрого лигирования ДНК [ВоегЫпдег Маппкеш]. Реакцию лигирования выполняют для трансформации штамма ДМ109 Е. со11 (Рготеда), колонии собирают для очистки плазмиды (Раздев, Оааргер т1Ш8рш) и анализа последовательности ДНК. Для индуцируемой экспрессии путем индукции изопропил-Ь-Э-тиогалактопиранозидом (ΙΕΤΟ) экспрессирующий вектор переносят в штамм ВЬ21 Е. сой (8(а(адепе). Бактериальные культуры выращивают в жидкой среде ЬВ в присутствии ампициллина в концентрации 100 мкг/мл и индуцируют рост в логарифмической фазе при оптической плотности 0Ό600 0,6-1,0, добавляя 1 мМ ΦΤΟ, в течение 4 ч при 37°С. Клеточный осадок собирают центрифугированием.

Чтобы клонировать последовательности Ни-Акр2 позади метки Т7 и лидерной последовательности каспазы (8Е0 ΙΌ N0: 23 и 24), созданную выше конструкцию, содержащую последовательность Т7-Ни-Акр2 (8Е0 ΙΌ N0: 21 и 22), открывают на сайте ВатН, после чего фосфорилированные лидерные олигонуклеотиды сакраке 8 № 559=САΤССАΤСАСΤАΤСΤСΤСАСΤСΤСССССΤСААСАССАСС (8ЕО ΙΌ N0: 37), № 560=САΤСССΤССΤСΤΤСАСССССАСАСΤСАСАСАΤАСΤСАΤС (8ЕО ΙΌ N0: 38) отжигают и лигируют в векторную ДНК. Свисающий 5'-конец для каждого набора олигонуклеотидов сконструирован таким образом, что он делает возможным лигирование с сайтом ВатН1 и препятствует последующему расщеплению ВатНЕ Продукт реакции лигирования трансформируют в ДМ109, как это описано выше, для анализа экспрессии белка после переноса в штамм ВЬ21 Е. сой.

Чтобы уменьшить число СС у 5'-конца Акр2, конструируют пару антипараллельных олигонуклеотидов для замены оснований вырожденного кодона в положениях 15 аминокислот от С/С на А/Т (8Е0 ΙΌ N0: 25 и 26). Новая нуклеотидная последовательность у 5'-конца Акр2 не изменяет кодируемую аминокислоту, поэтому ее выбирают с возможностью оптимизации экспрессии в Е. со11. Последовательность смыслового линкера представляет собой 5'-ССССАΤСССССΤСССССΤСССΤАССССΤСΤСССΤССΤСС ΤССАСΤСССΤСΤСССΤСΤССССССССАСАСССАССААС3' (8ЕО ΙΌ N0: 39). Последовательность антисмыслового линкера представляет собой 5'-СΤΤССΤСССΤСΤССССССССАСАСССАСАСССАСΤС САССАССАСССАСАССССТАСССАСССССАСССССАТСССС3' (8ЕО ΙΌ N0: 40). Фосфорилированные линкеры отжигают в 0,1М №1С1 - 10 мМ Τηκ, рН 7,4, и лигируют в уникальные сайты С1а Ι и 8та Ι в Ни-Акр2 в вектор рТАС. Для индуцируемой экспрессии путем индукции изопропил-Ь-Э-тиогалактопиранозидом (ΙΕΤΟ) бактериальные культуры выращивают в бульоне ЬВ в присутствии ампициллина при 100 мкг/мл и индуцируют рост в логарифмической фазе при оптической плотности 0Ό600 0,6-1,0, добавляя 1 мМ ΡΤΟ, в течение 4 ч при 37°С. Клеточный осадок собирают центрифугированием.

Чтобы создать вектор, в котором лидерные последовательности можно удалить ограниченным протеолизом с использованием каспазы 8 так, что в результате этого выделяется полипептид Ни-Акр2, начинающийся ^концевой последовательностью С8РУ (8Е0 ΙΌ N0: 27 и 28), выполняют следующую процедуру. Два фосфорилированных олигонуклеотида, содержащих сайт расщепления каспазы 8 ΙΒΤΌ, № 571=5'САΤССАΤСАСΤАΤСΤСΤСАСΤСΤССССΤССАСΤСΤССΤАΤССАААСССАСС (8ЕО ΙΌ N0: 41) и № 572=САΤСССΤСССΤΤΤССАΤАССАСАСΤССАССССАСАСΤСАСАСАΤАСΤСАΤС (8ЕО ΙΌ N0: 42), отжигают и лигируют в вектор рЕТ23а+, открытый ВатНЕ После трансформации в ДМ 109 очищенную векторную ДНК выделяют и ориентацию вставки подтверждают анализом последовательности ДНК. Для амплификации выбранной последовательности Ни-Акр2 используют нижеследующие олигонуклеотиды: № 573=5'-ААССАΤССΤΤΤСΤССАСАΤССΤССАСААССΤС (8ЕО ΙΌ N0: 43) и № 554=САААССΤΤΤ САΤСАСΤСАΤСΤСΤСΤСΤССААΤСΤΤС (8ЕО ΙΌ N0: 44), которые располагают сайты ВатШ и Нт6ΙΙΙ, фланкирующие, соответственно, 5'- и 3'-концы вставки. Последовательность Акр2 амплифицируют из полноразмерной кДНК Акр2, клонированной в рс^NА3.1, с использованием набора для РСК кДНК

- 26 009216

АЙуап1адс-СС |С1оп1ес11| в соответствии с инструкциями производителя, производя гибридизацию и удлинение при 68°С в результате выполнения двухстадийной РСК на протяжении 25 циклов. Вставку и вектор разрезают ВатН1 и НшйШ, очищают электрофорезом в агарозном геле и лигируют с использованием набора для быстрого лигирования ДНК [ВоегЫпдег Мапп11спп|. Реакцию лигирования выполняют для трансформации штамма ДМ109 Е. сой (Рготеда), колонии собирают для очистки плазмиды (О|адеп. О1аргер тгшкрт) и анализа последовательности ДНК. Для индуцируемой экспрессии путем индукции изопропил-Ь-О-тиогалактопиранозидом (1РТ6) экспрессирующий вектор переносят в штамм ВЬ21 Е. сой (81а!адепе). Бактериальные культуры выращивают в бульоне ЬВ в присутствии ампициллина при 100 мкг/мл и индуцируют рост в логарифмической фазе при оптической плотности ΟΌ600 0,6-1,0, добавляя 1 мМ 1РТС, в течение 4 ч при 37°С. Клеточный осадок собирают центрифугированием.

Для облегчения очистки метку 6-Н1к можно ввести в любую из вышеуказанных конструкций после лидерной последовательности Т7 путем открытия конструкции на сайте ВатН1 и последующего лигирования с фосфорилированными олигонуклеотидами, подвергшимися отжигу, содержащими последовательность из шести остатков гистидина № 565=6АТС6САТСАТСАССАТСАССАТ6 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 45), № 566=6АТССАТ66Т6АТ66Т6АТ6АТ6С (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 46). Свисающий 5'-конец для каждого набора олигонуклеотидов сконструирован так, что он делает возможным лигирование в сайт ВатН1 и препятствует последующему расщеплению ВатН1.

Получение бактериального осадка

36,34 г бактериального осадка, предназначенного для получения 10,8 л питательной среды, диспергируют в общем объеме, равном 200 мл, и гомогенизируют при помощи 20 мм зонда тканевого гомогенизатора со скоростью 3000-5000 об./мин в 2М КС1, 0,1М Тпк, 0,05М ЕЭТА, 1 мМ ОТТ. Проводимость доводят примерно до 193 ММйок, добавляя воду.

К диспергированному осадку добавляют дополнительное количество раствора КС1, доводя общий объем до 500 мл. Эту суспензию гомогенизируют при помощи того же зонда в течение примерно 3 мин со скоростью 5000 об./мин. Затем смесь пропускают через гомогенизатор высокого давления Ранни под давлением 700 атм (10000 фунтов/кв.дюйм).

Во всех случаях осадок подвергают дальнейшей обработке, а растворимую фракцию удаляют. Полученный раствор центрифугируют в течение 1 ч в роторе 68А со скоростью 12500 об./мин. Осадок повторно суспендируют в аналогичном растворе (без ОТТ), используя тот же самый зонд тканевого гомогенизатора со скоростью 2000 об./мин. После гомогенизации в течение 5 мин со скоростью 3000 об./мин объем доводят до 500 мл, добавляя тот же раствор, и центрифугируют в течение 1 ч со скоростью 12500 об./мин. Осадок вновь суспендируют как и раньше, но теперь конечный объем доводят до 1,5 л, добавляя тот же раствор, после чего его гомогенизируют в течение 5 мин. После центрифугирования с той же скоростью в течение 30 мин эту процедуру повторяют еще раз. Осадок повторно суспендируют примерно в 150 мл холодной воды, собирают осадок из шести центрифужных пробирок, используемых в роторе С8А. Осадок гомогенизируют в течение 5 мин со скоростью 3000 об./мин, объем доводят до 250 мл, добавляя холодную воду, и центрифугируют в течение 30 мин. Масса полученного осадка равна 17,75 г.

Краткий обзор

Для первоначального получения осадка производят лизис бактериального осадка в растворе КС1 с последующим центрифугированием в роторе С8А. Для повторного суспендирования/гомогенизации трижды используют одинаковый раствор. Конечную промывку водой/гомогенизацию выполняют с целью удаления избытка КС1 и ЕЭТА.

Солюбилизация гНиАкр2Ь

Для солюбилизации гНцАкр2Ь из вышеописанного осадка используют соотношение, равное 9-10 мл/г осадка. Оттаивают 17,75 г осадка и добавляют 150 мл 8М раствора гидрохлорида гуанидина, 5 мМ вМе, 0,1% ЭЕА. Полученную смесь титруют до рН 8,6, используя 3М раствор Тпк. Сначала осадок повторно суспендируют в растворе гуанидина, производя гомогенизацию 20 мм зондом тканевого гомогенизатора со скоростью 1000 об./мин. Затем смесь перемешивают при 4°С в течение 1 ч и центрифугируют со скоростью 12500 об./мин в течение 1 ч в роторе С8А. Полученный супернатант центрифугируют в течение 30 мин со скоростью 40000 х градиент в роторе 88-34. Конечный супернатант хранят при -20°С, за исключением 50 мл. Аффинная хроматография на иммобилизованном никеле солюбилизованного гНиАкр2Ь

Используют нижеследующие растворы:

А) 6М гидрохлорида гуанидина, 0,1М NАР, рН 8,0, 0,01М Тпк, 5 мМ вМЕ, 0,5 мМ имидазола;

А') 6М мочевины, 20 мМ NАР, рН 6,80, 50 мМ №С1;

В') 6М мочевины, 20 мМ NАР, рН 6,20, 50 мМ №С1, 12 мМ имидазола;

С) 6М мочевины, 20 мМ NАР, рН 6,80, 50 мМ №С1, 300 мМ имидазола.

Примечание. Буферы А' и С' смешивают в соответствующих отношениях, чтобы получить промежуточные концентрации имидазола.

мл солюбилизованного вещества смешивают с 50 мл буфера А и добавляют к 100-125 мл О|адеп Νΐ-ΝΊΆ 8ирегР1о\у (предварительно уравновешенного буфером А) в колонке 5х10 см Вю-Най есопо. Колонку осторожно встряхивают в течение ночи при 4°С в холодном помещении.

- 27 009216

Стадии выполнения хроматографии

1) Полученное вещество проточно дренируют.

2) Промывают 50 мл буфера А (собирая проточную фракцию).

3) Промывают 250 мл буфера А (промывка 1).

4) Промывают 250 мл буфера А (промывка 2).

5) Промывают 250 мл буфера А'.

6) Промывают 250 мл буфера В'.

7) Промывают 250 мл буфера А'.

8) Элюируют 250 мл 75 мМ имидазола.

9) Элюируют 250 мл 150 мМ имидазола (150-1).

10) Элюируют 250 мл 150 мМ имидазола (150-2).

11) Элюируют 250 мл 300 мМ имидазола (300-1).

12) Элюируют 250 мл 300 мМ имидазола (300-2).

13) Элюируют 250 мл 300 мМ имидазола (300-3).

Результаты хроматографии гНиАкр элюируют имидазолом в количестве от 75 до 300 мМ. 75 мМ фракция, а также первая фракция, элюированная 150 мМ имидазола (150-1), содержат загрязняющие белки, которые визуализируют на геле, окрашенном кумассии голубым. Поэтому для экспериментов по повторной укладке цепи используют фракции 150-2 и 300-1, так как они содержат наибольшее количество белка (см. гель, окрашенный кумассии голубым).

Эксперименты по повторной укладке цепи гНцАкр2Ь

Эксперимент 1.

К 40 мл фракции 150-2 добавляют 1М ОТТ, 3М Тпк. рН 7,4, и ЭЕА до конечной концентрации, соответственно, равной 6 мМ, 50 мМ и 0,1%. Эту смесь быстро разводят (при перемешивании) 200 мл (4°С) холодного раствора 20 мМ NАР, рН 6,8, 150 мМ №С1. В результате этого разведения получают конечную концентрацию мочевины, равную 1М. Этот раствор остается светлым, даже если его оставляют открытым на воздухе при комнатной температуре или при температуре 4°С.

Этот раствор выдерживают открытым на воздухе в течение 4-5 ч при 4°С и диализуют в течение ночи против 20 мМ NАР, рН 7,4, 150 мМ №С1, 20% глицерина. Этот способ позволяет эффективно удалить мочевину из раствора без осаждения белка.

Эксперимент 2.

Некоторое количество элюата 150-2 дважды концентрируют в устройстве Ашюоп Сепйтргер, 10000 М^С0, и обрабатывают так же, как в эксперименте 1. Это вещество также остается в растворе без какого-либо видимого осаждения.

Эксперимент 3.

На 89 мл элюата 150-2 поливают 1М ОТТ, 3М Тпк, рН 7,4, и ЭЕА до конечной концентрации, соответственно, равной 6 мМ, 50 мМ и 0,1%. Эту смесь быстро разводят (при перемешивании) 445 мл (4°С) холодным раствором 20 мМ NАР, рН 6,8, 150 мМ №С1. Раствор остается светлым без каких-либо видимых признаков осаждения. Этот раствор доводят до комнатной температуры и перемешивают в течение 10 мин, после чего добавляют МЕА до конечной концентрации, равной 0,1 мМ. Раствор медленно перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Цистамин и Си80₄ добавляют до конечных концентраций, равных, соответственно, 1 мМ и 10 мкМ. Раствор медленно перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин, переносят в холодное помещение с температурой 4°С и медленно встряхивают в течение ночи, оставляя открытым на воздухе.

На следующий день раствор (по-прежнему светлый, без каких-либо видимых признаков осаждения) центрифугируют со скоростью 100000 х градиент в течение 1 ч. Собирают супернатанты из нескольких серий экспериментов и основную массу стабилизованного белка диализуют против 20 мМ NАР, рН 7,4, 150 мМ №С1, 20% глицерина. После диализа вещество хранят при -20°С.

Некоторое количество (примерно 10 мл) раствора белка (в 1М растворе мочевины) отбирают для биохимических анализов и хранят в замороженном виде при -20°С.

Пример 10. Экспрессия Ни-Акр2 и его производных в клетках насекомого.

Экспрессия путем инфецирования бакуловируса.

Кодирующую последовательность Ни-Акр2 и несколько производных конструируют для экспрессии в клетках насекомого при помощи РСК. Для получения полноразмерной последовательности 5'концевую смысловую олигонуклеотидную затравку, которая модифицирует сайт инициации трансляции в соответствии с согласованной последовательностью Козака, спаривают с 3'-концевой антисмысловой затравкой, которая имеет природный терминирующий трансляцию кодон в последовательности Ни-Акр2. Матрицу рс^NА3.1(йудΐо)/Ни-Акр2 амплифицируют при помощи РСК (см. пример 12). Выполняя РСК, конструируют также два производных Ни-Акр2, которые удаляют С-концевой трансмембранный домен (8ЕЦ ΙΌ N0: 29 и N0: 30) или трансмембранный домен и вводят метку из шести остатков гистидина в Сконец (8ЕЦ ΙΌ N0: 31 и N0: 32). При помощи РСК вышеуказанную 5'-концевую смысловую олигонук- 28 009216 леотидную затравку спаривают с 3'-концевой антисмысловой затравкой, которая вводит (1) терминирующий трансляцию кодон после кодона 453 (8ЕО ΙΌ N0: 3) или (2) метку из шести остатков гистидина с последующим терминирующим трансляцию кодоном, используя в качестве матрицы рсЭНЛ3.1(11удго)/Ни-Л5р2Е. Во всех случаях при помощи полимеразных цепных реакций производят амплификацию на протяжении 15 циклов, используя ДНК-полимеразу Γ\\όΙ (Воейппдег-Маппйет) в соответствии с инструкциями поставщика. Продукты реакции полностью расщепляют ВатН1 и №6 и лигируют с бакуловирусным вектором переноса рУЬ1393, расщепленным ВатН1 и (1пуйгодеп).

Часть лигирований используют для превращения компетентных клеток ΌΗ5α Е. со11, после чего производят отбор клеток при помощи антибиотика на ЬВ-Атр. Плазмидную ДНК получают путем стандартного щелочного лизиса и связывания в С§С1, что дает бакуловирусные векторы переноса рУЫ393/А8р2, рV^1393/А8р2ΔΤΜ и рV^1393/А8р2ΔΤΜ(Н^8)₆. Для создания рекомбинантных бакуловирусов и инфецирования клеток насекомого Г9 используют стандартные методы.

Экспрессия трансфекцией

Временную и стабильную экспрессию Ηυ^^ΔΤΜ и Ни-А8р2ΔΤΜ(Н^8)₆ в клетках насекомого Ηί§1ι 5 производят, используя экспрессирующий вектор р12/У5-Н18 для клеток насекомого. ДНК-вставки из экспрессирующих плазмидных векторов рУЫ393/А8р2, рV^1393/А8р2ΔΤΜ и рV^1393/А8р2ΔΤΜ(Н^8)₆вырезают путем двойного расщепления ВатН1 и №6 и субклонируют в р12/У5-Н18, расщепленном ВатН1 и №П, при помощи стандартных методов. Полученные экспрессирующие плазмиды, именуемые рIΖ/Ни-А8р2ΔΤΜ и рIΖ/Ни-А8р2ΔΤΜ(Н^8)₆, получают так, как описано выше.

Для выполнения трансфекции клетки насекомого Ηί§1ι 5 культивируют в бессывороточной среде Ηί§1ι Р1уе, содержащей 10 мкг/мл гентамицина, при 27°С в герметично закрытых колбах. Трансфекцию выполняют, используя клетки Ηί§1ι Р1уе, бессывороточную среду Ηί§1ι Р1уе, содержащую 10 мкг/мл гентамицина, и липосомы 1п8есбпР1и8 (1пуйгодеп, СагкЬаб, СА) при помощи стандартных методов.

Для выполнения крупномасштабной временной трансфекции 1,2х10⁷ клеток Ηί§1ι Р1уе помещают в 150 мм чашку для культуры ткани и оставляют для прикрепления при комнатной температуре в течение 15-30 мин. Во время прикрепления получают смесь ДНК/липосом, смешивая 6 мл бессывороточной среды, 60 мкг ДНК А8р2ΔΤΜ/рIΖ (+/-Н18) и 120 мкл Иъесйп Р1и8, и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Среду для чашек Петри удаляют из чашки с клетками, заменяют ее смесью ДНК/липосом и оставляют на 4 ч при комнатной температуре и постоянном покачивании со скоростью 2 об./мин. В чашку добавляют еще 6 мл среды и инкубируют в течение 4 дней при 27°С во влажном термостате. Через 4 дня после трансфекции среду собирают, очищают центрифугированием со скоростью 500 х градиент и анализируют экспрессию А§р2 при помощи вестерн-блоттинга. Для достижения стабильной экспрессии клетки обрабатывают 50 мкг/мл зеоцина и выжившую популяцию используют для получения клональных клеток, производя ограниченное разведение и анализ степени экспрессии, как было описано выше.

Очистка Ηυ^^ΔΤΜ и Ни-А8р2ΔΤΜ(Н^8)₆

Удаление трансмембранного сегмента из Ни-А8р2 вызывает секрецию полипептида в культуральную среду. После продуцирования белка путем инфецирования или трансфекции бакуловируса кондиционированную среду собирают, очищают центрифугированием и диализуют против ΤΠ5-ΗΟ1 (рН 8,0). Затем это вещество очищают последовательным выполнением анионообменной хроматографии (Τπ5НС1, рН 8,0) и катионообменной хроматографии (ацетатный буфер при рН 4,5) с использованием градиентов №С1. Параметры элюции контролируют (1) вестерн-блоттингом и (2) анализом активности с использованием пептидного субстрата, описанного в примере 12. Для Ни-А8р2ΔΤΜ(Н^8)₆ кондиционированную среду диализуют против Τπ5 буфера (рН 8,0) и очищают последовательным выполнением хроматографии на смоле 1МАС и анионообменной хроматографии.

Анализ последовательности очищенного белка Ни-А8р2ΔΤN(Н^8)₆ показывает, что произошло отщепление сигнального пептида [’ГрНСЖЬРЬК].

Пример 11. Экспрессия Ни-А8р2 в клетках яичника китайского хомячка (СН0).

Гетерологичная экспрессия Ни-А8р2Ь в клетках СН0-К1

Полную кодирующую последовательность Ни-А8р2 клонируют в экспрессирующем векторе рс^NА3.1(+)Нуд^о для клеток млекопитающего (1пуйгодеп, СагкЬаб, СА), который содержит промежуточный ранний промотор СМУ и сигнал полиаденилирования ЬСН для стимуляции экспрессии. Экспрессирующую плазмиду рс^NА3.1(+)Нуд^о/Ни-А8р2 получают путем щелочного лизиса, связывания в С§С1 и полного секвенирования обеих цепей для проверки целостности кодирующей последовательности.

Клетки яичника китайского хомячка дикого типа (СН0-К1) получены из АТСС. Эти клетки помещают в монослойные культуры, находящиеся в среде α-МЕМ, содержащей 10% РС8, при 37°С в 5% С0₂. Клетки СН0-К1 (60% слияние) в двух 100 мм чашках трансфецируют только рсОНА3.1(+)Нудго (контрольная плазмида) или рс^NА3.1(+)Нуд^о/Ни-А8р2, используя катионную липосому ^0ΤΛР в соответствии с рекомендациями поставщика. Клетки обрабатывают смесями плазмидной ДНК/липосом в течение 15 ч, после чего используемую среду заменяют питательной средой, содержащей 500 ед./мл гигромицина В. В случае клеток СН0-К1, трансфецированных рсОНА3.1(+)Нудго/Ни-А8р2, клонируют отдельные клетки, устойчивые к гигромицину В, производя ограниченное разведение. После клональной

- 29 009216 экспансии отдельных линий клеток экспрессию белка Ни-Акр2 оценивают при помощи вестернблоттинга, используя поликлональную антисыворотку кролика против рекомбинантного Ни-А8р2, полученного экспрессией в Е. сой. Почти полностью слитые линии клеток во всех чашках собирают, производя соскоб в РВ8, и отделяют клетки центрифугированием. Клеточный осадок повторно суспендируют в холодном буфере для лизиса (25 мМ Тп5-НС1 (8,0)/5 мМ БОТА), содержащем ингибиторы протеазы, и лизируют клетки ультразвуком. Растворимые и мембранные фракции отделяют центрифугированием (105000 х градиент, 60 мин) и нормализованные количества белка из каждой фракции отделяют при помощи 8Э8-РАСЕ. Отделенные полипептиды гибридизируют методом электропереноса с мембранами РУЭР, после чего детектируют белок Ни-А8р2Ь, используя антисыворотку против Ни-Акр2 кролика (1/1000 разведение), и визуализируют комплексы антиген-антитело, используя щелочную фосфатазу, конъюгированную с антителами козы против кролика (1/2500). Специфический иммунореактивный белок с кажущейся молекулярной массой (Мг) 65 кДа обнаружен в клетках, трансфецированных рс^NΑ3.1(+)Нуд^о/Ни-Α8р2, и не обнаружен в клетках, трансфецированных контрольной плазмидой. Кроме того, полипептид Ни-А§р2 обнаружен только в мембранной фракции при наличии сигнального пептида и сигнального трансмембранного домена в предполагаемой последовательности. На основании этого анализа можно сделать вывод о том, что клон № 5 характеризуется наибольшей экспрессией белка НиАкр2, поэтому эти линии продуцирующих клеток размножены с целью получения материала для очистки.

Очистка рекомбинантного Ни-А8р2Ь из клона № 5 СНО-К1/Ни-А§р2

Для выполнения типичной очистки в качестве исходного материала используют клеточный осадок клона № 5, полученный из 20 150 мм чашек слитых клеток. Клеточный осадок повторно суспендируют в 50 мл холодного буфера для лизиса, как это описано выше. Клетки лизируют гомогенизацией в политроне (2х20 с) и лизат центрифугируют со скоростью 338000 х градиент в течение 20 мин. Мембранный осадок повторно суспендируют в 20 мл холодного буфера для лизиса, содержащего 50 мМ β-октилглюкозида, с последующим покачиванием при 4°С в течение 1 ч. Экстракт детергента очищают центрифугированием со скоростью 338000 х градиент в течение 20 мин и супернатант собирают для последующего анализа.

Экстракт β-октилглюкозида вводят в анионообменную колонку Мопо О, которую предварительно уравновешивают 25 мМ Тгщ-НС1 (рН 8,0)/50 мМ β-октилглюкозида. После введения образца колонку элюируют линейным градиентом №10'1 с возрастающей концентрацией (0-1,0М в течение 30 мин), отдельные фракции анализируют вестерн-блоттингом и определяют активность β-секретазы (см. ниже). Фракции, обладающие иммунореактивностью Ни-А§р2Ь и активностью β-секретазы, собирают и диализируют против 25 мМ №1ОАс (рН 4,5)/50 мМ β-октилглюкозида. После выполнения диализа осажденное вещество удаляют центрифугированием и растворимое вещество хроматографируют на катионообменной колонке Мопо8, которую предварительно уравновешивают 25 мМ №ЮАс (рН 4,5)/50 мМ β-октилглюкозида. Колонку элюируют линейным градиентом №1С1 с возрастающей концентрацией (0-1,0М в течение 30 мин), отдельные фракции анализируют вестерн-блоттингом и определяют активность β-секретазы. Фракции, обладающие иммунореактивностью Ни-Акр2 и активностью β-секретазы, объединяют и при помощи 8Ь8-РАСА/окрашивания кумассии голубым определяют их чистоту, которая составляет >90%.

Пример 12. Анализ активности β-секретазы Ни-А§р2 с использованием пептидных субстратов.

Анализ β-секретазы

Активность β-секретазы определяют в количественном отношении, измеряя степень гидролиза синтетического пептида, содержащего шведскую мутацию АРР, при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой (КР-НРЬС) и детектирования в ультрафиолетовом свете. Каждая реакционная смесь содержит 50 мМ ΝιМЕ8 (рН 5,5), 1% β-октилглюкозида, пептидный субстрат (8ЕУЫЬПАЕРК, 70 мкМ) и фермент (1-5 мкг белка). Реакционные смеси инкубируют при 37°С в течение разных периодов времени и продукты реакции выделяют при помощи КР-НРЬС, используя линейный градиент 0-70 В в течение 30 мин (А=0,1% ТФУ в воде, В=1% ТФУ/10% воды/90% АсСЩ. Параметры элюции контролируют по оптической плотности при 214 нм. В предварительных экспериментах пики двух продуктов, которые элюировали перед субстратом из интактного пептида, подтвердили наличие последовательности ОАЕРК и 8ЕУНЬ при выполнении секвенирования Эдмана и масс-спектрометрии МАОЫ-ТОР. Процентное значение гидролиза пептидного субстрата высчитывают, сравнивая интегрированные площади пиков для двух пептидных продуктов и исходного вещества, полученного при оптической плотности 214 нм. Специфичность реакции расщепления протеазой определяют, выполняя анализ β-секретазы в присутствии смеси ингибиторов протеазы (8 мкМ пепстатина А, 10 мкМ лейпептина, 10 мкМ Е64 и 5 мМ ЕЬТА).

При выполнении альтернативного анализа β-секретазы используют субстраты с внутренне погашенной флуоресценцией, контролируя активность фермента при помощи флуоресцентной спектроскопии в одном образце или многолуночном формате. Каждая реакционная смесь содержит 50 мМ №а-МЕ8 (рН 5,5), пептидный субстрат МСА-ЕУКМОАЕР|К-ЬНР| (Вю8оигсе 1п1егпа1юпа1) (50 мкМ) и очищенный фермент Ни-А§р2. Эти компоненты уравновешивают при 37°С в течение разных периодов времени и инициируют реакцию, добавляя субстрат. Реакционную смесь осуществляют при 330 нм и контролируют кинетику реакции, измеряя флуоресцентное излучение при 390 нм. Чтобы обнаружить соединения, модулирующие активность Ни-А8р2, испытуемые соединения добавляют во время фазы предварительной

- 30 009216 инкубации и контролируют кинетику реакции так, как это описано выше. Активаторами являются соединения, увеличивающие скорость появления флуоресценции, и ингибиторами являются соединения, уменьшающие скорость появления флуоресценции.

Очевидно, что существуют другие варианты осуществления этого изобретения помимо рассмотренных в приведенном выше описании изобретения и примерах.

С учетом вышеизложенного возможны многочисленные модификации и варианты настоящего изобретения, поэтому все они входят в объем этого изобретения.

Все приведенные публикации полностью включены в это описание изобретения в качестве ссылки. Список последовательностей <110> Сигпеу, Маек Е.

ВЕепконзкх, М±сИае1 Ц. Нехпгхкаоп, КоЬегЕ Ь. РагосН, 1л1±з А.

Уап, РЪагтасха & Цр]окп Сотрапу <120> Роль секретаэы в болезни Альцгеймера <130> 6177.Р СР <140>

<141>

<150> 60/101594 <151> 1998-09-24 <160>49 <170> Программа РаЕеггЫп, версия 2.0 <210> 1 <211>1804 <212> ДНК <213> Человек (Нолю зархепз) <400> 1 аЕдддсдсас Еддсссддде дскдсЕдсЕд ссЕсЕдсЕдд сссадЕддсЕ ссЕдсдсдсс60 дссссддадс Еддсссссдс дсссЕЕсасд сЕдссссЕсо дддЕддесдс ддссасдаас120 сдсдЕадЕЕд сдсссасссс дддасссддд ассссЕдссд адсдссасде сдасддсЕЕд180 дсдсЕсдссс ЕддадссЕдс ссЕддсдЕсс сссдсдддсд ссдссаасЕЕ сЕЕддссаЕд240 дсадасаасс Едсаддддда сЕсЕддссдс ддсЕасЕасс ЕддадасдсЕ даЕсдддасс300 сссссдсада адсЕасадаЕ ЕсЕсдЕЕдас асЕддаадса дЕаасЕЕЕдс сдЕддсадда360 ассссдсасЕ ссЕасагада сасдсасЕЕЕ дасасадада ддССЕадсас асассдсЕсс420 аадддсЕЕЕд асдЕсасадС даадЕасаса сааддаадсс ддасдддсЕЕ сдЕЕддддаа480 дассЕсдЕса ссаЕссссаа аддсЕЕсааЕ асЕЕсЕЕЕЕс ЕЕдЕсаасаЕ ЕдссасЕаЕЕ540

ЕЕЕдааЕсад адааЕЕЕсЕЕ ЕЕЕдссЕддд аЕЕаааЕдда аЕддааЕасЕ ЕддссЕадсЕ600

ЕаЕдссасас ЕЕдссаадсс аЕсаадЕСсЕ сЕддадассЕ ЕсЕЕсдасЕс сссддЕдаса660 саадсаааса ЕссссаасдЕ ЕЕЕсЕссаЕд садаЕдЕдЕд дадссддсЕЕ дсссдЕЕдсЕ720 ддаЕсЕддда ссаасддадд ЕадЕсЕЕдьс ЕСдддЕддаа ЕЕдаассаад ЕЕСдЕаЕааа780 ддадасаЕсЕ ддгаЕасссс ЕаЕЕааддаа дадЕддЕасЕ ассадаЕада ааЕЕсЕдааа840

ЕЕддаааЕЕд даддссааад ссЕЕааЕсЕд дасЕдсадад адЕаЕааедс адасааддсс900 аЕсдЕддаса дЕддсассас дсЕдсЕдсдс сЕдссссада аддЕдЕЕЕда ЕдсддЕддЕд960 даадсЕдсдд сссдсдсаЕс ЕсЕдаЕЕсса дааЕЕсЕсЕд аЕддЕЕЕсЕд дасЕдддЕсс1020 садсЕддсдЕ дсЕддасдаа ЕЕсддаааса ссЕЕддЕсЕЕ асЕЕсссЕаа ааЕСЕссаЕс1080

ЕассЕдадад аЕдадаассс садсаддЕса ЕЕссдЕаЕса сааЕссЕдсс ЕсадсЕЕЕас1140

- 31 009216 аЕЕсадссса ЕдаЕдддддс сддссЕдааЕ ЕаЕдааЕдЕЕ ассдаЕЕсдд саЕЕЕсссса 1200 ЕссасаааЕд сдеЕддЕдаС сддсдссасд дЕдаЕддадд дсЕЕсЕасдЕ саЕсЕЕсдас 1260 ададсссада ададддЕддд сЕЕсдсадсд адссссЕдЕд садаааЕЕдс аддЕдсЕдса 1320 дсдсссдааа ЕЕЕссдддсс ЕЕЕсгсааса даддаЕдЕад ссадсаасЕд ЕдЕссссдсЕ 1380 садЕСЕЕЕда дсдадсссаЕ ЕЕЕдЕддаЕЕ дЕдЕссЕаЕд сдсЕсаЕдад сдЕсрдЕдда 1440 дссаЕссЕсс ЕЕдЕссЕааЕ сдЕссЕдсЕд сгдсЕдссдЕ ЕссддЕдЕса дсдЕсдсссс 1500 сдЕдасссЕд аддЕсдЕсаа ЕдаЕдадЕсс ЕсЕсЕддЕса дасаЕсдсЕд даааЕдааЕа 1560 дссаддссЕд ассссаадса ассаЕдаасЕ садсЕаЕЕаа дааааъсаса ЕЕЕссадддс 1620 адсадссддд аЕсдаЕддЕд дсдсЕЕЕсЕс сЕдЕдсссас ссдЕСЕЕсаа ЕсЕсЕдЕЕсЕ 1680 дсЕсесадаЕ дссЕЕсЕада ЕЕсасЕдЕсЕ ЕЕЕдаЕЕсЕЕ даЕЕСЕсаад сЕЕЕсаааЕс 1740 сЕсссЕасЕЕ ссаадааааа ЕааЕЕааааа ааааасЕЕса ЕЕсЕааасса аааааааааа 1800 аааа 1804 <210> 2 <211> 518 <212> Белок <213> Человек (Ното зархепз)

<400> 2

Ьеи

Ьеи Ьеи Рго Ьеи Ьеи А1а С1п

Тгр

ИеЕ 1

О1у

А1а

Ьеи

А1а Агд А1а 5

10

15

Ьеи

Агд

А1а

Рго

С1и

Ьеи

А1а

Рго

А1а

Рго

РЬе

ТЫ

Ьеи

Рго

20

25

30

Ьеи

Агд

νβΐ

А1а

ТЬг

Азп

Агд

Уа1

А1а

Рго

ТЬг

Рго

С1у

35

40

45

Рго

О1у

ТЬг

Рго

А1а

С1и

Агд

Н13

А1а

Азр

<31у

Ьеи

А1а

Ьеи

А1а

Ьеи

50

55

60

61и

Рго

А1а

Ьеи

А1а

Бег

Рго

А1а

С1у

А1а

Азп

РЬе

Ьеи

А1а

МеЕ

65

70

75

80

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

С1п

С1у

Азр

Зег

О1у Агд

(31у Тут

Туг

Ьеи

С1и

МеЕ

85

90

95

Ьеи

Не

С1у

ТЬг

Рго

С1п

Ьуз

Ьеи

С1П

11е

Ьеи

Уа1

Азр

ТЫ

С1у

100

105

110

Бег

Лап

РЬе

А1а

Уа1

А1а

С1у

ТЬг

Рго

ΗΪ3

Бег

Туг

11е

Азр

ТЫ

115

120

125

Туг

РЬе

Азр

ТЬг

С1и

Агд

Бег

ТЬг

Туг

Агд

Бег

Ьуз

С1у

РЬе

Азр

130

135

140

νβΐ

ТЬг

Уа1

Ьуз

Туг

ТЬг

С1п

С1у

Бег

Тгр

ТЬг

С1у

РЬе

ναΐ

С1у

С1и

145

150

155

160

- 32 009216

Азр Ьеи Уа1 ТЬг Не

Рго Ьуз С1у РЬе Азп ТЬг Бег РЬе Ьеи ναΐ

Азп

165

170

175

Не

А1а

ТЬг

Не 180

РЬе

С1и

Бег

С1и

Азп 185

РЬе

Ьеи

Рго

С1у 190

Не

Ьуз

Тгр

А$П

С1у 195

Не

Ьеи

С1у

Ьеи

А1а 200

Туг

А1а

ТЬг

Ьеи

А1а 205

Ьуз

Рго

Бег

Бег 210

Ьеи

С1и

ТЬг

РЬе

РЬе 215

Авр

Бег

Ьеи

Уа1

ТЬг 220

<31п

А1а

Азп

Не

Рго 225

Авп

Уа1

РЬе

Бет

Мес 230

С1п

МеС

Суз

С1у

А1а 235

С31у

Ьеи

Рго

νβΐ

А1а 240

С1у

Бег

С1у

ТЬг

Авп 245

С1у <31у

Бег

Ьеи

Уа1 250

Ьеи

<31у

С1у

Не

С1и 255

Рго

Бег

Ьеи

Туг

Ьуб 260

О1у

Азр

Не

Тгр

Туг 265

ТЬг

Рго

Не

Ьуз

С1и 270

<31и

Тгр

Туг

С1п 275

11е

<31и

Не

Ьеи

Ьуз 280

Ьеи

С1и

Не

С1у

С1у 285

С1п

Бег

Ьеи

Азп

Ьеи 290

Азр

Суз

Агд

С1и

Туг 295

Азп

А1а

Азр

Ьуз

А1а 300

Не

Уа1

Азр

Бег

С1у 305

ТЬг

Ьеи

Агд 310

Ьеи

Рго

С1п

Ьуз

Уа1 315

РЬе

Азр

А1а

Уа1

Уа1 320

<31и

А1а

ν*ι

А1а

Агд 325

А1а

Бет

Ьеи

Не

Рго 330

С1и

РЬе

Бег

Азр

С1у 335

РЬе

Тгр

ТЬг

<31у

Бег 340

С1п

Ьеи

А1а

Суз

Тгр 345

ТЬг

Азп

Бег

С1и

ТЬг 350

РГО

Тгр

Зег

Туг

РЬе 355

Рго

Ьуз

Не

Бег

Не 360

Туг

Ьеи

Агд

Азр

С1и 365

Азп

Бег

Агд

Бег 370

РЬе

Агд

Не

ТЬг

Не 375

Ьеи

Рго

С1п

Ьеи

Туг 380

Не

<31п

Рго

мес

Мес 385

С1у

А1а

С1у

Ьеи

Азп 390

Туг

<31и

Суз

Туг

Агд 395

РЬе

С1у

Не

Бег

Рго 400

Бег

ТЬг

Авп

А1а

Ьеи

Уа1

Не

С1у

А1а

ТЬг

νβΐ

Мес

<31и

С1у

РЬе

Туг

405 410 415

- 33 009216

Уа1

Не РЬе Азр Агд А1а С1п Ьуз Агд Уа1 С1у РЬе А1а А1а

Зег

Рго

420

425

430

Суз

А1а

С1и

11е

А1а

С1у

А1а

Ча1

Зег

С1и

Не

Зег

С1у

Рго

РЬе

435

440

445

Зег

ТЬг

С1и

Азр

Уа1

А1а

Зег

Азп

Суз

Ча1

Рго

А1а

С1п

Зег

Ьеи

Зег

450

455

460

<Пи

Рго

11е

Ьеи

Тгр

11е

νβΐ

Зег

Туг

А1а

Ьеи

МеЕ

Зег

Уа1

Суз

61у

465

470

475

480

А1а

11е

Ьеи

ν»1

Ьеи

11е

Уа1

Ьеи

Рго

РЬе

Агд

Суз

485

490

495

С1п

Агд

Рго

Агд

Азр

Рго

С1и

Уа1

Азп

Азр

С1и

Зег

Ьеи

500

505

510

V»! Агд Ηίβ Агд Тгр Ьуз

515 <2Ю> 3 <211> 2070 <212> ДНК <213> Человек (Ното вархепз) <400> 3 аЕддсссаад сссЕдсссЕд дсЕссЕдсЕд Еддасдддсд сдддадЕдсЕ дссЕдсссас 60 ддсасссадс асддсаЕссд дсЕдссссЕд сдсадсддсс Еддддддсдс сссссЕдддд 120 седсддсЕдс сссдддадас сдасдаадад сссдаддадс ссддссддад дддсадсЕЕЕ 180 дЕддадагдд ЕддасаассЕ даддддсаад Есддддсадд дсЕасЕасдЕ ддадаЕдасе 240 дЕдддсадсс ссссдсадас дсЕсаасаЕО сЕддсддаса саддсадсад ЕаасЕЕЕдса 300 дЕдддЕдсЕд ссссссассс сЕЕссЕдсаЕ сдсЕасЕасс ададдсадсЕ дЕСсадсаса 360 Еассдддасс Ессддааддд ЕдЕдЕаЕдЕд сссЕасассс адддсаадЕд ддааддддад 420 сЕдддсассд ассЕддЕаад саЕсссссаЕ ддссссаасд ЕсасЕдЕдсд ЕдссаасаЕЕ 480 дсЕдссасса сЕдааСсада саадЕЕсЕЕс аСсаасддсг ссаасЕддда аддсаСссЕд 540 дддсЕддссЕ аЕдсЕдадаЕ ЕдссаддссЕ дасдасЕссс ЕддадссЕЕЕ сЕЕЕдасЕсЕ 600 сЕддсааадс адассеасдС ЕсссаассЕс ЕЕсЕсссЕдс ассЕЕЕдЕдд ЕдсЕддсссс 660 ссссЕсаасс адЕсЕдааде дсЕддссЕсЕ дЕсддаддда дсаЕдаЕсаЕ ЕддаддЕаЕс 720 дассасЕсдс ЕдЕасасадд садСсЕсЕдд ЕаЕасассса Ессддсддда дЕддЕаЕЕаЕ 780 даддЕсаЕса ЕЕдЕдсдддС ддадаЕсааЕ ддасаддаСс ЕдааааЕдда сЕдсааддад 840 ЕасаасЕаЕд асаададсаЕ ЕдЕддасадЕ ддсассасса ассЕЕсдЕЕЕ дсссаадааа 900 дСдЕЕЕдаад сЕдсадсеаа аЕссассаад дсадссЕссЕ ссасддадаа дЕЕсссЕдас 960 ддЕЕЕсЕддс Еаддададса дсЕддЕдЕдс Еддсаадсад дсассасссс ЕЕддаасаЕЕ 1020 ЕЕсесадЕса ЕсЕсасЕсЕа ссЕааЕдддЕ даддЕЕасса ассадЕССЕЬ ссдсаЕсасс 1080 аЕссЕЕссдс адсааЕассЕ дсддссадЕд даадаЕдЕдд ссасдСссса адасдасЕдЕ 1140

- 34 009216

ЕасаадЕЕЕд ддсЕЕсЕасд саЕдЕдсасд даадасЕдгд дгсаЕддсЕд сдсЕдссЕсс аадЕдаддад сЕЕЕддЕсас ссасссасса ддасЕдЕасс сЕЕддЕсасс ЕЕдгссасса дЕасЕддсаЕ адассаадсг ЕдсЕЕЕадад ссаЕсЕсаса ЕЕдЕСЕЕЕда аЕдадЕЕсад дсЕасаасаЕ ссаЕсЕдсдс дсЕдссЕдсд дсссаЕдддс аадЕаддада ааЕдссЕсЕд Едсаддааас ЕсаааЕЕЕаа ЕЕссЕЕЕааа сасаедсадд ЕдЕЕЕсссЕд асадддасЕд дЕсаЕссасд Есдддсссда дасддсадсд Еесасадаса ссЕсЕЕсаЕд ссадсадсаЕ адаадасада сасадаЕддс ссЕЕдаЕдда адаааадада дЕсдддаааЕ ЕЕсЕссаасс ЕЕассЕЕддс сЕддссааад ЕаЕааасаад ддсаСЕдЕЕа ааасдааЕЕд дЕддааддсс даЕдадЕсаа сЕдссасЕсЕ даЕдасЕЕЕд даЕЕссссЕд ассЕдЕддсс дааддаааад адааадаадс ЕсЕдсЕдсЕЕ сааадЕаЕЕс дЕдЕдЕсссЕ ЕсадЕаддад ссЕааеаЕЕд

ЕдддадсЕдЕ дсЕЕЕдсЕдЕ сЕЕЕЕдЕсас сссЕсаЕдас дссЕсаЕддЕ сЕдаЕдасаЕ дассасасеЕ ададсассЕс дсЕддсаадд асЕсЕдсЕдд давасЕЕсад ЕЕСЕЕЕЕоЕЕ дЕддЕасссЕ аддаЕдсаса дЕдсааадаЕ

ЕаЕсаЕддад садсдсЕЕдс сЕЕддасаЕд саЕадссЕас дЕдЕсадЕдд сЕсссЕдсЕд ссдЕддЕЕса аддасссЕсс ЕдддЕЕссад сдддааЕасЕ СССЕдаассЕ адЕЕЕсадаа ддсададаад дЕЕЕдсЕаЕЕ ЕдссЕСЕЕда

1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 аЕЕааааааа аааааааааа аааааааааа

2070 <210> 4 <211> 501 <212> Белок <213> Человек (Ното зарХепз)

<400> 4 Мег А1а СХп 1

А1а

Ьеи Рго Тгр Ьеи Ьеи Ьеи Тгр МеЕ <31 у А1а СХу

Уа1

5

10

15

Ьеи

Рго

АХа

Ηίε

С1у

ТЬг

СХп

Нхз

С1у

Не

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

Агд

Бег

20

25

30

С1у

Ьеи

С1у С1у

А1а

Рго

Ьеи

СХу

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

Агд

С1и

ТЫ

Азр

35

40

45

С1и

Рго

С1и

Рго

С1у

Агд

С1у

Бег

РЬе

Уа1

СХи

МеЕ

Уа1

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Агд

СХу

Ьуз

Зег

СХу

С1п

С1у

Туг

УаХ

СХи

МеЕ

ТЬг

65

70

75

80

Уа1

С1у

5ег

Рго

СХп

ТЬг

Ьеи

Азп

Не

Ьеи

УаХ

Азр

ТЬг

С1у

Бег

85

90

95

Зег

Авп

РЬе

АХа

Уа1

С1у

А1а

Рго

Нхз

Рго

РЬе

Ьеи

Н1в

Агд

Туг

100

105

110

Туг

С1п

Агд

С1п

Ьеи

Бег

ТЫ

Туг

Агд

Азр

Ьеи

Агд

Ьуз

С1у

УаХ

115

120

125

Туг

Уа1

Рго

туг

ТЬг

С1п

С1у

Ьуз

Тгр

С1и

С1у

СХи

Ьеи

СХу

ТЫ

Азр

130 135 140

Ьеи Уа1 Зег 145

Не

Рго Ηίβ С1у Рго Азп Уа1 ТЬг Уа1 Агд А1а Азп Не

150

155

160

А1а

Не

ТЬг

С1и 165

Бег

Азр

Ьуз

РЬе

РЬе 170

Не

Азп

С1у

Бег

Азп 175

Тгр

й1и

С1у

Не

Ьеи 180

С1у

Ьеи

А1а

Туг

А1а 185

С1и

Не

А1а

Агд

Рго 190

Азр

Зег

Ьеи

С1и 195

Рго

РЬе

Азр

Зег 200

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1п

ТЫ 205

Н13

Уа1

Рго

Азп

Ьеи 210

РЬе

Зег

Ьеи

ΗΪ3

Ьеи 215

Суз

С1у

А1а

С1у

РЬе 220

Рго

Ьеи

Азп

С1п

Зег 225

С1и

Уа1

Ьеи

А1а

Зег 230

Уа1

<31у

О1у

Зег

Мес 235

Не

С1у

Не 240

Азр

Ηΐ$

Зег

Ьеи

Туг 245

ТЬг

С1у

Зег

Ьеи

Тгр 250

Тух

ТЫ

Рго

Не

Агд 255

Агд

С1и

Тгр

Туг

Туг 260

01и

Уа1

11е

Не

Уа1 265

Агд

Уа1

С1и

Не

Аяп 270

С1у

С1п

Азр

Ьеи

Ьуз 275

Мес

Азр

Суз

Ьуз

С1и 280

Туг

Азп

Туг

Азр

Ьуз 285

Зег

Не

Уа1

Азр

Зег 290

С1у

ТЬг

Азп

Ьеи 295

Агд

Ьеи

Рго

Ьуз

Ьуз 300

Уа1

РЬе

С1и

А1а

А1а 305

Уа1

Ьуз

Зег

Не

Ьуз 310

А1а

Зег

ТЫ 315

С1и

Ьуз

РЬе

Рго

Азр 320

С1у

РЬе

Тгр

Ьеи

С1у 325

С1и

С1п

Ьеи

Уа1

Суя 330

Тгр

С1п

А1а

С1у

ТЫ 335

ТЬг

Рго

Тгр

Азп

11е 340

РЬе

Рго

Уа1

Не

Зег 345

Ьеи

Туг

Ьеи

Мес

(31у 350

С1и

Уа1

ТЬг

Азп

С1п 355

Зег

РЬе

Агд

Не

ТЬг 360

Не

Ьеи

Рго

С1п

С1п 365

Туг

Ьеи

Агд

Рго

Уа1 370

С1и

Азр

Уа1

А1а

ТЫ 375

Зег

<Пп

Азр

Авр

Суз 380

Туг

Ьуз

РЬе

А1а

Не

Зег

О1п

Зег

ТЬг

С1у

ТЬг

Уа1

МеС

С1у

А1а

Уа1

Не

Мес

С1и

- 36 009216

ЭВ5

390

395

400

С1у

РЪе

Туг

Уа1

РЬе

Азр

Агд

А1а

Агд

Ьуз

Агд

11е

С1у

РЬе

А1а

405

410

415

Уа1

5ег

А1а

Суз

Ηΐε

Уа1

Ηίε

Азр

<31и

РЬе

Агд

ТЬг

А1а

ν*ι

С1и

420

425

430

С1у

Рго

РЪе

Уа1

ТЬг

Ьеи

Азр

Нее

О1и

Азр

Суз

С1у

Туг

Азл

Не

Рго

435

440

445

С1п

ТЬг

Азр

С1и

Зег

ТЬг

Ьеи

МеЕ

ТЬг

11е

А1а

Туг

Уа1

МеЕ

А1а

450

455

460

Не

Суз

А1а

Ьеи

РЬе

МеЕ

Ьеи

Рго

Ьеи

Суз

Ьеи

МеЕ

Уа1

Суз

С1п

Тгр

465

470

475

480

Агд

Суз

Ьеи

Агд

Суз

Ьеи

Агд

С1л

<31п

Ηίβ

Азр

РЬе

А1а

Азр

485

490

495

Не £ег Ьеи Ьеи Ьуз

500 <210> 5 <211> 1977 <212> ДНК <213> Человек (Ното зарЬепз) <400> 5 аЕддсссаад сссЕдсссЕд дсЕссЕдсЕд еддаЕдддсд сдддадЕдсЕ дссЕдсссас 60 ддсасссадс асддсаЕссд дсЕдссссЕд сдсадсддсс Еддддддсдс сссссЕдддд 120 сЕдсддсЕдс сссдддадас сдасдаадад сссдаддадс ссддссддад дддсадсЕЕЕ 180 дЕддадаЕдд ЕддасаассЕ даддддсаад Есддддсадд дсСасЕасдЕ ддадагдасс 240 дедддсадсс ссссдсадас дсЕсаасаес седдеддаЕа саддсадсад Еаасесгдса 300 дЕдддЕдсЕд ссссссассс сЕЕссЕдсаЕ сдсЕасЕасс ададдсадсЕ дЕссадсаса 360 Сассдддасс Ессддааддд ЕдЕдЕаЕдЕд сссЕасассс адддсаадЕд ддааддддад 420 сЕдддсассд асеЕддЕаад саЕсссссаЕ ддссссаасд ЕсасЕдЕдсд ЕдссаасаЕЕ 480 дсЕдссаЕса сЕдааЕсада саадЕЕсЕЕс аЕсаасддсЕ ссаасЕддда аддсаЕссЕд 540 дддсЕддссе аЕдседадаЕ ЕдссаддсЕЕ Едеддедсед дсЕЕсссссЕ саассадСсе 600 даадЕдсЕдд ссгсСдЕсдд адддадсаЕд аесаЕЕддад дЕаесдасса сЕсдсЕдЕас 660 асаддсадЕс ЕсЕддЕаЕас асссаЕссдд сдддадЕддЕ аЕЕаЕдадде даЕсаЕЕдЕд 720 сдддЕддада ЕсааЕддаса ддаЕсЕдааа аЕддасЕдса аддадЕасаа сЕаЕдасаад 780 адсаЕЕдЕдд асадЕддсас сассаассЕЕ сдЕЕЕдссса адааадЕдЕЕ ЕдаадсЕдса 840 дЕсаааЕсса Есааддсадс сЕссЕссасд дадаадЕЕсс сЕдаеддЕЕЕ сЕддсЕадда 900 дадсадсЕдд ЕдЕдсЕддса адсаддсасс ассссЕЕдда асаЕЕЕЕссс адЕсаЕсЕса 960 сЕСЕассЕаа ЕдддЕдаддЕ Еассаассад ЕссЕЕссдса ЕсассаЕссЕ Ессдаадсаа 1020 ЕассЕдсддс садЕддаада ЕдЕддссасд Есссаадасд асСдЕЕасаа дЕЕЕдссаЕс 1080

- 37 009216

ЕсасадСсаЕ ссасдддсас СдЕЕаСддда дсЕдЕСаСса Еддадддссс ссасдЕЕдсс 1140 сссдассддд сссдаааасд ааЕЕддсЕЕС дссдссадсд сЕЕдссаЕдс дсасдаедад 1200 Егсаддасдд садсддЕдда аддсссЕЕЕЕ дСсассЕСдд асаСддаада сЕдСддсЕас 1260 аасаЕЕссас адасадасда дссаассссс аедассаСад сссаЕдЕсаС ддсСдссасс 1320 СдсдсссСсС ЕсаСдсСдсс асЕсСдссСс «СддСдСдСс адсддсдсСд ссСссдсСдс 1380 седсдссадс адсаСдаЕда сЕЕСдсЕдаЕ дасаЕсЕссс ЕдсЕдаадЕд аддаддесса 1440 сдддсадаад аЕададасЕс сссЕддасса сассСссдсд дЕЕсасЕЕСд дссасаадЕа 1500 ддадасасад аСддсассСд Еддссададс ассЕсаддас ссЕссссасс сассаааЕдс 1560 сссСдссЕЕд асддадаадд ааааддсЕдд сааддсдддЕ ЕссадддасЕ дЕасссдЕад 1620 дааасадааа ададаадааа даадсасЕсЕ дссддсддда аЕасссЕЕдд ЕсассЕсааа 1680 сссаадссдд даааЕСсЕдс ЕдссСдааас ЕЕсадсссЕд аассЕЕсдСс сассасЕссЕ 1740 ЕСааассссс оаасссааад Еасссссссс ЕЕсЕЕадЕЕЕ садаадсасЕ ддеассасас 1800 дсаддССасс ссддсдсдсд ЕсссСдсддС асссЕддсад адаададасс аадсссдЕЕЕ 1860 сссСдсЕддс сааадЕсадЕ аддададдаЕ дсасадЕЕЕд сЕаЕЕЕдСЕЕ Еададасадд 1920 дассдсаСаа асаадсссаа саЕЕддЕдса аадаЕЕдссЕ сЕЕдаааааа ааааааа 1977 <210> 6 <211> 476 <212> Белок <213> Человек (Ното зархепз) <400> 6

Мес А1а 01л А1а 1

Ьеи 5

Рго Тгр Ьеи

Ьеи Ьеи Тгр Мес 01у А1а С1у Уа1

10

15

Ьеи

Рго

А1а

ΗΪ3 20

С1у

ТЫ

С1п

Н1з

(31у 25

Не

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи 30

Агд

Зег

С1у

Ьеи

С1у С1у 35

А1а

Рго

Ьеи

С1у 40

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

Агд 45

С1и

ТЬг

Азр

С1и

С1и 50

Рго

С1и

Рго

С1у 55

Агд

С1у

Зег

РЬе 60

Уа1

С1и

МеС

Уа1

Азр 65

Азл

Ьеи

Агд

С1у

Ьуз 70

Зег

©1у

61п

С1у

Туг 75

Тут

Уа1

01 и

Мес

ТЬг 80

Уа1

<31у

Зег

Рго

Рго 85

О1п

ТЬг

Ьеи

Азп

11е 90

Ьеи

Уа1

Азр

ТЬг

<31у 95

Зег

Бег

Азп

РЬе

А1а 100

Уа1

С1у

А1а

Рго 105

Н1з

Рго

РЬе

Ьеи

Ηίβ 110

Агд

Туг

©1п

Агд 115

б1п

Ьеи

Зег

ТЬг 120

Туг

Агд

Авр

Ьеи

Агд 125

Ьув

©1у

Уа1

Туг

Ча1 130

Рго

Тут

ТЫ

С1п

С1У 135

Ьуз

Тгр

О1и

<яу

С1и 140

Ьеи

О1у

ТЬг

Азр

- 38 009216

Ьеи 145

Уа1

Зег

11е

Рго

Ηίβ 150

С1у Рго Азп Уа1

ТЬг Уа1 Агд А1а Азп Не

155

160

А1а

Не

ТЬг

С1и 165

Зег

Азр

Ьуз

РЬе

РЬе 170

Не

Азп

С1у

Бег

Азп 175

Тгр

С1и

С1у

Не

Ьеи 180

С1у

Ьеи

А1а

Туг

А1а 185

С1и

11е

А1а

Агд

Ьеи 190

Суз

С1у

А1а

<31у

РЬе 195

Рго

Ьеи

Азп

О1п

Зег 200

С1и

Уа1

Ьеи

А1а

Зег 205

Уа1

С1у

Зег

Нес 210

11е

Не

С1у О1у

11е 215

Азр

Ηίβ

Зех

Ьеи

Тух 220

ТЬг

С1у

Зег

Ьеи

Тгр 225

Тух

ТЬг

Рго

Не

Агд 230

Агд

С1и

Тгр

Туг

Туг 235

С1и

Уа1

Не

νβΐ 240

Агд

Уа1

О1и

Не

Азп 245

С1у

С1п

Азр

Ьеи

Ьуз 250

Мес

Азр

Суз

Ьуз

С1и 255

Туг

Азп

Туг

Азр

Ьуз 260

Зег

Не

Уа1

Азр

Зег 265

С1у

ТЬх

ТЬг

Азп

Ьеи 270

Агд

Ьеи

Рго

Ьуз

Ьуз 275

Уа1

РЬе

С1и

А1а

А1а 280

Уа1

Ьуз

Зех

Не

Ьуз 285

А1а

Зег

ТЬХ 290

С1и

Ьуз

РЬе

Рго

Азр 295

С1у

РЬе

Тгр

Ьеи

С1у 300

С1и

С1п

Ьеи

Уа1

Суз 305

Тгр

С1п

А1а

<31у

ТЬг 310

ТЬг

Рго

Тгр

Азп

11· 315

РЬе

Рго

Уа1

Не

Зег 320

Ьеи

Туг

Ьеи

МеС

<31у 325

61и

Уа1

ТЬг

Азп

<31п 330

Зег

РЬе

Агд

Не

ТЬх 335

11е

Ьеи

Рго

С1п

С1п 340

Тух

Ьеи

Агд

Рго

Уа1 345

С1и

Азр

Уа1

А1а

ТЬг 350

Зег

С1п

Авр

Азр

Суз 355

Туг

Ьуз

РЬе

А1а

11е 360

Зег

С1п

Зег

ТЬг 365

С1у

ТЬг

Уа1

Мее

С1у 370

А1а

ν«ι

Не

Мес

С1и 375

С1у

РЬе

Туг

Уа1

Уа1 380

РЬе

Азр

Агд

А1а

Агд 385

Ьуз

Агд

Не

С31у

РЬе 390

А1а

Уа1

Зег

А1а

Суз 395

Ηίβ

Уа1

ΗΪ5

Азр

С1и 400

- 39 009216

РЬе Агд ТЬг А1а А1а

Уа1

О1и

О1у Рго РЬе Уа1 ТЬг 410

Ьеи

Азр Мес 415

С1и

405

Азр

Суз

С1у

Туг

Азп

11е

Рго

С1п

ТЬг

Азр

С1и

Зег

ТЫ

Ьеи

МеС

ТЬг

420

425

430

Не

А1а

Туг

νβΐ

МеС

А1а

11е

Суз

А1а

Ьеи

РЬе

МеС

Ьеи

Рго

Ьеи

435

440

445

Суй

Ьеи

МеС

Уа1

Суз

С1п

Тгр

Агд

Суз

Ьеи

Агд

Суя

Ьеи

Агд

<31 η

С1п

450

455

460

ΗΪ5

Азр

РЬе

А1а

Айр

Азр

11е

5ег

Ьеи

Ьув

465

470

475

<210>7 <211>2043 <212> ДНК <213> Мышь домовая (Миз шизси1из) <400> 7 аеддссссад сдсСдоассд дсСсседсса СдддСдддсс сдддааСдсс дссСдсссад60 ддаасссаСс есддсаСссд десдсссссс сдсадсддсс Сддсадддсс асссссдддс120 ссдаддссдс сссдддадас Сдасдаддаа ссддаддадс сСддссддад аддсадсссс1В0 дСддадаСдд СддасаассС даддддааад Сссддссадд дсЕасСаСдс ддадаСдасс240 дсаддсадсс ссссасадас дсссаасасс сСддСддаса сдддсадЬад СаассСЕдса300 дСдддддсСд ссссасассс СССсссдсаС сдсСасСасс ададдсадсС дСссадсаса360 саСсдадасс Сссдаааддд сдСдЪаСдСд ссссасассс адддсаадСд ддадддддаа420 сСдддсассд ассСддСдад саСсссСсаС ддссссаасд СсасСдСдсд СдссаасаСС480 дсСдссаСса сСдааСсдда саадССсССс аСсааСддСС ссаассддда дддсаСссСа540 дддсСддссС аСдсСдадаС Сдссаддссс дасдасСсСС СддадсссСС ссссдассос600 сСддСдаадс адасссасас ссссаасасс ССССсссСдс адссссдсдд сдссддсССс660 ссссСсаасс адассдаддс асСддссСсд дСдддаддда дсаСдаСсаС СддСддСаСс720 дассасСсдс СаСасасддд садСсСсСдд Сасасассса Ъссддсддда дСддСаССаС780 даадСдасса ССдСасдСдС ддаааСсааС ддСсаадаСс СсаадаСдда сСдсааддад840 сасаасСасд асаададсас сдсддасадс дддассасса асссесдссс дсссаадааа800 дсасссдаад сСдссдссаа дсссассаад дсадссСссС сдасддадаа дССсссддас960 ддсссссддс Саддддадса дссддсдсдс Сддсаадсад дсасдасссс ссддаасасс1020 сссссадсса ссссасссса ссСсасдддс даадссасса аСсадСсссс ссдсассасс1080 аСссССссСс адсааСассС асддссддСд даддасдСдд ссасдСссса адасдасСдС1140

СасаадСссд сСдСсСсаса дСсаСссасд ддсасСдССа СдддадссдС саСсаСддаа1200 ддСССссаСд СсдСсССсда есдадсссда аадсдааССд дсСССдсСдС садсдсССдс1260 саСдСдсасд аСдадССсад дасддсддса дСддааддСС сдсССдССас ддсадасаСд1320 даадассдсд дсСасаасаС Сссссадаса дасдадСсаа сасССаСдас саСадссСас1380 дссасддсдд ссаСсСдсдс сссссссасд ссдссаоСсс дссСсасддс асдссадсдд1440 сдсСдссСдс дССдссСдсд ссассадсас даСдасСССд сСдаСдасаС сссссСдсЬс1500

- 40 009216 аадСааддад асССддйсас сассаассСд дддсесдсас ссССаддсас сСдсссадса сддсдСсаса аассСсаССс СдаСадддас дсСсдСдддс аСдадССдда ссааСдсССс ссдСаддаса сасааасссд ссссссадад сСсаддсСас ссСдссддсс СдсадасСса адаедасдда дсСаСддаСд СддсдСдаса саддададдд адссддааас Сссссаассс ссддсаСдсд ааадСсадса адссСасасС дасдссссСд дСассСдСдд даасададаа ааддаадсад СССдсСдсСС ааадСаССсС СсссСдСддС даадааддбд ддСасааада дассасаСсС ссададсасс аСсаддсаад сдССсСддСд даадсССсад ССаСдСссСС ассссддсад аадСССдсса сСдсдСсССд дддСддССсс Ссаддасссс ссддассаса дсаддаасас сссСдасссС ссадаадСас адааадддсс дССдсСССад адасааасаа

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040 даа

2043 <210> 8 <211> 501 <212> Белок <213> Мышь домовая (Низ тизсиГиз) <400> 8

Мес А1а 1

Рго А1а

Ьеи Η15 Тгр Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Уа1 (31 у Зег С1у МеС

5

10

15

Ьеи

Рго

А1а

С1п

О1у

ТЬг

Н1з

Ьеи

С1у

Не

Агд

Ьеи

Рхо

Ьеи

Агд

Зег

20

25

30

С1у

Ьеи

А1а

С1у

Рго

Ьеи

С1у

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

Агд

С1и

ТЬг

Азр

35

40

45

С1и

О1и

Зех

С1и

Рхо

С1у

Агд

(31у

Зег

РЬе

Уа1

С1и

МеС

Уа1

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Агд

С1у

Ьуз

Зег

С1у

С1п

С1У

Туг

Тут

Уа1

О1и

Мес

ТЬг

65

70

75

80

Уа1

С1у

Зег

Рго

<31п

ТЬг

Ьеи

АЗП

Не

Ьеи

Уа1

Азр

ТЬг

<31у

Зег

85

90

95

Бег

АЗП

РЬе

А1а

Уа1

О1у

А1а

Рго

Н13

Рго

РЬе

Ьеи

ΗΪ8

Агд

Туг

100

105

110

Туг

С1п

Агд

С1п

Ьеи

Зег

ТЬг

Тут

Агд

Азр

Ьеи

Агд

Ьуз

С1у

Уа1

115

120

125

Тут

νβΐ

РГО

Туг

ТЬг

С1п

С1у

Ьуз

Тгр

61и

С31у

(31и

Ьеи

О1у

ТЬг

Азр

130

135

140

Ьеи

νβΐ

Зег

Не

Рго

Н15

С1у

Рго

Азп

Уа1

ТЬг

Уа1

Агд

А1а

Азп

Не

145

150

155

160

А1а

Не

ТЬг

61и

Зег

Азр

Ьуз

РЬе

Не

Азп

(Ну

Зег

Азп

Тхр

- 41 009216

165 170 175

С1и С1у Не Ьеи <31у Ьеи А1а Туг А1а С1и 11е А1а Агд Рго Аар Азр

180

185

190

Зег

Ьеи

С1и

Рго

РЬе

Авр

Зег

Ьеи

Уа1

Ьув

С1п

ТЬг

Нхз

11е

Рго

195

200

205

Азп

11е

РЬе

Зег

Ьеи

<31п

Ьеи

Суз

С1у

А1а

С1у

РЬе

Рго

Ьеи

Азп

(31п

210

215

220

ТЬг

С1и

А1а

Ьеи

А1а

Зег

Уа1

С1у

□1у

Зег

МеС

11е

С1у

11е

225

230

235

240

Азр

Ηϊβ

Зег

Ьеи

Туг

ТЬг

С1у

Зег

Ьеи

Тгр

Туг

ТЬг

Рго

Не

Агд

245

250

255

С1и

Тгр

Туг

С1и

Уа1

11е

Уа1

Агд

Уа1

С1и

11е

Авп

С1у

С1п

260

265

270

Азр

Ьеи

Ьуз

Мес

Азр

Суз

Ьуз

С1и

Туг

Авп

Туг

Авр

Ьув

Зег

11е

Уа1

275

280

285

Азр

Бег

С1у

ТЬг

Азп

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

Ьуз

Ьув

Уа1

РЬе

С1и

А1а

290

295

300

А1в

νβΐ

Ьуз

Зег

11е

Ьуз

А1а

Зег

ТЬг

<31и

Ьув

РЬе

Рго

Авр

305

310

315

320

С1у

РЬе

Тгр

Ьеи

О1у

С1и

С1п

Ьеи

Уа1

Сув

Тгр

С1п

А1а

□1у

ТЬг

325

330

335

Рго

Тгр

Азп

11е

РЬе

Рго

Уа1

11е

Зег

Ьеи

Туг

Ьеи

Мес

<31у

С1и

Уа1

340

345

350

ТЫ

Азп

С1п

Зег

РЬе

Агд

11е

ТЬг

11е

Ьеи

Рго

С1п

(31п

Туг

Ьеи

Агд

355

360

365

Рго

Уа1

<31и

Азр

νβΐ

А1а

ТЬг

Зет

С1п

Азр

Авр

Сув

Туг

Ьув

РЬе

А1а

370

375

380

Уа1

Зег

<31П

Зег

ТЬг

<31у

ТЫ

Уа1

Мес

<31у

А1а

Уа1

11е

МеС

(Пи

385

390

395

400

61у

РЬе

Туг

Уа1

νβΐ

РЬе

Авр

Агд

А1а

Агд

Ьуз

Агд

11е

С1у

РЬе

А1а

405

410

415

Уа1

Зег

А1а

Суз

Нхз

Уа1

Н£з

Азр

С1и

РЬе

Агд

ТЬг

А1а

νβΐ

С1и

- 42 009216

420

425

430

О1у

Рго

РЬе

Ча1

ТЬг

А1а

Азр

Мес

.С1и

Азр

Суз

(31у

Тут

Азп

Не

Рго

435

440

445

С1п

ТЫ

Азр

С1и

Зег

ТЬг

Ьеи

Мес

ТЬг

11е

А1а

Туг

νβΐ

Мес

А1а

450

455

460

Не

Суз

А1а

Ьеи

РЬе

Мес

Ьеи

Рго

Ьеи

Суз

Ьеи

МеС

Уа1

Суз

С1п

Тгр

465

470

475

480

Агд

Суз

Ьеи

Агд

Суз

Ьеи

Агд

ΗΪ8

С1п

Нхз

Азр

РЬе

А1а

Азр

485 490 495

Не Зег Ьеи Ьеи Ьуз

500 <210> 9 <211> 2088

<212> ДНК <213> Человек (Ното зараепз)
<400> 9
аСдсбдсссд	дсссддеасс	дсСссСдсСд	дссдссСдда	сддсСсдддс	дсСддаддСа	60
сссасСдабд	дСааСдсСдд	ссСдсСддсС	даассссада	ссдссасдеь	ссдеддсада	120
сСдаасаСдс	асасдаасдс	ссадааеддд	аадСдддаСС	садаСссаСс	адддассааа	180
асссдсассд	аеассаадда	аддсаСссСд	садСассдсс	аадаадссса	сссСдаасСд	240
садассасса	аСдСддсада	адссаассаа	ссадСдасса	СссадаасСд	дСдсаадсдд	300
ддссдсаадс	адСдсаадас	ссаСссссас	СССдСдаССс	ссСассдсСд	сссадссдде	360
дадСССдСаа	дсдаСдссес	СсСсдсСссс	дасаадсдса	ааССсССаса	ссаддададд	420
аСддаСдССС	дсдааасСса	ССССсасСдд	сасассдСсд	ссааададас	асдсадСдад	480
аададСасса	асССдсаСда	ссасддсаСд	Ссдссдессс	дсддааССда	саадССссда	540
ддддсададс	ссдсдсдссд	сссассддсс	даадааадСд	асааСдСдда	сссСдсСдаС	600
дсддаддадд	асдасседда	СдСССддСдд	ддсддадсад	асасадасСа	СдсадаСддд	660
адСдаадаса	аадСадсада	адСадсадад	даддаадаад	СддоСдаддС	ддаадаадаа	720
даадссдаСд	асдасдадда	сдаСдаддаС	ддСдаСдадд	Сададдаада	ддссдаддаа	780
сссСасдаад	аадссасада	дадаассасс	адсассдсса	ссассассас	сассассаса	840
дадсссдсдд	аададдсддс	есдадссосс	асаасадсад	ссадСасссс	СдаСдссдСС	900
дасаадСаСс	Ссдадасасс	сддддасдад	аасдаасасд	сссаСССеса	дааадссааа	960
дададдсссд	аддссаадса	ссдададада	аСдСсссадд	Сеасдадада	асдддаадад	1020
дсадаасдСс	аадсааадаа	сССдссСааа	дсСдаСаада	аддсадССаС	осадсасссс	1080
саддадааад	сддаасессс	ддаасаддаа	дсадссаасд	ададасадса	дссддсддад	1140
асасасасдд	ссададсдда	адссаСдсСс	аасдассдсс	дссдсссддс	сссддадаас	1200
СасаСсассд	ссссдсаддо	СдССсеСссС	сддссСсдСс	асдСдССсаа	СаСдсСааад	1260
аадСасдссс	дсдсадааса	дааддасада	садсасассс	СааадсаССС	сдадсаедсд	1320
сдсасддСдд	аСсссаадаа	адссдсесад	аСссддсссс	аддссаСдас	асассСссдс	1380
дсдасссасд	адсдсасдаа	ссадсссссс	СсссСдсгсс	аеаасдСдсс	Сдсадсддсс	1440

- 43 009216 даддадаЕЕс аддаЕдаадг сдаЕдадсЕд сЕСсадааад адсаааасса ЕЕсадасдас 1500 дЕсССддсса асасдаСЕад Едаассаадд агсадССасд дааасдаЕдс ЕсЕсаЕдсса 1560 ЕссЕСдассд ааасдаааас сассдЕддад сЕссЕЕСссд ЕдааЕддада дЕЕсадсссд 1620 дасдаЕсссс адссдсддса СЕспЕЕЕддд дсСдасЕсЕд Едссадссаа сасадаааас 1680 даадссдадс сЕдсЕдаСдс ссдсссЕдсС дссдассдад дасЕдассас Есдассаддс 1740 ксЕдддЕЕда саааСаЕеаа дасддаддад аЕсЕсЕдаад Едаадасдда сдсадааеес 1800 сдасаЕдасг саддасагда адЕЕсаесас саааааегдд ЕдЕЕссЕЕдс адаадасдЕд 1860 ддсссаааса ааддЕдсааС саЕСддассс аЕддЕдддсд дЕдЕЕдЕсаЕ адсдасадЕд 1920 аЕсдЕсаЕса ссЕЕддЕдаЕ дсЕдаадаад ааасадсаса саЕссаЕЕса ЕсаЕддСдСд 1980 дЕддаддсЕд асдссдсЕдС сассссадад дадсдссасс ЕдЕссаадаЕ дсадсадаас 2040

ддсЕасдааа аессаассЕа саадЕЕсЕЕС дадсадаЕдс адаасЕад	2088
<210>	10
<211>	695
<212>	Белок
<213>	Человек {Ното	зархепз)
<400>	10

МеЕ Ьеи Рго <31 у Ьеи

А1а Ьеи

Ьеи Ьеи

Ьеи А1а А1а Тгр ТЫ А1а

Агд

1

5

10

15

А1а

Ьеи

С1и

Уа1

Рго

ТЫ

Азр

01у

Азп

А1а

С1у

Ьеи

А1а

С1и

Рго

20

25

30

С1П

Не

А1а

МеЕ

РЬе

Суз

С1у

Агд

Ьеи

Ляп

Мес

Ηίβ

МеЕ

Авп

Уа1

<31п

35

40

45

АЗП

С1у

Ьуз

Тгр

Азр

Зег

Азр

Рго

Зег

<Э1у

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Суз

Не

Азр

50

55

60

ТЬг

Ьуз

С1и

С1у

Не

Ьеи

С1п

Туг

Суз

С1п

<31и

νβΐ

Туг

Рго

С1и

Ьеи

65

70

75

80

С1п

Не

ТЬг

Азп

Уа1

<31и

А1а

Азп

<31п

Рго

Уа1

ТЫ

Не

61п

Азп

85

90

95

Тгр

Суз

Ьуз

Агд

С1у

Агд

Ьуз

С1п

Суз

Ьуз

ТЫ

ΗΪ3

Рго

Н1з

РЬе

Уа1

100

105

НО

Не

Рго

туг

Агд

Суз

Ьеи

νβΐ

С1у

С1и

РЬе

Уа1

Зег

Азр

А1а

Ьеи

115

120

125

Уа1

Рго

Азр

Ьуз

Суз

Ьуз

РЬе

Ьеи

Н15

С1п

С1и

Агд

МеЕ

Азр

ν«ι

Суз

130

135

140

(31и

ТЬг

ΗΪ8

Ьеи

Ηίβ

Тгр

Ηίβ

ТЫ

Уа1

А1а

Ьуз

О1и

ТЫ

Суз

Зег

С1и

145

150

155

160

Ьув

Зег

ТЬг

Азп Ьеи 165

Ηίβ Азр Туг С1у Мес Ьеи Ьеи Рго Суз О1у 11е

170

175

Аар

Ьув

РЬе

Агд

С1у

Уа1

С1и

РЬе

Уа1

Суз

Рго

Ьеи

А1а

С1и

180

185

190

Зег

Азр

Азп

Уа1

Азр

Зег

А1а

Азр

А1а

<31и

С1и

Азр

Зег

Азр

Уа1

195

200

205

Тгр

С1у

01у

А1а

Авр

ТЬг

Азр

Ту_Г

А1а

Азр

(31у

Зег

С1и

Азр

Ьуз

210

215

220

Уа1

С1и

Уа1

А1а

СЯи

С1и

Уа1

А1а

<31и

Уа1

С1и

225

230

235

240

С1и

А1а

Азр

Авр

Азр

(31и

Азр

Авр

О1и

Азр

С1у

Азр

С1и

Уа1

С1и

245

250

255

(31и

А1а

С1и

01и

Рго

Туг

<31и

С1и

А1а

ТЬг

С1и

Агд

ТЬг

Зег

Не

260

265

270

А1а

ТЬг

С1и

Зег

Уа1

С1и

Уа1

Агд

275

280

285

ν*1

Рго

ТЬг

А1а

Зег

ТЬг

Рго

Авр

А1а

ν<1

Азр

Ьуз

Туг

Ьеи

290

295

300

<31и

ТЬг

Рго

С1у

Азр

С1и

Азп

С1и

ΗΪ3

А1а

Н1з

РЬе

С1п

Ьуз

А1а

Ьуз

305

310

315

320

<31и

Агд

Ьеи

С1и

А1а

Ьуз

ΗΪ3

Агд

С1и

Агд

Мее

Зег

αΐη

Уа1

Мее

Агд

325

330

335

01и

Тгр

С1и

А1а

С1и

Агд

О1П

А1а

Ьуз

Азп

Ьеи

Рго

Ьу®

А1а

Азр

340

345

350

Ьув

Ьуз

А1а

νβΐ

Не

31п

ΗΪ3

РЬе

С1п

С1и

Ьуз

Уа1

С1и

Зег

Ьеи

С1и

355

360

365

01п

<31и

А1а

Азп

С1и

Агд

С1п

<31п

Ьеи

ν&1

С1и

ТЬг

ΗΪ3

мее

А1а

370

375

380

Агд

Уа1

С1и

А1а

Мее

Ьеи

Азп

Азр

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи

С1и

Азп

385

390

395

400

Туг

Не

ТЬг

А1а

Ьеи

<31п

А1а

Уа1

Рго

Агд

Рго

Агд

Ηίβ

Уа1

РЬе

405

410

415

- 45 009216

Азп МеС Ьеи Ьув Ьуз Туг Уа1 Агд А1а С1и С1п Ьуз Азр Агд С1п Нхз

420

425

430

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Нхз

РЬе

С1и

Нхз

Уа1

Агд

МеС

Уа1

Азр

Рго

Ьуз

А1а

435

440

445

А1а

С1п

Не

Агд

Бег

С1п

иа1

Мес

ТЬг

Нхз

Ьеи

Агд

Уа1

Не

Туг

С1и

450

455

460

Агд

МеС

АЗП

С1п

Бег

Ьеи

Бег

Ьеи

Туг

Азп

Уа1

Рго

А1а

Уа1

А1а

465

470

475

480

С1и

Не

С1п

Азр

С1и

Уа1

Азр

С1и

Ьеи

С1п

Ьуз

С1и

С1п

Азп

485

490

495

Туг

Бег

Азр

Авр

Уа1

Ьеи

А1а

Азп

МеС

11е

Бег

<31и

Рго

Агд

Не

Бег

500

505

510

Туг

С1у

Азп

Азр

А1а

Ьеи

Мес

Рго

Бег

Ьеи

ТЫ

О1и

ТЫ

Ьуз

ТЬг

ТЫ

515

520

525

νβΐ

01и

Ьеи

Рго

Уа1

Азп

С1у

01 и

РЬе

Бег

Ьеи

Азр

Ьеи

С1п

530

535

540

Рго

Тгр

Нхз

Бет

РЬе

(31у

А1а

Азр

Бег

Уа1

Рго

А1а

Азп

ТЫ

<Э1и

Азп

545

550

555

560

<31 и

Уа1

С1и

Рго

Уа1

Азр

А1а

Агд

Рго

А1а

Азр

Агд

С1у

Ьеи

ТЬг

565

570

575

ТЫ

Агд

Рго

01у

Бег

С1у

Ьеи

ТЬг

Азп

Не

Ьуз

ТЬг

С1и

Не

Бег

580

585

590

С1и

Уа1

Ьуз

Мес

Азр

А1а

С1и

РЬе

Агд

Нхз

Азр

Бег

С1у

Туг

С1и

Уа1

595

600

605

Нхз

С1п

Ьуз

Ьеи

Уа1

РЬе

А1а

<31и

Азр

Уа1

С1у

Бег

Азп

Ьуз

610

615

620

01у

А1а

Не

С1у

Ьеи

Мес

Уа1

(31у

С31у

νβΐ

Уа1

Не

А1а

ТЬг

νβΐ

625

630

635

640

Не

7а1

Не

ТЬг

Ьеи

νβΐ

Мес

Ьеи

Ьуз

61п

Туг

ТЫ

Бег

Не

645

650

655

ΗΪ5

Нхз

С1у

Уа1

С1и

Уа1

Азр

А1а

Уа1

ТЫ

Рго

С1и

61и

Агд

660 665 670

- 46 009216

ΗΪ5	Ьеи 5ег Ьуз МеЕ С1п 61п Азп С1у Туг С1и Азп Рго ТЫ Туг Ьуз
675	680	685
РЬе	РЬе (31и С1п МеС	С1п Азп
4	690	695

<210>	11
<211>	2088
<212>	ДНК
<213>	Человек (Ното зар±епз)
<400>	11

аЕдсЕдсссд дЕЕЕддсасЕ дсЕссЕдсЕд дссдссЕдда сддсЕсдддс дссддаддЕа 60 сссасЕдаЕд дЕааЕдсЕдд ссЕдсЕддсЕ даассссада ЕЕдссаЕдЕЕ сЕдЕддсада 120 сЕдаасаЕдс асаЕдааЕдЕ ссадааЕддд аадЕдддаСЕ садаЕссаЕс адддассааа 180 ассЕдсаЕЕд аСассаадда аддсаСссСд садЕаСЕдсс аадаадЕсЕа сссЕдаасЕд 240 садаЕсасса аЕдгддЕада адссаассаа ссадсдасса ЕссадаасЕд дСдсаадсдд 300 ддссдсаадс адСдсаадас ссаСссссас сссдсдассс ссЕассдсСд сссадссддс 360 дадСЕЕдЕаа дЕдаСдсссЕ ЕсЕсдЕЕссЕ дасаадЕдса ааСЕсЕЕаса ссаддададд 420 асддаЕдЕЕЕ дсдааасЕса ЕсЕЕсасЕдд сасассдгсд ссааададас аСдсадСдад 480 дададЕасса асЕЕдсаЕда сЕасддсаЕд ЕЕдссдсссЕ дсддааЕЕда саадсЕссда 540 ддддЕададС ЕЕдЕдЕдСЕд сссасЕддсЕ даадааадЕд асааЕдЕдда ЕЕсЕдсЕдаЕ 600 дсддаддадд аЕдасЕсдда ЕдЕсЕддСдд ддсддадсад асасадасЕа Едсадасддд 660 адЬдаадаса аадсадеада адСадсадад даддаадаад Еддссдаддс ддаадаадаа 720 даадесдаед аЕдасдадда сдасдаддас ддСдаСдадд Сададдаада ддсЕдаддаа 780 сссЕасдаад аадссасада дадаассасс адсаЕЕдсса ссассасоас сассассаса 840 дадСссдсдд аададдСддС СсдадССссС асаасадсад ссадСасссс СдаСдссдсс 900 дасаадбаСс Ссдадасасс ЕддддаСдад ааСдаасаСд сссаСССсеа дааадссааа 960 дададдсЕЕд аддссаадса ссдададада аСдСсссадд ЕсаЕдадада аедддаадад 1020 дсадаасдСс аадсааадаа сЕЕдссЕааа дсЕдаСаада аддсадСЕаЕ ссадсаЕЕЕС 1080 саддадааад СддааСсССС ддаасаддаа дсадссаасд ададасадса дсЕддСддад 1140 асасасаедд ссададсдда адссаЕдсес ааЕдассдсс дссдссЕддс ссЕддадаас 1200 ЕасаЕсассд сСсСдсаддс СдССссСссС сддссссдСс асдсдССсаа сасдссааад 1260 аадЕаЕдЕсс дсдсадааса дааддасада садсасассс СааадсаССС сдадсаСдСд 1320 сдсаЕддЕдд аСсссаадаа адссдсСсад аессддСссс аддСЕаЕдас асассЕссдЕ 1380 дСдаСссасд адсдсасдаа СсадСсСсСс СсссСдсСсС асаасдСдсс СдсадСддсс 1440 даддадаЕЕс аддаЕдаадЕ сдасдадссд сЕЕсадааад адсаааасСа ЕЕсадаЕдас 1500 дСсЕЕддсса асаЕдаСЕад Едаассаадд аЕсадЕЕасд дааасдаЕдс ЕсЕсаЕдсеа 1560 ЕсЕЕЕдассд ааасдаааас сассдЕддад сЕссЕЕсссд ЕдааСддада дЕЕсадссЕд 1620 дасдаЕсСсс адесдеддса ЕЕсЕЕЕЕддд дсЕдасЕсЕд Едссадссаа сасадаааас 1680 даадЕЕдадс сЕдСЕдаедс ссдсссЕдсЕ дссдассдад даседассас ЕсдассаддЕ 1740 ЕссдддЕЕда саааЕассаа даеддаддад аСсСседаад СдааСсСдда сдсадааССс 1800 сдасаЕдасс саддасаеда адЕЕсаЕсаЕ саааааЕЪдд сдЕЕсЕЕЕдс адаадасдЕд 1860 ддЕСсаааса ааддЕдсааС саЕСддасСс аеддЕдддед дсдссдсеас адсдасадЕд 1920 аЕсдЕсаЕса ссЕЕддЕдаЕ дсЕдаадаад ааасадсаса саЕссаСЕса ЕсаЕддЕдЕд 1980 дЕддаддСЕд асдссдсСдС сассссадад дадедссасс ЕдСссаадаЕ дсадсадаас 2040 ддсЕасдааа аЕссаассЕа саадСЕсССС дадсадаЕде адаасЕад 2088

- 47 009216 <210> 12 <211> 695 <212> Белок <213> Человек (Ното аарл-Впе) <400> 12

МеЕ Ьеи Рго С1у Ьеи А1а Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи А1а А1а Тгр ТЬг А1а

Агд

1

5

10

15

А1а

Ьеи

01 и

Уа1 20

РГО

ТЫ

Азр

С1у

Азп 25

А1а

С1у

Ьеи

А1а 30

01 и

Рго

С1п

11е

А1а 35

МеЕ

РЬе

Сув

О1у

Агд 40

Ьеи

Азп

МеЕ

Ηΐε

МеЕ 45

АЗП

Уа1

С1п

Азп

С1у 50

Ьуз

Тгр

Азр

Зег

А5Р 55

Рго

Зет

<Э1у

ТЫ

Ьуз 60

ты

Суз

Не

Азр

ТЫ 65

Ьуз

С1и

51у

Не

Ьеи 70

С1п

Туг

Суз

01п

С1и 75

νβΐ

Тут

Рго

С1и

Ьеи 80

01 η

Не

ТЬг

Азп

νβΐ 85

Уа1

С1и

А1а

Азп

<31п 90

Рго

νβΐ

ТЫ

Не

С1п 95

Азп

Тгр

Суз

Ьуз

Агд С1у 100

Агд

Ьуз

С1п

Суз 105

Ьув

ты

Ηίβ

Рго

Ηίβ но

РЬе

Уа1

Не

РГО

Туг 115

Агд

Суз

Ьеи

ν»1

б1у 120

61и

РЬе

Уа1

Зег

АЗр 125

А1а

Ьеи

ν«ι

Рго 130

Азр

Ьуз

Суз

Ьуз

РЬе 135

Ьеи

ΗΪ5

С1п

С1и

Агд 140

МеЕ

Азр

Уа1

Суз

<31 и 145

ТЫ

Н1з

Ьеи

ΗΪ3

Тгр 150

Н13

ТЬг

Уа1

А1а

Ьуз 155

(31и

ТЫ

Сув

Зег

С1и 160

Ьуз

Зег

ТЬг

Азп

Ьеи 165

ΗΪ3

Азр

Туг

<31у

МеЕ 170

Ьеи

Рго

Суз

С1у 175

Не

Азр

Ьуз

РЬе

Агд 180

(31у

Уа1

<31и

РЬе

Уа1 185

Суз

Рго

Ьеи

А1а 190

С1и

5ег

Азр

Азп 195

ν»ι

Азр

Зег

А1а

Азр 200

А1а

С1и

Азр

Азр 205

Зег

Азр

νβΐ

Тгр

Тгр 210

С1у

А1а

Азр

ТЫ 215

Азр

Туг

А1а

Азр

С1У 220

Зег

О1и

Азр

Ьуз

- 48 009216

Уа1 Уа1 С1и 225

Уа1

А1а С1и О1и С1и <31 и Уа1 А1а

С1и

ν·ι

<31и <31и

С1и 240

230

235

О1и

А1а

Азр

С1и

Азр

С1и

Азр

С1у

Авр

С1и

Уа1

С1и

(Пи

245

250

255

С1ц

А1а

С1и

Рго

Туг

С1и

<31и

А1а

ТЬг

<31 и

Агд

ТЬг

5ег

Не

260

265

270

А1а

ТЬг

С1и

5ег

Уа1

<31 и

С1и

Уа1

Агд

275

280

285

ν&ι

Рго

ТЬг

А1а

5ег

ТЬг

Рго

Азр

А1а

Уа1

Авр

Буа

Туг

Беи

290

295

300

С1и

ТЬг

Рго

С1у

Азр

С1и

Азп

<31 и

Ηίβ

А1а

Ηίβ

РЬе

С1п

Буз

А1а

Буз

305

310

315

320

С1и

Агд

Беи

С1и

А1а

Буз

Ηίβ

Агд

С1и

Агд

МеЪ

5ег

С1п

Уа1

Меъ.

Агд

325

330

335

С1и

Тгр

С1и

01и

А1а

С1и

Агд

С1п

А1а

Був

Азп

Беи

Рго

Був

А1а

Авр

340

345

350

Буз

Буе

А1а

Уа1

Не

01п

Ηίβ

РЬе

С1п

С1и

Буз

Уа1

С1и

£ег

Беи

С1и

355

360

365

С1п

С1и

А1а

Азп

<31и

Агд

01»

61п

Беи

Уа1

<31 и

ТЬг

ΗΪ3

Мес

А1а

370

375

380

Агд

Уа1

(31и

А1а

МеЪ

Беи

АЗП

Азр Агд

Агд

Беи

А1а

Беи

<31и

Азп

385

390

395

400

Туг

Не

ТЬг

А1а

Беи

С1п

А1а

Уа1

Рго

Агд

Рго

Агд

Ηίβ

Уа1

РЬе

405

410

415

Аап

МеЪ

Беи

Буз

Туг

Уа1

Агд

А1а

С1и

С1п

Буз

Азр

Агд

(31п

Ηίβ

420

425

430

ТЬг

Беи.

Буз

Ηίβ

РЬе

С1и

Ηίβ

Уа1

Агд

Меъ

Уа1

Азр

РГО

Буз

А1а

435

440

445

А1а

ΰΐη

Не

Агд

5ег

С1п

Уа1

Меь

ТЬг

Ηίβ

Беи

Агд

Уа1

11е

Туг

01и

450

455

460

Агд

МеЪ

Азп

01п

Бег

Беи

5ег

Беи

Туг

Азп

Уа1

Рго

А1а

Уа1

А1а

465 470 475 480

- 49 009216

С1и С1и

Не

С1п Азр 485

<31 и Уа1 Азр С1и Ьеи Ьеи С1п Ьуз С1и С1п Азп

490

495

Туг

Зег

Азр

Уа1

Ьеи

А1а

АЗП

МеС

Не

Зет

С1и

Рго

Агд

Не

Зег

*

500

505

510

Туг

С1у

Азп

Азр

А1а

Ьеи

Мес

Рго

Бег

Ьеи

ТЬг

61и

ТЬг

Ьуз

ТЬг

515

520

525

Ча1

С1и

Ьеи

Рго

Уа1

Азп

С1у

61и

РЬе

Зег

Ьеи

Азр

Ьеи

01п

530

535

540

Рго

Тгр

Ηίβ

Зег

РЬе

С1у

А1а

Азр

Бег

Ча1

Рго

А1а

Азп

ТЬг

С1и

Азп

545

550

555

560

С1и

Уа1

С1и

Рго

Уа1

Азр

А 1а

Агд

Рго

А1а

Азр

Агд

С1у

Ьеи

ТЬг

565

570

575

ТЬг

Агд

Рго

С1у

Бег

О1у

Ьеи

ТЬг

Азп

Не

Ьуз

ТЬг

С1и

61и

Не

Зег

580

585

590

С1и

Уа1

Азп

Ьеи

АЗр

А1а

61 и

РЬе

Агд

ΗΪ3

АЗр

Зег

С1у

Туг

С1и

Ча1

595

600

605

Н1з

Ηίβ

(31п

Ьуз

Ьеи

Уа1

РЬе

А1а

С1и

Азр

Ча1

<31у

Зег

Азп

Ьуз

610

615

620

С1у

А1а

11е

Не

С1у

Ьеи

мес

Ча1

С1у О1у

Ча1

Не

А1а

ТЬг

ν«1

625

630

635

640

Не

Уа1

Не

ТЬг

Ьеи

УаХ

МеС

Ьеи

Ьуз

<31п

Туг

ТЬг

Зег

Не

645

650

655

Ηίβ

Ηίε

<31у

Уа1

С1и

Ча!

Азр

А1а

Ча1

ТЬг

Рго

01и

<31и

Агд

660

665

670

Ηίβ

Ьеи

Зег

Ьуз

Мес

С1п

61п

Азп

<31у

Туг

61и

АЗП

Рго

ТЬг

Туг

ьуз

675

680

685

РЬе РЬе С1и 61п МеС С1п Азп

690 695 <210> 13 <211> 2088 <212> ДНК <213> Человек (Ново зар1епз)

- 50 009216 <400> 13

аЕдсЕдссед дййЕддсасй дсйссйдсйд дссдссйдда сддсЕсдддс дсЕддаддЕа 60
сссасйдайд	дйаайдсйдд	ссйдсйддсс	даассссада	ЕйдссайдЕй	сйдйддсада	120
сЕдаасасдс	асаЕдааЕдЕ	ссадаайддд	аадЕдддайй	садайссайс	адддассааа	180
ассЕдсаЕЕд	айассаадда	аддсайссйд	садЕаййдсс	аадаадйсйа	сссйдаасйд	240
садайсасса	айдйддйада	адссаассаа	ссадйдасса	ЕссадаасЕд	дйдсаадсдд	300
ддссдсаадс	адйдсаадас	ссайссссас	ййЕдйдаййс	СсЕассдсЕд	сййадййддй	360
дадйййдйаа	дЕдаЕдсссЕ	ЕсйсдЕйссй	дасаадйдса	ааЕЕОЕЕаСа	ссаддададд	420
айддайдййй	дсдааасЕса	йсййсасйдд	сасассдйсд	ссааададас	айдсадйдад	480
аададйасса	асЕЕдсаЕда	ссасддсайд	ййдсйдсссй	дсддаайЕда	саадйЕссда	540
ддддйададС	ййдЕдсдййд	сссасЕддсЕ	даадааадйд	асаайдйдда	ййсйдсйдай	600
деддаддадд	айдасйсдда	йдЕсйддйдд	ддсддадсад	асасадасйа	йдсадайддд	660
адйдаадаса	аадЕадСада	адЕадсадад	даддаадаад	ЕддсЕдаддЕ	ддаадаадаа	720
даадссдайд	айдасдадда	сдайдаддай	ддйдайдадд	Еададдаада	ддсйдаддаа	780
сссЕасдаад	аадссасада	дадаассасс	адсаййдсса	есассассас	сассассаса	840
дадЕсЕдЕдд	аададдйддЕ	йсдадййссй	асаасадсад	ссадЕасссс	йдайдссдйй	900
дасаадЕаЕс	Есдадасасс	Еддддайдад	аайдаасайд	сссаЕЕЕсса	дааадссааа	960
дададдсЕЕд	аддссаадса	ссдададада	айдйсссадд	ЕсаЕдадада	айдддаадад	1020
дсадаасдЕс	аадсааадаа	сЕйдссйааа	дсйдайаада	аддсадйЕаЕ	ссадсайййс	1080
саддадааад	ЕддааЕсЕЕЕ	ддаасаддаа	дсадссаасд	ададасадса	дсйддйддад	1140
асасасаЕдд	ссададйдда	адссайдсйс	аайдассдсс	дссдссЕддс	ссйддадаас	1200
ЕасаЕсассд	СЕсЕдсаддс	ЕдЕЕссЕссй	сддссйсдйс	асдйдЕЕсаа	йайдсйааад	1260
аадйайдйсс	дсдсадааса	дааддасада	садсасассс	ЕааадсаЕЕЕ	сдадсайдйд	1320
сдсаЕддЕдд	айсссаадаа	адссдсЕсад	аЕссддЕссс	аддЕЕаЕдас	асассйседй	1380
дЕдаЕЕЕаЕд	адсдсайдаа	йсадйсйсйс	йсссйдсйсй	асаасдйдсс	йдсадйддсс	1440
даддадаййс	аддайдаадй	йдайдадсйд	сййсадааад	адсаааасйа	ййсадайдас	1500
дЕсЕЕддсса	асайдаЕйад	Едаассаадд	айсадййасд	дааасдайдс	йсйсайдсса	1560
йсйййдассд	ааасдаааас	сассдйддад	сйссййсссд	йдаайддада	дййсадссйд	1620
дасдаЕсЕсс	адссдйддса	ЕЕсЕЕЕЕддд	дсйдасссйд	Едссадссаа	сасадаааас	1680
даадЕйдадс	ейдййдайдс	ссдсссйдсй	дссдаесдад	дасЕдассас	йсдассаддй	1740
йсйдддййда	сааайайсаа	дасддаддад	айсйсйдаад	Едаадайдда	йдсадааййс	1800
сдасаЕдасЕ	саддайайда	адЕЕсайсай	саааааЕйдд	ЕдййсЕйЕдс	адаадайдйд	1860
ддЕЕсаааса	ааддйдсаай	саййддасйс	айддйдддсд	дЕдййдйсаЕ	адсдасадйд	1920
айсйссайса	ссйЕддЕдаЕ	дсЕдаадаад	ааасадЕаса	саЕссаЕЕса	Есайддйдйд	1980
дйддаддЕЕд	асдссдсйдй	сасессадад	дадсдссасс	ЕдЕссаадай	дсадсадаас	2040
ддсйасдааа	айссаассйа	саадЕБсЕЕЕ	дадсадайдс	адаасйад		2088
<210> 14
<211> 695
<212> Белок
<213> Человек (Ното	аархепз)

<400* 14

МеЕ Ьеи Рго <51у Ьеи А1а Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи А1а А1а Тгр ТЬг А1а Агд 15 10 15

А1а Ьеи С1и Уа1 Рго Пит Аар С1у Аап А1а 01у Ьеи Ьеи А1а С1и Рго

- 51 009216

25 30

61п Не

А1а МеЕ РЬе Суз С1у Агд Ьеи Азп МеЕ Н1з МеЕ Азп Уа1 С1п

35

40

45

Азп

61у

Ьуз

Тгр

Азр

2ег

Азр

Рго

Бег

61у

ТЬг

Ьув

ТЬг

Суз

11е

Азр

50

55

60

ТЬг

Ьуз

61и

С1у

Не

Ьеи

61п

Туг

Суз

С1п

С1и

ν*1

Туг

рго

С1и

Ьеи

65

70

75

80

61п

11е

ТЬГ

Азп

Уа1

61и

А1а

Авп

61п

Рго

Уа1

ТЬг

11е

С1п

Азп

85

90

95

Тгр

Суз

Ьуз

Агд

61у

Агд

Ьуз

С1п

Суз

Ьуз

ТЬг

Ηίε

Рго

ΗΪ8

РЬе

Уа1

100

105

но

Не

Рго

Туг

Агд

Суз

Ьеи

Уа1

61у

61и

РЬе

Уа1

Бег

АЗр

А1а

Ьеи

115

120

125

Уа1

Рго

Азр

Ьув

Суз

Ьуз

РЬе

Ьеи

ΗΪ5

(31п

(31и

Агд

МеЕ

Азр

Уа1

Суз

130

135

140

С1и

ТЬг

Н1з

Ьеи

ΗΪ3

Тгр

Нхз

ТЬг

Уа1

А1а

Ьуз

С1и

ТЬг

Суз

Бег

(31 и

145

150

155

160

Ьув

Зег

ТЬг

Азп

Ьеи

ΗΪ3

Азр

Тух

С1у

МеЕ

Ьеи

Рго

Суз

61у

11е

165

170

175

Азр

Ьуз

РЬе

Агд

С1у

Уа1

С1и

РЬе

Уа1

Суз

Рго

Ьеи

А1а

61и

180

185

190

5ег

Азр

Азп

Уа1

Азр

Бег

А1а

Азр

А1а

С1и

Азр

Бег

Азр

Уа1

195

200

205

Тгр

С1у 61у

А1а

Азр

ТЬг

Азр

Туг

А1а

Азр

61у

Бег

61и

Азр

Ьуз

210

215

220

Уа1

С1и

Уа1

А1а

<31 и

61и

С1и

Уа1

А1а

61и

Уа1

<31 и

<31и

61и

225

230

235

240

С1и

А1а

Азр

(31и

Азр

С1и

Азр

61у

Азр

61ц

Уа1

61и

С1и

245

250

255

61ц

А 1а

С1и

61и

Рго

Тут

6111

61и

А1а

ТЬг

С1и

Агд

ТЬг

Зег

11е

260

265

270

А1а

ТЬг

С1и

Бег

Уа1

61и

С1и

Уа1

Агд

- 52 009216

275

280

285

УаХ

Рго

ты

ТЬг

А1а

Зег

ТЫ

Рго

Азр

АХа

Уа1

Азр

Ьуз

Туг

Ьеи

290

295

300

ТЫ

Рго

С1у

Азр

ОХи

АЗП

ОХи

Ηίβ

А1а

Нхз

РЬе

<31п

Ьуз

А1а

ьуз

305

310

3X5

320

С1и

Агд

Ьеи

С1и

АХа

Ьуз

Ηίβ

Агд

О1и

Агд

МеЕ

Зег

С1п

УаХ

МеЕ

Агд

325

330

335

С1и

Тгр

СХи

АХа

С1и

Агд

С1П

А1а

Ьуз

Азп

Ьеи

Рго

Ьуз

А1а

Азр

340

345

350

Ьуз

А1а

Уа1

11е

С1п

Ηίβ

РЬе

С1п

С1и

Ьуз

Уа1

ОХи

Бег

Ьеи

01и

355

360

365

С1п

СХи

АХа

А1а

Азл

С1и

Агд

ОХп

С1п

Ьеи

УаХ

С1и

ТЫ

ΗΪ3

МеЕ

А1а

370

375

380

Агд

Уа1

СХи

А1а

МеЕ

Ьеи

АЗП

Азр

Агд

Ьеи

АХа

Ьеи

СХи

Азп

385

390

395

400

Туг

Не

ТЬг

А1а

Ьеи

С1п

А1а

Уа1

Рго

Агд

Рго

Агд

Ηίβ

Уа1

РЬе

405

410

415

Азп

МеЕ

Ьеи

Ьуз

Туг

УаХ

Агд

АХа

С1и

СХп

Ьуз

Азр

Агд

СХп

Ηίβ

420

425

430

ТЬг

Ьеи

Ьуз

НХз

РЬе

С1и

Нхз

УаХ

Агд

МеЕ

Уа1

Азр

Рго

Ьуз

А1а

435

440

445

А1а

СХп

Не

Агд

Зег

С1п

Уа1

МеЕ

ТЫ

Ηίβ

Ьеи

Агд

Уа1

1Хе

туг

СХи

450

455

460

Агд

МеЕ

Азп

С1п

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Туг

Азп

Уа1

Рго

А1а

УаХ

А1а

465

470

475

480

СХи

С1и

Не

С1п

Азр

СХи

Уа1

Азр

С1и

Ьеи

С1п

Ьуз

С1и

С1п

Азп

485

490

495

Туг

Зег

Азр

УаХ

Ьеи

А1а

Азп

МеЕ

Не

Зег

С1и

Рго

Агд

Не

5ег

500

505

510

Туг

С1у

Азп

Азр

А1а

Ьеи

МеЕ

Рго

Зег

Ьеи

ТЫ

О1и

ТЬг

Ьуз

ТЫ

515

520

525

УаХ

С1и

Ьеи

Рго

Уа1

Азп

О1у

ОХи

РЬе

Зег

Ьеи

Азр

Ьеи

С1п

- 53 009216

	530					535
Рго 545	Тгр	ΗΪ3	Зег	РЬе	С1у 550	А1а	Авр
С1и	Уа1	С1и	Рго	Уа1 565	Азр	А1а	Агд
ТЫ	Агд	Рго	О1у 580	Зег	О1у	Ьеи	ТЬг
О1и	νβΐ	Ьув 595	мее	Азр	А1а	С1и	РЬе 600
Н1з	Ηϊε 610	С1п	Ьув	Ьеи	Уа1	РЬе 615	РЬе
С1у 625	А1а	Не	Не	61у	Ьеи 630	МеС	Уа1
Не	РЬе	Не	ТЬг	Ьеи 645	Уа1	мес	Ьеи
Ηϊβ	ΗΪ5	С1у	Уа1 660	Уа1	С1и	ν«1	Азр
Нхз	Ьеи	Зег 675	Ьуз	Мее	С1п	С1п	Азп 680
РЬе	РЬе 690	С1и	С1п	МеС	<31п	Азп 695
<210> 15 <211> 2094 <212> ДНК <213> Человек	(Ногао зархепз)

<400> 15

540

Зег	Уа1	Рго 555	А1а	АЗП	ТЬг	(31и	Азп 560
Рго	А1а 570	А1а	Азр	Агд	О1у	Ьеи 575	ТЬг
Азп 585	Не	Ьуз	ТЬг	С1и	С1и 590	11е	Зег
Агд	ΗΪ3	Азр	Зег	С1у 605	Туг	<31и	Уа1
А1а	С1и	Азр	Уа1 620	С1у	Зег	Азп	Ьуз
<31у	С1у	Уа1 635	V»!	Не	А1а	ТЫ	Уа1 640
Ьуз	Ьуз 650	Ьуз	С1п	Туг	ТЬг	Зег 655	Не
А1а 665	А1а	Уа1	ТЫ	Рго	С1и 670	С1и	Агд
01у	Туг	С1и	Азп	Рго 685	ТЫ	Туг	Ьуз

асдссдсссд дсссддсасс дсСссСдсСд дссдсссдда сддсСсдддс десддаддса 60 сссасСдаСд дСааСдсСдд ссСдсСддсС даассссада ССдссаСдСС сСдСддсада 120 ссдаасаСдс асасдаасдс ссадаасддд аадСдддаСС садасесаСс адддассааа 180 ассСдсаССд аСассаадда аддсаСссСд садСасСдсс аадаадСсСа сссОдаассд 240 садассасса аСдСддСада адссаассаа ссадсдасса сссадаасСд дсдсаадсдд 300 ддссдсаадс адСдсаадас ссаСссссас СССдСдаССс ссСассдсСд оссадссддс 360 дадСССдСаа дСдаСдсссС СсСсдсСссС дасаадСдса аассессаеа ссаддададд 420 аСддаСдсСС дсдааасСса СсССсасСдд сасассдСсд ссааададас аЬдсадсдад 480 аададсасеа асССдсаСда ссасддсасд ссдссдсссс дсддаассда саадссосда 540

- 54 009216 ддддСададС ЕЕдЕдЕдЕЕд сссасСддсЕ даадааадЕд асааСдЕдда ССсЕдсЕдаЕ 600 дсддаддадд аЕдасЕсдда ЕдЕсЕддЕдд ддсддадсад асасадасЕа ЕдсадаЕддд 660 адгдаадаса аадсадЕада адсадсадад даддаадаад ЕддсЕдаддс ддаадаадаа 720 даадссдаЕд асдасдадда сдаЕдаддас ддЕдаЕдадд Сададдаада ддсЕдаддаа 780 сссЕасдаад аадссасада дадаассасс адсаЕЕдсса ссассассас сассассаса 840 дадгссдсдд аададдЕддс ЕсдадЕЕссс асаасадсад ссадсасссс ЕдасдссдЕЕ 900 дасаадЕаЕс есдадасасс ЕддддаЕдад аасдаасаЕд сссаЕЕСсса дааадссааа 960 дададдсЕЕд аддссаадса ссдададада аЕдЕсссадд ЕсаЕдадада асдддаадад 1020 дсадаасдЕс аадсааадаа сЕЕдссЕааа дсЕдаЕаада аддсадЕЕаЕ ссадсаЕЕЕс 1080 саддадааад ЕддааЕсЕЕЕ ддаасаддаа дсадссаасд ададасадса дсЕддЕддад 1140 асасасаЕдд ссададЕдда адссаЕдсЕс ааЕдассдсс дссдссЕддс ссЕддадаас 1200 ЕасаЕсассд сЕсЕдсаддс ЕдЕЕссЕссЕ сддссЕСдЕс асдЕдЕЕсаа ЕаЕдсЕааад 1260 аадЕаЕдЕсс дсдсадааса дааддасада садсасаесс ЕааадсаЕЕЕ сдадсаЕдЕд 1320 сдсаЕддЕдд ассссаадаа адссдсЕсад аЕссддЕссс аддЕЕаЕдас асассЕссдЕ 1380 дЕдаЕСЕаЕд адсдсаЕдаа ЕсадЕсЕсЕс ЕсссЕдсЕсЕ асаасдЕдсс ЕдсадЕддсс 1440 даддадаЕЕс аддаЕдаадЕ ЕдаЕдадсЕд сЕЕсадааад адсаааасЕа ЕЕсадаЕдас 1500 дЕсЕЕддсса асасдаЕЕад Едаассаадд аСсадЕЕасд дааасдаЕдс ЕоЕсаЕдсса 1560 ЕсЕЕЕдассд ааасдаааас сассдЕддад сЕссЕЕсссд ЕдааЕддада дЕЕсадссЕд 1620 дасдаЕсЕсс адссдсддса ЕЕСЕЕЕЕддд дсЕдасЕсЕд Едссадссаа еасадаааас 1680 даадЕЕдадс сЕдЕЕдаЕдс ссдсссЕдсЕ дссдассдад дасЕдассас ЕсдассаддЕ 1740 ЕсЕдддССда саааЕаЕсаа дасддаддад аЕсСесдаад ЕдаадаЕдда ЕдсадааЕЕс 1800 сдасаЕдасЕ саддаЕаЕда адсесаЕсаЕ саааааЕЕдд ЕдЕЕсЕЕЕдс адаадаЕдЕд 1860 ддЕЕсаааса ааддЕдсааЕ СаЕЕддйСЕс аЕддЕдддсд дЕдЕЕдЕсаЕ адсдасадЕд 1920 аЕсдЕсаЕса ссЕЕддЕдаЕ дсЕдаадаад ааасадЕаса саЕссаЕЕса СсаЕддЕдЕд 1980 дЕддаддЕЕд асдссдсЕдЕ сассссадад дадсдссасс ЕдЕссаадаЕ дсадсадаас 2040 ддсЕасдааа аЕссаассЕа саадЕЕсЕЕЕ дадсадаЕдс адаасаадаа дЕад 2094 <210> 16 <211> 697 <212> Белок <213> Человек (Ното зардепз) <400> 16

МеЕ 1

Ьеи

Рго <31у Ьеи А1а Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи А1а А1а Тгр ТЬг А1а Агд

5

10

15

А1а

Ьеи

С1и

Уа1 20

Рго

ТЬг

Азр С1у

Азп 25

А1а

С1у

Ьеи

А1а 30

С1и

Рго

С1п

11е

А1а 35

Мес

РЬе

Сув

С1у Агд 40

Ьеи

Азп

МеЕ

Н1з

МеЕ 45

Азп

Уа1

С1п

Азп

(Пу 50

Ьуз

Тгр

Авр

Зег

Азр Рго 55

Зег

С1у

ТЬг

Ьуз 60

ТЬг

Суз

11е

Азр

ТЬг

Ьуз

С1и

(31у

11е

Ьеи

О1П Туг

Суз

©1П

С1и

Ча1

Тут

Рго

С1и

Ьеи

70 75 80

- 55 009216

01η 11е ТЬг Азп ν«1 85

Уа1

01и

А1а Азп

С1п Рго Уа1 ТЬг 11е С1п Азп

90

95

Тгр

Суз

Ьуз

Агд 100

С1у

Агд

Ьуз

С1п

Суз 105

Ьуз

ТЬг

Нхз

Рго

Н15 но

РЬе

Уа1

Не

Рго

Туг 115

Агд

Суз

Ьеи

νβΐ

С1у 120

С1и

РЬе

Уа1

Бег

Азр 125

А1а

Ьеи

Уа1

Рго 130

Азр

Ьуз

Суз

Ьуз

РЬе 135

Ьеи

ΚΪ3

С1п

С1и

Агд 140

МеС

Азр

Уа1

С1и 145

ТЬг

Н13

Ьеи

Н1з

Тгр 150

Н13

ТЬг

νβΐ

А1а

Ьуз 155

<31и

ТЬг

Суз

Бег

С1и 160

Ьуз

Зег

ТЬг

Азп

Ьеи 165

Ηίβ

Азр

Туг

С1у

МеС 170

Ьеи

Рго

Суз

С1у 175

Х1е

Азр

Ьуз

РЬе

Агд 180

С1у

Уа1

<31и

РЬе

Уа1 185

Суз

Рго

Ьеи

А1а 190

<31и

С1и

Бег

Азр

Азп 195

νβΐ

Азр

Бег

А1а

Азр 200

А1а

С1и

01и

Азр

Азр 205

Бег

Азр

Уа1

Тгр

Тгр 210

<31у

(31у

А1а

Азр

ТЬг 215

Азр

ТУГ

А1а

Азр

С1у 220

Бег

С1и

Азр

ьуз

Уа1 225

Уа1

С1и

Уа1

А1а

С1и 230

Э1и

С1и

<31 и

Уа1

А1а 235

01и

Уа1

С1и

61и

<31и 240

С1и

А1а

Азр

Азр 245

С1и

Азр

С1и

Азр 250

С1у

Азр

С1и

ν«ι

С1и 255

С1и

А1а

С1и

С1и 260

Рго

Туг

<31и

О1и

А1а 265

ТЬг

С1и

Агд

ТЬг

ТЬг 270

Бег

Не

А1а

ТЬг

ТЬг 275

ТЬг

ТЬг 280

О1и

Бег

Уа1

О1и

С1и 285

Уа1

Агд

Уа1

Рго 290

ТЬг

А1а

Бег 295

ТЬг

Рго

Авр

А1а

ν«ι 300

Авр

Ьув

Туг

Ьеи

С1и 305

ТЬг

Рго

С1у

Азр

С1и 310

Азп

<31и

ΗΪ8

А1а

Нхз 315

РЬе

С1п

Ьуз

А1а

Ьуз 320

С1и

Агд

Ьеи

С1и

А1а

Ьуз

Н1з

Ахд

С1и

Агд

мес

Бег

С1п

Уа1

МеС

Агд

325 330 335

- 56 009216

С1и Тгр 61 и С1и А1а С1и Агд С1п А1а Ьуз Азп Ьеи Рго Ьуз А1а Аер

340

345

350

Ьуз

ьуз

А1а

Уа1

11е

61п

Ηίβ

РЬе

С1п

С1и

Ьуз

Уа1

С1и

Зег

Ьеи

(31и

355

360

365

С1п

С1и

А1а

Азп

<31и

Агд

С1п

Ьеи

ν«ι

С1и

ТЬг

ΗΪ5

Мес

А1а

370

375

380

Агд

νβΐ

<31и

А1а

МеС

Ьеи

Азп

Азр

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи

(31и

Азп

385

390

395

400

Туг

11е

ТЬг

А1а

Ьеи

С1п

А1а

Уа1

Рго

Агд

Рго

Агд

ΗΪ3

νβΐ

РЬе

405

410

415

Азп

МеС

Ьеи

Ьуз

Ьуе

Туг

Уа1

Агд

А1а

<31и

51п

Ьуз

Азр

Агд

(31п

Ηίβ

420

425

430

ТЬг

Ьеи

Ьуз

ΗΪ5

РЬе

С1и

ΗΪ3

Уа1

Агд

Мес

Уа1

Азр

Рго

Ьуз

А1а

435

440

445

А1а

С1п

11е

Агд

Зег

С1п

νβΐ

МеС

ТЬг

ΗΪ8

Ьеи

Агд

¥а1

11е

Туг

О1и

450

455

460

Агд

МеС

Азп

61п

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Туг

Азп

Уа1

Рго

А1а

Уа1

А1а

465

470

475

480

С1и

11е

С1п

Азр

61и

Уа1

Азр

(31и

Ьеи

С1п

Ьуз

С1и

С1п

Азп

485

490

495

Туг

Зег

Азр

ν&ι

Ьеи

А1а

Азп

МеС

11е

Зег

С1и

Рго

Агд

Не

Зег

500

505

510

Туг

(31у

Азп

Азр

А1а

Ьеи

Мес

Рго

Зег

Ьеи

ТЬг

С1и

ТЬг

Ьу5

ТЬг

515

520

525

Уа1

61и

Ьеи

Рго

Уа1

Азп

С1у

С1и

РЬе

Зег

Ьеи

Азр

Ьеи

σΐη

530

535

540

Рго

Тгр

Нхз

Зег

РЬе

01у

А1а

Азр

Зег

Уа1

Рго

А1а

Азп

ТЬг

61и

Азп

545

550

555

560

С1и

νβΐ

С1и

Рго

Уа1

Азр

А1а

Агд

Рго

А1а

Азр

Агд

б1у

Ьеи

ТЬг

565

570

575

ТЬг

Агд

Рго

С1у

Зег

С1у

Ьеи

ТЬг

Азп

11е

Ьуз

ТЬг

С1и

11е

Зег

580 585 590

- 57 009216

С1и

Уа1 Ьуз МеС Азр А1а 595

С1и

РЬе Агд Н1з Азр Зег О1у Туг С1и Уа1

600

605

Н1з

С1п

Ьуз

Ьеи

Уа1

РЬе

А1а

О1и

Азр

Ча1

<31у

Зег

Азп

Ьуз

610

615

620

С1у

А1а

11е

О1у

Ьеи

Мес

Уа1

01 у <31у

Уа1

νβΐ

11е

А1а

ТЬг

Ча1

625

630

635

640

11е

Уа1

11е

ТЬг

Ьеи

Ча1

МеС

Ьеи

Ьуз

О1п

Туг

ТЬг

Зег

11е

645

650

655

ΗΪ5

Ηίβ

<31у

Уа1

01«

Уа1

Азр

А1а

Уа1

ТЬг

Рго

О1и

С1и

Агд

660

665

670

ΗΪ2

Ьеи

Зег

Ьуз

Мес

С1п

<31 η

Азп

С1у

Туг

С1и

АЗП

Рго

ТЬг

Туг

Ьуз

675

680

685

РЬе

С1и

О1п

МеС

О1п

Азп

Ьуз

690

695

<210> 17 <211> 2094 <212> ДНК <213> Человек (Ното зархепз) <400>

асдсСдсссд сссасСдаСд сСдаасаСдс асссдсассд садассасса ддссдсаадс дадСССдСаа аСддаСдССС аададсасса ддддСададС дсддаддадд адСдаадаса даадссдаСд сссСасдаад дадсссдсдд дасаадСаСс дададдсССд дсадаасдСс саддадааад асасасасдд дСССддсасС дСааСдсСдд асаСдаасдс аСассаадда аСдСддсада адСдсаадас дСдаСдсссС дсдааассса асССдсаСда ССдСдСдССд асдасСсдда аадСадСада аСдасдадда аадссасада аададдсддс Ссдадасасс дсСссСдсСд ссСдсСддсС ссадааСддд аддсаСссСд аддссаадса аадсааадаа сддааСсССС ссададСдда адссаассаа ссаСссссас СсСсдССссС СсССсасСдд сСасддсаСд сссасСддсс СдСсСддСдд адСадсадад сдаСдаддаС дадаассасс ссдадссссе СддддаСдад ссдададада сссдсссааа ддаасаддаа адссасдссс дссдссСдда даассссада аадСдддаСС садСаССдсс ссадСдасса СССдСдаССс дасаадсдса сасассдСсд ССдсСдсссС даадааадСд ддсддадсад даддаадаад ддСдаСдадд адсаССдсса асаасадсад ааСдаасаСд аСдСсссадд дссдаСаада дсадссаасд ааСдассдсс сддсссдддс ссдссасдсс садаСссасс аадаадссса СссадаасСд ссСассдсСд ааССсССаса ссааададас дсддааССда асаасдсдда асасадасса СддсСдаддС Сададдаада ссассассас ссадСасссс сссаСССсса

СсаСдадада аддсадССаС ададасадса дссдссСдде дсСддаддса сСдСддсада адддассааа сссСдаасСд дСдсаадсдд сССадССддС ссаддададд аСдсадСдад саадССссда сСссдсСдас СдсадаСддд ддаадаадаа ддссдаддаа сассассаса СдаСдссдСС дааадссааа аСдддаадад ссадсаСССс дсСддСддад ссСддадаас

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

- 58 009216

Еасассассд сЕсЕдсаддс ЕдЕЕссЕссЕ сддссЕсдЕС асдЕдЕЕсаа ЕаЕдсЕааад 1260 аадЕвЕдЕсс дсдсадааса дааддасада садсасассс ЕааадсаЕЕЕ сдадсаЕдЕд 1320 сдсаЕддЕдд аЕсссаадаа адссдсЕсад аЕссддЕссс аддЕЕаЕдас асассЕссдЕ 1380 дЕдаЕЕЕаЕд адсдсаЕдаа ЕсадЕсЕСЕс ЕсесЕдсЕСЕ асаасдЕдсс сдсадЕддсс 1440 даддадаЕЕс аддаЕдаадЕ ЕдаЕдадсЕд сЕЕсадааад адсаааасЕа ЕЕсадаЕдас 1500 дЕсЕЕддсса асаЕдаЕЕад Едаассаадд аЕсадЕЕасд дааасдаЕдс ЕСЕсаЕдсеа 1560 ЕсЕЕЕдассд ааасдаааас сассдкддад сЕссЕЕсссд ЕдааЕддада дЕЕсадссЕд 1620 дасдаЕСЕсс адссдЕддса ЕЕсЕЕЕЕддд дсЕдасЕсЕд Едссадссаа сасадаааас 1680 даадЕЕдадс сЕдЕЕдаЕдс седсссЕдсЕ дссдассдад дасЕдассас ЕсдассаддЕ 1740 ЕсЕдддсЕда саааЕаЕсаа дасддаддад аЕсЕсЕдаад ЕдааЕсЕдда ЕдсадааЕЕС 1800 сдасаЕдасЕ саддаЕаЕда адЕЕсаЕсаЕ саааааЕЕдд ЕдЕЕсЕЕЕдс адаадаЕдкд 1860 ддЕЕсаааса ааддСдсааЕ саЕЕддасЕс вЕддЕдддсд дсдЕЕдЕсаЕ адсдасадЕд 1920 аЕсдЕсаЕса ссЕЕддЕдаЕ дсЕдаадаад ааасадЕаеа саЕссаЕЕса ЕсаЕддЕдЕд 1980 дЕддаддЕЕд асдссдсЕдЕ сассссадад дадсдссасс ЕдЕссаадаЕ дсадсадаас 2040 ддсЕасдааа аЕссаассЕа саадЕЕсЕЕЕ дадсадаЕдс адаасаадаа дЕад 2094 <210> 1В <211> 697 <212> Белок <213> Человек (Ното гархепз)

<400> 18

<31у Ьеи 5

А1а Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи А1а А1а Тгр 10

ТЬг

А1а 15

Агд

МеЕ 1

Ьеи

Рго

А1а

Ьеи

<31и

Уа1

Рго

ТЬг

Азр

С1у

Азп

А1а

С1у

Ьеи

А1а

С1и

Рго

20

25

30

О1п

Не

А1а

Мег

РЬе

Суз

<51у

Агд

Ьеи

Азп

мес

Ηίβ

МеЕ

Азп

Уа1

<31п

35

40

45

Азп

С1у

Ьуз

Тгр

Азр

Бег

Азр

Рго

Бег

С1у

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Суз

Не

АЗр

50

55

60

ТЬг

Ьуз

С1и

С1у

Не

Ьеи

<31п

Туг

Суз

61п

(31и

Уа1

Туг

Рго

С1и

Ьеи

65

70

75

80

С1п

11е

ТЬг

Авп

Уа1

О1и

А1а

Азп

С1п

Рго

Уа1

ТЬг

11е

С1п

Азп

85

90

95

Тгр

Суз

Ьуз

Агд

<31у

Агд

Ьуз

<31п

Суз

Ьуз

ТЬг

Ηί8

Рго

Ηίβ

РЬе

Уа1

100

105

но

Не

Рго

Туг

Агд

Суз

Ьеи

νβΐ

<Э1у

<31 и

РЬе

Уа1

Бег

Азр

А1а

Ьеи

115

120

125

Уа1

Рго

Азр

Ьуз

Суз

Ьуз

РЬе

Ьеи

Ηίβ

С1п

(Пи

Агд

МеЕ

Азр

Уа1

Суз

130

135

140

- 59 009216

С1и ТЫ Нхз 145

Ьеи

Нхз Тгр Нхз ТЬг Уа1 А1а Ьув С1и ТЬг Суз Зег С1и

150

155

160

Ьуз

Бег

ТЬг

Авп

Ьеи

Ηΐε

Авр

Туг

С1у

Мес

Ьеи

Рго

Сув

С1у

Не

165

170

175

Азр

Ьув

РЬе

Агд

С1у

νβΐ

С1и

РЬе

Уа1

Сув

Рго

Ьеи

А1а

О1и

<31и

180

185

190

Бег

Авр

АВП

Уа1

Авр

Зег

А1а

Авр

А1а

С1и

<31и

Авр

Зег

Авр

ν»ι

195

200

205

Тгр

(31у

С1у

А1а

Авр

ТЫ

Авр

Туг

А1а

Авр

С1у

Зег

С1и

Азр

Ьув

210

215

220

Уа1

ν»1

С1и

Уа1

А1а

С1и

£1и

С1и

7а1

А1а

<31и

Уа1

С1и

225

230

235

240

С1и

А1а

Авр

Аар

Авр

(31и

Авр

С1и

Авр

С1у

Авр

С1и

νβΐ

□1и

С1и

245

250

255

С1и

А1а

31и

С1и

Рго

Туг

С1и

А1а

ТЬг

(31и

Агд

ТЬг

ТЫ

Бег

11е

260

265

270

А1а

ТЫ

ТЬг

ТЫ

ТЬг

С1и

Зег

νβΐ

С1и

Уа1

Агд

275

280

285

Уа1

Рго

ТЫ

А1а

Зег

ТЬг

Рго

Авр

А1а

Уа1

Авр

Ьув

Туг

Ьеи

290

295

300

61и

ТЫ

Рго

С1у

Авр

С1и

Авп

□1и

Ηχε

А1а

Ηΐε

РЬе

61П

Ьув

А1а

Ьуз

305

310

315

320

С1и

Агд

Ьеи

С1и

А1а

Ьуз

Нхв

Агд

С1и

Агд

МеС

Зег

С1п

Уа1

Мес

Агд

325

330

335

О1и

Тгр

С1и

А1а

С1и

Агд

01п

А1а

Ьуз

Авп

Ьеи

Рго

Ьуз

А1а

Адр

340

345

350

Ьуз

А1а

Уа1

Не

<31п

НХЗ

РЬе

С1п

С1и

Ьув

Уа1

<31и

Зег

Ьеи

С1и

355

360

365

С1п

С1и

А1а

Авп

<31и

Агд

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

ТЫ

Нхз

МеС

А1а

370

375

380

Агд

Уа1

<31и

А1а

МеС

Ьеи

Авп

Авр

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи

С1и

Авп

385 390 395 400

- 60 009216

Туг

Не ТЬг А1а

Ьеи 405

С1п А1а Уа1

Рго Рго Агд Рго Агд Ηίε Уа1

РЬе

410

415

Азп

Мее

Ьеи

Ьуз

Тут

Уа1

Агд

А1а

01 и

С1п

Ьув

Азр

Агд

С1п

Ηίβ

420

425

430

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Ηίβ

РЬе

(Пи

Ηίβ

Уа1

Агд

Мее

Уа1

Азр

Рго

Ьуз

А1а

435

440

445

А 1а

С1п

11е

Агд

Зег

С1п

Уа1

Мее

ТЬг

Ηίβ

Ьеи

Агд

Уа1

Не

туг

<31 и

450

455

460

Агд

Мее

Азп

αΐη

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Туг

Азп

Уа1

Рго

А1а

Уа1

А1а

465

470

475

480

С1и

Не

αΐη

Азр

С1и

Уа1

Азр

<31и

Ьеи

С1п

Ьуз

С1и

С1п

Азп

485

490

495

Туг

Зег

Азр

Уа1

Ьеи

А1а

Азп

мае

Не

Зег

С1и

Рго

Агд

Не

Зег

500

505

510

Тут

С1у

Азп

Азр

А1а

Ьеи

Мее

Рго

Зег

Ьеи

ТЬг

С1и

ТЬг

Ьуз

ТЬг

515

520

525

Уа1

01и

Ьеи

Рго

Уа1

Азп

01у

01и

РЬе

Зег

Ьеи

Азр

Ьеи

С1п

530

535

540

Рго

Тгр

Ηίβ

Зег

РЬе

61у

А1а

Азр

Зег

Уа1

Рго

А1а

Азп

ТЬг

01и

Азп

545

550

555

560

<31и

Уа1

С1и

Рго

Уа1

Азр

А1а

Агд

Рго

А1а

Авр

Агд

С1у

Ьеи

ТЬг

565

570

575

ТЬг

Агд

Рго

С1у

Зег

С1у

Ьеи

ТЬг

Азп

Не

Ьуз

ТЬг

01и

С1и

Не

Зег

580

585

590

С1и

Уа1

Азп

Ьеи

Азр

А1а

СПи

РЬе

Агд

ΗΪ3

Азр

Зег

С1у

Туг

С1и

Уа1

595

600

605

Ηίβ

ΗΪ5

С1п

Ьуз

Ьеи

Уа1

РЬе

А1а

С1и

Азр

Уа1

С1у

Зег

Азл

Ьув

610

615

620

61у

А1а

Не

О1у

Ьеи

Мее

Уа1

(31у С1у

Уа1

Не

А1а

ТЬг

Уа1

625

630

635

640

Не

Уа1

Не

ТЬг

Ьеи

Уа1

Мее

Ьеи

Ьуз

С1п

Туг

ТЬг

Зег

Не

645

650

655

- 61 009216

Ηί8 ΗΪ3 С1у Уа1 νβΐ С1и Уа1 Азр А1а А1а Уа1 ТЫ Рго С1и 61и Агд

660 665670 (Из Ьеи Зег Ьуз МеЕ С1п С1п Азп <31 у Туг С1и Азп Рго ТЫ Туг Ьуз

675 680685

РЬе РЬе С1и С1п МеЕ <31п Азп Ьуз Ьуз

690695 <210>19 <211>2094 <212> ДНК <213> Человек (Ново зархепз) <400> 19 аЕдсЕдсссд дЕЕЕддсасЕ дсЕссЕдсЕд дссдссСдда сддсСсдддс дсЕддаддСа 60 сссасЕдаЕд дсааЕдссдд ссЕдсЕддсЕ даассссада ЕЕдссасдсЕ сЕдЕддсада 120 сЕдаасаедс асаЕдааЕдЕ ссадааЕддд аадЕдддаЕЕ садаЕссасс адддассааа 180 ассЕдсаЕЕд аЕассаадда аддсаЕссЕд садЕаСЕдсс аадаадЕсЕа сссЕдаасЕд 240 садаЕсасса аЕдЕддЕада адссаассаа ссадЕдасса сссадаасЕд дСдсаадсдд 300 ддссдсаадс адсдсаадас ссаЕссссас ЕЕЕдЕдаЕЕс ссЕассдсЕд сЕЕадЕЕддЕ 360 дадЕЕЕдсаа дЕдаЕдсссЕ ЕсЕсдЕЕссЕ дасаадЕдса аасЕсЕЕаса ссаддададд 420 аСддаЕдЕЕЕ дсдааасЕса ЕсЕЕсасЕдд сасассдЕсд ссааададас аЕдсадЕдад 480 аададЕасса асЕЕдсаЕда сЕасддсаЕд ЕЕдсЕдсссЕ дсддааЕЕда саадЕЕссда 540 ддддСададЕ ЕЕдЕдСдЕЕд сссасЕддсЕ даадааадЕд асааЕдЕдда ЕЕсЕдсЕдас 600 дсддаддадд аЕдасЕсдда ЕдЕсЕддЕдд ддсддадсад асасадасЕа ЕдсадаЕддд 660 адедаадаса аадЕадЕада адЕадсадад даддаадаад ЕддсЕдаддЕ ддаадаадаа 720 даадссдагд асдасдадда сдаЕдаддаЕ ддЕдаЕдадд Еададдаада ддсЕдаддаа 780 сссЕасдаад аадссасада дадаассасс адсаЕЕдсса ссассассас сассассаса 840 дадЕсЕдЕдд аададдЕддЕ ЕсдадЕЕСсЕ асаасадсад ссадЕасссс ЕдаЕдссдЕЕ 900 дасаадЕаЕс Есдадасасс ЕддддаЕдад ааСдаасаЕд сссаЕЕЕсса дааадссааа 960 дададдсЕЕд аддссаадса ссдададада аЕдЕсссадд ЕсаЕдадада аЕдддаадад 1020 дсадаасдЕс аадсааадаа сЕЕдссЕааа дсЕдаЕаада аддсадЕЕаЕ ссадсаЕЕЕс 1080 саддадааад ЕддааЕсЕЕЕ ддаасаддаа дсадссаасд ададасадса дсЕддЕддад 1140 асасасаЕдд ссададгдда адссасдсЕс ааЕдассдсс дссдссЕддс ссЕддадаас 1200 ЕасаЕсассд сЕсЕдсаддс ЕдЕЕссЕссЕ сддссЕсдЕс асдЕдЕЕсаа ЕаЕдсеааад 1260 аадЕаСдЕсс дсдсадааса дааддасада садсасассс ЕааадсаЕЕЕ сдадсаЕдсд 1320 сдсаЕддЕдд аЕсссаадаа адссдсЕсад аЕссддЕссс аддЕЕасдас асассЕссдЕ 1380 дЕдаЕЕЕаЕд адсдсаЕдаа ЕсадссссЕс ЕсссЕдсесс асаасдсдсс едсадЕддсс 1440 даддадаЕЕс аддаЕдаадЕ ЕдаЕдадсЕд сЕЕсадааад адсаааасЕа ЕЕсадаЕдас 1500 дЕсЕЕддсса асасдассад Едаассаадд аСсадЕЕасд дааасдаЕдс ЕсЕсаЕдсса 1560 ЕсЕЕЕдассд ааасдаааас сассдЕддад сЕссЕЕсссд ЕдааЕддада дЕЕсадссЕд 1620 дасдаЕсЕсс адссдЕддса ЕЕсЕЕЕЕддд дсЕдасЕсЕд Едссадссаа сасадаааас 1680 даадЕЕдадс ссдЕЕдасдс ссдсссСдсЕ дссдассдад дасЕдассас Есдассадде 1740 ЕсЕдддЕЕда саааЕаЕсаа дасддаддад аЕсЕсЕдаад ЕдаадаЕдда ЕдсадааЕЕс 1800 сдасаСдасЕ саддаЕаЕда адЕЕсаЕсаЕ саааааЕЕдд ЕдЕЕсЕЕЕдс адаадаЕдЕд 1860

- 62 009216 ддССсаааса ааддСдсааС саССддасСс аСддсдддсд дсдссдссас адсдасадСд 1920 асссссасеа ссССддсдаС дсСдаадаад ааасадСаса саСссаССса СсаСддСдСд 1980 дСддаддССд асдссдссдс сассссадад дадсдссасс сдсссаадаг дсадсадаас 2040 ддсСасдааа аСссаассСа саадСССССС дадсадаСдс адаасаадаа дСад 2094

<210>	20
<211>	697
<212>	Белок
<213>	Человек (Ното зархепа)

<400> 20

Мес Ьеи Рго С1у Ьеи

А! а Ьеи Ьеи Ьеи Ьеи А1а А1а Тгр ТЬг А1а

Агд

1

5

10

15

А1а

Ьеи

С1и

Ча1

Рго

ТЬг

Авр

С1у

Авп

А1а

<31у

Ьеи

А1а

С1и

Рго

20

25

30

С1п

11е

А1а

МеС

РЬе

Суз

О1у

Агд

Ьеи

АЗП

МеС

Ηίβ

МеС

АЗП

Ча1

С1п

35

40

45

Аап

С1у

Ьуа

Тгр

Аар

Бег

Азр

Рго

Бег

С1у

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Суз

11е

Азр

50

55

60

ТЬг

Ьуа

61и

С1у

Не

Ьеи

С1п

Туг

Суз

О1п

С1и

Ча1

Туг

Рго

<31и

Ьеи

65

70

75

80

С1п

11е

ТЬг

Азп

Ча1

(31 и

А1а

Азп

С1п

Рго

Ча1

ТЬг

Х1е

С1п

Азп

85

90

95

Тгр

Суз

Ьуа

Агд

31у

Агд

Ьуз

С1п

Суз

Ьуз

1Ьг

Ηίβ

Рго

Ηίβ

РЬе

Ча1

100

105

но

11е

Рго

Туг

Агд

Суз

Ьеи

Ча1

С1у

С1и

РЬе

Ча!

Бег

Азр

А1а

Ьеи

115

<

120

125

Ча1

Рго

Азр

Ьуз

Суз

Ьуз

РЬе

Ьеи

Н1з

С1п

С1и

Агд

МеС

Азр

Ча1

Сув

130

135

140

С1и

ТЬг

ΗΪ5

Ьеи

ΗΪ3

Тгр

Н13

ТЬг

Ча1

А1а

Ьуз

С1и

ТЬг

Суз

Бег

С1и

145

150

155

160

Ьуа

Бег

ТЬг

Азп

Ьеи

Ηίβ

Азр

Туг

С1у

Мес

Ьеи

Рго

Суз

С1у

Не

165

170

175

Азр

Ьуз

РЬе

Агд

С1у

Ча1

61и

РЬе

Ча1

Суз

Рго

Ьеи

А1а

С1и

180

185

190

Бег

Авр

Азп

Ча1

АЗр

Бег

А1а

Азр

А1а

С1и

Азр

Бег

Азр

Ча1

- 63 009216

195 200 205

Тгр Тгр 210

С1у С1у

А1а

Азр

ТЬг Азр Туг А1а Азр <31у

Бег

(Ни

Азр

Ьуз

215

220

νβΐ

Уа1

С1и

Уа1

А1а

С1и

<31и

О1и

С1и

Уа1

А1а

61и

Уа1

(Пи

С1и

(Пи

225

230

235

240

С1и

А1а

Азр

61и

Азр

С1и

АЗр

С1у

Азр

С1и

Уа1

С1и

245

250

255

С1и

А1а

<31и

(Пи

Рго

Туг

<31и

А1а

ТЬг

СП и

Агд

ТЫ

ТЬг

Бег

Не

260

265

270

А1а

ТЫ

ТЬг

С1и

Бег

Уа1

(31и

О1и

Уа1

Агд

275

280

285

ν*ι

Рго

ТЬг

А1а

Бег

ТЬг

Рго

Азр

А1а

Уа1

Азр

Ьуз

Туг

Ьеи

290

295

300

61и

ТЬг

Рго

<31у

Азр

С1и

Азп

61и

ΗΪ8

А1а

ΗΪ8

РЬе

61п

Ьуз

А1а

Ьуз

305

310

315

320

61и

Агд

Ьеи

61и

А1а

Ьуз

Шз

Агд

(Пи

Агд

МеЕ

Бег

С1п

Уа1

МеЕ

Агд

325

330

335

С1и

Тгр

С1и

<31и

А1а

<31и

Агд

С1п

А1а

Ьуз

Азп

Ьеи

Рго

Ьуз

А1а

Азр

340

345

350

Ьуз

А1а

Уа1

Не

С1п

ΗΪ3

РЬе

61п

<31и

ьуз

Уа1

С1и

Бег

Ьеи

С1и

355

360

365

С1п

С1и

А1а

Азп

С1и

Агд

О1П

С1п

Ьеи

ν»ι

61и

ТЬг

ΗΪ8

МеЕ

А1а

370

375

380

Агд

Уа1

С1и

А1а

МеЕ

Ьеи

Азп

Азр

Агд

Ьеи

А1а

Ьеи

01и

Азп

385

390

395

400

Туг

Не

ТЬг

А1а

Ьеи

С1п

А1а

Уа1

Рго

Агд

Рго

Агд

Нхз

Уа1

РЬе

405

410

415

АЗП

МеЕ

Ьеи

Ьув

Ьуз

Туг

Уа1

Агд

А1а

С1и

С1П

Ьуз

АЗр

Агд

61п

Нхз

420

425

430

ТЬг

Ьеи

Ьуз

Ηίδ

РЬе

С1и

ΗΪ3

Уа1

Агд

МеЕ

νβΐ

Азр

Рго

Ьуз

А1а

435

440

445

А1а

С1п

Не

Агд

Бег

О1п

Уа1

МеЕ

ТЬг

Н1з

Ьеи

Агд

Уа1

11е

Туг

(Пи

- 64 009216

450

455

460

Агд

Мег

АЗП

С1п

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Туг

Азп

Уа1

Рго

АХа

Уа1

А1а

465

470

475

480

С1и

СХи

11е

С1п

Азр

СХи

Уа1

Азр

С1и

Ьеи

СХп

Ьуз

СХи

С1п

Азп

485

490

495

Туг

Бег

Азр

Уа1

Ьеи

АХа

Азп

МеЕ

11е

Зег

С1и

Рго

Агд

11е

Зег

500

505

510

Туг

С1у

Азп

Азр

АХа

Ьеи

МеЕ

Рго

Зег

Ьеи

ТЬг

С1и

ТЫ

Ьуз

ТЬг

515

520

525

Уа1

СХи

Ьеи

Рго

УаХ

Азп

СХу

С1и

РЬе

Зег

Ьеи

Азр

Ьеи

С1п

530

535

540

Рго

Тгр

Нхз

Зег

РЬе

СХу

А1а

Авр

Зег

Уа1

Рго

АХа

Азп

ТЬг

С1и

Авп

545

550

555

560

С1и

УаХ

СХи

Рго

Уа1

Азр

А1а

Агд

Рго

А1а

АХа

Азр

Агд

СХу

Ьеи

ТЬг

565

570

575

ТЫ

Агд

Рго

С1у

Зег

С1у

Ьеи

ТЫ

Азп

Не

Ьуз

ТЫ

СХи

11е

Зег

580

585

590

С1и

Уа1

Ьуз

Мее

Азр

А1а

С1и

РЬе

Агд

Нхз

Азр

Зег

С1у

Туг

С1и

УаХ

595

600

605

Нхз

С1п

Ьуз

Ьеи

Уа1

РЬе

АХа

С1и

Азр

Уа1

С1у

Зег

Азп

Ьув

610

615

620

С1у

АХа

Не

11е

С1у

Ьеи

МеЕ

УаХ

СХу С1у

Уа1

УаХ

11е

А1а

ТЬг

Уа1

625

630

635

640

11е

РЬе

11е

ТЬг

Ьеи

УаХ

МеЕ

Ьеи

Ьуз

СХп

Туг

ТЬг

Зет

Х1е

645

650

655

Нхз

С1у

УаХ

СХи

УаХ

Азр

А1а

УаХ

ТЬг

Рго

С1и

Агд

660

665

670

Нхз

Ьеи

Бег

Ьуз

МеЕ

СХп

С1п

Азп

С1у

Туг

С1и

Азп

Рго

ТЬг

Туг

Ьуз

675

680

685

РЬе

С1и

СХп

МеЕ

СХп

Азп

Ьуз

690

695

- 65 009216 <210> 21 <211> 1341 <212> ДНК <213> Человек (Ново зархепз) <400> 21 аеддсЕадса ЕдасСддЕдд асадсаааЕд ддссдсддаЕ ссасссадса сддсаЕссдд 60 ссдссссЕдс дсадсддссЕ ддддддсдсс ссссСдддде ЕдсддсЕдсс ссдддадасс 120 дасдаададс ссдаддадсс сддссддадд ддсадсЕЕЕд ЕддадаЕддЕ ддасаасссд 180 аддддсаадС сддддсаддд сЕасЕасдСд дадаЕдассд Едддсадссс сссдсадасд 240 СЕсаасаЕсс сддЕддаЕас аддсадсадЕ аассЕЕдсад ЕдддЕдсЕдс сссссасссс 300 ЕЕссЕдсаЕО дсЕасЕасса даддсадсСд ЕссадсасаЕ ассдддассЕ ссддаадддЕ 360 дСдСаЕдЕдс ссЕасасеса дддсаадЕдд дааддддадс Едддсассда ссЕддСаадс 420 аЕсссссаЕд дссссаасдЕ сасЕдЕдсдЕ дссаасаСЕд сЕдссаЕсас ЕдааЕсадас 480 аадЕЕссЕса ЕсаасддсЕс саасЕдддаа ддсаЕссЕдд ддсЕддссСа ЕдсЕдадаЕЕ 540 дссаддсоЕд аодасЕсссЕ ддадссЕЕЕс ЕЕЕдасЕсЕс ЕддЕааадса дасссасдЕЕ 600 сссаассЕсъ ссЕеесЕдса ссЕЕЕдЕддС дсЕддсЕЕсс сссЕсаасса дЕсЕдаадъд 660 съддссЕсЕд Есддадддад саЕдаЕсаЕЕ ддаддЕаЕсд ассасЕсдсЕ дЕасасаддс 720 адЕсЕсЕддъ аЕасасссаЕ ссддсдддад ЕддъаЕЕаЕд аддСсаЕсас ЕдЕдедддъд 780 дадаЕсааЕд дасаддаЕСЕ дааааЕддас ЕдсааддадЕ асаасЕЭЕда саададсаЕЕ 840 дъддасадъд дсассассаа ссЕЕсдЕЕЕд сссаадааад ЕдЕЕЕдаадс ЕдсадЕсааа 900 ЕссаЕсаадд садссЕссЕс сасддадаад ЕЕсссЕдаЕд дЕЕЕсЕддсЕ аддададсад 960 сЕддЕдЕдсЕ ддсаадсадд сассассссЕ ЕддаасаСЕЕ ЕсссадЕсаЕ сЕсасЕсЕас 1020 сЕааЕдддЕд аддЕЕассаа ссадЕссЕЕс сдсаъсасса ЕссЕЕссдса дсааЕассЕд 1080 еддссадЕдд аадаЕдЕддс сасдЕсссаа дасдасЕдЕЕ асаадЕЕЕдс саЕсЕсасад 1140 ЕсаЕссасдд дсасъдЕЕаЕ дддадеСдЕЕ аЕсаЕддадд дсЕЕсЕасдЕ ЕдЕсЕЕЕдаЕ 1200 сдддсссдаа аасдааЕЕдд сЕЕЕдсЕдЕс адсдсЕЕдсс аЕдЕдсасда ЕдадЕЕсадд 1260 асддсадсдд Еддааддссс СЕЕЕдъсасс ъъддасаъдд аадасЕдъдд сЕасаасаЕЕ 1320 ссасадасад асдадЕсаЕд а 1341 <210> 22 <211> 446 <212> Белок <213> Человек (Ното зар±епз) <400> 22

МеЪ

А1а

Зег

Мес

ТЬг

<31у

С1у

(31 η

С1п

Мес

С1у Агд С1у

Зег

ТЬг

С1п

1

5

10

15

ΗΪ3

01у

11е

Агд

Беи

Рго

Беи

Агд

Зег

(Пу

Беи

О1у (31у

А1а

Рго

Беи

20

25

30

С1у

Ьеи

Агд

Беи

Рго

Агд

С1и

ТЬг

АЗР

С1и

(31и

Рго С1и

О1и

Рго

(Пу

35

40

45

Агд

С1у

Зег

РЬе

Уа1

б1и

Мес

Уа1

Азр

Азп

Беи Агд

С1у

Буз

Бег

55 60

- 66 009216

С1у С1п С1у 65

Туг

Туг Уа1 С1и МеС ТЬг Уа1 С1у Бег Рго Рго С1п ТЬг

70

75

80

Ьеи

Азп

Не

Ьеи

νβΐ

Азр

ТЬг

(Пу

Бег

Азп

РЬе

А1а

Уа1

С1у

Л 1а

85

90

95

А1а

Рго

Н15

Рго

РЬе

Ьеи

ΗΪ3

Агд

Туг

С1п

Агд

С1п

Ьеи

Бег

100

105

110

ТЬг

Туг

Агд

Азр

Ьеи

Агд

Ьув

С1у

Уа1

Туг

νβΐ

Рго

Туг

ТЬг

О1п

С1у

115

120

125

Ьуз

Тгр

С1и

С1у

С1и

Ьеи

(Ну

ТЬг

Азр

Ьеи

Уа1

Бег

Не

Рго

Н15

(Пу

130

135

140

Рго

Азп

Уа1

ТЬг

Уа1

Агд

А1а

Азп

Не

А1а

Не

ТЬг

С1и

Бег

Азр

145

150

155

160

ьуз

РЬе

Не

Азп

С1у

Бег

Азп

Тгр

С1и

(Пу

11е

Ьеи

С1у

Ьеи

А1а

165

170

175

Туг

А1а

С1и

Не

А1а

Агд

Рго

Азр

Бег

Ьеи

(Ни

Рго

РЬе

Азр

180

185

190

Бег

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1п

ТЬг

Н13

νβΐ

Рго

Азп

Ьеи

РЬе

Бег

Ьеи

Нхз

Ьеи

195

200

205

Суз

С1у

А1а

С1у

РЬе

Рго

Ьеи

Авп

01п

Бег

В1и

Уа1

Ьеи

А1а

Бег

Уа1

210

215

220

С1у

Бег

МеС

11е

Не

<Пу

(Пу

Не

Азр

Ηίβ

Бег

Ьеи

Туг

ТЬг

(Ну

225

230

235

240

Бег

Ьеи

Тгр

Туг

ТЬг

Рго

11е

Агд

С1и

Тгр

Туг

С1и

Уа1

Не

245

250

255

11е

Уа1

Агд

Уа1

(Пи

Не

Азп

С1у

С1п

Азр

Ьеи

Ьуз

МеС

Азр

Суз

Ьуз

260

265

270

<31и

Туг

Азп

Туг

Азр

Ьуз

Бег

Не

Уа1

Азр

Бег

□1у

ТЬг

Азп

Ьеи

275

280

285

Агд

Ьеи

Рго

Ьуз

Уа1

РЬе

С1и

А1а

Уа1

Ьуз

Бег

Не

Ьуз

А1а

290

295

300

А1а

Бег

ТЬг

(Пи

Ьув

РЬе

Рго

Азр

(Пу

РЬе

Тгр

Ьеи

(Ну

С1и

С1п

305 310 315 320

- 67 009216

Ьеи Уа1

Суз Тгр С1п А1а С1у ТЬг ТЬг Рго Тгр Азп 11е РЬе Рго Уа1

325

330

335

Не

Бег

Ьеи

Туг

Ьеи

МеС

С1у

С1и

Уа1

ТЬг

Азп

01Л

Бег

РЬе

Агд

Не

340

345

350

ТЫ

11е

Ьеи

Рго

О1п

С1п

Туг

Ьеи

Агд

Рго

Уа1

С1и

Азр

Уа1

А1а

ты

355

360

365

Бег

σΐη

Азр

Суз

Туг

Ьуз

РЬе

А1а

Не

Бег

С1п

Бег

ТЫ

С1у

370

375

380

ТЬг

Уа1

МеС

61у

А1а

Уа1

11е

МеЕ

С1и

61у

РЬе

Туг

Уа1

РЬе

Азр

385

390

395

400

Агд

А1а

Агд

Ьуз

Агд

Не

01у

РЬе

А1а

Уа1

Бег

А1а

Суз

Нхз

Уа1

Н1з

405

410

415

Азр

С1и

РЬе

Агд

ТЬг

А1а

Уа1

С1и

01у

Рго

РЬе

Уа1

ТЬг

Ьеи

Азр

420

425

430

Мес

О1и

Азр

Суз

Н1у

Туг

Азп

Не

Рго

С1п

ТЬг

Азр

01и

Бег

435

440

445

<210> <211> <212> <213>

23 1380 ДНК Человек (Ното зар±епз)

<400* 23 аЕддсСэдса ЕдасЕддедд асадсаааЕд ддЕсдсддаС сдаЕдасЕаС сЕсЕдасЕсЕ 60 ссдсдЕдаас аддасддаСс сасссадсас ддсаЕссддс ЕдссссЕдсд садсддссЕд 120 дддддсдссс сссЕддддсс дсддседссс сдддадассд асдаададсс сдаддадссс 180 ддссддаддд дсадсЕЕЕдс ддадаСддСд дасаассЕда ддддсаадЕс ддддсадддс 240 сассасдЕдд адаЕдассде дддсадсссс ссдсадасдс ЕсаасаЕссЕ ддсддасаса 300 ддсадсадса асЕЕЕдсадс дддЕдсСдсс ссссассссЕ ЕссЕдсаЕсд сЕасЕассад 360 аддсадсСдЕ ссадсасаса ссдддассСс сддаадддсд ЕдсаЕдЕдсс сЕасасссад 420 ддсаадсддд ааддддадсс дддсассдас сЕддЕаадса Есссссасдд ссссаасдЕс 480 асСдЕдсдЕд ссаасаЕЕдс ЕдссассасС дааЕсадаса адСЕсЕЕсаЕ еаасддсссс 540 аасЕдддаад дсаЕссЕддд дсЕддссЕаЕ дсЕдадаЕЕд ссаддссЕда сдасЕсссСд 600 дадссЕЕЕсЕ ССдасЕсЕсс ддеааадсад асссаедЕЕс ссаассЕсЕЕ сЕсссЕдсас 660 сСЕЕдЕддЪд сСддсСЕссс ссЕсаассад ЕсЕдаадЕдс ЕддссЕСЕдЕ сддадддадс 720 аЕдассаЕСд даддЕаЕсда ссасЕсдсЕд Еасасаддса дЕсЕсЕддЕа Сасасссасс 780 сддсдддадЕ ддЕасЕаСда ддЕсаЕсаЕЕ дСдсдддСдд адаЕсааЕдд асаддаесЕд 840 ааааеддасЕ дсааддадЕа саасЕаЕдас аададсаЕСд СддасадСдд сассассаас 900 сеседЕЕЕдс ссаадаааде дЕЕЕдаадсЕ дсадссаааЕ ссаЕсааддс адссЕссЕсс 960 асддадаадс ссссЕдаЕдд СЕЕСЕддсЕа ддададсадс СддСдСдсЕд дсаадсаддс 1020

- 68 009216 ассасссеСС садессССсс асдСсссаад ддадссдсса сссдссдсса СССдссассС ддаасаСССС дсассассас асдасСдсса СсаСддаддд дсдсССдсса СддасаСдда сссадссасс ссССссдсад саадССБдес сссссаедсс сдсдсасдас адассдСддс ссассссасс СааСдддСда ддССассаас 1080 сааСассСдс ддссадедда адасдСддсс 1140 аСсСсасадС саСссасддд сасСдССаСд 1200 дсссссдасе дддсссдааа асдааССддс 1280 дадессадда сддсадсддс ддааддсссс 1320 СасаасаССс сасадасада СдадСсаСда 1380 <210> 24 <211> 459 <212> Белок <213> Человек (Ното вархепв) <400> 24

МеС А1а Зег Мес ТЬг

С1у

С1п С1п Мес <31у Агд 31у Зег МеС ТЬг

1

5

10

15

Не

Зег

Авр

Зег

Рго

Агд

З1и

С1п

Авр

С1у

Зег

ТЬг

С1п

Н15

С1у

11е

20

25

30

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

Агд

Зег

(Ну

Ьеи

<31у

С1у

А1а

Рго

Ьеи

С1у

Ьеи

Агд

35

40

45

Ьеи

Рго

Агд

(Ни

ТЬг

Авр

(Ни

С1и

Рго

01и

С1и

Рго

С1у

Агд

01у

50

55

60

Зег

РЬе

ν«ι

С1и

МеС

Уа1

Азр

Азп

Ьеи

Агд

(Пу

Ьуз

Зег

<31у

(Нп

(Ну

65

70

75

80

Туг

Уа1

<31и

МеС

ТЬг

Уа1

□1у

Зег

Рго

51п

ТЬг

Ьеи

Авп

Не

85

90

95

Ьеи

Уа1

Азр

ТЬг

С1у

Зег

Авп

РЬе

А1а

Уа1

<31у

А1а

Рго

Ηϊβ

100

105

110

Рго

РЬе

Ьеи

Н18

Агд

Туг

С1п

Агд

С1п

Ьеи

Зег

ТЬг

Туг

Агд

115

120

125

Авр

Ьеи

Агд

Ьуз

С1у

Уа1

Туг

Уа1

Рго

Туг

ТЬг

С1п

С1у

Ьуз

Тгр

С1и

130

135

140

е1у

С1и

Ьеи

О1у

ТЬг

Авр

Ьеи

Уа1

Зег

Не

Рго

ΗΪΒ

(Ну

Рго

Азп

Уа1

145

150

155

160

ТЬг

Уа1

Агд

А1а

Азп

Не

А1а

Не

ТЬг

О1и

Зег

Авр

Ьув

РЬе

165

170

175

Не

Авп

(Ну

Зег

Авп

Тгр

С1и

(Ну

Не

Ьеи

С1у

Ьеи

А1а

Туг

А1а

(Ни

180

185

190

- 69 009216

11е

А1а

Агд 195

Рго

Азр Азр 5ег

Ьеи О1и Рго РЬе РЬе Азр Зег Ьеи Ча1

200

205

Ьуз

О1п

ТЬг

Нхз

Уа1

Рго

Азп

Ьеи

РЬе

Зег

Ьеи

ΗΪ3

Ьеи

Суз

<31у

А1а

210

215

220

01у

РЬе

Рго

Ьеи

Азп

С1п

Зег

С1и

νβΐ

Ьеи

А1а

Зег

ν»1

С1у

Зег

225

230

235

240

Мей

Не

11е

<31у С1у

Не

Азр

Ηΐε

Зег

Ьеи

Туг

ТЬг

С1у

Зег

Ьеи

Тгр

245

250

255

Туг

ТЬг

Рго

Не

Агд

(31и

Тгр

Туг

С1и

Уа1

Не

Уа1

Агд

260

265

270

Уа1

<31и

11е

Азп

<31 у С1п

Азр

Ьеи

Ьуз

Мей

Азр

Суз

Ьуз

О1и

Тух

Азп

275

280

285

Туг

Азр

Ьуз

бег

11е

νβΐ

Азр

Зег

О1у

ТЬг

Азп

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

290

295

300

Ьуз

Уа1

РЬе

С1и

А1а

Ча1

Ьуз

Зег

11е

Ьуз

А1а

Зег

305

310

315

320

ТЬг

С1и

Ьуз

РЬе

Рго

Азр

(31у

РЬе

Тгр

Ьеи

О1У

О1и

01п

Ьеи

νβΐ

Суз

325

330

335

Тгр

С1п

А1а

01у

ТЬг

Рго

Тгр

Азп

Не

РЬе

Рго

Уа1

Не

Зег

Ьеи

340

345

350

Тух

Ьеи

мей

<31у

С1и

Уа1

ТЬг

АЗП

01п

Зег

РЬе

Агд

Не

ТЬг

Не

Ьеи

355

360

365

Рго

<31П

<31 η

Туг

Ьеи

Агд

Рго

Уа1

01и

Азр

ν&ι

А1а

ТЬг

Зег

О1п

Азр

370

375

380

Азр

Суз

Туг

Ьуз

РЬе

А1а

Не

Зег

С1п

Зег

ТЬг

О1у

ТЬг

νβΐ

МеЕ

385

390

395

400

С1у

А1а

Уа1

Не

Мей

С1и

О1у

РЬе

Туг

Уа1

ν&1

РЬе

Азр

Агд

А1а

Агд

405

410

415

Ьуз

Агд

11е

С1у

РЬе

А1а

Уа1

Зег

А1а

Суз

ΗΪ5

Уа1

ΗΪ5

Азр

О1и

РЬе

420

425

430

Агд

ТЬг

А1а

Уа1

С1и

01у

Рго

РЬе

Уа1

ТЬг

Ьеи

Азр

Мей

<31и

Азр

435

440

445

- 70 009216

Сув 61у Туг Авп 11е рго <31 п ТЫ Авр С1и Зег

450455 <210>25 <211>1302 <212> ДНК <213> Человек (Ното зар±епз) <400> 25 асдасСсадс аСддСаССсд СсСдссасСд сдСадсддСс СдддСддСдс сееасСдддс 60 сСдсдСсСдс сссдддадас сдасдаадад сссдаддадс ссддссддад дддсадсССС 120 дсддадаСдд сддасаассС даддддсаад Ссддддсадд дсСасСасдС ддадасдасс 180 дсдддсадсс ссссдсадас дсссаасаСс ссддсддаса саддсадсад саассссдеа 240 дсдддсдесд ссссссассс сССссСдсаС сдсьассасс ададдсадсс дсссадсаса 300 Сассдддасс Сссддааддд СдСдСаСдСд сссГасассс адддсаадСд ддааддддад 360 сСдддсассд ассСддСаад саСсссссаС ддссссаасд сеассдСдсд сдссаасасс 420 дссдссаСса сСдааЕсада саадССсССс аСсаасддсС ссаасСддда аддсаСссСд 480 дддссддссс аСдсСдадаС СдссаддссС дасдассссс СддадссССС ссссдаессс 540 ссддсааадс адаоссасдС ссссааоссс ССсСсссСдс аоссссдсдд сдсСддсССс 600 ссссСоаасс адСсСдаадС дсСддссСсС дСсддаддда дсаСдассаС СддаддСасс 660 дассасссдс СдСасасадд садссссСдд СаСасассса Сссддсддда дсддсассас 720 даддСсаСоа ССдСдсдддС ддадаСсааС ддасаддаСс СдааааСдда ссдсааддад 780 СасаасСаСд асаададсас СдСддасадС ддсассаеса асссссдссс дсссаадааа 840 дсдсссдаад сСдсадСсаа асссассаад дсадсссссс ссасддадаа дссссссдас 900 ддСССсСддс Саддададса дсСддСдСдс Сддсаадсад дсассасссс седдаасасс 960 ССсссадСса СссоасСсСа ссСаасдддЕ даддССасса аосадСсссс ссдсаСсасс 1020 аСссССссдс адсааСассС дсддссадСд даадасдСдд ссасдсссса адасдассдс 1080 СасаадСССд ссаСсСсаса дСсаСссасд ддсасСдССа СдддадсСдС Сассасддад 1140 ддсССсСаед седСсСССда Ссдддсссда аааедааССд дсСССдеСдС садсдсССдс 1200 сасдсдсасд асдадсссад дасддсадсд дсддааддсс сесесдссас сссддасасд 1260 даадасСдСд дсСасаасаС Сссасадаса даСдадСсаС да 1302 <210> 26 <211> 433 <212> Белок <213> Человек (Ното зархвпз)

<400> 26

11е Агд

Ьеи

Рго

Ьеи Агд Зег 61у Ьеи С1у 61у

МеС ТЬг 1

С1п

Ηίβ 61у 5

10

15

А1а

Рго

Ьеи

61у

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

Агд

С1и

ТЬг

Азр

61и

О1и

Рго

С1и

20

25

30

61ч

Рго

С1у

Агд

61у

Зег

РЬе

Уа1

61ч

МеС

ν*ι

Азр

Азп

Ьеи

Агд

35

40

45

- 71 009216

(31у Ьуз 50

Зег С1у С1п Е1у

Туг 55

Туг Уа1 С1и МеЕ

ТЫ νβΐ 60

С1у

Зег

Рго

С1п

ТЬг

Ьеи

Азп

Не

Ьеи

νβΐ

Азр

ТЬг

С1у

Зег

Азп

РЬе

А1а

65

70

75

80

Уа1

(31у

А1а

Рго

Ηίε

Рго

РЬе

Ьеи

Н13

Агд

Туг

С1п

Агд

С1п

85

90

95

Ьеи

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Азр

Ьеи

Агд

Ьуз

С1у

νβΐ

Туг

Уа1

Рго

Туг

100

105

110

ТЫ

С1п

С1у

Ьуз

Тгр

С1и

С1у

О1и

Ьеи

<31у

ТЫ

Азр

Ьеи

Уа1

Зег

Не

115

120

125

Рго

ΗΪ5

С1у

Рго

АЗП

Уа1

ТЫ

Уа1

Агд

А1а

Азп

11е

А1а

Не

ТЫ

130

135

140

(31и

Зег

Азр

Ьуз

РЬе

11е

Азп

С1у

Зег

Азп

Тгр

С1и

С1у

11е

Ьеи

145

150

155

160

01у

Ьеи

А1а

Туг

А1а

С1и

Не

А1а

Агд

Рго

Азр

Зег

Ьеи

С1и

Рго

165

170

175

РЬе

Азр

Зет

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1п

ТЫ

Ηί3

V·!

Рго

Азп

Ьеи

РЬе

Зег

130

185

190

Ьеи

ΗΪ5

Ьеи

Суз

(31у

А1а

О1у

РЬе

Рго

Ьеи

Азп

С1п

Зег

С1и

ν<ι

Ьеи

195

200

205

А1а

Зег

ν*1

С1у

Зег

Мес

Не

11е

С1у

11е

Азр

Η1Ξ

Зег

Ьеи

210

215

220

Туг

ТЫ

61у

Зег

Ьеи

Тгр

Туг

ТЬг

Рго

Не

Агд

С1и

Тгр

Туг

225

230

235

240

С1и

Уа1

Не

11е

Уа1

Агд

V*!

С1и

Не

Азп

С1у

С1п

Азр

Ьеи

Ьуз

МеС

245

250

255

Азр

Суз

Ьуз

С1и

Туг

Азп

Туг

Азр

Ьуз

Зег

Не

Уа1

Азр

Зег

С1у

ты

260

265

270

ТЫ

Азп

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

Ьуз

Уа1

РЬе

01и

А1а

Уа1

Ьуз

Зег

275

280

285

Не

Ьуз

А1а

Зег

ТЫ

<31и

Ьуз

РЬе

Рго

Азр

С1у

РЬе

Тгр

Ьеи

290 295 300

- 72 009216

С1у С1и С1п Ьеи Уа1 Суз Тгр С1п
305	310
РЬе	Рго	V»! 11е	Зег Ьеи	Туг	Ьеи
				325
РЬе	Агд	Не ТЬг	11е Ьеи	Рго	αΐη
			340
ν<1	А1а	ТЬг Зег	01п Азр	Азр	Суз
		355				360
Зег	ТЬг	С1у ТЬг	Уа1 МеЕ	(31у	А1а
	370					375
Уа1	РЬе	Азр Агд	А1а Агд	Ьуз	Агд
385				390
Н1з	ν*1	Н1з Азр	<Э1и РЬе	Агд	ТЬг
				405
ТЬг	Ьеи	Азр Мее	С1и Азр	Суз	С1у
			Л Л
Зег
<210> 27
<211> 1276
<212> ДНК
<213> Человек	(Ното	зархепз)
<400	> 27
аЕддсСадса	ЕдасЕддедд	асадсаааед
ссдсЕддасЕ	сЕддЕаЕсда	аассдасдда
ддсаадСсдд	ддсадддсСа	сСаедЕддад
аасаЕссСдд	ЕддаЕасадд	садсадЕаас
сЕдсаЕсдсЕ	асеассадад	дсадседесс
СаЕдСдсссЕ	асасссаддд	саадЕдддаа
ссссаЕддсс	ссаасдЕсас	ЕдЕдсдЕдсс
ЕЕсЕЕсаСса	асддсЕссаа	сЕдддааддс
аддссЕдасд	асЕсссЕдда	дссЕЕЕсЕСЕ
аассЕсЕСсЕ	ссседсассЕ	ЕЕдЕддЕдсЕ
дссесЕдСсд	дадддадсаЕ	даесаЕЕдда
сСсЕддЕаСа	сасссаессд	дсдддад^дд
аЕсааЕддас	аддаЕсЕдаа	ааЕддасЕдс

А1а	С1у	ТЬг 315	ТЬг	Рго	Тгр	Азп	11е 320
МеЕ	□1у 330	61и	Уа1	ТЬг	АЗП	С1п 335	Зег
С1П 345	Туг	Ьеи	Агд	Рго	Уа1 350	£1и	Азр
Туг	Ьуз	РЬе	А1а	11е 365	Зег	С1п	Зег
Уа1	11е	Мес	С1и 380	С1у	РЬе	Туг	Уа1
11е	С1у	РЬе 395	А1а	Уа1	Зег	А1а	Суз 400
А1а	А1а 410	Уа1	С1и	С1у	Рго	РЬе 415	Уа1
Туг л η ₽ 4Ζ3	Азп	Не	Рро	(31п	ТЬг □* *! Л ч и	Азр	С1и

ддСсдсддае сдаедасСаЕ сЕсЕдасЕсЕ 60

ЕссЕЕСдЕдд адаеддЕдда саассСдадд 120 аСдасодЕдд дсадсссссс дсадасдсЕс 180

ЕЕЕдсадЕдд дЕдсЕдсссс ссассссЕЕс 240 адсасаЕасс дддассСссд даадддсдЕд 300 ддддадсЕдд дсассдассс ддЕаадсаЕс 360 аасаЕЕдсСд ссассасЕда аСсадасаад 420 аесседдддс Еддссеаедс ЕдадаЕЕдсс 480 дасссссгдд Еааадсадас ссасдЕЕссс 540 ддсЕСссссс СсаассадЕс ЕдаадЕдсЕд 600 ддСаеедасс асЕсдсЕдСа сасаддсадС 660

Еасеасдадд сеасеаСЕдЕ дсдддЕддад 720 ааддадЕаса асеаедасаа дадсаеедсд 780

- 73 009216 дасадЕддса ссассаассЕ ЕсдЕЕЕдссс аадааадсдс ЕЕдаадсЕдс адЕсаааЕсс 840 аЕсааддсад ссЕсоЕссас ддадаадЕЕС есЕдаЕддЕЕ ЕсЕддсЕадд ададсадсЕд 900 дЕдЕдсЕддс аадсаддсас сассссЕЕдд аасаЕЕЕЕсс садЕсаЕсгс асЕсЕассЕа 960 агдддсдадд ЕЕассаасса дЕссЕЕссдс аЕсассаЕсс ЕЕссдсадса аЕассЕдсдд 1020 ссадЕддаад аЕдЕддссас дЕсссаадас дасЕдЕЕаса адЕЕЕдссаЕ сЕсасадЕоа 1080 Ессасдддса сЕдЕЕаЕддд адсЕдЕЕаЕс аЕддадддсЕ ЕсЕасдЕЕдЕ сЕЕЕдаЕсдд 1140 дсссдаааас дааЕЕддсЕЕ ЕдсЕдЕсадс дсЕЕдссаЕд Едсаодагда дЕЕсаддасд 1200 деадеддЕдд ааддсссЕЕЕ ЕдЕсассЕЕд дасаЕддаад асЕдЕддсЕа саасаЕЕсса 1260 садасадаЕд адЕсаЕда 1278 <210> 28 <211> 425 <212> Белок <213> Человек (Ното зархёпз) <400> 28

МеЕ 1

А1а Зег МеЕ

ТЬг СХу СХу С1п С1п МеЕ СХу Агд

С1у

Зег МеЕ 15

ТЬг

5

10

Ле

Бег

Азр

Бег

Рго

Ьеи

Азр

Бег

С1у

Ле

С1и

ТЬг

Авр

С1у

Зег

РЬе

20

25

30

УаХ

С1и

МеЕ

νβΐ

Азр

АЗП

Ьеи

Агд

С1у

Ьуз

Бег

С1у

С1п

СХу

Туг

35

40

45

Уа1

С1и

МеЕ

ТЬг

УаХ

С1у

Бег

Рго

С1п

ТЬг

Ьеи

АЗП

Ле

Ьеи

Уа1

50

55

60

Азр

ТЬг

С1у

Бег

Азп

РЬе

А1а

УаХ

О1у

А1а

Рго

Нхз

Рго

РЬе

65

70

75

80

Ьеи

ΗΪ5

Агд

Тут

Туг

С1п

Агд

С1п

Ьеи

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Азр

Ьеи

85

90

95

Агд

Ьуз

<ЗХу

Уа1

Туг

Уа1

Рго

Тух

ТЬг

С1П

С1у

Ьув

Тгр

С1и

С1у

СХи

100

105

110

Ьеи

СХу

ТЬг

Азр

Ьеи

Уа1

Бег

Ле

Рго

Н1Б

С1у

Рго

Авп

Уа1

ТЬг

УаХ

115

120

125

Агд

А1а

Азп

Ле

А1а

Ле

ТЬг

СХи

Зег

Азр

Ьуз

РЬе

Ле

Азп

130

135

140

СХу

Бег

Азп

Тгр

С1и

С1у

Ле

Ьеи

С1у

Ьеи

АХа

Туг

А1а

С1и

Ле

А1а

145

150

155

160

Агд

Рго

Аар

Азр

Бег

Ьеи

СХи

Рго

РЬе

Азр

Бег

Ьеи

УаХ

Ьув

С1п

165 170 175

- 74 009216

ТЬг

ΗΪ5

Ча1

Рго 180

Азп

Ьеи

РЬе Зег Ьеи 185

Ηίβ

Ьеи Сув С1у А1а 190

С1у

РЬе

Рго

Ьеи

Авп

С1п

2ег

С1и

Ча1

Ьеи

А1а

Зег

Ча1

<31у

В1у

Зег

мес

Не

195

200

205

11е

С1у

Не

Авр

Η15

Зег

Ьеи

Туг

ТЬг

С1у

Зег

Ьеи

Тгр

туг

ТЬг

210

215

220

Рго

11е

Агд

<31и

Тгр

Туг

С1и

Ча1

Не

Ча1

Агд

Ча!

С1и

225

230

235

240

Не

Азп

С1у

С1п

Авр

Ьеи

Ьув

Мес

Авр

Суз

Ьув

01и

Туг

Авп

Туг

Авр

245

250

255

Ьуа

Бег

11е

Ча1

Аар

Бег

01у

ТЬг

Азп

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

Ьуз

Ьув

260

265

270

Ча1

РЬе

С1и

А1а

Ча1

Ьув

Зег

Не

ьуз

А1а

Зег

ТЬг

С1и

275

280

285

Ьуз

РЬе

Рго

Авр

С1у

РЬе

Тгр

Ьеи

01у

С1и

С1п

Ьеи

Ча1

сув

Тгр

С1п

2Э0

295

300

А1а

<31у

ТЬг

Рго

Тгр

Авп

Не

РЬе

Рго

Ча1

11е

Бег

Ьеи

Туг

Ьеи

305

310

315

320

МеС

01у

С1и

Ча1

ТЬг

Аап

С1п

Зег

РЬе

Агд

Не

ТЬг

Не

Ьеи

Рго

С1п

325

330

335

С1п

Туг

Ьеи

Агд

Рго

Ча1

С1и

Авр

Ча1

А1а

ТЬг

Зег

С1п

Аар

Авр

Сув

340

345

350

Туг

Ьув

РЬе

А1а

Не

Бег

<31п

Зег

ТЬг

<31у

ТЬг

Ча1

МеС

С1у

А1а

355

360

365

Ча1

11е

МеС

С1и

С1у

РЬе

Туг

Ча1

РЬе

Азр

Агд

А1а

Агд

Ьув

Агд

370

375

ЗВО

Пе

01у

РЬе

А1а

Ча1

Зег

А! а

Суа

Н1в

Ча1

Ηίε

Аар

О1и

РЬе

Агд

ТЬг

385

390

395

400

А1а

Ча!

С1и

С1у

Рго

РЬе

Ча1

ТЬг

Ьеи

Аар

Мес

01и

Азр

Суа

С1у

405

410

415

Туг

Азп

11е

Рго

<31п

ТЬг

Аар

<31и

Зег

420

425

- 75 009216 <210> 29 <211> 1362 <212> ДНК <213> Человек (Ното зар!епз) <400> 29 аЕддсссаад сссЕдсссЕд дсЕссЕдсЕд ЕддаЕдддсд сдддадЕдсЕ дссЕдсссас 60 ддсасссадс асддсаЕссд дсЕдссссЕд сдсадсддсс Еддддддсдс сссссЕдддд 120 сЕдсддсЕдс сссдддадас сдасдаадад сссдаддадс ссддссддад дддсадсЕЕЕ 180 дЕддадаЕдд ЕддасаассЕ даддддсаад Есддддсадд дсЕасгасдЕ ддадасдасс 240 дЕдддсадсс ссссдсадас дсЕсаасаЕс сЕддЕддаЕа саддсадсад ЕаасЕЕЕдса 300 дЕдддЕдсЕд ссесссассс сЕЕссЕдсаЕ сдсЕасЕасс ададдсадсЕ дЕссадсаса 360 Еассдддасс Еседдааддд ЕдЕдЕаЕдЕд сссЕасассс адддсаадЕд ддааддддад 420 сЕдддсассд ассЕддЕаад саЕсссссаЕ ддссссаасд есассдЕдсд ЕдссаасаЕЕ 480 дсЕдссаЕса сЕдааЕсада саадЕЕсЕЕс аЕсаасддсЕ ссаасСддда аддсаЕссЕд 540 дддсЕддссЕ аЕдсЕдадаЕ ЕдссаддссЕ дасдассссс ЕддадссЕЕЕ сЕЕЕдасЕсЕ 600 СЕддЕааадс адасссасдЕ ЕсссаассЕс ЕЕсЕссссдс ассЕЕЕдЕдд ЕдсЕддсЕЕс 660 ссссЕсаасс адЕсЕдаадЕ дсЕддссЕсЕ дЕсддаддда дсаЕдаСсаЕ ЕддаддЕаЕс 720 дассасЕсдс ЕдЕасасадд садЕсЕсЕдд ЕаЕасассса Ессддсддда дЕддЕаЕЕаЕ 780 даддЕсаЕса ЕЕдЕдсдддЕ ддадаЕсааЕ ддасаддаЕс ЕдааааЕдда сЕдсааддад 840 ЕасаасЕаЕд асаададсаЕ ЕдЕддасадЕ ддсассасса ассЕЕсдЕЕЕ дсссаадааа 900 дЕдЕЕЕдаад сЕдсадЕсаа аЕссаЕсаад дсадссЕссЕ ссасддадаа дЕЕСссЕдаЕ 960 ддЕСЕсЕддс Еаддададса дсЕддЕдЕдс Еддсаадсад дсассасссс ЕЕддаасаЕЕ 1020 ЕЕсссадЕса ЕсЕсасЕсЕа ссЕааЕдддЕ даддЕЕасса ассадЕссЕЕ ссдсаЕсасс 1080 аЕссЕЕссдс адсааЕассЕ дсддссадЕд даадаЕдЕдд ссасдЕссса адасдасЕдЕ 1140 ЕасаадЕЕЕд ссассЕсаса дЕсаСссасд ддсасЕдЕЕа ЕдддадсЕдЕ ЕаЕсаЕддад 1200 ддсЕЕсЕасд ЕЕдЕсЕЕЕда Есдддсссда ааасдааЕЕд дсЕЕЕдсЕдЕ садсдсЕЕдс 1260 саЕдЕдсасд аЕдадЕЕсад дасддсадсд дЕддааддсс сЕЕЕЕдЕсас сЕЕддасаЕд 1320 даадасЕдЕд дсЕасаасаЕ Ессасадаса даЕдадЕсаЕ да 1362 <210> 30 <211> 453 <212> Белок <213> Человек (Ното зархепз) <400> 30

МеЕ

А1а

С1п

А1а

Ьеи

Рго

Тгр

Ьеи

Тгр

МеЕ

С1у

А1а

С1у

Уа1

1

5

10

15

Ьеи

Рго

А1а

Н15

<31у

ТЬг

С1п

Ηίβ

С1у

Не

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

Агд

Зег

20

25

30

<31у

Ьеи

С1у С1у

А1а

Рго

Ьеи

С1у

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

Агд

С1и

ТЬг

Азр

35

40

45

<Э1и

С1и

Рго

С1и

<31 и

Рго

<31у

Агд

О1у

Зег

РЬе

Уа1

С1и

МеЕ

Уа1

- 76 009216

55 60

Азр Азп Ьеи 65

Агд

С1у Ьуз Зег С1у 01п С1у Туг Туг Уа1 (31и МеС ТЫ

70

75

80

νβΐ

С1у

Зег

Рго

С1п

ТЫ

Ьеи

Азп

Не

Ьеи

Уа1

Авр

ТЬг

С1у

Зег

85

90

95

Зег

АЗП

РЬе

А1а

Уа1

С1у

А1а

Рго

Н1з

Рго

РЬе

Ьеи

ΗΪ3

Агд

Туг

100

105

но

Туг

С1п

Агд

С1п

Ьеи

Зег

ТЫ

Туг

Агд

Азр

Ьеи

Агд

Ьуз

С1у

Уа1

115

120

125

Туг

Уа1

Рго

Туг

ТЫ

С1п

(Пу

Ьуз

Тгр

<31и

С1у

<31и

Ьеи

С1у

ТЬг

Азр

130

135

140

Ьеи

Уа1

Зег

Не

Рго

ΗΪ8

б1у

Рго

Азп

Уа1

ТЬг

Уа1

Агд

А1а

Азп

Не

145

150

155

160

А1а

Не

ТЬг

С1и

Зег

Азр

Ьуз

РЬе

Не

Азп

С1у

Зег

Азп

Тгр

165

170

175

С1и

С1у

Не

Ьеи

С1у

Ьеи

А1а

Туг

А1а

С1и

Не

А1а

Агд

Рго

Азр

180

185

190

Зег

Ьеи

б1и

Рго

РЬе

Азр

Зег

Ьеи

νβΐ

Ьуз

<31п

ТЫ

Н1з

Уа1

Рго

195

200

205

Азп

Ьеи

РЬе

Зег

Ьеи

С1п

Ьеи

Суз

<31у

А1а

(31у

РЬе

Рго

Ьеи

Азп

С1п

210

215

220

Зег

□1и

νβΐ

Ьеи

А1а

Зег

Уа1

С1у

<31у

Зег

МеС

Не

<31у

С1у

Не

225

230

-

235

240

Азр

ΗΪ5

Зег

Ьеи

Туг

ТЫ

С1у

Зег

Ьеи

Тгр

Туг

ТЬг

Рго

Не

Агд

245

250

255

С1и

Тгр

Туг

Т“уг

С1и

Уа1

Не

Уа1

Агд

Уа1

С1и

Не

Азп

С1у

С1п

260

265

270

Азр

Ьеи

Ьуз

МеС

Азр

Суз

Ьуз

С1и

Туг

Азп

Туг

Азр

Ьуз

Зег

Не

Уа1

275

280

285

Азр

Зег

61у

ТЫ

ТЬг

Азп

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

Ьуз

Уа1

РЬе

С1и

А1а

290

295

300

А1а

7а1

Ьуз

Зег

11с

Ьуз

А1а

Зег

ТЫ

С1и

Ьуз

РЬе

Рго

Азр

- 77 009216

305

310

315

320

С1у

РЬе

Тгр

Ьеи

С1у

С1и

С1п

Ьеи

Уа1

Суг

тгр

С1п

А1а

С1у

ТЫ

ТЬг

325

330

335

Рго

Тгр

А5П

11е

РЬе

Рго

νβΐ

11е

Бег

Ьеи

Туг

Ьеи

МеС.

С1у

С1и

Уа1

340

345

350

ТЫ

Азп

<31 η

Бег

РЬе

Агд

Не

ТЫ

11е

Ьеи

Рго

<?1п

С1п

Туг

Ьеи

Агд

355

360

365

Рго

νβΐ

(Ни

Агр

Уа1

А1а

ТЬг

Бег

С1п

Агр

Суз

Туг

Ьув

РЬе

А1а

370

375

380

Не

Бег

С1п

Бег

ТЫ

С1у

ТЬг

Уа1

Мес

<31у

А1а

Уа1

11е

МеС

С1и

385

390

395

400

С1у

РЬе

Туг

Уа1

νβΐ

РЬе

Агр

Агд

А1а

Агд

Ьуз

Агд

11 е

С1у

РЬе

А1а

405

410

415

Уа1

Бег

А1а

Суз

Ηίδ

Уа1

Н1в

Агр

С1и

РЬе

Агд

ТЬг

А1а

ν31

С1и

420

425

430

С1у

Рго

РЬе

Уа1

ТЬг

Ьеи

Агр

МеС

С1и

Азр

Суг

□1у

Туг

Азп

11е

Рго

435

440

445

<31п ТЫ Адр С1и Бег

450 <210>31 <211>1380 <212> ДНК <213> Человек (Ното зар!епз) <400> 31 асддсссаад ссссдсссСд дсСссСдсСд ЕддаСдддсд сдддадСдсС дссСдсссас60 ддсасссадс асддсаСссд дсСдссссСд сдсадсддсс сддддддсдс сссссСдддд120 ссдсддсЕдс сссдддадас сдасдаадад сссдаддадс ссддссддад дддеадсссс180 дсддадасдд сддасаассс даддддсаад ссддддсадд дсСассасдс ддадасдасс240 дСдддсадсс ссссдсадас дсСсаасаСс сСддсддаСа саддсадсад саассссдса300 дсдддсдссд ссссссассс ссссссдеас сдсс.асСасс ададдсадсс дСссадсаеа360

Сассдддасс сссддааддд ЕдСдСаСдСд ссссасассс адддсаадСд ддааддддад420 ссдддсассд ассСддСаад саСсссссаС ддссссаасд СсасСдСдсд СдссаасаСС480 дсСдссаСса сЕдааСсада саадЕСссЕс аЕсаасддсС ссаасСддда аддсаСссСд540 дддсСддссс аЕдсСдадаС Едссаддссс дасдасЕссс сддадссЕСС сСССдаессЕ600 ссддсааадс адасссасдС СсссаассСс ССсссссСдс асесссдсдд сдссддсСЕс660 ссссСсаасс адсосдаадс дсСддссСсс дссддаддда дсасдассас сддаддсасс720

- 78 009216 дассасЕсдс ЕдЕасасадд садЕсЕсЕдд ЕаЕасассса Ессддсддда дЕддЕаЕЕаЕ 780 даддЕсасса ЕЕдЕдсдддЕ ддадаЕсааЕ ддасаддаЕс ЕдааааЕдда сЕдсааддад 840 ЕасаасЕаЕд асаададсаЕ ЕдЕддасадЕ ддсассасса ассЕЕсдЕЕЕ дсссаадааа 900 дСдЕЕЕдаад сЕдсадЕсаа аЕссаЕсаад дсадссгссЕ ссасддадаа дЕЕсссЕдаЕ 960 ддЕЕЕсЕддс Еаддададса дсЕддЕдЕдс Еддсаадсад дсассасссс ЕЕддаасаЕЕ 1020 ЕЕсссадЕса ЕСЕсасЕсЕа ссЕааЕдддЕ даддЕЕасса ассадЕссЕЕ ссдсаЕсасс 1080 аЕссЕЕссдс адсааЕассЕ дсддссадЕд даадаЕдЕдд ссасдЕссса адасдасЕдЕ 1140 ЕасаадЕЕЕд ссаЕсЕсаса дЕсаЕссасд ддсасЕдЕЕа ЕдддадсЕдЕ ЕаЕсаЕддад 1200 ддсЕЕсЕасд ЕЕдЕСЕЕЕда Есдддсссда ааасдааЕЕд дсЕЕЕдсгдЕ садсдсЕЕдс 1260 саЕдЕдсасд агдадЕЕсад дасддсадсд дЕддааддсс сЕЕЕЕдЕсас сЕЕддасаЕд 1320 даадасЕдЕд дсЕасаасаЕ Ессасадаса даЕдадЕсас адсадсадса дсадсадсда 1380 <210> 32 <211> 459 <212> Белок <213> Человек (Ното зархепз) <400> 32

МеЕ Л1а 1

С1П А1а

Ьеи Рго Тгр Ьеи Ьеи Ьеи Тгр МеЕ <31у А1а 61у Уа1

5

10

15

Ьеи

Рго

А1а

ΗΪ3

С1у

ТЫ

<31п

Ηίβ

61у

11е

Агд

Ьеи

Рго

Ьеи

Агд

Бег

20

25

30

С1у

Ьеи

(31у

А1а

Рго

Ьеи

61у

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

Агд

(Пи

ТЬг

Азр

35

40

45

<31и

(31и

Рго

С1и

Рго

<31у

Агд

С1у

Бег

РЬе

Уа1

С1и

МеЕ

Уа1

50

55

60

Азр

Азп

Ьеи

Агд

С1у

Ьуз

Бег

С1у

С1п

С1у

Туг

Уа1

(Ии

МеЕ

ТЬг

65

70

75

80

Уа1

О1у

Бег

Рго

С1п

Т»рг

Ьеи

Азп

Пе

Ьеи

Уа1

Азр

ТЫ

61у

Бег

85

90

95

Бег

Азп

РЬе

А1а

17а1

61у

А1а

Рго

Ηίβ

Рго

рИе

Ьеи

Ηίβ

Агд

Туг

100

105

но

Туг

61п

Агд

С1п

Ьеи

Бег

ТЫ

Туг

Агд

Азр

Ьеи

Агд

Ьув

О1у

Уа1

115

120

125

Туг

Уа1

Рго

Туг

ТЫ

Э1п

(31у

Ьуз

Тгр

<31и

61у

61ц

Ьеи

(31у

ТЬг

Азр

130

135

140

Ьеи

Уа1

Бег

11е

Рго

Ηίβ

(Пу

Рго

Азп

Уа1

ТЬг

Уа1

Агд

А1а

Азп

11е

145

150

155

160

- 79 009216

А1а

Не ТЬг (Пи 165

Бег

Азр Ьуз

РЬе РЬе Не Азп С1у Бег Азп Тгр

170

175

С1и

С1у

Не

Ьеи

О1у

Ьеи

А1а

Туг

А1а

С1и

Не

А1а

Агд

Рго

Азр

180

185

190

Бег

Ьеи

(Пи

Рго

РЬе

Азр

Бег

Ьеи

Уа1

Ьуз

С1п

ТЬг

ΗΪ3

Уа1

Рго

195

200

205

Азп

Ьеи

РЬе

Бег

Ьеи

С1п

Ьеи

Сув

С1у

А1а

(31у

РЬе

Рго

Ьеи

Азп

(Нп

210

215

220

Бег

С1и

Уа1

Ьеи

А1а

Бег

Уа1

(Ну

С1у

Бег

Мес

11е

Не

(Пу

С1у

Не

225

230

235

240

Азр

Н1з

Бег

Ьеи

Туг

ТЬг

(Ну

Бег

Ьеи

Тгр

Туг

ТЬг

Рго

Не

Агд

245

250

255

С1и

Тгр

Туг

С1и

Уа1

Не

Уа1

Агд

Уа1

С1и

Не

Азп

<31у

С1п

260

265

270

Азр

Ьеи

Ьуз

«ее

Азр

Суз

Ьув

(Ни

Туг

Азп

Туг

Азр

Ьуз

Бег

Не

Уа1

275

280

285

Азр

Бег

С1у

ТЬг

ТЬх

Азп

Ьеи

Агд

Ьеи

Рго

Ьуз

Уа1

РЬе

С1и

А1а

290

295

300

А1а

Уа1

ьуз

Бег

11е

ьуз

А1а

Зег

Бег

ТЬг

(Ни

Ьуз

РЬе

Рго

Азр

305

310

315

320

С1у

РЬе

Тгр

Ьеи

(Пу

С1и

С1п

Ьеи

Уа1

Суз

Тгр

С1п

А1а

О1у

ТЬг

ТЬх

325

330

335

Рхо

Тгр

Авп

Не

РЬе

Рго

Уа1

11е

Бег

Ьеи

Туг

Ьеи

МеС

О1у

С1и

Уа1

340

345

350

ТЬГ

Азп

С1П

Бег

РЬе

Агд

Не

ТЬх

Не

Ьеи

Рго

<Э1п

(Нп

Туг

Ьеи

Агд

355

360

365

Рхо

Уа1

(Пи

Азр

Уа1

А1а

ТЬг

Зег

С1п

Азр

Суз

Туг

Ьуз

РЬе

А1а

370

375

380

Не

Бег

<31п

Бег

ТЬг

С1у

ТЬг

Уа1

МеС

(Ну

А1а

Уа1

Не

Мес

<31 и

385

390

395

-

400

Б1у

РЬе

Туг

Уа1

РЬе

Азр

Агд

А1а

Агд

Ьуз

Агд

Не

(Пу

РЬе

А1а

405

410

415

- 80 009216

Уа1

Зег

А1а

Суз

ΗΪ&

Уа1

Н15

Азр

С1и

РЬе

Агд

ТЫ

А1а

Уа1

С1и

420

425

430

С1у

Рго

РЬе

Уа1

ТЬг

Ьеи

Азр

МеЕ

<51и

Азр

суз

С1у

туг

Азп

11е

Рго

435

440

445

<51п

ТЫ

Азр

С1и

Зег

Н1з

ΗΪ8

Н1з

ΗΪ8

Н13

Η13

450

455

<210>	33
<211>	25
<212>	Белок
<213>	Человек	(Ното зархепз)
<400> 33
Зег С1и	С1п С1п	Агд Агд Рго Агд Азр Рго С1и Уа1 Уа1 Азп Азр С1и

1	5	10	15
Зег Зег	Ьеи Уа1 Агд Ηίβ Агд Тгр	ЬуЗ
	20	25
<210>	34
<211>	19
<212>	Белок
<213>	Человек (Ното зархепе)

<400> 34

Зет С1и С1п Ьеи Агд С1п С1п Ηίε Азр Αερ РЬе А1а Αερ Азр 11е Зег

Ьеи Ьеи Ьуз

<210>	35
<211>	29
<212>	ДНК
<213>	Человек (Ното	зархепз)
<400>	35
дЕддаЕссас ссадсасддс	аЕссддсЕд	29
<210>	36
<211>	36
<212>	ДНК
<213>	Человек (Ното	зархепз)

- 81 009216 <400> 36 дааадсйййс айдасйсайс йдйсйдйдда айдййд <210>37 <211>39 <212> ДНК <213> Человек (Ното зархепз) <400> 37 дайсдайдас йайсйсйдас йсйссдсдйд аасаддасд39 <2Ю>39 <211>39 <212> ДНК <213> Человек (Ново зархепз) <400> 38 дайссдйссй дййсасдедд ададйсадад айадйсайс <210> 39 <211> 77 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Ни-Аер2 <400> 39 сддсайссдд сйдссссйдс дйадсддйсй дддйддйдсй ссасйдддйс йдсдйсйдсс 60 ссдддадасс дасдаад77 <210>40 <211>77 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Ни-Азр2 <400> 40 сййсдйсддй сйсссддддс адасдсадас ссадйддадс ассасссада ссдсйасдса 60

<210>

<211>

<212>

<213>

ДНК

Синтетическая последовательность

- 82 009216 <220>

<223> Описание синтетической последовательности: сайт расщепления сазразе 8 <400> 41 дассдасдас Саеесседас ьеессдсСдд ассседдсае сдааассдас д51 <210>42 <211>51 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<22 3> Описание синтетической последовательности: сайт расщепления сазраее 8 <400> 42 даСссдСсдд ссссдасасс ададсссадс ддададесад адаСадСсаС с51 <210>43 <211>32 <212> ДНК <213> Человек (Ното зархепз) <400> 43 ааддаСсссС Сдсддадасд дсддасаасс Сд32 <210>44 <211>36 <212> ДНК <213> Человек (Ното зархепа) <400> 44 дааадсГССс аЬдасСсаСс СдСсСдСдда аьдССд36 <210>45 <211>24 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: метка 6-Н±з <400> 45 дассдсаСса ссассассас саСд 24 <210> 46

- 83 009216 <211> 24 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: метка 6-Н±з <400> 46 даЕссаЕддЕ даЕддЕдаЕд аЕдс 24 <210> 47 <211> 22 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: элемент введения КК <400> 47 дасЕдассас ЕсдассаддЕ Ес22 <210>48 <211>51 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: элемент введения КК <400> 48 сдааЕЕаааЕ Ессадсасас ЕддссасЕЕс ЕсдЕЕсЕдса гсЕсааадаа с 51 <210> 49 <211> 26 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: элемент введения КК <400> 49 сдааЕЕаааЕ Ессадсасас ЕддсЕа 26

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ идентификации средства, которое модулирует активность аспартилпротеазы Азр2 человека, участвующей в процессинге предшественника амилоидного белка (АРР) в в-амилоид, включающий стадии:

(a) обеспечение контактирования Азр2 и ее субстрата АРР, содержащего сайт процессинга в-амилоида, в присутствии и в отсутствие исследуемого средства, где Азр2 кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизируется с последовательностью, комплементарной 8Е0 ΙΌ N0: 3 или 8Е0 ΙΌ Ν0: 5 в следующих жестких условиях гибридизации:

(1) гибридизация при 42°С в течение около 2,5 ч в 6х88С и 0,1% 8Ό8 и (2) промывка при 65°С в 1х88С и 0,1% 8Ό8; и (b) определение и сравнение соответствующих активностей Азр2 в отношении процессинга АРР в присутствии и в отсутствие исследуемого средства, где средство, которое является ингибитором Азр2, снижает активность процессинга АРР, а средство, которое является агонистом Азр2, повышает эту ак

- 84 009216 тивность.
2. Способ по п.1, где субстрат АРР содержит сайт, который расщепляется β-секретазой.
3. Способ по п.2, где указанный сайт расщепления содержит последовательность Р2-Р1-Э-А, где Р2 представляет собой К или Ν, а Р1 представляет собой М или Ь.
4. Способ по п.3, где сайт расщепления содержит последовательность КМЭА.
5. Способ по п.3, где сайт расщепления содержит последовательность ИЕ-ЭА.
6. Способ по п.2, где сайт расщепления содержит последовательность ЕУКМОАЕР.
7. Способ по п.2, где сайт расщепления содержит последовательность ЖУИЕОАЕРК.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где субстрат АРР содержит карбоксиконцевой дилизин (КК).
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где субстрат АРР включает в себя пептид, содержащий спаренный флуорофор и гаситель флуоресценции.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где АРР представляет собой изоформу АРР человека.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стадию (а) осуществляют в клетке, которая экспрессирует АРР.
12. Способ по п.11, где указанное определение активности Акр2 включает измерение продукции βамилоида клеткой в присутствии и в отсутствие исследуемого агента.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где Акр2 стадии (а) является очищенной или выделенной.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, где Акр2 содержит аминокислотную последовательность, которая представляет собой:

(a) 8Е0 ΙΌ ИО: 6 или ее фрагмент;

(b) 8Е0 ΙΌ ИО: 4 или ее фрагмент;

(c) последовательность, идентичную (а) или (Ь), за исключением консервативных замен.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, где Акр2 содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности БЕЦ ΙΌ ИО: 4, или 8ЕЦ ΙΌ ИО: 6, или их фрагментам, и где аминокислотная последовательность содержит трипептиды ЭТС и Ό8Ο активных сайтов аспартилпротеазы последовательностей 8ЕЦ ΙΌ ИО: 4 или 8ЕЦ ΙΌ ИО: 6.
16. Способ по п.15, где идентичность составляет по меньшей мере 95%.
17. Способ по п.15, где Акр2 содержит последовательность 8ЕЦ ΙΌ ИО: 4 или ее фрагмент.
18. Способ по п.17, где Акр2 содержит аминокислоты 93-291 последовательности 8ЕЦ ΙΌ ИО: 4.
19. Способ по п.15, где Акр2 содержит последовательность 8ЕЦ ΙΌ ИО: 6 или ее фрагмент.
20. Способ по п.19, где Акр2 содержит аминокислоты 93-266 последовательности 8ЕЦ ΙΌ ИО: 6.
21. Способ по любому из предшествующих пунктов, где Акр2 не содержит трансмембранного домена.
22. Выделенный или очищенный полипептид Акр2, который характеризуется признаками, раскрытыми в пп.14-21.
23. Выделенный или очищенный полинуклеотид, кодирующий полипептид Акр2 по п.22.
24. Полинуклеотид по п.23, который содержит полинуклеотиды 277-873 последовательности БЕЦ ΙΌ ИО: 3.
25. Полинуклеотид по п.23, который содержит полинуклеотиды 277-798 последовательности БЕЦ ΙΌ ИО: 5.
26. Полинуклеотид по п.23, который гибридизируется с последовательностью, комплементарной БЕЦ ΙΌ ИО: 3 или 8ЕЦ ΙΌ ИО: 5, в жестких условиях, определенных в п.1, и который кодирует Акр2, в которой отсутствует трансмембранный домен.
27. Полинуклеотид по любому из пп.23-26, который содержит последовательность, которая кодирует сигнальный пептид, слитый с полипептидом Акр2;

где сигнальный пептид обеспечивает внеклеточную секрецию Акр2 клеткой-хозяином, трансфицированной полинуклеотидом; и

Акр2 секретируется клеткой-хозяином.
28. Вектор, который содержит полинуклеотид по любому из пп.23-27.
29. Вектор по п.28, который является вектором экспрессии.
30. Вектор по п.29, в котором указанный полинуклеотид функционально связан с гетерологичным промотором и экспресируется в клетке-хозяине млекопитающего.
31. Вектор по п.30, в котором полинуклеотид функционально связан с гетерологичным промотором и экспрессируется в клетке-хозяине насекомого.
32. Клетка-хозяин, трасформированная или трасфицированная полинуклеотидом по любому из пп.23-27 или вектором по любому из пп.28-31.
33. Клетка-хозяин по п.32, которая является клеткой млекопитающего.
34. Способ получения полипептида Акр2 человека, включающий культивирование клетки-хозяина по п.32 или 33, в условиях, при которых клетка экспрессирует указанный полипептид.

- 85 009216
35. Способ по п.34. дополнительно включающий выделение полипептида из среды для роста клеток.
36. Способ идентификации средства. которое модулирует активность Акр2 человека. раскрытой в пп.14-21. который включает измерение и сравнение соответствующих активностей Акр2 в присутствии и в отсутствие исследуемого средства. где высокий уровень активности Акр2 в присутствии исследуемого средства указывает на то. что средство повышает активность Акр2. а более низкий уровень активности Акр2 указывает на то. что средство понижает активность Акр2.

АКХКСССАСТС^ССО^^ОСтаПССТКСТСТЗСТОЗСССАСГГСОСТССТССССССС И С А Ь А Р. АЬЬЬРЬЬАОМАЬЙА

СССС<РЗАрГТСССССССССССгсТГСАСаСТОССССТСС<55СТО<>еСОССОССАС<1ААС АРЕЬАРАРГТЬРЦЯУАААТК

ССХХГ17)С/ГПХХЮа1АССССОСаАСССО»»ССССТССейАССгССАСйСССАСОССТГС ΚννΑΡΤΡαΡΟΤΡΑΕλΗΛΟβί (х^^свссстсслмяжсстоосатсссссосаоасосссссААСТТсттокслтс ЛЬАЬЕРАЬАВРЛСААИРЬАМ

СТАСАСААССТскэиимасАСТСтоассамвстАстаеетваАЯА'гоствАтаязоАсс уоыьосввскиууьЕмьхст

ΡΡ(1ΚΙ.0ΙΙ<νΡΤββ5ΝΡΛνΛΟ ассссссаст^ стасатасасасстастттсаслсаслсасрзтстассасатасссстсс

ТРЯ371РТУРЦТЕЯ35ТУН5 ллс«р?гго1м:зтсАСАсталАОТАСлсАСААа<1ААаст(Х5АССсссттсст1ххюаАА κοΓπντνκγτοαεΜτβρνβΕ аАССТСаТСАССАТССССАААаСС'ГГСААТАСТТГТГГГС'ГРСТСААСА'ТТСССАеТАТТ ε Ь V Т I РКСРВТ5РЬУВ1АТ1 ти'вААгаилиААТПХГГПЯтисстамАтаААЛтоаААтааллтасттосссТАост РЕЗЕИЕР1,РС1КЫИС1ЬС1.А тлтоссАслстттсслАскатсАлоттсгстаслйлссттсттсалстссстостаАсл

ТАТЬАХР585ЪЕТЕЕ05Ь¥Т (1ААеСАААСАТССССААССтТтеТССАТКАаАТСТСТОаАССССССТТССССаГ1ССТ 0 а ν ι ΡΜνρίΜΟΜεοχαυρνΑ ашсткшсаидоэдаэдатсттотсттвавтваААтткмссмктпстАТААА сзатнссзъуьввтЕРзьук аСДСАСАТСТЮМТАесССХАТХШиХААСкСТОСТАСЛЪССЛаАПиШАПСТаААА аО1М¥ТР1КЕЕЯУУ81Е1ЬК

ТТХХ^ААТТОаА<ХИСЛ4ААСССТТМТСТЗОАСТОСА<;АСАСТА1ЛАСССЛСАСААСССС

ЬЕ1СС08ЬМ1.ПСЯЕУМАВКА АТСЗТООЛСАаГОвСАСХАСМТвСТОСОСС1вССССАШЙ<»ИОТТтаАТОС<»К«ТО

I ν05βΤΤΕϋΒΕ₽2ΚνΡϋΑνν <мииастзтоассс(косАТСТМгатгсст10Алттсгстситсаггтствмстсзатсс

ΕΑνΑΒλεείΡΕΡεϋβΡΗταε

СЛОСТСОССТССТОСАСвААТТСССАААСАС1.ТИДЛ'.1^,1ЛСТ1ССС'1АААЛТС'1ССАТС βΙ>λεΚΤΝ9ΕΤΡΗ5ϊΡΡΚΙ8]

ТАССТ«лаАаАто^1Алстссл1х^иэатс*ттсх?атАТСЛСААТСстосстсАастт1АС УЬВСЕН53В5РК1'Г1ЬРйЬУ лттоих^слтслтосоосхетжхстелАттатоАлта'тгАссмттсоасА’птссссА 1ЙРМИОАС1,Я¥ЕСУЯГС13Р тссАСАААтсаилпсттатсаи®ХА«1<и«АТ80Ааюст1«лсиКАТ1ЛТсалс

ΪΤΗλίνίΟΛΤνΜΕΟΓΥνίΡη АаюсссАтлшпймавсттакшжшзсссстатссАсгмпссмктостасА