EA008905B1

EA008905B1 - Вакцинная композиция на основе ганглиозидов для подкожного введения

Info

Publication number: EA008905B1
Application number: EA200501367A
Authority: EA
Inventors: Луис Энрике Фернандес Молина; Сирсе Меса Пардильо
Original assignee: Сентро Де Инмунология Молекулар
Priority date: 2003-02-27
Filing date: 2004-02-27
Publication date: 2007-08-31
Also published as: TWI344372B; UA80859C2; DE602004004768D1; DE602004004768T2; CN100418576C; ECSP055978A; EP1604683A2; JP2006519186A; CL2004000374A1; HRP20050763A2; UY28207A1; CA2535214A1; MY139811A; WO2004075811A2; CY1106668T1; PE20040955A1; BRPI0407854A; EG26446A; KR20060003857A; CU23257A1

Abstract

Изобретение относится к вакцинным композициям, в которых объединяют ганглиозиды и белковый комплекс наружной мембраны N. meningitidis (OMPC) с образованием протеолипосом очень малого размера (VSSP), предназначенным для подкожного введения. Для композиций согласно изобретению не требуется применения дополнительных адъювантов. Указанные композиции облегчают иммунологическое лечение с ганглиозидами, в частности N-AcGM3/VSSP и N-GcGM3/VSSP, что является преимущественным за счет менее выраженной воспалительной реакции в месте введения, и их можно легче использовать без дискомфорта для пациентов.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к вакцинным композициям для подкожного введения, содержащим ганглиозиды, пригодные для иммунологического лечения аутоиммунных заболеваний, инфекционных заболеваний и опухолей, без какого-либо дополнительного адъюванта.

Описание предшествующего уровня техники

Давно уже известно намерение использовать иммунологическое лечение для аутоиммунных заболеваний и опухолей, например, в патенте США № 4965198 описывается применение ганглиозида ОМ2 для профилактики и лечения таких заболеваний. В заявке на патент ЕР-А-661061 и в патенте США № 6149921 описаны вакцинные композиции для стимуляции или повышения ответной выработки антител против ганглиозида, который состоит из иммуногена и иммунологического адъюванта.

Описанными иммуногенами являются У88Р (протеолипосомы очень малого размера), полученные в результате ассоциации ганглиозидов Ν-ацетилОМЗ и Ν-гликолилОМЗ, в последующем обозначаемые как (Ν-АеОМЗ) и (Ν-ОсОМЗ), с другим белковым комплексом наружной мембраны (ОМР) из Белела тешпдШФк.

Такие иммуногены в последующем будут обозначаться как Б-АсСМ3/У88Р и Б-СсСМ3/У88Р; они имеют очень маленький размер и практически не видны под электронным микроскопом, растворимы в воде и обладают повышенной флотационной активностью.

Для вакцинных композиций, описанных в ЕР-А-661061 и патенте США № 6149921, необходимо использование адъюванта, такого как очень хорошо известный неполный адъювант Фрейнда.

В заявке на патент УО-А-02145746 описаны вакцинные композиции, содержащие (А) один или более антигенов с низкой иммуногенностью; (В) У88Р с включенными ганглиозидами, в основном ΝАсОМ3/У88Р и Б-СсСМ3/У88Р. и (С) в некоторых случаях один или более адъювантов.

В статье Сагг А. е! а1., опубликованной в журнале Ме1апота Кекеатсй, 2001, Уо1. 11, рр. 219-227, описана противоопухолевая активность вакцины, содержащей ганглиозид №АсОМ3, против меланомы В16, поддерживаемой у мышей.

В данной статье также оценивалось влияние присутствия иммунологического адъюванта, особенно полного адъюванта Фрейнда или неполного адъюванта Фрейнда, такого как Моп1ашбе 18А 51. Вакцины вводили внутримышечно, и было сделано заключение, что у мышей, иммунизированных ΝАсОМ3/У88Р с любым из адъювантов, Фрейнда или Моп1ашбе 18А 51, имела место ответная выработка 1дМ и анти-Ы-АсОМ3 1дО на 8 неделе (табл. 1). В отличие от этого, вакцина с Б-АсСМ3/У88Р без какого-либо адъюванта не вызывала ответной иммуногенной реакции (стр. 223, правая колонка).

Следовательно, в данной области установлено, что в состав вакцин, содержащих У88Р, конъюгированные с ганглиозидами, следует включать адъюванты, в основном адъювант Фрейнда (полный или неполный) или Моп1ашбе 18А 51.

Однако хорошо известно, что, когда их вводят парентерально, такие адъюванты, в частности полный адъювант Фрейнда, вызывают некоторые нежелательные побочные эффекты, такие как хроническое воспаление в месте инъекции, возможная гранулема и асептический абсцесс или язвенный некроз в тканях. Моп1ашбе 18А 51 является менее раздражающим, но также может вызвать некоторые воспалительные реакции.

Было бы желательно, с точки зрения их применений для иммунологического лечения аутоиммунных, инфекционных и злокачественных заболеваний, иметь новые вакцинные композиции на основе ганглиозидов, которые вызывали бы меньшее раздражение в месте инъекции и применение которых было бы более легким и удобным для пациентов.

Авторы настоящего изобретения установили, что вакцины на основе ганглиозидов с У88Р при подкожном введении можно использовать без каких-либо адъювантов, при сохранении соответствующих иммунологических свойств.

Предметом настоящего изобретения являются новые вакцинные композиции, включенные в У88Р, предпочтительно Б-АсСМ3/У88Р и №ОсОМ3/У88Р, которые не содержат какого-либо иммунологического адъюванта и вводятся подкожно.

Также предметом настоящего изобретения является способ лечения пациента, нуждающегося в усилении его иммунологического ответа, включающий в себя подкожное введение вакцинных композиций с ганглиозидами, предпочтительно Б-АсСМ3/У88Р и N-СсСМ3/V88Р. не содержащих какого-либо иммунологического адъюванта.

Также предметом настоящего изобретения являются вакцинные композиции с Б-АсСМ3/У88Р и/или N-СсСМ3/V88Р. не содержащие других антигенных компонентов, кроме ганглиозидов или какихлибо других иммунологических адъювантов, и которые вводят подкожно.

Подробное описание изобретения

Целевые вакцинные композиции согласно изобретению содержат раствор или дисперсию в воде одного или более ганглиозидов и его включение в ОМР Ν. тешпдйШк (У88Р), и они способны стимулировать иммунологический ответ при подкожном введении без дополнительного иммунологического адъюванта.

У88Р представляют собой высокостабильные ганглиозидные гидрофобные ассоциации с белковым

- 1 008905 комплексом наружной мембраны №188епа тешпдй1б18, без необходимости в ковалентных связях. Такие системы белки-ганглиозиды подробно описаны в патентах ЕР-А-661061 и И8-А-6149921, а также в других публикациях, например ЕЧсуех е1 а1., Уассте, 1999; Уо1. 18(1-2): рр. 190-197. В этих документах также описан способ их получения.

Среди ганглиозидов, включенных в У88Р, предпочтение отдается Ν-АсСМЗ и Ν-СсСМЗ. где ΝАс6М3 является особенно предпочтительным.

Подробное описание иммуногенности конъюгированных ганглиозидов, а также их применения в качестве противоопухолевых средств и стимуляторов приобретенного иммунитета можно найти в вышеуказанных документах и в обзоре Βίΐΐοη К. е1 а1., Опсо1о§у Керойз (2002), Уо1. 9, рр. 267-276, и в недавних сообщениях и материалах научных встреч, например 6-ого латиноамериканского конгресса по иммунологии, который проходил в Гаване 9 декабря 2002 года, сообщение 8аиге/ 6. е1 а1. Рйазе I сйшса1 1г1а1 о£ Ле дапд1ю81бе сапсег Уассше №АсеШ6М3/У88Р МоШашбе 18А 51 ίη абгапсеб Ьгеай сапсег раиепй.

Вакцинные композиции, не содержащие других антигенных компонентов, кроме ганглиозидов, являются предпочтительным предметом изобретения, где особенно предпочтительными являются содержащие уникальный иммуногенный компонент Ν-АсбМЗ Щ-АсОМ3/У88Р) и/или Ν-бСбМЗ (ΝОсОМ3/У88Р), где особенно предпочтительными являются содержащие только №АсОМ3/У88Р.

Целевые вакцинные композиции согласно изобретению представляют собой растворы или дисперсии в воде У88Р, которые в некоторых случаях могут содержать нетоксичные, не вызывающие раздражения, совместимые с водой растворители, обычно используемые в фармацевтических препаратах для парентерального введения, например это может быть полиэтиленгликоль.

Концентрация конъюгированных гликозидов в растворах и в дисперсиях в воде не является решающей и может находиться в пределах 0,03-3% (мас./об.), предпочтительно от 0,04 до 2,5% (мас./об.). Диапазон доз для п/к введения, используемых для данных вакцин согласно изобретению, составляет в пределах от 50 мкг до 2,4 мг, предпочтительно от 200 мкг до 2 мг.

Основное свойство вакцинных композиций, предмета настоящего изобретения, заключается в том, что они предназначены для подкожного введения без какого-либо дополнительного иммунологического адъюванта.

Иммунологические адъюванты часто используются в вакцинных композициях. Такие адъюванты способствуют проявлению иммуногенного действия различными путями созданием депо антигена в месте инъекции с освобождением или высвобождением антигена в систему кровообращения;

обеспечением того, чтобы антиген достиг селезенки и лимфатических узлов посредством образования масляных микрокапель, легко захватываемых макрофагами;

прямым или опосредованным активированием клеток, участвующих в иммунном ответе.

Наиболее известными иммунологическими адъювантами являются полный или неполный адъювант Фрейнда, МоШашбе 18А, адъюванты КтЫ, НиЩег'8 ТйетМах, соли алюминия, адъювант ОетЬи, 08-21 и т.д.

Совершенно неожиданно авторы настоящего изобретения установили, что, когда вакцины на основе ганглиозидов/У88Р вводят подкожно, то можно полностью исключить адъюванты. Это дает возможность, в отличие от предшествующего уровня, почти полностью исключить необходимость во внутримышечном введении.

Следовательно, настоящее изобретение имеет несомненные преимущества практически во всех случаях, когда это касается проблем с местным воспалением, возникающих в результате применения адъювантов. Этот способ вакцинации с ганглиозидами является простым, эффективным и вызывающим меньшее раздражающее действие у пациентов.

В последующих примерах включены сравнительные экспериментальные подробности, позволяющие продемонстрировать иммунологическую эффективность вакцинной композиции, не содержащей иммунологических адъювантов.

Пример 1.

Используя способ, описанный в примере 3 патента США № 6149921, готовили водную вакцинную композицию (Трис-НС1 буфер), содержащую 2,4 мг/мл №АсОМ3/У88Р. К аликвоте такой иммуногенной композиции добавляли такой же объем адъюванта МоШашбе 18А 51 (8еррю Рапе, Франция). Одновременно к другой аликвоте добавляли такой же объем Трис-НС1 буфера.

Получали две вакцинные композиции:

А: водный раствор, содержащий 1,2 мг/мл №АсОМ3/У88Р.

В: эмульсию вода/масло, содержащую 1,2 мг/мл №6сОМ3/У88Р.

Отбирали 50 мышей-самок С57ВЬ/6 с массой тела в пределах 18-20 г, и формировали 5 опытных групп по 10 животных в каждой.

Животным группы 1 (контроль) вводили внутримышечно на 0, 14, 28 и 42 дни 0,1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (РВ8).

Животным группы 2 вводили внутримышечно на 0, 14, 28 и 42 дни 0,1 мл вакцинной композиции В

- 2 008905 (120 мкг Ы-ЛсОМ3/У88Р).

Животным группы 3 (контроль) вводили подкожно на 0, 14, 28 и 42 дни 0,1 мл РВ8.

Животным группы 4 вводили подкожно на 0, 14, 28 и 42 дни 0,1 мл вакцинной композиции В (120 мкг де Ы-ОсОМ3/У88Р).

Животным группы 5 вводили подкожно на 0, 14, 28 и 42 дни 0,1 мл вакцинной композиции А (120 мкг де Ы-ЛсОМ3/У88Р).

Мышам всех групп прививали на 63 день 5х10³ клеток меланомы МВ16Б10 подкожно (0,2 мл).

С 0-го дня за мышами проводили индивидуальное наблюдение и дважды в неделю определяли следующие параметры: объем опухоли, выживаемость и время прогрессирования.

Были получены следующие результаты.

Объем опухоли

На фиг. 1 представлена кинетика роста опухолей у животных каждой опытной группы. Использовали тест Манн-Уитни с Ц-критерием (двухсторонний) для анализа статистической значимости в парных группах значений объема опухоли у каждого животного на 33 день после прививки опухоли.

Данный метод статистической обработки особенно подходит для оценки результатов опытов данного типа, где имеется естественная дисперсия данных, относящихся к биологическому событию.

Значение р представляет собой вероятность, связанную с практическим значением, рассчитанным для пробы, и позволяет определить близость значения альфа (достоверность), рассчитанного по графику, и реальных данных, подтверждающих исходную гипотезу (р>0,05).

Результаты представлены на фиг. 1 и в табл. 1.

Таблица 1

Влияние вакцинации на объем опухолей

Группы	Объем опухоли (см³)
33 сутки
Среднее значение	Значения р в тесте Манн-Уитни с Цкритерием (двухсторонним)
Группа 1	6,53	-
Группа 2	3, 99	0, 46^а
Группа 3	6, 63	-
Группа 4	4,11	0, 12^ь
Группа 5	1,89	0, 01^е

а - значение р, полученное в результате сравнения данных по группе 2 против данных по группе 1 Ъ - значение р, полученное в результате сравнения данных по группе 4 против данных по группе 3 с - значение р, полученное в результате сравнения данных по группе 5 против данных по группе 3

Данные, представленные на фиг. 1 и в табл. 1, свидетельствуют о том, что у мышей, вакцинированных целевой композицией согласно изобретению, имело место достоверное уменьшение объема опухолей по сравнению с животными других опытных и соответствующих контрольных групп.

Выживаемость

С помощью данного параметра оценивают способность вакцинации увеличивать продолжительность жизни у иммунизированных мышей с летальной опухолью, такой как МВ16. Данный параметр выражают в сутках по сравнению с выживаемостью необработанных животных. Для определения статистической значимости использовали тест Бод-рангов.

Полученные данные представлены на фиг. 2 и в табл. 2. В табл. 2 выражение “сравниваемая группа X” означает группу, которую сравнивают с каждой колонкой.

Таблица 2 Статистические данные по выживаемости, полученные с использованием теста Бод-рангов

Группы	Выживаемость (сутки)	Р (сравниваемая группа 1)	Р (сравниваемая группа 3)	Р (сравниваемая группа 5)
Среднее значение	Медиана
Группа 1	35	33	-	-	--
Группа 2	43	36	0,06	-	0,26
Группа 3	40	40	-	-	0, 002
Группа 4	42	40	-	0,53	0, 13
Группа 5	52	53	-	0, 002	-

- 3 008905

Полученные результаты показали, что у мышей, входящих в группу 5, вакцинированных подкожно целевой композицией согласно изобретению, имела место самая высокая выживаемость после прививки опухоли.

Время прогрессирования

Время прогрессирования представляет параметр, с помощью которого оценивают период, необходимый для определения опухолей у каждого животного отдельно, размеры которых определяли с момента прививки. Данные представлены в табл. 3.

Таблица 3

Статистические данные по времени прогрессирования, полученные с использованием теста Бод-рангов

Группы	Время прогрессирования (сутки)	Р (сравниваемая группа 1)	Р (сравниваемая группа 3)	Р (сравниваемая группа 5)
Среднее значение	Медиана
Группа 1	19	19	-	-	-
Группа 2	32	19	0,02	-	0,5
Группа 3	19	19		-	0, 004
Группа 4	23	19	-	0,5	0,06
Группа 5	37	26	-	0, 004	-

Для мышей, у которых не развивалась какая-либо опухоль на время окончания опыта, за время прогрессирования принимали 60 суток.

Удлинение времени прогрессирования объективно является параметром, очень желаемым для получения достоверных изменений в действии вакцины против опухолей, и согласно результатам, представленным в табл. 3, у животных группы 5, подкожно вакцинированных целевой композицией с У88Р согласно изобретению, были, соответственно, более положительные результаты.

Регрессия опухолей

В группах 4 и 5, соответствующих подкожной вакцинации с адъювантом и без него, у животных наблюдали регрессию опухолей. У животного в группе 4 опухоль определялась на 19 сутки после прививки, практически не увеличиваясь до 35 суток. При пальпации у мыши в группе 5 наличие опухоли определяли на 26 сутки после прививки, и были получены отрицательные результаты на 29 сутки.

Оценка в целом

Результаты опытов показывали, что целевая вакцинная композиция согласно изобретению повышала время выживания и время прогрессирования, одновременно достоверно снижая скорость роста опухолей по сравнению с животными контрольной группы, обработанными РБ8.

С другой стороны, введение вакцинной композиции, содержащей адъювант Моп1ашйе 18 А 51, оказывало защитное действие только при внутримышечном введении, показывая полное отсутствие эффективности при подкожном введении.

В заключении подкожная вакцинация целевыми вакцинными композициями согласно изобретению показывала более высокие результаты по сравнению с результатами, полученными при внутримышечном введении вакцинных композиций, содержащих адъювант типа Моп1ашйе.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлено графическое изображение роста объема опухолей у животных 5 групп, подвергшихся обработке различными вакцинами и прививке клеток злокачественных опухолей.

На фиг. 2 представлен график, позволяющий оценить параметр выживаемости у опытных животных 5 групп.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Вакцинная композиция, содержащая раствор или водную дисперсию одного или более ганглиозидов, заключенных в протеолипосомы очень малого размера (У88Р), отличающаяся тем, что указанные ганглиозиды выбраны из Ν-АсСМЭ и Ν-СсСМЗ и способны стимулировать иммунный ответ при подкожном введении без какого-либо дополнительного иммунологического адъюванта.
2. Вакцинная композиция по п.1, в которой ганглиозид, включенный в У88Р, представляет собой ΝАеОМ3.
3. Вакцинная композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве уникальных иммунологических компонентов она содержит ^АсСМ3/У88Р и/или ^СсСМ3/У88Р.
4. Вакцинная композиция по п.3, которая содержит в качестве уникального иммунологического

- 4 008905 компонента Ν-ΑοΟΜ3/ν88Ρ.
5. Применение вакцинной композиции по пп.1-4 для производства фармацевтической композиции для подкожного введения, используемого для лечения пациентов, нуждающихся в усилении их иммунологического ответа.