EA007005B1

EA007005B1 - Антитела против tnf, композиции, способы и применения

Info

Publication number: EA007005B1
Application number: EA200300243A
Authority: EA
Inventors: Джилл Джайлс-Комар; Дэвид М. Найт; Джордж Хивнер; Бернард Скаллон; Дэвид Шили
Original assignee: Сентокор, Инк.
Priority date: 2000-08-07
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2006-06-30
Also published as: DK3118318T3; WO2002012502A3; LTPA2010004I1; NO20030620L; PL206833B1; PT2330129T; UA81743C2; EP2330129B1; JP6449113B2; SI3118318T1; JP2016019519A; LTPA2019013I1; US7691378B2; JP2004523209A; BRPI0113110C1; MY157288A; EA200600126A1; DK2159230T3; NO2013012I1; ATE446367T1

Abstract

Настоящее изобретение относится по меньшей мере к одному из новых антител против TNF, в том числе, к выделенным нуклеиновым кислотам, кодирующим по меньшей мере одно антитело против TNF, векторам, клеткам-хозяевам, трансгенным животным или растениям, и способам их получения и применения.

Description

Настоящее изобретение относится к антителам, включая определенные части или варианты, специфичные для по меньшей мере одного белка фактора некроза опухоли альфа (ΤΝΕ) или его фрагмента, а также нуклеиновой кислоте, кодирующей такие антитела против ΤΝΕ, комплементарным нуклеиновым кислотам, векторам, клеткам-хозяевам и способам их получения и применения, включая лекарственные композиции, введение и устройства.

Уровень техники

ΤΝΕ-альфа представляет собой растворимый гомотример субъединиц белка массой 17 кД (8тйй е1 а1., 1. ΒίοΙ. Сйет., 262:6951-6954 (1987)). Также существует мембраносвязанная форма предшественника ΤΝΕ массой 26 кД (КпеДег е1 а1., Се11, 53:45-53 (1988)). Для общего представления о ΤΝΕ см. Веи11ег е1 а1., Хаиие 320:584 (1986); 01б, 8с1епсе, 230:630 (1986; и Ье е! а1., ЬаЬ. Шуей., 56:234 (1987).

Другие клетки, кроме моноцитов или макрофагов, также продуцируют ΤΝΕ-альфа. Например, ΤΝΕальфа продуцируют человеческие немоноцитарные клеточные линии опухоли (КнЬШ е1 а1., 1. Ехр. Меб., 164:1350 (1986); 8рпд§5 е1 а1., Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 84:6563 (1987)). Т-Лимфоциты периферической крови СБ4+ и СБ8+ и некоторые культивированные линии Т- и В-клеток (Си1шт е1 а1., 1. Ехр. Меб., 165:1581 (1987); 8ип§ е1 а1., 1. Ехр. Меб., 168:1539 (1988); Τιιιη'Γ е1 а1., Еиг. 1. 1ттипо1., 17:1807-1814 (1987)) также продуцируют ΤΝΕ-альфа.

ΤΝΕ-альфа оказывает провоспалительное действие, приводящее к повреждению тканей, такое как разрушение хрящей и костей (8ак1а1уа1а, №1иге, 322:547-549 (1986); ВейоНш, №Шге, 319:516-518 (1986)), индукции фактора адгезии, индукции прокоагулянтной активности на эндотелиальных клетках сосудов (РоЬег е1 а1., 1. 1ттипо1., 136:1680 (1986)), усилению прилипания нейтрофилов и лимфоцитов (РоЬег е1 а1., 1. 1ттипо1., 138:3319 (1987)), стимуляции высвобождения фактора активации тромбоцитов из макрофагов, нейтрофилов и эндотелиальных клеток сосудов (Сатикй е1 а1., 1. Ехр. Меб., 166:1390 (1987)).

Последние факты связывают ΤΝΕ-альфа с инфекционными заболеваниями (Сегат1 е1 а1., 1ттипо1. ГОбау, 9:28 (1988)), иммунными нарушениями, новообразованиями (011ГГ е1 а1., Се11, 50:555 (1987)), аутоиммунными нарушениями и реакцией «трансплатата против хозяина» (Р1дие1 е1 а1., 1. Ехр. Меб., 166:1280 (1987)). Связь ΤΝΕ-альфа со злокачественными и инфекционными заболеваниями часто относят к катаболическому состоянию хозяина. Больные злокачественными опухолями страдают от потери веса, как правило, связанной с анорексией.

Сильное истощение, связанное со злокачественными опухолями и другими болезнями, известно как кахексия (Кет е1 а1., 1. Рагеп1. Еп1ег. ΝιιΙγ.. 12:286-298 (1988)). Кахексия включает прогрессирующую потерю массы, анорексию и стойкую потерю недостаточной массы тела в ответ на рост злокачественной опухоли. Кахектическое состояние вызывает наибольшую болезненность и смертность при злокачественной опухоли. Имеются доказательства, что ΤΝΕ-альфа участвует в развитии кахексии при злокачественной опухоли, инфекционных заболеваниях и других каболических состояниях (см., например, Веи11ег апб Сегат1, Апп. Кеу. 1ттипо1., 7:625-655 (1989)).

Полагают, что ΤΝΕ-альфа играет центральную роль в грамотрицательном сепсисе и эндотоксическом шоке (МюШе е1 а1., Вг. 1. 8игд., 76:670-671 (1989); ИеЬе18 е1 а1., 8есопб У1еппа 81юск Вогит. р.463466 (1989); 81тр§оп е1 а1., Сгй. Саге С1Ш., 5:27-47 (1989)), включая лихорадку, недомогание, анорексию и кахексию. Эндотоксин сильно активирует продуцирование моноцитов/макрофагов и секрецию ΤΝΕальфа и других цитокинов (КогпЬ1и1й е1 а1., 1. 1ттипо1., 137:2585-2591 (1986)). ΤΝΕ-альфа и другие цитокины, образованные моноцитами, опосредуют метаболические и нейрогуморальные реакции на эндотоксин (М1сЫе е1 а1., Кеу Епд1. 1. Меб., 318:1481-1486 (1988)). Введение эндотоксина добровольцам вызывает острое заболевание с симптомами, напоминающими грипп, включая лихорадку, тахикардию, ускоренный метаболизм и выделение гормонов стресса (Кеуйаид е1 а1., Агсй. 8игд., 123:162-170 (1988)). У пациентов, страдающих от грамотрицательного сепсиса, увеличивается уровень ΤΝΕ-альфа в кровотоке (ХУааде е1 а1., Ьапсе1, 1:355-357 (1987); Наттег1е е1 а1., 8есопб У1еппа 81юск Вогит. р.715-718 (1989); БеЬе18 е1 а1., Сп1. Саге Меб., 17:489-497 (1989); Са1апбга е1 а1., 1. 1пГес1. ϋΐδ., 161:982-987 (1990)).

Таким образом, ΤΝΕ-альфа вовлекается в воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, вирусные, бактериальные и паразитарные инфекции, злокачественные опухоли и/или нейрогенеративные заболевания и является удобной мишенью для специфического биологического лечения при таких заболеваниях, как ревматоидный артрит и болезнь Крона. Сообщается о благоприятном действии при испытаниях с открытой меткой с химерными моноклональными антителами против ΤΝΕ-альфа (сА2) с подавлением воспаления и успешным повторным лечением после рецидива при ревматоидном артрите (ЕШой е1 а1., Аг£йп118 Кйеит., 36:1681-1690 (1983); и ЕШой е1 а1., Бапсе!, 344:1125-1127 (1994)) и при болезни Крона (Уап ЭнИетеп е1 а1., Са81гоеп1его1о§у, 109:129-135 (1995)). Также сообщается о благоприятных результатах при случайном двойном слепом плацебо-контролируемом испытании сА2 при ревматоидном артрите с подавлением воспаления (ЕШой е1 а1., Бапсе!, 344:1105-1110 (1994)). Антитела к веществу

- 1 007005 модулятору, который характеризуется как кахектин (обнаружено, что последний идентичен ΤΝΕ), описаны Сегаш1 е! а1. (публикация патента ЕРО 0212489, 4 марта 1987 г.). Такие антитела указаны как применимые при диагностических иммуноанализах и лечении шока при бактериальных инфекциях. ВиЬш е! а1. (публикация патента ЕРО 0218868, 22 апреля 1987 г.) описывают моноклональные антитела против ΤΝΡ человека, гибридомы, секретирующие такие антитела, способы получения таких антител и применение таких антител при иммуноанализе ΤΝΡ. Уоие е! а1. (публикация патента ЕРО 0288088, 26 октября 1988 г.) описывают антитела против ΤΝΕ, в том числе тАЬ, и их применимость для диагностики заболеваний методом иммуноанализа, в частности, болезни Кавасаки и бактериальной инфекции. Сообщается, что жидкости организма больных болезнью Кавасаки (острый лихорадочный синдром кожно-слизистых лимфоузлов у детей: Катакай Т., А11егду, 16:178 (1967); Катакай Т., 81юшса (Реб1а!пск), 26:935 (1985)) содержат повышенные концентрации ΤΝΡ, связанные с развитием патологии (Уоие е! а1., см. выше).

Другие исследователи описывают тАЬ, специфические для рекомбинатного ΤΝΡ человека, с нейтрализующей активностью ίη νίΐτο (Ыапд. С-М. е! а1., ВюсЬет. Вюрйук. Век. Сотт., 137:847-854 (1986); Меадег А. е! а1., НуЬпбота, 6:305-311 (1987); Еепб1у е! а1., НуЬпбота, 6:359-369 (1987); Вппдтап Τ.8. е! а1., НуЬпбота, 6:489-507 (1987); Ниш М. е! а1., 1. 1ттипо1. Ме!й., 96:57-62 (1987); Мо11ег А. е! а1., Су!окше, 2:162-169 (1990)). Некоторые из таких тАЬ использовали для картирования эпитопов ΤΝΕ человека и разработки иммуноферментных анализов (Еепб1у е! а1., см. выше; Н1га1 е! а1., см. выше; Мо11ег е! а1., см. выше) и для обеспечения очистки рекомбинантного ΤΝΡ (Вгшдтап е! а1., см. выше). Однако указанные исследования не обеспечивают основу для получения антител, нейтрализующих ΤΝΕ, которые можно использовать при диагностике ш νί\Ό или лечении людей, из-за иммуногенности, отсутствия специфичности и/или фармацевтической пригодности.

Показано, что нейтрализующие антисыворотки или тАЬ против ΤΝΕ у других млекопитающих, отличных от человека, отменяют вредные физиологические изменения и предупреждают гибель после летального заражения при экспериментальной эндотоксемии и бактериемии. Такое действие показано, например, при анализах летальности грызунов и на модельных системах болезни приматов (Ма!Ыкоп ЕС. е! а1., 1. С1ш. 1^ек!., 81:1925-1937 (1988); ВеиЙег В. е! а1. , 8с1епее, 229:869-871 (1985); Егаееу К.1. е! а1.. Ыа!иге, 330:662-664 (1987); 8Ытато!о Υ. е! а1., 1ттипо1. Ье!!., 17:311-318 (1988); 8ί1νη А.В е! а1., 1. 1пЕес!. Όίκ., 162:421-427 (1990); Ора1 8.М. е! а1., 1. 1пЕес!. Όίκ., 161:1148-1152 (1990); 11тк1ш\ Ь.В. е! а1., С1гс. 8йоск, 30:279-292 (1990)).

Предполагаемые локусы связывания рецепторов 11ΤΝΕ описываются Еск апб 8ргапд, 1. Вю1. Сйет., 264(29), 17595-17605 (1989), которые идентифицировали локусы связывания ΤΝΕ-а как состоящие из аминокислот 11-13, 37-42, 49-57 и 155-157. В заявке РСТ \У091/02078 (дата приоритета 7 августа 1989 г.) описываются лиганды ΤΝΕ, которые могут связываться с моноклональными антителами, имеющими следующие эпитопы: по меньшей мере один из 1-20, 56-77 и 108-127; по меньшей мере два из 1-20, 5677, 108-127 и 138-149; все из 1-18, 58-65, 115-125 и 138-149; все из 1-18 и 108-128; все из 56-79, 110-127 и 135- или 136-155; все из 1-30, 117-128 и 141-153; все из 1-26, 117-128 и 141-153; все из 22-40, 49-96 или 97, 110-127 и 136-153; все из 12-22, 36-45, 96-105 и 132-157; все как из 1-20, так и из 76-90; все из 22-40, 69-97, 105-128 и 135-155; все из 22-31 и 146-157; все из 22-40 и 49-98; по меньшей мере один из 22-40, 49-98 и 69-97, оба из 22-40 и 70-87.

Антитела млекопитающих, отличных от человека, химерные, поликлональные (например, антисыворотки) и/или моноклональные антитела (МаЬ) и фрагменты (например, продукты их протеолитического расщепления или их слитые белки) являются потенциальными лекарственными средствами, которые в ряде случаев исследуются с целью попытки лечения некоторых заболеваний. Однако такие антитела или фрагменты при введении людям могут дать иммунную реакцию. Такая иммунная реакция может привести к опосредуемому иммунным комплексом клиренсу антител или их фрагментов из кровообращения и сделать повторное введение неподходящим для лечения, что снижает лечебную пользу для пациента и ограничивается повторное введение антител или фрагментов. Например, повторное введение антител или фрагментов, содержащих части, не происходящие от человека, может привести к сывороточной болезни и/или анафилаксии. Для того, чтобы избежать указанных и других проблем, использован ряд подходов для снижения иммуногенности таких антител и их частей, включая химеризацию и гуманизацию, хорошо известные из уровня техники. Однако такие и другие подходы все еще могут привести к образованию антител или фрагментов с некоторой иммуногенностью, низкой аффинностью, низкой авидностью или к проблемам с культурами клеток, масштабированием, получением и/или низким выходом. Таким образом, такие антитела или фрагменты могут оказаться не идеально подходящими для получения или применения в качестве лекарственных белков.

Соответственно, существует потребность в создании антител против ΤΝΕ или фрагментов, преодолевающих большинство указанных проблем, а также превосходящих известные антитела или их фрагменты.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенным антителам человека, приматов, грызунов, млекопитающих, химерным, гуманизированным и/или СОВ-слитым антителам против ΤΝΕ, иммуноглобулинам, продуктам их расщепления и другим их специфическим частям и вариантам, а также к композициям

- 2 007005 с антителами против ΤΝΕ, кодирующим или комплементарным нуклеиновым кислотам, векторам, клеткам-хозяевам, композициям, составам, устройствам, трансгенным животным, трансгенным растениям и способам их получения и применения, описанным в данном описании, в сочетании с известным в технике.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному выделенному антителу против ΤΝΕ, описанному в данном описании. Антитело согласно настоящему изобретению включает любой белок или пептид, содержащий молекулу, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок (СЭВ) тяжелой цепи, или легкой цепи, или его лигандсвязывающую часть, вариабельную область тяжелой цепи, или легкой цепи, константную область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасный участок, или любую его часть, которые можно включить в антитело настоящего изобретения. Антитело изобретения может включать антитело или может происходить от любого млекопитающего, такого как человек, мышь, кролик, крыса, грызун, примат или другое млекопитающее, или любое их сочетание, и т. п.

Настоящее изобретение относится, в одном аспекте, к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, включающим, комплементарным или гибридизующимся с полинуклеотидом, кодирующим специфические антитела против ΤΝΕ, содержащим по меньшей мере одну его специфическую последовательность, домен, часть или вариант. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам, содержащим указанные молекулы нуклеиновых кислот антител против ΤΝΕ, клеткам-хозяевам, содержащим такие нуклеиновые кислоты и/или рекомбинантные векторы, а также к способам получения и/или применения таких нуклеиновых кислот антител, векторов и/или клеток-хозяев.

По меньшей мере одно антитело изобретения связывается по меньшей мере с одним специфическим эпитопом, специфическим по меньшей мере к одному белку ΤΝΕ, субъединице, фрагменту, части или любой их комбинации. По меньшей мере один эпитоп может содержать по меньшей мере один связывающийся с антителом участок, который содержит по меньшей мере одну часть указанного белка, и указанный эпитоп, предпочтительно, состоит из по меньшей мере 1-5 аминокислот из по меньшей мере одной его части, такой как по меньшей мере один функциональный, внеклеточный, растворимый, гидрофильный, внешний или цитоплазматический домен, указанного белка или любой его части.

По меньшей мере одно антитело может, необязательно, содержать по меньшей мере одну специфическую часть по меньшей мере одного гипервариабельного участка (СОЯ) (например, СЭВ1. СЭВ2 или СЭЯЗ вариабельной области тяжелой или легкой цепи) и/или по меньшей мере одну константную или вариабельную область каркасного участка или любую его часть. По меньшей мере одна аминокислотная последовательность антитела также может, необязательно, содержать по меньшей мере одну специфическую замену, вставку или делецию, описанные в данном описании или известные в технике.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному выделенному антителу против ΤΝΕ, описанному в данном описании, где антитело обладает по меньшей мере одной активностью, такой как, но не ограничиваясь этим, ингибирование индуцированных ΤΝΕ факторов адгезии клетки, ингибирование связывания ΤΝΕ с рецептором, улучшенным артритным индексом на мышиной модели (см., например, примеры 3-7). Антитело против ΤΝΕ можно, таким образом, скринировать на соответствующую активность известными методами, такую как биологическая активность в отношении белка ΤΝΕ и другую активность.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному антиидиотипическому антителу против ΤΝΕ по меньшей мере к одному антителу против ΤΝΕ настоящего изобретения. Антиидиотипическое антитело включает любой белок или пептид, содержащий молекулу, содержащую по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, например, но не ограничиваясь этим, по меньшей мере один гипервариабельный участок (СОЯ) тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина или его лигандсвязывающую часть, вариабельную область тяжелой или легкой цепи, константную область тяжелой или легкой цепи, каркасный участок, или любую его часть, которые можно ввести в антитело настоящего изобретения. Антитело изобретения может содержаться в или происходить от любого млекопитающего, такого как человек, мышь, кролик, грызун, примат или другое млекопитающее.

Настоящее изобретение относится, в одном аспекте, к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, содержащих, комплементарных или гибридизующихся с полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одно антиидиотипическое антитело против ΤΝΕ, содержащим по меньшей мере одну специфическую его последовательность, домен, часть или вариант. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам, содержащим указанные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антиидиотипическое антитело против ΤΝΕ, клеткам-хозяевам, содержащим такие нуклеиновые кислоты и/или рекомбинантные векторы, а также к способам получения и/или применения таких нуклеиновых кислот антиидиотипических антител, векторов и/или клеток-хозяев.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному способу экспрессии по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ, или антиидиотипического антитела против ΤΝΕ в клеткехозяине, включающему культивирование клеток-хозяев, как описывается в данном описании, в условиях, где по меньшей мере одно антитело против ΤΝΕ экспрессируется в количествах, которые можно обнаружить и/или извлечь.

- 3 007005

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, содержащей (а) выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против ΤΝΕ, и/или антитела, описанные в данном описании, и (Ь) подходящий носитель или разбавитель. Композиция также может содержать, необязательно, по меньшей мере одно другое соединение, белок или композицию.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному способу введения терапевтически эффективного количества антител против ΤΝΕ или композиции для модуляции или лечения по меньшей мере одного связанного с ΤΝΕ состояния в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, и/или введения до, после или во время такого состояния, как известно в технике и/или описано в данном описании.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, устройству и/или способу доставки терапевтически или профилактически эффективного количества по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному способу или композиции с антителами против ΤΝΕ для диагностики по меньшей мере одного связанного с ΤΝΕ состояния в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, и/или диагностики до, после или во время такого состояния, как известно в технике и/или описано в данном описании.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, устройству и/или способу доставки с целью диагностики по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ по настоящему изобретению.

Описание фигур

Фиг. 1 дает графическое представление, отражающее анализ способности тАЬ ΤΝν в супернатантах клеток гибридом ингибировать связывание ΤΝΕν с рецептором рекомбинантного ΤΝΕ. Различные количества супернатантаов клеток гибридом, содержащих известные количества тАЬ ΤΝν, предварительно инкубируют с фиксированной концентрацией (5 нг/мл) ¹²⁵1-меченного ΤΝΕν. Смесь переносят в 96-луночные планшеты ΘρΙίρΙαΙοδ. предварительно сенсибилизированные ρ55-δΓ2 - слитым белком рецептор рекомбинантного ΤΝΕ/Ι§0. Количество ΤΝΕν, связанного с рецептором р55 в присутствии тАЬ, определяют после вымывания несвязанного вещества и подсчета с использованием счетчика гаммаквантов. Хотя в данных экспериментах проверяли восемь образцов тАЬ ΤΝν, для простоты три тАЬ, идентичных, как показал анализ последовательности ДНК, одному из других тАЬ ΤΝν (см. раздел 5.2.2), на фигуре не указаны. Каждый образец испытывают дважды. Приведенные результаты являются характерными результатами двух независимых экспериментов.

Фиг. 2 показывает последовательности ДНК вариабельных областей тяжелой цепи тАЬ ΤΝν. Показанный ген зародышевой линии является геном ΌΡ-46. ΤΝν показывает, что приведенная последовательность является последовательностью ΤΝνΐ4, ΤΝνΐ5, ΤΝνΐ48 и ΤΝνΐ96. Первые три нуклеотида в последовательности ΤΝν определяют кодон инициации трансляции Меб Точки в последовательностях гена тАЬ ΤΝν показывают, что нуклеотид тот же, что и в последовательности зародышевой линии. Первые ΐ9 нуклеотидов (подчеркнуты) последовательностей ΤΝν соответствуют олигонуклеотиду, используемому для амплификации вариабельной области методом ПЦР (РСК). Начало трансляции аминокислоты (однобуквенная аббревиатура) со зрелого тАЬ показана только для гена зародышевой линии. Три домена СОК в трансляции аминокислоты зародышевой линии отмечены жирным шрифтом и подчеркнуты. Линии, отмеченные ΤΝνΐ48(β), показывают, что приведенная последовательность имеет отношение как к ΤΝνΐ48, так и к ΤΝνΐ48Ε. Бреши в последовательности ДНК зародышевой линии (СЦК3) имеют место из-за того, что последовательность неизвестна или не существует в гене зародышевой линии. Тяжелые цепи тАЬ ΤΝν используют соединяющий участок 16.

Фиг. 3 показывает последовательности ДНК вариабельных областей легких цепей тАЬ ΤΝν. Показанный ген зародышевой линии является характерным членом семейства человеческих генов Уд/38К с вариабельной областью каппа зародышевой линии. Точки в последовательностях гена тАЬ ΤΝν показывают, что нуклеотид тот же, что и в последовательности зародышевой линии. Первые ΐ6 нуклеотидов (подчеркнуты) последовательностей ΤΝν соответствуют олигонуклеотиду, используемому для ПЦРамплификации вариабельной области. Начало трансляции аминокислоты зрелого тАЬ (однобуквенная аббревиатура) показана только для гена зародышевой линии. Три домена СЭК в трансляции аминокислоты зародышевой линии отмечены жирным шрифтом и подчеркнуты. Линии, отмеченные ΤΝνΐ48(β), показывают, что приведенная последовательность имеет отношение как к ΤΝνΐ48, так и к ΤΝνΐ48Β. Бреши в последовательности ДНК зародышевой линии (СЭК3) имеют место из-за того, что последовательность неизвестна или отсутствуют в гене зародышевой линии. Легкие цепи тАЬ ΤΝν используют соединяющий участок 13.

Фиг. 4 показывает расшифрованные аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи тАЬ ΤΝν. Приведенные аминокислотные последовательности (однобуквенная аббревиатура) расшифрованы из последовательности ДНК, определенной как из неклонированных продуктов ПЦР, так и из клонированных продуктов ПЦР. Аминокислотные последовательности показаны по частям в доменах выделенной сигнальной последовательности (сигнал), каркасном участке (Ε^) и гипервариа

- 4 007005 бельном участке (СЭР). Аминокислотная последовательность для гена зародышевой линии ΌΡ-46 приводится на верхней линии для каждого домена. Точки показывают, что аминокислотная последовательность тАЬ ΤΝν идентична гену зародышевой линии. ТЫУ148(В) показывает, что приведенная последовательность имеет отношение как к ΤΝνΐ48, так и к ΤΝνΐ48Β. ΤΝν§ показывает, что приведенная последовательность имеет отношение ко всем тАЬ, если не приводится другая последовательность. Штрихи в последовательности зародышевой линии (ί.ΌΡ3) показывают, что последовательности неизвестны или не существуют в гене зародышевой линии.

Фиг. 5 показывает расшифрованные аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи тАЬ ΤΝν. Приведенные аминокислотные последовательности (однобуквенная аббревиатура) расшифрованы из последовательности ДНК, определенной как из неклонированных продуктов ПЦР, так и из клонированных продуктов ПЦР. Аминокислотные последовательности показаны по частям в доменах выделенной сигнальной последовательности (сигнал), каркасном участке (Р^) и гипервариабельном участке (СОВ). Аминокислотная последовательность для гена с легкой цепью типа Уд/38К приводится на верхней линии для каждого домена. Точки показывают, что аминокислота в тАЬ ΤΝν идентична гену зародышевой линии. ΤNV148(В) показывает, что приведенная последовательность имеет отношение как к ΤΝνΐ48, так и к ΤΝνΐ48Β. Все показывает, что приведенная последовательность имеет отношение к ΤΝνΐ4, ΤΝνΐ5, ΤΝνΐ48, ΤΝνΐ48Β и ΤΝνΐ86.

Фиг. 6 показывает схематические пояснения к экспрессирующим плазмидам тяжелой и легкой цепи, используемым для получения клеток С466, экспрессирующих τΤΝνΐ48Β. р1783 является плазмидой тяжелой цепи и р1776 является плазмидой легкой цепи. Кодирующие домены вариабельной и константной областей τΤΝνΐ48Β показаны черными участками. Иммуноглобулиновые энхансеры в интронах 1-С показаны серыми участками. Приводятся соответствующие сайты рестрикции. Плазмиды показаны ориентированными таким образом, что транскрипция генов АЬ происходит в направлении по часовой стрелке. Плазмида ρΐ783 имеет длину 19,53 т.п.н. и плазмида р1776 имеет длину 15,06 т.п.н. Полные нуклеотидные последовательности обеих плазмид известны. Кодирующую последовательность вариабельной области в р1783 можно легко заменить другой последовательностью вариабельной области тяжелой цепи посредством замены рестрикционного фрагмента ΒδίΧνί/ΒδίΒΙ. Кодирующую последовательность вариабельной области в р1776 можно заменить другой последовательностью вариабельной области посредством замены рестрикционного фрагмента 8а11/АП11.

Фиг. 7 дает графическое представление об анализе кривой роста пяти клеточных линий, продуцирующих τΤΝνΐ48Β. Культуры инициируют в день 0, высевая клетки в колбы Т75 в среды Ι5Ο+ΜΗΧ. и получают плотность жизнеспособных клеток 1,0 х 10⁵ клеток/мл в объеме 30 мл. Клеточные культуры, используемые для данных исследований, культивируют непрерывно, так как осуществляют трансфекции и субклонирование. В последующие дни клетки в Т-колбах тщательно ресуспендируют и извлекают аликвоты культуры в 0,3 мл. Исследования кривой роста заканчивают, когда число клеток падает ниже ΐ,5 х 10⁵ клеток/мл. Число живых клеток в аликвоте определяют путем исключения трипанового синего, и оставшуюся аликвоту хранят для последнего определения концентрации тАЬ. На всех аликвотах образцов одновременно осуществляют ЕЬ18А на человеческий 1§С.

Фиг. 8 показывает графическое сравнение скоростей роста клеток в присутствии различных концентраций МНХ для отбора. Субклоны клеток С466А и С466В распускают в свободных от МНХ средах (ΙΜΌΜ, 5% ΡΒ8, 2 мМ глутамина) и культивируют еще в течение двух суток. Затем обе клеточные культуры делят на три культуры, которые или не содержат МНХ, или содержат 0,2Х МНХ или 1Χ МНХ. На другой день культуры высевают в свежие колбы Т75 в исходной плотности ΐ х ΐ0⁵ клеток/мл, и клетки подсчитывают с интервалом в 24 ч в течение одной недели. Время удвоения в течение первых 5 суток вычисляют с использованием формулы в 8ΘΡ ΡΌ32.025 и показывают в виде столбцов.

Фиг. 9 дает графическое представление о стабильности продуцирования тАЬ со временем в двух клеточных линиях, продуцирующих τΤΝνΐ48Β. Субклоны клеток, культивируемых непрерывно с тех пор, как осуществляют трансфекции и субклонирование, используют для начала длительного культивирования в 24-луночных культуральных планшетах. Клетки культивируют в средах Ι5Ο с или без МНХ для отбора. Клетки непрерывно пересевают путем расщепления культур каждые 4-6 дней и сохранения новых жизнеспособных культур, в то время как прежние культуры истощаются. Аликвоты супернатанта отработанных клеток собирают сразу после истощения культур и хранят до определения концентраций тАЬ. На всех аликвотах образцов одновременно осуществляют ЕЬ18А на человеческий 1§С.

Фиг. 10 показывает изменение массы на мышиной модели артрита Τ§ 197 в ответ на антитела против ΤΝΡ настоящего изобретения по сравнению с контрольными антителами в примере 4. Для исследования на Τ§ 197 мышей в возрасте приблизительно 4 недель, основываясь на виде и массе тела, отбирают в одну из 9 обрабатываемых групп и обрабатывают однократным интраперитонеальным болюсом - в ΐ мг/кг или 10 мг/кг - ΡΒ8 Дульбекко (Ό-ΡΒ8) или антителами против ΤΝΡ настоящего изобретения (ΤΝνΐ4, ΤΝνΐ48 или ΤΝνΐ96). Когда массы анализируют как изменение по сравнению с массой до введения, животные, обработанные ΐ0 мг/кг сА2, на протяжении всего исследования последовательно показывают более высокое прибавление массы, чем животные, обработанные Ό-ΡΒ8. Такое прибавление мас

- 5 007005 сы существенно в недели 3-7. Животные, обработанные 10 мг/кг ΤΝΎ148, также достигают существенного прибавления массы на неделе 7 исследования.

Фиг. 11, А-С, представляют развитие тяжести заболевания на основании артритного индекса, как представлено в примере 4. Артритный индекс группы, обработанной 10 мг/кг сА2, ниже, чем у контрольной группы с Ό-ΡΒ8, начиная с недели 3 и на протяжении остальной части исследования (неделя 7). Животным, обработанным 1 мг/кг ΤΝΎ14, и животным, обработанным 1 мг/кг сА2, после 3 недели не удается показать значительное снижение ΑΙ по сравнению с группой, обработанной Ό-ΡΒ8. Нет существенного различия между группами, обработанными 10 мг/кг, при сравнении групп с подобными дозами друг с другом (10 мг/кг сА2 по сравнению с 10 мг/кг ΤΝΥ14. 148 и 196). Когда сравнивают группы, обработанные 1 мг/кг, группа, обработанная 1 мг/кг ΤΝν148, показывает существенно более низкий ΑΙ, чем обработанная 1 мг/кг сА2, на 3, 4 и 7 неделях. Обработка 1 мг/кг ΤΝν148 также дает существенно более низкий ΑΙ, чем в группах, обработанных 1 мг/кг ΤΝν14, на 3 и 4 неделях. Хотя ΤΝν196 показывает существенное снижение ΑΙ до 6 недели исследования (при сравнении с группой, обработанной Ό-ΡΒ8), значимой в заключение исследования признана только обработка 1 мг/кг ΤΝν148.

Фиг. 12 показывает изменение массы на мышиной модели артрита Τ§ 197 в ответ на антитела против ΤΝΓ настоящего изобретения по сравнению с контрольными антителами в примере 5. Для исследования на Τ§ 197 мышей в возрасте приблизительно 4 недель, основываясь на виде и массе тела, отбирают в одну из 8 обрабатываемых групп и обрабатывают интраперитонеальным болюсом контрольного вещества (Ό-ΡΒ8) или антителами (ΤΝν14, ΤΝν148) в 3 мг/кг (неделя 0). Инъекции повторяют всем животным в недели 1, 2, 3 и 4. Группы 1-6 оценивают на эффективность испытываемого вещества. Образцы сывороток, полученные от животных групп 7 и 8, оценивают на индукцию иммунной реакции и фармакокинетический клиренс ΤΝν14 или ΤΝν148 в недели 2, 3 и 4.

Фиг. 13, А-С, являются графиками, представляющими развитие тяжести заболевания в примере 5 на основании артритного индекса. Артритный индекс группы, обработанной 10 мг/кг сА2, значительно ниже, чем у контрольной группы с Ό-ΡΒ8, начиная с недели 2 и на протяжении остальной части исследования (неделя 5). Животным, обработанным 1 мг/кг или 3 мг/кг сА2, и животным, обработанным 3 мг/кг сА2 ΤΝν14, не удается достичь значительного снижения ΑΙ в любое время исследования по сравнению с контрольной группой, обработанной Ό-ΡΒ8. Животные, обработанные 3 мг/кг ΤΝν148, показывают значительное снижение при сравнении с группой, обработанной Ό-ΡΒ8, на недели 3 и далее до недели 5. Животные, обработанные 10 мг/кг сА2, показывают значительное снижение ΑΙ при сравнении с обеими более низкими дозами (1 мг/кг и 3 мг/кг) сА2 в недели 4 и 5 исследования, а также существенно более низкий ΑΙ, чем у животных, обработанных ΤΝν14, в недели 3-5. Хотя существенных различий между любыми группами, обработанными 3 мг/кг, не выявлено, ΑΙ для животных, обработанных 3 мг/кг ΤΝν14, в некоторые моменты времени существенно выше, чем при обработке 10 мг/кг, в то время как животные, обработанные ΤΝν148, существенно не отличались от животных, обработанных 10 мг/кг сА2.

Фиг. 14 показывает изменение массы на мышиной модели артрита Τ§ 197 в ответ на антитела против ΤΝΓ настоящего изобретения по сравнению с контрольными антителами в примере 6. Для исследования на Τ§ 197 мышей в возрасте приблизительно 4 недель, основываясь на виде и массе тела, отбирают в одну из 6 обрабатываемых групп и обрабатывают однократным интраперитонеальным болюсом антител (сА2 или ΤΝν148), или в 3 мг/кг, или в 5 мг/кг. В данном исследовании используют контрольные группы, обработанные Ό-ΡΒ8 и 10 мг/кг сА2.

Фиг. 15 представляет развитие тяжести заболевания на основании артритного индекса, как представлено в примере 6. Все обрабатываемые группы показывают некоторую защиту в более ранние моменты времени, причем обработанные 5 мг/кг сА2 и 5 мг/кг ΤΝν148 показывают значительное снижение ΑΙ в недели 1-3, и все обработанные группы показывают значительное снижение ΑΙ в неделю 2. Позднее при исследовании животные, обработанные 5 мг/кг сА2, показывают некоторую защиту со значительным снижением в недели 4, 6 и 7. Низкая доза (3 мг/кг) как сА2, так и ΤΝν148, показывает существенное снижение в 6 неделю, и все обработанные группы показывают существенное снижение в неделю 7. Ни одна из обработанных групп не способна сохранить существенное снижение в заключение исследования (неделя 8). Нет существенных различий между какими-либо обработанными группами (за исключением контрольной группы с физиологическим раствором) в какой-либо момент времени.

Фиг. 16 показывает изменение массы на мышиной модели артрита Τ§ 197 в ответ на антитела против ΤΝΓ настоящего изобретения по сравнению с контрольными антителами в примере 7. Сравнивают эффективность однократного интраперитонеального болюса ΤΝν148 (полученного из клеток гибридомы) и τΤΝν148Β (полученного из трансфицированных клеток). Для исследования на Τ§ 197 мышей в возрасте приблизительно 4 недель, основываясь на виде и массе тела, отбирают в одну из 9 обрабатываемых групп и обрабатывают однократным интраперитонеальным болюсом ΡΒ8 Дульбекко (Ό-ΡΒ8) или антителами (ΤΝν148, τΤΝν148Β) в 1 мг/кг.

Фиг. 17 представляет развитие тяжести заболевания на основании артритного индекса, как представлено в примере 7. Артритный индекс группы, обработанной 10 мг/кг сА2, ниже, чем контрольной группы с Ό-ΡΒ8, начиная с недели 4 и на протяжении остальной части исследования (неделя 8). Как группы, обработанные ΤΝν148, так и группа, обработанная 1 мг/кг сА2, показывают значительное сни

- 6 007005 жение ΑΙ в неделю 4. Хотя предыдущее исследование (Р-099-017) показало, что ΤΝνΐ48 несколько эффективнее в отношении снижения артритного индекса после однократного интраперитонеального болюса в 1 мг/кг, данное исследование показывает, что ΑΙ групп, обработанных обоими вариантами антител ΤΝν, несколько выше. Хотя (за исключением недели 6) в группе, обработанной 1 мг/кг сА2, нет существенного повышения по сравнению с группой, обработанной 10 мг/кг сА2, и в группах, обработанных ΤΝνΐ48, происходит некоторое повышение в недели 7 и 8, существенных различий в ΑΙ при обработке 1 мг/кг сА2, 1 мг/кг ΤΝν148 и 1 мг/кг ΤΝν148Β, не имеется в любой момент исследования.

Описание изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенным, рекомбинантным и/или синтетическим антителам против ΤΝΡ человека, приматов, грызунов, млекопитающих, химерным, гуманизированным и/или СЭЯслитым антителам против ΤΝΡ и антиидиотипическим антителам ΤΝΡ к ним, а также к композициям и кодирующим молекулам нуклеиновых кислот, содержащих по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одно антитело против ΤΝΡ или антиидиотипическое антитело. Настоящее изобретение также относится, но не ограничивается перечисленным, к способам получения и применения таких нуклеиновых кислот и антител и антиидиотипических антител, включая диагностические и терапевтические композиции, способы и устройства.

Используемые в данном описании термины антитело против фактора некроза опухоли альфа, антитело против ΤΝΡ, часть антитела против ΤΝΡ или фрагмент антитела против ΤΝΡ и/или вариант антитела против ΤΝΡ и подобные термины относятся к любому белку или пептиду, содержащему молекулу, которая содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, такую как по меньшей мере один гипервариабельный участок (СИЯ) тяжелой или легкой цепи или его лигандсвязывающую часть, вариабельная область тяжелой или легкой цепи, константная область тяжелой или легкой цепи, каркасный участок, или любую ее часть, или по меньшей мере одну часть рецептора ΤΝΡ или связывающего белка, которую можно ввести в антитело настоящего изобретения. Такое антитело также, необязательно, может воздействовать на специфический лиганд, такой, но не ограничиваясь этим, где такое антитело модулирует, снижает, повышает, выступает антагонистом, агонистом, смягчает, облегчает, блокирует, ингибирует, нейтрализует, препятствует, или иным образом воздействует на по меньшей мере одну активность или связывание ΤΝΡ, или на активность или связывание рецептора ΤΝΡ ίη νίίτο, ίη Ли и/или ίη νίνο. В качестве примера, не являющегося ограничением, подходящее антитело против ΤΝΡ, специфическая часть или вариант по настоящему изобретению может связываться с по меньшей мере одним ΤΝΡ или его специфическими частями, вариантами или доменами. Подходящее антитело против ΤΝΡ, специфическая часть или вариант также могут, необязательно, воздействовать на по меньшей мере одну активность или функцию ΤΝΡ, такую как синтез РНК, ДНК или белка, высвобождение ΤΝΡ, передача сигнала рецептором ΤΝΡ, расщепление мембраны ΤΝΡ, активность ΤΝΡ, продуцирование и/или синтез ΤΝΡ, или другую активность или функцию. Также подразумевается, что термин анти-тело охватывает антитела, фрагменты их расщепления, специфические части и варианты, включая миметики антител или части антител, имитирующие строение и/или функцию антитела или его специфического фрагмента или его части, включая одноцепочечные антитела и их фрагменты. К функциональным фрагментам относятся антигенсвязывающие фрагменты, связывающиеся с ΤΝΡ млекопитающего. Например, изобретением охватываются фрагменты антител, способные связываться с ΤΝΡ или его частью, в том числе РаЬ (например, при расщеплении папаином), РаЬ' (например, при расщеплении пепсином и частичном восстановлении) и Р(аЬ')₂ (например, при расщеплении пепсином), £асЬ (например, при расщеплении плазмином), рРс' (например, при расщеплении пепсином или плазмином), Рб (например, при расщеплении пепсином, частичном восстановлении и реагрегации), фрагменты Ρν или 5сРу (например, методами молекулярной биологии), и другие фрагменты (см., например, СоШдап, 1тшипо1оду, см. выше).

Такие фрагменты можно получить ферментативным расщеплением, синтетическими или рекомбинантными методами, известными в технике и/или описанными в данном описании. Антитела также можно получить во многих процессированных формах с использованием генов антител, в которых один или несколько стоп-кодонов введены в обратном направлении естественного сайта терминации. Например, можно создать комбинированный ген, кодирующий часть тяжелой цепи Р(аЬ')₂, для включения последовательностей ДНК, кодирующих СН₁-домен и/или шарнирную область тяжелой цепи. Различные части антител можно соединить химически обычными методами или методами генной инженерии можно получить белок с определенной последовательностью.

Используемый в данном описании термин человеческое антитело относится к антителу, в котором, по существу, каждая часть белка (например, СИЯ, каркасный участок, домены С_ъ, С_Н (например, С_Н1, С_Н2, С_Н3), шарнир (Уь, ν_Η)) является неиммуногенной для людей только с незначительными изменениями или вариациями последовательности. Подобным образом, антитела, называемые антителами приматов (обезьяны, бабуина, шимпанзе и т.п.), грызуна (мыши, кролика, морской свинки, хомяка и т.п.) и других млекопитающих, означают такие специфические антитела вида, подрода, рода, подсемейства, семейства. Кроме того, химерные тела включают любую комбинацию вышеназванных антител. Такие изменения или вариации, необязательно и предпочтительно, сохраняют или снижают иммуногенность в отношении людей или других видов, по сравнению с немодифицированными антителами. Таким обра

- 7 007005 зом, человеческие антитела отличаются от химерных или гуманизированных антител. Отмечается, что человеческие антитела могут продуцироваться животными, не относящимися к человеку, или прокариотическими, или эукариотическими клетками, способными экспрессировать гены функциональности реаранжированного иммуноглобулина человека (например, тяжелой цепи и/или легкой цепи). Кроме того, когда человеческое антитело представляет собой одноцепочечное антитело, оно может содержать линкерный пептид, не обнаруживаемый в нативных человеческих антителах. Например, Εν может содержать линкерный пептид, такой как от двух до примерно восьми остатков глицина или других аминокислот, связывающий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Считают, что такие линкерные пептиды происходят от человека.

Можно также использовать биспецифические, гетероспецифические, гетероконъюгированные или подобные антитела, являющиеся моноклональными, предпочтительно человеческими антителами или гуманизированными, обладающие специфичностями связывания с по меньшей мере двумя различными антигенами. В данном случае одна из специфичностей связывания существует для по меньшей мере одного белка ΤΝΕ, другая специфичность - для любого другого антигена. Способы получения биспецифических антител известны в технике. Традиционно, рекомбинантное получение биспецифических антител основывается на совместной экспрессии двух пар тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, где две тяжелые цепи имеют различные специфичности (Мбйеш аиб Сие11о, ΝηΙιιΐΌ. 305:537 (1983)). Из-за случайного выбора тяжелых и легких цепей иммуноглобулина такие гибридомы (квадромы) продуцируют возможную смесь молекул 10 различных антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка нужных молекул, которую обычно проводят на стадиях аффинной хроматографии, весьма громоздкая, а выход продукта низкий. Подобные процедуры описываются, например, в νθ 93/08829, патентах США №№ 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, νθ 91/00360, νθ 92/00373, ЕР 03089, Тгаииескег е1 а1., ЕМВО 1., 10:3655 (1991), Зигекй е1 а1., Ме1йобк ίη Епгуто1оду, 121:210 (1986), включенных в данное описание в качестве ссылок.

Антитела против ΤΝΕ (также называемые антителами против ΤΝΕ), полезные в способах и композициях настоящего изобретения, можно, необязательно, охарактеризовать высокой аффинностью связывания с ΤΝΕ и, необязательно и предпочтительно, как имеющие низкую токсичность. В частности, в настоящем изобретении полезны антитела, специфические фрагменты или варианты по изобретению, где отдельные компоненты, такие как вариабельная область, константная область и каркасный участок, отдельно и/или коллективно, необязательно и предпочтительно, обладают низкой иммуногенностью. Антитела, которые можно использовать в изобретении, необязательно, характеризуются своей способностью оказывать лечебное действие на пациентов в течение длительного периода с поддающимся оценке смягчением симптомов и низкой и/или приемлемой токсичностью. Низкая или приемлемая иммуногенность и/или высокая аффинность, а также другие подходящие свойства, могут вносить вклад в достигаемые результаты лечения. Низкая иммуногенность в данном случае определяется как появление достаточных реакций НАНА, НАСА или НАМА у менее 75% или предпочтительно у менее 50% пациентов, которых лечат, и/или появление у пациента низких титров (менее примерно 300, предпочтительно менее примерно 100, при измерении иммуноферментным анализом методом двойных антигенов) (ЕШой е1 а1., Ьаисе1, 344:1125-1127 (1994), работа включена в данное описание в качестве ссылки).

Применимость

Выделенные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно использовать для получения по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ или его специфического варианта, которые можно использовать для измерения или воздействия на клетку, орган или животное (включая млекопитающих и людей), для диагностики, контроля, модуляции, лечения, облегчения, в помощь для предупреждения распространения или ослабления симптомов по меньшей мере одного связанного с ΤΝΕ состояния, выбранного из числа по меньшей мере одного иммунного нарушения или заболевания, сердечно-сосудистого нарушения или заболевания, инфекции, злокачественности и/или неврологического нарушения или заболевания, и других расстройств и заболеваний.

Такой способ может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело против ΤΝΕ, в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, нуждающемуся в такой модуляции, лечении, облегчении, предупреждении или ослаблении симптомов, действий или механизмов. Эффективное количество может включать количество в примерно 0,001-500 мг/кг на однократное (например, болюсное), многократное или непрерывное введение, или для достижения концентрации в сыворотке 0,01-5000 мкг/мл сыворотки на однократное, многократное или непрерывное введение, или в любом эффективном интервале или величине в нем, установленных и определенных с использованием известных способов, описанных в данном описании или известных в технике.

Ссылки

Все публикации или патенты, цитированные в данном описании, включены в него в качестве ссылок, так как указывают на состояние уровня техники на момент создания настоящего изобретения, и/или относятся к описанию и возможностям настоящего изобретения. Публикации относятся к любым науч

- 8 007005 ным и патентным публикациям или любой другой информации, доступной в любом информационном формате, включая все записанные, электронные или печатные форматы. Перечисленные далее работы включены в данное описание в качестве ссылок. Ли5иЬс1 е! а1., Сиггеп! Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν. ίοΐιη У11еу & 8опк, 1пс., ΝΥ, ΝΥ (1987-2001); 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота!огу Мапиа1, 2'¹ Еб1ίίοη, Со1б 8рбпд НагЬог, ΝΥ (1989); Наг1оте апб Ьапе, АпбЬоб1ек, а ЬаЬота1огу Мапиа1, Со1б 8рбпд НагЬог, ΝΥ (1989); СоШдап е! а1., ебк., Сиггеп! Рго!осо1к ίη 1ттипо1о§у, боПп \УПеу & 8опк, 1пс., ΝΥ (1994-2001); СоШдап е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к ίη Рто!еш 8аепсе, боПп \Убеу & 8опк, 1пс., ΝΥ, ΝΥ (1997-2001).

Антитела настоящего изобретения

По меньшей мере одно антитело против ΤΝΕ настоящего изобретения может, необязательно, продуцироваться клеточной линией, смешанной клеточной линией, иммортализованной клеточной линией или клональной популяцией иммортализованных клеток, хорошо известных в технике. См., например, АикиЬе1 е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, бойп У11еу & 8опк, 1пс., ΝΥ, ΝΥ (1987-2001); 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг Сбогипд: А ЬаЬота!огу Мапиа1, 2пб Ебйюп, Со1б 8рбпд НагЬог, ΝΥ (1989); Наботе апб Ьапе, Ап!1Ьоб1ек, а ЬаЬота!огу Мапиа1, Со1б 8рбпд НагЬог, ΝΥ (1989); СоШдап е! а1., ебк., Сиггеп! Рго!осо1к ίη 1ттипо1о§у, бо11п \УПеу & 8опк, 1пс., ΝΥ (1994-2001); СоШдап е! а1., Сиггеп! Рго!осо1к ίη Рго!еш 8с1епсе, бо11п \Убеу & 8опк, 1пс., ΝΥ, ΝΥ (1997-2001); работы включены в данное описание в качестве ссылок.

Человеческие антитела, специфические к белкам ΤΝΕ человека или их фрагментам, можно создать против соответствующего иммунногенного антигена, такого как выделенный белок ΤΝΕ и/или его часть (включая синтетические молекулы, такие как синтетические пептиды). Подобным образом можно создать генерализованные антитела других млекопитающих. Получение иммунногенных антигенов и получение моноклональных антител можно осуществить с использованием любых подходящих методов.

При одном из подходов получают гибридому посредством слияния подходящей иммортализованной клеточной линии (например, миеломной клеточной линии, такой как, но без ограничений, 8р2/0, 8р2/0-АС14, Ν8Θ, Ν81, Ν82, АЕ-1, Ь.5, >243, Р3Х63А§8.653, 8р2 8А3, 8р2 МА1, 8р2 881, 8р28А5, И937, МЬА 144, АСТ IV, МОЬТ4, ЭА-1, 1ИВКАТ, УЕН1, К-562, СО8, ВАЛ, МН 3Τ3, НЬ-60, МЬА 144, ЫАМАПУЛ, ΝΕυΚΌ 2А или подобной, или другой, или гетеромиелом, продуктов их слияния или любых образованных из них гибридных клеток) или любой подходящей клеточной линии, известной в технике (см., например, тетете.а!сс.огд, тетете.1бе!есй.сот., и т.п.), с клетками, продуцирующими антитела, такими как, без ограничений, выделенные или клонированные клетки селезенки, периферической крови, лимфы, миндалин или другие В-клетки, или любыми другими клетками, экспрессирующими константную или вариабельную области или каркасный участок или последовательности СЭВ тяжелой или легкой цепи, или эндогенные или гетерологичные нуклеиновые кислоты, такие как рекомбинантные или эндогенные, вирусные, бактериальные, водорослей, прокариотические, амфибий, насекомых, рептилий, рыб, млекопитающих, грызунов, лошадиные, овечьи, козьи, приматов, эукариотические, геномная ДНК, кДНК, рДНК, митохондриальная ДНК или РНК, хлоропластовая ДНК или РНК, гяРНК, мРНК, тРНК, одноцепочечные, двухцепочечные или трехцепочечные, гибридизированные и т.п., или любое их сочетание. См., например, АикиЬе1, см. выше, и СоШдап, 1ттипо1оду, см. выше, глава 2 включена в данное описание в качестве ссылки.

Клетки, продуцирующие антитела, также можно получить из периферической крови или, предпочтительно, селезенки или лимфоузлов людей или других подходящих животных, иммунизированных представляющими интерес антигенами. Любую другую подходящую клетку-хозяина также можно использовать для экспрессии гетерологичной или эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело настоящего изобретения, его специфический фрагмент или вариант. Слитые клетки (гибридомы) или рекомбинантные клетки можно выделить с использованием условий селективного культивирования или других известных способов, и клонировать путем предельного разведения или сортировки клеток или другими известными способами. Клетки, продуцирующие антитела с нужной специфичностью, можно отобрать подходящим методом анализа (например, ЕЫ8А).

Можно использовать другие подходящие способы получения или выделения антител с требуемой специфичностью, включая, но не ограничиваясь ими, способы, при которых отбирают рекомбинантные антитела из библиотеки пептидов или белков (например, библиотеки бактериофагов, рибосом, олигонуклеотидов, РНК, кДНК или подобной, или другой библиотеки; например, доступной от СатЬббде апбЬобу Τес11ηο1οβ^ек. СатЬббдекЫте, иК; Могр1о8ук, Мабткте1б/Р1апедд, ΌΕ; Вюуабоп, АЬегбееп, 8со!1апб иК; Вю1пуеп!, Ьипб, 8тееебеп; Эуах Согр., Епхоп, АЛутах/Вюкйе; Хота, Вегке1у, СА; 1хкук. См., например, ЕР 368684, РСТ/СВ91/01134; РСТ/6В92/01755; РСТ/СВ92/002240; РСТ/6В92/00883; РСТ/СВ93/00605; и8 08/350260(5/12/94); РСТ/СВ94/01422; РСТ/СВ94/02662; РСТ/6В97/01835; (САΤ/МВС); УО90/14443; УО90/14424; УО90/14430; РСТ/и894/1234; УО92/18619; УО96/07754; (8сбррк); ЕР 614989 (Могр1о8ук); УО95/16027 (ВЫпуеп!); УО88/06630; УО90/3809 (Эаух); и8 4704692 (Еп/оп); РСТ/и891/02989 (АЛутах); УО 89/06283; ЕР 371998; ЕР 550400; (Хота); ЕР 229046; РСТ/и8 91/07149 (1хкук); или стохастически полученных пептидов или белков - и8 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, УО 86/05803, ЕР 590689 (1хкук, теперь Аррйеб Мо1еси1аг Еуо1и!юп (АМЕ)), все включены в настоящее описание в качестве ссылок, или способы, имеющие в основе иммунизацию

- 9 007005 животных (например, мышей 8СГО, Хдиуеп е! а1., М1егоЫо1. 1ттипо1., 41:901-907 (1997); БапбЬи е! а1., Сп!. Кеу. Вю!есйпо1., 16:95-118 (1996); Егеп е! а1., 1ттипо1., 93:154-161 (1998), все работы включены в настоящее описание в качестве ссылок, как и патенты и заявки), способных продуцировать спектр человеческих антител, известные в технике и/или описанные в данном описании. Такие методы включают воспроизведение рибосом (Напев е! а1., Ргос. Νη11. Асаб. 8ст И8А, 94:4937-4942 (Мау 1997); Напев е! а1., Ргос. Ν!1. Асаб. 8ст И8А, 95:14130-14135 Щоу. 1998)); технологии получения антител из малого числа клеток (например, ве1ес!еб 1утрйосу!е апйЬобу тебюб (ЗЬАМ) (патент США № 5627052), \¥еп е! а1., б. 1ттипо1., 17:887-892 (1987); Вабсоок е! а1., Ргос. Ν!1. Асаб. 8ск И8А, 93:7843-7848 (1996)); метод микрокапелек в геле и проточную цитометрию (Ротее11 е! а1., Вю!есйпо1. 8:333-337 (1990); Опе Се11 8ув!етв, СатЬпбде, МА; Огау е! а1., Птт. Ме!й. 182:155-163 (1995); Кеппу е! а1., Вю/Тесйпо1. 13:787-790 (1995)0; В-се11 ве1ес!юп (§!еепЬаккегв е! а1., Мо1ес. Вю1. Керог1в 19:125-134 (1994); бопак е! а1., Ргодгевв Вю!есй, Уо1. 5, 1п У1!го 1ттиш/а!юп ш НуЬпбота Тес11по1оду, ВоггеЬаеск, еб., Е1веу1ег 8с1епсе РиЬНвЬегв В.У., Атв!егбат, №!йег1апбв (1988)).

Способы конструирования или гуманизации антител, отличных от человека и человека, также можно использовать, и они хорошо известны в технике. Как правило, гуманизированное или сконструированное антитело содержит один или несколько аминокислотных остатков из источника, не являющегося человеком, например крысы, кролика, не являющегося человеком примата или другого млекопитающего. Такие аминокислотные остатки часто называют импортными остатками, взятыми, обычно, из импортной вариабельной, константной или другой области известной последовательности человека. Известные последовательности человеческого 1д описываются, например, в

1¥5лплг.псЬ1.п1т.п1Ъ.8ОУ/еп1ге^иегу.Гся1; хууду.а1сс.ог§/рйа§е/Ис1Ь.й1:т1; \уулу.вс1дие51.сот/; \¥\уду.аЪсат.сот/; \¥^лу.апНЬо<1уге5оигсе.сот/оп1тесогпр.й1т1; хуу^.риЫюлавШе.ебиЛфебго/гевеагсИДоок.Ыгп!; улщу.т^еп.итйе10е1Ьег£.бе/8О/П7ГГ±1гп1; \УХу\у,\уЫгеетап.сот/1тп1пипо1о§у/СН05/киЬу05.Ь11п; ий¥ХУ.НЬгагу.1Ыпкрие81.огд/12429/1ттипе/Ап{1Ьобу.Мтп1;

^^й¥^.Ь1шц.ог§/8гап{8/1ес1иге8/199б/у1аЬ/; 5учду.рай1.сат.ас.ик/~тгс7/т1ке1та§е5.1111п1; иэуту.апйЬобугевоигсе.сот/;

тсЬ.йагуагб.еби/В1оЕткз/1ттипо1о£у.й1т1.\у\¥УУлпттшю1о£у1тк.согп/;

раШЪох.ууизЙ .еди/~ксеп1егЛп(1ех.Ыт1; \УХУ\у.Ыо1еск.иЯ.е0и/~Ис1/;

\¥Л¥\у.реЬ1о.сот/ра/340913/340913.1йт1; \у\уулпа1.шба.£ОУ/аху1с/риЬУапйЬо<1у/; \у\¥У/.т.еЫте-и.ас^р/~уавиййо/ЕИ5а.й1т1; упу\у.Ыо0е51^.соп1/1аЫе.а8р; ^,«ллп¥Лспе1.ик/ахр/£асз/(1аУ1е8/1тк5.Ыт1; хуулу.Ъю1есй.и£1.еби/~£сс1/рго1осо1.111п11; νπνιν.κβοпеГ.ог&/вйе5_£ео.Ь1т1; ахпп! 1 лт1.ип1-тагЬиг2.0е/~гек/АЕР51а1Т±1т1;

Ьавегу.исткип.пк-рта^/Нпкз! .И1т1; УЛУ^.гесаЬ.ит-йб.бе/ттипо.Ьте.пуги.еби/; \¥УЛУ.тгс-сре.сат.ас.ик/1т1-бос/риЫ1с/ПЧТКО.Ь1т1; \ууу^лЬСипат.тх/Уг/У_гтсе.к1т1; пп§1:.спи5с.£г:8104/; 5хг«п¥.Ь1’оскет.ис1.ас.ик/~тагНп/аЬ5/т<1ех.Ыт1; апБЬобу.ЬаЙтас.ик/; аЬееп.сУЛ1.1ати.е<1и/1аЪ/5¥ипуаЪ£еп.Ь1т1;

хуху\у.1Ш12Й.с11/~110пе^ег/АН05ет1паг/811<1еО 1 .Ь1т1; АУ%пу.С1у51.ЬЬк.ас.ик/~иЬсе07а/; х¥Уй¥.штг.1пгс.ас.ик/СС/ссае^¥8/ссаешв.Ь1т;

5¥«йУ.ра±.сат.ас.ик/~тгс7Л1итат5а110п/ТАННР.Ь1т1;

5¥«пулЪ1.ипат.п1х/У1г/51гис1иге/8и1_а1П1.Ыт1; хутУАУ.Ь1О5С1.т15вошт.еби/втйй^/тбех.й1т1; ^ту1¥.сгу51.Ь1ос.сат.ас.ик/~йпоНпаЛ¥еЬ-раде8/Рер1/5ройесЬ.Ыт1;

хуипу.]епт.(1е/&_рго<1ис18.Ь1т; утт¥.ра1еп18лЪт.сот/1Ьт.И1т1.КаЪа1 е1 а1., Зециепсеа о£

Рго1етз о£1тт.1то1о§1са1 Ιηΐετβδζ и.З. ϋβρί. НеаШ1 (1983) которые все полностью включены в данное описание в качестве ссылок.

Такие импортированные последовательности можно использовать для снижения иммуногенности или ослабления, усиления или изменения связывания, аффинности, ускорения, замедления, авидности, специфичности, времени полужизни или любых других подходящих характеристик, как известно в тех

- 10 007005 нике. Как правило, сохраняются часть или все отличные от человеческих и человеческие СЭК. в то время как отличные от человеческих последовательности вариабельной и константной областей заменяются на человеческие или другие аминокислоты. Антитела также можно. необязательно. гуманизировать с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для того. чтобы достичь такой цели. гуманизированные антитела можно. необязательно. получить способом анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов обычно доступны и знакомы специалистам в данной области техники. Доступны компьютерные программы. иллюстрирующие и отображающие трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей-кандидатов иммуноглобулинов. Просмотр таких отображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании последовательностей-кандидатов иммуноглобулинов. т.е. проанализировать остатки. влияющие на способность иммуноглобулина-кандидата связываться со своим антигеном. Таким образом. можно выбрать остатки РК из консенсусной и импортной последовательностей и соединить. так что достигаются нужные характеристики антител. такие как повышенная аффинность в отношении антигена(ов)-мишени(ей). Как правило. остатки СОК прямо и весьма существенно вовлекаются во влияние на связывание антигена. Гуманизицию или инженерию антител настоящего изобретения можно осуществить с использованием любого известного способа. такого как способы. описанные в Жп!сг Допев с! а1.. №!игс. 321:522 (1986); Й1сеЬтапп с! а1.. №1игс. 332:323 (1988); Усгйосусп с! а1.. 8с1спсс. 239:1534 (1988)). 81тв с! а1.. б. 1ттипо1.. 151:2296 (1993); Сйо1Ыа апб Ьсвк. б. Мо1. Вю1.. 196:901 (1987); Саг1сг с! а1.. Ргос. Ча11. Асаб. δοί. ϋδΑ. 89:428 (1992); Ргсв!а с! а1.. б. 1ттипо1.. 151:2623 (1993). патенты США №№ 5723323. 5976862. 5824514. 5817483. 5814476. 5763192. 5723323. 5766886. 5714352. 6204023. 6180370. 5693762. 5530101. 5585089. 5225539. 4816567. РСТ/: ϋ898/16280. ϋ896/18978. ϋ891/09630. ϋ891/05939. ϋ894/01234. ОВ89/01334. ОВ91/01134. ОВ92/01755; \УО90/14443. \УО90/14424. \У090/14430. ЕР 229246. включенных в данное описание в качестве ссылок. включая ссылки. цитированные в них. и в других работах.

Антитела против ΤΝΡ также можно получить. необязательно. путем иммунизации трансгенных животных (например. мыши. крысы. хомяка. примата. не относящегося к человеку. и т.п.). способных продуцировать спектр человеческих антител. как описывается в данном описании и/или как известно в технике. Клетки. продуцирующие антитела против ΤΝΡ человека. можно выделить из таких животных и иммортализовать с использованием подходящих способов. таких как способы. описанные в данном описании.

Трансгенных мышей. которые могут продуцировать спектр человеческих антител. связывающихся с человеческими антигенами. можно получить известными способами (например. описанными в патентах США №№ 5770428. 5569825. 5545806. 5625126. 5625825. 5633425. 5661016 и 5789650. выданных ЬопЬсгд с! а1.;

бакоЬоУЙ5 εί αΐ. Ж) 98/50433, бакоЬоУйз εί αΐ. Ж) 98/24893, ЬопЬегд εί а1.

ХУО 98/24884, ЬопЬегд εί а1. Ж) 97/13852, ЬопЬегд е/ а!. Ж) 94/25585, Кискег1ара1е εί а1.

ХУО 96/34096, КисЬег1ара1е е/а/. ЕР 0463 151 В1, КисИеНараСе е/а/. ЕР 0710 719 А1,

8игаш εί а1.168. Ра1. Νο. 5,545,807, Вгиддегпапп εί а1. Ж) 90/04036, Вгиддетапп εί а1. ЕР

0438 474 В1, ЬопЬегд εί а1. ЕР 0814 259 А2, ЬопЬеге εί αΐ. ОВ 2 272 440 А, ЬопЬегк βί а1.

Ыа1иге 368:856-859 (1994), Тау1ог εί α!., Ιηί. 1ттипо1. 6(4)579-591 (1994), Сгееп εί а1,

ЫаЫге СепсИсз 7:13-21 (1994), Мепбег εί а1., Ыа1иге ОепеИсз 15:146-156 (1997), Тау1ог е1 а1., Нис1е1с Асйк Яе$еагс1г 20(23):6287-6295 (1992), ТиаШоп εί а1., Ргос ΝαίΙ АсаА 8σί ΙΙ5Α

90(8)3720-3724 (1993), ЬопЬегд εί αί, Ιηί Κεν ΙιηηιιιηοΙ 13(1):65-93 (1995) апб НзЬтШ εί αΐ, Ναί Вю1ес1то1 14(7):845-851 (1996), включенных в данное описание в качестве ссылок. и в других работах). Как правило. такие мыши содержат по меньшей мере одну трансгенсодержащую ДНК по меньшей мере от одного локуса иммуноглобулина человека. который функционально реаранжирован. или который может претерпевать функциональную реаранжировку. Эндогенные локусы иммуноглобулина в таких мышах можно разрушить или удалить для устранения способности животных продуцировать антитела. кодируемые эндогенными генами.

Скриниг антител на специфическое связывание с подобными белками или фрагментами можно удобно осуществить с использованием библиотек отображений пептидов. Такой способ включает скрининг больших коллекций пептидов на отдельные члены с нужными функцией или строением. Скрининг антител из библиотек отображений пептидов хорошо известен в технике. Отображенные пептидные последовательности могут иметь длину от 3 до 5000 или более аминокислот. часто 5-100 аминокислот. и

- 11 007005 часто - от примерно 8 до 25 аминокислот. Кроме методов прямого химического синтеза получения пептидных библиотек описаны некоторые методы рекомбинантных ДНК. Один тип включает отображение пептидной последовательности на поверхности бактериофага или клетки. Каждый бактериофаг или клетка содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую определенную отображенную пептидную последовательность. Такие способы описываются в патентных публикациях РСТ №№ 91/17271, 91/18980, 91/19818 и 93/08278. Другие системы получения библиотек пептидов содержат аспекты как химического синтеза ίη νίίτο, так и рекомбинантных способов. См. патентные публикации РСТ №№ 92/05258, 92/14843 и 96/19256. См. также патенты США №№ 5658754 и 5643768. Библиотеки отображений пептидов, вектор и набор для скрининга коммерчески доступны от таких поставщиков, как Ιηνίΐτο^θη (Карлсбад, Калифорния) и СатЬпбде апБЬобу Тсс11по1ощс5 (СатЬпбдезЫте, ИК). См., например, патенты США №№ 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, принадлежащие Εηζοη; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, принадлежащие Эуах, 5427908, 5580717, принадлежащие Лйутах; 5885793, принадлежащий СатЬпбде а1ШЬо4у Тсс1то1ощс5; 5750373, принадлежащий Сспс1сс11; 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, принадлежащие Хота; СоШдащ см. выше; Аи8иЬе1, см. выше; или 8атЬгоок, см. выше; все перечисленные выше патенты и публикации включены в данное описание в качестве ссылок.

Антитела настоящего изобретения также можно получить с использованием по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело против ΤΝΕ, с целью получения трансгенных животных или млекопитающих, таких как козы, коровы, лошади, овцы и т.п., которые продуцируют такие антитела в своем молоке. Таких животных можно получить с использованием известных способов. См., например, патенты США №№ 5827690; 5849992; 4873316; 5849992; 5994616; 5565362; 5304489, и т.п., включенные в данное описание в качестве ссылок, и другие работы.

Антитела настоящего изобретения также можно получить с использованием по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело против ΤΝΡ, с целью получения трансгенных растений и культивированных растительных клеток (например, табака, маиса и других), продуцирующих такие антитела, специфические части или варианты в частях растений или в клетках, культивируемых из них. Как пример, не являющийся ограничением, листья трансгенного табака, экспрессирующие рекомбинантные белки, успешно используют для получения больших количеств рекомбинантных белков, например, с использованием индуцируемого промотора. См. Сгатег е1 а1., Сигг. Тор. МютоЬю1. Iттиηο1., 240:95-118 (1999) и цитированные в указанной работе ссылки. Также используют трансгенную кукурузу для экспрессии на коммерческих уровнях производства белков млекопитающих с биологическими активностями, равноценными активностям, получаемым в других рекомбинантных системах или выделенных в чистом виде из природных источников. См., например, Нооб е1 а1., Αάν. Ехр. Меб. Вю1., 464:127-147 (1999), и цитированные в указанной работе ссылки. Антитела, в том числе фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела (^Εν), получают в больших количествах также из семян трансгенных растений, включая семена табака и клубни картофеля. См., например, Сошаб е1 а1., Р1аи1. Мо1. Вю1., 38:101-109 (1998), и цитированные в указанной работе ссылки. Таким образом, антитела настоящего изобретения также можно получить с использованием трансгенных растений согласно известным способам. См. также Рщсйет е1 а1., Вю1ссЬшо1. Арр1. Вюсйет., 30:99-108 (Ос1., 1999), Ма е1 а1., Тгсп48 Вю1ссЬшо1., 13:522-7 (1995); Ма е1 а1., Р1аШ. РЬу8ю1., 109:341-6 (1995); \У1Ше1ат е1 а1., Вюсйет. 8ос. Тгащ., 22:940-944 (1994); и ссылки, цитированные в указанных работах. См. также литературу для общего представления об экспрессии антител растениями, и не только. Каждая из указанных выше ссылок включена в данное описание в качестве ссылки.

Антитела изобретения могут связываться с Т№ человека в широком интервале аффинности (К_с). В предпочтительном варианте по меньшей мере одно человеческое тАЬ настоящего изобретения может, необязательно, связываться с Т№ человека с высокой аффинностью. Например, человеческое тАЬ может связываться с Т№ человека с К_с, по величине равным или меньше примерно 10^-7 М, таким как, без ограничений, 0,1-9,9 (или любого интервала или величины в указанном пределе) х 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11, 10^-12, 10^-13, или любого интервала или величины в указанном пределе.

Аффинность или авидность антитела к антигену можно определить экспериментально с использованием любого подходящего способа. (См., например, ВегеоГзку е1 а1., Аηί^Ьοάу-Аηί^деη Iηίе^асΐ^οη8, в Εиηάатеηίа1 Iттиηο1οду, Раи1 ^.Е., Еб., Рагеи Ргезз: №\ν Уогк, ΝΥ (1984); КиЬу, ЕтА Iттиηο1οду, А.Н. Ететам апб Сотрту: №\ν Υο^к, ΝΥ (1992); и способы, описанные в данном описании). Измеряемая аффинность взаимодействия конкретных антитела и антигена может изменяться, если измеряется в разных условиях (например, таких как концентрация соли, рН). Таким образом, измерения аффинности и других антигенсвязывающих параметров (например, К_с, К_а, К_б) осуществляют, предпочтительно, в стандартных растворах антител и антигенов и стандартном буфере, таком как буфер, описанный в данном описании.

Молекулы нуклеиновых кислот

С использованием приведенных в данном описании сведений, таких как о нуклеотидных последовательностях, кодирующих по меньшей мере 70-100% последовательных аминокислот по меньшей мере одной из 8Еф ΙΌ №: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, их специфических фрагментах, вариантах или консенсусных по

- 12 007005 следовательностях, или депозитном векторе, содержащем по меньшей мере одну из таких последовательностей, можно получить молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, кодирующей по меньшей мере одно антитело против ΤΝΡ, с использованием способов, описанных в данном описании или известных в технике.

Молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут находиться в форме РНК, такой как мРНК, гяРНК, тРНК, или любой другой форме, или в форме ДНК, в том числе кДНК и геномной ДНК, или другой ДНК, полученной клонированием или полученной синтетически или любыми их сочетаниями. ДНК может являться трехцепочечной, двухцепочечной или одноцепочечной, или представлять любое их сочетание. Любая часть по меньшей мере одной цепи ДНК или РНК может представлять собой кодирующую цепь, также известную как смысловая цепь, или она может представлять собой некодирующую цепь, также известную как антисмысловая цепь.

Выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут являться молекулами нуклеиновых кислот, содержащими открытую рамку считывания (ОКБ), необязательно, с одним или несколькими интронами, например, по меньшей мере одной специфической частью по меньшей мере одного ΟΌΚ, например ΟΌΚ1, СЭК2 и/или ΟΌΚ3, по меньшей мере одной тяжелой цепи (например, 8ЕО ΙΌ N0: 1-3) или легкой цепи (например, 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 4-6), или другими интронами; молекулами нуклеиновых кислот, содержащими кодирующую последовательность для антитела против ΤΝΡ или вариабельной области (например, 8Е0 ΙΌ N0: 7,8); и молекулами нуклеиновых кислот, содержащими нуклеотидную последовательность, по существу, отличающуюся от описанных выше, но которая, из-за вырожденности генетического кода, еще кодирует по меньшей мере одно антитело против ΤΝΡ, описанное в данном описании и/или известное в технике. Конечно, генетический код хорошо известен в технике. Таким образом, для специалиста в данной области техники будет самым обычным делом получение таких вырожденных вариантов нуклеиновых кислот, кодирующих специфические антитела против ΤΝΡ настоящего изобретения. См., например, Ли8иЬе1 с1 а1., см. выше, и такие варианты нуклеиновых кислот включены в настоящее изобретение. Не являющиеся ограничительными примеры выделенных молекул нуклеиновых кислот настоящего изобретения включают 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 10, 11, 12, 13, 14, 15, соответствующие не являющимся ограничительными примерам нуклеиновой кислоты, кодирующей, соответственно, НС СЭК1, НС ί.ΌΚ2. НС СЭК3. ЬС СЭК1, ЬС СЭК2. ЬС СЭК3, вариабельную область НС и вариабельную область ЬС.

В другом аспекте изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих антитело против ΤΝΡ с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеиновой кислотой, содержащейся в плазмиде, депонированной под обозначенными названиями клонов и депозитными №№ АТСС, соответственно, депонированных.

Как указывается в данном описании, молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против ΤΝΡ, могут включать, но не ограничиваться перечисленным, молекулы, сами кодирующие аминокислотную последовательность фрагмента антитела; кодирующую последовательность для всего антитела или его части; кодирующую последовательность для антитела, фрагмента или части, а также дополнительные последовательности, такие как кодирующая последовательность по меньшей мере одной сигнальной последовательности или слитого пептида, с или без вышеуказанных дополнительных кодирующих последовательностей, таких как по меньшей мере один интрон, вместе с дополнительными некодирующими последовательностями, включая, но не ограничиваясь перечисленным, некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие как транскрибированные не транслируемые последовательности, которые играют роль при транскрипции, процессировании мРНК, включая сплайсинг, и сигналы полиаденилирования (например, связывания рибосом и устойчивости мРНК); дополнительную кодирующую последовательность, кодирующую дополнительные аминокислоты, такие как обеспечивающие дополнительные функциональности. Таким образом, последовательность, кодирующая антитело, может быть слита с маркерной последовательностью, такой как последовательность, кодирующая пептид, что облегчает очистку слитых антител, содержащих фрагменты или части антител.

Полинуклеотиды, селективно гибридизующиеся с полинуклеотидом, описанным в данном описании

Настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, гибридизурующимся в условиях селективной гибридизации с полинуклеотидом, описанным в данном описании. Таким образом, полинуклеотиды в таком варианте можно использовать для выделения, детекции и/или количественного определения нуклеиновых кислот, содержащих такие полинуклеотиды. Например, полинуклеотиды настоящего изобретения можно использовать для идентификации, выделения или амплификации неполных или полноразмерных клонов в депонированной библиотеке. В некоторых вариантах полинуклеотиды представляют собой геномные последовательности или последовательности кДНК, выделенные или иным образом комплементарные кДНК из библиотеки нуклеиновых кислот человека или млекопитающего.

Предпочтительно, библиотека кДНК содержит по меньшей мере 80% полноразмерных последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 85 или 90% полноразмерных последовательностей, и

- 13 007005 предпочтительнее по меньшей мере 95% полноразмерных последовательностей. Библиотеки кДНК можно нормализовать для повышения представления редких последовательностей. Условия гибридизации низкой или умеренной жесткости, как правило, но не исключительно, используются с последовательностями с пониженной идентичностью последовательности относительно комплементарных последовательностей. Условия умеренной и высокой жесткости можно использовать, необязательно, в случае последовательностей большей идентичности. Условия низкой жесткости допускают селективную гибридизацию последовательностей с примерно 70% идентичностью последовательностей и могут использоваться для идентификации ортологичных или паралогичных последовательностей.

Необязательно, полинуклеотиды данного изобретения будут кодировать по меньшей мере часть антитела, кодируемого полинуклеотидами, описанными в данном описании. Полинуклеотиды данного изобретения включают нуклеотидные последовательности, которые можно использовать для селективной гибридизации с полинуклеотидом, кодирующим антитело настоящего изобретения.

См., например, Ли8иЬе1, см. выше; СоШдаи, см. выше, включенные в данное описание в качестве ссылок.

Конструирование нуклеиновых кислот

Выделенные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно создать с использованием (а) рекомбинантных методов, (Ь) синтетических методов, (с) методами очистки или их сочетанием, хорошо известными в технике.

Обычно нуклеиновые кислоты могут содержать последовательности в дополнение к полинуклеотиду настоящего изобретения. Например, в нуклеиновую кислоту можно встроить сайт множественного клонирования, содержащий одну или несколько эндонуклеаз, для того, чтобы способствовать выделению полинуклеотида. Также можно встроить транслируемые последовательности для того, чтобы способствовать выделению транслируемого полинуклеотида настоящего изобретения. Например, гексагистидиновая маркерная последовательность является удобным средством для очистки белков настоящего изобретения. Нуклеиновая кислота настоящего изобретения, исключая кодирующую последовательность, представляет собой, необязательно, вектор, адаптер или линкер для клонирования и/или экспрессии полинуклеотида настоящего изобретения.

Можно добавить дополнительные последовательности к таким клонирующим и/или экспрессирующим последовательностям, с целью оптимизации их функции при клонировании и/или экспрессии, для того, чтобы способствовать выделению полинуклеотида, или с целью улучшения введения полинуклеотида в клетку. Использование клонирующих векторов, экспрессирующих векторов и линкеров хорошо известно в технике (см., например, Ли8иЬе1, см. выше; или 8атЬгоок, см. выше).

Рекомбинантные способы конструирования нуклеиновых кислот

Выделенные композиции нуклеиновых кислот данного изобретения, таких как РНК, кДНК, геномная ДНК или любое их сочетание, можно получить из биологических источников с использованием любого числа методологий клонирования, известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах олигонуклеотидные зонды, селективно гибиридизирующие с полинуклеотидами настоящего изобретения в условиях высокой жесткости, используют для идентификации нужной последовательности в библиотеке кДНК или геномной ДНК. Выделение РНК и конструирование библиотек кДНК и ДНК хорошо известно рядовым специалистам в данной области техники (см., например, Ли8иЬе1, см. выше; или 8атЬгоок, см. выше).

Скрининг нуклеиновых кислот и способы выделения

Библиотеку кДНК или геномную библиотеку можно скринировать с использованием зонда на основе последовательности полинуклеотида настоящего изобретения, как описано в данном описании. Зонды можно использовать для гибридизации с последовательностями геномной ДНК или кДНК для выделения гомологичных генов в одних и тех же или разных организмах. Специалистам в данной области техники будет понятно, что при анализе можно использовать различную степень жесткости; и жесткой может быть среда или для гибридизация или для промывки. Так как условия гибридизации становятся более жесткими, должна существовать большая степень комплементарности между зондом и мишенью для того, чтобы происходило образование дуплекса. Степень жесткости можно регулировать с помощью одного или нескольких факторов, таких как температура, ионная сила, рН и наличие растворителя для неполной денатурации, такого как формамид. Например, жесткость гибридизации обычно изменяют путем изменения полярности реагирующего раствора через, например, манипуляции с концентрацией формамида в интервале от 0 до 50%. Степень комплементарности (идентичность последовательностей), требуемая для детектируемого связывания, будет изменяться в соответствии с жесткостью среды для гибридизации и/или среды для промывки. Степень комплементарности оптимально будет составлять 100 или 70-100%, или любой интервал или величину в указанных пределах. Однако следует представлять, что незначительные изменения последовательности в зондах и праймерах можно компенсировать снижением жесткости среды для гибридизации и/или промывки.

Способы амплификации РНК или ДНК хорошо известны в технике и могут использоваться согласно настоящему изобретению без излишнего экспериментирования на основании указаний, представленных в данном описании.

- 14 007005

Известными способами амплификации ДНК или РНК являются полимеразная цепная реакция (ПЦР) и родственные способы амплификации (см., например, патенты США №№ 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, Ми1118 е! а1.; 4795699 и 4921794, Ταϋοτ е! а1.; 5142033, 1шт; 5122464, \\Ί1κοιι е! а1.; 5091310, Ιηηίκ; 5066584, Су11еп§!еп е! а1.; 4889818, Се 1 Гааб е! а1.; 4994370, 8буег е! а1.; 4766067, Βί5\ν;·ΐ5; 4656134, Κίη§ο1ά), и амплификация, опосредуемая РНК, при которой используют РНК, антисмысловую к последовательности-мишени, в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США № 5130238, Ма1ек е! а1., торговое наименование ΝΆδΒΆ) (все указанные ссылки внесены в данное описание в качестве ссылок, см., например, Ли8иЬе1, см. выше; или БатЬгоок, см. выше), и другие способы.

Например, технологию полимеразной цепной реакции (ПЦР) можно использовать для амплификации последовательностей полинуклеотидов настоящего изобретения и родственных генов непосредственно из библиотек геномной ДНК или кДНК. ПЦР и другие способы амплификации ίη νίΐτο также могут быть полезны, например, для клонирования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих экспрессируемые белки, для получения нуклеиновых кислот для применения в качестве зондов для детекции присутствия нужной РНК в образцах, для секвенирования нуклеиновых кислот или для других целей. Примеры методов, достаточные для ориентации специалистов в способах амплификации ίη νί!το, имеются в Вегдег, см. выше, 8атЬ^οοк, см. выше, а также в МиШк е! а1., патент США № 4683202 (1987), и ΙηηΕ е! а1., РСЯ Ρτο!οοο1δ А Сшбе !ο Мебюбк аиб АррИсШют, Ебк, Асабетк Ргекк 1пс., 8аи ^^едο, СА (1990). Коммерчески доступные наборы для геномной ПЦР-амплификации известны в технике. См., например, набор для геномной ПЦР Абνаиΐаде-СС (С'кгИесй). Кроме того, для улучшения выхода длинных продуктов ПЦР можно использовать белок Т4 гена 32 (Βοей^^иде^ Μηηηΐ^ίιη).

Синтетические способы конструирования нуклеиновых кислот

Выделенные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно также получить прямым химическим синтезом известными способами (см., например, Аи8иЬе1, см. выше). Химический синтез, как правило, дает одноцепочечные олигонуклеотиды, которые можно превратить в двухцепочечную ДНК методом гибридизации с комплементарной последовательностью или полимеризацией с ДНКполимеразой с использованием одной цепи в качестве матрицы. Специалисту в данной области техники будет понятно, что хотя химический синтез ДНК может быть ограничен последовательностями в примерно 100 или больше оснований, можно получить более длительные последовательности лигированием более коротких последовательностей.

Рекомбинантные экспрессирующие кассеты

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным экспрессирующим кассетам, содержащим нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, например, кДНК, или геномную последовательность, кодирующую антитело настоящего изобретения, можно использовать для конструирования рекомбинантной экспрессирующей кассеты, которую можно ввести в по меньшей мере одну клетку-хозяина. Рекомбинантная экспрессирующая кассета обычно будет содержать полинуклеотид настоящего изобретения, оперативно соединенный с регуляторными последовательностями инициации транскрипции, которые будут управлять транскрипцией полинуклеотида в предполагаемой клетке-хозяине. Как гетерологичные, так и негетерологичные (т.е., эндогенные) промоторы можно использовать для управления экспрессией нуклеиновых кислот настоящего изобретения.

В некоторых вариантах выделенные нуклеиновые кислоты служат в качестве промоторов, эхансеров или других элементов, которые можно ввести в соответствующую позицию (в обратном направлении, в прямом направлении или в интрон) негетерологичной формы полинуклеотида настоящего изобретения таким образом, чтобы положительно или отрицательно регулировать экспрессию полинуклеотида настоящего изобретения. Например, эндогенные промоторы можно изменить ίη νίνο или ίη νίΙΐΌ путем мутации, делеции и/или замены.

Векторы и клетки-хозяева

Настоящее изобретение также относится к векторам, включающим нуклеиновые кислоты настоящего изобретения, клеткам-хозяевам, генетически созданным с помощью рекомбинантных векторов, и получению по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ рекомбинантными методами, хорошо известными в технике. См., например, 8ηιη«οο1< е! а1., см. выше; Аи§иЬе1 е! а1., см. выше; работы, включенные в данное описание в качестве ссылок.

Полинуклеотиды, необязательно, можно соединить с вектором, содержащим селектируемый маркер для размножения в хозяине. Как правило, плазмидный вектор вводят в преципитат, такой как кальцийфосфатный преципитат, или в комплекс с нагруженным липидом. Если вектор представляет собой вирус, его можно упаковать ίη νίίτο с использованием соответствующей пакующей клеточной линии и затем трансдуцировать в клетки-хозяева.

ДНК-вставка должна оперативно связываться с соответствующим промотором. Экспрессирующие конструкции также будут содержать сайты для инициации транскрипции, терминации и, в транскрибируемом участке, сайт связывания рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессированных конструкциями, будет, предпочтительно, включать инициацию трансляции в начале и кодон терминации (например, ИАА, ИСА или ИАС), соответственно располагающиеся в конце транс- 15 007005 лируемой мРНК, с ИАА и ИАС, предпочтительными для экспрессии клеток млекопитающих или эукариот.

Экспрессирующие векторы, предпочтительно, но необязательно, будут включать по меньшей мере один селектируемый маркер. Такие маркеры включают, но не ограничиваются перечисленным, гены устойчивости к метотрексату (МТХ), дигидрофолатредуктазе (ΌΗΕΚ, патенты США №№ 43992ΐ6; 4634665; 4656ΐ34; 4956288; 5ΐ49636; 5179017), ампициллину, неомицину (0418), микофеноловой кислоте или глутаминсинтетазе (С8, патенты США №№ 5ΐ22464; 5770359; 5827739) для культуры эукариотических клеток и гены устойчивости к ампициллину для культивирования в Е. сой и других бактериях или прокариотах (вышеперечисленные патенты включены в данное описание в качестве ссылок). Соответствующие культуральные среды и условия для вышеописанных клеток-хозяев известны в технике. Подходящие векторы будут очевидны для специалистов. Введение векторной конструкции в клетку-хозяина можно осуществить кальцийфосфатной трансфекцией, опосредованной ΌΕΆΕ-декстраном трансфекцией, опосредованной катионным липидом трансфекцией, электропорацией, трансдукцией, инфицированием или другими известными способами. Такие способы описаны, например, в 8агпЬгоок, см. выше, главы 14 и 16-18; в АикиЬе1, см.выше, главы 1, 9, ΐ3, ΐ5, ΐ6.

По меньшей мере одно антитело настоящего изобретения можно экспрессировать в модифицированной форме, такой как слитый белок, и можно включить не только сигналы секреции, но также дополнительные гетерологичные функциональные участки. Например, участок дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, можно добавить к Ν-концу антитела для улучшения устойчивости и сохранности в клетке-хозяине, во время очистки или во время последующих операций и хранения. Также к антителу настоящего изобретения можно добавить пептидные группы для облегчения очистки. Такие участки можно удалить до окончательного получения антитела или по меньшей мере одного его фрагмента. Такие способы описываются во многих известных лабораторных руководствах, таких как 8атЬгоок, см. выше, главы ΐ7.29-ΐ7.42 и ΐ8.ΐ-ΐ8.74; АикиЬе1, см. выше, главы ΐ6, 17 и ΐ8.

Рядовым специалистам в данной области техники известны многочисленные экспрессирующие системы, доступные для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей белок настоящего изобретения.

С другой стороны, нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно экспрессировать в клеткехозяине, манипулируя клеткой-хозяином, содержащим эндогенную ДНК, кодирующую антитело настоящего изобретения. Такие способы хорошо известны в технике, например, описанные в патентах США №№ 5580734, 564ΐ670, 5733746 и 5733761, включенных в данное описание в качестве ссылок.

Примерами клеточных культур, полезных для продуцирования антител, их специфических частей или вариантов являются клетки млекопитающих. Системы клеток млекопитающих часто будут находиться в форме монослоев клеток, хотя также можно использовать суспензии клеток млекопитающих или биореакторы. В технике разработан ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных экспрессировать интактные гликозилированные белки, в том числе, клеточные линии СО8-1 (например, АТСС СКЬ 1650), СО8-7 (например, АТСС СКЬ 1651), НЕК293, ВНК21 (например, АТСС СКЬ-10), СНО (например, АТСС СКЬ 1610) и В8С-1 (например, АТСС СКЬ-26), клетки Сок-7, клетки СНО, клетки йер 02, Р3Х63Ад8.653, 8Р2/0-Ад14, клетки 293, клетки Не1а и т.п., которые легко доступны, например, от Американской коллекции типовых культур, Мапаккак, να (те^ет.а1сс.огд). Предпочтительными клеткамихозяевами являются клетки лимфоидного происхождения, такие как миеломные и лимфомные клетки. Особенно предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки Р3Х63Ад8.653 (АТСС, инвентарный № СКЬ-1580) и клетки 8Р2/0-Ад14 (АТСС, инвентарный № СКЬ-1851). В особенно предпочтительном варианте рекомбинантной клеткой является клетка Р3Х63АЬ8.653 или клетка 8Р2/0-Ад14.

Экспрессирующие векторы для указанных клеток могут включать одну или несколько из перечисленных далее регулирующих экспрессию последовательностей, таких как сайт начала репликации; промотор (например, поздние или ранние промоторы 8ν40, промотор СМV (патенты США №№ 5168062; 5385839), промотор Н8У 1к промотор рдк (фосфоглицераткиназа), промотор ΕΕ-1-альфа (патент США № 526649ΐ), по меньшей мере один промотор иммуноглобулина человека); энхансер и/или процессингинформирующие сайты, такие как сайты связывания рибосом, сайты РНК-сплайсинга, сайты полиаденилирования (например, сайт присоединения большого Т-Ад-поли-А 8ν40), и последовательности терминаторов транскрипции. См., например, АикиЬе1, см. выше; 8атЬгоок, см. выше. Другие клетки, полезные для получения нуклеиновых кислот или белков настоящего изобретения, известны и/или доступны, например, из каталога клеточных линий и гибридом Американской коллекции типовых культур (\у\у\у.а1сс.огд) или других известных или коммерческих источников.

Когда используют эукариотические клетки в качестве хозяев, в вектор обычно включают последовательности полиаденилирования или терминации транскрипции. Примером терминаторной последовательности является последовательность полиаденилирования из гена гормона роста коровы. Также можно включать последовательности для точного сплайсинга транскрипта. Примером сплайсингпоследовательности является интрон УР1 из 8ν40 (8ргадие е1 а1., 1. УйоЕ 45:773-781 (1983)). Кроме того, в вектор можно ввести последовательности генов для регулирования репликации в клетке-хозяине, известные в технике.

- ΐ6 007005

Очистка анитител

Антитела против ΤΝΕ можно извлечь из рекомбинантных клеточных культур и очистить хорошо известными способами, включая очистку с протеином А, осаждение сульфатом аммония или этанолом, кислотную экстракцию, анион- или катионобменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатите и хроматографию на лектинах, и другие способы. Для очистки также можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). См., например, СоШдап, Сиггеи! Рго!осо1к ίη 1ттиио1оду, или Сштеи! РгоЮсоЕ т Рго!ет §аеисе, 1о1т \νίΚν & §ои8, ΝΥ, ΝΥ (1997-2001), например, главы 1, 4, 6, 8, 9, 10, включенные в данное описание в качестве ссылок.

Антитела настоящего изобретения включают очищенные природные продукты, продукты химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными методами из эукариотного хозяина, в том числе, например, из клеток дрожжей, высшего растения, насекомого и млекопитающего. В зависимости от хозяина, используемого при получении рекомбинантным способом, антитела настоящего изобретения могут быть гликозилированными или негликозилированными, и гликозилированные предпочтительнее. Такие способы описываются во многих известных лабораторных руководствах, таких как ЗатЬгоок, см. выше, разделы 17.37-17.42; Аи8иЬе1, см. выше, главы 10, 12, 13, 15, 16, 18 и 20; СоШдаи, Рго1ет 8с1еисе, см. выше, главы 12-14, которые все включены в данное описание в качестве ссылок.

Антитела против ΤΝΕ

Выделенные антитела настоящего изобретения содержат аминокислотные последовательности антител, описанные в данном описании, кодируемые любым подходящим полинуклеотидом, или любые выделенные или полученные антитела. Предпочтительно, человеческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с ΤΝΕ человека и посредством этого частично или полностью нейтрализует по меньшей мере одну биологическую активность белка. Антитело или его специфическая часть или вариант, которые частично или, предпочтительно, полностью нейтрализует по меньшей мере одну биологическую активность белка ΤΝΕ или фрагмента, могут связываться с белком или фрагментом и посредством этого ингибируют активности, опосредуемые через связывание ΤΝΕ с рецептором ΤΝΕ или через другие ΤΝΕ-зависимые или опосредуемые механизмы. Используемый в данном описании термин нейтрализующее антитело относится к антителу, которое может ингибировать ΤΝΕ-зависимую активность примерно на 20-120%, предпочтительно по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более, в зависимости от анализа. Способность антитела против ΤΝΕ ингибировать ΤΝΕ-зависимую активность оценивают, предпочтительно, методом по меньшей мере одного подходящего анализа белка или рецептора, описанным в данном описании и/или известным в технике. Человеческое антитело по изобретению может быть любого класса (1дО, 1дА, 1дМ, 1дЕ, 1дЭ и т.п.) или изотипа и может содержать легкую цепь каппа или лямбда. В одном варианте человеческое антитело содержит тяжелую цепь 1дО или определенный фрагмент, например, по меньшей мере одного из изотипов 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4. Антитела такого типа можно получить, используя трансгенную мышь или другое трансгенное млекопитающее, не относящееся к человеку, содержащее трансгены с по меньшей мере одной человеческой легкой цепью (например, 1дО, 1дА и 1дМ (например, γ1, γ2, γΌ3, γ4), описанные в данном описании и/или известные в технике. В другом варианте человеческое антитело против ΤΝΕ человека содержит тяжелую цепь 1дС1 и легкую цепь 1дС1.

По меньшей мере одно антитело изобретения связывается по меньшей мере с одним специфическим эпитопом, специфическим по меньшей мере к одному белку ΤΝΕ, его субъединице, фрагменту, части или любому их сочетанию. По меньшей мере один эпитоп может содержать по меньшей мере один антителосвязывющий участок, содержащий по меньшей мере одну часть указанного белка, где эпитоп, предпочтительно, состоит по меньшей мере из одной внеклеточной, растворимой, гидрофильной, внешней или цитоплазматической части указанного белка. По меньшей мере один специфический эпитоп может содержать любую комбинацию по меньшей мере от одной аминокислотной последовательности из по меньшей мере 1-3 аминокислот до полной специфической части последовательных аминокислот 8ЕО ГО \о: 9.

Как правило, человеческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент настоящего изобретения будет содержать по меньшей мере один человеческий гипервариабельный участок (СЭК.1, СЭК2 и СЭКЗ) или вариант по меньшей мере одной вариабельной области тяжелой цепи, и по меньшей мере один человеческий гипервариабельный участок (СЭК.1, СЭЕ2 и СЭКЗ) или вариант по меньшей мере одной вариабельной области легкой цепи. Как пример, не являющийся ограничением, антитело или антигенсвязывающий фрагмент или вариант могут содержать по меньшей мере одну тяжелую цепь СЭЕ3 с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО Но: 3 и/или легкую цепь СЭЕ3 с аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО Ко: 6. В частном варианте антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут содержать антигенсвязывающий участок, содержащий по меньшей мере часть по меньшей мере одной тяжелой цепи СЭЕ (т.е., СЭЯ1, СЭЕ2 и/или СЭК3) с аминокислотной последовательностью, соответствующей СЭЯ1, 2 и/или 3 (например, 8ЕО ГО ΝΟ: 1, 2 и/или 3). В другом частном варианте антитело или антигенсвязывающий фрагмент или вариант могут содержать антигенсвязывающий участок, содержа

- 17 007005 щий по меньшей мере часть по меньшей мере одной легкой цепи Τ'ΌΡ (т.е., СОК1, ί.'ΌΡ2 и/или СОК3) с аминокислотной последовательностью, соответствующей СОК1, 2 и/или 3 (например, ΞΕφ ΙΌ Νο: 4, 5 и/или 6). В предпочтительном варианте три СОК тяжелой цепи и три СОК легкой цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента имеют аминокислотную последовательность, соответствующую СОК по меньшей мере одного тΑЬ ΤΝν148, ΤΝν14, ΤΝν15, ΤΝν196, ΤΝν118, ΤΝν32, ΤΝν86, описанных в данном описании. Такие антитела можно получить, соединяя химически различные части (например, СОК, каркасный участок) антитела с использованием обычных методов, путем получения и экспрессии (т.е., одной или нескольких) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, с использованием обычных методов технологии рекомбинантных ДНК, или используя любой другой подходящий способ.

Антитело против ΤΝΡ может содержать по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой или легкой цепи с определенной аминокислотной последовательностью. Например, в предпочтительном варианте антитело против ΤΝΡ содержит по меньшей мере одну из по меньшей мере одной вариабельной области тяжелой цепи, необязательно содержащую аминокислотную последовательность ΞΕφ ΙΌ ΝΟ: 7, и/или по меньшей мере одной вариабельной области легкой цепи, необязательно содержащую аминокислотную последовательность ΞΕφ ΙΌ ΝΟ: 8. Антитела, связывающиеся с ΤΝΡ человека и содержащие определенную вариабельную область тяжелой или легкой цепи, можно получить с использованием подходящих способов, таких как отображение фагов (КайиЬе Υ. е1 а1., Ιηΐ. 1. Μοί. Меб., 1(5):863-868 (1998)), или способов с использованием трансгенных животных, известных в технике и/или описанных в данном описании. Например, трансгенную мышь, содержащую функционально реаранжированный трансген тяжелой цепи иммуноглобулина человека, и трансген, содержащий ДНК из локуса легкой цепи иммуноглобулина человека, который может претерпевать функциональную реаранжировку, можно иммунизировать ΤΝΡ человека или его фрагментом с целью добиться продуцирования антител. При необходимости, клетки, продуцирующие антитела, можно выделить, и можно получить гибридомы или другие иммортализованные клетки, продуцирующие антитела, как описывается в данном описании и/или известно в технике. С другой стороны, антитело, специфическую часть или вариант можно экспрессировать в подходящей клетке-хозяине с использованием кодирующей нуклеиновой кислоты или ее части.

Изобретение также относится к антителам, антигенсвязывающим фрагментам, иммуноглобулиновым цепям и СОК, содержащим аминокислоты в последовательности, по существу, такой же, как аминокислотная последовательность, описанная в данном описании. Предпочтительно, такие антитела или антигенсвязывающие фрагменты и антитела, содержащие такие цепи или СОК, могут связываться с ΤΝΡ человека с высокой аффинностью (например, К_с меньше или равен примерно 10^-9 М). Аминокислотные последовательности, по существу, такие же, как последовательности, описанные в данном описании, включают последовательности, содержащие консервативные аминокислотные замены, а также делеции и/или вставки аминокислот. Консервативной аминокислотной заменой называется замена первой аминокислоты второй аминокислотой с химическими и/или физическими свойствами (такими как, например, заряд, структура, полярность, гидрофобность/гидрофильность), подобными свойствам первой аминокислоты. Консервативные замены включают замену одной аминокислоты другой в пределах следующих групп: лизин (К), аргинин (К) и гистидин (Н); аспарагиновая кислота (О) и глутаминовая кислота (Е); аспаргин (Ν), глутамин (О), серин (Ξ), треонин (Т), тирозин (Υ), К, К, Н, О и Е; аланин (А), валин (У), лейцин (Ь), изолейцин (Ι), пролин (Р), фенилаланин (Ρ), триптофан (^), метионин (М), цистеин (С) и глицин (О); Ρ, и Υ; С, Ξ и Т.

Аминокислотные коды

Аминокислоты, составляющие антитела против ΤΝΡ настоящего изобретения, часто обозначаются аббревиатурами. Обозначения аминокислот можно указать, обозначая аминокислоту первой буквой ее буквенного кода, тремя буквами ее кода, названия или трехнуклеотидными кодонами, что хорошо известно в технике (см. Л1Ьег15 В. е1 а1., Мо1еси1аг Βίοίοβν ο£ Τίκ Се11, ΤΙίτά Ε6., Оат1ап6 ΡπΜίδ1ίη§, Ιηο, Ыете ΥογΕ 1994).

- 18 007005

Однобуквен- ный код	Трехбуквенный код	Название	Трехнуклеотидный(е) кодон(ы)
А	А1а	Аланин	сса, ссс, ссс, сси
С	Суз	Цистеин	исс, иси
ϋ	Азр	Аспарагиновая кислота	сас, сди
Е	С1и	Глутаминовая кислота	САА, САС
Г	РНе	Фенилаланин	иис, иии
С	С1у	Глицин	сса, ссс, ссс, сси
н	ΗΪ3	Гистидин	САС, САЦ
I	Не	Изолейцин	лил, лис, лии
к	Ьуз	Лизин	ААА, ААС
ь	Ьеи	Лейцин	иид, иис, сил, сис, сис, сии
м	Меб	Метионин	лис
N	Азп	Аспарагин	ААС, ААП
Р	Рго	Пролин	сса, ссс, ссс, сси
0	С1п	Глутамин	САА, САС
к	Агд	Аргинин	АСА, АСС, ССА, ССС, ссс, сси
3	Зег	Серин	асс, леи, исА, исс, исс, иси
т	ТЬг	Треонин	АСА, АСС, АСС, Аси
V	Уа1	Валин	сил, сис, сис, сии
и	Тгр	Триптофан	исс
Υ	Туг	тирозин	иле, или

Антитело против ΤΝΡ настоящего изобретения может включать одну или несколько аминокислотных замен, делеций или дополнений из-за или природных мутаций или действий человека, описанных в данном описании.

Конечно, число аминокислотных замен, которые может сделать специалист, зависит от многих факторов, включая указанные выше. Вообще говоря, число замен, вставок или делеций аминокислот для любого данного антитела против ΤΝΡ, фрагмента или варианта не будет превышать 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 1, 6, 5, 4, 3, 2, 1, например 1-30 или любого интервала или величины в указанных пределах, как определено в данном описании.

Аминокислоты в антителе против ΤΝΡ настоящего изобретения, являющиеся необходимыми для функции, можно идентифицировать способами, известными в технике, такими как сайт-направленный мутагенез или аланинсканирующий мутагенез (см., например, Аи8иЬе1, см. выше, главы 8,15; СипшпдЬат апй ^е11§, 8с1епсе, 244:1081-1085 (1989)). В последней процедуре вводят отдельные аланиновые мутации в каждый остаток в молекуле. Затем полученные мутантные молекулы проверяют на биологическую активность, такую как, например, нейтрализующую активность в отношении ΤΝΡ, или другую активность. Сайты, критичные для связывания антитела, также можно идентифицировать методами структурного анализа, такими как кристаллизация, ядерный магнитный резонанс или протоаффинное мечение (8тйй е! а1., I. Μο1. Βΐο1., 224:899-904 (1992), и йе νο§ е! а1., 8с1епсе, 255:306-312 (1992)).

Антитела против ΤΝΡ настоящего изобретения могут включать, но не ограничиваться перечисленным, по меньшей мере одну часть, последовательность или сочетание, выбранные из числа от 5 до всех последовательных аминокислот из по меньшей мере одной из 8Е0 И) ΝΟ: 1, 2, 3, 4, 5, 6.

Антитело против ΤΝΡ также, необязательно, может содержать полипептид по меньшей мере из одной из 70-100% последовательных аминокислот по меньшей мере из одной из 8Е0 И) ΝΟ: 7, 8.

В одном варианте аминокислотная последовательность иммуноглобулиновой цепи или ее части (например, вариабельной области, СЭР) имеет примерно 70-100% идентичность (например, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, или любой интервал или величину в указанных пределах) с аминокислотной последовательностью соответствующей цепи по меньшей мере одной из 8Е0 И) ΝΟ: 7, 8. Например, аминокислотную последователь

- 19 007005 ность вариабельной области легкой цепи можно сравнить с последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 8, или аминокислотную последовательность СЭКЗ тяжелой цепи можно сравнить с последовательностью 8ЕО Ш ΝΟ: 7. Предпочтительно, определяют 70-100% идентичность аминокислот (т.е., 90, 91, 92, 93, 94, 95. 96, 97, 98, 99, 100, или любой интервал или величину в указанных пределах) с использованием подходящего вычислительного алгоритма, известного в технике.

Примерами последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи являются 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 7, 8. Антитела настоящего изобретения или их специфические варианты могут содержать любое число последовательных аминокислотных остатков из антитела настоящего изобретения, где такое число выбирают из группы целых чисел, составляющих 10-100% от числа последовательных остатков в антителе против ΤΝΡ. Необязательно, такая последовательность последовательных аминокислот имеет длину в по меньшей мере примерно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 или больше аминокислот, или соответствует любому интервалу или величине в указанных пределах. Кроме того, число таких последовательностей может представлять любое целое число, выбранное из группы от 1 до 20, например, по меньшей мере 2, 3, 4 или 5.

Как понятно специалистам в данной области техники, настоящее изобретение включает по меньшей мере одно биологически активное антитело настоящего изобретения. Биологически активные антитела имеют специфическую активность, составляющую по меньшей мере 20, 30 или 40%, предпочтительно по меньшей мере 50, 60 или 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80, 90 или 95-100%, от активности нативного (несинтетического), эндогенного или родственного и известного антитела. Способы оценки и количественного определения ферментативной активности и специфичности субстрата хорошо известны специалистам в данной области техники.

В другом аспекте изобретение относится к человеческим антителам и антигенсвязывающим фрагментам, описанным в данном описании, модифицированным путем ковалентного присоединения органической группы. Такие модификации могут дать антитела или антигенсвязывающие фрагменты с улучшенными фармакокинетическими свойствами (например, с повышенным ίη νίνο временем полужизни в сыворотке). Органическая группа может представлять собой линейную или разветвленную гидрофильную полимерную группу, остаток жирной кислоты или эфира жирной кислоты. В отдельных вариантах гидрофильная полимерная группа может иметь молекулярную массу от примерно 800 до примерно 120000 Да и может представлять собой полиалкиленгликоль (например, полиэтиленгилколь (РЕО), полипропиленгликоль (РРО)), углеводный полимер, полиаминокислоту или поливинипирролидон, и остаток жирной кислоты или эфира жирной кислоты может содержать от примерно восьми до примерно сорока атомов углерода.

Модифицированные антитела и антигенсвязывающие фрагменты изобретения могут содержать одну или несколько органических групп, связанных ковалентно, прямо или косвенно с антителом. Каждая органическая группа, связанная с антителом или антигенсвязывающим фрагментом изобретения, может представлять собой, независимо, гидрофильную полимерную группу, остаток жирной кислоты или остаток эфира жирной кислоты. Используемый в данном описании термин жирная кислота охватывает монокарбоновые кислоты и дикарбоновые кислоты. Используемый в данном описании термин гидрофильная полимерная группа относится к органическому полимеру, который в воде растворяется лучше, чем в октане. Например, полилизин более растворим в воде, чем в октане. Таким образом, антитело, модифицированное ковалентным присоединением полилизина, охватывается изобретением. Гидрофильные полимеры, подходящие для модификации антител изобретения, могут являться линейными или разветвленными и включают, например, полиалкангликоли (например, РЕО, монометоксиполиэтиленгликоль (шРЕО), РРО и т.п.), углеводы (например, декстран, целлюлозу, олигосахариды, полисахариды и т.п.), полимеры гидрофильных аминокислот (например, полилизин, полиаргинин, полиаспартат и т. п.) и поливинилпирролидон. Предпочтительно, гидрофильный полимер, модифицирующий антитело изобретения, имеет молекулярную массу от примерно 800 до примерно 150000 Да как отдельный молекулярный объект. Например, можно использовать РЕО5000 и РЕО20000, где подстрочный индекс представляет собой среднюю молекулярную массу полимера в дальтонах. Гидрофильная полимерная группа может быть замещена одной-шестью алкильными группами или остатками жирных кислот или эфиров жирных кислот. Гидрофильные полимеры, замещенные остатком жирной кислоты или эфира жирной кислоты, можно получить с использованием подходящих способов. Например, полимер, содержащий аминогруппу, можно ввести в реакцию присоединения с карбоксилат-ионом жирной кислоты или эфира жирной кислоты, а активированный карбоксилатион (например, активированный Ν,Ν-карбонилдиимидазолом) жирной кислоты или эфира жирной кислоты можно ввести в реакцию присоединения с гидроксильной группой полимера.

Жирные кислоты и эфиры жирных кислот, подходящие для модификации антител, могут быть насыщенными или могут содержать одну или несколько ненасыщенных связей. Жирными кислотами, подходящими для модификации антител изобретения, являются, например, ионы н-додеканоат (С₁₂, лаурат), н-тетрадеканоат (С14, миристат), н-октадеканоат (С18, стеарат), н-эйкозаноат (С20, арахидат), н-докозаноат (С₂₂, бегенат), н-триаконтаноат (С₃₀), н-тет-раконтаноат (С₄₀), цис-Д9-октадеканоат (С₁₈, олеат), все цисА5,8,11,14-эйкозатетраноаты (С₂₀, арахидонат), октандикарбоновая кислота, тетрадекандикарбоновая

- 20 007005 кислота, октадекандикарбоновая кислота, докозандикарбоновая кислота, и т.п. Подходящими эфирами жирных кислот являются моноэфиры дикарбоновых кислот, содержащие линейную или разветвленную низшую аликильную группу. Низшая аликильная группа может содержать от одного до примерно двенадцати, предпочтительно от одного до примерно шести атомов углерода.

Модифицированные человеческие антитела и антигенсвязывающие фрагменты можно получить с использованием подходящих способов, таких как взаимодействие с одним или несколькими модифицирующими агентами. Используемый в данном описании термин модифицирующий агент относится к подходящей органической группе (например, гидрофильному полимеру, жирной кислоте, эфиру жирной кислоты), содержащей активирующую группу. Активирующая группа представляет собой химическую группу или функциональную группу, которая может, в подходящих условиях, взаимодействовать с другой химической группой, посредством чего образуется ковалентная связь между модифицирующим агентом и другой химической группой. Например, аминореактивными активирующими группами являются электрофильные группы, такие как тозилат, мезилат, галоген (хлор, бром, фтор, йод), Νгидроксисукцинимидилэфиры (ΝΗ8), и т.п. Активирующие группы, которые могут взаимодействовать с тиолами, включают, например, малеимид, йодацетил, акрилоил, пиридилдисульфиды, тиол 5-тиол-2нитробензойной кислоты (ΤΝΒ-тиол), и т.п. Альдегидная функциональная группа может соединяться с амин- или гидразидсодержащими молекулами, а азидогруппа может реагировать с группой трехвалентного фосфора с образованием фосфорамидатных или фосфоримидных связей. Подходящие способы введения активирующих групп в молекулы известны в технике (см., например, Негтапкоп С.Т., Вюсонщда1е Тесйпк|иек. Асабетк Ргекк: 8ап О1едо, СА (1996)). Активирующая группа может соединяться с органической группой непосредственно (например, гидрофильным полимером, жирной кислотой, эфиром жирной кислоты) или через линкерную группу, например двухвалентную группу С₁-С₁₂, где один или несколько атомов углерода могут быть заменены гетероатомом, таким как атом кислорода, азота или серы. Подходящими линкерными группами являются, например, тетраэтиленгликоль, -(СН₂)₃-, -ΝΗ-(ΟΗ₂)₆-ΝΗ-, -(СНЩ-ΝΗ- и -ί.Ή₂-Θ-ί.Ή₂-ί.Ή₂-Θ-ί.Ή₂-ί.Ή₂-ϋ-ί.Ή-ΝΗ-. Модифицирующие агенты, содержащие линкерную группу, можно получить, например, взаимодействием моно-Вос-алкилдиамина (например, моноВос-этилендиамина, моно-Вос-диаминогексана) с жирной кислотой в присутствии 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (БОС), с образованием амидной связи между свободным амином и карбоксилат-ионом жирной кислоты. Защитную группу Вос можно удалить из продукта обработкой трифторуксусной кислотой (ТФК), воздействующей на первичный амин, который может соединяться с другим описанным карбоксилат-ионом или может взаимодействовать с малеиновым ангидридом, и полученный продукт циклизуют, и получают активированное малеимидопроизводное жирной кислоты (см., например, Тйотркоп е1 а1., \¥О 92/16221, включенную в данное описание в качестве ссылки).

Модифицированные антитела изобретения можно получить взаимодействием человеческого антитела или антигенсвязывающего фрагмента с модифицирующим агентом. Например, органические группы можно присоединить к антителу неспецифически, используя аминореактивный модифицирующий агент, например, эфир ΝΗ8 или РЕС. Модифицированные человеческие антитела или антигенсвязывающие фрагменты также можно получить восстановлением дисульфидных связей (например, внутрицепных дисульфидных связей) антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Затем восстановленные антитело или антигенсвязывающий фрагмент можно ввести во взаимодействие с тиолреактивным модифицирующим агентом и получить модифицированное антитело изобретения. Модифицированные человеческие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие органическую группу, связанную со специфическими сайтами антитела настоящего изобретения, можно получить с использованием подходящих способов, таких как обратный протеолиз (Нксй е1 а1., Вюсонщда1е Сйет., 3:147-153 (1992); \Уег1еп е1 а1., Вюсопщда1е Сйет., 5:411-417 (1994); Китагап е1 а1., Рго1еш 8сЕ, 6 (10):2233-2241 (1997); Ной е1 а1., Вюогд. Сйет., 24(1):59-68 (1996); Саре11ак е1 а1., Вю1есйпо1. Вюепд., 56 (4):456-463 (1997)), и способов, описанных в Негтапкоп С.Т., Вюсопщда1е Тесйпк|иек. Асабетк Ргекк: 8ап О1едо, СА (1996).

Антиидиотипические антитела к композициям антитела против ΤΝΕ

Кроме моноклональных или химерных антител против Т№ настоящее изобретение также относится к антиидиотипическим (анти-1б) антителам, специфическим для таких антител изобретения. Анти-1б антитело является антителом, узнающим уникальные детерминанты, обычно ассоциированные с антигенсвязывающим участком другого антитела. Анти-1б можно получить иммунизацией животного того же вида и генетического типа (например, мышиного штамма), что и источник 1б-антитела, антителами или их СИЯ-содержащими участками. Иммунизированное животное будет узнавать и реагировать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела и продуцировать анти-1б антитела. Анти-1б антитела также можно использовать в качестве иммуногена для индукции иммунной реакции у другого животного, продуцирующего так называемые антитела против анти-1б.

Композиции антител против ΤΝΕ

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции антител против Т№, содержащей по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть или по меньшей мере семь или больше его антител против Т№, описанных в данном описании и/или известных в технике, которые образуют компози

- 21 007005 ции, смесь или форму, не встречающиеся в природе. Такие композиции содержат не встречающиеся в природе композиции, содержащие по меньшей мере один или два полноразмерных делегированных по С- и/или Ν-концу варианта, домена, фрагмента или специфических варианта аминокислотной последовательности антитела против ΤΝΡ, выбранной из группы, состоящей из 70-100% последовательных аминокислот 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, или их специфических фрагментов, доменов или вариантов. Предпочтительные композиции антител против ΤΝΡ включают по меньшей мере один или два полноразмерных фрагмента, домена или варианта, таких как по меньшей мере один СОК или БВК, содержащие части последовательности антитела против ΤΝΡ из 70-100% 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 3, 4, 5, 6, или их специфических фрагментов, доменов или вариантов. Другие предпочтительные композиции содержат 40-99% по меньшей мере одной из 70-100% 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 3, 4, 5, 6, или их специфических фрагментов, доменов или вариантов. Проценты таких композиций являются массовыми, объемными, концентрацией, молярностью или моляльностью жидких или сухих растворов, смесей, суспензий, эмульсий или коллоидных систем, известных в технике или описанных в данном описании.

Композиции антител против ΤΝΡ настоящего изобретения также могут включать по меньшей мере одну композицию или фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело против ΤΝΡ, в любом количестве, подходящем и эффективном для клетки, ткани, органа, животного или пациента, нуждающихся в такой модуляции, обработке или лечении, также содержащую, необязательно, по меньшей мере один компонент, выбранный из числа по меньшей мере одного анатагониста (например, антитела против ΤΝΡ или его фрагмента, растворимого рецептора ΤΝΡ или его фрагмента, их слитых белков или антагониста ΤΝΡ с небольшой молекулой, или другого антагониста), антиревматического средства (например, метотрексата, ауранофина, ауротиоглюкозы, азатиоприна, этанерцепта, золотонатрийтиомалата, гидроксихлорохинсульфата, лефлуномида, сульфазалзина), миорелаксанта, наркотического средства, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (Ν8ΆΙΌ), аналгетика, анестетика, седативного средства, местного анестетика, нервно-мышечного блокатора, антимикробного средства (например, аминогликозида, противогрибкого средства, антипаразитарного средства, противовирусного средства, карбапенема, цефалоспорина, фторхинолона, макролида, пенициллина, сульфонамида, тетрациклина, другого антимикробного средства), антипсориатического средства, кортикостероида, анаболического стероида, средства, связанного с диабетом, минерального вещества, питательного вещества, средства для щитовидной железы, витамина, связанного с кальцием гормона, средства против диареи, противокашлевого средства, противорвотного средства, средства против язвы, слабительного, антикоагулянта, эритропоэтина (например, эпоэтина-альфа), филграстима (например, 6-С8Р, №иродеи), сарграмостима (СМ-С8Р, Беикше), средства для иммунизации, иммуноглобулина, иммуносупрессора (например, базиликсимаба, циклоспорина, даклицумаба), гормона роста, гормонзаменяющего лекарственного средства, модулятора эстрогенового рецептора, мидриатического средства, циклоплегического средства, алкилирующего агента, антиметаболита, ингибитора митоза, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, антиманиакального средства, антипсихотического средства, анксиолитика, снотворного, симпатомиметического средства, стимулятора, донепезила, такрина, лекарственного средства против астмы, бета-агониста, стероида для ингаляции, ингибитора лейкотриена, метилксантина, кромолина, эпинерфина или аналога, дорназы-альфа (РЫто/уте), цитокина или антагониста цитокина. Примерами таких цитокинов являются любой из РС-1 - ΙΕ-23, и другие цитокины. Подходящие дозировки хорошо известны в технике. См., например. \Уе11к е! а1., ебк., РйагтасоШегару НаибЬоок, 2иб ЕбШои, Лрр1еЮп аиб Байде, 81атГогб, СТ (2000); ΡΌΚ Рйагтасорое1а, Τа^аксοи Роске! Рйагтасорое1а 2000, Пе1ихе Ебйюи, Τагаксои РиЬйкЫпд, Бота Бшба, СА (2000), включенные в данное описание в качестве ссылок.

Такие противораковые или противоинфекционные средства также могут включать молекулы токсина, ассоциированные, связанные, введенные в состав или вводимые по меньшей мере с одним антителом настоящего изобретения. Токсин, необязательно, может действовать как селективно убивающий патологическую клетку или ткань. Патологическая клетка может являться раковой клеткой или другой клеткой. Такие токсины могут представлять собой очищенные токсины или рекомбинантные токсины, или другие, или фрагменты, содержащие по меньшей мере один функциональный домен токсина, например, выбранный по меньшей мере из одного из числа рицина, дифтерийного токсина, токсина змеиного яда, или бактериальный токсин. Термин токсин также включает как эндотоксины, так и экзотоксины, продуцируемые любыми встречающимися в природе, мутантными или рекомбинантными бактериями или вирусами, которые могут вызвать любое патологическое состояние у человека или других млекопитающих, в том числе токсиновый шок, который может привести к гибели. К таким токсинам можно отнести, не ограничиваясь перечисленным, термолабильный энтеротоксин (БЦ энтеротоксигенной Е. сой, термостабильный энтеротоксин (8Τ) , цитотоксин 8Ыде11а, энтеротоксины Аеготоиак, токсин-1 токсического шока (Τ88Τ-1), стафилококковый энтеротоксин А (8ЕА), В (8ЕВ) или С (8ЕС), стрептококковые энтеротоксины и т. п. К таким бактериям относятся, но не ограничиваются перечисленным, штаммы видов энтеротоксигенной Е. сой (ЕΤЕС), энтерогеморрагической Е. сой (например, штаммы серотипа 0157:Н7), вид 81арйу1ососсик (например, 81арйу1ососсик аигеик, 81арйу1ососсик руодеиек), вид 8Ыде11а (например, 8й1де11а букеШепае, 8Ыде11а Г1ехиеп, 8Ыде11а Ьоуби и 8Ыде11а копией, вид 8а1топе11а (например, 8а1тоие11а 1урй1, 8а1тоие11а сйо1ега-кшк, 8а1тоие11а еи1ег111б1к), вид С1ок1пбйпп (например, С1ок1г1б

- 22 007005 шт регГттдепк, С1ок1пйц.пп йШсйе, С1ок1пйшт ЬоФНшит), вид СатрЫоЬас1ег (например, СатрЫоЬас1ег )е)ип1. СатрЫоЬас1ег Ге!ик), вид Не1юЬас1ег (например, НекоЬасТег ру1оп), вид Аеготопак (например, Аеготопак когЫа, Аеготопак йуйторййа, Аеготопак сау1ае), Р1е1котопак кЫде11о1йек, Уегкша еп!егосо1Шса, вид У1Ьпок (У1Ьпок с1ю1егае. УФпок ратайето1уйсик), вид К1еЬк1е11а, Ркеийотопак аегидЕ пока и 81гер1ососсг См., например, 8!еш, ей., ΙΝΤΕΚΝΑΕ МЕП1СШЕ, 3гй ей., рр. 1-13, Ьййе, Вгоюп апй Со., ВокЮп (1990); Еуапк е! а1., ейк., Вас1епа1 1пГесйопк оГ Нитапк: Ер1йетю1оду апй Соп!го1, 2й Ей., рр. 239-254, Р1епит Мей1са1 Воок Со., №\ν Уогк (1991); Мапйе11 е! а1., Ргтар1ек апй Ргасйсе оГ ИчГесйоик ΌΪ8еакек, 3й Ей., СйитсЫ11 Ь1утдк1опе, №\ν Уогк (1990); Вегкою е! а1., ейк., Т1е Мегск Мапиа1. 1611 ейШоп, Мегск апй Со., Кайюау, Ν.Ε, 1992; \Уоой е! а1., ЕЕМ8 М1сгоЫо1оду 1ттипо1оду, 76:121-134 (1991); Маггаск е! а1., 8аепсе, 248:705-711 (1990), включенные в данное описание в качестве ссылок.

Составы, композиции или комбинации антител против ΤΝΕ настоящего изобретения также могут содержать по меньшей мере одно из любых подходящих вспомогательных веществ, таких как разбавитель, связующее вещество, стабилизатор, буферы, соли, липофильные растворители, консервант, адъювант или подобное вещество. Предпочтительны фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества. Примеры, не являющиеся ограничительными, и способы получения таких стерильных растворов хорошо известны в технике, например, из Сепиаго, Ей., КеттдТоп'к РЬагтасеийса1 8с1епсек, 18'¹' Еййюп, Маск РиЬНкЫпд Со. (Еак!оп, РА), 1990 и других источников. Фармацевтически приемлемые носители можно выбрать обычным образом, чтобы они подходили для способа введения, по растворимости и/или устойчивости композиции антител против ΤΝΕ, фрагментов или вариантов, как хорошо известно в технике или описывается в данном описании.

К фармацевтическим наполнителям и добавкам, полезным в композиции настоящего изобретения, относятся, но не ограничиваются перечисленным, белки, пептиды, аминокислоты, липиды и углеводы (например, сахара, включая моносахариды, ди-, три-, тетра- и олигосахариды; дериватизированные сахара, такие как альдиты, альдоновые кислоты, этерифицированные сахара и т.п.; и полисахариды или полимерные сахара), которые могут присутствовать по отдельности или в сочетании, при содержании одного или в сочетании 1-99,99 мас.% или об.%. Примерами белков-эксципиентов являются сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека (Н8А), рекомбинантный альбумин человека (гНА), желатин, казеин и т.п. Характерными представителями аминокислотных компонентов и/или антител, которые могут функционировать в буфере, являются аланин, глицин, аргинин, бетаин, гистидин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, цистеин, лизин, лейцин, изолейцин, валин, метионин, фенилаланин, аспартам и т. п. Одной из предпочтительных аминокислот является глицин.

Наполнители-углеводы, подходящие для применения в изобретении, включают, например, моносахариды, такие как фруктоза, мальтоза, галактоза, глюкоза, Ό-манноза, сорбоза и т.п.; дисахариды, такие как лактоза, сахароза, трегалоза, целлобиоза и т.п.; полисахариды, такие как рафиноза, мелезитоза, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и т.п.; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилитсорбит (глюцитол), миоинозит и т. п. Предпочтительными углеводными наполнителями для применения в настоящем изобретении являются маннит, трегалоза и рафиноза.

Композиции антител против ΤΝΕ также могут включать буфер или агент для доводки рН, обычно, буфер представляет собой соль, полученную из органической кислоты или основания. Характерные буферы включают соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; трис, гидрохлорид трометамина, или фосфатные буферы. Предпочтительными буферами для применения в настоящем изобретении являются соли органических кислот, такие как цитраты.

Кроме того, композиции антител против ΤΝΕ изобретения могут включать полимерные наполнители/добавки, такие как поливинилпирролидоны, фиколлы (полисахариды), декстраты (например, циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропил-в-циклодекстрин), полиэтиленгликоли, отдушки, антимикробные средства, подсластители, антиоксиданты, антистатики (например, полисорбаты, такие как твин 20 и твин 80), липиды (например, фосфолипиды, жирные кислоты), стероиды (например, холестерин) и хелатообразующие агенты (например, ЭДТК).

Такие и другие известные фармацевтические наполнители и/или добавки, подходящие для применения в композициях антител против ΤΝΕ, частей или вариантов по настоящему изобретению, известны в технике, например, перечисляются в ВештдФп: Τ1κ 8с1епсе & Ртасйсе оГ Рйагтасу, 19'¹' ей., ^1Шатк & ^1Шатк (1995), и в РйукЩап'к Пекк КеГегепсе, 52пй ей., Мей1са1 Есопоткк, Моп!уа1е, Ν1 (1998), включенных в данное описание в качестве ссылок. Предпочтительными носителями или наполнителями являются углеводы (например, сахариды и альдиты) и буферы (например, цитратный) и полимерные вещества.

Композиции

Как отмечалось выше, изобретение относится к устойчивым композициям, представляющим собой, предпочтительно, фосфатный буфер с физиологическим раствором или выбранной солью, а также к стабилизированным растворам и композициям, содержащим консервант, а также к стабилизированным растворам для многократного применения, подходящим для фармацевтического или ветеринарного применения, содержащим по меньшей мере одно антитело против ΤΝΕ в фармацевтически приемлемой компо

- 23 007005 зиции. Стабилизированные композиции содержат по меньшей мере один известный консервант или, необязательно, выбранный из группы, состоящей из по меньшей мере одного из числа фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, нитрита фенилртути, феноксиэтанола, формальдегида, хлорбутанола, хлорида магния (например, гексагидрата), алкилпарабена (например, метил-, этилпропил-, бутилпарабена и т.п.), хлорида бензалкония, хлорида бензотония, дегидроацетата натрия и тимеросала, или их смесей, в водном разбавителе. Можно использовать любую концентрацию или смесь, как известно в технике, такую как 0,001-5%, или в любом интервале или любой величины в указанных пределах, такую как, например, 0,001, 0,003, 0,005, 0,009, 0,01, 0,02, 0,03, 0,05, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,3, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, или в любом интервале или любой величины в указанных пределах. Примеры, не являющиеся ограничительными, включают отсутствие консерванта, 0,1-2% м-крезола (например, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,1-3% бензилового спирта (например, 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), 0,001-0,5% тимеросала (например, 0,005, 0,01%), 0,001-2,0% фенола (например, 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005-1,0% алкилпарабена(ов) (например, 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) и т.п.

Как отмечалось выше, изобретение относится к изделию, содержащему упаковку и по меньшей мере один флакон, содержащий раствор по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ с описанными ранее буферами и/или консервантами, необязательно, в водном разбавителе, где указанная упаковка содержит этикетку, на которой указывается, что такой раствор можно хранить в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66, 72 ч или более. Изобретение также относится к изделию, содержащему упаковку, первый флакон, содержащий лиофилизованное по меньшей мере одно антитело против ΤΝΕ, и второй флакон, содержащий водный разбавитель описанного ранее буфера и/или консерванта, где указанная упаковка содержит этикетку, которая инструктирует пациента, как восстановить по меньшей мере одно антитело против ΤΝΕ в водном разбавителе с образованием раствора, который можно хранить в течение двадцати четырех часов или более.

По меньшей мере одно антитело против ΤΝΕ согласно изобретению можно получить рекомбинантными методами, в том числе, из клеток млекопитающего или трансгенных препаратов, или можно выделить в чистом виде из других биологических источников, как описывается в данном описании или известно в технике.

Содержание по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ в продукте настоящего изобретения включает количества, дающие, после восстановления в случае влажной/сухой системы, концентрации от примерно 1,0 мкг/мл до примерно 1000 мг/мл, хотя рабочими являются и более низкие и более высокие концентрации, в зависимости от предполагаемого носителя при доставке, например составы растворов будут отличаться от чрескожного пэтча, будут разными для легочного, чресслизистого или осмотического введения или введения с микронасосом.

Предпочтительно, водный разбавитель, необязательно, также содержит фармацевтически приемлемый консервант. Предпочтительными консервантами являются консерванты, выбранные из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил-, этил-пропил-, бутилпарабена и т. п.), хлорида бензалкония, хлорида бензотония, дегидроацетата натрия и тимеросала или их смесей. Концентрация консерванта, используемого в композиции, является концентрацией, достаточной для получения антимикробного действия. Такие концентрации зависят от выбранного консерванта и легко определяются специалистом в данной области техники.

Другие наполнители, например агенты для придания изотоничности, буферы, антиоксиданты, усилители консервантов, можно, необязательно и предпочтительно, добавлять к разбавителю. Агент для придания изотоничности, такой как глицерин, обычно используют в известных концентрациях. Физиологически переносимый буфер, предпочтительно, добавляют для обеспечения улучшенного регулирования рН. Композиции могут иметь рН в широком интервале, например, от примерно рН 4 до примерно рН 10, и предпочтительные интервалы составляют от примерно рН 5 до примерно рН 9, и наиболее предпочтителен интервал от примерно 6,0 до примерно 8,0. Предпочтительно, композиции настоящего изобретения имеют рН от примерно 6,8 до примерно 7,8. Предпочтительными буферами являются фосфатные буферы, наиболее предпочтителен натрийфосфатный, в частности, забуференный фосфатом физиологический раствор (РВ8).

В составы или композиции для уменьшения агрегации можно добавлять, необязательно, другие добавки, такие как фармацевтически приемлемые солюбилизаторы, подобные твину 20 (полиоксиэтилен (20)сорбитанмонолаурат), твину 40 (полиоксиэтилен(40)сорбитанмонолаурат), твину 80 (полиоксиэтилен (80)сорбитанмонолаурат), плюронику Ε68 (полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые блоксополимеры) и РЕС (полиэтиленгликоль), или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 20 или 80 или полоксамер 184 или 188, полиолы Р1игоп1с®, другие блоксополимеры и хелатообразователи, такие как ЭДТК и ΕΟΤΛ. Такие добавки особенно полезны, если для введения композиции используют насос или пластиковый контейнер. Присутствие фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества уменьшает склонность белка к агрегации.

- 24 007005

Композиции настоящего изобретения можно получить способом, включающим смешивание по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ и консерванта, выбранного из группы, состоящей из фенола, м-крезола, п-крезола, о-крезола, хлоркрезола, бензилового спирта, алкилпарабена (метил-, этил- пропил-, бутилпарабеена и т.п.), хлорида бензалкония, хлорида бензотония, дегидроацетата натрия и тимеросала, или их смесей, в водном разбавителе. Смешивание по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ и консерванта в водном разбавителе осуществляют с использованием обычных процедур растворения и перемешивания. Для того, чтобы получить подходящую композицию, например, отмеренное количество по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ в забуференном растворе соединяют с нужным консервантом в забуференном растворе в количествах, достаточных для обеспечения нужных концентраций белка и консерванта. Специалист в данной области техники может знать варианты такого способа. Например, порядок добавления компонентов, используются ли дополнительные добавки, температура и рН при получении композиции являются, факторами, которые можно оптимизировать в отношении концентрации и используемого способа введения.

Заявляемые композиции можно предоставить пациентам в виде прозрачных растворов или двух флаконов, в том числе флакона с лиофилизованным по меньшей мере одним антителом против ΤΝΕ, которое восстанавливают с помощью второго флакона, содержащего воду, консервант и/или водный разбавитель. Любой из флаконов - единственный с раствором или один из двух, в котором требуется восстановление, можно использовать повторно несколько раз, и его содержимое может быть достаточным для однократного или нескольких циклов лечения пациента и таким образом может обеспечить более удобный режим лечения, чем доступные в настоящее время.

Заявляемые изделия полезны для введения в течение периода от немедленного до двадцати четырех часов или более. Соответственно, заявляемые изделия предлагают пациенту значительные преимущества. Композиции изобретения могут безопасно храниться при температурах от примерно 2 до примерно 40°С и сохранять биологическую активность белка в течение длительных периодов времени, причем на этикетке на упаковке указывается, что раствор может храниться и/или использоваться на протяжении 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 или 96 ч или более. Если используют содержащий консервант разбавитель, на такой метке могут быть указаны 1-12 месяцев, полгода, полтора года и/или два года.

Растворы, содержащие по меньшей мере одно антитело против ΤΝΕ по изобретению, можно получить способом, включающим смешивание по меньшей мере одного антитела с водным разбавителем. Смешивание осуществляют с использованием обычных процедур растворения и перемешивания. Для того, чтобы получить подходящее разбавление, например, отмеренное количество по меньшей мере одного антитела в воде или буфере соединяют в количествах, достаточных для предоставления белка и, необязательно, консерванта или буфера в нужных концентрациях. Специалист в данной области техники может знать варианты такого способа. Например, порядок добавления компонентов, используются ли дополнительные добавки, температура и рН при получении композиции являются факторами, которые можно оптимизировать в отношении концентрации и используемого способа введения.

Заявляемые продукты можно предоставить пациентам в виде прозрачных растворов или двух флаконов, в том числе флакона с лиофилизованным по меньшей мере одним антителом против ΤΝΕ, которое восстанавливают с помощью второго флакона, содержащего водный разбавитель. Любой из флаконов единственный с раствором или один из двух, в котором требуется восстановление, можно использовать повторно несколько раз, и его содержимое может быть достаточным для однократного или нескольких циклов лечения пациента и таким образом обеспечивает более удобный режим лечения, чем доступные в настоящее время.

Заявляемые продукты можно предоставить пациентам косвенно, обеспечивая аптеки, клиники или другие такие учреждения и объекты прозрачными растворами или двумя флаконами, в том числе флаконом с лиофилизованным по меньшей мере одним антителом против ΤΝΕ, которое восстанавливают с помощью второго флакона, содержащего водный разбавитель. В таком случае прозрачный раствор может находиться в емкости до одного литра и даже большей, из которой более маленькие порции раствора по меньшей мере одного антитела можно брать один или несколько раз и переносить в меньшие флаконы для обеспечения покупателей аптеки или пациентов клиники.

Известные устройства, содержащие такие системы из отдельных флаконов, включают пэн-шприцы для доставки раствора, такие как ΒΌ Репк, ΒΌ Аи1о)ес1ог®. Нита)ес1®. ЫоуоРеп®, В-Э®Реп, Аи!оРеп® и ОрЕРеп®, ОепоЕоршРеп®, Сепо1гопогт Реп®, Нита1го Реп®, Кесо-Реп®, КоГегоп Реп®, В1о)ес1ог®. уес!®, Э-Г1р ^ебк-Втее 1п)есЮг®. [п(г|ес(®, Меб|-1ес1®. например, изготовленные или разработанные ВесЮп Б|скеп5еп (Франклин-Лэйкс, Нью-Джерси), \у\у\у.Ьес1опб1скеп5оп.сот). Бщейошс (Бурдорф, Швейцария, ууу.бщеЕошс.сот), В1о_|ес(. Портленд, Орегон (\у\у\у.Ыо)ес1.сот). Ыа11опа1 Меб1са1 РгобисК ХУейоп Меб1са1 (Петербург, Соединенное Королевство, \у\у\у.\уейоп-теб1са1.сот). МебГОес! Согр. (Миннеаполис, Миннесота, \у\у\у.тебцес1.сот). Известные устройства с системой с двумя флаконами включают системы пэн-шприцов для восстановления лиофилизованного лекарственного средства в картрижде для доставки восстановленного раствора, такие как Нита1гоРеп®.

Заявляемые продукты включают упаковку. Упаковка обеспечивает, кроме информации, требуемой проверяющими органами, условия, в которых продукт можно использовать. Упаковка настоящего изо

- 25 007005 бретения в случае двух флаконов с сухим/влажным продуктом предоставляет инструкции для пациента по восстановлению раствора по меньшей мере одного антитела против ΤΝΡ в водном разбавителе и по применению раствора в течение периода в 2-24 ч или более. В случае одного флакона с продуктомраствором, этикетка указывает, что такой раствор можно использовать в течение периода в 2-24 ч или более. Заявляемые продукты полезны для применения в качестве фармацевтических продуктов для людей.

Композиции настоящего изобретения можно получить способом, включающим смешивание по меньшей мере одного антитела против ΤΝΡ и выбранного буфера, предпочтительно фосфатного буфера, содержащего физиологический раствор или выбранную соль. Смешивание по меньшей мере одного антитела против ΤΝΡ и буфера в водном разбавителе осуществляют с использованием обычных процедур растворения и перемешивания. Для того, чтобы получить подходящую композицию, например, отмеренное количество по меньшей мере одного антитела в воде или буфере соединяют с нужным буферирующим агентом в воде в количествах, достаточных для предоставления белка и буфера в нужных концентрациях. Специалист в данной области техники может знать варианты такого способа. Например, порядок добавления компонентов, используются ли дополнительные добавки, температура и рН при получении композиции, являются факторами, которые можно оптимизировать в отношении концентрации и используемого способа введения.

Заявляемые устойчивые или стабилизированные композиции можно предоставить пациентам в виде прозрачных растворов или в виде двух флаконов, включающих флакон с лиофилизованным по меньшей мере одним антителом против ΤΝΡ, которое восстанавливают с помощью второго флакона, содержащего консервант или буфер и наполнители в водном разбавителе. Любой из флаконов - единственный с раствором или один из двух, в котором требуется восстановление до раствора, можно использовать повторно несколько раз, и его содержимое может быть достаточным для однократного или нескольких циклов лечения пациента и таким образом обеспечивает более удобный режим лечения, чем доступные в настоящее время.

По меньшей мере одного типа антитела против ΤΝΡ в виде или устойчивых или стабилизированных композиций или растворов, описанных в данном описании, можно ввести пациенту согласно настоящему изобретению с помощью различных способов доставки, включая ΞС или ΙΜ инъекцию; чрескожный, легочный, чресслизистый, с помощью имплантата, осмотического насоса, картриджа, микронасоса или другие способы, хорошо известные в данной области.

Терапевтические применения

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного связанного с ΤΝΡ заболевания, в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, известному в технике или описанному в данном описании, с использованием по меньшей мере одного двухинтегринового антитела настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного связанного с ΤΝΡ заболевания, в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, в том числе, но без ограничения, по меньшей мере одного заболевания из числа ожирения, заболевания иммунной системы, сердечно-сосудистого заболевания, инфекционной болезни, злокачественной болезни или нервной болезни.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного иммунного заболевания в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, в том числе, но без ограничения, по меньшей мере одного заболевания из числа ревматоидного артрита, ювенильного ревматоидного артрита, системного начального ювенильного ревматоидного артрита, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, язвы желудка, серонегативной артропатии, остеоартрита, воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита, системной красной волчанки, антифосфолипидного синдрома, иридоциклита/увеита/оптического неврита, идиопатического пневмофиброза, системного васкулита/грануломатоза Вегенера, саркоидоза, орхита/обратных процедур вазэктомии, аллергических/атопических болезней, астмы, аллергического ринита, экземы, аллергического контактного дерматита, аллергического конъюнктивита, пневмонита при гиперчувствительности, трансплантатов, отторжения трансплантатов органов, болезни трансплантат против хозяина, синдрома системной воспалительной реакции, грамположительного сепсиса, грамотрицательного сепсиса, культуроотрицательного сепсиса, грибкового сепсиса, нейтропенической лихорадки, уросепсиса, менингококцемии, травмы/кровоизлияния, ожогов, воздействия ионизирующего излучения, острого панкреатита, респираторного дистресссиндрома взрослых, алкогольного гепатита, хронических воспалительных патологий, болезни Крона, серповидно-клеточной анемии, нефроза, атопических болезней, аллергических реакций, сенной лихорадки, круглогодичного ринита, конъюнктивита, эндометриоза, крапивницы, системной анафилаксии, дерматита, пернициозной анемии, гемолитической болезни, тромбоцитопении, отторжения трансплантата любого органа или ткани, отторжения трансплантата почек, отторжения трансплантата сердца, отторжения трансплантата печени, отторжения трансплантата поджелудочной железы, отторжения трансплантата легкого, отторжения трансплантата костного мозга (ВМТ), отторжения аллотрансплантата кожи, отторжения хрящевого трансплантата, отторжения костного трансплантата, отторжения трансплантата

- 26 007005 тонкой кишки, отторжения имплантата плодного тимуса, отторжения трансплантата паращитовидной железы, отторжения ксенотрансплантата любого органа или ткани, отторжения аллотрансплантата, антирецепторных аллергически реакций, болезни Грейвса, болезни Рейно, инсулинрезистентного диабета по типу В, тяжелой псевдопаралитической миастении, опосредуемой антителами цитотоксичности, аллергических реакций по ΙΙΙ типу, синдрома РОЕМ8 (сочетания полинейропатии, спланхномегалии, эндокринопатии, моноклональной гаммапатии и патологии кожи), полинейропатии, спланхномегалии, эндокринопатии, моноклональной гаммапатии, синдрома изменений кожи, пузырчатки, склеродермии, смешанной болезни соединительной ткани, идийпатической болезни Аддисона, сахарного диабета, хронического активного гепатита, первичного билиарного цирроза, витилиго, васкулита, синдрома постинфарктной кардиотомии, гипертензии по типу Ιν, гранулем, вызванных внутриклеточными паразитами, чувствительности к лекарственному средству, болезни обмена веществ/идиопатического заболевания, болезни Вильсона, гемохроматоза, дефицита альфа-1-ингибитора трипсина, диабетической ретинопатии, тиреоидита Хасимото, остеопороза, развития оси гипоталамуса-гипофиза-надпочечников, тиреоидита, энцефаломиелита, кахексии, муковисцидоза, хронической болезни легких новорожденных, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), наследственного гематофагоцитарного лимфогистиоцитоза, кожных состояний, псориаза, алопеции, нефротического синдрома, нефрита, гломерулонефрита, острой почечной недостаточности, гемодиализа, уремии, отравлении, преэклампсии, при терапии ок13. цитокиновой терапии, химиотерапии, лучевой терапии (например, включая лечение тоастении, анемии, кахексии и т.п.), хронической салицилатной интоксикации и т.п. См., например, Мегск Маша! 12(Н-17(Ь Е616оп8, Мегск & Со трапу, Яайгау, Ν6 (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999); РйагтасоШегару Шп^ооЦ \Уе115 е( а1., еб§., 8есоЫ ЕбНют ΑρρΕΕη аиб Ьа^е, 81ат£огб, Сопп. (1998, 2000), включенные в данное описание в качестве ссылок.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одного сердечно-сосудистого заболевания в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, в том числе, но без ограничения, по меньшей мере одного заболевания из числа синдрома остановки сердца, инфаркта миокарда, застойной сердечной недостаточности, инсульта, ишемического удара, кровоизлияния, артериосклероза, атеросклероза, рестеноза, диабетической атеросклеротической болезни, гипертензии, артериальной гипертензии, реноваскулярной гипертензии, синкопе, шока, сифилиса сердечно-сосудистой системы, сердечной недостаточности, легочного сердца, первичной легочной гипертензии, сердечных аритмий, эктопических сокращений предсердий, трепетания предсердий, фибрилляции предсердий (непрерывной или пароксизмальной), постперфузионного синдрома, воспалительной реакции на аппарат искусственного кровообращения, хаотической или мультифокальной предсердной тахикардии, регулярной тахикардии узких ОЯ8, специфических аритмий, фибрилляции желудочков, аритмии пучка Гиса, атрио-вентрикулярной блокады, блокады ножки пучка Гиса, миокардиальных ишемических нарушений, ишемической болезни сердца, стенокардии, кардиомиопатии, дилятационной застойной кардиомиопатии, рестриктивной кардиомиопатии, пороков клапанов сердца, эндокардита, болезни перикарда, кардиальных опухолей, аортальных и периферических аневризм, рассечения аорты, воспаления аорты, закупорки брюшной аорты и ее ветвей, периферических сосудистых нарушений, закупорки артерий, атеросклероза периферических сосудов, облитерирующего тромбоангиита, функциональных нарушений периферических артерий, феномена и болезни Рейно, акроцианоза, эритромелалгим, болезней вен, тромбоза вен, варикозной болезни вен, артериовенозного свища, лимфедемы, жирового отека, нестабильной стенокардии, постнасосного синдрома и т. п. Такой способ может, необязательно, включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции по меньшей мере одного антитела против ΤΝΡ в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, нуждающимся в таких модуляции, обработке или лечении.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одной инфекционной болезни в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, в том числе, но без ограничения, по меньшей мере одной болезни из числа острой или хронической бактериальной инфекции, острого и хронического паразитарного или инфекционного процесса, в том числе, бактериальных, вирусных и грибковых инфекций, ВИЧ-инфекции/ВИЧ-невропатии, менингита, гепатита (А, В или С или подобного), септического артрита, перитонита, пневмонии, эпиглоттита, заражения Е. сой 0157:к7, гемолитического уремического синдрома/тромболитической тромбоцитопенической пурпуры, малярии, геморрагической лихорадки денге, лейшманиоза, лепры, токсического шока, стрептококкового миозита, газовой гангрены, заражения МусоЬас1епшп ШЬегсйоык, МусоЬасЮгшт ηνίιιιη т1гасе11и1аге, пневмонии Рηеишοсу8ί^8 сагиб, воспаления тазовых органов, орхита/эпидидимита, заражения ^ед^οηе11а, болезни Лайма, гриппа, заражения вирусом Эпстайна-Барр, угрожающего жизни гемафагоцитарного синдрома, угрожающего жизни энцефалита/асептического менингита и подобных болезней.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одной злокачественной болезни в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, в том числе, но без ограничения, по меньшей мере одной болезни из числа лейкоза, острого лейкоза, острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), В-клеточного, Т-клеточного или ΡΑΒ ОЛЛ, острого миелоидного лейкоза (ЛМЕ), хронического миелолейкоза (ХМЛ), хронического лимфолейкоза (ХЛЛ), волосато-клеточного лейкоза, миело- 27 007005 диспластического синдрома (МО8), лимфомы, болезни Ходжкина, злокачественной лимфомы, неходжкинской лимфомы, лимфомы Беркитта, множественной лимфомы, саркомы Капоши, колоректальной карциномы, панкреатической карциномы, назофарингеальной карциномы, злокачественного гистиоцитоза, паранеопластического синдрома/гиперкальциемии злокачественной опухоли, солидных опухолей, аденокарцином, сарком, злокачественной меланомы, гемангиомы, метастазирующей опухоли, резорбции костей, связанной со злокачественной опухолью, боли в костях, связанной со злокачественной опухолью, и подобных болезней.

Настоящее изобретение также относится к способу модуляции или лечения по меньшей мере одной нервной болезни в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, в том числе, но без ограничения, по меньшей мере одной болезни из числа нейродегенеративных заболеваний, рассеянного склероза, мигрени, СПИД-ассоциированной деменции, демиелинизирующих болезней, таких как рассеянный склероз и острый поперечный миелит; экстрапирамидальных и мозжечковых расстройств, таких как повреждения кортикоспинальной системы; нарушений базальных ядер или мозжечковых расстройств; гиперкинетических двигательных расстройств, таких как хорея Гентингтона и старческая хорея; расстройств движения, вызванных лекарственным средством, таких как расстройства, вызванные лекарственными средствами, блокирующими допаминовые рецепторы ЦНС; гипокинетических двигательных расстройств, таких как болезнь Паркинсона; прогрессирующего надъядерного паралича; структурных повреждений мозжечка; спиномозжечковых дегенеративных состояний, таких как спинальная атаксия, атаксия Фридрайха, мозжечковокорковые дегенеративные состояния, дегенеративные состояния множества систем (Менцеля, Дижерина-Томаса, Ши-Драгера и Мачадо-Жозефа); системных расстройств (болезни Рефсума, абеталипопротеидемии, атаксии, телеангиэктазии и митохондриального многосистемного расстройства); демиелинизирующих серединных расстройств, таких как рассеянный склероз, острый поперечный миелит; и расстройств двигательных единиц, таких как нейрогенные мышечные атрофии (дегенерации клеток переднего рога, такой как боковой амиотрофический склероз, спинальная мышечная атрофия детей раннего возраста, юношеская спинальная мышечная атрофия); болезни Альцгеймера; синдрома Дауна в среднем возрасте; диффузной болезни тела Льюи; старческой деменции, ассоциированной с телом Льюи; синдрома Вернике-Корсакова; хронического алкоголизма; болезни Крейтцфельдта-Якоба; подострого склерозирующего панэнцефалита, болезни Халлеррордена-Шпаца и деменции боксеров, и подобных болезней. Такой способ может включать, необязательно, введение по меньшей мере одного антитела против Т№ или специфической части или варианта в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, нуждающимся в таких модуляции, обработке или лечении. См., например, Мегск МашаЕ 16'¹' ЕбШощ Мегск & Сοтрашу, Какгау, N1 (1992).

Любой способ настоящего изобретения может включать введение эффективного количества композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело против Т№, в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, нуждающимся в такой модуляции, обработке или терапии. Такой способ может, необязательно, также включать совместное введение или комбинированную терапию для лечения такого иммунного заболевания, где введение указанного по меньшей мере одного антитела против ΊΝΕ, его специфической части или варианта, также сопровождается введением до, одновременно и/или после по меньшей мере одного активного компонента, выбранного из числа по меньшей мере одного антагониста (например, антитела против Т№ или его фрагмента, растворимого рецептора ΊΝΕ или его фрагмента, их слитых белков или антагониста ΊΝΕ с небольшой молекулой, или другого антагониста), антиревматического средства (например, метотрексата, ауранофина, ауротиоглюкозы, азатиоприна, этанерцепта, золотонатрийтиомалата, гидроксихлорохинсульфата, лефлуномида, сульфазалзина), миорелаксанта, наркотического средства, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (Ν8ΑΙΌ), аналгетика, анестетика, седативного средства, местного анестетика, нервно-мышечного блокатора, антимикробного средства (например, аминогликозида, противогрибкого средства, антипаразитарного средства, противовирусного средства, карбапенема, цефалоспорина, фторхинолона, макролида, пенициллина, сульфонамида, тетрациклина, другого антимикробного средства), антипсориатического средства, кортикостероида, анаболического стероида, средства, связанного с диабетом, минерального вещества, питательного вещества, средства для щитовидной железы, витамина, связанного с кальцием гормона, средства против диареи, противокашлевого средства, противорвотного средства, средства против язвы, слабительного, антикоагулянта, эритропоэтина (например, эпоэтина-альфа), филграстима (например, 6-С8Е, Nеирοдеη), сарграмостима (СМ-С8Е, Ьеикше), средства для иммунизации, иммуноглобулина, иммуносупрессора (например, базиликсимаба, циклоспорина, даклицумаба), гормона роста, гормонзаменяющего лекарственного средства, модулятора эстрогенового рецептора, мидриатического средства, циклоплегического средства, алкилирующего агента, антиметаболита, митотического ингибитора, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, антиманиакального средства, антипсихотического средства, анксиолитика, снотворного, симпатомиметического средства, стимулятора, донепезила, такрина, лекарственного средства против астмы, бета-агониста, стероида для ингаляции, ингибитора лейкотриена, метилксантина, кромолина, эпинерфина или аналога, дорназы-альфа (Ри1тοζуте), цитокина или антагониста цитокина. Подходящие дозировки хорошо известны в технике. См., например, \Уе1Е е1 а1., е4§., РкаттасоШетару НашάЬοοк, 2^ш| Е6Шоп, Арр1еЮг1 ηηά Еагще, 8!атЕотб, СТ (2000); РОК Ркаттасорое1а, Тагахсог! Роске! Ркат

- 28 007005 тасорое1а 2000, Эе1ихе Εάϋίοη, Τηπι^οη ΡυΜίδΗιηβ, Ьота Ьтйа, СА (2000), включенные в данное описание в качестве ссылок.

Антагонистами ΤΝΡ, подходящими для композиций, комбинированной терапии, совместного введения, устройств и/или способов настоящего изобретения (также включающие в себя по меньшей мере одно антитело, его специфическую часть и вариант настоящего изобретения), являются, но не ограничиваются перечисленным, антитела против ΤΝΡ, их антигенсвязывающие фрагменты и рецепторные молекулы, специфически связывающиеся с ΤΝΡ; соединения, предотвращающие и/или ингибирующие синтез ΤΝΡ, высвобождение ΤΝΡ или его действие на клетки-мишени, такие как талидомид, тенидап, ингибиторы фосфодиэстеразы (например, пентоксифиллин и ролипрам), агонисты аденозиновых рецепторов А2Ь и усилители аденозиновых рецепторов А2Ь; соединения, предотвращающие и/или ингибирующие передачу сигнала рецепторами ΤΝΡ, такие как ингибиторы митогенактивированной протеинкиназ (МАРкиназ); соединения, блокирующие и/или ингибирующие расщепление мембранного ΤΝΡ, такие как ингибиторы металлопротеиназ; соединения, блокирующие и/или ингибирующие ΤΝΡ-активность, такие как ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) (например, каптоприл); и соединения, блокирующие и/или ингибирующие продуцирование и/или синтез ΤΝΡ, такие как ингибиторы МАР-киназ.

В данном случае антитело к фактору некроза опухоли, антитело против ΤΝΡ, антитело против ΤΝΡ-а или фрагмент уменьшает, блокирует, ингибирует, отменяет или препятствует активности ΤΝΡ-α ίη νίίτο, ίη δίΐιι и/или, предпочтительно, ίη νίνο. Например, . подходящее антитело против ΤΝΡ человека настоящего изобретения может связываться с ΤΝΡ-α, и к нему относятся антитела против ΤΝΡ, их антигенсвязывающие фрагменты и их специфические мутанты или домены, специфически связывающиеся с ΤΝΡα. Подходящее антитело против ΤΝΡ или фрагмент также могут ослаблять, блокировать, отменять, препятствовать, предотвращать и/или ингибировать синтез РНК, ДНК или белка ΤΝΡ, высвобождение ΤΝΡ, продуцирование и/или синтез ΤΝΡ.

Химерное антитело сА2 состоит из антигенсвязывающей вариабельной области высокоаффинного нейтрализующего мышиного античеловеческого антитела против ΤΝΡ-α Ι§Ο1, обозначенного А2, и константной области человеческого каппа-иммуноглобулина Ι§Ο1. Участок Ρс человеческого ЦС1 улучшает аллогенную эффекторную функцию антитела, повышает сывороточное время полужизни в кровотоке и уменьшает иммуногенность антитела. Авидность и специфичность антигенной детерминанты химерного антитела сА2 происходят от вариабельной области мышиного антитела А2. В отдельном варианте предпочтительным источником для нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельную область мышиного антитела А2 является гибридомная клеточная линия А2.

Химерное А2 (сА2) нейтрализует цитотоксическое действие как природного, так и рекомбинантного человеческого ΤΝΡ-α в зависимости от дозы. Из анализов связывания химерного антитела сА2 и рекомбинантного человеческого ΤΝΡ-α вычислена константа аффинности химерного антитела сА2, равная 1,04х10¹⁰ М^-1. Предпочтительные способы определения специфичности и аффинности моноклональных антител методом конкурентного ингибирования можно найти в Η;·ιιΊο\ν е! а1., Аη!^Ьοά^е8: А Ьа^гайгу Маииа1, Οο1ά 8ртшд ΗπιΡογ ^аЬο^а!ο^у ΡϊΌδδ, Οο1ά 8рппд На^т, №\ν ΥοιΈ 1988; РоЖдаи е! а1., ейк., СиггеШ Ρτο!ο^1δ ίη Iттиηο1οду, Сгееме ΡιιΝΝΙιίηβ Акюс. аиб ^11еу Iη!е^8с^еηсе, №\ν Υογ1< (1992-2000); Κοζе! а1., Iттиηο1. ^бау, 4:72-79 (1983); АизиЬе1 е! а1., ебк., СиггеЫ ΡγοΙο^Ν ίη Μο^^^τ Βίο1ο^, ^11еу Iηΐе^8с^еηсе, №\ν Υογ1< (1987-2000); и ΜιΠΕγ Μе!Ь. Εηζутο1., 92:589-601 (1983), включенных в данное описание в качестве ссылок.

В отдельном варианте мышиные моноклональные антитела А2 получают с помощью клеточной линии, обозначенной с 134 А. Химерные антитела сА2 получают с помощью клеточной линии, обозначенной с168А.

В технике описаны другие примеры моноклональных антител против ΤΝΡ, которые можно использовать в настоящем изобретении (см., например, патент США № 5231024; Μο1Βτ е! а1., Суйкте, 2(3):162169 (1990); заявка на патент США № 07/943852 (зарегистрирована 11 сентября 1992 года); Κηΐΐ^η е! а1., международная публикация № XVΟ 91/02078 (опубликована 21 февраля 1991); ВиЬш е! а1., публикация патента ЕРО № 0218868 (опубликована 22 апреля 1987 года); Υοικ е! а1., публикация патента ЕРО № 0288088 (опубликована 26 октября 1988 года); Манд е! а1., БюсНет. Βίορίκδ. Век. Сотт., 137:847-854 (1986); Μеаде^ е! а1., ЩЬи^та, 6:305-311 (1987); Ρеηά1у е! а1., ЩЬи^та, 6:359-369 (1987); Β^^ηдтаη е! а1., ЩЬи^та, 6:489-507 (1987); и Ниш е! а1., I. Iттиηο1. Μе!Ь., 95:57-62 (1987), включенные в данное описание в качестве ссылок.

Рецепторные молекулы ΤΝΕ

Предпочтительными рецепторными молекулами ΤΝΡ, полезными в настоящем изобретении, являются молекулы, связывающиеся с ΤΝΡ-α с высокой аффинностью (см., например, Ρе1άтаηи е! а1., международная публикация № νΟ 92/07076 (опубликована 30 апреля 1992 г); 8сНа11 е! а1., Се11, 61:361-370 (1990); и ^οе!8Ье^ е! а1., Се11, 61:351-359 (1990), включенные в данное описание в качестве ссылок) и, необязательно, обладающие низкой иммуногенностью. В частности, в настоящем изобретении полезны рецепторы клеточной поверхности ΤΝΡ в 55 кДа (р55 ΤΝΡ-В) и 75 кДА (р75 ΤΝΡ-В). Укороченные формы таких рецепторов, содержащие внеклеточные домены (Έί',Ό) рецепторов или их функциональные

- 29 007005 части (см., например, Οογοογοπ е! а1., Еиг. 1. Вюсйет., 223:840 (1994)), также полезны в настоящем изобретении. Укороченные формы рецепторов ΤΝΕ, содержащие ЕСЭ, обнаружены в урине и сыворотке в виде белков массой 20 и 40 кДа, ингибирующих связывание ΤΝΕ-α (Еиде1таии е! а1., 1. Βίο1. Сйет., 265:1531-1536 (1990)). Мультимерные рецепторные молекулы ΤΝΕ и гибридные иммунорецепторные молекулы ΤΝΕ и их производные и фрагменты или части являются дополнительными примерами рецепторов молекул ΤΝΕ, полезных в способах и композициях настоящего изобретения. Рецепторные молекулы ΤΝΕ, которые можно использовать в изобретении, характеризуются своей способностью оказывать лечебное действие на пациентов длительтое время с хорошим и даже превосходным облегчением симптомов и низкой токсичностью. Низкая иммуногенность и/или высокая аффинность, а также другие не указанные свойства, могут вносить вклад в достигаемые результаты лечения.

Мультимерные рецепторные молекулы ΤΝΕ, полезные в настоящем изобретении, содержат полную или функциональную часть Εί,Ό двух или большего числа рецепторов ΤΝΕ, связанные через пептидные линкеры или другие непептидные связи, такие как полиэтиленгликоль (РЕС). Мультимерные молекулы также могут содержать сигнальный пептид секретируемого белка для экспрессии мультимерной молекулы. Такие мультимерные молекулы и способы их получения описываются в заявке на патент США № 08/437533 (зарегистрированной 9 мая 1995 года), включенной в данное описание в качестве ссылки.

Гибридные иммунорецепторные молекулы ΤΝΕ, полезные в способах и композициях настоящего изобретения, содержат по меньшей мере одну часть одной или нескольких молекул иммуноглобулинов и целиком или функциональную часть одного или нескольких рецепторов ΤΝΕ. Такие гибридные иммунорецепторные молекулы можно собрать в виде мономеров или гетеро- или гомодимеров. Гибридные иммунорецепторные молекулы также могут быть одновалентными или многовалентными. Примером такой гибридной иммунорецепторной молекулы ΤΝΕ является слитый белок рецептора ΤΝΕ и 1дС (рецептор ΤΝΕ/Ι§^. Гибридные иммунорецепторные молекулы ΤΝΓ и способы их получения известны в технике (Ъе881аиег ег а1., Еиг, 1. Iттυиο1., 21:2883-2886 (1991); А^Икеиа/! е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А, 88:10535-10539 (1991); Рерре1 е! а1. , 1. Ехр. Меб., 174:1483-1489 (1991); Κο1Η е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А, 91:215-219 (1994); Ви!1ег е! а1., Суккше, 6(6):616-623 (1994); Вакег е! а1., Еиг, 1. Iттυиο1., 24:20402048 (1994); Веи!1ег е! а1., патент США № 5447851; и заявка на патент США № 08/442133 (зарегистрированная 16 мая 1995 г), все работы внесены в данное описание в качестве ссылок). Способы получения гибридных иммунорецепторных молекул можно также найти в Сарοи е! а1., патент США № 5116964; Сарοи е! а1., патент США № 5225538; и Сарοи е! а1., №!иге, 337:525-531 (1989), все работы внесены в данное описание в качестве ссылок.

Функциональный эквивалент, фрагмент или участок рецепторной молекулы ΤΝΕ относится к части рецепторной молекулы ΤΝΕ или части последовательности рецепторной молекулы ΤΝΕ, кодирующей рецепторную молекулу ΤΝΕ, имеющей достаточный размер и последовательности для того, чтобы походить на рецепторные молекулы ΤΝΕ, которые можно использовать в настоящем изобретении (например, связывающиеся с ΤΝΕ с высокой аффинностью и обладающие низкой иммуногенностью). Функциональный эквивалент рецепторной молекулы ΤΝΕ также включает модифицированные рецепторные молекулы ΤΝΕ, функционально похожие на рецепторные молекулы ΤΝΕ, которые можно использовать в настоящем изобретении (например, связывающиеся с ΤΝΕ с высокой аффинностью и обладающие низкой иммуногенностью). Например, функциональный эквивалент рецепторной молекулы ΤΝΕ может содержать молчащий кодон или одну или несколько аминокислотных замен, делеций или присоединений (например, замену одной аминокислоты на другую аминокислоту; или замену кодона, кодирующего ту же самую или другую гидрофобную аминокислоту, на другой кодон, кодирующий гидрофобную аминокислоту). См. Ли5иЬе1 е! а1., Сштеи! РюЮ^Е ίη Μο^αιΕπ ВюЕду, Сгееие ΡυЬ1^8Ыид Акгос. апб «беу1п1ег8с1епсе, Νονν ΥογΕ (1987-2000).

Цитокины включают любой известный цитокин. См., например, Сοреν^ΐйСу!οк^ие8.сοт. Антагонистами цитокинов являются, но не ограничиваются перечисленным, любое антитело, его фрагмент или миметик, любой растворимый рецептор, его фрагмент или миметик, любой низкомолекулярный антагонист или любое их сочетание.

Терапевтическое лечение

Любой способ настоящего изобретения может заключаться в способе лечения опосредуемого ΤΝΕ расстройства, включающего введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело против ΤΝΕ, в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, нуждающимся в таких модуляции, обработке или лечении. Такой способ также может заключаться, необязательно, в совместном введении или комбинированной терапии для лечения таких иммунных заболеваний, где введение указанного по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ, его специфической части или варианта, также включает введение до, одновременно и/или после по меньшей мере одного активного компонента, выбранного из числа по меньшей мере одного антагониста ΤΝΕ (например, но без ограничений, антитела против ΤΝΕ или его фрагмента, растворимого рецептора ΤΝΕ или его фрагмента, их слитых белков или антагониста ΤΝΕ с небольшой молекулой), антиревматического средства (например, метотрексата, ауранофина, ауротиоглюкозы, азатиоприна, этанерцепта, золотонатрийтиомалата, гидроксихлорохинсульфата, лефлуномида, сульфазалзина), миорелаксанта, наркотическо

- 30 007005 го средства, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (№А1Э), аналгетика, анестетика, седативного средства, местного анестетика, нервно-мышечного блокатора, антимикробного средства (например, аминогликозида, противогрибкого средства, антипаразитарного средства, противовирусного средства, карбапенема, цефалоспорина, фторхинолона, макролида, пенициллина, сульфонамида, тетрациклина, другого антимикробного средства), антипсориатического средства, кортикостероида, анаболического стероида, средства, связанного с диабетом, минерального вещества, питательного вещества, средства для щитовидной железы, витамина, связанного с кальцием гормона, средства против диареи, противокашлевого средства, противорвотного средства, средства против язвы, слабительного, антикоагулянта, эритропоэтина (например, эпоэтина-альфа), филграстима (например, 6-С8Е, №иродеп), сарграмостима (СМ-С8Е, Ьеикше), средства для иммунизации, иммуноглобулина, иммуносупрессора (например, базиликсимаба, циклоспорина, даклицумаба), гормона роста, гормонзаменяющего лекарственного средства, модулятора эстрогенового рецептора, мидриатического средства, циклоплегического средства, алкилирующего агента, антиметаболита, митотического ингибитора, радиофармацевтического средства, антидепрессанта, антиманиакального средства, антипсихотического средства, анксиолитика, снотворного, симпатомиметического средства, стимулятора, донепезила, такрина, лекарственного средства против астмы, бета-агониста, стероида для ингаляции, ингибитора лейкотриена, метилксантина, кромолина, эпинерфина или аналога, дорназы-альфа (Ри1то/уте), цитокина или антагониста цитокина.

Обычно лечение патологических состояний осуществляют путем введения эффективного количества или дозировки по меньшей мере одной композиции антител против ΤΝΕ, в целом, в среднем, в интервале от по меньшей мере примерно 0,01 до 500 мг по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ на кг массы тела пациента на дозу и предпочтительно от по меньшей мере примерно 0,ΐ до ΐ00 мг антител на кг массы тела пациента на однократное или многократное введение, в зависимости от специфической активности, содержащейся в композиции. С другой стороны, эффективная концентрация в сыворотке может составлять 0,1-5000 мкг/мл на однократное или многократное введение. Подходящие дозировки известны врачам и будут, конечно, зависеть от конкретного болезненного состояния, специфической активности вводимой композиции и состояния конкретного пациента, подвергаемого лечению. В некоторых случаях для достижения требуемого лечебного количества может потребоваться повторное введение, т. е. повторное отдельное введение конктерной контролируемой или отмеренной дозы, где отдельные введения повторяют до достижения нужной суточной дозы или желаемого эффекта.

Предпочтительные дозы могут включать, необязательно, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ΐ0, ΐΐ, ΐ2, ΐ3, ΐ4, ΐ5, ΐ6, ΐ7, ΐ8, ΐ9, 20, 2ΐ, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 3ΐ, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 и/или ΐ00-500 мг/кг/введение, или любой интервал, величину или часть в указанных пределах, или количество для достижения в сыворотке концентрации 0,ΐ, 0,5, 0,9, ΐ,0, ΐ,ΐ, ΐ,2, ΐ,5, ΐ,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, ΐ0, ΐ0,5, ΐ0,9, ΐΐ, ΐΐ,5, ΐΐ,9, ΐ2,0, ΐ2,5, ΐ2,9, ΐ3,0, ΐ3,5, ΐ3,9, ΐ4,0, ΐ4,5, ΐ4,9, ΐ5, ΐ5,5, ΐ5,9, ΐ6, ΐ6,5, ΐ6,9, ΐ7, ΐ7,5, ΐ7,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 и/или 5000 мкг/мл в сыворотке на однократное или многократное введение, или любой интервал, величину или часть в указанных пределах.

С другой стороны, вводимая дозировка может изменяться в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические характеристики конкретного агента и типа и способа введения; возраста, состояния здоровья и массы реципиента; характера и степени симптомов, вида совместного лечения, частоты обработки и желаемого эффекта. Как правило, дозировка активного ингредиента может составлять примерно 0,1-100 мг на кг массы тела. Обычно 0,1-50, и предпочтительно 0,1-10, мг на кг на введение или в отсроченной форме эффективны для получения нужных результатов.

Как пример, не являющийся ограничением, лечение людей или животных можно обеспечить однократной или периодической дозировкой по меньшей мере одного антитела настоящего изобретения в количестве 0,1-100 мг/кг, такой как 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг в сутки в по меньшей мере один из дней 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40, или, с другой стороны или дополнительно, в по меньшей одну из недель 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 или 52, или, с другой стороны или дополнительно, в по меньшей один из годов 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, или в любом их сочетании, с использованием однократной, инфузионной или повторяющихся доз.

Лекарственные формы (композиции), подходящие для внутреннего введения, как правило, содержат от примерно 0,1 мг до примерно 500 мг активного ингредиента на единицу или емкость. В таких фармацевтических композициях активный ингредиент будет присутствовать обычно в количестве примерно 0,5-99,999 мас.% от общей массы композиции.

- 31 007005

В случае парентерального введения антитела можно ввести в состав раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизованного порошка в сочетании или с предоставляемым отдельно фармацевтически приемлемым парентеральным носителем. Примерами таких носителей являются вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и 1-10% раствор сывороточного альбумина человека. Также можно использовать липосомы и неводные носители, такие как нелетучие масла. Носитель или лиофилизо ванный порошок могут содержать добавки, сохраняющие изотоничность (например, хлорид натрия, маннит) и химическую устойчивость (например, буферы и консерванты). Композицию стерилизуют известными или подходящими методами.

Подходящие фармацевтические носители описываются в самом последнем издании Веттд!оп'к Рйагтасеи!1са1 8с1епсек, А. Око1, стандартной ссылке в данной области техники.

Другие способы введения

Многие известные и разработанные способы введения можно использовать, согласно настоящему изобретению, для введения фармацевтически эффективных количеств по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ по изобретению. Хотя далее по описанию используют легочное введение, согласно настоящему изобретению можно использовать другие способы введения с подходящими результатами.

Антитела против ΤΝΕ настоящего изобретения можно доставить в носителе в виде раствора, эмульсии, коллоида или суспензии, или в виде сухого порошка, с использованием любого из многочисленных устройств и способов, подходящих для введения путем ингаляции, или других способов, описанных в данном описании или известных в технике.

Парентеральные композиции и введение

Композиции для парентерального введения могут содержать в качестве обычных наполнителей стерильную воду или физиологический раствор, полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль, масла растительного происхождения, гидрогенизированные нафталины и т.п. Водные или масляные суспензии для инъекций можно получить, используя соответствующий эмульгатор или увлажняющее вещество и суспендирующий агент согласно известным способам. Вещества для инъекции могут быть нетоксичными, не вводимыми перорально разбавителями, такими как водный раствор, или стерильный раствор или суспензия для инъекций в растворителе. В качестве подходящего носителя или растворителя допускаются вода, раствор Рингера, изотонический солевой раствор и т. п.; в качестве обычного растворителя или растворителя для суспендирования можно использовать стерильное нелетучее масло. Для таких целей можно использовать любой вид нелетучего масла и жирной кислоты, в том числе природные или синтетические или полусинтетические жирные масла или жирные кислоты; природные или синтетические или полусинтетические моно- или ди- или триглицериды. Парентеральное введение известно в технике и включает применение обычных средств для инъекций, устройств для безыгольных инъекций под давлением газа, описанных в патенте США № 5851198, и лазерного перфоратора, описанного в патенте США № 5839446, патентах, включенных в данное описание в качестве ссылок, и другие устройства.

Альтернативная доставка

Изобретение также относится к введению по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ парентеральным, подкожным, внутримышечным, внутривенным, интраартикулярным, внутрибронхиальным, интраабдоминальньм, интракапсулярным, внутрихрящевым, внутриполостным, интрацелиальным, внутримозжечковым, интрацеребровентрикулярным, внутрикишечным, интрацервикальным, внутрижелудочным, внутрипеченочным, интрамиокардиальным, внутрикостным, внутритазовым, интраперикардиальным, интраперитонеальным, внутриплевральным, в предстательную железу, внутрилегочным, интраректальным, интраренальным, интраретинальным, интраспинальным, внутрисуставным, интраторацикальным, внутриматочным, внутрипузырьковым, болюсным, вагинальным, ректальным, буккальным, подъязычным, интраназальным или чрескожным способом. Композицию по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ можно получить для применения для парентерального (подкожного, внутримышечного или внутривенного) или любого другого введения, в частности, в форме растворов или суспензий; для применения при вагинальном или ректальном введении, в частности, в полутвердых формах, таких как кремы и суппозитории, и других формах; для буквального или подъязычного введения в таких формах, как таблетки или капсулы, и других формах; или для интраназального введения в таких формах, как порошки, капли в нос или аэрозоли, и других формах; или для чрескожного введения в таких формах как гель, мазь, лосьон, суспензия, и других формах, или в форме системы доставки пэтч с химическими усилителями, такими как диметилсульфоксид, или для модификации структуры кожи, или для повышения концентрации лекарственного средства в чрескожном пэтче (.Типдтдег е! а1., В Эгид Регтеа!юп ЕпЬапсетеп!; Нк1ей Ό.8., Ебк., рр. 59-90 (Магсе1 Оеккег, 1пс., Хете Υο^к, 1994, работа включена в данное описание в качестве ссылки), или с окислителями, способствующими нанесению на кожу композиций, содержащих пептиды (\УО 98/53847), или с применением электрического поля для создания временных путей переноса, таким как электропорация, или для усиления продвижения заряженных лекарственных средств через кожу, таким как ионтофорез, или с применением ультразвука, таким как сонофорез (патенты США №№ 4309989 и 4767402) (причем вышеуказанные публикации и патенты включены в данное описание в качестве ссылок).

- 32 007005

Легочное/назальное введение

Для легочного введения, предпочтительно, по меньшей мере одну композицию с антителами против ΤΝΕ доставляют в виде частиц размером, эффективным для достижения нижних дыхательных путей легкого или синусов. Согласно изобретению по меньшей мере одно антитело против ΤΝΕ можно доставить любым из различных устройств для ингаляции или назальных устройств, известных в технике для введения лекарственного средства путем ингаляции. Такие устройства, способные осаждать композиции в форме аэрозолей в синусной полости или альвеолах пациента, включают ингаляторы с дозатором, небулайзеры, устройства для подачи сухих порошков, распылители и т.п. В технике также известны другие устройства, подходящие для осуществления легочного или назального введения антител. Во всех таких устройствах можно использовать композиции, подходящие для введения для диспергирования антител в аэрозоле. Такие аэрозоли могут состоять, или из растворов (как водных, так и неводных), или из твердых частиц. В ингаляторах с дозатором, подобных Уеи!о1т™, как правило, используют газ-пропеллент, и они приводятся в действие во время вдыхания (см., например, νθ 94/16970, νθ 98/35888). В ингаляторах для сухих порошков, подобных ΤιιώιιΙιηΚΓ™ (Ак!га), Ко!айа1ег™ (61ахо), Э1ккик™ (61ахо), 8р1гок™ (Эига), устройствах, продаваемых 1и1а1е Τйе^ареиί^ск, и порошковом ингаляторе 8ршйа1ег™ (Икоик) используют приведение в действие при вдохе смешанного порошка (патент США 4668218, Ак!га, ЕР 237507, Ак!га, νθ 97/25086, 61ахо, νθ 94/08552, Эига, патент США 5458135, 1и1а1е, νθ 94/06498, Икоик включены в данное описание в качестве ссылок). Небулайзеры, подобные АЕЕх™, Агаб1дт, небулайзер иНцкегИ™ (МаШискгоб!) и небулайзер Асоги II™ (Мащиек! Мебюа1 Ргобис!к) (патент США 5404871, Агаб1дт, νθ 97/22376), все указанные публикации включены в данное описание в качестве ссылок, образуют аэрозоли из растворов, в то время как ингаляторы с дозаторами, ингаляторы для сухих порошков и т.п. образуют аэрозоли из мелких частиц. Предполагается, что такие конкретные примеры коммерчески доступных устройств для ингаляции являются характерными представителями специальных устройств, подходящих для практического применения данного изобретения, и не предназначаются для ограничения объема изобретения. Предпочтительно, композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело против ΤΝΕ, доставляют с помощью ингалятора для сухих порошков или распылителя. Существует несколько желательных особенностей устройства для ингаляции для введения по меньшей мере одного антитела настоящего изобретения. Например, доставка с помощью устройства для ингаляции является преимущественно надежной, воспроизводимой и точной. Устройство для ингаляции может доставлять, необязательно, мелкие сухие частицы, например, размером примерно 10 мкм, предпочтительно примерно 1-5 мкм, для возможности хорошего вдыхания.

Введение композиции антител против ΤΝΕ в виде спрея

Спрей, содержащий белок композиции антител против ΤΝΕ, можно получить путем принудительного распыления раствора по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ под давлением через наконечник. Размер и конфигурация наконечника, применяемое давление и скорость подачи жидкости можно выбрать с тем, чтобы достичь нужного выхода и размера частиц. Электрораспыление можно получить, например, с помощью электрического поля в сочетании с подачей через капилляр или наконечник. Преимущественно, частицы по меньшей мере белка композиции одного антитела против ΤΝΕ, доставляемые распылителем, имеют размер менее примерно 10 мкм, предпочтительно в интервале от примерно 1 мкм до примерно 5 мкм, и наиболее предпочтительно от примерно 2 мкм до примерно 3 мкм.

Композиции белка композиции по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ, подходящие для применения с распылителем, обычно включают белок композиции антител в водном растворе в концентрации от примерно 0,1 мг до примерно 100 мг белка композиции по меньшей мере одного антитела против ΤΝΕ на мл раствора или мг/г, или в любом интервале или значении в указанных пределах, например 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/мл или мг/г, но не ограничиваясь этими пределами. Композиция может содержать вещества такие как наполнитель, буфер, вещество для достижения изотоничности, консервант, поверхностно-активное вещество и, предпочтительно, цинк. Композиция также может включать наполнитель или вещество для стабилизации белка композиции антител, такое как буфер, восстановитель, объемный белок или углевод. Объемные белки, полезные при составлении белков композиции антител, включают альбумин, протамин или подобное вещество. Обычными углеводами, полезными в композициях белков композиции антител, являются сахароза, маннит, лактоза, трегалоза, глюкоза или подобные углеводы. Композиция белка композиции антител может также включать поверхностно-активное вещество, которое может понижать или предупреждать индуцированную поверхностями агрегацию белка композиции антител, вызываемую распылением раствора при образовании аэрозоля. Можно использовать различные обычные поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтилированные эфиры жирных кислот и спиртов и полиоксиэтилированные эфиры сорбита и жирных кислот. Количество будет, как правило, колебаться от 0,001 до 14 мас.% от композиции. Особенно предпочтительными поверхностно-активными веществами для целей изобретения являются полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 или подобные вещества. Другие вещества, известные в технике для композиции белков, таких как антитела против ΤΝΕ, или их специфические части или варианты, также можно включать в композицию.

- 33 007005

Введение композиций антител против ΤΝΡ с помощью небулайзера

Белок композиции антител можно вводить с помощью небулайзера, такого как струйный небулайзер или ультразвуковой небулайзер. Обычно в струйном небулайзере используют сжатый воздух для того, чтобы создать струю воздуха, выходящую с высокой скоростью из наконечника. Так как газ расширяется вне наконечника, создается область низкого давления, которая протягивает раствор белка композиции антител через капиллярную трубку, присоединенную к резервуару с жидкостью. Струя жидкости из капиллярной трубки рассекается на неустойчивые нити и капли, существующие в трубке, образуя аэрозоль. Можно использовать различные конфигурации, скорости потока и типы перегородки для достижения желательных рабочих свойств данного струйного небулайзера. В ультразвуковом небулайзере используют электроэнергию высокой частоты для получения механической энергии вибрации, как правило, с использованием пьезоэлектрического преобразователя. Полученную энергию передают композиции белка композиции антител или непосредственно или через соединяющую жидкость, причем образуется аэрозоль, содержащий белок композиции антител. Преимущественно, частицы белка композиции антител, доставляемые небулайзером, имеют размер менее примерно 10 мкм, предпочтительно от примерно 1 мкм до примерно 5 мкм и наиболее предпочтительно от примерно 2 мкм до примерно 3 мкм.

Композиции по меньшей мере одного антитела против ΤΝΡ, подходящие для применения с помощью небулайзера, как струйного, так и ультразвукового, обычно содержат от примерно 0,1 до примерно 100 мг по меньшей мере одного белка антител против ΤΝΡ на мл раствора. Композиция может содержать вещества, такие как наполнитель, буфер, вещество для достижения изотоничности, консервант, поверхностно-активное вещество и, предпочтительно, цинк. Композиция также может включать наполнитель или вещество для стабилизации белка композиции антител против ΤΝΡ, такое как буфер, восстановитель, объемный белок или углевод. Объемные белки, полезные при составлении белков композиции антител против ΤΝΡ, включают альбумин, протамин или подобное вещество. Обычными углеводами, полезными при составлении белков композиции антител против ΤΝΡ, являются сахароза, маннит, лактоза, трегалоза, глюкоза или подобные углеводы. Композиция по меньшей мере одного антитела против ΤΝΡ может также включать поверхностно-активное вещество, которое может понижать или предупреждать индуцированную поверхностями агрегацию антител против ΤΝΡ, вызываемую распылением раствора при образовании аэрозоля. Можно использовать различные обычные поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтилированные эфиры жирных кислот и спиртов и полиоксиэтилированные эфиры сорбита и жирных кислот. Количество, как правило, будет колебаться от 0,001 до 4 мас.% от композиции. Особенно предпочтительными поверхностно-активными веществами для целей данного изобретения являются полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полисорбат 80, полисорбат 20 или подобные вещества. Другие вещества, известные в технике для композиции белков, таких как антитела, также можно включать в композицию.

Введение композиций антител против ΤΝΡ с помощью ингалятора с дозатором

В ингаляторе с дозатором (ΜΌΙ) пропеллент, по меньшей мере одно антитело против ΤΝΡ и любые наполнители или другие добавки содержатся в контейнере в виде смеси, включающей сжиженный сжатый газ. Приведение в действие дозирующего клапана высвобождает смесь в виде аэрозоля, содержащего, предпочтительно, частицы размером менее примерно 10 мкм, предпочтительно от примерно 1 мкм до примерно 5 мкм и наиболее предпочтительно от примерно 2 мкм до примерно 3 мкм. Желательный размер аэрозольных частиц можно получить, используя композицию белка композиции антител, полученную разными способами, известными в специалистам в данной области техники, включая струйное измельчение, распылительную сушку, конденсацию в критической точке или подобные способы. Предпочтительными ингаляторами с дозатором являются ингаляторы, изготовляемые 3М или ΟΗχο, и с использованием фторированного углеводородного пропеллента.

Композиции по меньшей мере одного антитела против ΤΝΡ для применения с помощью ингалятора с дозатором, как правило, будут содержать тонко измельченный порошок, содержащий по меньшей мере одно антитело против ΤΝΡ в виде суспензии в неводной среде, например, суспендированное в пропелленте с помощью поверхностно-активного вещества. Пропеллент может представлять собой обычное вещество, используемое для такой цели, такое как хлорофторуглерод, хлорфторсодержащий углеводород, фторсодержащий углеводород или углеводород, в том числе трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан, ΗΡΑ-134а (гидрофторалкан-134а), ΗΡΑ-227 (гидрофторалкан-227), или подобное вещество. Предпочтительно пропеллентом является фторсодержащий углеводород. Поверхностно-активное вещество можно выбрать для стабилизации по меньшей мере одного антитела против ΤΝΡ в виде суспензии в пропелленте для защиты активного вещества от химического разложения и т.п. Подходящими поверхностно-активными веществами являются сорбитантриолеат, соевый лецитин, олеиновая кислота или подобное вещество. В некоторых случаях предпочтительны растворы для аэрозоля с использованием растворителей, таких как этанол. Другие вещества, известные в технике для композиций белков, таких как белок, также можно использовать в композиции.

Специалисту в данной области техники легко понять, что способы данного изобретения можно осуществить путем легочного введения композиции по меньшей мере одного антитела против ΤΝΡ с помощью устройств, не описанных в данном описании.

- 34 007005

Пероральные композиции и введение

Композиции для перорального введения имеют в основе совместное введение адъювантов (например, резорцинов и неионных поверхностно-активных веществ, таких как полиоксиэтиленолеиловый эфир и н-гексадецилпропилэтиленовый эфир) для искусственного повышения проницаемости стенок кишечника, а также совместное введение ингибиторов ферментов (например, ингибиторов панкреатического трипсина диизопропилфторфосфатата (ΌΕΕ) и тразилола) для ингибирования ферментативного расщепления. Активное составляющее соединение лекарственной формы твердого типа для перорального введения можно смешать с по меньшей мере одной добавкой, в том числе сахарозой, лактозой, целлюлозой, маннитом, трегалозой, рафинозой, мальтитом, декстраном, крахмалами, агаром, альгинатами, хитинами, хитозанами, пектинами, трагакантовой смолой, аравийской камедью, желатином, коллагеном, казеином, альбумином, синтетическим или полусинтетическим полимером и глицеридом. Такие лекарственные формы также могут содержать другой(ие) тип(ы) добавки, например неактивный разбавитель, смазывающее вещество, такое как стеарат магния, парабен, консервант, такой как сорбиновая кислота, аскорбиновая кислота, альфа-токоферол, антиоксидант, такой как цистеин, вещество, способствующее рассыпанию, связующее вещество, загуститель, буферирующее вещество, подслащиватель, корригент, отдушку и т. п.

Таблетки и пилюли также можно получить в виде препаратов с энтеросолюбильным покрытием. К жидким препаратам для перорального введения, разрешенным для применения в медицине, относятся эмульсия, сироп, эликсир, суспензия и раствор. Такие препараты могут содержать неактивные разбавители, обычно используемые в указанной области, например воду. Описаны липосомы как системы для доставки лекарственных средств для инсулина и гепарина (патент США № 4239754). Позднее были описаны микросферы из искусственных полимеров смешанных аминокислот (протеиноидов) для доставки фармацевтических препаратов (патент США № 4925673). Кроме того, в технике известны носители для пероральной доставки биологически активных веществ, описанные в патенте США № 5879681 и патенте США № 55871753.

Композиции для введения через слизистые оболочки

Для поглощения через поверхности слизистых оболочек композиции и способы введения по меньшей мере одного антитела против ΤΝΤ включают эмульсию, содержащую множество частиц субмикронного размера, мукоадгезивную макромолекулу, биологически активный пептид и непрерывную водную фазу, промотирующую поглощение через поверхности слизистых оболочек путем прилипания частиц эмульсии к слизистой оболочке (патент США № 5514670). Поверхности слизистых оболочек, подходящие для применения эмульсий настоящего изобретения, могут предполагать корнеальный, конъюнктивальный, буккальный, сублингвальный, назальный, вагинальный, легочный, желудочный, кишечный и ректальный способы введения. Композиции для вагинального или ректального введения, например, суппозитории, могут содержать в качестве наполнителей, например, полиалкиленгликоли, вазелин, масло какао и подобные вещества. Композиции для интраназального введения могут быть твердыми и содержать в качестве наполнителей, например, лактозу, или могут представлять собой водные или масляные растворы - капли в нос. В случае буккального введения наполнителями являются сахара, стеарат кальция, стеарат магния, прежелатинированный крахмал и подобные вещества (патент США № 5849695).

Чрескожные композиции и введение

Для чрескожного введения по меньшей мере одно антитело против ΤΝΤ инкапсулируют в средство для доставки, такое как липосома или полимерные наночастицы, микрочастица, микрокапсула или микросферы (все вместе называемые микрочастицами, если не указано другое). Известен ряд подходящих средств, в том числе микрочастицы, полученные из синтетических полимеров, таких как полиоксикислоты, такие как полимер молочной кислоты, полигликолевая кислота и их сополимеры, полиортоэфиры, полиангидриды и полифосфазены, и природных полимеров, таких как коллаген, полиаминокислоты, альбумин и другие белки, альгинат и другие полисахариды, и их сочетания (патент США № 5814599).

Пролонгированное действие и композиции

Иногда может потребоваться доставка соединений настоящего изобретения субъекту в течение продолжительных периодов времени, например в период от одной недели до одного года, от однократного введения. Можно использовать различные лекарственные формы с постепенным высвобождением, депо или имплантатом. Например, лекарственная форма может содержать фармацевтически приемлемую нетоксическую соль соединений с плохой растворимостью в жидкостях организма, например (а) аддитивную соль кислоты с многоосновной кислотой, такой как фосфорная кислота, серная кислота, лимонная кислота, винная кислота, дубильная кислота, памовая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталин(моно- или ди-)сульфоновые кислоты, полигалактуроновая кислота и т.п.; (Ь) соль с поливалентным катионом металла, такого как цинк, кальций, висмут, барий, магний, алюминий, медь, кобальт, никель, кадмий и т.п., или с органическим катионом, образованным от, например, Ν,Ν'-дибензилэтилендиамина или этилендиамина; или (с) сочетания (а) и (Ь), например таннат цинка. Кроме того, соединения настоящего изобретения или, предпочтительно, относительно нерастворимые соли, такие как только что описанные, можно ввести в состав геля, например геля моностеарата алюминия с, например, кунжутным маслом, подходящим для инъекций. Особенно предпочтительными солями являются цинко- 35 007005 вые соли. цинковые таннаты. памоаты и т.п. Другой тип композиции для инъекции с депо для постепенного высвобождения может содержать соединение или соль. диспергированные для инкапсулирования в медленно разрушающемся нетоксичном неантигенном полимере. таком как полимер молочной кислоты/полимер гликолевой кислоты. например. описанном в патенте США № 3773919. Соединения или. предпочтительно. относительно нерастворимые соли. какие описаны выше. можно также ввести в состав гранул из силастика с холестериновой матрицей. особенно. для применения для животных. Из литературы известны другие композиции с постепенным высвобождением. депо или имплантатом (патент США № 5770222 и 8ив1ашсб апб Соп1го11сб Кса1савс Игцд Исйусгу 8ув!ств. 1.К. КоЬтвоп. сб.. Магсс1 Искксг. 1пс.. Ν.Υ.. 1978).

Описанное в изобретении будет более понятным при обращении к приведенным далее примерам. которые приводятся только для иллюстрации и не предназначены для ограничения.

Пример 1. Клонирование и экспрессия антител против ΤΝΡ в клетках млекопитающих.

Обычный экспрессирующий вектор млекопитающих содержит по меньшей мере один промоторный элемент. опосредующий инициацию транскрипции мРНК. последовательность. кодирующую антитело. и сигналы. необходимые для терминации транскрипции и полиаденелирования транскрипта. К дополнительным элементам относятся энхансеры. последовательности Козак и интроны. фланкированные донорным и акцепторным сайтами для сплайсинга РНК. Высокоэффективной транскрипции можно достичь с ранним и поздним промоторами из 8У40. длинными концевыми повторами (ЬТК8) из ретровирусов. например. К.8У. НТЬУ1. Ηΐνΐ. и ранним промотором цитомегаловируса (СМУ). Однако также можно использовать клеточные элементы (например. промотор актина человека). Подходящими экспрессирующими векторами для применения в практике настоящего изобретения являются. например. такие векторы. как р1КЕ81псо. рКс1го-0ГГ. рВс!го-Оп. ΡΕΧ8Ν или ρΕΝί’Χ (С1оп!ссй ЬаЬв. Пало-Альто. Калифорния). κΩΝΑ3.1 (+/-). рсЭХА/2со (+/-) или рсЭНА/Нудго (+/-) (1пуЦгодсп). Р8УЪ и РМ8С (Рйаттааа. Упсала. Швеция). рК8Уса! (АТСС 37152). р8У2бЬГг (АТСС 37146) и рВС12М1 (АТСС 67109). Клетками млекопитающих. которые можно использовать. являются клетки человека Нс1а 293. Н9 и клетки 1игка!. мышиные клетки МН3Т3 и С127. Сов 1. Сов 7 и СУ 1. клетки перепела ДС1-3. мышиные Ь-клетки и клетки яичника китайского хомячка (СНО).

С другой стороны. ген можно экспрессировать в устойчивых клеточных линиях. содержащих ген. интегрированный в хромосому. Котрансфекция с селектируемым маркером. таким как бЬГг. др!. неомицин или гигромицин. допускает идентификацию и выделение трансфицированных клеток.

Трансфицированный ген также можно амплифицировать для экспрессии больших количеств кодированного антитела. Маркер ИНРК (дигидрофолатредуктаза) полезен для разработки клеточных линий. несущих несколько сотен или даже несколько тысяч копий гена. представляющего интерес. Другим полезным селектируемым маркером является фермент глутаминсинтаза (С8) (Мигрйу с! а1.. Вюсйст. 1.. 227:277-279 (1991); ВсЬЬтд!ои с! а1.. Вю/Тсс1то1оду. 10:169-175 (1992)). С использованием таких маркеров клетки млекопитающих выращивают в селективной среде. и отбирают клетки с наивысшей устойчивостью. Такие клеточные линии содержат амплифицированный(е) ген(ы). интегрированный(е) в хромосому. Для получения антител часто используют клетки яичника китайского хомячка (СНО) и клетки Ν80.

Экспрессирующие векторы рС1 и рС4 содержат сильный промотор (ЬТ) вируса саркомы Рауса (Си11сп с! а1.. Мо1сс. Сс11. Вю1.. 5:438-447 (1985)) с фрагментом СМУ-энхансера (Вовйат! с! а1.. Сс11. 41:521530 (1985)). Сайты множественного клонирования. например сайты расщепления рестриктазами ВатН1. ХЬа1 и Авр718. облегчают клонирование гена. представляющего интерес. Векторы содержат. кроме 3'интрона. сигнал полиаденелирования и терминации гена препроинсулина крысы.

Клонирование и экспрессия в клетках СНО

Для экспрессии антител против ТЫР используют вектор рС4. Плазмида рС4 является производным плазмиды р8У2-бЫг (АТСС. инвентарный № 37146). Плазмида содержит мышиный ген ИНРК под контролем раннего промтора 8У40. Клетки яичника китайского хомячка или другие клетки. лишенные дигидрофолатной активности. трансфицированные указанными плазмидами. можно отобрать. выращивая клетки в селективной среде (например. альфа минус МЕМ. ЬгГс Тсс11по1од1св. Гайтерсбург. Мэриленд) с добавлением химиотерапевтического средства метотрексата. Амплификация генов ИНРК в клетках. устойчивых к метотрексату (МТХ). хорошо описана (см.. например. Р.^. А1! с! а1.. 1. Вю1. Сйст.. 253:13571370 (1978); РЬ. Нат1ш апб С. Ма.. Вюсйст. с! Вюрйув. Ас!а.. 1097:107-143 (1990); и М.1. Радс апб М.А. 8убсп11ат. Вю1сс11по1оду. 9:64-68 (1991)). В клетках. выращенных при повышающихся концентрациях МТХ. развивается устойчивость к лекарственному средству путем сверхпродуцирования ферментамишени ИНРК в результате амплификации гена ИНРК. Если к гену ИНРК присоединить второй ген. он. как правило. коамплифицируется и сверхэкспрессируется. В технике известно. что такой подход можно использовать для разработки клеточных линий. несущих более 1000 копий амплифицированного(ых) гена(ов). Затем. когда метотрексат удаляют. получают клеточные линии. содержащие амплифицированный ген. интегрированный в одну или несколько хромосом клетки-хозяина.

Плазмида рС4 содержит для экспрессии гена. представляющего интерес. сильный промотор длинного концевого повтора (ЬТК) вируса саркомы Рауса (Си11сп с! а1.. Мо1сс. Сс11. Вю1.. 5:438-447 (1985)) с

- 36 007005 фрагментом из энахансера немедленно-раннего гена цитомегаловируса человека (СМУ) (Вокйай е! а1., Се11, 41:521-530 (1985)). В прямом направлении промотора находятся сайты расщепления рестриктазами ВатН1, ХЬа1 и Акр718, допускающие интеграцию генов. За указанными сайтами клонирования плазмида содержит 3'-интрон и сайт полиаденилирования гена препроинсулина крысы. Также можно использовать для экспрессии другие высокоэффективные промоторы, например Ь-актиновый промотор человека, ранний или поздний промоторы δν40 или длинные концевые повторы из других ретровирусов, например ВИЧ и ΗΊΈνΐ. Системы экспрессии генов Τеΐ-ΟΓΓ и Τеΐ-Οη от С1оп1ес11 и подобные системы можно использовать для регулируемой экспрессии ΤΝΕ в клетках млекопитающих (М. Соккеп апб Н. Вщагб, Ргос. КаИ. Асаб. 8ск И8А, 89:5547-5551 (1992)). Для полиаденелирования мРНК также можно использовать другие сигналы, например, из гормона роста человека или генов глобинов. Устойчивые клеточные линии, несущие ген, представляющий интерес, интегрированный в хромосомы, также можно отобрать после котрансфекции с селектируемым маркером, таким как др!, С418 или гигромицин. Вначале выгодно использовать несколько селектируемых маркеров, а не один, например С418 и метотрексат.

Плазмиду рС4 расщепляют рестриктазами и затем дефосфорилируют с использованием плодной кишечной фосфатазы с помощью процедур, известных в технике. Затем выделяют вектор из 1% агарозного геля.

Затем ДНК, кодирующую выделенные вариабельную и константную области, и дефосфорилированный вектор лигируют с помощью Т4-ДНК-лигазы. Затем трансформируют клетки Е. со11 НВ101 или ХЬ-1 В1ие, и идентифицируют бактерии, содержащие фрагмент, встроенный в плазмиду рС4, с использованием, например, рестрикционного анализа.

Клетки яичника китайского хомячка (СНО), лишенные активности гена ИНЕК, используют для трансфекции. Экспрессирующую плазмиду рС4 (5 г) котранфицируют с 0,5 г плазмиды р8V2-ηео с использованием липофектина. Плазмида р8V2-ηео содержит доминантный селектируемый маркер ген пео из Тп5, кодирующий фермент, придающий устойчивость к группе антибиотиков, включая С418. Через 2 суток клетки обрабатывают трипсином и высевают в планшеты для клонирования гибридом (Сгетег, Германия) в среду альфа минус МЕМ с добавлением 10, 25 или 50 нг/мл метотрексата и 1 г/мл С418. Через 10-14 суток отдельные клоны обрабатывают трипсином и затем высевают в 6-луночные чашки Петри или 10-мл колбы с использованием различных концентраций метотрексата (50 нМ, 100 нМ, 200 нМ, 400 нМ, 800 нМ). Затем клоны, растущие при самых высоких концентрациях метотрексата, переносят в новые 6-луночные планшеты, содержащие даже еще более высокие концентрации метотрексата (1 мМ, 2 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 20 мМ). Такую процедуру повторяют до тех пор, пока не получают клоны, растущие при концентрации 100-200 мМ. Экспрессию нужного генного продукта анализируют, например, методом δΌδ-РАСЕ и Вестерн-блоттингом или методом анализа ВЭЖХ с обращенной фазой.

Пример 2. Получение с использованием трансгенных мышей высокоаффинных человеческих моноклональных антител 1дС, реакционноспособных в отношении ΤΝΕ человека.

Краткое изложение

Используют трансгенных мышей с генами тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека для получения высокоаффинных, полностью человеческих моноклональных антител, которые можно использовать терапевтически для ингибирования действия ΤΝΕ для лечения одного или нескольких заболеваний, опосредуемых ΤΝΕ. Гибридных мышей (СВА/1 х С57/ВЬ6/1)Е₂, содержащих трансгены антител с человеческими вариабельной и константной областями как для тяжелых, так и для легких цепей, иммунизируют рекомбинантным ΤΝΕ человека (Гау1ог е! а1., Ιπΰ. 1ттипо1., 6:579-591 (1993); ЬопЬегд е! а1., №111.11^ 368:856-859 (1994); №иЬегдег М., №1:иге Вю1есй., 14:826 (1996); Ε^кй^^1б е! а1., МаШге Вю1ес1то1оду, 14:845-851 (1996)). Несколько гибридов дают одну или несколько панелей полностью человеческих моноклональных антител 1дС, реакционноспособных в отношении ΤΝΕ. Затем полностью человеческие антитела против ΤΝΕ характеризуют. Все представляют собой 1дС1. Обнаружено, что такие антитела имеют константы аффинности где-то между 1х10⁹ и 9х10¹². Неожиданно высокая аффинность таких полностью человеческих моноклональных антител делает их подходящими кандидатами для терапевтических применений при болезнях, патологиях или расстройствах, связанных с ΤΝΕ.

Аббревиатуры

В8А - бычий сывороточный альбумин,

СО₂ - диоксид углерода,

ДМСО - диметилсульфоксид,

Е1А - ферментный иммуноанализ с аффинной хроматографией,

ΕΒδ - сыворотка плода коровы,

Н₂О₂ - пероксид водорода,

НРК - пероксидаза из хрена,

ГО - интрадермальный,

1д - иммуноглобулин,

ΤΝΕ (ΤΝΕ) - фактор некроза опухоли-альфа,

1Р - интраперитеонеальный,

Ιν - внутривенный,

- 37 007005

МаЬ - моноклональное антитело,

ΟΌ - оптическая плотность,

ΟΡ^ - дигидрохлорид о-фенилендиамина,

РЕС - полиэтиленгликоль,

Р8А - пенициллин, стрептомицин, амфотерицин,

ΚΤ - комнатная температура,

- подкожный, об./об. - объем/объем, мас./об. - масса/объем.

Материалы и методы

Животные

Трансгенные мыши, которые могут экспрессировать человеческие антитела, известны в технике (и коммерчески доступны (например, от ОеиРйагт Шегиайопа! Сан-Хосе, Калифорния; АЬдешх, Фримонт, Калифорния; и других), и экспрессируют иммуноглобулины человека, но не мышиный ΙμΜ или Ι§. Например, такие трансгенные мыши содержат трансгены последовательностей человека, которые претерпевают соединение ν(Ό)1, переключение класса цепи на тяжелую и соматическую мутацию для получения спектра иммуноглобулинов с человеческими последовательностями (ЬоиЬегд е! а1., №Гиге, 368:856859 (1994)). Можно получить трансген легкой цепи, например, частично из дрожжевого клона искусственных хромосом, который включает почти половину человеческой ν области зародышевой линии. Кроме того, трансген тяжелой цепи может кодировать как человеческую μ, так и человеческую γ1 (ИкйМ1б, е! а1., №Гиге, 14:845-851 (1996)), и/или константные области γ3. Мышей, полученных из соответствующих генотипических линий дифференцировки, можно использовать при иммунизации и в процессе слияния для получения полностью человеческих моноклональных антител против ΤΝΡ.

Иммунизация

Можно использовать одну или несколько схем иммунизации для получения человеческих гибридом против ΤΝΡ. Первые несколько слияний можно осуществить после приведенного далее протокола иммунизации, но можно использовать другие подобные протоколы. Несколько самок в возрасте 14-20 недель и/или хирургически кастрированных трансгенных самцов мышей иммунизируют ГР и/или ΙΌ 1-1000 мкг рекомбинантного человеческого ΤΝΡ, эмульгированного с равным объемом ΤIΤЕКΜΛX или полного адъюванта Фрейнда в конечном объеме 100-400 мкл (например, 200). Каждая мышь также может, необязательно, получить 1-10 мкг в 100 мкл физиологического раствора в каждое из 2 мест 80. Затем мышей можно иммунизировать 1-7, 5-12, 10-18, 17-25 и/или 21-34 дня спустя после № (1-400 мкг) и 80 (1-400 мкг х 2) ΤΝΡ, эмульгированным с равным объемом ^БЕРМАХ или неполного адъюванта Фрейнда. У мышей можно взять кровь спустя 12-25 и 25-40 дней ретроорбитальной пункцией без антикоагулянта. Затем кровь оставляют свертываться при ΚΤ в течение одного часа, и сыворотку собирают и титруют с использованием анализа ΤΝΡ ΕΙΛ согласно известным способам. Слияния осуществляют, когда повторные инъекции не вызывают повышения титров. В это время мышам можно дать конечную Ιν бустеринъекцию 1-400 мкг ΤΝΡ, разведенного в 100 мкл физиологического раствора. Три дня спустя мышей можно умертвить путем цервикального смещения, селезенки асептически удалить и погрузить в 10 мл холодного забуференного фосфатом физиологического раствора (РВ8), содержащего 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В (Р8А). Спленоциты собирают путем стерильной перфузии селезенки Р8А-РВ8. Клетки промывают один раз в холодном Р8А-РВ8, подсчитывают с использованием эксклюзии красителя трипанового синего и ресуспендируют в среде ^ΜΙ 1640, содержащей 25 мМ Нерек.

Слияние клеток

Слияние можно осуществлять при соотношении от 1:1 до 1:10 мышиных миелоидных клеток к жизнеспособным клеткам селезенки согласно известным способам, например, как известно в технике. Как пример, не являющийся ограничением, клетки селезенки и клетки миеломы можно осадить вместе центрифугированием. Затем осадок можно постепенно, в течение 30 с, ресуспендировать в 1 мл 50% (мас./об.) растворе РЕС в РВ8 (молекулярная масса РЕС 1450, 81дта) при 37°С. Затем слияние можно остановить, постепенно добавляя 10,5 мл среды ^ΜΙ 1640, содержащей 25 мМ Нерек (37°С), в течение 1 мин. Слитые клетки центрифугируют в течение 5 мин при 500-1500 об/мин. Затем клетки ресуспендируют в среде НАΤ (среда ^ΜΙ 1640, содержащая 25 мМ Нерек, 10% фетальной сыворотки клона Ι (Нус1оие), 1 мМ пирувата натрия, 4 мМ Ь-глутамина, 10 мкг/мл гентамицина, 2,5% добавки для культивирования Ο^^деи (Р1кйег), 10% 653-кондиционированных сред ^ΜΙ 1640/Нерек, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкМ гипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина и 16 мкМ тимидина), и затем высевают по 200 мкл/лунку в пятнадцать 96-луночных планшетов для культивирования тканей с плоскодонными лунками. Затем планшеты помещают в инкубатор при 37°С с влажной средой, содержащей 5% СΟ₂ и 95% воздуха, на 710 суток.

- 38 007005

Детекция человеческих антител 1цС против ΤΝΡ в мышиной сыворотке

Твердофазный Е1А можно использовать для скрининга мышиных сывороток на человеческие антитела 1дС, специфичные для ΤΝΕ. Коротко, на планшеты можно нанести ΤΝΕ при 2 мкг/мл в РВ8 в течение ночи. После промывки в 0,15 М физиологическом растворе, содержащем 0,02% (об./об.) твина 20, лунки блокируют 1% (мас./об.) В8А в РВ8, 200 мкл/лунку, в течение 1 ч при ΚΤ. Планшеты используют сразу же или замораживают при -20°С для последующего использования. Разведения мышиной сыворотки инкубируют на покрытых ΤΝΕ планшетах при 50 мкл/лунку при ΚΤ в течение 1 ч. Планшеты промывают и затем зондируют 50 мкл/лунку меченным НКР козьими античеловеческими Εс 1дС. специфически разведенными 1:30000 в 1% В8А-РВ8 в течение 1 ч при ΚΤ. Планшеты можно снова промыть, и добавляют в течение 15 мин при ΚΤ 100 мкл/лунку раствора цитратфосфатного субстрата (0,1 М лимонной кислоты и 0,2 М фосфатат натрия, 0,01% Н₂О₂ и 1 мг/мл ОРБ). Затем добавляют стоп-раствор (4 н серная кислота) в количестве 25 мкл/лунку, и считывают ОБ при 490 нм с помощью автоматизированного спектрофотометра для прочтения планшетов.

Детекция полностью человеческих иммуноглобулинов в супернатантах гибридом

Рост положительных гибридом, секретирующих полностью человеческие иммуноглобулины, можно обнаружить с использованием подходящего Е1А. Коротко, на 96-луночные выдергивающиеся (ророи!) планшеты (У\УК. 610744) можно нанести 10 мкг/мл раствор козьих античеловеческих Εс 1дС в натрийкарбонатном буфере в течение ночи при 4°С. Планшеты промывают и блокируют 1% В8А-РВ8 в течение одного часа при 37°С и используют сразу же или замораживают при -20°С. Неразведенные гибридомные супернатанты инкубируют на планшетах в течение одного часа при 37°С. Планшеты промывают и зондируют меченными НКР козьими античеловеческими каппа (1§С), разведенными 1:10000, в 1% В8А-РВ8 в течение одного часа при 37°С. Затем планшеты инкубируют с раствором субстрата как описано выше.

Определение реакционной способности полностью человеческих антител против ΤΝΡ

Гибридомы, описанные выше, можно одновременно проанализировать на реакционноспособность в отношении ΤΝΕ с использованием подходящего К1А или другого анализа. Например, супернатанты инкубируют на планшетах с козьими античеловеческими Εс 1дС. как описано выше, планшеты промывают и затем в течение 1 ч при ΚΤ зондируют меченным радиоактивным изотопом ΤΝΕ с соответствующим числом импульсов на лунку. Лунки дважды промывают РВ8, и количественно определяют связанный меченный радиоактивным изотопом ΤΝΕ с использованием подходящего счетчика.

Гибридомы, секретирующие человеческий 1дС1 против ΤΝΕ, можно размножить в клеточной культуре и серийно субклонировать путем предельных разведении. Полученные популяции клонов можно размножить и сохранить на холоде в замораживающей среде (95% РВ8. 5% ДМСО) и хранить в жидком азоте.

Изотипирование

Определение изотипов антител можно осуществить с использованием Е1А в формате, подобном формату, используемому для скрининга мышиных иммунных сывороток на специфические титры. ΤΝΕ можно нанести на 96-луночные планшеты, как описано выше, и очищенные антитела в концентрации 2 мкг/мл можно инкубировать на планшетах в течение одного часа при ΚΤ. Планшет промывают и зондируют меченным НКР козьим античеловеческим 1дС| или меченным НКР козьим античеловеческим 1дС₃, разведенными 1:4000 в 1% В8А-РВ8, в течение одного часа при КГ. Планшет снова промывают и инкубируют с раствором субстрата, как описано выше.

Кинетика связывания человеческих антител против человеческого ΤΝΡ с человеческим ΤΝΡ

Характеристики связывания для антител можно соответствующим образом оценить с использованием, например, Е1А с захватом ΤΝΕ и технологии В1Асоге. Шкалу концентраций очищенных человеческих антител против ΤΝΕ можно оценить на связывание с планшетами для Е1А с нанесенным ΤΝΕ, 2 мкг/мл, при анализах, описанных выше. Затем ОБ можно представить в полулогаримических графиках, показывающих относительную эффективность связывания.

Количественные константы связывания можно получить, например, как описано далее, или любым другим известным подходящим способом. Чип В1Асоге СМ-5 (карбоксиметил) помещают в прибор В1Асоге 2000. Создают поток буфера НВ8 (0,01 М НЕРЕ8, 0,15 М ЫаС1, 3 мМ ЭДТК, 0,005%, об./об., поверхностно-активного вещества Р20, рН 7,4) через проточную кювету чипа при скорости 5 мкл/мин до получения стабильной базовой линии. Раствор (100 мкл) 15 мг ЕБС (гидрохлорида Ы-этил-Х'-(3диметиламинопропил)карбодиимида) в 200 мкл воды добавляют в 100 мкл раствора 2,3 мг ΝΉ8 (Νгидроксисукцинимида) в 200 мкл воды. Сорок (40) мкл полученного раствора подают на чип. Шесть мкл раствора человеческого ΤΝΕ (15 мкг/мл в 10 мМ растворе ацетата натрия, рН 4,8) подают на чип, получая возрастание на примерно 500 КИ. Буфер заменяют на рабочий буфер ΤΒ§/Са/Мд/Β§А (20 мМ трис, 0,15 М хлорида натрия, 2 мМ хлорида кальция, 2 мМ ацетата магния, 0,5% тритона Х-100, 25 мкг/мл В8А, рН 7,4) и непрерывно подают на чип в течение ночи для его уравновешивания и для гидролиза или кэпирования непрореагировавших эфиров сукцинимида.

Антитела растворяют в рабочем буфере в количестве 33,33, 16,67, 8,33 и 4,17 нМ. Скорость потока доводят до 30 мкл/мин, а температуру прибора до 25°С. Для кинетических серий используют две про

- 39 007005 точные кюветы, в одной из которых иммобилизован Т№ (образец), а вторая кювета недериватизирована (пустышка). В кюветы подают 120 мкл каждой концентрации антител при скорости 30 мкл/мин (фаза ассоциации), а затем непрерывно в течение 360 с подают буфер (фаза диссоциации). Поверхность чипа восстанавливают (комплекс фактор некроза опухоли альфа/антитело распадается) двумя последовательными инъекциями по 30 мкл каждая 2 М раствора гуанидинтио цианата.

Анализ результатов дают с использованием оценок по В1А 3.0 или СЬАМР 2.0, известных в технике. Для каждой концентрации антител вычитают сенсограмму пустышки из сенсограммы образца. Глобальную подгонку осуществляют как для диссоциации (к_б, с^-1), так и для ассоциации (ка, моль^-1-с^-1), и вычисляют константу диссоциации (Кс, моль, к_б/к_а). Когда аффинность антител настолько высока, что ЯИ захваченных антител составляют >100, получают дополнительные разведения антител.

Результаты и обсуждение

Получение моноклональных антител против человеческого ΤΝΕ

Осуществляют несколько слияний, и каждое слияние высевают в 15 планшетов (1440 лунок/ слияние), что дает несколько дюжин антител, специфических для человеческого Т№. Найдено, что некоторые из них состоят из комбинации цепей человеческого и мышиного 1д. Остальные гибридомы секретируют антитела, состоящие только из человеческих тяжелых и легких цепей. Ожидается, что все человеческие гибридомы являются 1дС1.

Кинетика связывания человеческих антител против человеческого ΤΝΕ

Анализ методом ЕЫ8А подтверждает, что очищенные антитела из большинства или всех гибридом связываются с Т№ в зависимости от концентрации. Фиг. 1-2 показывают результаты по относительной эффективности связывания таких антител. В данном случае измеряют авидность антител в отношении их соответствующих антигенов (эпитопов). Следует отметить, что связывание Т№ непосредственно с планшетом для Е1А может вызвать денатурацию белка, и кажущиеся аффинности связывания не могут отражать связывание с неденатурированным белком. В интервале концентрации обнаруживается связывание на пятьдесят процентов.

Количественные константы связывания получают с использованием анализа В1Асоге человеческих антител, и получают, что некоторые человеческие моноклональные антитела имеют очень высокую аффинность с К,, в интервале 1х10^-9 - 7х10^-12.

Выводы

Осуществляют ряд слияний с использованием спленоцитов от гибридных мышей, содержащих трансгены антител с человеческими вариабельными и константными областями, которых иммунизируют человеческим Т№. Получают набор нескольких полностью человеческих моноклональных реакционноспособных в отношении ТМГ антител 1дС изотипа 1дС1. Полностью человеческие моноклональные антитела характеризуются далее. Некоторые из полученных антител имеют константы аффинности от 1х10⁹до 9х10¹². Неожиданно высокая аффинность таких полностью человеческих моноклональных антител делает их пригодными для терапевтических применений при Т№-зависимых болезнях, патологиях или родственных состояниях.

Пример 3. Получение человеческих моноклональных антител 1дС, реакционноспособных в отношении человеческого ЮТУ.

Краткое изложение

Гибридных мышей (СВА/Й х С57/ВЬ6/Й)Р₂ (1-4), содержащих трансгены антител с вариабельной и константной областями человека как для тяжелых, так и для легких цепей, иммунизируют рекомбинантным человеческим ЮТУ. Одно слияние, названное СепТКУ, дает восемь полностью человеческих моноклональных антител 1дС1к, связывающихся с иммобилизованным рекомбинантным человеческим Т№а. Вскоре после идентификации восемь клеточных линий переносят в лабораторию молекулярной биологии для дальнейшей характеризации. Так как таким Май являются полностью человеческими по последовательностям, ожидается, что они менее иммуногенны для людей, чем сА2 (Яетюабе).

Аббревиатуры

В8А - бычий сывороточный альбумин,

СО2 - диоксид углерода,

ДМСО - диметилсульфоксид,

РВ8 - сыворотка плода коровы,

Н2О2 - пероксид водорода,

НС - тяжелая цепь,

НРЯ - пероксидаза из хрена,

1д - иммуноглобулин,

1Р - интраперитеонеальный,

IV - внутривенный,

Май - моноклональное антитело,

ΟΌ - оптическая плотность,

- 40 007005

ОРО - дигидрохлорид о-фенилендиамина,

РЕС - полиэтиленгликоль,

Р8А - пенициллин, стрептомицин, амфотерицин,

ΕΤ - комнатная температура,

- подкожный,

ΤΝΕΥ (ΤΝΕΥ) - фактор некроза опухоли-альфа, об./об. - объем/объем, мас./об. - масса/объем.

Введение

Трансгенных мышей, содержащих гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека, используют для получения полностью человеческих моноклональных антител, специфичных для рекомбинантного человеческого ΤΝΕΥ. Ожидается, что такие уникальные антитела можно использовать, как используют сА2 (Еетюабе), для терапевтического ингибирования воспалительных процессов, вовлеченных в опосредуемое ΤΝΕΥ заболевание, с преимуществом повышенного времени полужизни в сыворотке и пониженным побочным действием, связанным с иммуногенностью.

Материалы и методы

Животные

Трансгенные мыши, экспрессирующие иммуноглобулины человека, но не мышиный 1дМ или 1дк, разработаны СепРйагт 1п!ета1юпа1. Такие мыши содержат функциональные трансгены человеческих антител, которые претерпевают соединение У(Э)Е переключение класса цепи на тяжелую и соматическую мутацию для получения спектра антиген-специфических иммуноглобулинов человека (1). Трансгены легкой цепи образуются частично из дрожжевого клона искусственных хромосом, который включает почти половину человеческого Ук-локуса зародышевой линии. Кроме нескольких генов УН, трансген тяжелой цепи (НС) кодирует как человеческую μ, так и человеческую γ1 (2), и/или константные области γ3. Мышей, полученных из генотипических линий дифференцировки НСо12/КСо5, используют при иммунизации и в процессе слияния для получения полностью человеческих моноклональных антител против ΤΝΕ.

Очистка человеческих ΤΝΕΎ

Человеческие ΤΝΕΥ выделяют в чистом виде из супернатанта культуры ткани из клеток С237А посредством аффинной хроматографии с использованием колонки со слитым белком ΤΝΕΥ-рецептор Εс (р55-к£2) (5), соединенным с сефарозой 4В (Рйагтааа). Клеточный супернатант смешивают с одной девятой его объема 10х РВ8 Дульбекко (Э-РВ8) и пропускают через колонку при 4°С со скоростью 4 мл/мин. Затем колонку промывают РВ8, и элюируют ΤΝΕΥ 0,1 М раствором цитрата натрия, рН 3,5, и нейтрализуют 2 М трис-НС1, рН 8,5. Очищенным ΤΝΕΥ заменяют буфер на 10 мМ трис, 0,12 М хлорида натрия, рН 7,5, и фильтруют через шприц с фильтром 0,2 мкм.

Иммунизация

Самок мышей СепРйагт в возрасте приблизительно 16 недель иммунизируют 1Р (200 мкл) и ΙΌ (100 мкл в основание хвоста) в целом 100 мкг ΤΝΕΥ (серия ГО102298 или ГО102098), эмульгированных с равным объемом адъюванта Ейегтах, в дни 0, 12 и 28. У мышей берут кровь в дни 21 и 35 ретроорбитальной пункцией без антикоагулянта. Кровь оставляют свертываться при ΒΤ в течение одного часа, и сыворотку собирают и титруют с использованием для ΤΝΕΥ твердофазного анализа Е1А. Слияние, названное СеиЕМУ, осуществляют после того, как мышь остается без изменений в течение семи недель, на 28 день после инъекции. Затем мыши с титром специфического человеческого 1дС 1:160 против ΤΝΕΥ дают конечную IV бустер-инъекцию 50 мкг ΤΝΕΥ, разведенного в 100 мкл физиологического раствора. Три дня спустя мышей умерщвляют путем цервикального смещения, селезенки асептически удаляют и погружают в 10 мл холодного забуференного фосфатом физиологического раствора (РВ8), содержащего 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В (Р8А). Спленоциты собирают путем стерильной перфузии селезенки Р8А-РВ8. Клетки промывают один раз в холодном Р8А-РВ8, подсчитывают с использованием счетчика Сои1!ег и ресуспендируют в среде ЕРМ1 1640, содержащей 25 мМ Нерек.

Клеточные линии

Несекретирующего партнера для слияния миелому мышей 653 получают в группе Се11 Вю1оду 8егтюек (СВ8) на 5-14-97 от группы Сеп!осог'к Ргобис! ^еνе1οртеη!. Клеточную линию размножают в среде ЕРМ1 (ДНЕ Вюкаепсек) с добавлением 10% (об./об.) ΕВ8 (Се11 Си1!иге ЬаЬк), 1 мМ пирувата натрия, 0,1 мМ КЕАА, 2 мМ Ь-глутамина (все от ДНЕ Вюкаепсек) и криоконсервируют в смеси 95% ΕВ8 и 5% ДМСО (81дта), затем хранят в СВ8 в морозильной камере, охлаждаемой парами жидкого азота. Банк клеток стерилен (ОиаШу Соп!го1 Сеп!осог, Макет) и свободен от микоплазмы (Вюшсще ЬаЬога!опек). Клетки до слияния сохраняют в культуре в логарифмической фазе. Их промывают в РВ8, подсчитывают, и перед слиянием определяют жизнеспособность (>95%) по эксклюзии красителя трипанового синего.

Человеческие ΤΝΕΥ получают с помощью рекомбинантной клеточной линии, названной С237А, полученной в Мо1еси1аг Вю1оду при Сеп!осог. Клеточную линию размножают в среде 1МОМ (ДЕН Вю

- 41 007005

5с1ег1се5) с добавлением 5% (об./об.) ЕВ8 (Се11 Сикиге ЬаЬ§), 2 мМ Ь-глутамина (все от ДНК Вю5с1ег1се5) и 0,5 мкг/мл микофеноловой кислоты и криоконсервируют в смеси 95% ЕВ8 и 5% ДМСО (81дта), затем хранят в СВ8 в морозильной камере, охлаждаемой парами жидкого азота (13). Банк клеток стерилен (ОнаШу СоШго1 СеШосог, Ма1гет) и свободен от микоплазмы (Вюшдие ЬаЬогаЮпек).

Слияние клеток

Слияние клеток осуществляют с использованием соотношения 1:1 мышиных миелоидных клеток 653 и жизнеспособных клеток селезенки мыши. Коротко, клетки селезенки и клетки миеломы осаждают вместе центрифугированием. Осадок постепенно, в течение 30 с, ресуспендируют в 1 мл 50% (мас./об.) раствора РЕС в РВ8 (молекулярная масса РЕС 1450 г/моль, 81дта) при 37°С. Слияние останавливают, постепенно добавляя 10,5 мл среды КРМ1 (без добавок) (1КН) (37°С), в течение 1 мин. Слитые клетки центрифугируют в течение 5 мин при 750 об/мин. Затем клетки ресуспендируют в среде НАТ (среда КРМ1/НЕРЕ8, содержащая 10% сыворотки плода коровы (1КН), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ Ьглутамина, 2,5% добавки для культивирования Олден (Ещкег), 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 1% 653кондиционированных сред КРМ1, 100 мкМ гипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина и 16 мкМ тимидина) и затем высевают по 200 мкл/лунку в пять 96-луночных планшетов для культивирования тканей с плоскодонными лунками. Затем планшеты помещают в инкубатор при 37°С с влажной средой, содержащей 5% СО₂ и 95% воздуха, на 7-10 суток.

Детекция человеческих антител 1§С против ΤΝΕΥ в мышиной сыворотке

Твердофазный Е1А используют для скрининга мышиных сывороток на человеческие антитела 1дС, специфичные для человеческого Т№У. Коротко, на планшеты наносят ΙΝΕν при 1 мкг/мл в РВ8 в течение ночи. После промывки в 0,15 М физиологическом растворе, содержащем 0,02% (об./об.) твина 20, лунки блокируют 1% (мас./об.) В8А в РВ8, 200 мкл/лунку, в течение 1 ч при КТ. Планшеты используют или сразу же или замораживают при -20°С для последующего использования. Мышиные сыворотки инкубируют при двухкратных серийных разведениях на покрытых человеческим ТКЕУ планшетах при 50 мкл/лунку при КТ в течение 1 ч. Планшеты промывают и затем зондируют 50 мкл/лунку меченными НКР козьими античеловеческими Ес 1дС, специфически (точно) разведенными 1:30000 в 1% В8А-РВ8, в течение 1 ч при КТ. Планшеты снова промывают, и добавляют в течение 15 мин при КТ 100 мкл/лунку раствора цитратфосфатного субстрата (0,1 М лимонной кислоты и 0,2 М фосфатат натрия, 0,01% Н₂О₂ и 1 мг/мл ОРО). Затем добавляют стоп-раствор (4 н серная кислота) в количестве 25 мкл/лунку, и считывают ОЭ при 490 нм с помощью автоматизированного спектрофотометра для прочтения планшетов.

Поскольку мыши СеиРкалп способны генерировать цепи как мышиных, так и человеческих иммуноглобулинов, используют два Е1А для испытания жизнеспособных клонов положительных гибридом на наличие как человеческих легких цепей, так и человеческих тяжелых цепей. Планшеты сенсибилизируют так, как описано выше, и неразведенные гибридомные супернатанты инкубируют на планшетах в течение одного часа при 37°С. Планшеты промывают и зондируют в течение одного часа при 37°С или конъюгированными с НКР козьими античеловеческими антителами каппа (8ои!кет Вю1еск), разведенными 1:10000 в 1% В8А-НВ88, или конъюгированными с НКР козьими античеловеческими специфическими антителами Ес 1дС, разведенными 1:30000 в 1% В8А-НВ88. Затем планшеты инкубируют с раствором субстрата как описано выше. Клоны гибридом, не дающие положительного сигнала как в формате Е1А с античеловеческими каппа, так и в формате Е1А с античеловеческими Ес 1дС, отбрасывают.

Изотипирование

Определение изотипов антител осуществляют с использованием Е1А в формате, подобном формату, используемому для скрининга мышиных иммунных сывороток на специфические титры. Планшеты для 1ЕА покрывают козьим античеловеческим 1дС(Н+Ь) при 10 мкг/мл в натрийкарбонатном буфере в течение ночи при 4ЕС и блокируют так, как описано выше. Чистые супернатанты 24 луночных культур инкубируют на планшете в течение одного часа при КТ. Планшет промывают и зондируют меченным НКР козьим античеловеческим 1дС_ь 1дС₂, 1дС₃ или 1дС₄ (Вшбшд 8ке), разведенными 1:4000 в 1% В8А-РВ8, в течение одного часа при КТ. Планшет снова промывают и инкубируют с раствором субстрата, как описано выше.

Результаты и обсуждение

Получение полностью человеческих моноклональных антител против ΤΝΕΥ

Осуществляют одно слияние, названное СеηΤNV, от мыши Се^кали, иммунизированной рекомбинантным человеческим белком ΊΝΕν. Из такого слияния скринируют 196 жизнеспособных гибридов. Идентифицируют восемь гибридомных клеточных линий, секретирующих полностью человеческие антитела 1дС, реакционноспособные в отношении человеческого Т№7. Каждая из указанных восьми клеточных линий секретирует иммуноглобулины изотипа человеческого 1дСК, и их все субклонируют дважды путем предельного разведения, и получают устойчивые клеточные линии (гомогенность >90%). Названия клеточных линий и соответствующие С-кодовые обозначения приводятся в табл. 1. Каждую клеточную линию замораживают в банках исследуемых клеток на 12 флаконов, которые хранят в жидком азоте.

- 42 007005

Родительские клетки каждой из восьми клеточных линий, собранные из лунок 24-луночного планшета, передают в группу молекулярной биологии 2-18-99 для трансфекции и дальнейшей характеризации.

Таблица 1

Обозначения клеточных линий СепТЫУ

Название	С-кодовое обозначение
ΟθηΤΝνΐ4,17,12	С414А
ΟθηΤΝνίδ,28,11	С415А
6εηΤΝν32,2,16	С416А
ΟεηΤΝνδβ,14,34	С417А
ΟεηΤΝνίΙδ,3,36	С418А
СепТЫУ122,23,2	С419А
ΟθηΤΝνΐ48,26,12	С420А
6епТЫУ196,9,1	С421А

Выводы

Слияние ΘеηΤNV осуществляют с использованием спленоцитов от гибридной мыши, содержащей трансгены антител с человеческими вариабельными и константными областями, иммунизированной рекомбинантным человеческим ΤΝΡν, полученным в Сеηίοсο^. Получены восемь полностью человеческих моноклональных антител 1цО изотипа ОСА, реакционноспособных в отношении ΤΝΡν. Родительские клеточные линии передают в группу молекулярной биологии для дальнейшей характеризации и разработки. Одно из таких новых человеческих антител может оказаться полезным противовоспалительным средством с возможным преимуществом уменьшенной иммуногенности и осложнений аллергического типа по сравнению с Кеш1сабе.

Ссылки !· Тау1ог, βί аЦ. 1пГетаНопа11ттипо1оеу 6:579-591 (1993).

²· ЬопЪегд,« а1.» ΝαΠιτε 368:856-859 (1994).

³· ЫеиЬегдег, М. Ыа1иге В101есЬпо1оду 14:826 (1996).

⁴· Γίβίπνίΐά, еГ а!., №1иге Вю1есИпо1о_еу 14:845-851 (1996).

⁵· ЗсаПоп, « а!., СуЮкте 7:759-770 (1995).

Пример 4. Клонирование и получение клеточных линий, экспрессирующих человеческие антитела против ΤΝΡν.

Краткое изложение

Обнаружено, что панель из восьми человеческих моноклональных антител (βιΑΙΕ) с обозначением ΤΝν связывается с иммобилизованным ΤΝΡν с кажущейся высокой авидностью. Показано, что семь из восьми тΑЬ блокируют связывание ΙηιΤΝ1^;ν с рецептором рекомбинантного ΤΝΡ. Анализ последовательностей ДНК, кодирующей семь βιΑΙι, подтверждает, что тΑЬ имеют человеческие ν-области. Последовательности ДНК также показывают, что три пары тΑЬ идентичны друг другу, так что первоначальная панель из восьми тΑЬ содержит только четыре разных βιΑΙι, представленных ΤΝν14, ΤΝν15, ΤΝν148 и ΤΝν196. На основании анализа расшифрованных аминокислотных последовательностей тΑЬ и результатов данных о нейтрализации ΤΝΡν ΐη νΐίΓο для дальнейших исследований отбирают тΑЬ ΤΝΥ148 и ΤΝΥ14.

Поскольку пролиновый остаток в позиции 75 (каркасный участок 3) в тяжелой цепи ΤΝν148 в других человеческих антителах той же подгруппы во время исследования базы данных в указанной позиции не обнаружен, осуществляют сайт-направленный мутагенез для кодирования серинового остатка в указанной позиции, для того, чтобы приспособить его к известным последовательностям каркасного участка зародышевой линии. Модифицированные серином тΑЬ обозначают ΤΝν148Β. ПЦРамплифицированную ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелых и легких цепей ΤΝν148Β и ΤΝν14, клонируют в заново полученные экспрессирующие векторы, основанные на недавно клонированных генах тяжелых и легких цепей другого человеческого тΑЬ (12Β75), описанного в заявке на патент США №60/236827, поданной 7 августя 2000 г., озаглавленной Антитела к Ш-12, композиции, способы и применения, опубликованной как АО 02/125000, которая полностью включена в данное описание в качестве ссылки.

Клетки Р3Х63А§8.653 (653) или клетки миеломы мыши 8р2/0-А§14 (Ξρ2/0) трансфицируют соответствующими плазмидами, экспрессирующими тяжелые и легкие цепи, и скринируют в двух циклах субклонирования на клеточные линии, продуцирующие высокие уровни рекомбинантных тΑЬ ΤΝΥ148Β

- 43 007005 и ΤΝν14 (ίΤΝν148Β и ΓΤΝν14). Кривые развития роста и стабильность продуцирования тΑЬ во времени показывают, что клоны трансфектантов 653 С466Б и С466С устойчиво продуцируют приблизительно 125 мкг/мл шΑЬ ΓΤΝν148Β в отработанных культурах, в то время как трансфектант 8р2/0 1.73-12-122 (С447А) устойчиво продуцируют приблизительно 25 мкг/мл шΑЬ ΓΤΝΎ148Β в отработанных культурах. Подобные анализы показывают, что клон трансфектантов 8р2/0 С476А продуцирует 18 мкг/мл шΑЬ ΓΤΝν14 в отработанных культурах.

Введение

Ранее показано, что панель из восьми шΑЬ, полученных от мышей ОеηРЬ^т/Меба^еx, иммунизированных человеческим ΤΝΡν (генотип НСо12/КСо5), связывается с человеческим ΤΝΡν и имеет полностью человеческий Ι§Ο1 изотипа каппа. Используют простой анализ связывания для того, чтобы путем оценки способности блокировать ΤΝΡν от связывания с рецептором рекомбинантного ΤΝΡ определить, вероятно ли, что примеры шΑЬ изобретения обладают ΤΝΡν-нейтрализующей активностью. На основании полученных результатов, результатов секвенирования ДНК и характеризации ίη νΐίΐΌ нескольких шΑЬ отбирают ΤΝν148 как тΑЬ для дальнейшей характеризации.

Последовательности ДНК, кодирующие шΑЬ ΤΝν148, клонируют, модифицируют для подгонки к векторам, экспрессирующим гены, кодирующие подходящие константные области, вводят в хорошо охарактеризованные клетки миеломы мыши 653 и 8р2/0, и полученные трансфицированные клеточные линии скринируют до тех пор, пока не идентифицируют субклоны, продуцирующие в 40 раз больше тΑЬ, чем первоначальная гибридомная клеточная линия.

Материалы и методы Реагенты и клетки

Реагент ΤΚΙΖΟΕ закупают в О1Ьсо ΒΚΚ Протеиназу К получают от 81§та СЬет1са1 Сотрану. Обратную транскриптазу получают от ЫГе Заде^ез, Ιη^. !ад-ДНК-полимеразу получают или от Регкт Е1тег СеШз или от О1Ьсо ΒΚΚ Рестриктазы закупают в Ые^ Еп^эЫ Βω^^. Набор рЬДдшск РСЯ РигШсэНоп закупают в (^адеи. Набор для сайт-направленного мутагенеза Ри^кСка^е закупают в Наборы Ш|/агб р1а8т1б тткер и ΚΝα^ίη закупают в Рготеда. ОрИрЫез получают от Раскагб. ¹²⁵Ι закупают в Αше^8Ьаш. Обычные олигонуклеотиды закупают в Κеу8ΐοηе/Β^ο8οи^се Шета^о^Ь Названия, порядковые номера и последовательности олигонуклеотидов, используемых в данной работе, приводятся в табл. 2.

Таблица 2. Олигонуклеотиды, используемые для клонирования, конструирования или секвенирования генов шΑЬ ΤΝν.

Аминокислоты, кодированные олигонуклеотидами 5'14з и НиН-16, показаны выше последовательности. Аминокислотный остаток М представляет кодон начала трансляции. Подчеркнутые последовательности в олигонуклеотидах 5'14з и НиН-16 отмечают сайты рестрикции Βδΐ^Ι и ΒδΐΒΙ соответственно. Слэш в НиН-16 соответствует границе экзон/интрон. Следует отметить, что олигонуклеотиды, чьи последовательности соответствуют минус-цепи, представлены в ориентации 3'-5'.

Название Ι.Ρ. Последовательность________

НС1-4Ь

119

З’-ТТООТССАбТССОАСТОб-У

Н61-5Ь

НО111_е

НО1-6

360

НСК1-ЗЕ

117

НиК-ЗШ

208

ΗΥΚΚΝΑδβς

5'148

366

367

368

370

388

362

НиЬ-В

Υ148

380

У148-РС2

3’-САССТОСАСТСО6ТССТТ-5'

3'-САСТСТТТТ6АОТОТОТАСОООСТТААОТТ-5'

3'-6ССССАСОТОТООААС}66-5’

З-АОТСААСЮТСООАСТОбСТТААСТТ-5'

3'-СТТОТССССТСТСАСААТСТГСС}АА1ТТ-5'

3'-6ОС6ОТАОАСТАСТСОТС-5'

I

5-ТТТСС1ДССССАССАТСОАСТССАССТаСАССАТС-3'

5'-ТТТС0ТАС0ССАССАТО60аТТТ006СТОА0СТ0-3'

5'-ТТТСОТАСОССАССАТСОАОТТТ060СТОАОСАТ6-3*

5'-ТТТСОТАС6ССАССАТОАААСАССТОТСОТТСТТС-3’

5'-ТТТС6ТАС6ССАССАТО60ОТСААССОССАТССТС-3’

Вз№1

3'-аТ<ЗССАаТС6САОАСОАСТС/САТТСААС€ТТАА<ЗТТ-5'

8

5'-ТПШШДСАССАТООАСАТОАОООТСС(ТС)С-3’

5'-ПТОТС6АСАССАТООААОССССА6СТС-3'

I

З'СТОСТТТСАССТАТАСгТТТС/САТТСАОААТТСССгССССПТ

5’-САТСТССАОАОАСААТ1ССААСААСАС6€ТОТАТС-3’

З'-ОТАОАОСТСТСТОТТАабСТТСТТОТОССАСАТАО-б'

- 44 007005

Получают отдельный флакон с замороженными клетками миеломы мыши 653. Флакон оттаивают, и в тот же день клетки размножают в Т-колбах в ГМЭМ, 5% РВ8, 2 мМ глутамина (среда). Полученные клетки выдерживают при непрерывном культивировании до тех пор, пока спустя 2-3 недели их не трансфицируют ДНК против ΤΝΕ, как описано в данном описании. Некоторые из культур собирают через 5 дней после даты оттаивания, осаждают центрифугированием и ресуспендируют в смеси 95% РВ8 и 5% ДМСО, делят на аликвоты в 30 флаконов, замораживают и хранят для последующего использования. Подобным образом, получают отдельный флакон с замороженными клетками миеломы мыши 8р2/0. Флакон оттаивают, вновь получают замороженные препараты, как описано выше, и флаконы с замороженными клетками хранят в морозильных камерах АА и АВ СВС. Такие клетки оттаивают и используют в случае всех трансфекций 8р2/0, описанных в данном описании.

Анализ на ингибирование связывания ΤΝΕ с рецептором

Супернатанты гибридомных клеток, содержащие тАЬ ΤΝν, используют для анализа способности тАЬ блокировать связывание меченного ¹²⁵Ι ΤΝΕΥ со слитым белком рецептора рекомбинантного ΤΝΕ р55-кГ2 (8са11ои е! а1. (1995), Су!окте, 7:759-770). К Ор!1р1а!ек добавляют 50 мкл 0,5 мкг/мл раствора р55кГ2 в РВ8 для сенсибилизации лунок во время одночасовой инкубации при 37°С. Получают серийные разведения восьми клеточных супернатантов в 96-луночных планшетах с круглодонными лунками с использованием в качестве разбавителя РВ8/0,1% В8А. Клеточный супернатант, содержщий тАЬ против 1Ь-18, включают в качестве отрицательного контроля, и тот же супернатант против 1Ь-18 с насаженным сА2 (химерные антитела против ΤΝΕ, Еетюабе, патент США № 5770198, включен в данное описание в качестве ссылки) включают в качестве положительного контроля. Меченный ¹²⁵Ι ΤΝΕΥ (50 мКи/мг, Ό. 8йеа1у) добавляют к клеточным супернатантам 100:1 до конечной концентрации 5 нг/мл. Смесь предварительно инкубируют в течение одного часа при ΕΤ. Сенсибилизированные ОрЕр1а!ек промывают для удаления несвязанного р55-кГ2, и смесь ¹²⁵Ι ΤΝΕν/клеточный супернатант, 50:1, переносят на Ор!1р1а!ек. После 2 ч при ΕΤ Ор!1р1а!ек промывают три раза смесью РВ8 и твина. Добавляют М1сгоксш!-20, 100:1, и определяют число импульсов в минуту для связанного материала с использованием гамма-счетчика Шр^ии!.

Амплификация У-генов и анализ последовательности ДНК

Гибридомные клетки промывают один раз в РВ8 перед добавлением реагента таКОЕ для получения РНК. От 7х10⁶ до 1,7х10⁷ клеток ресуспендируют в 1 мл ТОКОЕ. После добавления 200 мкл хлороформа пробирки энергично встряхивают. Образцы центрифугируют при 4°С в течение 10 мин. Водную фазу переносят в чистую центрифужную пробирку, и добавляют равный объем изопропанола. Пробирки энергично встряхивают, и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем образцы центрифугируют при 4°С в течение 10 мин. Осадки промывают один раз 1 мл 70% этанола и кратковременно сушат в вакуумной сушилке. Осадки РНК ресуспендируют с 40 мкл воды, обработанной ЭЕРС. Количество препаратов РНК определяют фракционированием 0,5 мкл в 1% агарозном геле. РНК до использования хранят в морозильнике при -80°С.

Для того, чтобы получить кДНК тяжелых и легких цепей, получают смеси, содержащие 3 мкл РНК и 1 мкг или олигонуклеотида 119 (тяжелая цепь) или олигонуклеотида 117 (легкая цепь) (см. табл. 2) в объеме 11,5 мкл. Смеси инкубируют при 70°С в течение 10 мин на водяной бане и затем охлаждают на льду в течение 10 мин. Получают отдельную смесь, полученную из 2,5 мкл 10Х буфера для обратной транскрипции, 10 мкл 2,5 мМ бNΤР, 1 мкл обратной транскриптазы (20 единиц) и 0,4 мкл ингибитора рибонуклеазы ЕПакт (1 единица). Добавляют 13,5 мкл такой смеси к 11,5 мкл охлажденной смеси РНК и олигонуклеотида, и реакционную смесь инкубируют в течение 40 мин при 42°С. Затем продукт реакции синтеза кДНК хранят в морозильнике при -20°С до использования.

Неочищенные кДНК тяжелой и легкой цепи используют в качестве матриц для ПЦР-амплификации последовательностей, кодирующих вариабельные области. Пять пар олигонуклеотидов (366/354, 367/354, 368/354, 369/354 и 370/354, табл.2) одновременно испытывают на их способность примировать амплификацию ДНК тяжелой цепи. Две пары олигонуклеотдов (368/208 и 363/208) одновременно испытывают на их способность примировать амплификацию ДНК легкой цепи. Реакции ПЦР осуществляют с использованием 2 единиц высокоточной Τπς-ДНК-полимеразы платинум™ (ΗΙΕΙ) в общем объеме 50 мкл. Каждая реакционная смесь включает 2 мкл реакционной смеси кДНК, 10 пмоль каждого олигонуклеотида, 0,2 мМ бЭТР, 5 мкл 10Х буфера ΗΙΕΙ и 2 мМ сульфата магния. Программа термоячейки: 90°С в течение 5 мин с последующими 30 циклами (94°С в течение 30 с, 62°С в течение 30 с, 68°С в течение 1,5 мин). Затем следует конечная инкубация при 68°С в течение 10 мин.

Для того, чтобы подготовить продукты ПЦР для прямого секвенирования ДНК, их очищают с использованием набора для очистки продуктов ПЦР О^цшск™ согласно протоколу изготовителя. ДНК элюируют из вращающейся колонки с использованием 50 мкл стерилизованной воды и затем концентрируют до объема 10 мкл с использованием вакуумной сушилки. Затем получают реакционную смесь для секвенирования ДНК с 1 мкл очищенного продукта ПЦР, 10 мкл олигонуклеотидного праймера, 4 мкл готовой реакционной смеси терминатор™, В1дЭуе, и 14 мкл стерилизованной воды в общем объеме 20 мкл. Продукты ПЦР тяжелой цепи, полученные с парой олигонуклеотидов 367/354, секвенируют с оли

- 45 007005 гонуклеотидными праймерами 159 и 360. Продукты ПЦР легкой цепи, полученные с парой олигонуклеотидов 363/208, секвенируют с олигонуклеотидными праймерами 34 и 163. Программа термоячейки для секвенирования состоит из 25 циклов (96°С в течение 30 с, 50°С в течение 15 с, 60°С в течение 4 мин) с последующей выдержкой при 4°С в течение ночи. Продукты реакции фракционируют в полиакриламидном геле и детектируют с использованием секвенатора ДНК АВ1 377.

Сайтнаправленный мутагенез для замены аминокислоты

Заменяют один нуклеотид в последовательности ДНК вариабельной области тяжелой цепи ΤΝν148 для того, чтобы в тАЬ ΤΝν148 заменить Рго⁷⁵ на остаток серина. Создают и располагают комплементарные олигонуклеотиды 399 и 400 (табл. 2) для осуществления такой замены с использованием уникального сайта клонирования Вк1\У1 непосредственно перед сайтом инициации трансляции, следуя протоколу изготовителя. Полученную плазмиду называют р1747. Для того, чтобы ввести сайт ВкбВ1 в 3'-конец вариабельной области, создают 5'-олигонуклеотидный праймер с сайтами 8а11 и ВкбВ1. Такой праймер используют с обратным праймером риС для амплификации фрагмента в 2,75 т.п.н. из р1747. Затем такой фрагмент клонируют обратно во встречающийся в природе сайт 8а11 в вариабельной области 12В75 и сайт НшбШ, причем посредством этого вводят уникальный сайт ВкбВ1. Полученный промежуточный вектор, обозначенный р1750, может принимать фрагменты вариабельной области с концами Вк1\У1 и ВкбВ1. Для того, чтобы получить вариант вектора тяжелой цепи, в котором константная область также происходит от гена 12В75, вставку ВатН1-НшбШ в р1750 переносят в рВВ322 для получения сайта ЕсоВ1 после сайта НбпбШ. Затем полученную плазмиду р1768 расщепляют НшбШ и ЕсоВ1 и лигируют с фрагментом НшбШ-ЕсоШ из р1744 - субклона, полученного клонированием большого фрагмента ВатН1-ВатН1 из р1560 в рВС. Затем полученную плазмиду р1784 используют в качестве вектора для фрагментов кДНК АЬ ΤΝν с концами Вк1\У1 и ВкбВ1. Проводят дополнительную работу для получения экспрессирующих векторов р1788 и р1798, содержащих константную область 1дС 1 из гена 12В75 и отличающихся друг от друга тем, какую часть интрона б-С тяжелой цепи 12В75 они содержат.

Для того, чтобы модифицировать ген легкой цепи 12В75 в плазмиде р 1558, фрагмент 8а11/Аб111 в 5,7 т.п.н., содержащий промотор и вариабельную область 12В75, переносят из р1558 в сайты ХМ/АбШ плазмиды Ь28. Такая новая плазмида р1745 обеспечивает меньшую матрицу для стадии мутагенеза. Олигонуклеотиды (С340ка11 и С340ка12) используют для введения уникального сайта рестрикции 8а11 в 5'конец вариабельной области мутагенезом с помощью ЦшскСйапде™. Полученный промежуточный вектор р1746 имеет уникальные сайты рестрикции 8а11 и А6111, в которые можно клонировать фрагменты вариабельной области. Любой фрагмент вариабельной области, клонированный в р1746, можно, предпочтительно, соединить с 3'-половиной гена легкой цепи. Для того, чтобы получить рестрикционный фрагмент из 3'-половины легкой цепи гена 12В75, который можно использовать для данной цели, олигонуклеотиды ВЛНN-1 и ВЛНN-2 отжигают один с другим с образованием двухцепочечного линкера, содержащего сайты рестрикции ВкбУ1, АЙИ, НбпбП и Ыо!1, и содержащего концы, которые можно лигировать в сайты Крп1 и 8ас1. Такой линкер можно клонировать между сайтами Крп1 и 8ас1 рВС и получить плазмиду р1757. Фрагмент в 7,1 т.п.н., содержащий константную область легкой цепи 12В75, полученный расщеплением р1558 А6111 с последующим неполным расщеплением с НбпбШ, клонируют между сайтами А6111 и НбпбШ р1757, и получают р1762. Эта новая плазмида содержит уникальные сайты для ВкбУ1 и А6111, в которые можно перенести фрагмент Вк1У1/Аб111, содержащий промоторную и вариабельную области, объединяя две половины гена.

Клонирование кДНК и сборка экспрессирующих плазмид

Все реакционные смеси ОТ-ПЦР (ΚΤ-РСВ) (см. выше) обрабатывают ферментом Кленова для дальнейшего заполнения в концах ДНК. Фрагменты ПЦР тяжелой цепи расщепляют рестриктазами ВкбУ1 и ВкбВ1 и затем клонируют между сайтами ВкбУ1 и ВкбВ1 плазмиды Ь28 (используют Ь28, поскольку промежуточный вектор на основе 12В75 р1750 пока не получен). Анализ последовательности ДНК клонированных вставок показывает, что полученные конструкции правильные, и что ошибки во время ПЦРамплификации не вкрались. Присвоенные порядковые номера таких конструкций плазмиды Ь28 (для ΤΝν14, ΤΝνΐ5, ΤΝν148, ΤΝν148β и ΤΝν196) приводятся в табл. 3.

Вставки ВкбУ1/ВкбВ1 для тяжелых цепей ΤΝν14, ΤΝν148 и ΤNV148В переносят из вектора Ь28 во вновь полученный промежуточный вектор р1750. Присвоенные порядковые номера таких промежуточных плазмид приводятся в табл. 3. Указанную стадию клонировния и последующие стадии для ΤΝΎ15 и ΤΝν196 не проводят. Затем вариабельные области переносят в два разных экспрессирующих вектора для человеческого 1дС1. Для переноса вариабельных областей в вектор 1дС1 р104, примененный ранее Сеп!осог, используют рестриктазы ЕсоШ и НшбШ. Полученные экспрессирующие плазмиды, кодирующие 1§О1 аллотипа От(б+), обозначают р1781 (ΤΝν14), р1782 (ΤΝν148) и р1783 (ΤΝν148β) (см. табл. 3). Вариабельные области также клонируют в обратном направлении от константной области 1дС1, полученной из гена 12В75 (ОепРйагт). Такие экспрессирующие плазмиды, кодирующие ΙβΟΙ аллотипа 01111(/), также приводятся в табл. 3.

Таблица 3. Порядковые номера плазмид для различных плазмид тяжелых и легких цепей.

Вектор Ь28 или вектор рВС представляет исходный клон кДНК АЬ. Вставки в указанных плазмидах переносят в неполный вектор на основе 12В75, и получают промежуточные плазмиды. Одна дополни- 46 007005 тельная стадия переноса приводит к конечным экспрессирующим плазмидам, которые или вводят в клетки после линеаризации, или используют для очистки вставок генов тАЬ перед трансфекцией клеток.

(ΝΟ) = не проводилось.
МАЬ	№ плазмиды	№ промежуточной	№ экспрессирующей	№ э кпре с сирующе й
	вектора Ь-	плазмиды	плазмиды Сш(£+)	плазмиды
	28			С1т (ζ)
Тяжелые
цепи
_л	ТС1	„ Ί Π Т -7	ΊΟΊ
11Ν V ± Ч	/ л	Ю'	х / и х	д ι / ии
ΤΝν 15	р1752	(Νϋ)	(N0)	(Νϋ)
Т№7148 р1753	р1778	р1782	р1787
ΤΝνΐ48Β ρ1760	р1779	р1783	р1788
ΤΝνΐ96 р1754	(Νϋ)	(Νϋ)	(Νϋ)
Легкие	№	№	№
цепи	плазмиды	промежуточной	эксперссирующей
	вектора	плазмиды	плазмиды
	рВС
ΤΝν 14	р1748	Р1755	р1775
ΤΝν 15	р1748	р1755	р1775
ΤΝνΐ48	р1749	р1756	Р1776
ΤΝνΐ96	Р1749	р1756	р1776

Продукты ПЦР легких цепей расщепляют рестриктазами 8а11 и 8ас11 и затем клонируют между сайтами 8а11 и 8ас11 плазмиды рВС. Два разных варианта легких цепей, отличающихся одной аминокислотой, обозначают р1748 и р1749 (табл. 3). Анализ последовательностей ДНК подтверждает, что полученные конструкции имеют правильные последовательности. Затем фрагменты 8а11/АЙ11 в р1748 и р1749 клонируют между сайтами 8а11 и АЙИ промежуточного вектора 1746, и получают р 1755 и р 1756 соответственно. Затем такие 5'-половины генов легких цепей соединяют с 3'-половинами гена путем переноса фрагментов В81«1/АЙП из р1755 и р1756 во вновь полученную конструкцию р1762, и получают конечные экспрессирующие плазмиды р 1775 и р1776 соответственно (табл. 3).

Трансфекции клеток, скрининг и субклонирование

Осуществляют всего 15 трансфекций клеток миеломы мыши с различными экспрессирующими ΤΝν плазмидами (см. табл. 4 в разделе Результаты и обсуждение). Такие Трансфекции различаются тем, что или (1) клетки-хозяева представляют собой, или 8р2/0, или 653; или (2) константная область тяжелой цепи кодируется ранее описанным вектором 1дС1 ί^ηΙο^Γ или константной областью тяжелой цепи 12В75; или (3) тАЬ представляют собой ΤNV148Β, ΤΝν148, ΤΝν14 или новое сочетание НС/ЬС; или (4) ДНК представляет собой, или линеаризованную плазмиду, или ген АЬ, представляющий интерес; (5) наличием или отсутствием полной последовательности интрона 1-С в гене тяжелой цепи. Кроме того, некоторые трансфекции повторяют для повышения вероятности того, что можно скринировать большое число клонов.

Клетки 8р2/0 и клетки 653 трансфицируют смесью ДНК тяжелой и легкой цепей (8-12 мкг каждой) путем электропорации в стандартных условиях, описанных ранее (Кшдй! Ό.Μ. е! а1. (1993), Мсйес-икш Iттυηο1οду, 30:1443-1453). Для трансфекций 1, 2, 3 и 16 соответствующие экспрессирующие плазмиды перед трансфекцией линеаризуют путем расщепления рестриктазами. Например, рестриктазы 8а11 и Νο!ΐ используют для линеаризации плазмиды тяжелой цепи р1783 и плазмиды легкой цепи р1776 ΤNV148Β, соответственно. Для остальных трансфекций путем расщепления плазмид тяжелых цепей ВатН1 и плазмид легких цепей В81«1 и Νο!ΐ из плазмидного вектора выделяют вставки ДНК, содержащие только ген тАЬ. Затем вставки генов тАЬ очищают электрофорезом в агарозном геле и смолами для очистки 01ех. Клетки, трансфицированные очищенными генными вставками, одновременно трансфицируют 3-5 мкг плазмиды р8V2др!, линеаризованной Рк!1 (р13), как источником селектируемого маркера. После электропорации клетки высевают в 96-луночные планшеты для культивирования тканей в ΙΜΌΜ, 15% ЕВ8, 2 мМ глутамина, и инкубируют при 37°С в инкубаторе с 5% СО₂. Через двое суток добавляют равный объем ΙΜΌΜ, 5% ЕВ8, 2 мМ глутамина, 2Х МНХ для селекции (1Х МНХ = 0,5 мг/мл микофеноловой кислоты, 2,5 мг/мл гипоксантина, 50 мг/мл ксантина), и планшеты инкубируют еще в течение 2-3 недель, пока формируются колонии.

Клеточные супернатанты, собранные из лунок с колониями, анализируют на человеческий 1дС методом ЕЫ8А, как описано. Коротко, различные разведения клеточных супернатантов инкубируют в 96луночных планшетах для Е1А с нанесенными фрагментами Ес поликлональных козьих античеловеческих

- 47 007005

1дС, и затем детектируют связанный человеческий 1дС с использованием конъюгированного с щелочной фосфатазой козьего античеловеческого 1дС(Н+Ь) и соответствующих цветовых субстратов. Для того, чтобы иметь возможность количественно определить в супернатантах человеческий 1дС, для каждого планшета для Е1А привлекают стандартные кривые, для которых в качестве стандарта используют те же очищенные тАЬ, которые определяют в клеточных супернатантах. Клетки в таких колониях, которые, как оказывается, продуцируют наибольшее количество человеческого 1дС, высевают в 24-луночные планшеты для дополнительных оценок продуцирования в отработанных культурах, и затем идентифицируют наиболее продуцирующие родительские клоны.

Наиболее продуцирующие родительские клоны субклонируют для идентификации наиболее продуцирующих субклонов и получения более однородной клеточной линии. Засевают 96-луночные планшеты для культивирования тканей одной клеткой на лунку или четырьмя клетками на лунку в среде 1МПМ, 5% ЕВ8, 2 мМ глутамина, 1Х МНХ, и инкубируют при 37°С в инкубаторе с 5% СО₂ в течение 12-20 суток до появления колоний. Собирают клеточные супернатанты из лунок, содержащих одну колонию на лунку, и анализируют методом ЕЫ8А, как описано выше. Отобранные колонии пересевают в 24-луночные планшеты, и перед идентификацией наиболее продуцирующих субклонов путем количественного определения содержания человеческого 1дС в их супернатантах позволяют культурам вырабатываться. Этот процесс повторяют, когда субклоны, отобранные в первом цикле, подвергают второму циклу субклонирования. Наилучшие субклоны второго цикла отбирают как клеточные линии для разработки.

Характеризация клеточных субклонов

Наилучшие субклоны второго цикла отбирают и получают кривые роста для оценки уровней продуцирования тАЬ и характеристики клеточного роста. Колбы Т75 засевают 1х10⁵ клеток/мл в 30 мл 1МОМ, 5% ЕВ8, 2 мМ глутамина и 1Х МНХ (или бессывороточных средах). Отбирают каждые 24 ч 300мкл аликвоты, и определяют плотность живых клеток. Анализы проводят до тех пор, пока число живых клеток не станет менее 1х10⁵ клеток/мл. Собранные аликвоты клеточных супернатантов анализируют на содержание присутствующих антител. Осуществляют анализы методом ЕБ18А с использованием в качестве стандарта 1С92399 ΓΤΝΥ148Β или ΓΤΝΥ14. Образцы инкубируют в течение 1 ч на планшетах для ЕЫ8А, сенсибилизированных поликлональными козьими античеловеческими Ес 1дС, и детектируют связанные тАЬ с помощью конъюгированного с щелочной фосфатазой козьего античеловеческого 1дС(Н+Ь) при разведении 1:1000.

Также осуществляют другой анализ кривых роста для двух клеточных линий с целью сравнения скоростей роста в присутствии различных количеств среды для селекции МНХ. Клеточные линии С466А и С466В распускают в среде без МНХ (1МОМ, 5% ЕВ8, 2 мМ глутамина) и культивируют еще в течение двух суток. Затем обе клеточные культуры делят на три культуры или не содержащие МНХ, или содержащие 0,2Х МНХ или 1Х МНХ (1Х МНХ = 0,5 мкг/мл микофеноловой кислоты, 2,5 мкг/мл гипоксантина, 50 мкг/мл ксантина). На следующий день чистые колбы Т75 засевают культурами с исходной плотностью 1х10⁵ клеток/мл, и подсчитывают клетки с интервалами в 24 ч в течение одной недели. Аликвоты на продуцирование тАЬ не собирают. Время удвоения для таких образцов вычисляют с использованием формулы, приведенной в 8ОР РЭ32.025.

Осуществляют дополнительное исследование антител для оценки стабильности продуцирования тАЬ со временем. Культуры выращивают в 24-луночных планшетах в 1М0М, 5% ЕВ8, 2 мМ глутамина, или с МНХ для селекции или без МНХ для селекции. Культуры делят на свежие культуры всякий раз, когда они сливаются, и затем старой культуре позволяют вырабатываться. В это время берут аликвоту супернатанта и хранят при 4°С. Аликвоты берут в течение 55-78 дней. По окончании указанного периода супернатанты проверяют на количество присутствующих антител методом ЕБ18А с античеловеческими Ес 1дС, как описано выше.

Результаты и обсуждение Ингибирование связывания ΤΝΕ с рекомбинантным рецептором

Осуществляют простой анализ на связывание для определения, все ли восемь тАЬ ΤΝν, содержащиеся в супернатантах гибридомных клеток, способны блокировать связывание ΤΝΡν с рецептором. Сначала стандартным ЕЫ8А для человеческого 1дС определяют концентрации тАЬ ΤΝν в их соответствующих клеточных супернатантах. Затем рекомбинантный слитый белок рецептора ΤΝΕ р55 и 1дС р55-кГ2 наносят на планшеты для Е1А, и допускают связывание меченного ¹²⁵Ι ΤΝΡν с рецептором р55 в присутствии различных количеств тАЬ ΤΝν. Как показано на фиг. 1, все, кроме одного (ΤΝν122), антитела из восьми тАЬ ΤΝν эффективно блокируют связывание ΤΝΡν с рецептором р55. Действительно, оказывается, что тАЬ ΤΝν более эффективны при ингибировании связывания ΤΝΡν, чем тАЬ положительного контроля сА2, которые насажены в супернатанты гибридом отрицательного контроля. Такие результаты интерпретируются как показывающие, что высока вероятность того, что тАЬ ΤΝν могут блокировать биологическую активность ΤΝΡν при анализах на клетках и ш у1уо, и, следовательно, дополнительные анализы оправданы.

- 48 007005

Анализ последовательности ДНК Подтверждение того, что РНК кодируют человеческие шАЬ

Как первую стадию при характеризации семи тАЬ ΤΝν (ΤΝν14, ΤΝν15, ΤΝν32, ΤΝν86, ΤΝν118, ΤΝν148 и ΤΝν196), которые показывают ΤΝΡ V-блокирующую активность, выделяют полную РНК из семи гибридомных клеточных линий, продуцирующих такие тАЬ. Затем каждый образец РНК используют для получения кДНК тяжелой или легкой цепей человеческих антител, включающей полную сигнальную последовательность, полную последовательность вариабельной области и часть последовательности константной области для каждого тАЬ. Затем такие кДНК-продукты амплифицируют при реакциях ПЦР, и ПЦР-амплифицированную ДНК непосредственно секвенируют без первого клонирования фрагментов. Секвенированные кДНК тяжелых цепей идентичны на >90% одному из пяти генов человеческих зародышевых линий ЭР-46, присутствующих у мышей (фиг. 2). Подобным образом, секвенированные кДНК легких цепей идентичны, или на 100%, или на 98% одному из генов человеческих зародышевых линий, присутствующих у мышей (фиг. 3). Такие результаты секвенирования подтверждают, что молекулы РНК, транскрибированные и секвенированные в кДНК, кодируют тяжелые цепи человеческих антител и легкие цепи человеческих антител. Следует отметить, что поскольку вариабельные области ПЦР-амплифицированы с использованием олигонуклеотидов, картирующих до 5'-конца последовательности, кодирующей сигнальную последовательность, первые несколько аминокислот сигнальной последовательности не могут быть фактической последовательностью первоначальных продуктов трансляции ΤΝν, но они представляют фактические последовательности рекомбинантных тАЬ ΤΝν.

Уникальные нейтрализующие тАЬ

Анализ последовательностей ДНК полных вариабельных областей как тяжелых, так и легких цепей каждого тАЬ показывает, что ΤΝν32 идентичны ΤΝν15, ΤΝν118 идентичны ΤΝν14, и ΤΝν86 идентичны ΤΝν148. Результаты анализа связывания с рецепторами соответствуют анализам последовательностей ДНК, т.е. как ΤΝν86, так и ΤΝν148 приблизительно в 4 раза лучше, чем как ΤΝν118, так и ΤΝν14, при блокировании связывания ΤΝΡ. Поэтому дальнейшая работа фокусируется только на четырех уникальных тАЬ ΤΝν: ΤΝν14, ΤΝν15, ΤΝν148 и ΤΝν196.

Родство четырех тАЬ

Результаты секвенирования ДНК показывают, что гены, кодирующие тяжелые цепи четырех тАЬ ΤΝν, высоко гомологичны друг с другом и, оказывается, все происходят от одного и того же гена зародышевой линии ЭР-46 (фиг. 2). Кроме того, поскольку каждая из последовательностей СЭК3 тяжелой цепи является настолько подобной и имеет одну и ту же длину, и поскольку все они используют экзон 16, они, несомненно, являются результатом одного события перегруппировки гена УЭБ за которым следуют соматические изменения, которые делают каждый тАЬ уникальным. Анализы последовательностей ДНК показывают, что имеются только два разных гена легкой цепи среди четырех тАЬ (фиг. 3). Кодирующие последовательности вариабельных областей легких цепей в ΤνΝ14 и ΤνΝ15 идентичны друг другу и характерной последовательности зародышевой линии семейства Vд/38Κ человеческих каппа-цепей. Кодирующие последовательности легких цепей ΤνΝ148 и ΤνΝ196 идентичны друг другу, но отличаются от последовательности зародышевой линии по двум нуклеотидным позициям (фиг. 3).

Расшифрованные аминокислотные последовательности четырех тАЬ показывают родство фактических тАЬ. Четыре тАЬ содержат четыре разные тяжелые цепи (фиг. 4), но только две разные легкие цепи (фиг. 5). Различия между последовательностями тАЬ ΤΝν и последовательностями зародышевой линии ограничиваются, главным образом, доменами СЭК, но три тяжелые цепи тАЬ также отличаются от последовательности зародышевой линии в каркасных участках (фиг. 4). При сравнении с каркасными участками АЬ, кодированными ЭР-46 зародышевой линии, ΤνΝ14 являются идентичными, ΤνΝ15 отличается на одну аминокислоту, ΤνΝ148 отличается на две аминокислоты и ΤνΝ196 отличается на три аминокислоты.

Клонирование кДНК, сайт-специфический мутагенез и сборка конечных экспрессирующих плазмид

Клонирование кДНК

Основываясь на последовательности ДНК ПЦР-амплифицированных вариабельных областей, заказывают новые олигонуклеотиды для осуществления еще одного цикла ПЦР-амплификации с целью адаптации кодирующей последовательности к клонированию в экспрессирующие векторы. В случае тяжелых цепей продукты второго цикла ПЦР расщепляют рестриктазами Вк^^VI и ВкίВI и клонируют в плазмидный вектор Б28 (порядковые номера плазмид показаны в табл. 3). В случае легких цепей продукты второго цикла ПЦР расщепляют 8аИ и АЙИ и клонируют в плазмидный вектор рВС.

Затем отдельные клоны секвенируют для подтверждения того, что их последовательности идентичны предыдущим последовательностям, полученным при прямом секвенировании продуктов ПЦР, которое показывает самый распространенный нуклеотид в каждой позиции в потенциально неоднородной популяции молекул.

- 49 007005

Сайт-специфический мутагенез для замены ΤΝνΐ48

Последовательно отмечают, что тАЬ ΤΝν148 и ΤΝν196 при нейтрализации биологической активности ΤΝΡΥ в 4 раза более сильные, чем следующие самые лучшие тАЬ (ΤΝνΐ4). Однако, как описано выше, последовательности каркасных участков тяжелых цепей ΤΝν148 и ΤΝν196 отличаются от последовательностей каркасных участков зародышевой линии. Сравнение последовательности тяжелой цепи ΤΝν148 с другими человеческими антителами показывает, что ряд других человеческих тАЬ содержат остаток Не в позиции 28 каркасного участка 1 (считают только зрелую последовательность), в то время как остаток Ργο в позиции 75 в каркасном участке 3 является необычной аминокислотой в указанной позиции.

Подобное сравнение тяжелой цепи ΤΝν196 наводит на мысль, что три аминокислоты в каркасном участке 3, по которым они отличаются от последовательности зародышевой линии, могут быть редкими в человеческих тАЬ. Существует вероятность того, что указанные различия могут придать ΤΝν148 и ΤΝν196 иммуногенность, если их ввести людям. Поскольку ΤΝν148 имеют только один аминокислотный остаток, вызывающий озабоченность, и полагают, что данный остаток не является важным для связывания с ΤΝΡΥ, используют метод сайт-направленного мутагенеза для замены одного нуклеотида в кодирующей последовательности тяжелой цепи ΤΝνΐ48 (в плазмиде р1753) с тем, чтобы в позиции 75 вместо остатка Ργο можно было кодировать остаток 8ег зародышевой последовательности. Полученную плазмиду обозначают р1760 (см. табл. 3). Полученные ген и тАЬ называют ΤNV148В для отличия их от исходных гена и тАЬ ΤΝνΐ48 (см. фиг. 5).

Сборка конечных экспрессирующих плазмид

Получают новые экспрессирующие антитела векторы, основываясь на генах 12В75 тяжелых цепей и легких цепей, предварительно клонированных как геномные фрагменты. Хотя получают различные экспрессирующие ΤΝν плазмиды (см. табл. 3), в каждом случае 5'-фланкирующие последовательности, промотор и энхансер интрона происходят от соответствующих генов 12В75. В случае плазмид, экспрессирующих легкие цепи, полный интрон Ι-С, последовательность, кодирующую константную область, и 3'-фланкирующую последовательность также получают от гена легкой цепи 12В75. В случае плазмид, экспрессирующих тяжелые цепи, приводящие к конечным продуктивным клеточным линиям (р1781 и р1783, см. ниже), последовательности, кодирующие константные области человеческого ЦС1, получают от экспрессирующего вектора, использованного ранее ΤοηΙο^Γ (р104). Более того, конечные продуктивные клеточные линии, описанные в данном описании, экспрессируют другой аллотип (Ст(£+)) тАЬ ΤΝν, чем исходные полученные из гибридом тАЬ ΤΝν (Ό1ιη(ζ)). Это происходит потому, что ген тяжелой цепи 12В75, полученный от мышей СеηΡΗа^т. кодирует остаток Агд в С-концевом окончании домена СН1, в то время как экспрессирующий вектор р104 ЦС1 Сеη!οсο^ кодирует остаток Ьук в указанной позиции. Получают другие плазмиды, экспрессирующие тяжелые цепи (например, р1786 и р1788), в которых интрон Ι-С, полная кодирующая последовательность константной области и 3'-фланкирующая последовательность происходят от гена тяжелой цепи 12В75, но клеточные линии, трансфицированные указанными генами, не отбирают как продуктивные клеточные линии. Тщательно создают векторы, допускающие одностадийное клонирование будущих ПЦР-амилифицированных ν-областей, которые приведут к конечным экспрессирующим плазмидам.

ПЦР-амилифицированные кДНК вариабельных областей переносят из векторов Ь28 или рВС в промежуточные векторы на основе 12В75, которые создают промоторную область и часть интрона 1-С (см. табл. 3 порядковых номеров плазмид). Затем рестрикционные фрагменты, содержащие 5'-половину генов антител, переносят из указанных промежуточных векторов в конечные экспрессирующие векторы, которые обеспечивают 3'-половину соответствующих генов, и получают конечные экспрессирующие плазмиды (см. табл. 3 порядковых номеров плазмид).

Трансфекции клеток и субклонирование

Экспрессирующие плазмиды или линеаризуют расщеплением рестриктазами или выделяют в чистом виде из плазмидных остовов вставки генов антител в каждой плазмиде. Клетки миеломы мыши 8р2/0 и 653 посредством электропорации трансфицируют ДНК тяжелой и легкой цепями. Осуществляют пятнадцать различных трансфекций, большинство из которых уникально, что определяют с помощью АЬ, специфических характеристик генов АЬ, являются ли гены линеаризованными целыми плазмидами или очищенными генными вставками и клеточной линии-хозяина (суммировано в табл. 4). Клеточные супернатанты от клонов, устойчивых к микофеноловой кислоте, анализируют на наличие человеческого ЦС методом ЕЫ8А и определяют количественно с использованием очищенных τΤΝνΐ48Β как эталона для стандартной кривой.

Итоги клеточных трансфекций

Приводятся порядковые номера плазмид тяжелых и легких цепей, кодирующих каждые тАЬ. В случае трансфекций, осуществленных с очищенными вставками генов тАЬ, включают плазмиду р13 (ρ8V2дρ!) как источник селектируемого маркера др!. Константные области тяжелых цепей кодируются или тем же экспрессирующим вектором для человеческого ЦС, используемым для кодирования Вет1сайе (старый), или константными областями, содержащимися в гене тяжелой цепи 12В75 (Сеш

- 50 007005

Рйагт/Мебагех) (новый). Н1/Б2 относится к новым тАй, полученным из тяжелой цепи ТКУ14 и легкой цепи ТКУ 148. Плазмиды р 1783 и р 1801 отличаются только тем, какую часть интрона 1-С содержат их гены тяжелых цепей. Номера трансфекций, определяющие первое число общих названий клеточных клонов, приводятся справа. Продуцирующие гТКУ148В клеточные линии С466 (А, В, С, Э) и С467А, описанные в данном описании, получены из трансфекций 1 и 2 соответственно. Продуцирующая гТКУ148В клеточная линия С476А получена из трансфекции 3.

МАВ	Плазмиды НС/ЬС/дрС	Вектор НС	Формат ДНК	№ трансфекции
Зр2/0	653
гТКГУ148В	1783/1776	старый	линейный	1	2
гТ№714	1781/1775	старый	линейный	3	-
ΓΤΝνΐ4	3,27-1	С476А	Зр2/0	19	мкг/мл

Характеризация субклонированных клеточных линий

Для более тщательного определения характеристик роста клеточных линий и определения уровней продуцирования тАй в крупном масштабе осуществляют анализ кривых роста с использованием культур Т75. Результаты показывают, что каждая клеточная линия из ряда четырех С466 достигает пика плотности клеток от 1,0х10⁶ до 1,25х10⁶ клеток/мл и максимальных уровней накопления тАй между 110 и 140 мкг/мл (фиг. 7). Анализ кривой роста проводят на продуцирующей гТ№У14 клеточной линии С476А.

Для определения порядка величин считается возможным, что использование меньшей концентрации МНХ может привести в существенно меньшему времени удвоения без потерь стабильности продуцирования тАй. Клеточные линии С466А и С466В культивируют или в отсутствие МНХ, или в 0,2Х МНХ, или 1Х МНХ. Живые клетки подсчитывают с интервалами в 24 ч в течение 7 дней. Результаты показывают скорость роста клеток, зависимую от концентрации МНХ (фиг. 8). Клеточная линия С466А показывает время удвоения 25,0 ч в 1Х МНХ, но только 20,7 ч в отсутствие МНХ. Подобным образом, клеточная линия С466В показывает время удвоения 32,4 ч в 1Х МНХ, но только 22,9 ч в отсутствие МНХ. Более того, время удвоения для обеих клеточных линий в 0,2 МНХ больше напоминают время, которое отмечают в отсутствие МНХ, чем при 1Х МНХ (фиг. 8). Такие наблюдения увеличивают возможность того, что усиленные рабочие характеристики клеток в биореакторах, для которых время удвоения является важным параметром, можно будет реализовать путем использования меньшего количества МНХ. Однако, хотя результаты испытания на стабильность (см. ниже) наводят на мысль, что клеточная линия С466Э способна к стабильному продуцированию гТХУ148В в течение по меньшей мере 60 дней даже в отсутствие МНХ, испытание на стабильность также показывает, что уровни продуцирования тАй в случае культивирования клеток в присутствии МНХ более высокие, чем в отсутствие МНХ.

Для того, чтобы оценить получение тАй от различных клеточных линий на протяжении периода в приблизительно 60 дней, осуществляют испытания на стабильность на культурах, которые или содержат или не содержат МНХ для отбора. Не все клеточные линии сохраняют высокое продуцирование тАй. После только 2 недель культивирования клон С466А продуцирует приблизительно на 45% меньше, чем в начале исследования. Также оказывается, что существенно падает продуцирование клона С466В. Однако клоны С466С и С466Э сохраняют довольно стабильное продуцирование, причем С466Э показывает более высокие абсолютные уровни продуцирования (фиг. 9).

Вывод

Из начальной панели из восьми человеческих тАй против человеческого ТКРУ отбирают ТКУ148В как предпочтительные на основании ряда критериев, включающих последовательность белка и возможность нейтрализации ТКР, а также ТКУ14. Получают клеточные линии, продуцирующие более 100 мкг/мл ιΓΝνΐ48Β и 19 мкг/мл гТКУ14.

Пример 4. Исследование на артритных мышах с использованием антител против ТКР и контроля с использованием однократной болюсной инъекции.

Тд 197 мышей в возрасте приблизительно 4 недели, основываясь на поле и массе тела, отбирают в одну из 9 обрабатываемых групп и обрабатывают однократным интраперитонеальным болюсом, или 1 мг/кг, или 10 мг/кг РВЗ Дульбекко (Э-РВЗ) или антителами против ТКР настоящего изобретения (ТКУ14, ТКУ148 или ТКУ196).

Результаты

Когда анализируют массы как изменяющиеся по сравнению с массой до введения, животные, обработанные 10 мг/кг сА2, последовательно показывают более высокий прирост массы, чем обработанные Э-РВЗ на протяжении всего исследования. Такой прирост массы существенен в недели 3-7. Животные, обработанные 10 мг/кг ТКУ148, также достигают существенного прироста массы в неделю 7 исследования (см. фиг. 10).

Фиг. 11, А-С, представляют развитие тяжести заболевания на основании артритного индекса (А1). У группы, обработанной 10 мг/кг сА2, артритный индекс ниже, чем у контрольной группы с Э-РВЗ, начи

- 51 007005 ная с недели 3 и на протяжении остальной части исследования (неделя 7). Животные, обработанные 1 мг/кг ΤΝνΐ4, и животные, обработанные 1 мг/кг сА2, не показывают существенного снижения А1 через 3 недели по сравнению с группой, обработанной Ц-РВЗ. Нет существенных различий между группами, обработанными 10 мг/кг, когда их сравнивают с другими, обработанными подобной дозой (10 мг/кг сА2 относительно 10 мг/кг ΤΝν14, 148 и 196). Когда сравнивают группы, обработанные 1 мг/кг, то группа, обработанная 1 мг/кг ΤΝνΐ48, показывает существенно более низкий А1, чем группа, обработанная 1 мг/кг сА2, в недели 3, 4 и 7. У группы, обработанной 1 мг/кг ΤΝνΐ48, А1 также существенно ниже, чем у обработанной 1 мг/кг ΤΝνΐ4, в недели 3 и 4. Хотя ΤΝνΐ96 показывает существенное снижение А1 до 6 недели исследования (при сравнении с группой, обработанной Ц-РВЗ), только обработка 1 мг/кг ΤΝν148 осталась значимой для заключения исследования.

Пример 5. Исследование на артритных мышах с использованием антител против ΤΝΕ и контроля в виде многократных болюсов.

Мышей в возрасте приблизительно 4 недель, основываясь на массе тела, отбирают в одну из 8 обрабатываемых групп и обрабатывают интраперитонеальным болюсом - 3 мг/кг контрольного продукта (Ц-РВЗ) или антител (ΤΝνΐ4, ΤΝνΐ48) (неделя 0). Инъекции животным повторяют в недели 1, 2, 3 и 4. Группы 1-6 оценивают на активность испытываемого продукта. Образцы сывороток, полученных от животных групп 7 и 8, оценивают на индукцию иммунной реакции и фармакокинетический клиренс ΤΝν14 или ΤΝν148 в недели 2, 3 и 4.

Результаты

Существенных различий не отмечают, когда анализируют массы как изменяющиеся по сравнению с массой до введения. Животные, обработанные 10 мг/кг сА2, последовательно показывают более высокий прирост массы, чем животные, обработанные Ц-РВЗ, на протяжении всего исследования (см. фиг. 12).

Фиг. 13, А-С, представляют развитие тяжести заболевания на основании артритного индекса. В группе, обработанной 10 мг/кг сА2, артритный индекс существенно ниже, чем в контрольной группе с ΌРВЗ, начиная с недели 2 и на протяжении остальной части исследования (неделя 5). У животных, обработанных 1 мг/кг или 3 мг/кг сА2, и животных, обработанных 3 мг/кг ΤΝν14, в любой момент на протяжении исследования существенного снижения А1, по сравнению с контрольной группой с Ц-РВЗ, не достигается. Животные, обработанные 3 мг/кг ΤΝνΐ48, показывают существенное снижение А1 при сравнении с группой, обработанной Ц-РВЗ, начиная с недели 3 и до недели 5. Животные, обработанные 10 мг/кг сА2, показывают существенное снижение А1 при сравнении с группами, обработанными меньшими дозами (1 мг/кг и 3 мг/кг) сА2 в недели 4 и 5 исследования и также существенно более низкие А1, чем животные обработанные ΤΝνΐ4, в недели 3-5. Хотя не выявляется существенных различий между группами, обработанными 3 мг/кг, А1 животных, обработанных 3 мг/кг ΤΝνΐ4, в некоторые моменты времени существенно выше, чем в случае 10 мг/кг, в то время как у животных, обработанных ΤΝν148, нет существенных различий при сравнении с животными, обработанными 10 мг/кг сА2.

Пример 6. Исследование на артритных мышах с использованием антител против ΤΝΕ и контроля в виде однократного интраперитонеального болюса.

Мышей в возрасте приблизительно 4 недель, основываясь на поле и массе тела, отбирают в одну из 6 обрабатываемых групп и обрабатывают однократным интраперитонеальным болюсом - или 3 мг/кг или 5 мг/кг антител (сА2 или ΤΝνΐ48). В данном исследовании используют контрольные группы, которые получают Ό-РВЗ и 10 мг/кг сА2.

Когда анализируют массы как изменяющиеся по сравнению с массой до введения, все животные достигают подобного прироста массы. Животные, обработанные или 3 мг/кг или 5 мг/кг ΤΝν148 или 5 мг/кг сА2 существенно прибавляют в весе на ранней стадии исследования (в недели 2 и 3). Только животные, обработанные ΤΝν148, сохраняют существенный прирост массы в более поздние периоды. Животные, обработанные как 3 мг/кг, так и 5 мг/кг ΤΝν148, показывают значимые величины в неделю 7, и животные, обработанные 3 мг/кг ΤΝν148, все еще существенно прибавляют массу в 8 неделю после инъекции (см. фиг. 14).

Фиг. 15 представляет развитие тяжести заболевания на основании артритного индекса. Все обработанные группы показывают некоторую защиту в более ранние периоды, причем обработанные 5 мг/кг сА2 и 5 мг/кг ΤΝνΐ48 показывают существенное снижение А1 в недели 1-3, и все обработанные группы показывают существенное снижение А1 в неделю 2. Позднее при исследовании животные, обработанные 5 мг/кг сА2, показывают некоторую защиту при существенном снижении в недели 4, 6 и 7. Низкая доза (3 мг/кг) как сА2, так и ΤΝν148 показывает значительное снижение на неделе 6, и все обработанные группы показывают значительное снижение на неделе 7. Ни одна из обработанных групп не сохраняет существенного снижения при окончании исследования (неделя 8). Не имеется существенных различий между любыми обработанными группами (за исключением контрольной группы, обработанной физиологическим раствором) в любой момент времени.

Пример 7. Исследование артритных мышей с использованием антител против ΤΝΕ и контроля в виде однократного интраперитонеального болюса для сравнения антител против ΤΝΕ и модифицированных антител против ΤΝΕ.

- 52 007005

Для того, чтобы сравнить эффективность однократного интраперитонеального болюса ΤΝν148 (полученных из гибридомных клеток) и гтаУ148В (полученных из трансфицированных клеток), мышей в возрасте приблизительно 4 недель, основываясь на поле и массе тела, отбирают в одну из 9 обрабатываемых групп и обрабатывают однократным интраперитонеальным болюсом - 1 мг/кг РВ8 Дульбекко (ΌРВ8) или антител (ΤΝν148, ггаУ148В).

Когда анализируют массы как изменяющиеся по сравнению с массой до введения, животные, обработанные 10 мг/кг сА2, последовательно показывают больший прирост массы, чем животные, обработанные Б-РВ8, на протяжении всего исследования. Такой прирост массы существенен в недели 1 и 3-8. Животные, обработанные 1 мг/кг ΤΝν148, также достигают существенного прироста массы в недели 5, 6 и 8 исследования (см. фиг. 16).

Фиг. 17 представляет развитие тяжести заболевания на основании артритного индекса. Артритный индекс в группе, обработанной 10 мг/кг сА2, существенно ниже, чем в контрольной группе с Б-РВ8, начиная с недели 4 и на протяжении остальной части исследования (неделя 8). Как группы, обработанные ΤΝν148, так и группа, обработанная 1 мг/кг сА2, показывают значительное снижение А1 в неделю 4. Хотя предварительные исследования (Р-099-017) показали, что ΤΝν148 несколько более эффективен при снижении артритного индекса после однократного интраперитонеального болюса в 1 мг/кг, данное исследование показывает, что А1 в группах, обработанных обоими вариантами антител ΤΝν, несколько выше. Хотя (за исключением недели 6) группа, обработанная 1 мг/кг сА2, не показывает существенного повышения по сравнению с группой, обработанной 10 мг/кг сА2, и в группах, обработанных ΤΝν148, в недели 7 и 8 показатели более высокие, нет существенных различий в А1 между обработками 1 мг/кг сА2, 1 мг/кг ΤΝν148 и 1 мг/кг ΤNV148Β в любой момент исследования.

Очевидно, что изобретение можно применить на практике иначе, чем описывается конкретно в приведенных выше описании и примерах.

Многочисленные модификации и варианты осуществления настоящего изобретения возможны в свете приведенных выше указаний и, следовательно, все они входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

Claims

1. По меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против ΤΝΕ, содержащее по меньшей мере одну вариабельную область, содержащую 8ЕО ΙΌ ΝΌ: 7 или 8.

2. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против ΤΝΕ, содержащее по меньшей мере одну вариабельную область, содержащую 8ЕО ΙΌ ΝΌ: 7 или 8.

3. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту по п.2.

4. Композиция, содержащая по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против ΤΝΕ, имеющее по меньшей мере одну вариабельную область, содержащую 8ЕО ΙΌ ΝΌ: 7 или 8, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

5. Способ лечения связанного с ΤΝΕ состояния у человека, предусматривающий введение ингибирующего ΤΝΕ количества фармацевтически приемлемой композиции, содержащей антитело по п.1 в количестве, эффективном для лечения указанного связанного с ΤΝΕ состояния, где указанное связанное с ΤΝΕ состояние выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, болезни Крона, псориатического артрита, псориаза, анкилозирующего спондилита, кахексии, воспаления сустава, карциномы, гепатита С, язвенного колита, воспалительного заболевания кишечника, астмы, хронической обструктивной болезни легких, эндометриоза и язв.

6. По меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против ΤΝΕ, содержащее или (1) все аминокислотные последовательности гипервариабельных участков (СБК) тяжелых цепей из 8ЕО ΙΌ ΝΌ: 1, 2 и 3; или (ίί) все аминокислотные последовательности СБК легких цепей из 8ЕО ΙΌ ΝΌ: 4, 5 и 6.

7. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против ΤΝΕ, содержащее, или (1) все аминокислотные последовательности СБК тяжелых цепей из 8ЕО ΙΌ ΝΌ: 1, 2 и 3; или (ίί) все аминокислотные последовательности СБК легких цепей из 8ЕО ΙΌ ΝΌ: 4, 5 и 6.

8. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту по п.7.

9. Композиция, содержащая по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против ΤΝΕ, имеющее или (ί) все аминокислотные последовательности СБК тяжелых цепей из 8ЕО ΙΌ ΝΌ: 1, 2 и 3; или (ίί) все аминокислотные последовательности СБК легких цепей из 8ЕО ΙΌ ΝΌ: 4, 5 и 6, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

10. Способ лечения связанного с ΤΝΕ состояния у человека, предусматривающий введение ингибирующего ΤΝΕ количества фармацевтически приемлемой композиции, содержащей антитело по п.6 в количестве, эффективном для лечения указанного связанного с ΤΝΕ состояния, где указанное связанное с

- 53 007005

ΤΝΕ состояние выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, болезни Крона, псориатического артрита, псориаза, анкилозирующего спондилита, кахексии, воспаления сустава, карциномы, гепатита С, язвенного колита, воспалительного заболевания кишечника, астмы, хронической обструктивной болезни легких, эндометриоза и язв.

11. По меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против ΤΝΕ, содержащее по меньшей мере один СОЕ тяжелой или легкой цепи с аминокислотной последовательностью по меньшей мере одной из 8Е0 ΙΌ НО: 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

12. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против ΤΝΕ, содержащее по меньшей мере один СОЕ тяжелой или легкой цепи с аминокислотной последовательностью по меньшей мере одной из 8Е0 ΙΌ ΝΌ: 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

13. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту по п.12.

14. Композиция, содержащая по меньшей мере одно выделенное антитело млекопитающего против ΤΝΕ, имеющее по меньшей мере один СОЕ тяжелой или легкой цепи с аминокислотной последовательностью по меньшей мере одной из 8Е0 ΙΌ ΝΌ: 1, 2, 3, 4, 5 или 6, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.

15. Способ лечения связанного с ΤΝΕ состояния у человека, предусматривающий введение ингибирующего ΤΝΕ количества фармацевтически приемлемой композиции, содержащей антитело по п.11 в количестве, эффективном для лечения указанного связанного с ΤΝΕ состояния, где указанное связанное с ΤΝΕ состояние выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита, болезни Крона, псориатического артрита, псориаза, анкилозирующего спондилита, кахексии, воспаления сустава, карциномы, гепатита С, язвенного колита, воспалительного заболевания кишечника, астмы, хронической обструктивной болезни легких, эндометриоза и язв.

- 54 007005

Список последовательностей <110> ОНев-Котаг, ЛИ;