EA006162B1 - Препарат для бесклеточного синтеза белка, способ синтеза белка с использованием данного препарата и устройство для его осуществления - Google Patents
Препарат для бесклеточного синтеза белка, способ синтеза белка с использованием данного препарата и устройство для его осуществления Download PDFInfo
- Publication number
- EA006162B1 EA006162B1 EA200101189A EA200101189A EA006162B1 EA 006162 B1 EA006162 B1 EA 006162B1 EA 200101189 A EA200101189 A EA 200101189A EA 200101189 A EA200101189 A EA 200101189A EA 006162 B1 EA006162 B1 EA 006162B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cell
- protein synthesis
- free protein
- synthesis
- preparation
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 53
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims abstract description 151
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 claims abstract description 139
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 77
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 52
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 48
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 58
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 claims description 40
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 32
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 32
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 16
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 14
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 14
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 12
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 10
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims description 9
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 6
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 4
- 240000008620 Fagopyrum esculentum Species 0.000 claims description 2
- 235000009419 Fagopyrum esculentum Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 claims description 2
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 claims 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 22
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000007599 discharging Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 abstract description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 30
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 23
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 23
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 22
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 22
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 21
- DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N N-phosphocreatine Chemical compound OC(=O)CN(C)C(=N)NP(O)(O)=O DRBBFCLWYRJSJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 14
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 12
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 12
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 9
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 9
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 9
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 9
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 9
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 9
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 7
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- FUSNMLFNXJSCDI-UHFFFAOYSA-N tolnaftate Chemical compound C=1C=C2C=CC=CC2=CC=1OC(=S)N(C)C1=CC=CC(C)=C1 FUSNMLFNXJSCDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 5
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000005188 flotation Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 101710141795 Ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 3
- 229940122208 Ribonuclease inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N Aniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030088 ATP-dependent RNA helicase A Human genes 0.000 description 1
- 101710164022 ATP-dependent RNA helicase A Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077078 Creatinase Proteins 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100010343 Drosophila melanogaster lobo gene Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000981515 Homo sapiens Phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102100024111 Phospholysine phosphohistidine inorganic pyrophosphate phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011177 media preparation Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940005657 pyrophosphoric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/18—Apparatus specially designed for the use of free, immobilized or carrier-bound enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
Изобретение относится к препарату для бесклеточного синтеза белка, способу синтеза белка в бесклеточной белоксинтезирующей системе и устройству для его осуществления. Препарат для бесклеточного синтеза белка содержит клеточный экстракт, полученный из зародышей растений, из которых полностью удален загрязняющий их эндотерм. Препарат стабилен и сохраняет свою биологическую активность при хранении при комнатной температуре. Способ синтеза белка в бесклеточной белоксинтезирующей системе предусматривает выделение синтезированного белка и характеризуется тем, что бесклеточный синтез белка протекает во время прохождения исходных веществ через носитель, обладающий свойствами молекулярного сита, в качестве подвижной фазы. Устройство для непрерывного бесклеточного синтеза белка обеспечивает возможность введения в систему субстрата, и/или источника энергии, и/или мРНК, и/или фермента системы регенерации энергии, а также возможность удаления метаболитов из системы непосредственно в процессе синтеза белка.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и, в частности, касается препарата для бесклеточного синтеза белка, содержащего клеточные экстракты, полученные из клеток и тканей, предназначенного для синтеза белка в бесклеточной системе, причем препарат получен путем стабилизации клеточных экстрактов, что позволяет его хранить и траснпортировать при комнатной температуре, а также касается способа и устройства для бесклеточного синтеза белка с помощью разработанного препарата.
Уровень техники
Реакции синтеза белка протекают в клетке таким образом, что генетическая информация, содержащаяся в ДНК, сначала транскрибируется в мРНК, а затем из мРНК она транслируется в рибосомах. В настоящее время проводятся интенсивные исследования методов синтеза белка ех νίνο, к примеру, ίη νίΐτο, в бесклеточной системе, при которых из живого организма выделяют рибосомы и используют их для проведения синтеза белка ίη νίίτο (японские патентные публикации для открытого доступа Не1 698790, Не1 6-225783, Не1 7-194, Не1 9-291 и Не1 7-147992). В этом методе в качестве исходного материала для получения рибосом используют ЕксйепсЫа со11, эмбрионы, ретикулоциты кролика и т.п.
Реакционные смеси для бесклеточного синтеза белка, содержащие клеточные экстракты для системы бесклеточного синтеза белка и химические вещества, необходимые для реакции трансляции или повышения её эффективности-синтетические субстраты, за исключением матрицы для трансляции, источники энергии, различные ионы и т.д. - нестабильны при обычных температурах; стабильное хранение их возможно лишь при сверхнизких температурах, например, -80°С и ниже.
Бесклеточная система синтеза белка является полезным методом, который способен поддерживать точное выполнение, сравнимое с живыми клетками по скорости реакции синтеза пептидов и реакции трансляции, при котором требуемые белки можно получать без проведения сложных стадий очистки. Именно поэтому было опубликовано несколько изобретений по улучшению эффективности синтеза, предназначенных для лучшего применения этой системы в промышленности. Однако для лучшего применения в промышленности необходимо обеспечить не только эффективность синтеза, но и стабильность и высокое качество различных веществ, применяемых в системе синтеза.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение имеет целью обеспечить способ поддержания стабильности и сохранения биологической функции препарата при комнатной температуре, содержащего клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, необходимые для системы бесклеточного синтеза, и химические вещества, необходимые для реакции трансляции или повышения её эффективности - субстраты для синтеза, за исключением матрицы, источники энергии, различные ионы и т.п.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение условий для стабильного хранения и поставок набора, включающего препарат, содержащий клеточные экстракты для системы бесклеточного синтеза белка, упрощая тем самым рабочие операции при бесклеточном синтезе белка.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение условий для бесклеточного синтеза белка с помощью препарата, содержащего клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, и улучшения его производительности, результативности и простоты.
Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования для решения поставленных задач, в результате чего было осуществлено настоящее изобретение, прежде всего, путем устранения системы, участвующей в ингибировании реакций синтеза белка рег ке в клетках, используемых в качестве исходного материала для бесклеточного синтеза белка. Другое условие настоящего изобретения заключается в применении такой обработки, как лиофилизация клеточных экстрактов, предназначенных для бесклеточного синтеза белка, или клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка вместе с веществами, участвующими в системе реакций бесклеточного синтеза белка, с целью получения сухого препарата, посредством которого осуществляется настоящее изобретение.
Следующим условием настоящего изобретения является метод бесклеточного синтеза белка, который заключается в применении системы бесклеточного синтеза белка, указанной выше, с применением принципа молекулярного сита.
Еще одним условием бесклеточного синтеза белка является проведение его в непрерывном режиме с помощью диализной мембраны, что влечет за собой применение дополнительных элементов и специального устройства.
Перечень фигур
На фиг. 1 показано сравнение активности синтеза белка с помощью лиофилизованного экстракта из зародышей пшеницы, хранившегося при -80°С в течение 2 месяцев, и нелиофилизованного экстракта из зародышей пшеницы, хранившегося в течение 2 месяцев в жидком азоте. Символы (□-□) означают экстракт, хранившийся 2 месяца в жидком азоте общепринятым способом, а символы (-) означают экстракт, хранившийся такой же срок после лиофилизации. По оси ординат - включение радиоактивности в белок как число распадов за 1 мин (брщ) в 5 мкл реакционной смеси, по оси абсцисс - время реакции при 26°С.
На фиг. 2 показано влияние температуры хранения лиофилизованного экстракта на активность син- 1 006162 теза белка. Символы (□-□) означают экстракт, хранившийся при комнатной температуре в течение 1 месяца, символы (-) означают экстракт, хранившийся такой же срок при 4°С, а символы (·-·) - экстракт, хранившийся такой же срок при -80°С, соответственно.
На фиг. 3 показана активность синтеза белка с помощью лиофилизованного бесклеточного экстракта из зародышей пшеницы в периодическом режиме. Символы (-) означают экстракт, хранившийся 2 месяца в жидком азоте общепринятым методом, а символы (□-□) означают экстракт, хранившийся такой же срок после лиофилизации.
Фиг. 4А показывает собой фотографию результатов синтеза белка в бесклеточной системе на открытой колонке. На дорожке 1 показаны результаты в отсутствие матрицы и на дорожке 3 показаны результаты синтеза за 12 ч колоночным способом. В качестве сравнительного примера на дорожке 2 показаны результаты синтеза за тот же срок методом непрерывного бесклеточного синтеза белка с применением обычного диализа. Слева представлены маркеры молекулярного веса в 94 кД, 67 кД, 43 кД, 30 кД и 20,1 кД, соответственно, сверху вниз. Стрелками отмечено положение синтезированной дигидрофолатредуктазы.
Фиг. 4В показывает фотографию результатов синтеза белка в бесклеточной системе на коммерчески доступной установке для жидкостной хроматографии. На дорожке 1 показаны, в качестве сравнительного примера, результаты синтеза за 12 ч методом непрерывного бесклеточного синтеза белка с применением обычного диализа. На дорожке 2 показаны результаты синтеза за тот же срок методом непрерывного бесклеточного синтеза белка с применением жидкостной хроматографии. Стрелками отмечено положение синтезированной дигидрофолатредуктазы.
Фиг. 5 - перспективное изображение кассетной установки.
Фиг. 6 - центральный поперечный разрез кассетной установки.
На фиг. 5 и 6 имеются следующие обозначения:
I - камера;
2- крышка;
- наружная диализная жидкость;
- уровень наружной диализной жидкости;
- входное отверстие для подачи субстрата и/или источника энергии и т.п.;
- выходное отверстие для отвода субстрата и/или источника энергии и т.п. из камеры;
- канал;
- входное отверстие в камере для отвода наружной диализной жидкости;
- наружное выходное отверстие для отвода наружной диализной жидкости;
9а - наружное выходное отверстие для отвода наружной диализной жидкости;
- канал;
II - входное отверстие для подачи мРНК и/или ферментов системы регенерации энергии;
- цилиндр для диализной мембраны;
- насадка впускного отверстия 11;
- сборка для прикрепления мембраны;
- нижний конец мембраны;
- магнитная мешалка;
- насадка входного отверстия 5;
- насадка выходного отверстия 6 в камере;
- насадка входного отверстия 8 в камере;
- насадка выходного выпускного отверстия 9;
20а - насадка наружного выходного отверстия 9а.
Фиг. 7 показывает поддержание уровня синтеза белка при дополнительном внесении мРНК и креатинкиназы. Символы о-о означают добавление САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, вместе с креатинкиназой, Δ-Δ означают дополнительное внесение только мРНК, ν-Ϋ означают добавление только креатинкиназы, □-□ указывает на отсутствие добавок. Стрелками отмечено время внесения добавок.
Фиг. 8 показывает поддержание уровня синтеза белка при смене наружной диализной жидкости. Символы о-о означают, что производилась смена наружной диализной жидкости, Δ—Δ означают, что смена не производилась, а стрелки показывают время замены.
Фиг. 9 показывает поддержание уровня синтеза белка при применении автоматической установки. Символы о-о означают добавление САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, вместе с креатинкиназой, Δ—Δ означают отсутствие дополнительного добавления мРНК. Белыми стрелками отмечено положение дигидрофолатредуктазы - продукта синтеза, а звездочкой - окрашенные полоски добавленной креатинкиназы.
Раскрытие сущности изобретения
1) Удаление системы, участвующей в ингибировании реакций синтеза эндогенного белка в клетке, для бесклеточного синтеза белка.
- 2 006162
Удаление системы, участвующей в ингибировании реакций синтеза эндогенного белка в клетках, служащих исходным материалом для бесклеточного синтеза белка, является одним из условий настоящего изобретения и означает удаление системы, контролирущей синтез эндогенного белка, содержащегося в этих клетках. В частности, удаление этой системы, обнаруженной авторами настоящего изобретения, означает удаление веществ, воздействующих на рибосомы, факторов трансляции белка, мРНК и тРНК и вызывающих ингибирование их функций.
Вещества, содержащиеся в клетках, служащих исходным материалом, и подавляющие функцию белкового синтеза, включают тритин (Макыай ЛЭ. апб Наг1е1у М.К. (1995) Р1ап1а, 197, 633-640), белок тионин, содержащий много цистеина (Вгиттег 1., Т1ю1е Н., апб К1оррк1ес11 К. (1994) Еиг. 1. Вюсйет, 219, 425-433), рибонуклеазу (МаЫикййа 8., Мет. Кек. 1пкС Еооб 8сБ Куо1о υηίν., Νο. 19, 1) и им подобные, которые, как известно, в большом количестве присутствуют, например, в эндосперме семян.
Путем полного удаления из зародышей той группы белков, что подавляет (ингибирует) бесклеточный синтез белка и присутствует в примесях эндосперма на стадии выделения зародышей - тритина, тионина, рибонуклеазы и др., можно предотвратить инактивацию реакций синтеза белка.
Таким образом, одно из условий настоящего изобретения достигается с помощью технологии удаления тех механизмов, что подавляют реакции синтеза эндогенных белков и вступают в действие при повреждении тканей организма или клеток, иными словами, механизмов подавления реакций синтеза эндогенного белка, действующих в качестве физиологического механизма защиты от патогенов, и технологии нейтрализации или удаления той активности, которая подавляет реакции белкового синтеза и индуцируется при повреждении и приготовлении экстрактов для бесклеточного синтеза белка из клеток или тканей.
В качестве исходного клеточного материала настоящего изобретения в основном могут служить зародыши, ЕксйепсЫа со11, ретикулоциты, раковые клетки и т.д., которые обычно применяются в системах бесклеточного синтеза белка, а также клетки из других организмов. В предпочтительном воплощении исходным клеточным материалом служат зародыши пшеницы, ячменя, риса, кукурузы, шпината, гречихи и т. п.
Получение клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка по настоящему изобретению из этих исходных клеточных материалов можно проводить в сочетании с различными известными методами (1ойпк1оп Е.В. е1 а1. (1957) №Ыте, 179, 160-161). Для удаления системы, контролирующей синтез эндогенных белков, что является одним из условий настоящего изобретения, подходит обработка исходного клеточного материала поверхностно-активными веществами, в частности, неионными детергентами. Можно использовать широкий спектр неионных детергентов, лишь бы они были неионными. Предпочтительными являются Вту, Ттйоп, №Ыбе1 Р-40, Тетееп и им подобные, которые являются производными полиоксиэтилена. Из них наиболее предпочтителен №Ыбе1 Р-40. Эти неионные детергенты применяются, к примеру, в концентрации 0,5%.
Когда в качестве исходного клеточного материала служат, к примеру, зародыши пшеницы, их обработка заключается в получении экстрактов путем размалывания, флотации и просеивания с помощью известных методов. Экстракты зародышей промывают несколько раз детергентом для удаления эндосперма, загрязняющего экстракты. Промывку повторяют до тех пор, пока не исчезнет мутность. Эту обработку предпочтительно проводят в сочетании с обработкой ультразвуком, что обеспечивает более эффективное удаление эндосперма.
Полученные таким образом экстракты зародышей практически полностью лишены эндосперма, содержащего эндогенные специфические ингибиторы типа тритина и др., а зародыши основательно очищены. При оценке загрязнения белками эндосперма до и после ультразвуковой обработки методом иммуноблота с применением антитритиновых антител и тритина в качестве контроля было подтверждено, что обработка ультразвуком приводит к снижению уровня тритина ниже предела определения. Это значит, что экстракты зародышей практически свободны от загрязнения белками эндосперма, а другие факторы, инактивирующие синтез белка и локализованные в эндосперме, такие как тионин и рибонуклеаза, тоже удалены из этих экстрактов. Полученные экстракты зародышей очищены до такой степени, что рибосомы еще практически не деаденилированы: показатель деаденилирования рибосом составляет менее 7%, предпочтительно 1% или еще меньше.
2) Способ стабилизации препарата.
Следующее условие настоящего изобретения заключается стабилизации препарата клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка. Прежний способ хранения клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка - хранение при температуре от -80 до -196°С, тогда как новым способом препараты, содержащие клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, стабильно хранятся при комнатной температуре. Разработка такой технологии, при которой препараты настоящего изобретения можно хранить при комнатной температуре, может иметь применение в промышленности.
Способ стабилизации клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка заключается в получении сухого препарата, в частности, путем лиофилизации (высушивания с замораживанием). Лиофилизация может проводиться любым известным методом. Например, клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка можно быстро заморозить в жидком азоте. Высушивание проводится в течение 3 ч с
- 3 006162 помощью обычной лиофильной сушки. После полного удаления воды получают порошкообразный препарат, который герметически закупоривают под вакуумом или в атмосфере азота; из него также получают другие формы препарата.
Полученный препарат может содержать только клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, обработанные способом настоящего изобретения, но при желании в него можно добавить отдельные вещества, необходимые для системы бесклеточного синтеза белка, например, синтетические субстраты, аминокислоты, источники энергии.
В этот препарат можно добавлять вещества, повышающие эффективность реакций системы бесклеточного синтеза белка, например, соединения различных ионов, предпочтительно ионов калия, магния и др.
Кроме того, при желании в препарат можно добавлять вещества, повышающие растворимость - детергенты, вещества, защищающие рибосомы от деаденилирования.
Предпочтительно препарат представляет собой композицию такого состава, работа с которой заключается в простом добавлении воды. Альтернативно композиция может применяться в виде набора из препарата и других необходимых компонентов. Естественно, при формировании набора в него можно по отдельности включать клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, необходимые компоненты системы бесклеточного синтеза белка, вещества, повышающие эффективность реакций системы бесклеточного синтеза белка, и другие водные растворы, необходимые для проведения реакции.
3) Способ бесклеточного синтеза белка: применение носителей со свойствами молекулярного сита.
В другом воплощении настоящего изобретения реакционную камеру для бесклеточного синтеза белка можно заполнить носителем, обладающим свойствами молекулярного сита. Выбор носителя не ограничен, он только должен подходить для фракционирования в диапазоне молекулярных весов от 10000 и ниже. К таким носителям относятся, например, пористые частицы для гельфильтрации, особенно Сефадекс С10 или С25. Носитель может быть пропитан водой. Более предпочтительно носитель уравновешивают с буферным раствором перед употреблением. Подготовка носителя может проводиться после заполнения камеры или же при формировании набора отдельно от камеры так, чтобы носитель готовился по мере необходимости.
Предпочтительно камера должна подходить для хроматографии, более предпочтительно - для колоночной хроматографии. Диаметр и длину колонки и объем носителя следует подбирать, исходя из времени реакции и скорости хроматографии. Объем камеры выбирают в зависимости от количества синтезируемого белка. Камера должна иметь по меньшей мере два отверстия, которые можно открывать при необходимости с тем, чтобы можно было заполнить её носителем заранее, а исходные материалы для системы бесклеточного синтеза белка вносить туда по желанию.
Заполнять камеру носителем можно перед работой или заранее. Желательно, чтобы исходные материалы для системы бесклеточного синтеза белка, в частности, субстраты для синтеза - аминокислоты, источники энергии - АТФ, ГТФ, креатинфосфат, а также ионные компоненты, повышающие эффективность реакций бесклеточного синтеза белка, которые добавляют по мере необходимости, были распределены равномерно во внесенном наполнителе, предпочтительно в виде оптимальной дисперсии, и особенно в виде локально-однородной дисперсии. Состояние дисперсии достигается путем расчета эффективности реакции с учетом связи между концентрацией этих веществ в подвижной фазе носителя и скоростью подачи клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка и/или транслируемой матрицы, если их вводят раздельно.
При этом, если необходимо, носитель может состоять исключительно из носителя типа молекулярного сита, а препарат, приготовленный заранее из соответствующих клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка, субстратов для синтеза, источников энергии и, при необходимости, ионных компонентов, повышающих эффективность реакций бесклеточного синтеза белка, вводят в носитель по мере необходимости, так же вводится и подается транслируемая матрица, и таким образом происходит бесклеточный синтез белка.
Скорость прохождения подвижной фазы через носитель типа молекулярного сита зависит от размера колонки и эффективности синтеза, но обычно она колеблется от 1/10 до 1/30 внутреннего объема колонки в час. Раствор для элюции содержит субстраты для синтеза - аминокислоты, источники энергии АТФ, ГТФ и креатинфосфат, а также необязательные ионные компоненты, повышающие эффективность реакций бесклеточного синтеза белка, но не ограничивается ими. Элюцию предпочтительно контролируют автоматически, но не ограничиваются этим.
Реакции синтеза предпочтительно проводят в камере, заполненной носителем. Однако, в зависимости от состояния носителя, синтез можно проводить в супернатанте от носителя, или же начать его в отдельной порции, а затем продолжить при прохождении раствора через носитель.
Реакции синтеза по настоящему изобретению отличаются тем, что клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, к примеру, рибосомы, движутся в составе подвижной фазы, а побочные продукты, образующиеся в реакции синтеза, отделяются и удаляются при фракционировании в процессе элюции, и в то же время реакции синтеза протекают с максимальной скоростью при подаче химических веществ, необходимых для трансляции или для повышения эффективности реакции - субстратов для
- 4 006162 синтеза, источников энергии и различных ионов в оптимальных концентрациях.
Способ настоящего изобретения может осуществляться путем автоматически контролируемого заполнения и пропускания (элюции) исходных материалов системы бесклеточного синтеза белка и выделения синтезированного белка. При желании можно автоматически контролировать каждое звено процесса. Более предпочтительно поддерживать автоматический контроль скорости прохождения раствора в подвижной фазе.
С помощью способа и устройства настоящего изобретения в комбинации с другими известными методами очистки белков - разными вариантами ионообменной или аффинной хроматографии, в зависимости от получаемого белка можно непрерывно получать большие количества белка с высокой степенью чистоты.
Таким образом, применение устройства настоящего изобретения, описанного выше, обеспечивает действенный способ получения требуемого белка.
Далее, применение способа настоящего изобретения, описанного выше, позволяет получить устройство для бесклеточного синтеза требуемого белка.
Кроме того, применение способа и устройства настоящего изобретения, описанного выше, позволяет получить набор, предназначенный для бесклеточного синтеза требуемого белка.
4) Способ непрерывного бесклеточного синтеза белка (дополнительное внесение компонентов).
В следующем воплощении цель настоящего изобретения достигается путем дополнительного внесения компонентов, используемых в системе бесклеточного синтеза белка.
В настоящем изобретении мРНК, служащая матрицей для синтеза белка, поступает по мере необходимости или непрерывно после запуска реакции, примерно к тому моменту времени, когда появляется тенденция к снижению матричной активности той мРНК, что была внесена исходно. Добавление может производиться непрерывно по мере необходимости в очень маленьком количестве или же периодически. Количество добавленной мРНК колеблется от одной десятой части до полного эквивалента исходно внесенной мРНК. Настоящее изобретение отличается тем, что эффект от добавочной порции был впервые подтвержден, а количество добавленной мРНК и время добавления специалисты в этой области могут легко изменить или установить по их действию на синтез. Все это верно и в отношении других компонентов и в том же самом смысле, даже если ниже не будет дано конкретного описания.
В настоящем изобретении фермент системы регенерации энергии поступает по мере необходимости или непрерывно после запуска реакции, примерно к тому моменту времени, когда появляется тенденция к снижению активности той порции фермента системы регенерации энергии, что была внесена исходно. Добавление может производиться непрерывно по мере необходимости в очень маленьком количестве или же периодически. Количество добавленного фермента системы регенерации энергии колеблется от одной десятой части до полного эквивалента исходно внесенного фермента. Обычно ферментом системы регенерации энергии является креатинкиназа. Конечно, в качестве фермента системы регенерации энергии могут служить и другие вещества, обладающие такой же функцией, как фермент настоящего изобретения. Количество добавленного фермента и способ добавления можно при необходимости изменить, исходя из уровня синтеза.
Дополнительное внесение мРНК и фермента системы регенерации энергии можно производить отдельно друг от друга, но предпочтительно вместе. Способ добавления - либо непрерывный, либо периодический. Количество добавленных мРНК и фермента системы регенерации энергии и способ добавления можно при необходимости изменить, исходя из уровня синтеза.
В настоящем изобретении, помимо дополнительного внесения мРНК и/или фермента системы регенерации энергии, можно добавить операцию для предупреждения истощения субстрата и/или источника энергии и/или операцию для удаления побочных продуктов. Предпочтительно, чтобы производилось дополнительное внесение различных аминокислот, АТФ, ГТФ и т.п. в качестве субстрата или источника энергии, либо непрерывно, либо периодически. Количество добавленных компонентов следует предпочтительно поддерживать на уровне концентраций соответствующих веществ в момент запуска синтеза или близко к этим концентрациям. Однако количество добавленных компонентов можно при необходимости корректировать и изменять, исходя из уровня синтеза.
Удаление побочных продуктов означает удаление таких метаболитов, как АМФ и ГМФ и таких продуктов реакции, как фосфорная кислота и пирофосфорная кислота, причем такие соединения предпочтительно удаляют из системы либо непрерывно, либо периодически.
Для предупреждения истощения субстрата и/или источника энергии и/или для удаления побочных продуктов предпочтительно применяется непрерывное или периодическое обновление реакционной среды в системе. В настоящем изобретении, к примеру, описывается метод с применением диализной мембраны. В этом случае, скажем, наружная диализная жидкость непрерывно или периодически обновляется или заменяется.
Внесение, хранение, замену или удаление каждого компонента следует предпочтительно проводить автоматически. Для этого устройство должно находиться под управлением компьютерной системы, которая будет проводить добавление, хранение, замену или удаление каждого компонента системным образом. Реактивы для этих операций по каждому компоненту предпочтительно следует готовить в виде
- 5 006162 набора.
5) Устройство для автоматического непрерывного бесклеточного синтеза белка.
Устройство для автоматического бесклеточного синтеза белка находится под управлением компьютерной системы, функция которой в общем заключается в создании оптимальной среды для синтеза белка, а также в осуществлении добавления, хранения, замены или удаления каждого компонента системным образом.
Например, можно поддерживать требуемую температуру в нескольких диализных камерах независимо друг от друга, поместив в каждую из них электронный охладитель и нагреватель, которые способны поддерживать температуру от 15 до 37°С, что позволит поддерживать оптимальную температуру для синтеза данного белка.
При непрерывном или периодическом обновлении или замене наружной диализной жидкости в диализной камере скорость обновления или замены диализной жидкости можно варьировать от 0,1 до 1 мл/ч с помощью дозатора, например, перистальтического насоса или шприцевого насоса, непрерывно или периодически, что позволяет выбрать оптимальные условия для синтеза данного белка.
Далее, необходимые для синтеза белка вещества - матрицу из мРНК, креатиназу, фермент системы регенерации энергии - в требуемом количестве можно вводить дополнительно в системы для синтеза белка, находящиеся в нескольких диализных камерах, в любое время, к примеру, с интервалом от 6 до 15 ч.
В описанном выше устройстве соответствующие компоненты - матрица из мРНК, субстрат для фермента системы регенерации энергии, источник энергии, наружная диализная жидкость и т.п. - хранятся раздельно или в виде смеси в сосудах, подсоединенных к соответствующим диализным камерам, и поступают через соответствующие трубки, идущие от сосудов для хранения к системе синтеза белка или к диализным камерам. Сосуды для хранения предпочтительно находятся при 4°С.
6) Конструкция устройства для непрерывного бесклеточного синтеза белка.
В качестве примера устройства для непрерывного бесклеточного синтеза белка, воплощающей настоящее изобретение, рассмотрим кассетное устройство. Однако устройство по настоящему изобретению не обязательно должно быть кассетного типа.
Кассетное устройство - это устройство для непрерывного бесклеточного синтеза белка, конструкция которого включает камеру, в общем представляющую собой полый корпус, имеющий дно и крышку, которая плотно закрывается. В этом устройстве имеется канал с входным отверстием для внесения субстрата и/или источника энергии и выходным отверстием, сообщающимся в камере с отсеком для наружной диализной жидкости; канал с входным отверстием, находящимся в камере в отсеке для жидкости, которое служит для отвода метаболитов из диализной жидкости, и выходным отверстием, ведущим наружу; входное отверстие для внесения мРНК и/или фермента системы регенерации энергии; а также цилиндр для диализной мембраны, находящийся в камере в отсеке для наружной диализной жидкости.
Далее кассетное устройство настоящего изобретения будет описано подробно с привлечением чертежей. Однако представленное на чертежах устройство является лишь одним из воплощений и настоящее изобретение им не ограничивается.
Кассетная установка включает камеру 1, в общем состоящую из полого корпуса со дном и крышки 2, которая плотно закрывается, причем камера 1 заполнена наружной диализной жидкостью 3 до уровня 4. В частности, фундаментальной особенностью устройства является канал 7 со входным отверстием 5 для внесения источника энергии и т. п. и выходным отверстием 6, которое сообщается с находящимся в камере 1 отсеком для наружной диализной жидкости 3. В этом воплощении на фиг. 5 и 6 показано кассетное устройство с камерой, имеющей цилиндрический корпус. Однако форма камеры не ограничивается цилиндрической.
Выходное отверстие 6 сообщается с наружной диализной жидкостью таким образом, что его конец находится в верхней части камеры 1 чуть ниже уровня жидкости 4. Входное отверстие 8 сообщается с наружной диализной жидкостью 3, а его конец находится в нижней части камеры 1. Положения концов выходного отверстия 6 и входного отверстия 8 можно поменять местами.
Выходное отверстие 9а с насадкой 20а доходит до уровня жидкости 4 и находится чуть выше уровня жидкости 4. Выходное отверстие 9а с насадкой 20а обеспечивает вытекание жидкости самотеком. В том случае, когда удаление метаболитов из наружной диализной жидкости 3 проводится через выпускное отверстие 9 с насадкой 20, отверстие 9а с насадкой 20а можно заглушить или же камеру производить без выходного отверстия 9а с насадкой 20а при изготовлении. В случае, когда удаление метаболитов из наружной диализной жидкости 3 проводится самотеком через выходное отверстие 9а с насадкой 20а, отверстие 9 с насадкой 20 можно заглушить или же камеру производить без выходного отверстия 9 с насадкой 20 при изготовлении. В последнем случае, хотя это и не показано, насадку 19 и насадку 20а можно сделать таким образом, чтобы насадка 20а выходного отверстия 9а и насадка 19 входного отверстия 8 соединялись друг с другом. При этом конец насадки 19 входного отверстия 8 со стороны выходного отверстия 9 не подсоединяется к крышке, а соединяется с насадкой 20а выходного отверстия 9а.
Цилиндр 12, выполняющий функции диализной мембраны, может быть выполнен вместе с насадкой 13 входного отверстия 11 или прикреплен к ним с помощью сборки 14 (держателя мембраны), как
- 6 006162 показано на чертеже. Цилиндр 12 вставлен в камеру в таком положении, что он погружен в наружную диализную жидкость 3. Тот конец цилиндра 12, который противоположен входному отверстию 11, может находиться в камере в таком положении, что он будет погружен в наружную диализную жидкость 3 и может быть закрытым. В данном примере он закрыт особой крышкой, образующей концевую часть 15 мембраны, либо может представлять собой мешочек, открытый только с одной стороны.
Кассетное устройство предпочтительно должно включать приспособление для перемешивания наружной диализной жидкости 3. В данном примере им служит вращательный механизм - магнитная мешалка 16, помещенная в камеру 1.
Для эффективного синтеза в камере 1 предпочтительно поддерживается гомеостаз каким-либо способом. Например, можно модифицировать конструкцию камеры 1 так, чтобы она помещалась в специальный резервуар для инкубации. Кассетное устройство обычно поставляется потребителям в таком виде, что оно не заполнено диализной жидкостью и компонентами системы синтеза, и потребители сами заливают жидкость через входные отверстия 11 и 5 в нужное время.
Входные отверстия 11 и 5 и выходное отверстие 9 могут быть снабжены средствами автоматического контроля проходящих через них потоков. Самый легкий, и предпочтительный способ автоматизации - это автоматический контроль входных/выходных потоков из отверстия 5 в отверстие 6 и из отверстия 8 в отверстие 9, что обеспечивает постоянный уровень жидкости 4. В этом случае дополнительное внесение веществ через отверстие 11 может проводиться вручную. В том случае, когда выпускное отверстие 9а с насадкой 20а располагается непосредственно на уровне жидкости 4 (чуть выше него), возможен слив жидкости самотеком.
Кассетное устройство настоящего изобретения может быть полностью собрано заранее или смонтировано по желанию. В том случае, когда сборка проводится по желанию, камера 1, крышка 2 камеры 1, насадка 13 отверстия 11, насадка 17 отверстия 5, насадка 18 отверстия 6, насадка 19 отверстия 8, насадка 20 отверстия 9, цилиндр 12 (может быть встроен заранее вместе с насадкой 13) поставляются отдельно и подсоединяются, к примеру, с помощью ленты.
Для изготовления кассетного устройства можно использовать широкий спектр пластических материалов.
Препарат настоящего изобретения позволяет: (1) применять его с высоким качеством длительное время без необходимости транспортировки при низких температурах типа ультранизкотемпературного сосуда для хранения клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка или сухого льда, (2) лиофилизация клеточного препарата, содержащего экстракты для бесклеточного синтеза белка по настоящему изобретению, полученного путем смешивания клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка с аминокислотами, субстратами для синтеза типа АТФ и другими веществами, необходимыми для реакции трансляции или повышения её эффективности, например, с различными ионами, позволяет хранить и транспортировать препарат в удобной форме с сохранением высокого уровня синтеза белка.
Препарат, содержащий клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка по настоящему изобретению, не требует приготовления реакционной смеси при синтезе белка ех νίνο. Согласно настоящему изобретению, практически одно лишь добавление воды и матрицы для трансляции (мРНК) обеспечивает возможность идентифицировать генные продукты и синтезировать их в больших количествах, а также с легкостью анализировать механизм трансляции.
Настоящее изобретение обеспечивает возможность стабильного хранения и транспортировки веществ, нестабильных при комнатной температуре, например, компоненты системы реакций бесклеточного синтеза белка, включающей клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, другие субстраты для синтеза за исключением матриц для трансляции, источники энергии и вещества, необходимые для реакции трансляции или повышения её эффективности, например, различные ионы, необходимые для системы бесклеточного синтеза белка. Наличие лиофилизованного препарата, содержащего клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка по настоящему изобретению, облегчает работу с системой бесклеточного синтеза белка по сравнению с обычными условиями, а отсутствие необходимости приготовления реакционной смеси сокращает процесс работы и делает эту систему пригодной для промышленного применения.
В другом способе настоящего изобретения используется принцип молекулярного сита, служащего носителем для реакции в камере для бесклеточного синтеза белка, что позволяет увеличить объем бесклеточного синтеза белка, что было бы трудно достичь обычным способом непрерывного бесклеточного синтеза белка с применением мембраны.
Кроме того, способ настоящего изобретения привел к открытию установки диализного типа для автоматического непрерывного синтеза белка, что упрощает процесс синтеза белка.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно на примерах, относящихся к препарату, содержащему клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка из зародышей пшеницы. Однако нижеследующие примеры следует рассматривать только как средство для получения конкретной информации о настоящем изобретении, никоим образом не ограничивая его объем этими примерами.
Пример 1. Получение экстрактов из зародышей пшеницы.
- 7 006162
Для выделения интактных зародышей (сохраняющих способность к прорастанию) из семян путем измельчения, флотации и просеивания применяли метод Ιοίιηδίοη е! а1. (1ойнк!он ЕВ. е! а1. (1957) Ыа1иге, 179, 160-161) с незначительными модификациями. А именно, семена (нестерилизованные) пшеницы . СЫйоки, выращенной на Хоккайдо, подавали в измельчитель (Κοΐοτ 8рееб М111 рнЬепкеИе Туре 14) со скоростью 100 г в минуту и слегка измельчали при 8000 об/мин. Раздавленные семена измельчали еще раз при 6000 об/мин и просеивали (размер решетки от 0,71 мм до 1,00 мм), получая неочищенную фракцию зародышей. После этого зародыши, сохраняющие способность к прорастанию, выделяли путем флотации в смеси четыреххлористого углерода и циклогексана (2,5:1) и удаляли органическую фазу высушиванием при комнатной температуре. Такие загрязнения, как семенные оболочки, удаляли из фракции зародышей путем адсорбции на наэлектризованном предмете - полиэтиленовой пластине.
Зародыши разделяли на 3 фракции: мелких (0,71-0,85 мм), средних (0,85-1,00 мм) и легких частиц (0,85-1,00 мм, но легкие по весу), соответственно, с помощью сита и статического электричества и окончательно сортировали визуально. Фракция мелких частиц проявляла самую высокую активность синтеза белка. Что касается легких частиц, то они, по-видимому, были слегка повреждены при измельчении и лопались при флотации. После этого для полного удаления компонентов эндосперма зародыши помещали в марлевый мешочек и промывали холодной бидистиллированной водой с охлаждением, суспендировали в 0,5% растворе неионного детергента ΝΡ-40 и промывали несколько раз, обрабатывая их ультразвуком до тех пор, пока не исчезала белая муть. После еще одной промывки с обработкой ультразвуком в бидистиллированной воде зародыши пшеницы фильтровали под давлением и промывали несколько раз холодной бидистиллированной водой, получая очищенные зародыши пшеницы.
Экстракты из зародышей пшеницы получали в соответствии с общепринятым методом (Епскком А.Н. е! а1. (1996) Мебюбк Еп2ушо1., 96, 38-50). Все последующие операции проводили при 4°С. Очищенные зародыши пшеницы замораживали в жидком азоте и измельчали в ступке. К полученному порошку добавляли экстракционный раствор в соотношении 1 мл/г порошка. Указанный раствор содержал 80 мМ Нерек-КОН, рН 7,8, 200 мМ ацетата калия, 2 мМ ацетата магния, 4 мМ хлорида кальция, 8 мМ дитиотреитола, 0,6 мМ каждой из 20 Ь-аминокислот, 1 мкМ РИТ, Е-64 и РМ8Р (ингибиторы протеолитических ферментов); раствор готовили по методу РаЦегкои е! а1. с незначительными модификациями: Раствор перемешивали, стараясь избежать образования пены. После центрифугирования 15 мин при 30000*д собирали супернатант в качестве экстракта зародышей и подвергали гель-фильтрации на колонке из Сефадекса 6-25 (соагке), предварительно уравновешенного раствором 40 мМ Нерек-КОН, рН 7,8, 100 мМ ацетата калия, 5 мМ ацетата магния и 4 мМ дитиотреитола. Концентрацию образца доводили до 170-250 единиц А260 нм (А260/А280 _ 1,5).
Степень деаденилирования в полученном препарате всегда составляла не более 1%, при этом во многих опытах степень деаденилирования составляла 0,01 до 0,3% (степень деаденилирования измеряли методом элиминации с анилином в кислой среде: Ен6о Υ. е! а1. (1987) 1. Вю1. Сйет., 262, 5908-5912; Уоκΐιίηηπ 8. е! а1. (1966) Еиг. 1. Вюсйет., 242, 585-591). Загрязнение тритином определяли с помощью иммуноблотинга с антителами к тритину, содержание которого было ниже предела обнаружения.
Пример 2. Диализный способ непрерывного бесклеточного синтеза белка с использованием экстрактов из зародышей пшеницы.
Способ непрерывного бесклеточного синтеза белка с использованием экстрактов из зародышей пшеницы ранее был описан в литературе (Ен6о Υ. е! а1. (1992) 1. Вю!есй., 25, 221-230). Приготовленную по методике примера 1 реакционную смесь вносили в диализатор Эйро 0|а1ухег (8рес!га/Рог® СЕ, предел исключения 25 кД, объем 0,5 мл) и проводили реакцию при 20°С в диализаторе против 10-кратного (относительно реакционной смеси) объема диализного раствора (20 мМ Нерек-КОН, рН 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата магния, 4 мМ дитиотреитола, 1,2 мМ АТФ, 0,25 мМ ГТФ, 16 мМ креатинфосфата, 0,38 мМ спермидина, 0,3 мМ каждой из 20 Ь-аминокислот, 0,005% №N3, 0,05% ΝΡ-40, 1 мМ Е64 и 1 мМ РМ8Р).
В описанных выше условиях проводили испытания непрерывного бесклеточного синтеза белка с использованием экстрактов из зародышей пшеницы и обнаружили, что могут синтезироваться различные белки с молекулярным весом от 5000 до 130000, причем эффективность синтеза составила от 0,3 до 1,8 мг/мл объема реакции (табл. 1).
Таблица 1. Синтез и свойства белков, синтезированных в бесклеточной системе из зародышей пшеницы (диализный способ) (ί) ЬНРР (20 кД) 1,8 мг/мл (активный белок);
(ίί) Митохондриальная Ме!-тРНК-синтетаза человека (84 кД) 1,3 мг/мл (неактивный белок, (ίίί) Люцифераза (60 кД) (ίν) Зеленый флуоресцентный белок (27 кД) (ν) РНК-геликаза А человека (130 кД) антиген для получения антитела)
0,7 мг/мл (активный белок)
0,4 мг/мл (активный белок)
0,3 мг/мл (неактивный белок, антиген для получения антитела)
- 8 006162 (νί) Белок-активатор протеасом α, β и γ (28, 28 и 31 кД, соответственно) по 0,5 мг/мл (неактивный белок, антиген для получения антитела)
В приведенных выше примерах определение синтеза белков проводили в соответствии с Еийо е! а1. Включение 14С-лейцина в белок, разделение синтезированных белков методом электрофореза в 8Ό8полиакриламидном геле и окрашивание Кумасси ВпШап! В1ие, а также определение профиля полирибосом при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы проводили в соответствии с Еийо е! а1. (Еийо Υ. е! а1. (1992) 1. ВЫесЬ., 25, 221-230; Еийо Υ. е! а1. (1975) ВюсЫш. ВюрЬув· Ас!а, 383, 305-315).
Пример 3. Получение препарата из экстракта зародышей пшеницы.
Экстракт зародышей пшеницы, полученный согласно примеру 1, замораживали в жидком азоте и высушивали в стандартной лиофильной сушке (ЬаЬсоис Е гее хе Игу 8ук!ет Егеехопе 4.5) в течение 3 ч. Полученный порошок хранили в пробирках, запаянных либо под вакуумом, либо в атмосфере азота.
Пример 4. Определение активности препаратов, содержащих экстракты из зародышей пшеницы.
Лиофилизированный препарат согласно изобретению, содержащий экстракт из зародышей пшеницы, хранили при -80°С в течение 2 месяцев. Параллельно нелиофилизированные замороженные экстракты из зародышей пшеницы хранили в жидком азоте (-196°С) также в течение 2 месяцев. Эти экстракты сравнивали между собой по активности синтеза белка.
К каждому экстракту из зародышей пшеницы добавляли раствор, содержащий 30 мМ Нерек-КОН, рН 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата магния, 2,85 мМ дитио-треитола, 0,5 мг/мл креатинкиназы, 1,2 мМ АТФ, 0,25 мМ ГТФ, 16 мМ креатинфосфата, 0,380 мМ спермидина, 0,3 мМ каждой из 20 Ьаминокислот, в соответствии с методом Епсккои е! а1., затем 1000 единиц/мл ингибитора рибонуклеаз Виакш и ΝΡ-40 (конечная концентрация 0,05%), после чего добавляли САР-содержащую мРНК дигидрофолат-редуктазы (80 мкг/мл смеси), полученную методом, описанным ранее авторами насто-ящего изобретения (Еийо Υ. е! а1. (1992) 1. Вю!есй., 25, 221-230), а также 50 μθί (на 1 мл объема реакции) [И-14С]лейцина (166 тС1/ммоль). Активность синтеза белка измеряли по включению [И-14 С]-лейцина. Реакцию проводили при температуре от 20 до 30°С.
Как показано на фиг. 1, даже после хранения при температуре -80°С в течение 2 месяцев лиофилизованный препарат (-), содержащий экстракты из зародышей пшеницы, сохранял активность синтеза белка, эквивалентную активности экстрактов при стандартном хранении в жидком азоте (□-□). Изучение влияния температуры хранения лиофилизированных экстрактов на активность синтеза белка показало, что при хранении в течение 1 месяца наибольшую активность сохранили экстракты, хранившиеся при -80°С (·-·), однако и экстракты, хранившиеся при 4°С (-) или при комнатной температуре (□-□) сохранили значительную активность (фиг. 2).
Полученные результаты означают, что способ настоящего изобретения обеспечивает возможность хранения и транспортировки клеточных экстрактов для бесклеточного синтеза белка с сохранением их высокой активности при температуре от -80°С до комнатной температуры, что превышает общепринятые температуры хранения.
Пример 5. Получение препарата для бесклеточного синтеза белка, содержащего экстракты из зародышей пшеницы.
Реакционная смесь содержала по объему от 20 до 60% экстракта из зародышей пшеницы, полученного согласно примеру 1, в который добавляли 30 мМ Нерек-КОН, рН 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата магния, 2,85 мМ дитиотреитола, 0,5 мг/мл креатинкиназы, 1,2 мМАТФ, 0,25 мМГТФ, 16 мМ креатинфосфата, 0,380 мМ спермидина, 0,3 мМ каждой из 20 Ь-аминокислот, в соответствии с методом Епсккои е! а1., после чего смесь замораживали в жидком азоте и лиофилизировали в стандартной лиофильной сушке. Полученный порошок хранили в пробирках, запаянных под вакуумом или в атмосфере азота, чтобы его компоненты не подвергались химическим реакциям.
Пример 6. Определение активности синтеза белка.
Активность препарата для бесклеточного синтеза белка, содержащего экстракты из зародышей пшеницы, полученного согласно примеру 5, хранившегося при -80°С в течение 2 месяцев, сравнивали с активностью экстракта для бесклеточного синтеза белка, полученного стандартным способом и хранившегося в жидком азоте (-196°С) тот же срок. Для определения активности к экстрактам добавляли вещества из состава, полученного в соответствии с методом Епсккои е! а1., как указано в примере 5. После добавления 1000 единиц/мл ингибитора рибонуклеаз (ΡΝηκίη) и ΝΡ-40 (конечная концентрация 0,05%) определяли активность синтеза белка согласно примеру 4. Как следует из фиг. 3, препарат для бесклеточного синтеза белка по настоящему изобретению (□-□), содержащий лиофилизованные экстракты из зародышей пшеницы, сохранял активность синтеза белка, эквивалентную активности препарата, полученного стандартным способом и хранившемуся в жидком азоте (-).
Это означает, что способ настоящего изобретения обеспечивает возможность хранения и транспортировки препарата, содержащего клеточные экстракты для бесклеточного синтеза белка, при сохранении его высокой активности при температурах от -80°С до комнатной температуры, что значительно превышает стандартные температуры хранения, а также упрощает проведение бесклеточного синтеза белка.
- 9 006162
Пример 7. Непрерывный бесклеточный синтез белка с помощью гель-фильтрации на колонке в качестве реактора: ручной метод с открытой колонкой.
После набухания носитель для гель-фильтрации - 8ерйабех С-25 (Пас) фирмы Рйагтааа АВ уравновешивали раствором, содержащим 20 мМ Нере5-К0Н. рН 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата магния, 4 мМ дитиотреитола, 1,2 мМ АТФ, 0,25 мМ ГТФ, 16 мМ креатинфосфата, 0,38 мМ спермидина, 0,3 мМ каждой из 20 Ь-аминокислот, 0,005% ЫаМз, 0,05% ΝΡ-40, 1 мМ Е-64 и 1 мМ РМ8Е, и заполняли им колонку (внутренний диаметр 10 мм, длина 100 мм).
На колонку наносили 0,1 мл раствора для бесклеточного синтеза белка, приготовленного согласно примеру 1 (содержащего в качестве матрицы для трансляции 80 мкг 5'-САР-содержащей мРНК дигидрофолатредуктазы в 1 мл смеси), и инкубировали 1 ч при 23°С, после чего с помощью перистальтического насоса добавляли необходимые для синтеза компоненты - аминокислоты со скоростью 0,5 мл/ч. Через 12 ч отбирали пробы объемом 1 мкл и анализировали электрофорезом в 12,5%-ном полиакриламидном геле с 8Ό8, белки окрашивали Кумасси ВпШаЩ В1ие и определяли количество синтезированного белка с помощью денситометра (Епбо Υ. е! а1. (1992) 1. В1о1есй., 25, 221-230; Епбо Υ. е! а1. (1975) Вюс1пт. Вюрйуз. Ас!а, 383, 305-315).
Полученные результаты показаны на фиг. 4А. На дорожке 1 показаны результаты в отсутствие матрицы, а на дорожке 3 показаны результаты синтеза колоночным способом за 12 ч. Слева нанесены маркеры в 94 кД, 67 кД, 43 кД, 30 кД и 20,1 кД, соответственно. Стрелкой отмечено положение синтезированной дигидрофолатредуктазы.
Пример 8. Непрерывный бесклеточный синтез белка с использованием колонки для гельфильтрации в качестве реакционной емкости: устройство на основе жидкого хроматографа.
Состав реакционной смеси, проведение реакции и анализа проводили согласно примеру 1, за исключением того, что использовали колонку НЯ 10/30 (внутренний диаметр 10 мм, длина 300 мм), заполненную 8ерйабех С-25 (йпе) фирмы Рйагтаста АВ в качестве носителя, и жидкостный хроматограф 8МАЯТ® 8у51ет фирмы Рйагтаста В|о1ес11, а объем реакции составлял 0,3 мл. Полученные результаты представлены на дорожке 2 фиг. 4В.
Сравнение проводили с диализной модификацией непрерывного бесклеточного синтеза белка с использованием экстрактов из зародышей (сравнительный пример) пшеницы диализным методом. Реакционную смесь для бесклеточного синтеза белка, приготовленную согласно примеру 1, вносили в диализатор ЬЬро 0|а1ухег (8рес!га/Рог® СЕ, предел исключения 25 кД, объем 0,5 мл) и проводили реакцию при 23-30°С в течение 12 ч в диализаторе против 10-кратного (относительно реакционной смеси) объема диализного раствора, содержащего 20 мМ Нере8-К0Н, рН 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата магния, 4 мМ дитиотреитола, 1,2 мМ АТФ, 0,25 мМ ГТФ, 16 мМ креатинфосфата, 0,38 мМ спермидина, 0,3 мМ каждой из 20 Ь-аминокислот, 0,005% NаN3, 0,05% №-40, 1 мМ Е-64 и 1 мМ РМ8Е. Полученные результаты представлены на дорожке 2 фиг. 4А и на дорожке 1 фиг. 4В.
Экспериментальные результаты, полученные с использованием дигидрофолатредуктазы в качестве модели (фиг. 4), показывают выход целевого белка в колоночном способе (0,25 мг/мл объема реакции), как в ручной модификации с открытой колонкой, так и в модификации с жидкостным хроматографом, близок к выходу, полученному диализным способом. Увеличение размера колонки позволяет получать больший выход белка.
Пример 9. Повышение эффективности синтеза путем увеличения времени реакции и дополнительного внесения мРНК и креатинкиназы.
Реакцию синтеза проводили в течение 24 ч с использованием в качестве модели мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу. Реакционная смесь в соответствии с методом Епскзоп е! а1., содержала 48% объем. экстракта из зародышей пшеницы, полученного согласно примеру 1, и 1000 единиц/мл ингибитора рибонуклеаз (Я№вт), 30 мМ Нере8-К0Н, рН 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата магния, 2,85 мМ дитиотреитола, 0,5 мг/мл креатинкиназы, 1,2 мМ АТФ, 0,25 мМ ГТФ, 16 мМ креатинфосфата, 0,38 мМ спермидина, 0,3 мМ каждой из 20 Ь-аминокислот, 0,05% №-40, а также САР-содержащую мРНК (80 мкг/мл смеси), кодирующую дигидрофолатредуктазу и полученную согласно методу Епбо Υ. е! а1. (1992) 1. ВюйсЬ., 25,221-230.
Реакцию проводили при 23°С в диализной системе против 20-кратного объема диализной жидкости, содержащей 20 мМ Нере8-К0Н, рН 7,6, 95 мМ ацетата калия, 2,65 мМ ацетата магния, 4 мМ дитиотреитола, 1,2 мМ АТФ, 0,25 мМ ГТФ, 16 мМ креатин-фосфата, 0,38 мМ спермидина, 0,3 мМ каждой из 20 Ь-аминокислот, 0,005% NаN3, 0,05% №-40, 1 мМ Е-64 и 1 мМ РМ8Е.
Через 12 ч после начала реакции добавляли 20 мкг САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, и 200 мкг креатинкиназы (на 1 мл объема реакции). В качестве контроля добавляли либо только 20 мкг САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, либо только 200 мкг креатинкиназы (на 1 мл объема реакции). В качестве сравнительного контроля реакцию проводили без добавления этих компонентов. Эти операции проводили вручную, а наружную диализную жидкость не меняли. Количество синтезированного белка определяли методом электрофореза полученного белка в 8Ό8полиакриламидном геле путем окрашивания его Кумасси ВпШаЩ В1ие, измерения интенсивности окрашенной зоны и сравнения со стандартным препаратом (Епбо Υ. е! а1. (1992) 1. Вю1ес11., 25, 221-230; Епбо
- 10 006162
Υ. е) а1. (1975) ВюсЫт. Βίορίινδ. Лс)а, 383, 305-315).
Результаты, приведенные на фиг. 7, показывают, что при дополнительном внесении мРНК и креатинкиназы (о-о) через 12 ч после начала реакции реакция протекала практически линейно. В случае дополнительного внесения одной мРНК (Δ—Δ) или одной креатинкиназы реакция останавливалась, как и без дополнительного внесения мРНК и креатинкиназы (□-□). Полученные результаты подтверждают, что прекращение синтеза белка вызвано падением матричной активности мРНК и истощением источников энергии вследствие снижения активности креатинкиназы, и показывает решения возможных способов этих проблем.
Пример 10. Повышение эффективности синтеза путем увеличения времени реакции с периодической заменой диализной жидкости.
Реакцию синтеза белка проводили в течение 60 ч, используя в качестве модели мРНК, кодирующую дигидрофолатредуктазу и те же условия синтеза (состав реакционной смеси, температура и т.д.), что в примере 9 с заменой наружной диализной жидкости через 24 и 45 ч, соответственно, после начала реакции. В качестве сравнительного контроля проводили синтез белка без замены наружной диализной жидкости. В каждой из этих систем дополнительно добавляли 20 мкг САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, и 200 мкг креатинкиназы (на 1 мл объема реакции). Количество синтезированного белка определяли как в примере 9.
Результаты, приведенные на фиг. 8, показывают, что в модификации без замены наружной диализной жидкости (Δ—Δ) синтез протекал практически линейно вплоть до 24 ч. Однако примерно через 30 ч скорость реакции заметно снижалась. Тем не менее, замена наружной диализной жидкости (о-о) через каждые 24 ч (показано стрелками) позволила продлить синтез белка почти до 60 ч. Полученные результаты подтверждают, что прекращение синтеза белка вызывается истощением исходных материалов, необходимых для синтеза белка, и накоплением побочных продуктов, и показывает возможный способ решения этих проблем.
Пример 11. Увеличение времени реакции и повышение эффективности синтеза путем автоматического добавления мРНК и креатинкиназы и автоматической замены диализной жидкости с помощью автоматической установки для непрерывного бесклеточного синтеза белка.
Синтез белка проводили в течение 60 ч, используя в качестве модели мРНК, кодирующую дигидрофолатредуктазу, и те же условия синтеза (состав реакционной смеси, температура и т.д.), что в примере 9, с использованием автоматического устройства для непрерывного бесклеточного синтеза белка. Через каждые 12 ч после начала реакции добавляли 20 мкг САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, и 200 мкг креатинкиназы (на 1 мл объема реакции) аликвотами по 5 мкл, которые хранили при 4°С, и продолжали реакцию. Наружную диализную жидкость подавали в отсек непрерывно (0,3 мл/ч) из сосуда, находившегося при 4°С, и отводили из отсека с такой же скоростью. Пробы отбирали в 1 мкл из объема, эквивалентного 0,5 мл исходной реакционной смеси, разделяли электрофорезом в 8Ό8полиакриламидном геле и окрашивали Кумасси В1ие (фиг. 9А). В качестве сравнительного контроля проводили синтез белка в условиях, описанных выше, но с дополнительным добавлением только креатинкиназы без добавления САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу (фиг. 9В). Кроме того, к пробе объемом 1 мкл, взятой через 0 ч после начала реакции, добавляли 1 мкг стандартного препарата дигидрофолатредуктазы и проводили электрофорез и окрашивание, как описано выше (правая дорожка на фиг. 9А). Количество синтезированного белка определяли как описано в примере 9 (фиг. 9С).
Как показывают результаты, приведенные на фиг. 9, при внесении одной креатинкиназы без добавления САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу (Δ—Δ), реакция прекращалась примерно через 15 ч. Подобное прекращение реакции наблюдалось (не показано) и при внесении одной САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, без добавления креатинкиназы. С другой стороны, при автоматическом добавлении САР-содержащей мРНК, кодирующей дигидрофолатредуктазу, вместе с креатинкиназой через каждые 12 ч и автоматической замене наружной диализной жидкости через каждые 24 ч (о-о) наблюдался эффективный бесклеточный синтез белка. Полученные результаты подтверждают, что устройство настоящего изобретения работает эффективно.
Claims (16)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Препарат для бесклеточного синтеза белка, содержащий клеточный экстракт, полученный из зародышей растений, отличающийся тем, что из зародышей полностью удален загрязняющий их эндосперм путем промывки зародышей неионным детергентом.
- 2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что зародыши являются зародышами пшеницы, ячменя, риса, ржи, кукурузы, гречихи или шпината.
- 3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что неионный детергент представляет собой производные полиоксиэтилена.- 11 006162
- 4. Препарат по п.3, отличающийся тем, что производные полиоксиэтилена выбирают из Вгц, Тгйоп, Т\усеп и/или ΝοιικΉ Р-40.
- 5. Препарат по п.4, отличающийся тем, что производное полиоксиэтилена представляет собой Νοηΐάβί Р-40.
- 6. Препарат по п.1, отличающийся тем, что промывку неионным детергентом проводят в сочетании с обработкой ультразвуком.
- 7. Препарат по п.1, отличающийся тем, что он изготовлен в высушенной форме.
- 8. Препарат по п.7, отличающийся тем, что он изготовлен в лиофилизированной форме.
- 9. Препарат по п.7, характеризующийся тем, что он стабилен при комнатной температуре.
- 10. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что из него полностью удалена система ингибирования реакций синтеза эндогенного белка.
- 11. Препарат по п.1, характеризующийся тем, что степень деаденилирования рибосом составляет менее 7%, предпочтительно менее 1%.
- 12. Препарат для бесклеточного синтеза белка, содержащий клеточный экстракт, полученный из зародышей пшеницы, из которых полностью удален загрязняющий их эндосперм путем промывки зародышей пшеницы неионным детергентом до исчезновения мутности промывочного буфера, степень деаденилирования рибосом которого составляет менее 1%, стабильный при хранении в сухом виде при комнатной температуре, обеспечивающей непрерывный бесклеточный синтез белка в бесклеточный белоксинтезирующей системе при восполнении субстрата и других реагентов с постоянным выходом не менее 1 мг/мл за 24 ч в течение не менее 24 ч.
- 13. Способ осуществления синтеза белка в бесклеточной белок-синтезирующей системе с использованием препарата по любому из пп.1-12, характеризующийся тем, что указанная система включает реакционную камеру, содержащую носитель, обладающий свойствами молекулярного сита, а реакция бесклеточного синтеза белка протекает во время прохождения исходных веществ через носитель в качестве подвижной фазы.
- 14. Способ осуществления синтеза белка в бесклеточной белок-синтезирующей системе с использованием препарата по любому из пп.1-12, характеризующийся тем, что указанная система включает реакционную камеру, обеспечивающую возможность проведения диализа, а исходные вещества и продукт реакции бесклеточного синтеза белка разделяются диализной мембраной.
- 15. Способ по п.13 или 14, отличающийся тем, что синтез осуществляется непрерывно, а указанная система обеспечивает добавление, хранение, замену и/или удаление таких компонентов, как мРНК, фермент системы регенерации энергии, субстрат и источник энергии.
- 16. Устройство для осуществления непрерывного бесклеточного синтеза белка согласно способу по п.15, включающее реакционную камеру с крышкой, герметически ее закрывающей, в которой имеется первый канал с входным отверстием, служащим для введения в систему субстрата и/или источника энергии, и выходным отверстием, ведущим в отсек для наружного диализного раствора; второй канал с входным отверстием в отсеке для наружного диализного раствора, служащим для отвода метаболитов в наружном диализном растворе, и выходным отверстием, ведущим из системы наружу; а также входное отверстие, служащее для введения мРНК и/или фермента системы регенерации энергии; и средство, обладающее свойствами диализной мембраны, находящееся в отсеке для наружного диализного раствора.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11130395A JP2000316595A (ja) | 1999-05-11 | 1999-05-11 | 無細胞タンパク質合成手段 |
| JP11130393A JP2000316594A (ja) | 1999-05-11 | 1999-05-11 | 無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有製剤、及び無細胞タンパク質合成反応用キット |
| JP11151599A JP2000333673A (ja) | 1999-05-31 | 1999-05-31 | 連続無細胞タンパク質合成手段 |
| PCT/JP1999/004088 WO2000068412A1 (en) | 1999-05-11 | 1999-07-29 | Preparation containing cell extract for synthesizing cell-free protein and means for synthesizing cell-free protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200101189A1 EA200101189A1 (ru) | 2002-04-25 |
| EA006162B1 true EA006162B1 (ru) | 2005-10-27 |
Family
ID=27316108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200101189A EA006162B1 (ru) | 1999-05-11 | 1999-07-29 | Препарат для бесклеточного синтеза белка, способ синтеза белка с использованием данного препарата и устройство для его осуществления |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6905843B1 (ru) |
| EP (1) | EP1176210B1 (ru) |
| KR (1) | KR100546009B1 (ru) |
| AT (1) | ATE424467T1 (ru) |
| AU (1) | AU765632B2 (ru) |
| CA (1) | CA2373057A1 (ru) |
| DE (1) | DE69940525D1 (ru) |
| EA (1) | EA006162B1 (ru) |
| WO (1) | WO2000068412A1 (ru) |
Families Citing this family (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2373057A1 (en) * | 1999-05-11 | 2000-11-16 | Wakenyaku Co., Ltd. | Preparation containing cell extracts for cell-free protein synthesis and means for synthesizing protein using the preparation |
| DE10011209A1 (de) * | 2000-03-08 | 2001-09-13 | Roche Diagnostics Gmbh | Matrix-Reaktor und Verfahren zur Herstellung von Produkten in diesem Reaktor |
| US7074595B2 (en) * | 2000-07-21 | 2006-07-11 | Cellfree Sciences Co., Ltd. | General means of labeling protein by using wheat embryo cell-free protein synthesis system |
| DE60129717D1 (de) | 2000-08-29 | 2007-09-13 | Cellfree Sciences Co Ltd | Verfahren zur synthese von zellfreien proteinen |
| JP4838957B2 (ja) * | 2001-05-02 | 2011-12-14 | 独立行政法人理化学研究所 | 無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質の製造方法 |
| DE10137792A1 (de) * | 2001-08-06 | 2003-02-27 | Erdmann Volker | Verfahren zur Genexpression |
| DE60218533D1 (de) * | 2001-12-27 | 2007-04-12 | Cellfree Sciences Co Ltd | Nukleotidsequenzen mit aktivität zur steuerung der translationseffizienz und deren nutzung |
| CA2474466A1 (en) * | 2002-01-31 | 2003-08-07 | Yaeta Endo | Germ extract for cell-free protein synthesis and process for producing the same |
| WO2003072796A1 (fr) * | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Yaeta Endo | Solution de reaction pour la synthese de proteines sans cellule, procede de preparation de cette solution et procede de synthese de cette proteine utilisant cette solution |
| AU2003235844A1 (en) * | 2002-05-14 | 2003-11-11 | Cellfree Sciences Co., Ltd. | Lyophilized preparation for synthesis of cell-free protein |
| JP4359707B2 (ja) | 2002-05-22 | 2009-11-04 | 独立行政法人理化学研究所 | チオレドキシン融合タンパク質発現ベクターを用いた無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法 |
| JP4441170B2 (ja) | 2002-11-28 | 2010-03-31 | 独立行政法人理化学研究所 | Ｓ１２リボソームタンパク質に変異を有する大腸菌細胞抽出液及びそれを用いる無細胞系によるタンパク質の製造方法 |
| JP2006129702A (ja) * | 2002-12-05 | 2006-05-25 | Zoegene Corp | タンパク質製造方法 |
| JP2004208640A (ja) | 2003-01-07 | 2004-07-29 | Rengo Co Ltd | 無細胞系タンパク質合成用酵母抽出液およびその調製方法、ならびにそれを用いた無細胞系タンパク質合成方法 |
| US20060188947A1 (en) * | 2003-08-07 | 2006-08-24 | Yaeta Endo | Reagent for producing a protein chip |
| EP1660885B1 (en) * | 2003-08-07 | 2012-10-03 | CellFree Sciences Co., Ltd. | Reagent for producing a protein chip |
| US20060233789A1 (en) * | 2004-09-24 | 2006-10-19 | Cellfree Science Co., Ltd. | Process for producing antigenic substance |
| JP2008514240A (ja) * | 2004-10-01 | 2008-05-08 | インヴィトロジェン コーポレーション | 生体分子のインビトロ合成用の供給バッファー、系、及び方法 |
| JP4868731B2 (ja) | 2004-11-17 | 2012-02-01 | 独立行政法人理化学研究所 | 哺乳動物培養細胞由来の無細胞タンパク質合成システム |
| JP4787488B2 (ja) | 2004-11-19 | 2011-10-05 | 独立行政法人理化学研究所 | 直鎖状鋳型ｄｎａを用いた無細胞タンパク質合成方法及びそのための細胞抽出液 |
| JP2007199047A (ja) | 2005-12-28 | 2007-08-09 | Cellfree Sciences Co Ltd | ビオチン化タンパク質の調製方法及び該タンパク質を用いた検出方法 |
| US20070207520A1 (en) * | 2006-03-02 | 2007-09-06 | Ryo Morishita | Method for cell-free synthesizing protein using wheat embryo extract under low temperature condition |
| CN101903512A (zh) * | 2007-10-15 | 2010-12-01 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 使用稳定的储存中间体制造生物产物的方法 |
| EP2213747B1 (en) | 2007-11-05 | 2021-06-30 | Riken | Method for producing membrane protein |
| US8522515B2 (en) * | 2009-01-26 | 2013-09-03 | R.J. Reynolds Tobacco Company | Method and apparatus for customizing cigarette packages |
| CN102421431B (zh) * | 2009-04-06 | 2019-04-02 | 克雷勒内有限公司 | 包含一或多种肌酸化合物的血液透析和腹膜透析溶液 |
| US20120208232A1 (en) * | 2009-07-15 | 2012-08-16 | William Yang | Cell-Free Synthesis of Active Reprogramming Transcription Factors |
| KR101161786B1 (ko) * | 2009-12-18 | 2012-07-03 | (주)바이오쉴드 | 번역효율 증가제로서 계면활성제를 포함하는 무세포 단백질 합성계에서 펩타이드를 합성하는 방법 및 이를 위한 조성물 |
| US9982227B2 (en) | 2011-03-08 | 2018-05-29 | University Of Maryland, Baltimore County | System and method for production of on-demand proteins in a portable unit for point of care delivery |
| US10774304B2 (en) | 2011-03-08 | 2020-09-15 | University Of Maryland, Baltimore County | System and method for production of on-demand proteins in a portable unit for point of care delivery |
| US12227734B2 (en) | 2011-03-08 | 2025-02-18 | University Of Maryland, Baltimore County | Microscale bioprocessing system and method for protein manufacturing from human blood |
| US20120301904A1 (en) | 2011-04-26 | 2012-11-29 | Prosetta Antiviral, Inc | Multiprotein assemblies |
| EP2787346B1 (en) | 2011-11-28 | 2017-06-21 | National University Corporation Nagoya University | Biomarker for lymphocytic infundibuloneurohypophysitis, and use applications thereof |
| WO2015085209A1 (en) * | 2013-12-06 | 2015-06-11 | President And Fellows Of Harvard College | Paper-based synthetic gene networks |
| US20170273261A1 (en) | 2014-08-29 | 2017-09-28 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and devices involving oil matrices |
| US9078427B1 (en) | 2014-08-29 | 2015-07-14 | Pioneer Hi Bred International Inc | Method of storing plant embryos |
| DK3242931T3 (da) | 2015-01-08 | 2021-05-10 | Sutro Biopharma Inc | Formuleringer til stabilisering af bakteriecelleekstrakter |
| CA3032514C (en) | 2015-07-31 | 2021-05-04 | Takehiro SHINODA | Method of producing membrane protein and utilization thereof |
| WO2019035916A1 (en) | 2017-08-15 | 2019-02-21 | Northwestern University | DESIGN OF PROTEIN GLYCOSYLATION SITES BY RAPID EXPRESSION AND CHARACTERIZATION OF N-GLYCOSYLTRANSFERASES |
| US11673921B2 (en) | 2017-11-10 | 2023-06-13 | Northwestern University | Cell-free protein synthesis platform derived from cellular extracts of Vibrio natriegens |
| WO2019204346A1 (en) | 2018-04-16 | 2019-10-24 | Northwestern University | METHODS FOR CO-ACTIVATING IN VITRO NON-STANDARD AMINO ACID (nsAA) INCORPORATION AND GLYCOSYLATION IN CRUDE CELLLYSATES |
| US11814621B2 (en) | 2018-06-01 | 2023-11-14 | Northwestern University | Expanding the chemical substrates for genetic code reprogramming |
| US12421537B2 (en) | 2018-07-06 | 2025-09-23 | Northwestern University | Ribosome variants for sequence defined polymer synthesis |
| WO2020072127A2 (en) | 2018-08-03 | 2020-04-09 | Northwestern University | On demand, portable, cell-free molecular sensing platform |
| EP3931341A4 (en) | 2019-02-25 | 2023-03-29 | Northwestern University | Cell-free protein synthesis platforms derived from clostridia |
| US20250043324A1 (en) * | 2021-07-28 | 2025-02-06 | Northwestern University | A low-cost, thermostable, lyophilized, cell-free protein synthesis platform |
| JPWO2025063209A1 (ru) * | 2023-09-18 | 2025-03-27 | ||
| KR102873056B1 (ko) * | 2023-11-15 | 2025-10-23 | 대한민국(방위사업청장) | 무세포 단백질 합성 반응액의 안정한 보관을 위한 동결건조 제형 및 이의 제조방법 |
| CN118022387B (zh) * | 2024-04-11 | 2024-07-26 | 福建龙生生物科技有限公司 | 一种融合蛋白制备装置 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2904583B2 (ja) * | 1991-10-11 | 1999-06-14 | プロメガ・コーポレーション | 真核無細胞抽出物中での転写と翻訳の共役 |
| JPH07147992A (ja) * | 1993-11-30 | 1995-06-13 | Kobe Steel Ltd | 無細胞抽出液を利用したポリペプチドの合成方法 |
| JP3255784B2 (ja) * | 1994-01-26 | 2002-02-12 | 弥重太 遠藤 | 蛋白質の合成方法 |
| KR0131166B1 (ko) * | 1994-05-04 | 1998-04-11 | 최차용 | 무세포시스템에서 단백질을 제조하는 방법 |
| JPH1080295A (ja) | 1996-07-15 | 1998-03-31 | Nippon Flour Mills Co Ltd | 無細胞タンパク合成系によるタンパクの合成方法及び装置 |
| ATE357513T1 (de) | 1996-07-16 | 2007-04-15 | Qiagen North American Holdings | Verfahren zur herstellung komplexer multienzymatischer lagerstabiler reaktionsgemische und deren verwendung |
| CA2373057A1 (en) * | 1999-05-11 | 2000-11-16 | Wakenyaku Co., Ltd. | Preparation containing cell extracts for cell-free protein synthesis and means for synthesizing protein using the preparation |
-
1999
- 1999-07-29 CA CA002373057A patent/CA2373057A1/en not_active Abandoned
- 1999-07-29 AT AT99933168T patent/ATE424467T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-07-29 US US10/019,995 patent/US6905843B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-29 EP EP99933168A patent/EP1176210B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-07-29 AU AU49301/99A patent/AU765632B2/en not_active Ceased
- 1999-07-29 KR KR1020017014336A patent/KR100546009B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-29 DE DE69940525T patent/DE69940525D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-29 EA EA200101189A patent/EA006162B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-07-29 WO PCT/JP1999/004088 patent/WO2000068412A1/ja not_active Ceased
-
2005
- 2005-03-25 US US11/089,652 patent/US7235382B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7235382B2 (en) | 2007-06-26 |
| KR20010112953A (ko) | 2001-12-22 |
| CA2373057A1 (en) | 2000-11-16 |
| DE69940525D1 (de) | 2009-04-16 |
| US6905843B1 (en) | 2005-06-14 |
| US20050186655A1 (en) | 2005-08-25 |
| ATE424467T1 (de) | 2009-03-15 |
| KR100546009B1 (ko) | 2006-01-25 |
| EP1176210A1 (en) | 2002-01-30 |
| AU4930199A (en) | 2000-11-21 |
| EP1176210A4 (en) | 2004-09-08 |
| EP1176210B1 (en) | 2009-03-04 |
| EA200101189A1 (ru) | 2002-04-25 |
| WO2000068412A1 (en) | 2000-11-16 |
| AU765632B2 (en) | 2003-09-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA006162B1 (ru) | Препарат для бесклеточного синтеза белка, способ синтеза белка с использованием данного препарата и устройство для его осуществления | |
| McPherson | Introduction to protein crystallization | |
| Evans et al. | Cyclin: a protein specified by maternal mRNA in sea urchin eggs that is destroyed at each cleavage division | |
| US3275528A (en) | Method and apparatus for controlling culture growth | |
| JP2004536292A (ja) | マルチチャンバデバイスおよび生物試料の加工処理のためのその用途 | |
| Aguda et al. | Affinity crystallography: A new approach to extracting high-affinity enzyme inhibitors from natural extracts | |
| JP2002125693A (ja) | 無細胞タンパク質合成用細胞抽出液組成物 | |
| JP3675804B2 (ja) | 無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、及びその製造方法 | |
| Rossi et al. | Are the structure and function of an enzyme the same in aqueous solution and in the wet crystal? | |
| Pomeroy et al. | Membrane properties of isolated winter wheat cells in relation to icing stress | |
| JP2000333673A (ja) | 連続無細胞タンパク質合成手段 | |
| Godchaux III et al. | The effect of chloramphenicol in intact erythroid cells | |
| US20040043088A1 (en) | Process for producing germ extract | |
| Bernath et al. | Lysozyme activity in the presence of nonionic detergent micelles | |
| JP4637746B2 (ja) | アミノ酸選択的標識化蛋白質合成方法 | |
| EP3406732B1 (en) | Method for measuring oxidoreductase activity | |
| Langlands et al. | SILAC-Based Quantitative Proteomic Analysis of Drosophila Embryos | |
| US20070134734A1 (en) | Novel screening method of indicator substance | |
| JP2000316594A (ja) | 無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有製剤、及び無細胞タンパク質合成反応用キット | |
| JP2005348739A (ja) | 無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有製剤、及び無細胞タンパク質合成反応用キット | |
| JP2000316595A (ja) | 無細胞タンパク質合成手段 | |
| JP2005218357A (ja) | 無細胞蛋白質合成方法 | |
| Duda et al. | Change in the constructive metabolism and ultrastructural organization of Bacillus cereus cells under the influence of a specific autoregulatory factor | |
| Saotome | Chromosome number of sea urchin andromerogones during early development | |
| Zhang et al. | Photocaged Activity-Based Probes for Spatiotemporal Detection of Protein S-sulfenylation in Living Cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC1A | Registration of transfer to a eurasian application by force of assignment | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |