EA005601B1

EA005601B1 - Способ лечения злокачественных опухолей у млекопитающего, характеризующихся аномально высокой экспрессией лиганда, индуцирующего пролиферацию клеток (april)

Info

Publication number: EA005601B1
Application number: EA200200427A
Authority: EA
Inventors: Паскаль Шнайдер; Джеффри Томпсон; Тереза Качеро; Кристин Амброуз; Пол Реннерт
Original assignee: Байоджен, Инк.; Апотек Р Энд Д, С.А.
Priority date: 1999-10-06
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2005-04-28
Also published as: HUP0203567A2; ATE360434T1; CZ297633B6; BR0014583A; US7276241B2; EP1847273A1; IL204401A; SK286331B6; SK4512002A3; PL355102A1; ZA200202578B; NZ517907A; IL148839A; NO20021594L; EP2324844A2; EP1223964A1; CA2386463A1; IL148839A0; JP2011079863A; EA200200427A1

Abstract

Настоящее изобретение раскрывает способ лечения злокачественных опухолей, характеризующихся аномально высокой экспрессией лиганда, индуцирующего пролиферацию клеток (APRIL). В способе используется полипептид с аминокислотной последовательностью представленной в SEQ ID NO:8 или его биологически активные фрагменты или варианты, или антитело, направленное против таких последовательностей.

Description

Настоящее изобретение в основном относится к способам лечения ракового заболевания. Способы включают введение некоторых антагонистов фактора некроза опухолей (ΤΝΕ).

Предпосылки изобретения

Члены семейства фактора некроза опухолей (ΤΝΕ), относящиеся к цитокинам, участвуют в постоянно увеличивающемся количестве ключевых биологических функций. Каждый член семейства ΤΝΕ действует при связывании с одним или более членами соответствующего семейства рецепторных белков. В свою очередь данные рецепторы передают сигналы внутриклеточно для индукции широкого ряда физиологических или относящихся к развитию ответных реакций. Многие из рецепторных сигналов воздействуют на судьбу клеток и часто «запускают» конечную дифференциацию. Примеры клеточной дифференциации включают пролиферацию, созревание, миграцию и гибель.

Члены семейства ΤΝΕ представляют связанные с мембраной белки типа II, имеющие короткий внутриклеточный Ν-концевой домен, трансмембранный домен и С-концевые связывающие рецептор домены, лежащие на внешней клеточной поверхности. В некоторых случаях внеклеточный участок белка отщепляется, создавая секретируемую форму цитокина. Несмотря на то, что связанные с мембраной белки действуют локально, вероятно, через опосредуемое клетками контактное взаимодействие с их рецепторами, секретируемые формы обладают потенциальной возможностью циркулировать или диффундировать, следовательно, могут действовать на отдалении. Как связанные с мембраной, так и секретируемые формы находятся в виде тримеров, и полагают, что они передают свой сигнал рецепторам, способствуя образованию рецепторных кластеров.

Семейство рецепторных белков ΤΝΕ характеризуется наличием одного и более богатых цистеином доменов. Каждый богатый цистеином домен образует связанный через дисульфидную связь ядерный домен, который участвует в создании трехмерной структуры, которая образует связывающий лиганд «карман». Рецепторы являются связанными с мембраной белками типа I, в которых внеклеточный домен кодируется Ν-концом, затем трансмембранным доменом и С-концевым внутриклеточным доменом. Внутриклеточный домен ответственен за передачу сигнала рецептором. Некоторые рецепторы включают внутриклеточный «домен гибели», который может передавать клеткам сигнал об апоптозе, и они могут представлять собой эффективные индукторы гибели клеток. Другая группа рецепторов может в слабой степени индуцировать гибель; оказывается, что они теряют «домен гибели». Третья группа рецепторов не индуцирует гибель клеток. Все группы рецепторов могут передавать сигналы о пролиферации или дифференциации клеток вместо гибели, в зависимости от типа клеток или наличия других сигналов.

Хорошо изученным примером плюрипотентной природы активности семейства ΤΝΡ является номинальный член, ΤΝΕ. ΤΝΕ может существовать в виде связанного с мембраной цитокина или может быть отщеплен и секретирован. Обе формы связываются с двумя ΤΝΕ-рецепторами, ΤΝΕ-Κ.55 и ΤΝΕК75. Первоначально описанный по его способности непосредственно убивать опухолевые клетки ΤΝΕ также регулирует большое множество иммунных процессов, включая индукцию острых воспалительных реакций, а также поддержание гомеостаза в лимфоидных тканях. В результате того, что данный цитокин может играть двойную роль в различных патологических процессах, были разработаны агонисты и антагонисты в качестве модификаторов заболевания. Например, ΤΝΕ и ΕΤα (который также передает сигналы через ΤΝΕ-рецепторы) использовали для лечения раковых заболеваний, особенно с периферической локализацией, таких как лимбическая саркома. При данном процессе непосредственная передача сигналов цитокинами через рецептор индуцирует гибель опухолевых клеток (Лддагоа1 апб №11ага)ап. 1996. Еиг Су1окше ΝοΙ\ν 7:93-124).

В иммунологических процессах агенты, которые блокируют передачу сигналов через ΤΝΕрецепторы (например, анти-ΤNΕ-тΑЬ, растворимые слитые ΤΝΕ-Κ-белки), использовали для лечения заболеваний, подобных ревматоидному артриту и воспалительному заболеванию кишечника. При этих патологиях ΤΝΕ действует, индуцируя клеточную пролиферацию и эффекторную функцию, обостряя тем самым аутоиммунное заболевание, и в этом процессе блокирование связывания ΤΝΕ с его рецептором(ами) имеет терапевтическую пользу (Веибег, 1999. I. Р11еита1о1 26 Бирр1. 57:16-21).

Оказалось, что открытая недавно система лиганд/рецептор поддается аналогичной регуляции. Лимфотоксин-бета (ΕΤβ), член семейства ΤΝΕ, который образует гетеродимеры с ΕΤα, связывается с ΕΤβ-Β. Некоторые опухолевые клетки аденокарциномы, которые экспрессируют ΕΤβ-Κ, могут погибнуть или подвергнуться дифференциации при обработке агонистическими 34111+43-^-11^6 (Вго^шпд е! а1., 1996. I. Ехр. Меб. 183:867-878). Было показано в иммунологических процессах, что анти-^Τβ-тΑЬ или растворимый слитый ^Τβ-Κ.-Iд-белок может блокировать развитие воспалительных заболеваний кишечника, возможно, действуя на взаимодействие дендритных клеток и Т-клеток (Маскау е! а1., 1998. Са81гоеп1его1оду 115:1464-1475).

Система ΤΚΑΙΕ также имеет потенциальную возможность применения в качестве противоопухолевой терапии. ΤΚΑΙΕ взаимодействует с рядом связанных с мембраной и растворимых рецепторов. Два из этих рецепторов, ΤΚΑΙΕ-Κ1 и ΤΚΑΙΕ-Κ2 (также называемые ΌΚ4 и ΌΚ5), передают гибель, индуцируя сигналы опухолевым клеткам, но не нормальным клеткам, которые экспрессируют дополнительные

- 1 005601

ТКАГЬ-рецепторы, которые не индуцируют гибель. Полагают, что эти дополнительные рецепторы функционируют в качестве ловушек. Применение растворимого ТКАГЬ для уничтожения опухолевых клеток основано на избирательной экспрессии рецепторов-ловушек в нормальной, но не опухолевой ткани (Сига, 1997. 8с1епсе 277:768).

Опухолевые клетки сами по себе часто экспрессируют различные рецепторы-ловушки, которые блокируют иммунное распознавание или эффекторные функции. Действительно, некоторые опухоли гиперэкспрессируют рецепторы-ловушки ТКАГЬ, вероятно для того, чтобы избежать опосредуемой ТКАГЬ гибели (8йе1кй е1 а1., 1999. Опсодепе 18;4153-4159). Это ограничивает применимость ТКАГЬ в качестве противоопухолевого агента при некоторых процессах. Подобные наблюдения были сделаны в отношении рецептора-ловушки для РА8-Ь, который гиперэкспрессируется в опухолевых клетках легких и ободочной кишки (Ρίΐΐί е1 а1., 1998. Ыа1иге 396:699-703), и для антагониста ГЬ-1-рецептора (ΜαηΙοναηί е1 а1., 1998. Апп. N Υ Асаб. 8ст 840:338-351). Рецепторы-ловушки также используются вирусными геномами для защиты зараженных клеток хозяина от защитных механизмов хозяина.

АРКГЬ (лиганд, индуцирующий пролиферацию) является новым членом ΤΝΡ-семейства белков. На основании исследований по экспрессии и функционированию АРКГЬ можно предположить, что этот белок используется опухолевыми клетками для индукции быстрой пролиферации. Линии опухолевых клеток, обработанные растворимым АРКГЬ-белком или трансфицированные кДНК АРКГБ быстро растут в условиях ш νίΐτο. Трансфицированные АРКГЬ клетки, имплантированные мышам с иммунодефицитом, быстро растут в виде опухолей. Наконец, человеческие опухолевые клетки, но не нормальная ткань, экспрессируют высокие уровни мРНК АРКГЕ На основании этих наблюдений можно предположить, что АРКТЬ связывается с рецептором, который также экспрессируется опухолевыми клетками, приводя к аутокринной или паракринной активации опухолевых клеток. Кроме того, возможно, что АРКТЬ действует при других болезненных состояниях так, что активирование или блокирование пути с участием АРКТЬ будет иметь дополнительную применимость. Например, пониженная или повышенная экспрессия АРКТЬ может играть роль в аномалиях развития, поскольку развитие также часто характеризуется тщательно регулируемым балансом между пролиферацией клеток и гибелью клеток. Аналогично АРКТЬ может действовать при заболеваниях, связанных с пролиферацией клеток, таких как возникают при некоторых аутоиммунных заболеваниях (например, волчанке) или при воспалительных заболеваниях, где происходит быстрое увеличение клеточных популяций (например, бактериальный сепсис).

Основываясь на известности использования агонистов и антагонистов ΤΝΡ и членов семейства ΤΝΡ-рецепторов в качестве модуляторов заболевания, путь с участием АРКТЬ сам по себе представляет важную мишень для разработки лекарственных препаратов. Это особенно верно для лечения раковых заболеваний, поскольку, как оказалось, опухолевые клетки продуцируют и используют АРКГЬ для поддержания их собственного роста и, следовательно, мало вероятно, что они продуцируют рецепторыловушки или другие антагонисты пути с участием АРКГЕ Таким образом, путь с участием АРКГЬ уникально отличается, например, от путей с участием ТКАГЬ или РА8-Ь, которым можно препятствовать с помощью опухолевых рецепторов-ловушек.

Имеющиеся в настоящее время виды лечения раковых заболеваний являются неадекватными для многих типов опухолей за счет слабой эффективности, незначительного воздействия на выживаемость, токсичности, которая вызывает тяжелые побочные эффекты, или их комбинаций. Следовательно, имеется потребность в идентификации и разработке дополнительных способов лечения развития раковых заболеваний, которые могут обеспечить эффективность, не вызывая тяжелых побочных эффектов. Следовательно, антагонисты пути с участием АРКГЬ, включая анти-АРК1Ь-тАЬ8, анти-АРКЬЬ рецепторныешАЬк, растворимые АРКГЬ рецепторные-Гд слитые белки, естественные антагонисты, небольшие молекулы-антагонисты и химические, фармацевтические или другие антагонисты будут полезными.

Для этой цели заявители идентифицировали опосредуемый В-клетками белок (ВСМ или ВСМА) в качестве рецептора АРКГЬ.

Краткое описание изобретения

Заявители установили, что ВСМА является рецептором для фактора некроза опухолей, АРКГЬ. АРКГЬ представляет ту же молекулу, описанную ранее в АО9912965, которая включена здесь для сведения. АРКГЬ-рецептор определен в дальнейшем как «АРКГО-К». Настоящее изобретение направлено на способы лечения и фармацевтические препараты для применения в целях лечения видов млекопитающих, уже имеющих раковое заболевание или при риске его развития. Данные субъекты включают субъектов, уже пораженных раковым заболеванием, или которые уже подвергались противоопухолевой терапии.

Способы и композиции по данному изобретению происходят отчасти в результате открытия того, что некоторые агенты, которые представляют собой агенты для лечения раковых заболеваний, определенные здесь в качестве антагонистов АРКГЬ-К, включая, например, анти-АРКГЬ-К-антитела, можно применять для лечения субъектов при риске развития ракового заболевания, как здесь определено, или при необходимости лечения ракового заболевания.

Терапевтические агенты для лечения ракового заболевания можно вводить любым путем введения, который совместим с выбранным агентом, и могут быть представлены с любым фармацевтически при

- 2 005601 емлемым носителем, который соответствует пути введения. Предпочтительными путями введения являются парентеральные и, в частности, внутривенный, внутрибрюшинный и внутрисуставный. Лечение также предпочтительно проводить в течение длительного периода времени амбулаторно. Полагается, что суточные дозы агентов для лечения ракового заболевания будут находиться в пределах примерно 0,011000 мкг/кг массы тела, и более предпочтительно примерно 10-300 мкг/кг массы тела, хотя точные дозы будут варьировать в зависимости от используемого конкретного агента для лечения ракового заболевания и конкретного состояния субъекта и анамнеза.

Лечение по настоящему изобретению пригодно для уничтожения в основном клональной популяции (колонии) трансформированных клеток в организме млекопитающего или подавления или ослабления роста колонии, которую обычно относят как к опухоли. В качестве таковых они пригодны для продления жизни и для поддержания качества жизни у субъектов при риске возникновения или уже пораженных раковым заболеванием.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показана последовательность (8ЕЦ ГО N0:1) нуклеиновой кислоты кДНК мышиного АРКГО и на основе ее аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0:3) в виде карты в векторе рССМ213.10. Представленное подчеркнутым является тус-эпитопом и аминокислотами из ЕакЬ. Начало последовательности, кодирующей внеклеточный домен АРКГО, указано стрелками.

На фиг. 2 показана последовательность (8ЕЦ ГО N0:4) нуклеиновой кислоты и на основе ее аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0:6) конструкции ЕЬАС-человеческого АРКГО для экспрессии в клетках млекопитающих. Карта указывает сигнальную последовательность (1-15); ЕЬАС-эпитоп (АА 16-23) и начало последовательности, кодирующей внеклеточный домен человеческого АРКГО (32-конец).

На фиг. 3А показана последовательность (8ЕЦ ГО N0:7) нуклеиновой кислоты и аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0:8) полной длины человеческого ВСМА. На фиг. 3В показана последовательность (8ЕЦ ГО N0:11) нуклеиновой кислоты р18Т538, плазмиды, кодирующей человеческую слитую конструкцию АРКГО-К-ЫдСЕс, и на основе ее аминокислотная последовательность (8ЕЦ ГО N0:12).

На фиг. 4 показано связывание тус-мышиного АРКГО с мышиной В-клеточной лимфомой линии А20. В трех отдельных опытах было показано наличие специфического связывания АРКГО с клетками А20 по сравнению с А) неокрашенными клетками и клетками, окрашенными только К1532, В) клетками, окрашенными КАИКЕ-Ь и К1532 и С) клетками, окрашенными АРКГО, и несоответствующей кроличьей сывороткой.

На фиг. 5 показано связывание тус-мышиного АРКГО с человеческой В-клеточной лимфомой линии КАЛ. В двух отдельных опытах было показано наличие специфического связывания АРКГО с клетками КАЛ по сравнению с А) неокрашенными клетками и клетками, окрашенными только К1532, и клетками, окрашенными КАИК-1, и К1532 и В) клетками, окрашенными АРКГО, и несоответствующей кроличьей сывороткой.

На фиг. 6 показано, что связывание АРКГО с клетками А20 (А) и клетками КАЛ (В) является конкурентным с использованием растворимого белка ВАЕЕ или растворимого белка ВСМА-1д.

На фиг. 7 показано связывание ЕЬАС-человеческого АРКГО с клетками различных линий: А) клетками А20, В) клетками НТ29, С) клетками И1Н3Т3. Специфическое связывание показано с использованием детекции биотинилированных анти-ЕЕАС-шАЬ М2 по сравнению со связыванием, наблюдаемым с несоответствующими изотипными контрольными тАЬ и без добавления ЕЬАС-АРКГО.

На фиг. 8 показана иммунопреципитация тус-тАРК1Ь с использованием слитого ВСМА-Ес-белка. Верхняя левая панель показывает специфическую йВМСА-Ес/тус-тАРКГО и положительную контрольную иммунопреципитации по сравнению с верхними правыми отрицательными контролями. В нижних панелях показано, что количества нагруженного белка были эквивалентными.

На фиг. 9 показаны опыты с ЕЫ8А, демонстрирующие, что ЕЬАС-й АРКГО связывается со слитым йВСМА-Ес-белком. Различные рецепторные слитые Ес-белки наносили на планшеты для ЕЫ8А и связывали с ЕЬАС-меченными лигандами. А) Детектирование связанных лигандов выявило, что только АРКГО и йВАЕЕ специфически связываются с йВСМА-Ес, но не йСГО40-Ес. В) Титрование дозы, показывающее, что сигнал ЕЬ18А, обнаруженный после связывания йАРКГО или йВАЕЕ на покрытых йВСМА-Ес планшетах, имел линейную зависимость по отношению к количеству добавленного белка.

На фиг. 10 показана иммунопреципитация ЕЬАб-йАРКГО и ЕЕАС-йВАЕЕ слитым йВСМА-Есбелком. Верхние 4 панели показывают эквивалентность белковых нагрузок при каждой реакции иммунопреципитации, в то время как нижние панели показывают, что йАРКГО и йВАЕЕ иммунопреципитировались йВСМА-Ес, но не йТКАГН-Ес.

На фиг. 11 показан анализ В1аСоге связывания тус-тАРК1Ь, ЕЬАб-йВАЕЕ и ЕЕАб-тВАЕЕ с йВСМА, йЬТбета-рецептором или йТИЕ-К80 или контроль, показывающий специфическое связывание только с йВСМА.

На фиг. 12 показано связывание АРКГО с трансфицированными ВСМА клетками. Клетки 293ЕВNА трансфицировали плазмидой, которая экспрессирует полную длину ЙВСМА. Клетки собирали через 48 ч с использованием 5 мМ ЭДТА и окрашивали тус-йАРКГО. Панель А показывает, что степень окрашива

- 3 005601 ния зависит от дозы. Панель В показывает, что окрашивание снижалось до фонового уровня с использованием растворимого белка ВСМЛ-1д.

На фиг. 13 показан рост клеток ΝΙΗ3Τ3, имплантированных подкожно мышам с иммунодефицитом (Νϋ/Νπ), обработанных контрольными реагентами или белком ВСМАПд. На данной модели клетки ΝΙΗ3Τ3 образуют фибросаркому.

На фиг. 14 показан рост человеческой карциномы ободочной кишки 8^480, имплантированной подкожно мышам с иммунодефицитом (Νπ/Νπ), обработанных контрольными реагентами или слитым белком ЬВСМЛ-1д.

На фиг. 15 А показан рост человеческой карциномы ободочной кишки НТ29, имплантированной подкожно мышам с иммунодефицитом, обработанных контрольными реагентами или слитым белком 11ВСМЛ-1д. На фиг. 15В показан рост человеческой карциномы легких А549, имплантированной подкожно мышам с иммунодефицитом (Νϋ/Νπ), обработанных контрольными реагентами или слитым белком ЬВСМЛ-1д.

Подробное описание

Определения

Для того чтобы более четко и кратко выяснить сущность заявленного изобретения, предоставляются следующие определения специальных терминов, использованных в последующем описании и прилагаемой формуле изобретения.

Далее изобретение будет описано при обращении к последующему подробному описанию, в которое включены следующие определения.

Термины «АРЕЮ-рецептор» или «ЛРШЬ-К», используемые здесь, включают естественную последовательность АРЕЮ-Е и варианты АРЕШ-Е. АРЕШ-Е можно выделить из различных источников, таких как типы мышиных или человеческих тканей, или из другого источника, или получить рекомбинантными или синтетическими методами. Кроме того, термин АРЕШ-Е дополнительно относится к полипептиду, который способен связываться с членом семейства фактора некроза опухоли, АРЕЩ или его гомологами, или фрагментами. Примером АРЕЮ-Е является ВСМА.

Термин «ВСМА» или «ВСМ» относится к новому белку для созревания В-клеток, как описано у Сга5 е! а1. (1995), 1и1ета11оиа1 1ттипо1оду, 7:1093-1106, «ВСМАр»: ап 1п(сцга1 тетЬгаие рго!еш ίη 1йе до1д1 аррага!и8 оГ йитап тайпе В 1утрйосу!е8; Υ. ЬааЫ е! а1. (1995), ЕМВО 1., 11, 3897-3904, «А пе\\' депе ВСМ оп Сйготозоте 16 18 Гизеб 1о !йе ш1ег1еикт 2 депе Ьу а ΐ (4; 16) (с.|26:р13) 1гап81осайоп ш а тайдпап! Т се11 1утрйота».

«Естественная последовательность АРЕШ-Е» включает полипептид, имеющий такую же аминокислотную последовательность, как АРЕЗЪ-Е, выделенный из природы. Подобную естественную последовательность АРШЬ-В можно выделить из природных источников или можно получить рекомбинантными или синтетическими методами. Естественная последовательность АРЕЗЪ-Е может представлять имеющиеся в естественных условиях усеченные или секретируемые формы АРЕЗЪ-Е (т.е. растворимые формы, включающие, например, последовательность внеклеточного домена), имеющиеся в естественных условиях вариантные формы (например, альтернативно сплайсированные формы) и естественные аллельные варианты АРЕЗЪ-Е. В одном воплощении изобретения естественная последовательность АРЕЗЬ-Е является зрелой или естественной последовательностью полипептида АРЕЮ-Е полной длины, включающей аминокислоты 1-184 по 8ЕО ΙΌ ΝΟ:8, или его фрагмента.

«Внеклеточный домен АРЕ1Ь-Е» или «АРЕ1Ь-Е ЕСП» относится к форме АРЕ1Ь-Е, которая в основном свободна от трансмембранного или цитоплазматического доменов АРЕ1Ь-Е. Обычно внеклеточный домен АРЕ1Ь-Е будет включать менее 1% таких трансмембранного и цитоплазматического доменов и предпочтительно будет иметь менее 0,5% таких доменов. Необязательно АРЕ1Ь-Е ЕСП будет включать аминокислотные остатки 1-51, или 1-52, или 1-53 8ЕО ΙΌ ΝΟ:8. В предпочтительном воплощении АРЕ1Ь-ЕСП включает аминокислотные остатки 4-51 по 8ЕО ΙΌ ΝΟ:8 или более предпочтительно аминокислотные остатки 8-41 по 8ЕО ΙΌ ΝΟ:8. Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что трансмембранный домен, установленный для полипептида АРЕГЬ-Е по настоящему изобретению, идентифицирован в соответствии с критериями, обычно используемыми в данной области для идентификации данного типа гидрофобных доменов. Точные границы трансмембранного домена могут варьировать, но наиболее вероятно не более, чем примерно на 5 аминокислот с каждого конца домена, детально указанного здесь.

«Вариант АРЕШ-Е» означает активный АРЕШ-Е, как определено ниже, имеющий идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере на 80% с АРЕ1Ь-Е, имеющего выведенную аминокислотную последовательность, показанную в 8ЕО ΙΌ ΝΟ:5 для полной длины естественной последовательности АРЕЮ-Е, или с последовательностью АРЕ[Ь-Е ЕСЭ. Подобные варианты АРЕЮ-Е включают, например, полипептиды АРЕШ-Е. в которых один или более аминокислотных остатков вставлены или удалены в конце или на С-конце последовательности по 8ЕО ΙΌ ΝΟ:8. Обычно вариант АРЕШ-Е будет иметь идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере примерно на 80 или 85%, более предпочтительно идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере при

- 4 005601 мерно на 90% и еще более предпочтительно идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере на 95% с аминокислотной последовательностью 8Еф ΙΌ N0:8.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» по отношению к последовательностям ЛРК1Б-К, идентифицированным здесь, определяется как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые совпадают с аминокислотными остатками в последовательности АРК1Б-К. после расположения последовательностей и введения «брешей», если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности и без учета любых консервативных замещений в качестве части идентичности последовательности. Расположение в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно достичь различными путями, которые известны специалистам в данной области, например с использованием широко доступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение ВЬА8Т, ΆΕΙΟΝ или Меда11дп (ΌΝΑ8ΤΆΚ). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для определения расположения, включая любые алгоритмы, необходимые для максимального расположения по полной длине последовательностей, которые сравниваются.

Термин «меченый эпитоп», когда здесь используется, относится к химерному полипептиду, включающему АРКЗЕ-К, или последовательность его домена, слитые с «меченым полипептидом». Меченый полипептид имеет достаточное количество остатков для обеспечения эпитопа, против которого можно получить антитела или который может быть идентифицирован каким-то другим агентом, который к тому же является достаточно коротким, чтобы не мешать активности АРКЗЬ-К. Меченый полипептид предпочтительно также является довольно уникальным в том плане, что антитела в основном не реагируют перекрестно с другими эпитопами. Подходящие меченые эпитопы обычно включают по меньшей мере 6 аминокислотных остатков и обычно примерно от 8 до примерно 50 аминокислотных остатков (предпочтительно примерно от 10 до примерно 20 остатков).

«Выделенный», когда используется для описания различных полипептидов, раскрытых здесь, означает полипептид, который был идентифицирован и выделен и/или извлечен из компонента его естественного окружения. Загрязняющими компонентами его естественного окружения являются вещества, которые обычно будут мешать диагностическим или терапевтическим применениям полипептида, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и не белковые растворенные вещества. В предпочтительных воплощениях полипептид должен быть очищенным (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков Ν-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающейся чашкой или (2) до гомогенности при проведении 8Ό8РАСЕ в невосстанавливающих и невосстанавливающих условиях с использованием Кумасси синего или, предпочтительно, серебряной окраски. Выделенный полипептид включает полипептид ίη 811и внутри рекомбинантных клеток, поскольку по меньшей мере один компонент из естественного окружения АРК1Б-К не будет присутствовать. Однако обычно выделенный полипептид будет получен по меньшей мере с одной стадией очистки.

Термин «антитело» используется в самом широком смысле и, в частности, включает отдельные моноклональные антитела против АРКЗЬ-К. (включая агонистические, антагонистические и нейтрализующие антитела) и композиции на основе анти-АРКЗЕ-К-антител с полиэпитопной специфичностью. Термин «моноклональное антитело» в том смысле, как он здесь используется, относится к антителу, полученному из популяции в основном гомогенных антител, т. е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных, имеющих место в естественных условиях мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах.

«Очищенный препарат» или «в основном очищенный препарат» полипептида в том смысле, как этот термин здесь используется, означает полипептид, который отделен от других белков, липидов и нуклеиновых кислот, с которыми он находится в естественных условиях. Предпочтительно полипептид также отделен от других веществ, например антител, матриксов и т.д., которые используются для его очистки.

Термины «проведение лечения», «лечение» и «терапия» в том смысле, как они здесь используются, относятся к лечебной терапии, профилактической терапии и превентивной терапии.

Термины «пептиды», «белки» и «полипептиды» используются здесь равнозначно.

«Биологически активный» в том смысле, как этот термин здесь используется, означает обладающий активностью ίη νίνο или ίη νίίτο, которая может осуществляться прямо или опосредованно. Биологически активные фрагменты могут иметь, например, 70% аминокислотную гомологию с активным сайтом рецептора, более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно 90% гомологию. Идентичность или гомология по отношению к рецептору определяется здесь в виде процента аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны остаткам АРК1Б-К в БЕф ΙΌ N0:8.

Термин «млекопитающее» в том смысле, как он здесь используется, относится к любому животному, отнесенному к млекопитающему, включая людей, коров, лошадей, собак, мышей и кошек. В предпочтительном воплощении изобретения млекопитающее является человеком.

В практике настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иначе, обычные методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микро

- 5 005601 биологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые известны в данной области. Такие методы описаны в литературе.

Далее будут подробно представлены предпочтительные воплощения настоящего изобретения. Данное изобретение относится к использованию АРШЬ-К и связанных с АРШЬ-К молекул для воздействия на рост и созревание В-клеток и клеток, не относящихся к В-клеткам, особенно, если они относятся к опухолевым клеткам. Изобретение также относится к использованию АРШЬ-К и связанных с АРШБ-К молекул для воздействия на ответы иммунной системы, что является необходимым при нарушениях, связанных с иммунной системой. Кроме того, изобретение включает лечение ракового заболевания и иммунных нарушений посредством использования АРШЬ-К или связанного с АРКТБ-К гена посредством методов генной терапии.

АРШЬ-К и его гомологи, продуцированные хозяевами, трансформированными последовательностями по изобретению, а также нативный АРШЬ-К, очищенный способами, известными в данной области, или полученный из известных аминокислотных последовательностей, пригодны в различных способах противораковых, противоопухолевых и иммунорегуляторных применений. Они также пригодны при терапии и способах, направленных на другие заболевания.

Другой аспект изобретения относится к применению полипептида, кодированного выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей АРШЬ-К, в «антисмысловой» терапии. В том смысле, как этот термин здесь используется, «антисмысловая» терапия относится к введению или продукции ίη зйн олигонуклеотидов или их производных, которые специфически гибридизируют в клеточных условиях с клеточной мРНК и/или ДНК, кодирующей интересующий лиганд для того, чтобы ингибировать экспрессию кодированного белка, т.е. путем ингибирования транскрипции и/или трансляции. Связывание может происходить на основе комплементарности пар оснований или, например, в случае связывания с ДНКдуплексами посредством специфических взаимодействий в основном желобке двойной спирали. В основном «антисмысловая» терапия относится к ряду методов, как правило, используемых в данной области, и включает любую терапию, основанную на специфическом связывании с олигонуклеотидными последовательностями.

«Антисмысловую» конструкцию по настоящему изобретению можно доставить, например, в виде экспрессирующей плазмиды, которая при транскрипции в клетке продуцирует РНК, которая является комплементарной по меньшей мере к части клеточной мРНК, которая кодирует Кау-лиганд. Альтернативно «антисмысловая» конструкция может быть олигонуклеотидным зондом, который получают ех νίνο. Такие олигонуклеотидные зонды предпочтительно представляют собой модифицированные олигонуклеотиды, которые устойчивы к эндогенным нуклеазам и поэтому стабильны в условиях ίη νίνο. Примерами молекул нуклеиновых кислот для использования в качестве «антисмысловых» олигонуклеотидов являются фосфорамидатные, фосфотиоатные и метилфосфонатные аналоги ДНК (см., например, патенты США 5176996, 5264564 и 5256775). Кроме того, имеется обзор по общим подходам к конструированию олигомеров, пригодных для «антисмысловой» терапии, например, у Vаη Эег Кго1 е1 а1. (1988) Вю1ес11пк|ие5 6:958-976; и 81еш е1 а1. (1988) Сапсег Кез 48:2659-2668, специально включенных здесь для сведения.

АРШЬ-К. по изобретению, как обсуждалось выше, является членом семейства ΤΝΡ-рецепторов. Белок, его фрагменты или гомологи могут иметь широкие терапевтические и диагностические применения.

Полипептиды по изобретению специфически взаимодействуют с АРКТБ, полипептидом, ранее описанным в ^099/12964, включенной здесь для сведения. Однако пептиды и способы, раскрытые здесь, создают возможность для идентификации молекул, которые специфически взаимодействуют с АРШЬ-К или его фрагментами.

Заявленное изобретение в некоторых воплощениях включает способы применения пептидов, производных АРШЬ-К, которые обладают способностью связываться с АРКТБ. Фрагменты АРШБ-К можно получить несколькими путями, например рекомбинацией, с помощью ПЦР, протеолитическим расщеплением или химическим синтезом. Внутренние или концевые фрагменты полипептида можно получить удалением одного или более нуклеотидов с одного конца или обоих концов нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид. Экспрессия мутировавшей ДНК дает фрагменты полипептида.

Фрагменты полипептида также можно синтезировать химическим путем с использованием методов, известных в данной области, таких как обычный способ Меррифилда с использованием 1-шос-или ΐ-Ьос в твердой фазе. Например, пептиды и последовательности ДНК по настоящему изобретению можно произвольно разделить на фрагменты желаемой длины без перекрывания фрагмента или разделить на перекрывающиеся фрагменты желаемой длины. Способы такие, как эти, описаны более подробно ниже.

Получение растворимых форм АРШЬ-К

Растворимые формы АРШЬ-К часто могут эффективно передавать сигналы, и, следовательно, их можно вводить в качестве лекарственного препарата, который уже имитирует естественную мембранную форму. Возможно, что заявленные здесь АРШЬ-К секретируются в естественных условиях в виде растворимых цитокинов, однако, если нет, то можно переконструировать ген для вынужденной секреции. Для создания растворимой секретируемой формы АРШЬ-К необходимо удалить на уровне ДНК Ν-концевые трансмембранные области и некоторый участок стволовой области и заменить их лидерной последовательностью типа I и, альтернативно, лидерной последовательностью типа II, что позволит про

- 6 005601 текать эффективному расщеплению в выбранной экспрессирующей системе. Специалисты в данной области могут менять размеры стволовой области, оставшейся в экспрессирующей конструкции для секреции в целях оптимизации как свойств связывания лиганда, так и эффективности секреции. Например, конструкции, включающие все возможные стволовые длины, т.е. Ν-концевые усечения, можно приготовить таким образом, что получатся белки, начинающиеся с аминокислот 1-52. Из данного типа анализа будут получены стволовые последовательности с оптимальной длиной.

Получение антител, реагирующих с ЛРК1Ь-К.

Изобретение также включает антитела, специфически реагирующие с заявленным АРКбЬ-К и его корецепторами. Антибелок/антипептид-антисыворотку или моноклональные антитела можно получать стандартными методами (см., например, АшЬоб1е8: А ЬаЬога!огу Мапиа1 еб. Ьу Наг1о\г апб Ьапе (Со1б 8ргшд НагЬог Рге§5: 1988)). Млекопитающее, такое как мышь, хомячок и кролик, можно иммунизировать иммуногенной формой пептида. Методы для предоставления иммуногенности белку или пептиду включают конъюгацию на носителях или другие методы, хорошо известные в данной области.

Иммуногенный участок АРКбЬ-К. или его корецепторов можно вводить в присутствии адъюванта. За течением иммунизации можно прослеживать по установлению титров антител в плазме или сыворотке. Можно использовать стандартные ЕЫ8А или другие иммуноанализы с иммуногеном в качестве антигена для оценки уровней антител.

В предпочтительном воплощении целевые антитела являются иммуноспецифическими для антигенных детерминант АРКЕЕ-К или его корецепторов, например антигенных детерминант полипептида по 8 ЕС ΙΌ N0:8 или тесно связанного человеческого или нечеловеческого гомолога млекопитающих (например, на 70, 80 или 90% гомологичного, более предпочтительно на 95% гомологичного). В еще одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения анти-АРКбЬ-К. или анти-АРКбЕ-корецепторыантитела в значительной степени не реагируют перекрестно (т.е. реагируют специфически) с белком, который, например, менее чем на 80% гомологичен по отношению к 8ЕО ΙΌ N0:8, предпочтительно менее чем на 90% гомологичен по отношению к 8Е0 ΙΌ N0:8 и наиболее предпочтительно менее чем на 95% гомологичен по отношению к 8Е0 ΙΌ N0:8. Выражение «в значительной степени не реагируют перекрестно» означает, что антитело имеет аффинность связывания для негомологичного белка, которая составляет менее 10%, более предпочтительно менее 5% и даже более предпочтительно менее 1% аффинности связывания для белка по 8Е0 ΙΌ N0:8.

Термин «антитело» в том смысле как он здесь используется, предназначен для включения его фрагментов, которые также являются специфически реагирующими с АРКЕЕ-К или его рецепторами. Антитела могут быть фрагментированы с использованием обычных методов, и фрагменты подвергнуты скринингу на применимость таким же образом, как описано выше для цельных антител. Например, Е(аЬ')₂фрагменты можно получить обработкой антитела пепсином. Полученный Е(аЬ')₂-фрагмент можно обработать для восстановления дисульфидных связей с получением ЕаЬ'-фрагментов. Антитела по настоящему изобретению дополнительно предназначены для включения биоспецифических и химерных молекул, обладающих анти-АРКЕЕ-К- или анти-АРКЕЬ-корецепторы-активностью. Таким образом, как моноклональные, так и поликлональные антитела (АЬ), направленные против АРКТЕ-К и их корецепторов, и фрагменты антител, такие как ЕаЬ' и Е(аЬ')₂, можно использовать для блокирования действия АРКГЕ-К и его соответствующих корецепторов.

Различные формы антител можно также приготовить с использованием стандартных методов рекомбинантной ДНК (^1и!ег апб М1к!еш, №1Шге 349:293-299 (1991), специально включенный здесь для сведения). Например, можно сконструировать химерные антитела, в которых домен связывания антигена из антитела животного связан с человеческим константным доменом (например, СаЬШу е! а1., патент США № 4816567, включенный здесь для сведения). Химерные антитела могут снизить наблюдаемые иммуногенные ответы на антитела животного происхождения, когда используются в клинике для лечения человека.

Кроме того, можно синтезировать рекомбинантные «гуманизированные антитела», которые распознают АРКЕЕ-К или его корецепторы. «Гуманизированные» антитела являются химерами, включающими в основном человеческие последовательности Ι§0, в которые вставлены области, ответственные за специфическое связывание с антигеном. Животных иммунизируют желаемым антителом, выделяют соответствующие антитела и удаляют участок последовательностей вариабельной области, ответственной за специфическое связывание с антигеном. Области связывания антигена от животных затем клонируют в соответствующее положение генов человеческих антител, в которых удалены области связывания антигена. «Гуманизированные» антитела сводят до минимума применение гетерологичных (т. е. межвидовых) последовательностей в человеческих антителах и, таким образом, маловероятно, что они будут вызывать иммунные ответы у обработанного субъекта.

Конструкцию различных групп рекомбинантных антител также можно проводить приготовлением химерных или «гуманизированных» антител, включающих вариабельные домены и человеческие константные домены (СН1, СН2, СН3), выделенные из различных классов иммуноглобулинов. Например, антитела с повышенными валентностями сайта связывания антигена можно получить рекомбинантным

- 7 005601 методом при клонировании сайта связывания антигена в векторы, несущие человеческие константные области цепей (Аги1апапбат с1 а1., 1. Ехр. Меб. 177:1439-1450 (1993), включенный здесь для сведения).

Кроме того, обычные методы рекомбинантной ДНК можно использовать для изменения аффинности связывания рекомбинантных антител с их антигенами изменением аминокислотных остатков в окружении сайтов связывания антигена. Аффинность связывания антигена «гуманизированного» антитела может быть повышена мутагенезом, основанным на молекулярном моделировании (Оиееи е1 а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. 86:10029-33 (1989)), включенный здесь для сведения.

Получение аналогов: продукция измененных ДНК и пептидных последовательностей

Аналоги АРК1Ь-К могут отличаться от имеющегося в естественных условиях АРК1Б-К по аминокислотной последовательности или другим свойствам, не связанным с последовательностью, или по обоим. Не связанные с последовательностью модификации включают химическую дериватизацию АРКЛ-К ίη νίνο или ίη νίΐτο. Не связанные с последовательностью модификации включают, но не ограничиваются изменениями в результате ацетилирования, метилирования, фосфорилирования, карбоксилирования или гликозилирования.

Предпочтительные аналоги включают биологически активные фрагменты АРИ1Б-И. чьи последовательности отличаются от последовательности, представленной в 8ЕС ΙΌ N0:8, одной или более консервативной заменой аминокислот или одной или более неконсервативной заменой аминокислот, делениями или вставками, которые не приводят к потере активности АРК1Ь-лиганда. Консервативные замены обычно включают замену одной аминокислоты на другую с одинаковыми свойствами, например замены внутри следующих групп: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин. Применения

Полную длину гена АРК1Б-К (8Е0 ΙΌ N0:8) или его участки можно использовать в качестве зондов гибридизации для библиотеки кДНК для выделения, например, еще других генов, которые обладают желаемой идентичностью последовательности по отношению к последовательности АРК1Б-В, раскрытой в 8Е0 ΙΌ N0:6. Нуклеотидные последовательности, кодирующие АРК1Ь-К, также можно использовать для конструирования зондов гибридизации в целях картирования гена, который кодирует АРИЕ-К, и для генетического анализа индивидуумов с генетическими нарушениями. Скрининг может быть построен таким образом, чтобы найти основные соединения, которые подражают биологической активности АРК1Б-К. Подобный скрининг будет включать тесты, предназначенные для скрининга с высокой пропускной способностью химических библиотек, делая их особенно пригодными для идентификации небольших молекул, кандидатов для лекарственных препаратов. Предполагаемые небольшие молекулы включают синтетические органические или неорганические соединения. Нуклеиновые кислоты, которые кодируют АРИ1Б-И или его модифицированные формы, можно также использовать для получения или трансгенных животных, или «сконструированных» животных, которые, в свою очередь, пригодны при разработке и скрининге терапевтических полезных реагентов, включая, например, реагенты против ракового заболевания.

АРК1Б-К и гомологи, полученные от хозяев, трансформированных последовательностями по изобретению, а также нативный АРК1Б-В, очищенный способами, известными в данной области, или полученный по известным аминокислотным последовательностям, являются пригодными в различных способах противораковых применений.

В одном воплощении изобретения обеспечивается способ лечения млекопитающего от состояния, связанного с нежелаемой пролиферацией клеток, назначением млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, включающей антагонист АРК1Б-В, где антагонист АРВ1Б-Р содержит полипептид, который противодействует взаимодействию между АРК1Ь-К и его родственным рецептором или рецепторами, с фармакологически приемлемым наполнителем.

В предпочтительном воплощении родственным рецептором АРК1Б на поверхности клетки является ВСМА.

Способ можно использовать с любым антагонистом АРК1Б-В, который имеет полипептид, который противодействует взаимодействию между АРРбЬ и его родственным рецептором или рецепторами. Примеры антагонистов АРК1Б-Р включают, но не ограничиваются растворимым полипептидом АРК1Ь-К, включая, но не ограничиваясь растворимым ВСМА; растворимыми химерными молекулами АРК1Ь-К, включая, но не ограничиваясь ВСМА-1дС-Бс, и гомологами анти-АРК1Ь-К-антитела, включая, но не ограничиваясь анти-ВСМА моноклональным антителом.

Способ по изобретению можно использовать при любом состоянии, связанном с нежелаемой пролиферацией клеток. В частности, способы по настоящему изобретению можно использовать для обработки опухолевых клеток, которые экспрессируют АРК1Ь и/или АРК1Б-К (т.е. ВСМА).

Примеры раковых заболеваний, где пролиферация клеток модулируется под действием АРК1Ь, можно тестировать при определении в условиях ίη νίίτο уровня мРНК, АРК1Ь и/или АРК1Ь-К (т.е. ВСМА), экспрессированной в библиотеках опухолевых тканей. Библиотеки опухолевых тканей, в которых имеется высокая экспрессия мРНК АРК1Ь и/или АРШЬ-К (т.е. ВСМА), будут кандидатами. Альтернативно, можно провести скрининг кандидатов при поиске в общедоступных или частных базах данных (т.е. база данных !ису1е) с помощью, например, полной длины последовательности кДНК АРК1Ь. С ис

- 8 005601 пользованием этих методов было установлено, например, что экспрессия мРНК ЛРК1Ь обнаружена в большом ряде типов опухолей, включая, но не ограничиваясь таковыми, найденными в табл. 1 ниже.

Таблица 1 Описание библиотеки

Линия опухоли простаты ЬЦСаР, СА, 50М, нелеченные, ТЮК

Т-лимфоцитарная опухоль, лимфома, ТЮК

Опухоль яичника, папиллярная серозная цистаденоСА

Легкое, шм/аденоСА, ΟΟΡϋ, 47М

Опухоль молочной железы, аденоСА, 46Р, Зив, т/ВКЗТЫОТЗЗ

Ганглий, дорсальный корень, цервикальный, ам/лимфома, 32М, ΝΟΚΜ

Опухоль мозга, лобная, нейронная неоплазма, 32М

Опухоль простаты, аденоСА, 59М, Зив, ΙΠ./ΡΚΟ3ΝΟ3Τ19

Опухоль ободочной кишки, печеночный изгиб, аденоСА, 55М, Зив, ш/СОЬАТМТ01

Опухоль поджелудочной железы, ТЮК

Опухоль параганглия, параганглиома, ам/почечноклеточная СА, 46М

Молочная железа, шм/проточная СА, 43Г, т/ВКЗТТОТЮ

Опухоль почки, почечноклеточная СА, 51Г

Мочевой пузырь, шы/ТССА, СА ίη зхДи, 60М, т/ВЬАОТиТ04

Опухоль матки, эндометриальная, Г, ТЮК

Простата, ВРН, т«/аденоСА, ΡΙΝ, 59М

Легкое, т^/аденоСА? 53М, ιη/ΣυΝΟΤυΤ17

Костная опухоль/линия, МС-63, остеоЗАК/гигантоклеточная, М/Г, пул, КР

Мозг, лобная кора, аш/легочная СА, 77М

Опухоль ободочной кишки, аденоСА, ΝΟΚΜ, Зив, ССАР

Опухоль легких, плоскоклеточная СА, 57М

Легкое, ιην/аденоСА, , 63М

Простата, АН, ши/аденоСА, 50М, го/ΡΚΟΞΤϋΤθΙ

Периферическая кровь, В-лимфоциты, СЬЪ, пул, ΝΟΚΜ, З'ССАР

Опухоль ободочной кишки, аденоСА, пул, ΝΟΚΜ, 3'/5'СОАР

Почка, тк/почечноклеточная СА, 8,53Г, пул, ΝΟΚΜ

Яичник, дермоидная киста, 22Г

Опухоль ободочной кишки, аденоСА, ΝΟΚΜ, З'ССАР

Опухоль ободочной кишки, аденоСА, З'СОАР

Простата, ВРН, тм/аденоСА, 70М, зив

Опухоль яичника, метастазы аденоСА ободочной кишки, 58Г

Матка, миометрий, шн/лейомиома, 43Г

Тонкий кишечник, подвздошная кишка, тк/сис, 25Г

Лимфатический узел, перипанкреатический, ам/поджелудочной железы аденоСА, 65М_______________________________________________

Яичник, ам/лейомиома, 36Г, ΝΟΚΜ

Легкое, ши/веретеноклеточная карцинома, 62Г

Опухоль легкого, плоскоклеточная СА, 50М

Опухоль мозга, менингиома, 36М

Опухоль, аденоСА, 65Г, γπ/ΡΑΝΟΝΟΤ08

Опухоль, шу//эндобронхиальная карциноидная опухоль, ЗЗМ

Надпочечник, пм/феохромоцитома, 43Е, ш/АОКЕТиТ07

Опухоль мозга, лобная, менингиома, 50М

Опухоль почки, раковое заболевание с четким типом клеток, пул,

ΝΟΚΜ, З'ССАР_______________________________________________________

Молочная железа, тм/дольковая СА, 67Г

Легкое, ты/метастазы остеоЗАК, а^/плевральные метастазы, 58М,

ΝΟΚΜ _______________________________________________________

Опухоль простаты, аденоСА, 59М, Зив, ιπ/ΡΚ08Ν0Τ19

Опухоль тонкого кишечника, подвздошная кишка, метастазы эндометриальной аденоСА, 64Г______________________________________

Опухоль яичника, аденоСА, 58Г

Молочная железа, заболевание молочной железы ΝΓ, 46Р

Опухоль мозга, лобная, метастазы гипернефромы, 58М

Опухоль почки, ϊίΐπβ, пул, ИМ/ИК

- 9 005601

Легкое, тт//метастазы СА щитовидной железы, 7ЭМ, πι/ΈυΝΟΤυΤ02

Опухоль легкого, метастазы СА щитовидной железы, 79М, ш/ЬОТЮЫОТОЗ

Опухоль паращитовидной железы, аденома, М/Г, ΝΟΚΜ, ИМ

Опухоль поджелудочной железы, анапластическая СА, 45Г

Яичник, ши/муцинозная цистаденоСА, 43Е, т/ОУАКТиТ01

Опухоль легкого, плоскоклеточная СА, пул, ΝΟΗΜ, ССАР

Опухоль молочной железы, аденоСА, 46Е, ιη/ΒΚ3ΤΝΟΤ17

Матка, тю/лейомиома, ат//аденоСА ободочной кишки, 4 5Е

Легкое, тм/аденоСА, ам/узловые, диафрагмальные метастазы, 63Г

Опухоль молочной железы, аденоСА, 4 6Е, т/ВКЗТЫОТЗЗ

Опухоль простаты, аденоСА, 66М, πι/ΡΚΟ3ΝΟΤ15, ΡΗΟΒϋΙΝΟΙ

Опухоль молочной железы, аденоСА, 54Г, πι/ΒΚ3ΤΝΟΤ03

ЭмОриональная опухоль, пул, ЗЦВ, З'ССАР

Костный мозг, большеберцовая кость, аМ/метастазы альвеолярной рабдомиоЗАК, 16М

Простата, АН, ши/аденоСА, 57М, т/РКОЗТЦТ04

Молочная железа, РЕ изменения, тиУаденоСА, 55Г, т/ВКЗТТЦТ01

Опухоль матки, серозная папиллярная СА, Е, пул, З'ССАР

Опухоль яичника, муцинозная цистаденоСА, 43Е, т/ОУАКИОТОЗ

Молочная железа, РГ изменения, тт//аденоСА, внутрипроточная СА, 43Е

Молочная железа, тт//проточная СА, СА ίη зтйи, ат//метастазы лимфатических узлов, 62Е

Опухоль нейроганглия, ганглионеврома, ЭМ

Опухоль поджелудочной железы, аденоСА, З'ССАР

Опухоль матки, эндометриальная аденоСА, Г, пул, З'ССАР

Опухоль легкого, нейроэндокринная карциноидная опухоль, пул, ΝΟΚΜ, З'ССАР.

СА - карцинома; ЗАК - саркома

Антагонисты АРШЬ-К как объект изобретения используются при лечении состояний, связанных с нежелаемой пролиферацией клеток, в частности при лечении опухолей, преимущественно ингибируют рост опухолевых клеток более, чем на 10, 20, 30 или 40% и наиболее преимущественно более чем на 50%. Антагонисты АРК1Ь-К получают в результате скрининга (см., например, обсуждение в примере 6). Например, антагонисты АРК1Ь-К можно отобрать на основе активности ингибировать рост (т.е. более чем на 10, 20, 30, 40 или 50%) карциномы ободочной кишки НТ29 человека или карциномы легких А549 человека (см., например, обсуждение на фиг. 15), которые происходят соответственно из опухоли ободочной кишки и легкого.

Другое воплощение изобретения обеспечивает способы ингибирования роста В-клеток и клеток, не относящихся к В-клеткам, индуцированного дендритными клетками роста В-клеток и созревания или продукции иммуноглобулинов у животного с использованием полипептида АРК1Ь-К.

В другом воплощении изобретение обеспечивает способы применения АРШЬ-К при лечении аутоиммунных заболеваний, гипертензии, сердечно-сосудистых нарушений, почечных нарушений, Вклеточных лимфо-пролиферативных нарушений, иммуносупрессорных заболеваний, при трансплантации органов, воспаления и заболевания, связанного с вирусом иммунодефицита человека. Также включены способы применения агентов для лечения, подавления или изменения иммунного ответа, включающего пути передачи сигналов между АРК1Ь-К и его лигандом.

Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции, включающие полипептид АРК1Ь-К и фармацевтически приемлемый наполнитель. Подходящие носители для полипептида АРК1Ь-К, например, и их композиции описаны в Кешшд1оп' РЬагшасеиИса1 Заепсез. 16^4Ь еб., 1980, Маск РиЫЕЫид Со., ебйеб Ьу Оз1о е! а1. Как правило, в композиции используется соответствующее количество фармацевтической приемлемой соли для того, чтобы сделать композицию изотонической. Примеры носителя включают буферы, такие как физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Значение рН раствора предпочтительно равняется от примерно 5 до примерно 8 и более предпочтительно от примерно 7,4 до примерно 7,8. Дополнительные носители включают препараты для непрерывного высвобождения, такие как полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, когда матрицы находятся в виде имеющих определенную форму частиц, например липосом, пленок или микрочастиц. Специалистам в данной области, очевидно, будет понятно, что некоторые носители будут более предпочтительными в зависимости, например, от пути введения и концентрации полипептида АРК1Ь-К, который вводится.

- 10 005601

Введение можно осуществлять инъекцией (например, внутривенной, внутрибрюшинной, подкожной, внутримышечной) или другими способами, такими как инфузия, для обеспечения доставки в кровяное русло в эффективной форме.

В практике настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иначе, обычные методы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, химии белков и иммунологии, которые известны специалистам в данной области. Эти методы описаны в литературе. См., например, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 2'¹ ебШоп. (8атЬгоок, ЕгбксН апб Машабк, ебк.), Со1б 8ртшд НагЬог ЕаЬогаЮгу Ргекк, 1989; ^NΑ С1ошпд: Уо1итек I апб II (Ό.Ν. С1оуег. еб.), 1985; 011допис1еоббе 8уп1Нек1к (М.1. СаИ, еб.), 1984; патент США № 4683195 (МиШк еί а1.); Шс1ек Ас1б НуЬпб|/а1юп (Β.Ό. Натек апб 8.1. Шддтк, ебк.), 1984; Тгапкспрбоп апб Тгапк1абоп (Β.Ό. Натек апб 8.1. Шддтк, ебк.), 1984; Сибиге ок Ашта1 Се11к (К.1. ЕгекЬпеу, еб.). А1ап К. Шк, 1пс., 1987; 1ттоЫНхеб Се11к апб Епхутек, 1КЬ Ргекк, 1986; А Ргас(1са1 Сшбе к Мо1еси1аг С1ошпд (В. РегЬа1), 1984; МеШобк ш Еп/утокду, Уо1итек 154 апб 155 (Аи еί а1., ебк.), Асабетк Ргекк, №\у Уогк: Сепе ТгапкГег УесЮгк Гог МаттаНап Се11к (кН. М111ег апб М.Р. Са1ок, ебк.), 1987; Со1б 8рппд НагЬог ЕаЬогаЮгу: 1ттипос11етка1 Мебюбк ш Се11 апб Мо1еси1аг Вк1оду (Мауег апб Аа1кег, ебк.). Асабетк Ргекк, Ьопбоп, 1987; НапбЬоок оГ Ехрептеп! 1ттипо1оду, Уо1итек Ι-ΐν (Э.М. Аен апб С.С. В1аск\уе11, ебк.), 1986; Машри1аР шд 1Не Мойке ЕтЬгуо, Со1б 8рппд НагЬог ЕаЬогаЮгу Ргекк, 1986.

Следующие примеры предоставлены для иллюстрации настоящего изобретения, и их не следует рассматривать, как ограничивающие его.

Примеры

В примерах, раскрытых ниже, использовали следующие методы.

Методы

Клонирование и экспрессия тус-меченного мышиного АРКШ (ССМ776) в РкЫа рак1ог1к

Экспрессирующий вектор рССМ213.10 конструировали, взяв РЭК004 (Н98 тиАРКШ с включающим высший ЕА8-лиганд «стволом», соединенным с Ν-концом вместе с ЕЬАС-эпитоп-меткой) и вырезав кодирующую последовательность ти АРКШ из 8ас I в Νϋί1. Синтетические олигонуклеотиды ЬТВ-559 и 560 образуют линкер Х1ю-1-8ас1, который включает лидерную последовательность с альфа-фактором скрещивания, тус-эпитоп-метку, а также мотив КЕЬ из ЕА8-лиганда. Фрагмент тиАРКШ и линкер лигировали в сайтах Х1ю-1-№11 в рсст211, экспрессирующей плазмиды РкЫа ракЮпк.

РССМ213.10 линеаризовали 8ίυ1, подвергали электропорации в штамм С8115 (Ык4-) и высевали в минимальной среде, содержащей декстрозу. Ш84-трансформанты анализировали на экспрессию белка посевом единичной представительной колонии в обогащенную среду (ВМСУ: забуференную, содержащую глицерин, сложную среду) и давали возможность расти до плотности в течение 48 ч при 30°С. Культуры центрифугировали и клеточные осадки ресуспендировали (1:5) в обогащенной индукционной среде, содержащей 1,5% метанола (ВММУ: забуференная, содержащая метанол, сложная среда). Через двое суток индукции при 30°С, супернатанты подвергали 8Э8-РАСЕ и оценивали на присутствие тиАРКШ. Окрашивание Кумасси и вестерн-блоттинг (с анти-тус-тАЬ9Е 10) показывали, что один штамм, ССМ776, продуцировал адекватные количества гликозилированной формы белка тус-меченного Н98 тиАРКШ.

Очистка тус-тАРКШ

Мус-тАРКШ, белок из 149 аминокислот, экспрессировали в ркЫа. Данный белок имеет изоэлектрическую точку 7,45. 175 мл супернатанта ркЫа диализовали против 10 мМ Трис буфера, рН 6,8 в течение ночи и затем пропускали через колонку 8Р емкостью 20 мл. Колонку тщательно промывали 10 мМ Трис-НС1 буфером, рН 6,8 и элюировали 250 мМ №1С1 в РВ8. Вторую стадию очистки проводили с использованием колоночной гель-фильтрации (8300). Фракции, содержащие тус-АРКШ, с колонки 8Р емкостью 20 мл концентрировали центрифугированием до объема 7 мл. После гель-фильтрации заявители получали 8 мг тус-АРКШ·, который детектировали по оптической плотности и окрашенному Кумасси гелю. Заявители также провели вестерн-блоттинг с использованием мышиных моноклональных антител 9Е10 (анти-тус), в котором было показано, что тус-метка была интактной после стадий очистки. Ν-концевая последовательность подтверждала, что очищенный белок соответствует тус-тАРКШ.

Очистка ЕЬАС-человеческого АРКШ·

Плазмиду рк429 (в последующем названную р1448) использовали для временной трансфекции клеток 293Т с использованием липофектамина (СЛсо-Вй) и несодержащей сыворотку среды. Плазмиду, конструировали в экспрессирующем векторе млекопитающих РСК3 (Зпубгодеп), кодирует домен связывания рецептора человеческого АРКШ с Ν-концевым белком в клеточной культуральной среде. Белок ЕЕАС-АРКШ выделяли из несодержащей сыворотку среды с использованием колонки с анти-ЕЕАС-шАЬ М2 и избытка пептида ЕЬАС, следуя рекомендациям производителя (Кобак).

Очистка НСВСА-Рс

НВСМА-Ес временно трансфицировали в клетки 293. Кондиционированную среду от клеток 293 с гиперэкспрессией ЬВСМ-Ес наносили на колонку с белком А. Белок элюировали с использованием 25 мМ фосфатного 100 нМ №1СЕ рН 2,8 с последующей нейтрализацией 1/20 объема 0,5М NаР0₄, рН 8,6. Отобранные по оптической плотности при 280 нм фракции подвергали 8Э8-РАСЕ в восстанавливающих

- 11 005601 и невосстанавливающих условиях и вестерн-блоттингу для идентификации очищенного белка. Из 500 мл кондиционированной среды было получено 3 мг белка.

Мус-тАРК1Ь связывается с различными клеточными линиями в анализе ЕАС8

450 нг/мл очищенного тус-тАРШЬ связывали с клеточными линиями в 100 мкл РВ8/2%ЕВС+Есблокирующие реагенты (ЕсВ1оск @ 20 мкг/мл (РНагтшдеп)) и очищенного человеческого 1дС @ 10 мкг/мл (Бапбох) на льду в течение 1 ч. Положительное связывание выявляли с использованием специфической кроличьей анти-мышиной к АРКЪЬ антисыворотки (1:500) и ослиного антикроличьего IдС-ΕIΤС Цасккоп). Клеточные линии А20, Кар, ΝΙΗ3Τ3 и НТ29 поддерживали в среде, как предложено поставщиком (АТСС ВеИекба, МИ). Клетки В1АВ культивировали в НЕРЕ8-забуференной среде Κ₽ΜΙ с добавление 10% ЕВ8 и Ь-глутамина. В конкурентных тестах добавляли 450 нг/мл тус-мышиного АРКЪЬ с 1 мкг/мл конкурентного белка.

Пример 1. Детектирование связывания АРКЪЬ с АРКЬЬ-К с использованием теста чашек.

В данном примере анализировали связь ВСМА с АРКЗЬ.

Для того, чтобы тестировать, насколько ВСМА связывается с АРКЪЬ, заявители провели опыт по коиммунопреципитации. В данном примере использовали растворимые белки НВСМА-Ес и тус1ПАРК+.

НВСМА-Ес и ПЬЕ-Ес добавляли с различными ΤΝΕ-лигандами:

тус-тАРК1Ь; тус-СЭ40Ь и тус-КАМ<+ в среду, содержащую 10% ЕВС, на 1/2 ч при комнатной температуре. Ес-белки связывали с гранулами, нагруженными белком А, в течение 1-2 ч, промывали три раза 1 мл РВ8, анализировали иммуноблоттингом с мышиными моноклональными 9Е10 (анти-тус) антителами и выявляли с использованием усиленной хемилюминесценции.

Заявители обнаруживали тус-АРК1Ь в иммунопреципитатах НВСМА-Ес, что указывает на то, что ВСМА взаимодействует с АРКЗЬ специфическим образом, поскольку другие ΤΝΕ-лиганды, тус-СО40Ь и тус-ΚΛΝΚΕ не обладали способностью связываться с ВСМА. Мус-АРК1Ь не связывается с ПЪК,-Ес.

Ту же мембрану очищали и повторно ставили блоттинг с анти-ЫС-НКР для того, чтобы показать, что то же количество ЕЛЬК-Ес с ВСМА-Ес использовали в иммунопреципитатах.

Пример 2.

В данном примере описывается, что НВСМА-Ес взаимодействует с ЕЬАС-ЬАРШЬ.

Анализ ЕЫ8А: покрытые рецепторными слитыми Ес-белками планшеты (НВСМА-Ес-739 или 1+^^2+^492) с концентрацией 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6 в течение ночи, при 4°С. Блокировали в течение 2 ч при комнатной температуре с использованием РВ8/5% обезжиренного сухого молока/0,5% Твина-20. Готовили двукратные последовательные разведения лигандов в 100 мкл блокирующего буфера (ЮТа-197 из 1000 нг/мл, тиВАЕЕ-657 из 1000 нг/мл, 11АРК+-507 из 2000 нг/мл (неактивный), 11АРК+-429 из пятикратно концентрированной среды). После инкубирования с лигандами планшет промывали РВ8/5% Твин-20 и зондировали 0,5 мкг/мл анти-ЕЕАС-тАЬ М2 в буфере для разведения. Антитела детектировали с использованием анти-мышиных-РО 1/2000 с энзиматическим выявлением (ОРИ).

Опыты по иммунопреципитации: клетки 293Т трансфицировали указанной экспрессирующей плазмидой (Кес-Ес или ЕЬАС-лиганд) в чашке диаметром 9 см. Трансфицированные клетки оставляли на 5 суток в 8 мл среды ОрЕшеш (С1Ьсо-ВКЬ). Иммунопреципитацию проводили при смешивании 200 мкл содержащей каждый рецептор кондиционированной среды с 200 мкл содержащей каждый лиганд кондиционированной средой+400 мкл РВ8+10 мкл Рго1С-сефарозы. Все это вращали в течение 1 ч на роторе, 4 раза промывали 1 мл РВ8, затем кипятили в 50 мкл буфера для образца (+ΌΤΤ). 20 мкл из каждой реакции иммунопреципитации наносили дорожку. Оценку результатов блоттинга проводили с помощью 1 мкг/мл анти-ЕЬАС-тАЬ М2 (81дта, 81 Ьошк МО) и анти-мышиными-РО (1/2000). Также блоттинг проверяли с античеловеческими-РО: 100 мкл кондиционированной среды осаждали смесью МеОН/СНС1₃/лизоцим. Эту смесь кипятили в 50 мкл буфера для образца (+ΌΤΤ) и 20 мкл нагружали. Оценку блоттинга проводили с анти-ЕЬАС-тАЬ М2 (1 мкг/мл) и анти-мышиными-РО (1/2000).

Пример 3.

В данном примере описывается связывание тус-тАРК1Ь; НКауЬ-440 (НВАЕЕ) и ЕЬАС-тВАЕЕ с НВСМА-Ц, ЬЬ'Г-К.Лд или Нр80 ΤΝΊ+-+

Все опыты проводили при 25°С со скоростью потока 10 мкл/мин.

Каждый опыт проводили с использованием НВ8 буфера (10 мМ НЕРЕ8, 150 мМ №С+ 0,005% поверхностно-активного вещества Р20 при рН 7,4). Этот же раствор использовали в качестве элюирующего буфера и в качестве разбавителя для проб.

Вначале поверхность чипов СМ5 активировали №гидрокси-сукцинимид/№этил-№-(3диэтиламинопропил)карбодиимидом гидрохлоридом (ВЩсоге). 20 мкл НВСМАЛд, 15 мкл 1+++05-^ и 10 мкл 1380+^+ разбавленные до 30 мкг/мл 10 мМ уксусной кислотой, затем блокировали один раз 30 мкл и повторно 15 мкл этанол-амина-НС1 (рН 8,5). Это приводило к поверхностной плотности 16003700 резонансных единиц (КИ). Чипы регенерировали 20 мкл 1 мМ муравьиной кислоты. Эти удаления повторяли пять раз для установления воспроизводимого и стабильного фона.

- 12 005601

Для опыта 100 мкл шус-шАРКГЬ, ЬКауЬ-400 и РЕАС-шБАРР, каждого, разбавляли до 30 мкл/мл буфером для разбавления и наносили по поверхности чипов. Сразу же после каждого нанесения чипы промывали 500 мкл буфера для разбавления. Поверхность регенерировали между опытами нанесением 20 мкл 1 мМ муравьиной кислоты, затем еще нанесением 15 мкл муравьиной кислоты. После регенерации чипы уравновешивали буфером для разведения.

Пример 4. Получение растворимых форм рецептора.

Для приготовления ингибитора рецептора для применения у людей необходима последовательность кДНК внеклеточного домена человеческого рецептора. Если мышиная форма известна, библиотеки человеческой кДНК можно легко подвергнуть скринингу с использованием последовательности мышиной кДНК и подобные манипуляции обычно проводят в данной области. С последовательностью человеческой кДНК можно приготовить олигонуклеотидные праймеры для амплификации в ПЦР внеклеточного домена рецептора при отсутствии трансмембранного и внутриклеточного доменов. Как правило, он включает большую часть аминокислот между последним связанным дисульфидной связью «Т№доменом» и трансмембранным доменом. Можно изменять количество включенной «стволовой» области для оптимизации активности полученного растворимого рецептора. Данный амплифицированный участок следует перестроить для включения подходящих сайтов рестрикции для предоставления возможности клонирования в различные С-концевые Гд-слитые химерные векторы. Альтернативно можно вставить стоп-сигнал в 3'-конце и приготовить растворимую форму рецептора без повторного сортинга для использования Гд-слитой химеры. Полученные векторы можно экспрессировать в большинстве систем, используемых в биотехнологии, включая дрожжи, клетки насекомых, клетки бактерий и млекопитающих, и существуют примеры для всех типов экспрессии. Можно присоединить различные человеческие Рс-домены для оптимизации или элиминации РсК и комплементарных взаимодействий по желанию. Альтернативно можно использовать мутировавшие формы данных Рс-доменов для избирательного удаления РсК, или комплементарных взаимодействий, или присоединения Ν-связанных сахаров к Рсдомену, который имеет некоторые преимущества.

Пример 5. Получение агонистических или антагонистических антител.

Вышеописанные растворимые формы рецепторов можно использовать для иммунизации мышей и приготовления моноклональных антител обычными методами. Полученные шАЬк, которые идентифицируются ЕЫ8А, можно затем подвергнуть скринингу на агонистическую активность либо в виде растворимых антител, либо иммобилизованных на пластмассе в различных клеточных тестах ш νίΐτο. Часто гибель клеточной линии НТ29 представляет подходящую систему, которая чувствительна к передаче сигналов через многие Т№-рецепторы. Если данная линия не имеет интересующий рецептор, полную длину данного рецептора можно стабильно трансфицировать в линию НТ29 для того, чтобы предоставить возможность протекать тесту на цитотоксичность. Альтернативно, эти клетки можно использовать в аппарате Су1о8еп§ог для оценки того, насколько активация рецептора может вызывать изменение рН, что свидетельствует о передаче сигнала. Семейство ΊΝΕ-рецепторов передает сигналы в таком формате, и для данного метода не требуется знать, какие действительные биологические события «запускаются» рецептором. Агонистические шАЬк следует «гуманизировать» перед использованием в клинике. Этот метод можно также использовать для определения антагонистических шАЬк. Подобные шАЬк будут определяться по отсутствию агонистической активности и способности ингибировать взаимодействия рецептор-лиганд, что прослеживается ЕЫ8А, классическими методами связывания или ВГАсоге. Наконец, индукция секреции хемокинов различными клетками в ответ на агонистическое антитело может быть тестом для скрининга.

Пример 6. Скрининг ингибиторов взаимодействия рецептор-лиганд.

Используя рецепторный-Гд-слитый белок, можно тестировать комбинаторные библиотеки на молекулы, которые могут непосредственно связываться с рецептором. Затем данные молекулы можно тестировать в ЕЫ8А с использованием рецепторного-Гд-слитого белка и растворимой формы лиганда на способность ингибировать взаимодействие рецептор-лиганд. ЕЬГ8А можно непосредственно использовать для скрининга библиотек различных естественных продуктов и т.д. на ингибирующие соединения. Рецептор можно трансфицировать в клеточную линию, такую как линия НТ29, для постановки биологического теста (в данном случае по цитотоксичности), который затем может дать тест для скрининга.

Пример 7. Ингибирование роста опухолей ш νί\Ό.

Эффективность ВСМА-Гд в качестве антагониста роста опухолей тестировали с использованием ряда различных линий опухолевых клеток в условиях ш νί\Ό. Для этих исследований использовали бестимусных мышей (Νυ/Νυ) с иммунодефицитом и опухолевые клетки имплантировали подкожно. Для опухолевой линии 8А480, которая обладает агрессивным ростом, заявители имплантировали 8х10⁵ клеток в 100 мкл не содержащего пирогенов, стерильного РВ8. Одну контрольную группу оставили необработанной (п=5), в то время как другим группам ввели 100 мкг контрольного-Гд (п=6) и 100 мкг ВСМА-Гд (п=6). Введение начали непосредственно перед имплантацией с последующим введением каждые 7 суток. Диаметр опухолей определяли микрометром и вычисляли объем с использованием формулы объем=4/3 Пг³.

Карцинома ободочной кишки 8А480 растет очень быстро на модели мышей Νυ/Νυ, и пальпируемые опухоли обнаруживали через 10 суток. Через 24 суток средний объем опухолей в контроле составлял 0,3 см³,

- 13 005601 в то время средний объем опухолей у мышей, обработанных ВСМА-1д, равнялся 0,19 см³, снижение опухолевой нагрузки на 46%. Карцинома ободочной кишки НТ29 также растет агрессивно на модели мышей Ыи/Ыи. Для этих опытов 1 χ 10⁶ клеток в 100 мкл не содержащего пирогенов, стерильного РВ8 имплантировали подкожно, и схема введения была аналогичной, описанной для 8А480. Пальпируемые опухоли обнаруживали через 7 суток, и в контрольных группах большая часть опухолей росла очень быстро. Через 42 суток средний объем опухолей в контрольных группах (необработанные и обработанные контрольным-^, п=12) равнялся 0,485 см³, в то время как средний размер опухолей в обработанной ВСМА-1д группе (п=5) составлял 0,095 см³, снижение опухолевой нагрузки на 80%. Через 50 суток 30% мышей в контрольной группе были оценены, как находящиеся на терминальной стадии за счет размера опухолей более 1,5 см³, и опыт был остановлен. В противоположность контрольной группе 0% мышей в группе, обработанной ВСМА-1д, было оценено, как находящиеся на терминальной стадии. Эти результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2 Объемы опухолей и летальность на модели НТ29 через 50 суток лечения

Контрольные животные (необработанные и обработанные контрольным 1д)	Обработанные ВСМА-1д
Объем опухолей	Терминальная стадия	Объем опухолей	Терминальная стадия
0,22	-	0,11	-
0,22	-	0,32	-
0,35	-	0,13	-
0,61	-	0, 56	-
0,73	-	0,33	-
1,74	+
2,53	+
1,51	+
0,90	-
0,44	-
0,32	-
1,92	±	-	-
В среднем: 0,96	%: 30	В среднем: 0,29	%:0

Она показывает 70% снижение объема опухоли и достоверное воздействие на смертность на модели роста опухоли НТ29 с использованием обработки ВСМА-1д.

Линия карциномы легкого А549 растет медленнее, чем линии карциномы ободочной кишки, описанные выше. Для этой клеточной линии заявители имплантировали 1 χ 10⁶ клеток в 100 мкл не содержащего пирогенов, стерильного РВ8 и обрабатывали с использованием схемы, описанной выше. Пальпируемые опухоли обнаруживали примерно через 20 суток после имплантации. Через 50 суток после имплантации опухолей средний объем опухолей в контрольных группах (необработанные и обработанные контрольным 1д; п=16) составлял 0,2 см³, в то время как средний объем в группе, обработанной ВСМА1д (=7), равнялся 0,1 см³, снижение объема опухолей на 50%. В группе, обработанной ВСМА-1д, у 57% мышей объем опухолей был менее 0,1 см³ через 50 суток, в то время как только 6% контрольных обработанных мышей сохраняли такую небольшую опухолевую нагрузку. Через 60 суток после имплантации опухолей средний объем опухолей в контрольной группе увеличивался до 0,3 см³. В противоположность средний объем опухолей в группе, обработанной ВСМА-1д, составлял по-прежнему менее 0,2 см³ (0,188).

Для мышиной линии ΝΙΗ3Τ3, которая также растет медленнее, чем линии карциномы ободочной кишки, заявители имплантировали 5χ10⁶ клеток в 100 мкл не содержащего пирогенов, стерильного РВ8 и обрабатывали, как описано выше. Клетки ΝΙΗ3Τ3 образовывали фибросаркому при подкожной имплантации у мышей Ыи/Ыи. Через 4 недели обнаруживали пальпируемые опухоли, и в контрольных группах (п=11) эти опухоли вырастали в течение последующих 10 суток до объема, достигающего среднего значения 0,136 см³. В противоположность объем опухолей в группе, обработанной ВСМА-1д (п=5), достигал значения только 0,03 см³, 78% снижение опухолевой нагрузки. На 48 сутки после имплантации средний объем опухолей в контрольных группах достигал 1,6 см³, в то время как средний объем опухолей в группе, обработанной ВСМА-1д, равнялся только 0,8 см³, 50% снижение объема опухолей. К 52 суткам 82% (9/11) животных в контрольных группах было оценено, как находящиеся на терминальной стадии, основываясь на объеме опухолей, который составлял более 1,5 см³, только 18% животных оставалось живыми. В противоположность 40% (2/5) животных в группе, обработанной ВСМА-1д, имело опухоли такого объема, что их необходимо было убить, в живых оставалось еще 60% животных. Эти результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Данные по выживаемости на модели ΝΙΗ3Τ3

	Дни после имплантации
Выживаемость, %	38	42	48	52
Контроль	100	90	64	18
ВСМА-1д	100	100	80	60

Данные, показывающие рост опухолей ΝΙΗ3Τ3 в течение времени, представлены на фиг. 13. Данные, показывающие рост опухолей 8А480 в течение времени, представлены на фиг. 14. Данные, показы- 14 005601 вающие рост опухолей НТ29 в течение времени, и диаграмма рассеяния, показывающая отдельных животных на 42 сутки после имплантации опухоли, представлены на фиг. 15 А. Данные, показывающие рост опухолей А549 у отдельных животных на 50 и 60 сутки после имплантации, представлены на фиг. 15В.

Данные по ингибированию роста опухолей для линии опухолевых клеток ΝΙΗ3Τ3 представлены на фиг. 13. Данные по ингибированию роста опухолей для линии опухолевых клеток 8\У480 представлены на фиг. 14. Данные по ингибированию роста опухолей для линии опухолевых клеток НТ29 и А549 представлены на фиг. 15.

Пример 8. ВСМА-1д вызывает снижение количества В-клеток у нормальных мышей.

Мышей ВАЬВ/с самок в возрасте восьми недель получали из 1аскзоп БаЬогаЮгу (Ваг НагЬог, МЕ).

Мыши (3 группы) получали внутрибрюшинно либо РВ8 из 400 мкг человеческого слитого белка ВСМА-ШдП (ЬВСМАЧд) (от Тегеза СасНего, Вюдеп), или 400 мкг очищенного человеческого 1дС (Ни1дС) (8апбох, Вазе1, Швейцария) на дни -8, -5, -1 и +2. Мыши получали 100 мкл 10% суспензии овечьих эритроцитов (8КВС) (Со1огабо 8егит Сотрапу, Эепуег, СО) на 0 день.

При вскрытии при пункции сердца собирали кровь в пробирки, содержащие ЭДТА, и эритроциты лизировали в гипотоническом буфере. Кровь также собирали без ЭДТА для приготовления сыворотки. Готовили отдельные клеточные суспензии из селезенки и брыжеечных лимфатических узлов (МЬЦ) и эритроциты лизировали в гипотоническом буфере. Проводили проточную цитометрию с использованием РЕ-конъюгированных анти-СО45В/В220, анти-синдекан/СО138 и анти-В7.2 и ФИТЦ-конъюгированного анти-1дМ и анти-СО45К/В220-антител. Все тАЬз получали от Рйагтшдеп (8ап О|е8о, СА). Кратко, Ес-рецепторы блокировали 10 мкг/мл Ес-блока (Рйагтшдеп) в течение 15 мин на льду с последующим добавлением РЕ- и ФИТЦ-конъюгированных тАЬз и инкубировали на льду в течение 20-30 мин. Клетки промывали 1 раз и суспендировали в 0,5% параформальдегиде. Данные по флуоресценции клеток получали на проточном цитометре ЕЛС8Са1^Ьи^™ (ВесЮп О|сктзоп, 8ап 1озе, СА) и анализировали с использованием программного обеспечения СЕББ-Оиез!™ (ВесЮп Оюктзоп).

После обработки НВСМАЧд было отмечено примерно 50% снижение количества В-клеток в периферической крови и в исследованных периферических лимфоидных органах. В220^{высокие} и 1дМ^низкиеВ-клетки составляли соответственно 23,4 и 21,5% клеток у мышей, обработанных РВ8 и Ни1дС, в то время как данная популяция составляла только 9,9% клеток у мышей, обработанных НВСМАЧд. Оказалось, что число плазматических клеток (синдекан/СО138+) было несколько снижено при соответственно 5,7 и 4,8% в крови мышей, обработанных РВ8 и Ни1дС, по сравнению с 3,9% у мышей, обработанных НВСМАЧд. Молекула В7.2 положительно регулировалась соответственно при 3,1 и 4,5% В220+ клеток у мышей, обработанных РВ8 и Ни1дС, по сравнению с 1,9% у мышей, получивших обработку НВСМАЧд.

В селезенке количество В220^{высоких} В-клеток было заметно ниже у мышей, обработанных НВСМА1д, и равнялось 18,8% по сравнению с соответственно 36,7 и 40% у мышей, обработанных РВ8 и Нп1дС. Данное снижение наблюдали в обеих 1дМ^{высоких} и 1дМ^низких субпопуляциях (смотри табл. 1). Не было изменений в количестве только что образовавшихся В-клеток в селезенке, В220^{высоких} 1дМ^низких (данные не представлены). Оказалось, что количество плазматических клеток (синдекан/СО138+) было несколько снижено при соответственно 3,3 и 3,4% в селезенке мышей, обработанных РВ8 и Ни1дС, по сравнению с 2,4% у мышей, получивших НВСМАЧд.

В МБ-Ν было установлено снижение В220+ В-клеток при 14,1% у мышей, обработанных НВСМА-1д, по сравнению с соответственно 26,7 и 35,8% у мышей с обработкой РВ8 и Нп1дС. Данные представлены в табл. 4.

Таблица 4 Популяции В-клеток у мышей¹, обработанных НВСМАЧд, РВ8 и Ни!дС

Кровь	В220^{высокие}, 1дМ^низкие	Синдекан	Е7.2/В22 0³™'
Забуференный фосфатом физиологический раствор ί РВЗ)	23,4+5,7	5,7±1,5	3,1+0,5
Ни1дС	21,5+4,5	4,8+0,9	4,5+1,0
НВСМА~1д	9,9+1,8	3,9+0,6	1,9+0,5
Селезенки	В220^{высокие}	В2 2 0^{высокие} 1дМ⁺	Синдекан
Забуференный фосфатом физиологический раствор (РВЗ)	27,8±1,6	11,9±1,6	3,3+0,8
Ни1дС	30,5±2	11,8+1,0	3,4+0,7
НВСМА-1д	10,6±0,2	8,4±0,2	2,4±0,2
Брыжеечные лимфатические узлы	В220*
Забуференный фосфатом физиологический раствор (РВЗ)	26,7
НиХдС	35,8±3,3
НВСМА-1д	14,1±5,9

- 15 005601

Мышей обрабатывали, как описано в разделе «Материалы и методы», и данные представлены в виде процента ± стандартное отклонение.

На основании пониженного уровня В7.2+ В-клеток в крови и плазматических клеток в крови и селезенке мышей, обработанных йВСМЛ-1§, после иммунизации 8КВС можно предположить, что имеется ингибирование активации и/или созревания В-клеток и потенциально повышенная элиминация активированных В-клеток. Очень небольшой процент антиген-специфических В-клеток будет активироваться и давать ответ на любой антиген, и в данном случае на 8КВС. Вследствие того, что обработка йВСМЛ-1§ приводит к такому заметному снижению процента В-клеток во всех исследованных тканях, на »50%, оказалось, что активность йВСМЛ-1д распространяется также на находящиеся в покое зрелые В-клетки.

Следовательно, ожидается, что слитый ВСМА-белок можно использовать в качестве лечебного препарата с клиническим применением при опосредуемых В-клетками заболеваниях. Заболевания будут включать таковые, которые являются аутоиммунными по своей природе, такими как системная красная волчанка, тяжелая, псевдопаралитическая миастения, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, антифосфолипидный синдром, болезнь Чагаса, болезнь Грейвса, грануломатоз Вегенера, полиартериит нодозный и быстро прогрессирующий гломерулонефрит. Терапевтический агент будет также иметь применение при нарушениях, связанных с плазматическими клетками, таких, как множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, заболевание, связанное с тяжелой цепью иммуноглобулинов, первичный или связанный с иммуноцитами амилоидоз, моноклональная гаммапатия неопределенного значения (МОИ8). Онкологические мишени будут включать В-клеточную карциному, лейкемию и лимфому.

Специалистам в данной области, очевидно, будет понятно, что можно сделать различные модификации и вариации в полипептидах, композициях и способах по изобретению, не изменяя сущности или объема изобретения. Таким образом, подразумевается, что настоящее изобретение включает модификации и вариации данного изобретения при условии, что они совпадают с объемом прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентами.

Список последовательностей <110> АросесЬ а & Э 3.А. Вίодел, 1лс.

<120> АргН НесерЬог (ВСМА) апд изез ТИегеоС <130> А083РСТ <140> пос. аззъдпед уес <141> 2000-10-05 <150> 60/215688 <151> 2000-06-30 <150> 60/181807 <151> 2000-02-11 <150> 60/157933 <151> 1999-10-06 <160> 12 <170> ЕазсЗЕО £сг Н’Г.аоыз \7егз1оп 4.0 <210> 1 <211> 736 <212> ДНК <213> Мышиная <400> 1ч.

ссааасдасд адассссссс еаасссссас сдсадсссса сссдсадсас ессссдсасс.60 адссдсссса дссаасасса саасадаада Сдааасддса сааассссдд ссдаадсСдс120 са+сддсьас ссадаессад ааддддассс. сдаед^ЪдсЬ дъсесдссас сссссаасад180 сасааасаас дддссаЬсдС ссасааасас саспассдсс адсассдссд ссааадаада240 аддддсассс сссдадаааа дадаасаааа асссассссС даддаадаСс сдаасааада300 дссссасьса дгссьдсасс ссдссссадс ъаасассасс сссааддась ссдасдсдас360 ададдсдасд сддсаассад еасссаддсд сдддададдс ссддаддссс адддадасас420 едьасдадсс сдддасасСд даасесаесе дсссьасадс саддссссдс сссасдасдс480 даспсьсаса асдддссадд сддсассьсд ддааддасаа дддадаадад ааассссаес.540 ссдаьдсасс адаадсасдс сссссдассс сдассдсдсс сасаасадсс дссасадедс600 аддсдссесх сасссасасс ааддддасас сассассдсс аааалсссас дддсааасдс660 аааасссадс ссссссссдс асддаасасс. ссъддддгсс. дс.дааассас даасддссдс 720 дааесаассс дссгса736 <210> 2 <211> 736 <212> ДНК <213> Мышиная <400> 2 ддсссдссас сссаааддаа дссааааасд асдс.саааас аадсдссдса ддаадсдсаа 60

СсдасдаддС садседСдаь дссдсссссс ассссдссдс дсссааддсс дассйсдаса 120

- 16 005601 дсадссаасд адсесааасс Сссссссааа дссасаасда саааасддса аааддссдсс180 дсдсссассд сссаасааса аасасссасд асдасаасдд ссдсаасдас дасссссссс240

СссссаСада дадесссссс ссессдсссс сдадсааада сссессссад асссасссссзоо сдаддсдадс саддасдСад аасааддсса ассдсаасдд аддсссссда дассдсассдЗбо

СсСссассас аседссддсс аСдаасссдс ассссссссд дасссссддд сссссссдСа асасдсСсад ассссдсдас ессааасада сдадасаСса дсссаддаса аадсассаса ссдааадСдс Сасссадссс ассасададс сссссссдсс ссессссссс сссдадасааеоо ддссасасад Сссьсасасд даадассадд ассддсасдд асдссаседа сдасдссасдббо сссасадааа дсааасдсад сссссссаса асадсдасад ссссааддсд сесдсссдсд72о

ССССдааСсд дааададдсд Сассссдсаа ддассссааа саесссдаса сссдссддсд?3б сссаассаад сддааС <210> 3 <211> 234 <212> РПТ <213> Человеческая <400> 3

мес

Агд

РЬе

Рго

Зег

Не

РЬе

ТЬг

А1а

Уа1

Ьеи

РЬе

А1а

А-а

Зег

1

5

10

15

А1а

Ьеи

А1а

Рго

Уа1

АЗП

ТЬг

С1и

Азр

С1и

Тпг

А- а

С1п

20

25

30

Не

Рго

А1а

С1и

А1а

Уа1

Не

С1у

Туг

Зег

Азр

Ьеи

(31и

С1у

Азр

РЬе

35

40

45

Аар

Уа1

А1а

Уа1

Ьеи

Рго

РЬе

Зег

Азп

Зег

ТЬг

Азп

<31у

Ьеи

50

55

60

РЬе

Не

Азп

ТЬг

Не

А1а

Зег

Не

А1а

Ьуз

С1и

С1у

Уа1

65

70

75

80

Зег

Ьеи

С1и

Ьуз

Агд

С1и

С1п

Ьуз

Ьеи

Не

Зег

С1и

Азр

Ьеи

АЗП

85

90

95

Ьуз

С1и

Ьеи

ΗΪ3

Зег

Уа1

Ьеи

ΗΪ5

Ьеи

Уа1

Рго

Уа1

Азп

Не

ТЬг

Зег

100

105

НО

Ьуз

Азр

Зег

Азр

νβΐ

ТЬг

С1и

Уа1

Мес

Тгр

С1п

Рго

Уа1

Ьеи

Агд

115

120

125

<31у

Агд

С1у

Ьеи

<31и

А1а

С1п

С1у

Азр

Не

Уа1

Агд

Уа1

Тгр

Азр

ТЬг

130

135

140

С1у

Не

Туг

Ьеи

Туг

Зег

С1п

Уа1

Ьеи

РЬе

ΗΪ3

Азр

Уа1

ТЬг

РЬе

145

150

155

160

ТЬг

Мес

<31у

С1п

Уа1

Зег

Агд

<31и

С1у

С1п

С1у

Агд

С1и

ТЬг

165

170

175

Ьеи

РЬе

Агд

Суз

Не

Агд

Зег

МеС

Рго

Зег

Азр

Рго

Азр

Агд

А1а

Туг

180

185

190

Азп

Зег

Суз

Туг

Зег

А1а

(Пу

Уа1

РЬе

Ηίε

Ьеи

ΗΪ3

С1п

С1у

Αδρ

Не

195

200

205

Не

ТЬг

Уа1

Ьуз

Не

Рго

Ага

А1а

Азп

А1а

Ьуз

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

210

215

220

Н13

С1у

ТЬг

РЬе

Ьеи

С1у

РЬе

Уа1

Ьу5

Ьеи

225

230

<210> 4 <211> 542 <212> ДНК <213 > Человеческая <400> 4

- 17 005601 ссаассаааа сасддссасс асссасссса сссссссдтс сассдссдсд сддддсдасс асааадасда сдасдасааа ддасссддас аддсдсадсс дсааааасад аадаадсадс ассссдсссс дсасссддсс сссассаасд ссасссссаа ддасдасссс дасдсдасад аддсдасдсд дсаассадсс сссаддсдсд ддададдссс асаддсссаа ддасасддсд сссдаассса ддасдссдда дсссасссдс сдсагадсса ддссссдссс саадасдсда сссссассас дддссаддсд дсдссссдад ааддссаадд ааддсаддад ассссасссс дасдсасаад аадсасдссс ссссасссдд ассдддссса саасадссдс сасадсдсад дсдсссесса сссасассаа ддддасасхс сдадсдссас аассссссдд дсаадддсда аасссаассс ссссссасас ддаасссссс сддддсссдс дааассдсда сссададддс сс

12С 180 240 300 360 420 480 540 542 <210> 5 <211> 542 <212> ДНК <213> Человеческая <400> 5 аассадсссс дсассдапад садасддадс аддадсасаа дсддссасас сдсссссссс ассдссассс сссдддсссд сссасдссса сссссссдсс сдадасадда сдсдаассаа ддасаассдс дссддаддсс сссасссадд сссассасас сдгсдассда даасссасас ссссхссдаа сссссдддсс аддсссаддс сссасаассС сааасадасд асасассод·: ссаадасааа дааадсддса сссадсссас сасададссс ссддсссс ссссссссхс ссасасассс сссасасддд адддсдддсс сддсссддас дссдссдаса сасадаадсс ааасдсдасс сссссасаад асссасасса ссаадддссс ссааассдаа дададдсдса ссссддаадд ассссаааса сссссаса дд сссссдссаа ссссссдхсд ссасассдсс ссгасассас дсхссссасх сдадасаадд асассдсдсс сдсссссдсс адассссссд

6ί ϊί·: 24^гЗОС Зс. 42: 43: 54 ' 54<210> 6 <211> 172 <212> РКТ <213> Человеческая <400> б

Мес Ί

А1а Не

Не Τ'/г 5

Ьеи

Не

Ьеи

Рпе Тпг А1а 7а1 10

Агд

С1у 15

Аар

Туг

Ьуа

Азр

Аар

Ьув

С1у

Рго

С’-У

С1п

Уа1

С 1г.

Ьеи

СХП

Ьуз

20

25

30

С1п

Ьуз

С1п

НХЗ

Зег

Уа1

Ьеи

Нхв

Ьеи

Уа1

Ргс

Не

Азг.

А1а

Тпг

35

40

45

5ег

Ьмз

Агр

Азр

Зег

Аар

\7а1

Тпг

С1и

ν=1

Мес

Тгр

С1г.

Рго

А1а

Ьеи

50

55

60

Агд

С1у

Ага

С1у

Ьеи

С1п

А1а

С1п

Ну

ΙΤ^

С1у

7ах

Агд

Σιβ

Схп

65

70

75

8:

Аар

А1а

С1у

Уа-

ТУГ

Ьеи

Т-/г

Зег

Схп

νβΐ

Ьеи

Рпе

С1г.

АЗО

Уа1

85

90

95

ТЬг

Рпе

ТЬг

Мес

С1у

С1п

Уа1

Зег

Агд

Ни

Ну

С1п

С1у

Агд

С1г.

100

105

11С

С1и

ТЬг

Ьеи

Рпе

Агд

Суз

Не

Агд

Зег

Мес

Рго

Зег

Нхз

Рго

Аар

Аге

115

120

125

А1а

Туг

Азп

Зег

Суз

Туг

Зег

А1а

С1у

Уа1

Рг.е

Нхз

Ьеи

Нхз

С1п

Сху

130

135

140

Аар

Не

Ьеи

Зег

ν*ι

Не

Рго

Ага

А1а

Агд

А1а

Ьуз

Ьеи

Азп

Ьеи

145

150

155

160

Зег

Рго

ΗΪ8

С1у

ТПГ

Рпе

Ьеи

<31у

Рпе

νβΐ

Ьуа

Ьеи

- 18 005601 <210> 7 <211> 555 <212> ДНК <213> Человеческая <400> 7 асдссдсада сддсСдддса дсдсесссаа аасдаасаЫ ссдасадссс дссдсасдсС60 сдсасасссс дссаассссд асдссссссс аасасссссс сСссаасасд ссадсдссас120 сдсаасдсаа дсдсдассаа РСсадсдааа ддаасдаасд едассссссд дасссдсссд180 ддассдадсс саасаасесс ессддеадсс сссдсдссаа сдсссссдсс ааддаадаса240 адсСсСдаае сассааадда сдадгссааа аасасаддаС саддсссссс дддсасддсс300 аасаесдасс сддаааадад саддассддс дасдааасса сссссссдад аддссссдад360 сасасддсдд аадаасдсас ссдсдаадас сдсассаада дсааассдаа ддссдасссс420 дассассдсс ссссассссс адссаеддад дааддсдсаа есасссссдс сассасдааа48С асдаасдасс ассдсаадад сссдссадсС дссСсдадсд ссасддадас ададааасса 540 асъсссдсса ддсаа555 <210> 8 <211> 184 <212> РЕТ <213> Человеческая <400> 8

Мес

Ьеи

С1п

Мес

А1а

С1у

С1п

Суз

Зег

С1п

Азп

С1и

Туг

РЬе

Азр

Зег

1

5

10

15

Ьеи

ΗΪ8

А1а

Суз

Не

Рго

Суз

С1г.

Ьеи

Агд

Суз

Зег

Азг.

ТЫ

20

25

30

Рго

Ьеи

ТЬг

Суз

С1п

Агд

Туг

Суз

Азг.

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Азг.

Зег

35

40

45

νβΐ

Ьуз

С1у

ТЬг

Азп

А1а

Не

Ьеи

Тгр

ТЬг

Суз

Ьеи

С1у

Ьеи

Зег

ьеи

50

55

60

Не

Зег

Ьеи

А1а

Уа1

РЬе

νβΐ

.Ьеи

МеС

РЬе

Ьеи

Агд

Ьуз

Не

65

70

75

80

Зег

Бег

С1и

Рго

Ьеи

Ьуз

Азр

С1и

РЬе

Ьуз

Азп

ТЬг

С1у

Зег

αίν

Ьеи

85

90

95

Ьеи

С1у

МеС

А1а

Азп

Не

Азр

Ьеи

С1и

Ьуз

Зег

Агд

ТЬг

С1у

Азр

С1и

100

105

110

Не

Ьеи

Рго

Агд

С1у

Ьеи

С1и

Туг

ТЬг

Уа1

С1и

Су 5

ТЬг

Суз

115

120

125

С1и

Азр

Суз

Не

Ьуз

Зег

Ьуз

Рго

Ьуз

νβΐ

Азр

Зег

Азр

Н13

Суз

РЬе

130

135

140

Рго

Ьеи

Рго

А1а

Мес

С1и

01и

С1у

А1а

ТЬг

Не

Ьеи

Уа1

ТЬг

ТЫ

Ьуз

145

150

155

160

ТЬг

Азп

Азр

Туг

Суз

Ьуз

Зег

Ьеи

Рго

А1а

Ьеи

Зег

А1а

Таг

С1и

165

170

175

Не

С1и

Ьуз

Зег

Не

Зег

А1а

Агд

180

<210> 9

<211> 483

<212> ДНК

<213> Человеческая

- 19 005601 <400> 9 дссдаадсса саадаадасс асдаддадда дассдсасад есдсаасаас ассасдесса60 сассддссаа дссасыхсс ССдсССасас саададассс ддасааассс едасесдаас120 сагсааадаа ассдссаааа дсасдаесас ааааасдасс ссссссассс дадасссддс.180 ааесссседс ссааагхсъЕ дсдссссадс ссададдасс сдеассдасг деааседдас240 сеъсесесдй сссдассасс ассгсаасаа дааддссссс сддадсссас дсдссасссг300 сССасд^дда сасес.сс.дас дсадсссьсд схьддссесс адсйдадасе ддиаасдааа360 ддедадддсс дасасссссс ьссдсдссдд ЬаадаасадС ддсдссейЬд сесаседаСа420 асдСЕсссдд асддесдасд ааасесасда сдсссссасс сссссадсса аадасдассс480 аСй483 <210> 10 <211> 483 <212> ДНК <213> Человеческая <400> 10 саассесдас дссссгссаа еасссссссс спааса^дсс адсдссассд саасдсаадс60 дСдассаасБ садсдааадд аасдааедсд асгссссдда сссдгссддд ассдадссса120 асаасс^ссс сддсадсссс сдсдсеаайд ьсъсгдссаа ддаадасаад ссссдаасса180 ссаааддасд ад^сгааааа сасаддагса ддссссссдд дсаеддссаа саБСдассед240 даааададса ддассддсда сдааасга^с. с^сссаадад дссСсдад^а сасддсддаа300 ааасдсассс дсдаадасгд сассаададс ааассдаадд ссдасЕссда ссасгдссе^360 ссасссссад ссасддаада аддсдсаасс асссс'дсса ссасдаааас даасдасса-420 сдсаададсс сдссадссдс сйсдадсдсс асддадасад адааассааг сессдссадд480 еаа483 <210> 11 <211> 906 <212> ДНК <213> Человеческая <400> 11 аСддадасад асасассссп дссасдддед ссдссдсссг дддсХссадд ссссаседдг60 дасдссасда сдГ^дсадас ддссдддсад сдспсссааа агдаасасси сдасадеьсд120 ссдсасдссс дсасассгсд Есаасъссда сдсчссссса асассссссс сссаасагдс180 садсдьсасс. дсаасдсаад едедассааг ссадсдааад дадгсдасаа аасссасаса240 сдсссассдс дсссадсасс сдаасесссд ддддсассде садссгсссг ссссссссса300 ааасссаадд асассспсас даСсйсссдд ассссгдадд ссасаедсдх ддсддсддас360 дсдадссасд аадассссда ддс.саадсс.с ааспддьасд сддасддсдс ддаддьдсас.420 аасдссаада сааадссдсд ддаддадсад Сасаасадса сдйассдсде ддссадсдпс480 сСсассдйсс пдсассадаа ссддссдааг ддсааддадй асаадедсаа ддйссссаас540 'ааадсссссс садсссссас сдадаааасс агссссааад ссааададса дссссдадаа600 ссасаддСдс. асассссдсс сссайсссдд дасдадссда ссаадаасса ддссадсссд660 асссдсссдд есаааддс^г. сСаСсссадс дасагсдссд гддадгддда дадсаасддд720 садссддада асаассасаа дассасдссг сссдсдссдд ассссдасдд сссссссссс780 сгссасадса адсссассдс ддасаададс аддсддсадс аддддаасдс сеесссаедс840 сссдсдасдс асдаддсссе дсасаассас сасасдсада ададссесгс сс^дссьссс900 дддааа 9 Ос <210> 12 <211> 302 <212> РНТ <213> Человеческая

- 20 005601 <400> 12

Мес

С1и

ТЬг

Аар

ТЬг

Ьеи

Тгр

νβΐ

Ьеи

Тгр

Уа1

Рго

1

5

10

15

61у

Зег

ТЬг

С1у

Азр

Уа1

ТЬг

Мес

Ьеи

О1п

МеС

А1а

О1у

О1п

Суз

Зег

20

25

30

С1п

Азп

С1и

Туг

РЬе

Азр

Зег

Ьеи

Н13

А1а

Суз

Не

Рго

Суа

С1п

35

40

45

Ьеи

Агд

Суз

Зег

Азп

ТЬг

Рго

Ьеи

ТЬг

Суз

О1п

Агд

Туг

Суз

50

55

60

Азп

А1а

Зег

νβΐ

ТЬг

Аап

Зег

νβΐ

Ьуз

01у

Уа1

Аар

Ьуз

ТЬг

НХЗ

ТЬг

65

70

75

80

Суа

Рго

Суа

Рго

А1а

Рго

С1и

Ьеи

С1у

Рго

Зег

νβΐ

РЬе

85

90

95

ьеи

РЬе

Рго

Ьуз

Рго

Ьуз

Аар

ТЬг

Ьеи

Мес

11е

Зег

Агд

ТЬг

Рго

100

105

110

С1и

νβΐ

ТЬг

Суа

Уа1

Аар

Уа1

Зег

Нхз

С1и

Азр

Рго

С1и

Уа1

115

120

125

Ьуа

РЬе

Азп

Тгр

Туг

Уа1

Азр

С1у

νβΐ

С1и

Уа1

Нхз

Азп

А1а

Ьуз

ТЬг

130

135

140

Ьуа

Рго

Агд

С1 и

О1и

С1г.

Туг

Азп

Зег

ТЬг

Туг

Агд

Уах

Уа1

Зег

Уа1

145

15.0

155

160

Ьеи

ТЬг

Уа1

Ьеи

Н13

С1п

Аар

Тгр

Ьеи

Азп

О1у

Ьуа

С1и

Туг

Ьуз

Суз

165

170

175

Ьуа

νβΐ

Зег

Ааг.

Ьуз

А1а

Ьеи

Рго

А1а

Рго

Не

С1и

Ьуз

ТЬг

Не

Зег

180

185

190

Ьуа

А1а

Ьуа

С1у

С1п

Рго

Агд

01и

Рго

С1п

Уа1

Туг

Тпг

Ьеи

Рго

195

200

205

Зег

Агд

Аар

С1и

Ьеи

ТЬг

Ьуз

Азп

С1п

Уа1

Зег

Ьеи

ТЬг

Суз

Ьеи

ν«ι

210

215

220

Ьуз

С1у

РЬе

Туг

Рго

Зег

Аар

Не

А1а

Уа1

С1и

Тгр

С1и

Зег

Азп

С1у

225

230

235

240

С1п

Рго

С1и

Азп

Туг

Ьуз

ТЬг

Рго

Уа1

Ьеи

Аар

Зег

Азр

245

250

255

С1у

Зег

РЬе

Ьеи

Туг

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

νβΐ

Аар

Ьуз

Зег

Агд

Тгр

260

265

270

С1п

С1у

Аап

Уа1

РЬе

Зег

Суз

Зег

νβΐ

Мес

ΗΪ3

С1и

А1а

Ьеи

НХЗ

275

280

285

Азп

Н13

Туг

ТЬг

О1г.

Ьуз

Зег

Ьеи

Зег

Ьеи

Зег

Рго

О1у

Ьуз

290

295

300

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения злокачественных опухолей у млекопитающего, характеризующихся аномально высокой экспрессией лиганда, индуцирующего пролиферацию клеток (АРКШ·), предусматривающий введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антагонист рецептора АРКШ·, выбранный из группы, включающей:

a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами 1-184 8Еф Ш N0:8, или полипептид, по меньшей мере на 80% идентичный указанному;

b) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами 1-52 8Еф Ш N0:8, или полипептид, по меньшей мере на 80% идентичный указанному;

c) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную аминокислотами 8-41 8Е() Ш N0:8, и

б) антитело, направленное против полипептида, имеющего аминокислотную последовательность 8Е() Ш N0:8, а также фармацевтически приемлемый наполнитель.
2. Способ по п.1, в котором полипептид дополнительно содержит гетерологичную аминокислотную последовательность.
3. Способ по п.2, в котором гетерологичная аминокислотная последовательность представлена сигнальной последовательностью секретируемого белка.
4. Способ по п.2, в котором гетерологичная аминокислотная последовательность представляет собой Гс-домен иммуноглобулина.
5. Способ по п.4, в котором иммуноглобулин представляет собой Ι§Ο.
6. Способ по п.5, в котором иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин человека.
7. Способ по п.6, в котором полипептид имеет аминокислотную последовательность 8Еф Ш N0:12.
8. Способ по любому из пп.1-7, согласно которому злокачественная опухоль представляет собой карциному.
9. Способ по п.8, согласно которому карцинома выбрана из группы, включающей карциному легкого, карциному ободочной кишки, карциному простаты и карциному молочной железы.
10. Способ по любому из пп.1-9, согласно которому млекопитающее представляет собой человека.