CN1399556A

CN1399556A - April受体(bcma)及其用途

Info

Publication number: CN1399556A
Application number: CN00816255A
Authority: CN
Inventors: 帕斯卡尔·施耐德; 杰弗里·汤普森; 特里萨·卡切罗; 克里斯廷·安布罗斯; 保罗·伦纳特
Original assignee: Apotec R&d Co ltd; Biogen Inc
Current assignee: Apotech R & D S A; Than Ao Gen Ma Co
Priority date: 1999-10-06
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2003-02-26
Anticipated expiration: 2020-10-05
Also published as: HUP0203567A2; ATE360434T1; CZ297633B6; BR0014583A; US7276241B2; EP1847273A1; IL204401A; SK286331B6; SK4512002A3; PL355102A1; ZA200202578B; NZ517907A; IL148839A; NO20021594L; EP2324844A2; EP1223964A1; CA2386463A1; IL148839A0; JP2011079863A; EA200200427A1

Abstract

本发明提供了一种属于TNF家族的受体：APRIL－R。另外还提供了针对APRIL－R的嵌合分子和抗体及其使用方法。

Description

APRIL受体(BCMA)及其用途

发明领域

广义上说本发明涉及治疗癌症的方法。该方法涉及施用特定肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂。

发明背景

细胞因子中的肿瘤坏死因子(TNF)家族成员参与的生物学功能领域日愈广泛。TNF家族每个成员都是通过与其受体蛋白匹配家族的一个或多个成员结合来发挥作用。接下来，这些受体向细胞内发送信号介导多种生理或发育反应。这些受体信号中的大部分都能决定细胞命运，并且通常可激发终末分化。细胞分化的实例包括增殖、成熟、迁移及死亡。

TNF家族成员是II型膜结合蛋白，具有一很短的膜内N-端结构域、一跨膜结构域以及一伸出细胞表面外的C-端受体结合结构域。某些情况下，所述蛋白的胞外部分被切割下来，成为一分泌形式的细胞因子。尽管膜结合蛋白是在原处发挥作用，推断为通过细胞接触介导来与其受体相互作用，但是所述分泌形式可以循环或扩散，因而也可在远处发挥作用。膜结合形式以及分泌形式二者均为三聚体，通过促进受体成簇将其信号转换给受体。

TNF受体蛋白家族的特征是具有一个或多个富含半胱氨酸的胞外结构域。每个半胱氨酸富集结构域都生成一个二硫键核心结构域，该结构域参与组成的三维结构形成配体结合口袋。所述受体是I型膜结合蛋白，该蛋白包含：N-末端编码的胞外区，后接一跨膜结构域以及一C-端胞内结构域。胞内结构域负责受体信号传导。一些受体包含胞内“致死结构域”，“致死结构域”可引发细胞凋亡，这些受体是细胞死亡的强诱导物。另一类受体微弱地引发细胞死亡；这些受体缺乏致死结构域。第三类受体不介导细胞死亡。根据细胞类型或其它信号发生的情况不同，所有各类受体都能引发细胞增殖或分化，但不引发细胞死亡。

对TNF家族活性的多能本质研究透彻的一个实例是命名为TNF的成员。TNF既可以膜结合细胞因子的形式存在，也能被切割和分泌。这两种形式都可结合两种TNF受体，TNF-R55和TNFR75。最初公开的TNF的功能是它可以直接杀死肿瘤细胞，TNF还可以调控多种免疫过程，包括诱导急性炎症反应，以及保持淋巴组织的动态平衡。由于其双重功效，该细胞因子可以在各种病理状态下发挥作用，因而既可以作为激动剂也可以作为拮抗剂对疾病进行调控。例如TNF和LTa(它也是通过TNF受体来传导信号)已被用于治疗癌症，尤其是位于外周位点的，例如四肢肉瘤。这种情况下细胞因子通过受体直接传导信号可以引发肿瘤细胞死亡(Aggarwal and Natarajan，1996.Eur Cytokine Netw 7：93-124)。

免疫学中，已经使用了那些能够阻断TNF受体信号传送的药剂(例如，抗TNF mAb，可溶性TNF-R融合蛋白)，用它们来治疗类风湿性关节炎和炎性肠道病等疾病。这些病理状态下，TNF可诱导细胞增殖并发挥效应器的作用，从而使自身免疫疾病恶化，因此，这种情况下，阻断TNF与其受体的结合具有治疗作用(Beutler，1999.J Rheumatol 26 Suppl57：16-21)。

新近发现一种配体/受体系统，该系统行使类似功能。淋巴毒素β(LTβ)是TNF家族的成员，与LTα形成异源三聚体，LTβ可结合LTβ-R。当用竞争性的抗-LTβ-mAb进行治疗时，一些表达LTβ-R的腺癌肿瘤细胞能被杀死或者分化(Browning et al.，1996.J Exp Med 183：867-878)。免疫学研究现已表明，抗-LTβmAb或可溶性LTβ-R-Ig融合蛋白能够阻止炎性肠道疾病的恶化，可能是通过影响树突状细胞和T细胞的相互作用来实现的(Mackayet al.，1998.Gastroenterology 115：1464-1475)。

TRAIL系统还可用于癌症治疗。TRAIL可与大量膜结合及可溶性受体相互作用。这些受体的其中两种，即TRAIL-R1和TRAIL R2(还称为DR4和DR5)，将致死信号传输给肿瘤细胞，但不传送给正常细胞，正常细胞上表达有额外的不诱发死亡的TRAIL受体。这些额外受体起到诱饵的作用。用可溶性TRAIL杀死肿瘤细胞的基础就是诱饵受体选择性表达在受体细胞而在肿瘤组织中不表达(Gura，1997.Science 277：768)。

肿瘤细胞自身往往表达多种诱饵受体，这些受体能阻止免疫识别或效应作用。实际上，一些肿瘤过量表达TRAIL诱饵受体，它们似乎可以逃避TRAIL介导的死亡(Sheikh et al.，1999.Oncogene 18：4153-4159)。这就限制了某些情况下将TRAIL用作抗肿瘤药物。类似的情况还出现在：IL-1受体拮抗剂所对应的诱饵受体(Mantovani et al.，1998.Ann.N Y Acad.Sci.840：338-351)，以及FAS-L的诱饵受体，该受体过量表达于肺癌及结肠癌细胞(Pitti et al.，1998.Nature 396：699-703)。诱饵受体也可以由病毒基因组来充当，保护感染后的宿主细胞抵御宿主防御系统。

APRIL(一种增殖诱导配体)是TNF蛋白家族的一个新成员。APRIL表达及功能研究表明：肿瘤细胞利用该蛋白诱导快速增殖。肿瘤细胞系体外用可溶性APRIL蛋白处理，或者用APRIL cDNA转染后，生长加速。APRIL转染后的细胞移植入免疫缺陷小鼠后，迅速生长为肿瘤。最后，人肿瘤细胞表达高水平的APRIL信使RNA，而正常组织不出现这种情况。这些结果表明：APRIL可与肿瘤细胞也表达的受体结合，启动自分泌或旁分泌肿瘤细胞的活化。此外，APRIL还可能在其它疾病中起作用，因而活化或阻断APRIL途径还可能有其它的用途。例如APRIL的不足表达或过量表达可能与发育缺陷有关，这是由于发育的特征往往就是在细胞增殖和细胞死亡间获得精确控制的平衡。类似地，APRIL与细胞增生疾病有关，例如，其发生与某些自身免疫疾病(例如，狼疮)有关的疾病，或者与细胞群快速扩增的自身免疫疾病(例如，细菌脓毒症)有关。

TNF以及TNF受体家族成员的激动剂或拮抗剂可用作疾病调节剂，以此用途为基础，APRIL途径本身就可作为药物开发的重要靶子。这在癌症治疗中尤为可行，这是因为肿瘤细胞产生APRIL并用APRIL支持其自身的生长，因而不太可能产生APRIL途径的诱饵受体或者其它拮抗剂。因此，APRIL途径相对于例如能够被肿瘤诱饵阻挠的TRAIL或FAS-L途径有其独特的特点。

由于疗效甚微、对幸存状态的影响小、引发严重副作用的毒性、或其兼而有之的原因，癌症的现有治疗对于多种类型的肿瘤而言还是不够的。因此，需要另外鉴定并开发出效果明显但不引发严重副作用的癌症治疗方法。APRIL途径的拮抗剂，包括抗-APRIL mAbs、抗APRIL受体mAbs、可溶性APRIL受体-Ig融合蛋白、天然拮抗剂、小分子拮抗剂、以及化学、药物学或者其它有效的拮抗剂。

最终，我们鉴定出了B细胞介导蛋白(BCM或BCMA)作为APRIL的受体。

发明概述

申请人已经发现BCMA是肿瘤坏死因子APRIL的受体。APRIL与此前WO 99 12965中描述的分子是同一分子，该文本在此引入作为参考。APRIL受体在本申请中称为″APRIL-R″。本发明涉及对患有癌症的或对癌症易感的哺乳动物进行治疗的方法，以及治疗所用药物的制备方法。所述受试者包括那些遭受癌症折磨的，或者已经接受过癌症治疗的患者。

本发明所述的方法和组合物部分得益于下述发现：某些可以作为癌症治疗药物、称为APRIL-R拮抗剂的药剂，包括例如，抗-APRIL-R抗体，可以用来治疗本发明所述的癌症易感者或者需要癌症治疗的患者。

本发明所述的癌症治疗药物可以通过与所选药物相匹配的任一种给药途径施用，所述药物可以与适于所选给药途径的任一种药物学可接受的载体配成制剂。优选的给药途径为非肠道途径，具体有，静脉内、腹膜内以及胶囊内。还优选在门诊的基础上延长治疗时间。所述癌症治疗药物的日服剂量为约0.01-1000μg/kg体重，更优选约10-300，ug/kg体重，但确切剂量要根据具体使用的癌症治疗药物以及具体的患者医疗状况及历史来确定。

本发明所述的治疗可以用于根除来自哺乳动物体的转化细胞的基本上克隆化群体(集落)，或者用来抑制或减缓该集落的生长，所述集落通常称作肿瘤。因此，它们可以用于延长癌症易感者或癌症患者的生命，维持其生命质量。

附图简述

图1给出的是在载体pCCM213.10中作图时，鼠APRIL cDNA的核酸序列(SEQ ID NO：1)及其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，下划线部分为myc表位以及FasL的氨基酸。APRIL包外区编码序列的开始处用箭头标出。

图2给出的是用来在哺乳动物细胞中表达的FLAG-人APRIL构建体的核酸序列(SEQ ID NO：4)及其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。该图中标出了信号序列(1-15)、FLAG表位(AA16-23)以及人APRIL胞外区编码序列的起点(32-末端)。

图3A给出的是全长人BCMA的核酸序列(SEQ ID NO：7)和氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。图3B给出的是pJST538的核酸序列(SEQ ID NO：11)及其推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)，pJST538是一种编码人APRIL-R-hIgGFc的融合构建体。

图4显示myc-鼠APRIL与鼠B细胞淋巴瘤系A20间的结合情况。3个独立的实验表明：与A)未染色的细胞和只用R1532染色的细胞、B)用RANKL-L和R1532染色的细胞以及C)用APRIL和无关兔血清染色的细胞相比，APRIL与A20细胞之间的结合是特异性的。

图5显示的是myc-鼠APRIL与人B细胞淋巴瘤系RAJI之间的结合情况。2个独立的实验表明：与A)未染色的细胞、只用R1532染色的细胞以及用RANK-1和R1532染色的细胞，以及B)用APRIL和无关兔血清染色的细胞相比，APRIL与RAJI细胞之间的结合是特异性的。

图6显示的用可溶性BAFF蛋白或可溶性BCMA-Ig蛋白时，APRIL与A20细胞(A)以及Raji细胞(B)间的竞争结合情况。

图7FLAG-人APRIL与不同细胞系间的结合情况：A)A20细胞，B)HT29细胞，C)NIH3T3细胞。与使用不相关同种型对照mAb或不加FLAG-APRIL的情况相比，用生物素化抗-Flag mAb M2检测时显示出了特异性结合。

图8给出的是用BCMA-Fc融合蛋白免疫沉淀myc-mApril的情况。左上图显示的是特异性hBMCA-Fc/myc-mAPRIL以及阳性对照OPG-Fc/Rank-1的免疫沉淀，右上图为阴性对照。下图证实蛋白的上样量是相等的。

图9显示的是一种ELISA模式的实验，该实验表明FLAG-hAPRIL能够结合hBCMA-fc融合蛋白。将不同的受体-Fc融合蛋白包被ELISA平板，并与FLAG-标记的配体结合。A)对结合配体的检测表明只有APRIL和hBAFF能够特异性地结合hBCMA-Fc，而hCD40-Fc不能。B)剂量滴定显示：hBAFF或hAPRIL与包被在平板上的hBCMA-Fc结合后检测到的ELISA信号与蛋白加入量呈线性关系。

图10显示的是用hBMCA-Fc融合蛋白免疫沉淀FLAG-hAPRIL和FLAG-hAPRIL。上方的4个图表明每个免疫沉淀中蛋白的上样量是相等的，而下方的图表明hAPRIL和hBAFF可被hBCMA-Fc免疫沉淀，但不能被hTRAIN-Fc免疫沉淀。

图11为myc-mAPRIL、FLAG-hBAFF和FLAG-mBAFF与hBMCA、hLTβ受体、或hTNF-R80或空白对照结合的结果的BiaCore分析，其显示仅能与hBCMA特异性结合。

图12显示APRIL与BCMA转染细胞的结合。用表达全长hBCMA的质粒转染293EBNA细胞。48小时后用5mM EDTA收获细胞，然后用myc-nAPRIL染色。图A显示染色程度呈剂量依赖性。图B显示使用可溶性BCMA-Ig蛋白将染色减弱至本底水平。

图13显示的是NIH3T3细胞皮下植入用对照试剂或用BCMA-Ig融合蛋白处理后的免疫缺陷(Nu/Nu)小鼠后的生长情况。该模型中，NIH3T3细胞形成纤维肉瘤。

图14显示的是人结肠癌SW480皮下植入用对照试剂或用hBCMA-Ig融合蛋白处理的免疫缺陷(Nu/Nu)小鼠后的生长情况。

图15A显示的是人结肠癌HT29皮下植入用对照试剂或用hBCMA-Ig融合蛋白处理的免疫缺陷(Nu/Nu)小鼠后的生长情况。图15B显示的是人肺癌A549皮下植入用对照试剂或用hBCMA-Ig融合蛋白处理的免疫缺陷(Nu/Nu)小鼠后的生长情况。

发明详述

定义

为了更清楚更确切地描述本发明的主题，为下列说明书及所附权利要求书中出现的特定术语进行下述定义。

现在，结合包括下列定义在内的发明详述部分对本发明进行描述：

术语″APRIL受体＂或″APRIL-R″用于本发明时包括APRIL-R的天然序列及APRIL-R变体。APRIL-R可以从多种来源分离得到，例如来自鼠或人组织类型或者其它来源，或者可以通过重组或合成的方法制备。另外，术语APRIL-R还指能够与肿瘤坏死因子家族成员APRIL或其同系物或片段结合的多肽。APRIL-R的一个实例是BCMA。

术语″BCMA″或″BCM″是指下述文献中所述的参与B细胞成熟的新型蛋白质：Gras et al.(1995)，International Immunology，7：1093-1106，＂BCMAp：人成熟B淋巴细胞高尔基体中的膜整合蛋白＂；Y.Laabi et al.(1992)，EMBO J.，11，3897-3904，＂通过恶性T细胞淋巴瘤中的(4；16)(q26；p13)易位，将染色体16上的BCM新基因融合到白细胞介素2基因上＂。

＂APRIL-R天然序列＂包括与天然来源的APRIL-R具有相同氨基酸序列的多肽。所述天然序列的APRIL-R可以分离自自然界，或者通过重组或合成方式制备而成。所述的天然APRIL-R可以是APRIL-R的天然生成的截短形式或分泌形式(例如，含有胞外区序列的可溶形式)、天然生成的变体形式(例如，可替换式剪接形式)以及天然生成的APRIL-R等位变体。本发明的一个实施方案中，APRIL-R天然序列是APRIL-R多肽的成熟或全长天然序列，包括SEQ ID NO：8中的第1-184位氨基酸或其片段。

″APRIL-R胞外区″或″APRIL-R ECD″是指基本上不包含APRIL-R的跨膜及胞内结构域的APRIL-R形式。通常，APRIL-R胞外区包含少于1％的所述跨膜及胞内结构域，优选包含少于0.5％的所述结构域。任选地，APRIL-R ECD包括SEQ ID NO：8中的第1-51、或1-52、或1-53位的氨基酸残基。优选实施方案中，APRIL-ECD包括SEQ ID NO：8中的第4-51位的氨基酸残基，或者更优选地包括SEQ ID NO：8中的第8-41位的氨基酸残基。本领域技术人员应该理解的是鉴定本发明所述APRIL-R的跨膜结构域采用的是本领域鉴定疏水型结构域的通用标准。跨膜结构域的确切界限可能各不相同，变动幅度很可能不超过本发明具体所述结构域任一端的约5个氨基酸。

″APRIL-R变体＂是指如下定义的活性APRIL-R，其氨基酸序列与SEQID NO：5所示APRIL-R全长天然序列的推导氨基酸序列或者与APRIL-RECD序列有至少约80％的氨基酸序列同一性。所述APRIL-R变体包括，例如，在如SEQ ID NO：8所示序列末端或C-末端添加或缺失了1个或多个氨基酸残基而得到的APRIL-R多肽。通常，APRIL-R变体与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列具有至少约80％或85％的氨基酸序列同一性，更优选至少约90％的氨基酸序列同一性，甚至更优选至少约95％的氨基酸序列同一性。

与本发明鉴定的APRIL-R序列之间的＂氨基酸序列同一性百分比(％)＂是指：将候选序列与APRIL-R序列对齐并在必要时引入缺口以便实现最大限度的序列同一性百分比，而且不将任一保守性取代计入序列同一性时，候选序列中与APRIL-R序列中氨基酸残基相同的氨基酸残基在该候选序列中所占的百分比。为测定氨基酸序列同一性百分比而进行的对齐可以通过各种本领域技术人员已知的途径实现，例如，使用公众可获得的电脑软件，如BLAST、ALIGN、或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定合适的参数用于测算对齐，包括为在待比较序列的全序列上达到最大限度的对齐而所需的任一算法。

术语″表位标签＂在本发明中出现时是指一嵌合多肽，其中包括融合到一“标签多肽”上的APRIL-R或其结构域序列。所述的标签多肽必须有提供一表位所需的足够残基，从而可以保证能够制备到抗该表位的抗体，或者该表位可被其它一些试剂鉴定，而且该表位必须足够的短从而保证其不会干扰APRIL-R的活性。优选地，所述标签多肽还应当是独一无二的，从而确保其抗体基本上不与其它表位发生交叉反应。通常，合适的标签多肽有至少6个氨基酸残基，并且通常为约8～约50个氨基酸残基(优选地，约10～约20个残基)。

描述本发明所述各种多肽时使用的＂分离的″是指从其所在天然环境一成分中鉴定并分离和/或回收的多肽。其天然环境中的污染成分是指通常会干扰所述多肽诊断或治疗作用的物质，可以包括酶、激素、以及其它蛋白质的或非蛋白质的溶解物。在优选实施方案中，将所述多肽纯化至下述程度：(1)使用转杯式测序仪可以测得至少15个N-末端或内部氨基酸的序列，或者(2)在非还原或还原条件下，使用考马氏蓝或优选银染可得到均一的SDS-PAGE结果。分离的多肽包括位于重组细胞内原位处的多肽，因为这样的多肽与APRIL-R的天然环境相比至少有一个成分不存在了。但是，分离的多肽通常经过了至少一个纯化步骤制备而成。

术语″抗体″取其最广泛的含义，具体包括单一的APRIL-R单克隆抗体(包括激动剂、拮抗剂、以及中和抗体)以及具有多表位特异性的抗APRIL-R抗体组合物。本发明中使用的＂单克隆抗体＂是从一组基本上均一的抗体中得到的抗体，即除了可能存在极少量天然发生的突变外，抗体个体之间是完全相同的。

本发明中，多肽的″纯化制品″或″基本上纯化的制品″是指该多肽已经从与其一起天然生成的其它蛋白、脂类及核酸分离开来。优选地，所述多肽还可分离自其它物质，例如用来纯化该多肽时使用的抗体、介质等。

本发明使用的＂进行处理＂＂处理＂以及＂治疗＂是指有治愈性治疗、预防性治疗、以及防止性治疗。

术语＂肽＂、＂蛋白＂以及＂多肽＂在本发明中交互使用。

本发明使用的＂生物活性＂是指具有体内或体外活性，这些活性可以是直接发挥也可以是间接起作用的。APRIL-R的生物活性片段与受体的活性位点之间，例如，具有70％的氨基酸同源性，更优选至少80％，最优选至少90％的同源性。与受体之间的同一性或同源性在本发明中是指候选序列中与SEQID NO：8所示APRIL-R残基相同的氨基酸残基所占的百分比。

本发明中使用的″哺乳动物＂是指分类学上属于哺乳动物的任一动物，包括，人、牛、马、狗、老鼠、以及猫。本发明的优选实施方案中，所述哺乳动物是人。

如非特别说明，本发明使用的是细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学中的常规技术，这些技术都属于本技术领域范畴之内。这类技术在文献中已有描述。

现在对本发明的优选实施方案做详细的参考。本发明涉及使用APRIL-R和APRIL-R相关分子影响B-细胞和非B细胞的生长和成熟以及免疫球蛋白的分泌。本发明涉及根据免疫相关疾病的需要，使用APRIL-R和APRIL-R相关分子影响免疫系统的应答。另外，本发明还包括通过基因疗法用APRIL-R或APRIL-R相关基因治疗癌症和免疫疾病。

用本发明所述序列转化宿主制备的APRIL-R及其同系物，以及用本领域已知方法纯化得到的天然APRIL-R，或者是从已知氨基酸序列制备的APRIL-R及其同系物，都可以用到抗癌、抗肿瘤及免疫调节的治疗方法中。它们也可以用于其它疾病的治疗及方法中。

本发明另一方面涉及将编码APRIL-R的分离的核酸编码的多肽用于＂反义＂治疗。本发明中使用的“反义”治疗是指施用或在原位生成寡核苷酸或其衍生物，这些寡核苷酸或其衍生物能够在细胞环境中与编码目的配体的细胞mRNA和/或DNA发生特异性地杂交，从而抑制所述编码蛋白的表达，即抑制转录和/或翻译。所述结合可以通过常规的碱基对互补，或者，例如，在与DNA双螺旋结合的情况下，通过与双螺旋的大沟间的特异性相互作用实现结合。

通常，“反义”治疗是指本领域通常使用的一系列技术，包括以与寡核苷酸特异性结合为基础的任一治疗方法。

本发明所述反义构建体可以表达质粒的形式来递送，在细胞中转录时，生成的RNA与编码Kay-配体的细胞mRNA的至少一部分互补。可替代地，所述的反义构建体可以是离体制备的寡核苷酸探针。所述寡核苷酸探针优选是经过修饰，故对内源性核酸酶有抗性的寡核苷酸，因而在体内是稳定的。用作反义寡核苷酸的核酸分子的实例有DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯及甲基膦酸酯类似物(参见，例如5,176，996；5,264,564；and 5,256,775)。另外，用来构建反义治疗所用寡聚体的常规方法已经在下列文献中综述，例如VanDer Krol et al.，(1988)Biotechniques 6：958-976；以及Stein et al.(1988)CancerRes 48：2659-2668，在此专门引入作为参考。

如上所述，本发明的APRIL-R是TNF受体家族的一个成员。所述蛋白质，及其片段或同系物都具有广泛的治疗及诊断用途。

本发明所述多肽与APRIL特异性地相互作用，APRIL是此前WO99/12964公开的一种多肽，在此引入作为参考。但是，本发明中公开的肽和方法可以用来鉴定可特异性地与APRIL-R或其片段相互作用的分子。

特定实施方案中主张的本发明包括那些衍生自APRIL-R并能结合APRIL的肽的使用方法。APRIL-R的片段的制备方法有好几种，例如，重组、PCR扩增、蛋白酶消化或者化学合成。多肽的内部片段或末端片段可以通过下述方法制备而成：从编码多肽的核酸的一端或两端除去1个或多个核苷酸。诱变后DNA的表达可以制得多肽片段。

还可以用本领域的已知技术化学合成多肽片段，例如常规的Merrifield固相f-moc或t-boc化学合成法。例如，可以任意地将本发明的肽和DNA序列分成所需长度并且不重叠的片段，或者是分成所需长度的重叠片段。下文将对这些方法详细描述。制备可溶性的APRIL-R

可溶型的APRIL-R通常能够有效地发送信号，因而可以作为模拟天然膜形式的药物来施用。本发明所述的APRIL-R是能够作为可溶性细胞因子形式被天然分泌的，但是，如果不能天然分泌，那么也可以重构基因以便强制分泌。为了制备APRIL-R的可溶性分泌形式，可在DNA水平上除去N-末端跨膜区域，以及部分茎干区域，并且用I型或者II型前导序列来取代它们，这些前导序列在所选择的表达系统中可通过蛋白水解被有效地切割掉。本领域技术人员可以改变分泌表达构建体中保留的茎干区域的数量，从而使配体的结合特性及分泌效率达到最佳。例如，可以制备到含有全部可能茎干长度的构建体，即N-末端截短形式，从而得到始于第1至52位氨基酸的蛋白质。可从这类分析中得到最适长度的茎干序列。制备能与APRIL-R反应的抗体

本发明还包括能与本发明请求保护的APRIL-R或其共受体特异性反应的抗体。抗-蛋白/抗-肽的抗血清或单克隆抗体可以通过标准方法(参见，例如，Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane编著(Cold Spring HarborPress：1988))制备。可以用免疫原性肽免疫哺乳动物，例如小鼠、仓鼠或兔子。赋予一蛋白或肽免疫原性的技术包括将其偶联到载体上，以及本领域熟知的其它技术。

可以将APRIL-R或其共受体的免疫原性部分与佐剂一起施用。免疫进程可以通过检测血浆或血清中抗体滴度来监测。可以用所述免疫原作为抗原，通过标准ELISA或其它免疫测定方法来测定抗体的水平。

在一个优选实施方案中，所述抗体具有针对APRIL-R或其共受体抗原决定族，例如SEQ ID NO：8所示多肽的抗原决定族，或密切相关的人或非人哺乳动物同系物(例如，70、80、或90％同源，更优选至少95％同源)的免疫特异性。在本发明的另一个优选实施方案中，抗-APRIL-R抗体或抗-APRIL-共受体抗体与具有下述特征的蛋白质基本上不交叉反应(即，为特异性反应)，即与SEQ ID NO：8之间同源性小于80％的蛋白质，优选同源性小于90％的蛋白质，最优选同源性小于95％的蛋白质。″基本上不交叉反应＂是指，抗体与非同源性蛋白质之间的亲和力，以及该抗体与SEQ ID NO：8所示蛋白质之间的结合亲和力，这二者相比，前者为后者的不到10％，更优选不到5％，甚至更优选不到1％。

本发明使用的术语抗体包括该抗体的能与APRIL-R或其受体特异性反应的片段。可以用常规技术将抗体片段化，用与上述用于完整抗体同样的方法来筛选可用的片段。例如，用胃蛋白酶处理抗体得到F(ab’)2片段。处理得到的F(ab’)2片段经过还原二硫键而生成Fab′片段。本发明所述抗体进一步还包括具有抗-APRIL-R或抗-APRIL-共受体活性的生物特异性和嵌合性的分子。因此，针对APRIL-R及其共受体的单克隆抗体及多克隆抗体(Ab)，以及抗体片段，如Fab′及F(ab′)2，都可以用来封闭APRIL-R及其相应共受体的活性。

也可以用标准重组DNA技术制备各种形式的抗体。(Winter and Milstein，Nature 349：293-299(1991)在此专门引入作为参考)例如，将动物抗体的抗原结合区连接到人源抗体的恒定区构建出嵌合抗体(例如，Cabilly等，U.S.4,816,567，在此引入作为参考)。嵌合抗体可以减弱动物抗体用于人临床治疗时激发的可见的免疫原性应答。

此外，还可以合成出能识别APRIL-R或共受体的合成“人源抗体”。人源化抗体是主要含有人IgG序列但其中已插入负责特异性抗原结合的区的嵌合体。用目的抗原免疫动物，分离相应抗体，取出负责特异性抗原结合的可变区序列。然后，将动物源的抗原结合区克隆入已经删除了抗原结合区的人抗体基因的相应位置。人源化抗体可以将人抗体中异源(即，种间)序列的使用降至最低，因而不太可能会在所治疗受试者中激发免疫应答。

通过制备含有可变功能区以及从不同类的免疫球蛋白分离出的人恒定功能区(CH1，CH2，CH3)的嵌合或人源化抗体，可以构建出不同类的重组抗体。例如，通过将抗原结合位点克隆入带有人：链恒定区的载体，可以增加抗体中的抗原结合位点的效价。(Arulanandam et al.，J.Exp.Med.，177：1439-1450(1993)，在此引入作为参考.)

此外，可以使用标准重组DNA技术改变抗原结合位点中的氨基酸残基，从而改变重组抗体与其对应抗原的结合亲和力。通过在分子模型上的诱变，可以提高人源化抗体的抗原结合亲和力。(Queen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.86：10029-33(1989)在此引入作为参考。制备同系物：制备改变后的DNA及肽序列

APRIL-R同系物在氨基酸序列上，或其它不涉及序列的方面，或者二者同时不同于天然生成的APRIL-R。非序列修饰包括APRIL-R的体内或体外化学衍生。非序列修饰包括，但不限于，乙酰化、甲基化、磷酸化、羧基化或糖基化中的改变。

优选的同系物包括APRIL-R的生物活性片段，其序列与SEQ ID NO：8所示序列之间的区别在于：1个或多个保守的氨基酸取代，或者1个或多个非保守的但不会破坏APRIL-配体活性的氨基酸取代、缺失或插入。保守取代一般包括一个氨基酸被另一个具有相同特性的氨基酸取代，例如，下列各组内部的取代：缬氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。用途

APRIL-R的全长基因(SEQ ID NO：8)或其片段可以用作cDNA文库的杂交探针，分离出与SEQ ID NO：6所示APRIL-R序列之间具有期望的序列同一性的其它基因。编码APRIL-R的核酸序列还可以用来构建下列用途的杂交探针，即用于对编码APRIL-R的基因进行做图的探针和用来对患有遗传疾病的个体进行基因分析的探针。可以设计筛选试验，找出模拟APRIL-R生物活性的先导化合物。这类筛选试验包括能够保证化学文库筛选高输出量的试验，从而使其特别适合用于鉴定小分子药物候选物。在考虑范围之内的小分子包括合成的有机化合物或无机化合物。编码APRIL-R的核酸或其修饰形式还可以用来制备转基因动物或者“敲除”动物，反过来再用这些动物开发及筛选治疗用试药，包括例如治疗癌症的药物。

通过用本发明所述序列转化宿主制备得到的APRIL-R及其同系物、以及用本领域已知方法纯化得到的天然APRIL-R，或者从已知氨基酸序列制得的APRIL-R及其同系物，这些都可以用于抗癌症用途的多种方法。

本发明的一个实施方案是一种治疗方法，该方法通过向哺乳动物施用治疗有效量的含APRIL-R拮抗剂的组合物治疗与不良细胞增殖相关的病症，其中所述APRIL-R拮抗剂包括能够拮抗APRIL及其一或多种同源受体间相互作用的多肽，以及药物学上可接受的接受体(recipient)。

一个优选实施方案中，细胞表面上的APRIL同源受体是BCMA。

该方法使用包含拮抗APRIL与其一或多种同源受体间相互作用的多肽的任何APRIL-R拮抗剂。APRIL-R拮抗剂的实例包括但不限于可溶性的APRIL-R多肽，包括但不限于可溶性BCMA；可溶性嵌合APRIL-R分子，包括但不限于BCMA-IgG-Fc和抗-APRIL-R抗体同系物，包括但不限于抗-BCMA单克隆抗体。

本发明所述方法可用于任一与不良细胞增殖相关的病症。具体地讲，本发明所述方法可以用来处理表达APRIL和/或APRIL-R(即，BCMA)的肿瘤细胞。

通过体外测定肿瘤组织库中表达的APRIL和/或APRIL-R(即，BCMA)信息的水平，可以对其细胞增生受APRIL调控的那些癌症实例进行筛选。其中APRIL和/或APRIL-R(即，BCMA)信息高表达的肿瘤组织库即为候选物。

替代地，可以用例如全长的人APRIL cDNA序列在公众及个人数据库(即，Incyte数据库)筛选候选物。应用这些技术，已经从多种类型肿瘤中检测到了APRIL mRNA表达，这些肿瘤类型包括但不限于下表1中所列类型：

表1

文库描述前列腺肿瘤系，LNCaP，CA，50M，未经处理，TIGRT-淋巴细胞瘤，淋巴瘤，TIGR卵巢肿瘤，乳头状浆囊腺瘤肺，mw/腺瘤，COPD，47M乳腺瘤，腺癌，46F，SUB，m/BRSTNOT33神经节、背根、颈、aw/淋巴瘤，32M，NORM脑瘤，额，神经瘤，32M前列腺瘤，腺癌，59M，SUB，m/PROSNOST19结肠瘤，肝曲，腺癌，55M，SUB，m/COLATMTO1胰腺瘤，TIGR副神经节肿瘤，副神经节瘤，aw/肾细胞癌，46M乳腺，mw/导管癌.43F，m/BRSTTUT16肾肿瘤，肾细胞癌，5IF膀胱，mw/TC CA，原位癌，60M，m/BLADTUT04子宫瘤，子宫内膜的，F，TIGR前列腺，BPH，mw/腺癌，PIN，59M肺，mw/腺癌，53M，m/LUNGTUT17骨瘤/系，MG-63，骨肉瘤/巨细胞，M/F pool，RP脑，额皮层，aw/肺癌，77M结肠瘤，腺癌，NORM，SUB，CGAP肺肿瘤，鳞状细胞癌，57M肺，mw/腺癌，63M前列腺，AH，mw/腺癌，50M，m/PROSTUTO1外周血，B-淋巴细胞，CLL，pool，NORM，3′CGAP结肠瘤，腺癌，pool，NORM，3/5′CGAP肾，mw/肾细胞，8，53F，pool，NORM卵巢，皮样囊肿，22F结肠瘤，腺癌，NORM，3′CGAP结肠瘤，腺癌，3′，CGAP前列腺，BPH，mw/腺癌，70M，SUB卵巢瘤，mets结肠腺癌，58F子宫，子宫肌层，mw/平滑肌瘤，43FSm肠，回肠，mw/CUC，25F淋巴节，胰周的，aw/胰腺腺癌，65M卵巢，aw/leiomyomata，36F，NORM肺，mw/纺锤形细胞良性瘤，62F肺肿瘤，鳞状癌，50M脑瘤，脑脊膜瘤，36M肿瘤，腺癌，65F，m/PANCNOT08肺，mw/支气管粘膜类癌，33M肾上腺，mw/嗜铬细胞瘤，43F，m/ADRETUT07脑瘤，额，脑脊膜瘤，50M肾肿瘤，clear cell type cancer，pool，NORM，3′CGAP乳腺，mw/小叶癌，67F肺部，mw/mets骨肉瘤，aw/胸膜mets，58M，NORM前列腺肿瘤，腺癌，59M，SUB，m/PROSNOT19Sm肠肿瘤，回肠，mets子宫内膜腺癌，64F卵巢肿瘤，腺癌，58F乳腺，NF乳腺疾病，46F脑瘤，额的，mets肾上腺样瘤，58M肾肿瘤，Wilms′，pool，WM/WN肺部，mw/mets甲状腺癌，79M，m/LUNGTUT02肺肿瘤，mets甲状腺癌，79M，m/LUNGNOT03甲状旁腺肿瘤，腺癌，M/F，NORM，WM胰腺肿瘤，退行发育瘤，45F卵巢，mw/粘蛋白囊腺瘤，43F，m/OVARTUTO1肺肿瘤，鳞状细胞癌，收集的，NORM，CGAP乳腺瘤，腺癌，46F，m/BRSTNOT17子宫，mw/平滑肌瘤，aw/结肠腺癌，45F肺部，mw/腺癌，aw/结节，膈mets，63F乳腺瘤，腺癌，46F，m/BRSTNOT33前列腺瘤，腺癌，66M，m/PROSNOT15，PROSDIN01

乳腺瘤，腺癌，54F，m/BRSTNOT03

干细胞肿瘤，pool，SUB，3′CGAP

骨髓，胫骨，aw/mets牙槽横纹肌肉瘤，16M

前列腺，AH，mw/腺癌，57M，m/PROSTUT04

乳腺，PF改变，mw/腺癌，55F，m/BRSTTUTO1

子宫瘤，血清乳头状CA，F，pooled，3′CGAP

卵巢瘤，粘蛋白囊腺瘤，43F，m/OVARNOT03

乳腺，PF改变，mw/腺癌，导管癌，43F

乳腺，mw/导管癌，原位癌，aw/结节mets，62F

神经节肿瘤，神经节细胞瘤，9M

胰腺肿瘤，腺癌，3′CGAP

子宫瘤，子宫内膜腺癌，F，pooled，3′CGAP

肺肿瘤，神经内分泌性质的类癌，pool，NORM，3′CGAP

本发明所述APRIL-R拮抗剂用于治疗与不良细胞增生相关的病症，具体是肿瘤，优选抑制肿瘤细胞生长的10％、20％、30％或40％以上，最优选50％以上。所述APRIL-R拮抗剂通过筛选(参见，例如，实施例6)获得。例如根据对分别来自结肠和肺的肿瘤的人结肠癌HT29或人肺癌A549的生长抑制活性(即，大于10％，20％，30％，40％或50％)(参见，例如，图15)，可以筛选得到APRIL-R拮抗剂。

本发明的另一个实施方案提供了用APRIL-R多肽抑制动物体内B-细胞和非B细胞的生长，树突状细胞诱导的B-细胞的生长及成熟或免疫球蛋白的生成的方法。

另一实施方案中，本发明提供了使用APRIL-R治疗下列病症的方法：自身免疫疾病、高血压、心血管病、肾脏疾病、B-细胞淋巴增生疾病、免疫抑制性疾病、器官移植、炎症、以及HIV。另外还包括了使用药剂来治疗、抑制或改变那些涉及APRIL-R与其配体间信号传输途径的免疫应答的方法。

本发明还提供了包括APRIL-R多肽和一种药物上可接受的赋形剂的药用组合物。与APRIL-R多肽适配的载体及其制剂在Oslo等编著的Remington′Pharmaceutical Sciences，第16版，1980，Mack Publishing Co.一书中有描述。通常，制剂中使用适量的药物学上可接受的盐来提供该制剂的等渗性。所述载体的实例包括缓冲溶液，例如盐水、Ringer′s溶液及葡萄糖溶液。所述溶液的pH值优选约pH5～约pH8，更优选约pH7.4～约pH7.8。进一步的载体包括缓释制剂，例如固相疏水聚合物的半透基质，该基质制成一定形式的成型物件，例如脂质体、膜或微粒。本领域技术人员明白，可以根据施用途径及所施用APRIL-R多肽的浓度对特定载体进一步地优化。

施用可以通过注射(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内)或通过输注等其它方法来完成，以确保能以有效的形式输送到血流中。

除另有说明外，实施本发明采用的为细胞生物学、细胞培养、分子生物学、微生物学、重组DNA、蛋白质化学以及免疫学中的常规技术，这些都是本领域的现有技术。这类技术在文献中已有描述。参见，例如，分子克隆：实验指南，第2版.(Sambrook，Fritsch和Maniatis，编著)，冷泉港实验室出版，1989；DNA克隆，第I及II卷(D.N.Glover，编著)，1985；寡核苷酸合成，(M.J.Gait，编著)，1984；美国专利US4,683,195(Mullis等)；核酸杂交(B.D.Hames和S.J.Higgins，编著)，1984；转录和翻译(B.D.Hames和S.J.Higgins，编著)，1984；动物细胞培养(R.I.Freshney，编著).Alan R.Liss，Inc.，1987；固定化的细胞和酶，IRL Press，1986；分子克隆使用指南(B.Perbal)，1984；Methods inEnzymology，第154及155卷(Wu et al.，编著)，Academic Press，New York；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos，编著)，1987，Cold Spring Harbor Laboratory；细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Mayer and Walker，编著)，Academic Press，London，1987；Handbook ofExperiment Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编著)，1986；Manipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1986。

下列实施例的提供是为了举例说明本发明，而决不应理解为对本发明的限制。

实施例：

下列方法用于本发明下文公开的实施例中。

方法：

myc-标记的鼠APRIL(CCM776)在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中的克隆和表达。

取用PDR004(H98 mu APRIL，在其N末端加有superFAS-配体茎和FLAG表位标签)，将其中Sac I到Not 1位点间的mu APRIL编码序列切割出来。合成寡核苷酸LTB-559和560形成一Xho-1-Sacl接头，该接头中包含一α匹配因子前导序列、myc表位标签、以及来自FAS配体的KEL基序。将muAPRIL片段和接头连接入pccm211的Xho-1-Not1位点，pccm211是一种巴斯德毕赤氏酵母表达质粒。

用Stu1使PCCM213.10线性化，并通过电穿孔导入GS115菌株(his4-)并铺板培养于含葡萄糖的极限培养基中。将单个典型菌落接种在富营养培养基(BMGY：缓冲的甘油复合培养基)中，30℃孵育48小时后，分析HIS4转化体的蛋白表达情况。离心培养物，将细胞沉淀重悬(1∶5)于含1.5％甲醇的富营养诱导培养基(BMMY：缓冲的甲醇复合培养基)。30℃诱导两天后，取上清液进行SDS-PAGE电泳，评估muAPRIL的存在。考马斯染色及Westem印迹(使用抗-myc mAb 9E10)的结果表明：一个菌株CCM776产生了足量的糖基化形式的myc-标记型-H98 muAPRIL蛋白。

Myc-mAPRIL纯化

Myc-mApril是一种表达于毕赤酵母(pichia)中的149个氨基酸的蛋白质。该蛋白质的等电点为7.45。取175ml毕赤酵母上清液透析，将缓冲换为10mM Tris pH6.8过夜，然后过20ml SP柱。用10mM Tris-HCI，pH6.8充分洗柱，用含250nmM NaCl的PBS洗脱。用凝胶过滤柱(S300)完成第二步纯化。将来自20ml SP柱的含myc-April的级分离心浓缩至7ml。凝胶过滤后，用OD和考马斯凝胶检测证实，我们收集到8mg myc-APRIL。我们还用鼠单克隆9E10抗体(抗-myc)进行了Westem印迹分析，结果表明纯化后myc标签仍是完好的。N末端测序证实了纯化后的蛋白对应于myc-mApril。

FLAG-人April纯化

使用脂质转染胺(lipofectamine)试剂(Gibco-Brl)和无血清培养基，将质粒ps429(后称p1448)瞬时转染293 T细胞。构建于哺乳动物表达载体PCR3(Invitrogen)中的该质粒编码人APRIL中的受体结合结构域，其中的N-末端蛋白被分泌至细胞培养基中。按照产品说明书(Kodak)，用抗-FLAGmAb M2柱和过量纯化的FLAG肽，从无血清培养基中纯化出FLAG-APRIL蛋白。

HBMCA-Fc纯化

将HBMCA-Fc瞬时转染入293细胞。将过量表达hBCM-Fc的293细胞培养物上样至蛋白A柱。用25mM磷酸盐100nM NaCl pH2.8洗脱蛋白，然后用1/20体积的0.5M NaP04 pH8.6中和。根据OD 280选择级分，将这些级分进行还原和非还原SDS-PAGE凝胶电泳和western印迹分析，以鉴定纯化后的蛋白。从500ml培养物中回收到了3mg蛋白。

FACS分析中Myc-mAPRIL与各种细胞系的结合

取450ng/ml已纯化的myc-mAPRIL，让其和100uI PBS/2％FBS+Fc阻断试剂(FcBlock 20ug/ml(Pharmingen)和纯化的人IgG 10ug/ml(Sandoz)在冰上结合1小时。用特异性的兔抗-鼠APRIL抗血清(1∶500)和驴抗-兔IgG-FTTC(Jackson)区分出阳性结合。将细胞系A20、Raji、NIH3T3和HT29维持在提供者(ATCC Bethesda，MD)建议的培养基中。BJAB细胞培养在加有10％FBS和L-谷氨酰胺的HEPES-缓冲的RPMI中。竞争试验中，450ng/mlmyc-鼠APRIL加入1ug/ml竞争性蛋白质。

实施例1：用平板试验来检测APRIL与APRIL-R的结合

该实施例中，测试BCMA与April的结合。

为了测试BCMA与April是否结合，我们进行了免疫共沉淀试验。该试验中使用了hBCMA-Fc和myc-mApril两种可溶性蛋白。

将HBCMA-Fc和LTbR-Fc以及下列不同TNF配体加入含10％FBS的培养基中：myc-mApril；myc-CD40L和myc-RANKL，室温孵育1/2小时。Fc蛋白与蛋白A珠结合1-2小时，用1ml PBS洗3遍，用鼠单克隆抗体9E10(抗-myc)进行免疫印迹分析，用增强型化学发光物质(Chemiluminescence)显色。

检测hBCMA-Fc免疫沉淀物中的myc-APRIL，结果表明：由于其它TNF配体myc-CD40L和myc-RANKL都不能结合BCMA，所以BCMA与April之间的作用是特异性的。Myc-April不结合LTbR-Fc。

将上述膜切成条，用抗-hIG-HRP再次转印，结果表明免疫沉淀中使用的的LTbR-Fc与BCMA-Fc等量。

实施例2：

该实施例描述了hBCMA-Fc与FLAG-hAPRIL间的相互作用。

ELISA试验：用受体-Fc融合蛋白(hBCMA-Fc739或hTNFR2-Fc-492)的pH9.6碳酸盐溶液(1ug/ml)包被平板，4℃过夜。室温下，用PBS/5％脱脂奶粉/0.5％Tween-20封闭2小时。用100μl封闭液对配体做2倍系列稀释(TNFa-197从1000ng/ml开始，muAPRIL-657从1000ng/ml开始，hApril-507从2000ng/ml开始(无活性)，hApril-429从5x浓缩的培养基开始)。用配体孵育后，将所述平板用含0.5％Tween-20的PBS洗涤，然后用以0.5μg/ml浓度溶于稀释缓冲液中的抗-FLAG mAb M2杂交。然后，用抗-鼠-PO 1/2000和酶显色(OPD)来检测该抗体。

免疫沉淀试验：在9cm平板中，用指定的表达质粒(Rec-Fc或flag配体)转染293T细胞。让转染后的细胞在8ml Optimem培养基(Gibco-BRL)中维持5天。每种受体培养物各取200μl，将其与200μl的每种配体培养物+400μlPBS+10μl ProtG-Sepharose混合，进行免疫沉淀。将这些混合物在轮上旋转1小时，用1ml PBS洗涤4遍，然后在50μl上样缓冲液(+DTT)中煮沸。将每种免疫沉淀以20μl/泳道的量上样。用1μg/ml抗-FLAG M2 mAb(Sigma，StLouis MO)和抗-鼠PO(1/2000)显示印迹。用抗-人-PO再探测的印迹膜也进行核实：100μl培养物与MeOH/CHC13/溶菌酶一起沉淀。将该混合物置于50μl上样缓冲液(+DTT)中煮沸，取20μl上样。用抗-FLAG mAb M2(1ug/ml)和抗-小鼠-PO(1/2000)显示印迹。

实施例3：

该实施例描述了myc-mAPRIL、hKayL-440(hAPRIL)和Flag-mAPRIL与hBCMA-Ig、hLT-R-Ig或hp80 TNFR-Ig间的结合情况。所有试验的条件均为：25℃，10μl/ml分钟的流速。

所有试验均使用HBS缓冲液(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％P20表面活性剂，pH7.4)。该溶液还用作电泳缓冲液和样品稀释液。。

首先，用N-羟基琥珀酰亚胺/N-乙基-N′-(3-二乙氨基丙基)-盐酸碳二亚胺(BIAcore)活化CM5芯片(BIAcore，Inc.)的表面。将hBCMA-Ig、hLT-R05-Ig、hp80-TNFR用10mM乙酸稀释至30g/ml，这三种溶液分别取20μl、15μl和10μl，然后用30μl并再用15μl乙醇胺-HCL(pH8.5)封闭。这使表面密度达到1600-3700共振单位(RU)。用20μl 1mM甲酸使芯片再生。这些重复5遍，以建立可重复的稳定基线。

在试验中，myc-mApril、hKayL-440和FLAG-mBAFF各取100μl，用稀释缓冲液稀释至30μg/ml，然后注射至芯片表面。每次注射后，立即用500μl稀释缓冲液洗涤芯片。试验间隙，注射20μl 1mM甲酸；然后另外再注射15μl甲酸使芯片再生。再生后，用稀释缓冲液平衡芯片。

实施例4：可溶型受体的制备

为了制备用于人的受体抑制剂，必须获得人受体胞外区的cDNA序列。如果该序列的鼠源形式已知，那么用该鼠cDNA序列就可以很容易地对人cDNA文库进行筛选，用本领域的常规技术来操作。有了人cDNA序列，可以设计寡核苷酸引物通过PCR扩增不含跨膜区和胞内区的受体胞外区。通常，应当包括有最后一个二硫键连接的“TNF结构域”与跨膜区之间的大多数氨基酸。可以调整其中所含的“茎干”区的量以使所得到的可溶性受体的功效最佳。对该扩增片段进行改造，使其中包含合适的限制性酶切位点，从而保证克隆入各种C-末端Ig融合嵌合载体。替代地，可以在3’末端插入终止信号，从而不必借助Ig融合嵌合体的方法就可以生产出可溶形式的受体。得到的载体可以在生物技术使用的多种系统中表达，包括酵母、昆虫细胞、细菌和哺乳动物细胞，以及现有的用于所有表达类型的实例。根据需要，挂接不同的人Fc区，从而优化或消除FcR与补体间的相互作用。替代地，可以使用这些Fc区的突变形式，从而选择性地去除FcR与补体相互作用，或者将N-连接糖与Fc区挂接从而获得某种优势。

实施例5：制备激动性或拮抗性的抗体：

用上述可溶性受体形式免疫小鼠，用常规方法制备单克隆抗体。得到的mAbs用ELISA方法鉴定后，可进一步在各种体外细胞试验中作为可溶性抗体或者固定于塑料基质上的抗体筛选激动剂活性。通常，HT29细胞系的死亡是一种感知经由多种TNF受体的信号传送的便捷系统。如果该细胞系不具有目的受体，那么可以将全长受体稳定地转染入HT29细胞系，从而可以进行细胞毒性试验。替代地，可以将该类细胞用于细胞感受器(Cytosensor)装置，评估该受体的活化是否能够引发pH变化，pH变化是信号传送事件的指示。TNF家族受体以这种模式很好地传送信号，而且该方法不必知道被该受体激发的真正生物学过程。可以将激动性的mAbs“人源化”以用于临床。该方法也可用来限定拮抗性的mAbs。这类mAb限定为：当用ELISA、经典结合试验或BIAcore技术监测时，缺乏激动活性并且能够抑制受体-配体间相互作用。最后，各种细胞响应激动性抗体而引发趋化因子分泌，这可以作为一个筛选试验。

实施例6：受体-配体相互作用的抑制剂的筛选：

使用受体-Ig融合蛋白，可以从组合文库中筛选出能够直接结合受体的分子。然后可以使用受体-Ig融合蛋白和一种能抑制受体-配体间相互作用的可溶性配体，用ELISA模式的试验来对上述这些分子进行测试。该ELISA可以直接用于在各种天然产物文库中筛选抑制活性的化合物。可以将所述受体转染入HT29等细胞系形成一种生物学测试(利用细胞毒性)，然后可将其用作筛选试验。

实施例7：体内肿瘤生长抑制

用大量生长在体内的不同肿瘤细胞系测试BCMA-Ig作为肿瘤生长拮抗剂的活性。这些试验使用无胸腺的(Nu/Nu)免疫缺陷小鼠，肿瘤细胞经皮下植入。对于SW480这种过分生长的肿瘤细胞系，我们植入了8×10⁵个置于100μl无致热原的灭菌PBS中的细胞。对照组不处理(n＝5)，而其它组施用100μg对照物-Ig(n＝6)或100μg BCMA-Ig(n＝6)蛋白。首次施用在将要植入前进行，然后每7天施用一次。用测微计测量肿瘤直径，并用公式：体积＝4/3πr³计算体积

使用Nu/Nu小鼠模型时，SW480结肠癌肿瘤生长非常迅速，10天内就可以检测到明显的肿瘤。24天后，对照肿瘤的平均体积为0.3cm³，而用BCMA-Ig处理的肿瘤的平均体积为0.19cm³，肿瘤负荷减少了46％。结肠癌HT29在Nu/Nu模型中也会快速生长。在这些试验中，将置于100μl无致热原的灭菌PBS中的1×10⁶个细胞皮下植入，给药方案同SW480。7天后检测到明显的肿瘤，对照组中，大部分肿瘤生长很快。42天后，对照组(未经任何处理以及用对照物-Ig处理的组，n＝12)平均肿瘤体积为0.485cm³，而用BCMA-Ig处理的组(n＝5)的平均肿瘤体积为0.095cm³，肿瘤负荷减少了80％。50天后，对照组中30％的小鼠肿瘤大小超过了1.5cm³被评定为终止，因而停止了试验。与对照组相反，BCMA-Ig处理组中0％小鼠被评定为终止。上述结果见表2。表2.处理50天后HT29模型中的肿瘤体积和致死率对照动物(未处理的和对照-Ig处理的) BCMA-Ig处理的肿癌体积终止肿瘤体积终止0.22 - 0.11 -0.22 - 0.32 -0.35 - 0.13 -0.61 - 0.56 -0.73 - 0.33 -1.74 +2.53 +1.51 +0.90 -0.44 -0.32 -1.92 ± - -平均：0.96 ％：30 平均：0.29 ％：0

该结果表明：用BCMA-Ig处理HT29肿瘤生长模型使平均肿瘤体积减小了70％，而且对死亡率也有显著影响。

肺癌肿瘤系A549比上述结肠癌肿瘤系生长慢。对于该细胞系，我们植入置于100μl无致热原的灭菌PBS中的1×10⁶个细胞，处理采用上述给药方案。

植入后约20天，检测到明显的肿瘤。植入后50天，对照组(未经任何处理以及用对照物-Ig处理的组，n＝16)平均肿瘤体积为0.2cm³，而用BCMA-Ig处理的组(n＝7)平均肿瘤体积为0.1cm³，肿瘤负荷减少了50％。BCMA-Ig处理组中，50天后57％的小鼠的肿瘤小于0.1cm³，而对照组仅6％的小鼠保持如此小的肿瘤负荷。肿瘤植入的60天后，对照组的平均肿瘤体积增至0.3cm³。相反，BCMA-Ig处理组的平均肿瘤体积仍小于0.2cm³(0.188)。

对于小鼠NIH3T3系，该肿瘤系也比结肠癌系生长缓慢，我们植入置于100μl无致热原的灭菌PBS中的1×10⁶个细胞，采用上述给药方案进行处理。当由皮下植入Nu/Nu小鼠时，NIH3T3细胞形成纤维肉瘤。4周后，检测到了明显的肿瘤，在接下来的10天里，对照组(n＝11)中这些肿瘤体积增大至平均大小达0.136cm³。相反，BCMA-Ig处理组(n＝5)肿瘤体积仅达到0.03cm³，肿瘤负荷减少了78％。肿瘤植入的48天后，对照组平均肿瘤体积已达1.6cm³，BCMA-Ig处理组的平均肿瘤体积仅为0.8cm³，肿瘤体积减小了50％。到52天时，对照组中82％(9/11)的动物由于肿瘤体积超过了1.5cm³而被评为终止，仅18％的动物仍然存活。相反，BCMA-Ig处理组中40％(2/5)的动物的肿瘤体积增至不得不宰杀的程度，剩下60％的动物存活。所得结果见表3。

表3.NIH3T3模型中的幸存数据

植入后的天数

38 42 48 52幸存％

对照 100 90 64 18

BCMA-1g 100 100 80 60

图13显示的是NIH3T3肿瘤随时间增长的结果。图14显示的是SW480肿瘤随时间增长的结果。图15A为HT29肿瘤随时间增长的结果，以及肿瘤植入的42天后动物个体的分布。图15B显示的是肿瘤植入后第50和60天时单个动物中A549肿瘤的生长情况。

NIH3T3肿瘤细胞系的肿瘤生长抑制的结果见图13。SW480肿瘤细胞系的肿瘤生长抑制的结果见图14。HT29和A549肿瘤细胞系的肿瘤生长抑制的结果见图15。

实施例8：BCMA-IgG导致正常小鼠体内B细胞数目的减少

8周龄的雌性BALB/c小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor，ME)。

第-8、-5、-1和+2天，在小鼠(每3个一组)腹膜内注入PBS、400μg人BCMA-huIgGI(hBCMA-Ig)融合蛋白(Teresa Cachero，Biogen提供)、或者400μg纯化后的人IgG(HuIgG)(Sandoz，Basel，Switzerland)。第0天时，小鼠接受了100μl 10％绵羊红细胞(SRBC)(Colorado Serum Company，Denver，CO)。

宰杀时，通过心脏穿刺将血液收集入含有EDT的试管中，在低渗缓冲液中溶解红细胞。也收集不加EDTA的血液用于血清制备。从脾和肠系膜淋巴结(MLN)制备单细胞悬液，在低渗缓冲液中溶解红细胞。使用PE-偶联的抗-CD45R/B220、抗-多配体聚糖/CD138和抗-B7.2，以及FITC-偶联的抗-IgM及抗-CD45R/B220，进行流式细胞计数(FloW cytometry)。所有单抗均购自Pharmingen(San Diego，CA)。

简而言之，在冰上，用10μg/ml Fc Block(Pharmingen)封闭Fc受体15分钟，接着加入PE-和FITC-偶联的mAb，在冰上孵育20-30分钟。细胞洗1次，悬浮于0.5％多聚甲醛中。在FACSCalibur流式细胞仪(BectonDickinson，San Jose，CA)上获取细胞荧光数据，并用CELLQuest^TM软件(Becton Dickinson)进行分析。

用hBCMA-Ig处理后，所测试的外周血和外周淋巴器官中B细胞数目减少了约50％。在PBS处理组和HuIgG-处理组的小鼠中，B220^高IgM^低B细胞在细胞中所占比例分别为23.4％和21.5％，而hBCMA-Ig-处理组的小鼠中，这一细胞类群所占细胞的比例仅为9.9％。PBS处理组以及HuIgG-处理组的小鼠的血液中，浆细胞(sndecan/CD138+)分别仅减少5.7％和4.8％，与之相比，hBCMA-Ig-处理组的小鼠减少了3.9％。PBS处理组和HuIgG-处理组的小鼠中，B220+细胞上的B7.2分子分别上调了3.1％和4.5％，与之相比，hBCMA-Ig处理组的小鼠中上调比例为1.9％。

hBCMA-Ig处理组的小鼠的脾内，B220^高B细胞显著减少，为18.8％，与之相比，PBS-和HuIgG-处理组的小鼠分别为36.7％和40％。IgM^high和IgM^low亚群中也观察到了这种下降趋势(见表1)。脾内新生B细胞区中未见变化，B220^low IgM^high(数据未显示)。PBS-处理组和HuIgG-处理组的小鼠的脾内，浆细胞(syndecan/CD138+)减少的比例分别为3.3％和3.4％，与之相比，hBCMA-Ig处理组的小鼠中的比例为2.4％。

hBCMA-Ig处理组的小鼠MLN显示B220+B细胞减少14.1％，与之相比，PBS-处理组以及HuIgG-处理组的小鼠分别为26.7％和35.8％。数据总结于表3。

表3hBCMA-Ig、PBS以及HuIgG-处理过的小鼠中的B细胞类群¹

血液 B220^high 多配体聚糖 B7.2/B220^lowIgM^lowPBS 23.4±5.7 5.7±1.5 3.1±0.5HuIgG 21.5±4.5 4.8±0.9 4.5±1.0HBCMA-Ig 9.9±1.8 3.9±0.6 1.9±0.5
	脾 B220^high B220^high 多配体聚糖IgM^lowPBS 27.8±1.6 11.9±1.6 3.3±0.8HuIgG 30.5±2 11.8±1.0 3.4±0.7HBCMA-Ig 10.6±0.2 8.4±0.2 2.4±0.2
MLN B220⁺PBS 26.7HuIgG 35.8±3.3HBCMA-Ig 14.1±5.9

¹按照材料和方法部分中的描述处理小鼠，数据以％±标准差的形式给出。

hBCMA-Ig处理组的小鼠在用SRBC免疫后，血液中B7.2+B细胞以及血液和脾内浆细胞的百分比降低，这表明B细胞活化和/或成熟受到抑制，而且活化B细胞的清除大大增强。极小百分比的抗原特异性B细胞被活化，并可应答任一抗原，在这种情况下指SRBC。因为hBCMA-Ig处理导致所检测的全部组织中B细胞都明显减少，达50％，所以hBCMA-Ig活性可能还靶向静息、成熟B细胞。

因此，可以将BCMA融合蛋白用作治疗药物临床用于B细胞介导的疾病。所述疾病包括那些天然状态下自身免疫的疾病，例如系统性红斑狼疮、重症肌无力、自身免疫溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂(antiphospholipid)综合征、恰加斯病(Chaga’s disease)、格雷夫斯病(Grave’sdisease)、韦格纳(Wegener)肉芽肿病、结节性多动脉炎和急进性肾小球肾炎。所述的治疗药剂还可以用于浆细胞疾病，例如多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦(Waldenstrom’s)巨球蛋白血症、重链病(Heavey-chain disease)、原发性或免疫细胞相关的淀粉样变、以及性质未明的单克隆丙种球蛋白病(monoclonalgammopathy of undetermined significance)(MGUS)。肿瘤学对象包括B细胞癌、白血病、和淋巴瘤。

本领域技术人员都知道，在不脱离本发明实质和范围的前提下，可以对本发明所述多肽、组合物及方法进行各种修饰和变更。因此，如果本发明的修饰和变更落在本发明所附权利要求及其等价物的范围之内，那么它们就应属于本发明所覆盖的范围。

序列表

序列表<110>阿波泰克R&D股份有限公司(Apotech R&D S.A.)

比奥根公司(Biogen，Inc.)<120>April受体(BCMA)及其用途<130>A083PCT<140>PCT/US00/27579<141>2000-10-05<150>60/215688<151>2000-06-30<150>60/181807<151>2000-02-11<150>60/157933<151>1999-10-06<160>12<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>736<212>DNA<213>鼠<400>1ccaaacgatg agatttcctt caatttttac tgcagtttta ttcgcagcat cctccgcatt 60agctgctcca gtcaacacta caacagaaga tgaaacggca caaattccgg ctgaagctgt 120catcggttac tcagatttag aaggggattt cgatgttgct gttttgccat tttccaacag 180cacaaataac gggttattgt ttataaatac tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga 240aggggtatct ctcgagaaaa gagaacaaaa actcatttct gaggaagatc tgaataaaga 300gctccactca gtcctgcatc ttgttccagt taacattacc tccaaggact ctgacgtgac 360agaggtgatg tggcaaccag tacttaggcg tgggagaggc ctggaggccc agggagacat 420tgtacgagtc tgggacactg gaatttatct gctctatagt caggtcctgt ttcatgatgt 480gactttcaca atgggtcagg tggtatctcg ggaaggacaa gggagaagag aaactctatt 540ccgatgtatc agaagtatgc cttctgatcc tgaccgtgcc tacaatagct gctacagtgc 600aggtgtcttt catttacatc aaggggatat tatcactgtc aaaattccac gggcaaacgc 660aaaacttagc ctttctccgc atggaacatt cctggggttt gtgaaactat gagcggccgc 720gaattaattc gcctta 736<210>2<211>736<212>DNA<213>鼠<400>2ggtttgctac tctaaaggaa gttaaaaatg acgtcaaaat aagcgtcgta ggaggcgtaa 60tcgacgaggt cagttgtgat gttgtcttct actttgccgt gtttaaggcc gacttcgaca 120gtagccaatg agtctaaatc ttcccctaaa gctacaacga caaaacggta aaaggttgtc 180gtgtttattg cccaataaca aatatttatg atgataacgg tcgtaacgac gatttcttct 240tccccataga gagctctttt ctcttgtttt tgagtaaaga ctccttctag acttatttct 300cgaggtgagt caggacgtag aacaaggtca attgtaatgg aggttcctga gactgcactg 360tctccactac accgttggtc atgaatccgc accctctccg gacctccggg tccctctgta 420acatgctcag accctgtgac cttaaataga cgagatatca gtccaggaca aagtactaca 480ctgaaagtgt tacccagtcc accatagagc ccttcctgtt ccctcttctc tttgagataa 540ggctacatag tcttcatacg gaagactagg actggcacgg atgttatcga cgatgtcacg 600tccacagaaa gtaaatgtag ttcccctata atagtgacag ttttaaggtg cccgtttgcg 660ttttgaatcg gaaagaggcg taccttgtaa ggaccccaaa cactttgata ctcgccggcg 720cttaattaag cggaat 736<210>3<211>234<212>PRT<213>人(homo sapiens)<400>3Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Leu Glu Lys Arg Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn

85 90 95Lys Glu Leu His Ser Val Leu His Leu Val Pro Val Asn Ile Thr Ser

100 105 110Lys Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Val Leu Arg Arg

115 120 125Gly Arg Gly Leu Glu Ala Gln Gly Asp Ile Val Arg Val Trp Asp Thr

130 135 140Gly Ile Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe His Asp Val Thr Phe145 150 155 160Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Arg Glu Thr

165 170 175Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser Asp Pro Asp Arg Ala Tyr

180 185 190Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile

195 200 205Ile Thr Val Lys Ile Pro Arg Ala Asn Ala Lys Leu Ser Leu Ser Pro

210 215 220His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu225 230<210>4<211>542<212>DNA<213>人(homo sapiens)<400>4ttaatcaaaa catggctatc atctacctca tcctcctgtt caccgctgtg cggggcgatt 60acaaagacga tgacgataaa ggacccggac aggtgcagct gcagaaacag aagaagcagc 120actctgtcct gcacctggtt cccattaacg ccacctccaa ggatgactcc gatgtgacag 180aggtgatgtg gcaaccagct cttaggcgtg ggagaggcct acaggcccaa ggatatggtg 240tccgaatcca ggatgctgga gtttatctgc tgtatagcca ggtcctgttt caagacgtga 300ctttcaccat gggtcaggtg gtgtctcgag aaggccaagg aaggcaggag actctattcc 360gatgtataag aagtatgccc tcccacccgg accgggccta caacagctgc tatagcgcag 420gtgtcttcca tttacaccaa ggggatattc tgagtgtcat aattccccgg gcaagggcga 480aacttaacct ctctccacat ggaaccttcc tggggtttgt gaaactgtga tctagagggc 540cc 542<210>5<211>542<212>DNA<213>人(homo sapiens)<400>5aattagtttt gtaccgatag tagatggagt aggaggacaa gtggcgacac gccccgctaa 60tgtttctgct actgctattt cctgggcctg tccacgtcga cgtctttgtc ttcttcgtcg 120tgagacagga cgtggaccaa gggtaattgc ggtggaggtt cctactgagg ctacactgtc 180tccactacac cgttggtcga gaatccgcac cctctccgga tgtccgggtt cctataccac 240aggcttaggt cctacgacct caaatagacg acatatcggt ccaggacaaa gttctgcact 300gaaagtggta cccagtccac cacagagctc ttccggttcc ttccgtcctc tgagataagg 360ctacatattc ttcatacggg agggtgggcc tggcccggat gttgtcgacg atatcgcgtc 420cacagaaggt aaatgtggtt cccctataag actcacagta ttaaggggcc cgttcccgct 480ttgaattgga gagaggtgta ccttggaagg accccaaaca ctttgacact agatctcccg 540gg 542<210>6<211>172<212>PRT<213>人(homo sapiens)<400>6Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Asp1 5 10 15Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Pro Gly Gln Val Gln Leu Gln Lys

20 25 30Gln Lys Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr

35 40 45Ser Lys Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu

50 55 60Arg Arg Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln65 70 75 80Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val

85 90 95Thr Phe Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln

100 105 110Glu Thr Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg

115 120 125Ala Tyr Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly

130 135 140Asp Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu145 150 155 160Ser Pro His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu

165 170<210>7<211>555<212>DNA<213>人(homo sapiens)<400>7atgttgcaga tggctgggca gtgctcccaa aatgaatatt ttgacagttt gttgcatgct 60tgcatacctt gtcaacttcg atgttcttct aatactcctc ctctaacatg tcagcgttat 120tgtaatgcaa gtgtgaccaa ttcagtgaaa ggaacgaatg cgattctctg gacctgtttg 180ggactgagct taataatttc tttggcagtt ttcgtgctaa tgtttttgct aaggaagata 240agctctgaac cattaaagga cgagtttaaa aacacaggat caggtctcct gggcatggct 300aacattgacc tggaaaagag caggactggt gatgaaatta ttcttccgag aggcctcgag 360tacacggtgg aagaatgcac ctgtgaagac tgcatcaaga gcaaaccgaa ggtcgactct 420gaccattgct ttccactccc agctatggag gaaggcgcaa ccattcttgt caccacgaaa 480acgaatgact attgcaagag cctgccagct gctttgagtg ctacggagat agagaaatca 540atttctgcta ggtaa 555<210>8<211>184<212>PRT<213>人(homo sapiens)<400>8Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser1 5 10 15Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr

20 25 30Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser

35 40 45Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu

50 55 60Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile65 70 75 80Ser Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu

85 90 95Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu

100 105 110Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys

115 120 125Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe

130 135 140Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys145 150 155 160Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu

165 170 175Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg

180<210>9<211>483<212>DNA<213>人(homo sapiens)<400>9gttgaagcta caagaagatt atgaggagga gattgtacag tcgcaataac attacgttca 60cactggttaa gtcactttcc ttgcttacgc taagagacct ggacaaaccc tgactcgaat 120tattaaagaa accgtcaaaa gcacgattac aaaaacgatt ccttctattc gagacttggt 180aatttcctgc tcaaattttt gtgtcctagt ccagaggacc cgtaccgatt gtaactggac 240cttttctcgt cctgaccact actttaataa gaaggctctc cggagctcat gtgccacctt 300cttacgtgga cacttctgac gtagttctcg tttggcttcc agctgagact ggtaacgaaa 360ggtgagggtc gatacctcct tccgcgttgg taagaacagt ggtgcttttg cttactgata 420acgttctcgg acggtcgacg aaactcacga tgcctctatc tctttagtta aagacgatcc 480att 483<210>10<211>483<212>DNA<213>人(homo sapiens)<400>10caacttcgat gttcttctaa tactcctcct ctaacatgtc agcgttattg taatgcaagt 60gtgaccaatt cagtgaaagg aacgaatgcg attctctgga cctgtttggg actgagctta 120ataatttctt tggcagtttt cgtgctaatg tttttgctaa ggaagataag ctctgaacca 180ttaaaggacg agtttaaaaa cacaggatca ggtctcctgg gcatggctaa cattgacctg 240gaaaagagca ggactggtga tgaaattatt cttccgagag gcctcgagta cacggtggaa 300gaatgcacct gtgaagactg catcaagagc aaaccgaagg tcgactctga ccattgcttt 360ccactcccag ctatggagga aggcgcaacc attcttgtca ccacgaaaac gaatgactat 420tgcaagagcc tgccagctgc tttgagtgct acggagatag agaaatcaat ttctgctagg 480taa 483<210>11<211>906<212>DNA<213>人(homo sapiens)<400>11atggagacag acacactcct gttatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60gacgtcacga tgttgcagat ggctgggcag tgctcccaaa atgaatattt tgacagtttg 120ttgcatgctt gcataccttg tcaacttcga tgttcttcta atactcctcc tctaacatgt 180cagcgttatt gtaatgcaag tgtgaccaat tcagtgaaag gagtcgacaa aactcacaca 240tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca 300aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 360gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 420aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 480ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 540aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa 600ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg 660acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg 720cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc 780ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc 840tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccc 900gggaaa 906<210>12<211>302<212>PRT<213>人(homo sapiens)<400>12Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1 5 10 15Gly Ser Thr Gly Asp Val Thr Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser

20 25 30Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln

35 40 45Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys

50 55 60Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser Val Lys Gly Val Asp Lys Thr His Thr65 70 75 80Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

85 90 95Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

100 105 110Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

115 120 125Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

130 135 140Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val145 150 155 160Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

165 170 175Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

180 185 190Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

195 200 205Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

210 215 220Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly225 230 235 240Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

245 250 255Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

260 265 270Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

275 280 285Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

290 295 300

Claims

1.一种治疗哺乳动物中与不良细胞增生相关的病症的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的含APRIL-R拮抗剂的组合物，其中所述APRIL-R拮抗剂包括一种能够拮抗APRIL与其一或多种同源受体之间相互作用的多肽，以及一种药物学可接受的赋形剂。

2.权利要求1中方法，其中所述的APRIL-R拮抗剂选自：

(a)一种可溶性的APRIL-R多肽；

(b)一种可溶性嵌合分子，其中包括融合于异源氨基酸序列上的可溶性APRIL-R多肽；以及

(c)抗-APRIL-R抗体同系物。

3.权利要求2中的方法，其中所述可溶性APRIL-R多肽选自：

a)一种分离的APRIL-R多肽变体或其片段，所述变体与含有SEQ IDNO：8(图3A)中第1-184位氨基酸残基的天然APRIL-R多肽序列之间具有至少80％氨基酸序列同一性；

b)一种分离的APRIL-R多肽变体或其片段，所述变体与SEQ ID NO：8(图3A)中第1-52位氨基酸残基之间具有至少80％氨基酸序列同一性；以及

c)一种分离的APRIL-R多肽或其片段，所述多肽包括SEQ ID NO：8(图3A)中的第8-41位氨基酸残基。

4.权利要求2中的方法，其中所述的可溶性嵌合分子包括：

a)一种可溶性APRIL-R多肽，该多肽选自：

i.一种分离的APRIL-R多肽变体或其片段，所述变体与含有SEQ IDNO：8(图3A)中第1-184位氨基酸残基的天然APRIL-R多肽序列之间具有至少80％氨基酸序列同一性；

ii.一种分离的APRIL-R多肽变体或其片段，所述变体与SEQ ID NO：8(图3A)中第1-52位氨基酸残基之间具有至少80％氨基酸序列同一性；以及

iii.一种分离的APRIL-R多肽或其片段，所述多肽包括SEQ ID NO：8(图3A)中的第8-41位氨基酸残基。

b)融合于异源氨基酸序列。

5.权利要求4中的方法，其中所述的异源氨基酸序列来自免疫球蛋白的IgG Fc区。

6.权利要求4中的方法，其中所述的异源氨基酸序列来自分泌蛋白的信号序列。

7.权利要求2中的方法，其中所述的抗APRIL-R抗体同系物包括能够与选自下列组的APRIL-R多肽结合的抗体：

8.一种治疗哺乳动物中与不良细胞增生相关的病症的方法，该方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的两种或多种拮抗剂，其中所述拮抗剂中至少两种包含第一APRIL-R拮抗剂和第二APRIL-R拮抗剂，所述第一拮抗剂能够拮抗APRIL与BCMA间的相互作用，所述第二拮抗剂能够拮抗APRIL与另一同源APRL受体或非BCMA的受体间的相互作用。

9.权利要求1-8中的方法，其中所述与不良细胞增生相关的病症为癌瘤。

10.权利要求1-8中的方法，其中所述的与不良细胞增生相关的病症为癌症。

11.权利要求1-8中的方法，其中所述的哺乳动物为人。

12.一种对其癌瘤增生可受APRIL调控的患者进行治疗的方法，该方法包括向所述患者施用治疗有效量的包含APRIL-R拮抗剂的组合物，所述APRIL-R拮抗剂包括一种能够拮抗APRIL和APRIL-R间相互作用的多肽。

13.权利要求9中的方法，其中所述的癌瘤选自人肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌，以及其它增生受APRIL调控的癌瘤。