DK173928B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et ønsket modent protein i en hvirveldyrværtscelle, polycistronisk ekspressionsvektor for det ønskede protein og hvirveldyrcellekultur transformeret med vektoren - Google Patents

Description

i DK 173928 B1

Opfindelsen angår anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi til produktion af polypeptid i hvirveldyrcellekulturer. Nærmere betegnet angår opfindelsen udnyttelse af kodningssekvensen for et sekundært kontrolpolypeptid som et redskab til at styre produktion af et fremmed polypeptid hos hvirveldyrcellekulturen.

5

Det almene princip at anvende en værtscelle til produktion af et heterologt protein, dvs. et protein, som almindeligvis ikke produceres af denne celle, er velkendt.

Imidlertid er der mange tekniske vanskeligheder ved at opnå rimelige mængder af det heterologe protein ved anvendelse af hvirveldyrværtsceller, hvilket er ønskeligt på 10 grund af deres egenskaber med hensyn til håndtering af proteinet. Der har været et antal heldige eksempler på inkorporering af genetisk materiale, der koder for heterologe proteiner, i bakterier og opnåelse af udtrykkelse deraf. F.eks. er der således blevet produceret humant interferon, desacetyl-thymosin a-1, somatostatin, og humant væksthormon. For nylig har det været muligt at udnytte ikke-bakterielle 15 værter, såsom gærceller (se f.eks. EP offentliggørelsesskrift nr. 0 060 057) og hvirveldyrcellekulturer (se EP offentliggørelsesskrift nr. 0 073 656), som værter. Anvendelsen af hvirveldyrcellekulturer som værter ved produktionen af pattedyrproteiner er fordelagtig, fordi sådanne systemer har yderligere evner til modifikation, glycosylering, tilføjelse af transportsekvenser og anden efterfølgende behandling af 20 det resulterende peptid, som er produceret i cellen. Medens f.eks. bakterier med held kan transficeres og bringes til at udtrykke "α-thymosin", mangler det producerede polypeptid N-acetylgruppen hos det "naturlige" α-thymosin, som findes i pattedyrsystemet.

25 I almindelighed inkluderer den gensplejsningsteknik, som er udformet til at gøre det muligt for værtsceller at producere heterologe proteiner, fremstillingen af en "ekspressionsvektor", som er en DNA-sekvens Indeholdende (1) en "promotor", dvs. en sekvens af nucleotider, der styrer og muliggør 30 ekspressionen afen kodningssekvens; (2) en sekvens, der forsyner mRNA med et ribosombindingssted; (3) et "kodningsområde", dvs. en sekvens af nucleotider, der koder for det ønskede 35 polypeptid; DK 173928 B1 2 (4) en "afslutningssekvens", som muliggør afslutning af transkriptionen, når hele koden for det ønskede protein er blevet aflæst; og (5) hvis vektoren ikke er direkte indsat i genomet, et "replikon" eller replicerings-5 origin, som gør det muligt for hele vektoren at reproduceres, når først den er i cellen.

Ved konstruktionen af vektorer ifølge opfindelsen styrer den samme promotor to kodningssekvenser, den ene for et ønsket protein og den anden for et sekundært 10 protein. Transkriptionsafslutningen deles også af disse sekvenser. Imidlertid fremstilles proteinerne i adskilt form, fordi de er adskilt af et stop- og start-translationssignal.

Almindeligvis har de genetiske ekspressionsvektorer form af plasmider, som er ekstra 15 chromosomale løkker af dobbeltstrenget DNA. Disse findes i naturlig form i bakterier, ofte i flere kopier pr. celle. Imidlertid kan der også konstrueres kunstige plasmider (og disse er selvfølgelig de mest nyttige) ved sammensplejsning af de fire nødvendige elementer, skitseret ovenfor, i rigtig rækkefølge under anvendelse af passende" restriktionsenzymer". Restriktionsenzymer er nucleaser, hvis katalytiske aktivitet er 20 begrænset til at lysere ved en bestemt basesekvens, idet hver basesekvens er karakteristisk for et bestemt restriktionsenzym. Ved fagmæssig konstruktion af de terminale ender af de ovenfor skitserede elementer (eller fraktioner deraf) er det muligt at få restriktionsenzymer til at splejse disse elementer sammen til dannelse af en færdig genetisk ekspressionsvektor.

25

Tilbage er derefter at få værtscellen til at inkorporere vektoren (transfektion) og at dyrke værtscellerne på en sådan måde, at der frembringes syntese af det ønskede polypeptid som et ledsagefænomen til normal vækst.

30 To typiske problemer er forbundet med den ovenfor skitserede procedure. For det første er det ønskeligt i en vektor foruden de fire nødvendige elementer, som er skitseret ovenfor, at have en markør, som vil tillade en direkte selektion for de celler, som faktisk har modtaget den genetiske ekspressionsvektor. Ved anvendelsen af bakterieceller som værter er hyppigt anvendte markører resistens over for et antibio-35 tikum, såsom tetracyklin eller ampicillin. Kun de celler, som er resistente over for midlet, vil vokse i kulturer indeholdende antibiotikummet. Hvis derfor cellekulturen, som er søgt transficeret, dyrkes på et medium indeholdende antibiotikummet, vil kun 3 DK 173928 B1 de faktisk transficerede celler vise sig som kolonier. Eftersom transformationsfrekvensen er ganske lav (omkring en celle pr. 106 transficeres under ideelle betingelser), er dette i praksis næsten en nødvendig forudsætning.

5 For hvirveldyrceller som værter er den opnåede transformationsgrad mere effektiv (omkring en celle pr. 103). Imidlertid forbliver en bekvem selektion vigtig for opnåelsen af de ønskede transficerede celler. Selektion gøres også vigtig, fordi celledelingshastigheden er omkring 50 gange lavere end i bakterieceller, dvs. medens E. coli deler sig en gang for ca. hver 20-30 minutter, deler humane vævskulturceller 10 sig kun en gang for hver 12-24 timer.

En side af den foreliggende opfindelse løser problemet med at selektere for hvirveldyrceller, som har optaget den genetiske ekspressionsvektor for det ønskede protein, ved at udnytte ekspressionen af kodningssekvensen for et sekundært protein, som 15 f.eks. et nødvendigt enzyn , med hensyn til hvilket værtscellen er deficient. F.eks. kan dihydrofolatreduktase (DHFR) anvendes som markør ved anvendelse af værtsceller, som er deficiente med hensyn til DHFR.

Et andet problem ved produktionen af polypeptider i en fremmed vært er udvindingen 20 af tilfredsstillende mængder af protein. Det ville være ønskeligt at have en eller anden mekanisme til at regulere, og fortrinsvis forhøje, produktionen af det ønskede heterologe polypeptid. Ifølge en anden side af forbindelsen udnyttes en sekundær kodningssekvens, som kan påvirkes af udefra styrede parametre, til at muliggøre styring af ekspressionen ved styring af disse parametre. Endvidere muliggør tilvejebringelsen af 25 begge sekvenser på et polycistron I sig selvselektion af transformanter med høje ekspressionsniveauer af den primære sekvens.

Det er blevet påvist, at DHFR-kodningssekvenser kan indføres i, udtrykkes i og forstærkes i pattedyrceller. Genomisk DNA fra methotrexat-resistente kinesisk 30 hamsterovarie-(CHO)-celler er blevet indført i museceller og resulterer i transformanter, som også er resistente over for methotrexat (1). Den mekanisme, hvorved methotrexat-(MTX)-resistens i museceller udvikles, viser sig at være tredobbelt; ved genforstærkning af DHFR-kodningssekvensen (2,3,4), ved sænkning i optagelsen af MTX (5,6) og ved reduktion i den producerede DHFR’s affinitet for MTX (7).

Det viser sig, at forstærkning af DHFR-genet-ved udsættelse for MTX kan resultere i en ledsagende forstærkning af en medtransficeret gensekvens. Det er også blevet 35 DK 173928 B1 4 påvist, at musefibroblaster transficeret med både et plasmid indeholdende hepatitis B DNA-sekvenser og genomisk DNA fra en hamstercellelinie indeholdende et mutant gen for MTX-resistent DHFR, secernerer forøgede mængder af hepatitis B overflade antigen (HBsAg) i mediet, når der anvendes MTX til at stimulere DHFR-sekvens-5 forstærkning (8). Endvidere forstærkes mRNA, der koder for E. coli proteinet XGPRT, i nærvær af MTX i CHO-celler, der er cotransficeret med DHFR- og XGPRT-gen-sekvenser under styring af uafhængige promotorer (9). Endelig er der blevet påvist forøget ekspression af en sekvens endogen for promotoren i en DHFR/SV40-plas-mid-kombination i nærvær af MTX (10).

10

Reference (8) sammen med reference (9) angiver blot co-transfektion af et plasmid, som koder for DHFR, med et (andet) plasmid, som koder for hepatitis B-overflade-antigen eller XGPRT. Hver af disse referencer beskriver systemer, hvor celler co-trans-ficeres med to separate plasmider, som hvert driver transskriptionen af et protein via 15 en promotor. Således frer. i.‘.»ringes i de systemer to transskripter, en fra hvert af de respektive to plasmider. Fra de to transskripter sker translation af de to separate polypeptider. Dette er forskelligt fra opfindelsen ifølge den foreliggende ansøgning, hvor et enkelt plasmid indeholdende DNA, som koder for to polypeptider, danner en enkelt transskript, som producerer de to polypeptider med uafhængig translation.

20

Den foreliggende opfindelse er baseret på den erkendelse, at i hvirveldyrscelleværter, hvor den genetiske ekspressionsvektor for et ønsket polypeptid indeholder en sekundær genetisk kodningsekvens under styring af den samme promotor, tilvejebringer denne sekundære sekvens en hensigtsmæssig udvælgelsesmarkør både for 25 transformanter i almindelighed og for transformanter, der udviser høje ekspressionsniveauer for den primære sekvens, samtidig med at den tjener som en kontrolindretning, hvorved ekspressionen afen ønsket polypeptid kan reguleres, hyppigst forhøjes.

30 Dette er særlig betydningsfuldt, da de to proteiner ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen produceres separat i moden form. Selv om begge DNA-kodningssekvenser styres af den samme transkriptionspromotor, således at der dannes en sammenknyttet mRNA, adskilles de af et translationsstop-signal for den første og et translationsstart-signal for den anden, således at der opstår to uafhængige proteiner.

35

Da et hvirveldyr-værtscelle-kultursystem ofte er fordelagtigt, fordi det er i stand til glycosylering, phosphorylering og lipid associering passende til dyresystemer (medens 5 DK 173928 B1 bakterieværter ikke er det), er det betydningsfuldt, at markørsystemer og reguleringssystemer kan tilvejebringes i denne sammenhæng.

I overensstemmelse hermed angår en side af opfindelsen en fremgangsmåde til 5 fremstilling af et ønsket modent protein i en hvirveldyrværtscelle, kendetegnet ved, at (a) der tilvejebringes en ekspressionsvektor, som omfatter i) en DNA-sekvens, som koder for det ønskede protein, og ii) en DNA-sekvens, som koder for et sekundært protein, hvis syntese er 10 underkastet styring af det omgivende miljø, og hvori hver af sekvenserne i) og ii) er anbragt således, at de er under styring af den samme promotor, men er adskilt af et translations-stop-signal og et translations-startsignal, (b) en hvirveldyrværtscellekultur transficeres med den under (a) beskrevne vektor, og 15 (c) værtscellekulturen får lov til at vokse under betingelser, som er gunstige for produktionen af det sekundære protein.

I andre henseender angår opfindelsen en polycitronisk ekspressionsvektor, som er I stand til i en hvirveldyrværtcellekultur at udtrykke et ønsket protein og et sekundært 20 protein, kendetegnet ved, at den omfatter en DNA-sekvens, som koder for et ønsket protein, og en DNA-sekvens, som koder for et sekundært protein, hvis syntese er underkastet styring af det omgivende miljø, hvor begge DNA-sekvenserne er operabelt forbundet med den samme promotorsekvens, men adskilt af translationsstop- og -start-codoner samt hvirveldyrceller, kendetegnet ved, at de er transformeret 25 med en vektor ifølge et hvilket som helst af kravene 9-13.

På tegningerne viser fig. 1 konstruktionen af en ekspressionsvektor for HBsAg, pE342.HS94.HBV; 30 fig. 2 konstruktionen afen ekspressionsvektor for DHFR, pE342.D22; og fig. 3 konstruktionen af ekspressionsvektorer for DHFR og HBsAg, pE342.HBV.D22 og pE342.HBV.E400.D22.

35 DK 173928 B1 6 A. Definitioner I denne beskrivelse med krav inkluderer "plasmider" både naturligt forekommende plasmider i bakterier og kunstigt konstruerede cirkulære DNA-fragmenter.

5 "Ekspressionsvektor" betyder et plasmid, som indeholder mindst de fire nødvendige elementer som anført ovenfor til ekspression af det heterologe peptid i en værtscellekultur.

io "Heterologt protein" betyder et protein eller peptid, som ikke normalt produceres af eller kræves for levedygtigheden af værtsorganismen.

"Ønsket protein" betyder et heterologt protein eller peptid, som fremgangsmåden ifølge opfindelsen er udformet til at producere.

15 "Sekundært peptid" betyder det protein eller peptid, som ikke er det heterologe peptid, der ønskes som det primære produkt af ekspressionen i værtscellen, men snarere et andet heterologt peptid, som på grund af dets egne egenskaber eller på grund af egenskaberne ved den sekvens, der koder for det, er i stand til at "markere" 20 transfektion af ekspressionsvektoren og/eller regulere ekspressionen af det primært ønskede heterologe peptid.

Peptidsekvensen kan være enten lang eller kort I området fra omkring fem aminosyrer til omkring 1000 aminosyrer. Den konventionelle skelnen mellem ordene peptid og 25 protein følges ikke rutinemæssigt i beskrivelsen af opfindelsen. Hvis der skal skelnes, vil det blive anført.

"Primær sekvens" er nucleotidsekvensen, der koder for det ønskede peptid, og sekundær sekvens" betyder en sekvens af nucleotider der koder for det sekundære 30 peptid.

"Transfektion" af en værtscelle betyder, at ekspressionsvektoren er blevet optaget af værtscellen på en sporbar måde, hvad enten der faktisk udtrykkes nogen kodningssekvenser eller ej. I opfindelsens sammenhæng vil heldig transfektion, blive 35 anerkendt, når der forekommer nogen som helst indikation af denne vektors virkning i værtscellen. Det erkendes, at der er forskellige niveauer af held i denne sammenhæng. For det første kan vektorens kodningssekvens udtrykkes eller ikke udtrykkes.

DK 173928 B1 7

Hvis vektoren er rigtigt konstrueret med inklusion af promotor og terminator, er det imidlertid stærkt sandsynligt, at der vil ske udtrykkelse. For det andet, hvis plasmidet, der repræsenterer vektoren, optages af cellen og udtrykkes, men ikke inkorporeres i cellens normale-chromosomale materiale, vil evnen til at udtrykke dette plasmid blive 5 tabt efter nogle få generationer. Hvis på den anden side vektoren optages i chromo-somet, forbliver ekspressionen stabil igennem gentagne replikationer af værtscellen.

Der kan også være et mellemresultat. De præcise detaljer ved den måde, hvorpå der således kan ske transfektion, er ikke forstået, men det er klart, at der eksperimentelt findes et kontinuum af resultater med hensyn til ekspressionens stabilitet over flere 10 generationer af værtskulturen.

B. En foretrukken udførelsesform af det ønskede peptid 15 I en foretrukken specifik udførelsesform af opfindelsen koder den primære genetiske sekvens for hepatitis-B-overfladeantigen (HBsAg). Dette protein afledes fra hepatitis B virus, det infektive agens for hepatitis B hos mennesker. Denne sygdom er karakteriseret af svækkelse, leverbeskadigelse, primær carcinoma og ofte død. Sygdommen er ret udbredt, især i mange afrikanske og asiatiske lande, hvor mange mennesker er 20 kroniske bærere med evne til at overføre sygdommen pandemisk. Viruset (HBV) består af et DNA molekyle omgivet af et nucleært capsld, som igen er omgivet af en kappe. Proteiner, som er forbundet med dette virus, inkluderer overfladeantigenet (HBsAg), et kerneantigen og en DNA-polymerase. HBsAg vides at frembringe antistoffer hos inficerede mennesker. HBsAg, som findes i serummet hos inficerede 25 individer, består af proteinpartikler med en gennemsnitsdiameter på ca. 22 nm og kaldes derfor "22 nm partikler". I overensstemmelse hermed antages det, at HBsAg-partiklen ville være en effektiv basis for en vaccine.

C. En foretrukken udførelsesform af det sekundære peptid 30

Det er blevet erkendt, at miljøbetingelser ofte er effektive til styring af mængden af bestemte enzymer, som produceres af celler under visse vækstbetingelser. I den foretrukne udførelsesform af opfindelsen drages der fordel af visse cellers følsomhed for methotrexat (MTX), som er en inhibitor for dihydrofolatreductase (DHFR). DHFR er 35 et enzym, som kræves indirekte ved syntesereaktioner, der involverer overførsel af en-carbon-enheder. Mangel på DHFR-aktivitet resulterer I cellers manglende evne til at vokse, undtagen i nærvær af de forbindelser, som ellers kræver overførsel af DK 173928 B1 8 en-carbon-enheder for deres syntese. Celler, der mangler DHFR, vil imidlertid vokse i nærvær af en kombination af glycin, thymidin og hypoxanthin.

Celler, som normale producerer DHFR, vides at inhiberes af methotrexat. Oftest vil 5 tilsætning af passende mængder methotrexat til normale celler resultere i cellernes død. Imidlertid synes visse celler at overleve methotrexat-behandlingen ved at fremstille forøgede mængder DHFR og således overskride methotrexatets kapacitet til at inhibere dette enzym (2,3,4). Det er tidligere blevet vist, at der i sådanne celler er en forøget mængde m-RNA, der koder for DHFR-sekvensen. Dette forklares ved antag-10 else af en forøgelse i mængden af DNA i det genetiske materiale, som koder for denne m-RNA. Genetisk forårsager tilsætningen af methotrexat øjensynligt genforstærkning af DHFR-genet. Genetiske sekvenser, som er fysisk forbundne med DHFR-sekvensen, selv om de ikke reguleres af den samme promotor, forstærkes også (1,8,9,10). Som følge heraf er det muligt at anvende forstærkningen af DHFR-genet, som sker ved 15 methotrexatbehandling, til samtidigt at forstærke genet for et andet protein, i dette tilfælde det ønskede peptid.

Hvis endvidere de værtsceller, hvori den sekundære sekvens for DHFR indføres, i sig selv er DHFR-deficiente, tjener DHFR også som en hensigtsmæssig markør for 20 selektion af celler, der er transficeret med held. Hvis DHFR-sekvensen effektivt forbindes med sekvensen for det ønskede peptid, tjener denne evne ligeledes som markør for heldig transfektion med den ønskede sekvens.

25 D. Anvendt vektorkonstruktionsteknik (materialer og metoderj

De vektorer, som konstrueres i de i afsnit E anførte eksempler, konstrueres ved spaltning og ligering af isolerede plasmider eller DNA-fragmenter.

30 Spaltning gennemføres ved behandling med restriktionsenzym (eller -enzymer) i en egnet puffer. I almindelighed kræver omkring 20 μg plasmid eller DNA-fragmenter omkring 1-5 enheder enzym i 200 μΙ pufferopløsning. (Passende puffere for bestemte restriktionsenzymer specificeres af producenten). Inkubationstider på omkring 1 time ved 37°C er praktiske. Efter inkubationer fjernes protein ved ekstraktion med phenol 35 og chloroform, og nudeinsyren udvindes fra den vandige fraktion ved fældning med ethanol.

9 DK 173928 B1

Hvis der kræves stumpe ender, behandles præparatet i 15 minutter vedl5 °C med 10 enheder Polymerase I (Klenow), phenol-chloroform-ekstraheres og ethanolfældes.

Størrelsesseparation af de spaltede fragmenter gennemføres under anvendelse af 6% 5 polyacrylamidgel som beskrevet af Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res 8.:4057 (1980).

Til ligering behandles omkring ækvimolære mængder af de ønskede komponenter, forsynet med passende hale i enderne til at give korrekt tilpasning, med omkring ίο 10 enheder T4-DNA-ligase pr. 0,5 pg DNA.

E. Detaljeret beskrivelse af en foretrukken udførelsesform I almindelighed konstrueres ekspressionsvektoren beregnet for den foreliggende 15 opfindelse ved tilpasning af gensplejsningsteknik. Udgangsmaterialet er et naturligt forekommende bakterielt plasmid, om ønsket modificeret i forvejen. I en foretrukken udførelsesform af opfindelsen anvendes et pML plasmid, som er et modificeret pBR 322 plasmid fremstillet ifølge Lusky, M. et al., Nature 239:79 (1981), der forsynes med en enkelt promotor afledt fra abeviruset SV-40 og med kodningssekvensen for 20 DHFR og for HBsAg.

Ved konstruktionen anbringes promotoren (såvel som en ribosombindingssekvens) oven for kodningssekvensen, der koder for et ønsket protein og en sekvens, der koder for et sekundært protein. En enkelt transkriptionsafslutningssekvens er anbragt neden 25 for begge. Ved enden af den øverste kodningssekvens anbringes et translationsstop-signal, og et translationsstart-signal begynder den nederste sekvens. Således resulterer ekspressionen af de to kodningssekvenser i en enkelt mRNA-streng, men to separate modne proteiner.

30 I en særlig foretrukken udførelsesform er sekvensen, der koder for det sekundære peptid, neden for den, der koder for det ønskede peptid. Under disse omstændigheder vil procedurer udformet til at selektere for cellerne transformeret med det sekundære peptid også selektere for særlig forhøjet produktion af det ønskede peptid.

35 DK 173928 B1 10 F. Eksempler

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.

5 EKSEMPEL 1

Vektor indeholdende HBsAa-sekvensen. pE342.HS94.HBV

10

Fig. 1 viser konstruktionen af HBsAg-plasmidet.

Det 1986 bp EcoRI-BgIII fragment, som spænder over overfladeantigen-genet blev 15 isoleret fra HBV-viralgenomet klonet med pBR322 som beskrevet-af Liu et al., DNA I;213 (1982). Denne sekvens blev ligeret mellem EcoRI- og BamHI-stederne i pML, et pBR322-derivat, som mangler sekvenser, der er inhiberende for dets replikation i abeceller, som beskrevet af Lusky et al., Nature 293:79 (1981.) I det resulterende plasmids enkelte EcoRI-sted indsattes 342 bp originfragmentet SV40 opnået ved 20 Hindlll-PvuII nedbrydning af virusgenomet, som var blevet modificeret til at være afgrænset af EcoRI-restriktionssteder resulterende i p342E (også betegnet som pHBs348-E) som beskrevet af Levinson et al. i EP offentliggørelsesskrift nr. 0 073 656. (Kort fortalt blev originet fra abeviruset SV40 isoleret ved nedbrydning af SV40-DNA med Hindlll og omdannelse af Hindlll-endeme til EcoRI-ender ved tilføjelse af en 25 omdanner (AGCTGAATTC). Denne DNA blev klippet med PvuII, og der blev tilføjet RI-bindeled. Efter nedbrydning med EcoRI blev 348 bp fragmentet, som spænder over originet, isoleret ved polyacrylamidgel-elektroforese og elektroeluering og klonet i pBR322. Ekspressionsplasmidet pHBs348-E blev konstrueret ved kloning af 1986 bp fragmentet fra EcoRI- og Bglll-nedbrydning af HBV (Animal Virus Genetics, (Ch. 5) 30 Acad. Press. N.Y. (1980)) (som spænder over genet, der koder for HBsAg) ind i plasmidet pML (Lusky et al.,Nature 293:79, 1981) ved EcoRI- og BamHI-stederne.

(pML er et derivat af pBR322, som har en slettelse, der fjerner sekvensen, som er inhiberende for plasmid-replikation i abeceller). Det resulterende plasmid (pRI-Bgl) blev derpå lineariseret med EcoRI, og 348 bp fragmentet repræsenterende 35 SV40-originområdet blev indført i EcoRI-stedet i pRI-B91. Originfragmentet kan indsættes i valgfri orientering. Da dette fragment koder for både den tidlige og den sene SV40-promotor foruden repliceringsoriginet, kunne HBV-gener udtrykkes under DK 173928 B1 11 styring af den ene eller den anden promotor afhængigt af denne orientering (pHBS348-E repræsenterer HBs udtrykt under styring af den tidlige promotor). pE342 modificeres ved delvis nedbrydning med EcoRI, udfyldning i det spaltede sted under anvendelse af Klenow DNA-polymerase I og sammenligering af plasmidet igen, 5 hvorved-EcoRI-stedet forud for SN/40-originet i pE342 fjernes. Det resulterende plasmid, betegnet pE342ARl, nedbrydes med EcoRI, udfyldes ved anvendelse af Klenow DNA-polymerase I og underdeles med BamHI. Efter elektroforese på acrylamidgel elektroelueres fragmentet på ca. 3 500 bp, ekstraheres med phenol-chloroform og fældes med ethanol som ovenfor). Det 5'-utranslaterede 10 lederområde i HBsAg blev fjernet ved behandling med EcoRI og med Xba, og det analoge 150 bp EcoRI-Xba fragment fra et hepatitis-ekspressionsplasmid pHS94 (Liu et al., ovenfor) blev indsat i dets sted til dannelse af pE342.HS94.HBV.

(Som beskrevet af Liu et al. ndeholder pHS94 translations-start-codonen fra det 15 autentiske HBsAg-gen, men mangler alle 5'-utranslaterede budbringersekvenser. Ekspressionsniveauerne af både det autentiske EcoRI-Bglll og det pHS94-afledte ækvivalent under styring af den tidlige SV40-promotor som beskrevet ovenfor er ækvivalente og er udskiftelige uden påvirkning af plasmidets opførsel).

20 EKSEMPEL 2

Vektor indeholdende DHFR-sekvensen PE342.D22 25

Et plasmid bærende DHFR som den eneste udtrykkelige sekvens er pE348.D22, hvis konstruktion er vist i fig. 2.

1 600 bp Pstl-indsætningen i DHFR-cDNA-plasmidet DH.FR-11 (Nunberg et al., Cell 30 19:355, 1980) blev behandlet med exonucleasen Bal31 for at Fjerne poly- G:C-området op til Pstl-stederne, blev nedbrudt med Bglll, og de resulterende fragmenter på omkring 660 bp blev Isoleret fra gelerne. Den Bal31-BglII-nedbrudte cDNA blev ligeret ind i et pBR322-plasmid-derivat indeholdende et Bglll-sted. (Efter nedbrydning af pBR322 med Hind III blev plasmidfragmentet fyldt ved anvendelse af 35 Klenow DNA-polymerase i nærvær af de fire deoxynucleotidtriphosphater og underdelt med Bglll). Det resulterende plasmid, pDHFR-D22, haret EcoRI-sted beliggende 29 bp ovenfor, sammenknytningsstedet mellem pBR322 og 5'-enden af DHFR-cDNA’en.

DK 173928 B1 12

EcoRI-BgIII-fragmentet, som indeslutter kodningssekvenserne af cDNA-indsætningen; blev derpå udskåret fra pDHFR-D22 og ligeret til EcoRI-BamHI-nedbrudt pE342.HBV (eksempel 1) til dannelse af DHFR-ekspressionsplasmidet pE342.D22.

5 EKSEMPEL 3

Vektorer indeholdende både DHFR- oo HBsAq-sekvenser 10

Der blev konstrueret to sådanne vektorer, pE342.HBV.D22 indeholdende et polycistron, hvori DHFR-genet er nedenfor HBsAg-genet, og pE342.HBV.E400.D22, (fig. 3), hvori generne, der koder for DHFR og HBsAg, ikke er polycistroniske.

15 A. pE342.HBV.D22 bl( v konstrueret ved ligering af EcoRI-Taql-fragmentet fra klonet HBV-DNA (Liu et al., ovenfor) til EcoRI-Clal-nedbrudt pE342.D22.

B. Dette plasmid blev yderligere modificeret ved til knytning af en yderligere tidlig SV40-promotor mellem Bglll-stedet og-Clal-stedet i DHFR-indsaetningen i 20 pE342.HBV.D22 til dannelse af pE342.HBV.E400.D22.

Viral HBV-DNA indeholder et enkelt Taql-sted 20 bp uden for Bglll-stedet, der blev anvendt til at skabe EcoRI-BgIII-fragmentet, der indeslutter overfladeantigen-genet. Således resulterer EcoRI- og Taql-nedbrydning af klonet viral HBV-DNA i et fragment 25 på ca. 2 000 bp, der spænder over overfladeantigen-genet og indeholder et enkelt BglN-sted (1985 bp-fra EcoRI-stedet (Liu et al., ovenfor)). (Taql- og Clal-enderne af DNA-fragmenter dannet ved nedbrydning er kohæsive og vil ligere sammen).

Clal-stedet gendannes; således indeholder pE342.HBV.D22 både et Bglll- og Clal-30 sted, der er beliggende umiddelbart foran DHFR-kodningssekvenserne.

Et SV40-origin bundet ved restriktionssteder, der er kohæsive med Bglll- og Clal-stederne i pE342.HBV.D22, blev konstrueret ved nedbrydning af SV40-DNA med Hpall, udfyldning som beskrevet ovenfor og underdeling med Hindlll. Et 440 bp 35 fragment, der spænder over originet, blev isoleret. Dette blev ligeret ved en treparts-ligering til 4 000 bp pBR322-fragmentet skabt ved Hindlll- og BamHI-ned-brydning og til 1 986 bp fragmentet, der spænder over overfladeantigengenet, skabt DK 173928 B1 13 ved nedbrydning af den klonede virale HBV-DNA med EcoRI, udfyldning med Klenow DNA-polymerase I, undernedbrydning med Bglll og isolering på en acrylamidgel.

Ligering af alle tre fragmenter kan kun opnås ved sammenføjning af det udfyldte Hpall-sted med EcoRI-stedet, de to Hindlll-steder med hinanden og Bglll-stedet med 5 BamHI-stedet. Når det resulterende plasmid restriktionsbehandles med Clal og BamHI, opnås således et 470 bp fragment, som indeholder SV40-originet. Dette fragment indsættes i Clal- og Bglllstederne i pE342.HBV.D22 (afsnit A) til dannelse af pE342.HBV.E400.D22 (fig. 3).

10 EKSEMPEL 4

Transfektion af værtsceller 15

De her anvendte værtsceller er hvirveldyrceller dyrket i vævskultur. Disse celler kan, som kendt inden for faget, holdes som permanente cellelinier fremstillet ved successive rækkeoverførsler fra isolerede normale celler. Disse cellelinier opretholdes enten på en fast bærer i flydende medium eller ved vækst i suspensioner indeholdende 20 understøttende næringsstoffer.

I den foretrukne udførelsesform anvendes CHO-celler, som er deficiente med hensyn til DHFR-aktivitet. Disse celler fremstilles og formeres som beskrevet af Urlaub and Chasin; Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216 (1980).

25

Cellerne transficeres med 5 mg ønsket vektor som fremstillet ovenfor under anvendelse af den metode, som er beskrevet af Graham and Van Der Eb, Virology 52:456(1978).

30 Metoden sikrer indvirkning af en samling plasmider på en bestemt værtscelle, hvorved sandsynligheden forøges for, at hvis et plasmid absorberes af en celle, vil yderligere plasmider også absorberes. I overensstemmelse hermed er det praktisk at indføre både de primære og de sekundære kodningssekvenser under anvendelse af separate vektorer for hver såvel som ved anvendelse af en enkelt vektor indeholdende begge 35 sekvenser.

DK 173928 B1 14 EKSEMPEL 5 Vækst af transficerede celler oq udtrvkkelse af peptider 5 CHO-cellerne som blev underkastet transfection som anført ovenfor, blev først dyrket i 2 dage i ikke-selektivt medium, hvorpå cellerne blev overført til medium, der mangler glycin, hypoxanthin og thymidin, således at der selekteres for celler, som er i stand til at udtrykke plasmid-DHFR'et. Efter omkring 1-2 uger blev individuelle kolonier isoleret 10 med kloningsringe.

Celler blev udpladet i 60 eller 100 mm vævskulturskåle med omkring 0,5 x 106 celler/skål. Efter to dages vækst blev vækstmediet ændret. HBsAg blev prøvet 24 timer senere ved RIA (Ausria II, Abbott). Celler blev talt, og HBsAg-produktion 15 standardiseret på en pr.-celle-basis. 10-20 tilfældige kolonier blev analyseret på denne måde for hver anvendt vektor.

I et eksempel på udøvelsen af opfindelsen blev der opnået følgende resultater: DK 173928 B1 15

O O —I O 1Λ O O <T

IA

Λ

O

O

CT> ιλ CO -Η

"O I O Ή O ΙΛ CD

\ O IA

M O <U ΙΛ H ^ rH 0) 1) Ό □ O »CO O U ΙΛ

VD El O Ή O O CD

O Q O CM iA

>-l O '-v <U .H

cn c c >

»·* cjl O

c c o O (0 »—i •Η I O r-t O O Γ"

4-> Η O ΙΑ "-H

-* -H 3 U

ό ω 0 ·Μ t-, c. c α o h 1 i—i i o >-h o o r-~ σι O □ ΙΑ Ή

< -DC

cn OD : o «η o o o o

<—I

flj t) J-> Q> -Η -H > C H O 4-> rH .DC Ό 0) .DC I*. ^ c*- y“< 0) p cn μ o cm C Q) Ή **

O r—I r—C iA O O O O

•Hr-Cc)fAv.<tcM^

4J <l> O CT\ Y IA IA

sc υ α> qH>

<*- fcCD

?>

O

CO Dl

Mm3 I— CT3 <*

CA

m cm

X CM

. o

CM

o IA CM O U N <f CX Q U •sj- + · · cm ctn cm > :=»

CM tn CM CO CD

Q X Ο X X

h · · · · ·

O CM CM CM CM CM

4J<T<T<T<T<T -DC fA ΙΑ ΤΑ ΙΑ PA

(D LJ UJ UJ LU LU

> α. α. ο. α CL

DK 173928 B1 16

Produktionen af overfladeantigen i flere af de højst ekspresserende cellelinier er blevet kontrolleret for mere end 20 passager og er stabil. Cellerne, der udtrykker overfladeantigen, forbliver knyttet til substratet i uendelighed og vil fortsætte med at secernere de store mængder overfladeantigen, så længe mediet efterfyldes.

5

Det er klart, at den polycistroniske genkonstruktion resulterer i isolering af de celler, der producerer de højeste niveauer af HBsAg. 100% af kolonierne transformeret med pE342.HBV.D22 producerede over 500 ng/106 celler/dag, medens 92% af dem, der blev transformeret med det ikke-potycistronlske plasmid pE342.HBV.E400.D22 10 producerede mindre end den mængde. Kun celler fra den polycistroniske transfektion udviste produktionsniveauer på mere end 1500 ng/106 celler/dag.

EKSEMPEL 6 15

Behandling med methotrexat

De overfladeantigen-udtrykkende cellelinier inhiberes af methotrexat (MTX), en 20 specifik inhibitor for DHFR ved koncentrationer pi over 10 nM. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser af virkningerne af MTX på vævskulturceller opstår der af og til kloner, som er resistente over for højere koncentrationer (50 nm) af MTX med en hyppighed af omkring 10'5. Imidlertid producerer disse kloner ikke længere overfladeantigen trods forstærkningen af HBV-sekvenser i de MTX-resistente kloner.

25 Således forstærkes HBV-genet, selv om ekspressionen falder bort i dette tilfælde.

Dette antyder, at yderligere produktion af overfladeantigen kan være dødelig for cellen.

DK 173928 B1 17 EKSEMPEL 7

Udvinding af det ønskede peptid 5

Det producerede overfladeantigen er i form af en partikel analog med den 22 nm partikel, der iagttages i serumet hos patienter inficeret med viruset. Denne form af antigen er blevet påvist at være højimmunogen. Når cellerne dyrkes i medium, der mangler kalveserum eller andre supplementer, er omkring 10% af det i mediet 10 indeholdte protein overfladeantigen, og dette protein kan isoleres ved velkendte metoder inden for faget. Overfladeantigenet vandrer på SDS-polyacrylamid-geler sammen med det fra 22 nm partiklen afledte protein.

15 REFERENCER

1. Wigler, M. eLal., Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567 (1980) 2. Schimke, Robert T. et al.. Science 202:1051 (1978) 20 3. Biedler. J.L. et al.. Cancer Res. 37:153 Γ1972Ί 4. Chang, S.E. £tal., Cell 7:391 (1976) 5. Fischer, G.A., Biochem Pharmacol. 11:1233 (1962) 6. Sirotnak, F.M. et al.. Cancer Res. 28:75 (1968) 7. Flintoff, W.F. eLal·/ Somat. Cell. Genet. 2:245 (1976) 25 8. Christman, J. eLél-, Proc. Natl. Acad. Sci. 72:1815 (1982) 9. Ringold,.Gordon et al.« J. Molec and AppI. Gen. 1:165 (1981) 10. Kaufman, R.F. et al.. J. Molec. Biol. 152:601 (1982) 11. Perucho, Manuel et al.. Cell 22:309 (1980)

Claims (14)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et ønsket modent protein i en hvirveldyrværtscelle, kendetegnet ved, at 5 (a) der tilvejebringes en ekspressionsvektor, som omfatter i) en DNA-sekvens, som koder for det ønskede protein, og ii) en DNA-sekvens, som koder for et sekundært protein, hvis syntese er underkastet 10 styring af det omgivende miljø, og hvori hver af sekvenserne i) og ii) er anbragt således, at de er under styring af den samme promotor, men er adskilt af et translations-stop-signal og et translations-startsignal, 15 (b) en hvirveldyrværtscellekultur transficeres med den under (a) beskrevne vektor, og (c) værtscellekulturen får lov til at vokse under betingelser, som er gunstige for produktionen af det sekundære protein. 20

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det sekundære protein er DHFR.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det ønskede 25 protein er HBsAg.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at værtscellerne er deficiente med hensyn til DHFR.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de forudgående krav, kendetegnet ved, at værtscellerne er CHO-celler.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den transficerede værtscellekultur dyrkes i nærvær af en DHFR-inhibitor. 35

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at inhibitoren er methotrexat. DK 173928 B1 19

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de forudgående krav, hvorved produktionen af et ønsket protein I en værtscelle styres, kendetegnet ved, at 5 (a) værtscellerne transficeres med en ekspressionsvektor indeholdende kodesekvenserne for et sekundært protein, hvis ekspression er underkastet styring af det omgivende miljø, og for det ønskede protein, hvor begge sekvenser er operabelt forbundet med den samme promotorsekvens, men adskilt af et translations-stopsignal og et translationsstart-signal, og 10 (b) cellerne dyrkes 1 nærvær af én eller flere miljøfaktorer, som forårsager forstærkning af sekvensen for det sekundære protein.

9. Polyclstronlsk ekspressionsvektor, som er I stand til I en hvirveldyrværtscellekultur 15 at udtrykke et ønsket protein og et sekundært protein, kendetegnet ved, at den omfatter en DNA-sekvens, som koder for et ønsket protein, og en DNA-sekvens, som koder for et sekundært protein, hvis syntese er underkastet styring af det omgivende miljø; hvor begge DNA-sekvenserne er operabelt forbundet med den samme promotor -sekvens, men adskilt af translations-stop- og -start-codoner.

10. Ekspressionsvektor ifølge krav 9, kendetegnet ved, at kodesekvensen for det sekundære protein koder for DHFR.

11. Ekspressionsvektor ifølge krav 9, kendetegnet ved, at promotorsekvensen 25 er den tidlige promotor afledt fra SV40.

12. Ekspressionsvektor ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den er plasmidet pE342.HBV.D22 der er fremstillet som angivet I eksempel 3.

13. Ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 9-12, k e n d e t e g- n e t ved, at sekvensen, som koder for det sekundære protein, følger efter sekvensen, som koder for det ønskede protein.

14. Hvirveldyrceller, kendetegnet ved, at de er transformeret med en vektor 35 ifølge et hvilket som helst af kravene 9-13.