DK173020B1 - Injicerbare materialer fra placenta til forstærkning af blødt væv og fremgangsmåde til fremstilling deraf - Google Patents

Description

i DK 173020 B1

Den foreliggende opfindelse angår injicerbare materialer til forstærkning af blødt væv.

Tanken om at anvende et injicerbart materiale til forstærkning af blødt væv udvikledes lige efter opfindelsen af den subkutane kanyle. Forskellige produkter er blevet injiceret i det menneskelige legeme med henblik på rettelse af fejl i det bløde væv, hvilke produk-5 ter indbefatter paraffin, vaselin, vegetabilske olier, lanolin, bivoks, silicone og senere kollagen.

Paraffin blev første gang benyttet af Gersury i 1899\ der injicerede det i en ung mands scrotum til erstatning for operativt fjernede testikler. Han benyttede senere paraffin til korrektion af fejl i ansigtskonturen. I løbet af tidsrummet fra 1900 til 1914 blev anven-10 delsen af paraffininjektioner gjort populær.

1 19062 beskrev Heidingsfeld fænomenet paraffinoma. Injiceret paraffin danner mange meget spredte smådråber i vævet. Fagocytose hos makrofager og kæmpeceller finder sted efterfulgt af hyalin nekrose i fibrovaskulære skillevægge, formering af fibroblaster samt udvikling af arret væv indeholdende oliesmådråber og cyster foret med legems-15 fremmede kæmpeceller.

Klinisk forekom ødemer og ardannelse, undertiden efterfulgt af sårdannelse. Anvendelsen af injicerbart paraffin blev afbrudt i USA omkring den første verdenskrig, men fortsatte med at blive benyttet i det fjerne østen indtil 1950’eme.

Siliconer var det næste materiale, der skulle blive injiceret i mennesker i stor skala.

20 Conway og Goulian omtalte anvendelsen af siliconeinjektioner i brystet og ansigtet i 1963\ Nog- le mennesker benyttede "Saknrai"-sammensætningen, en siliconevæske, der var fortyndet med et additiv med henblik på bedre forankring4. Dow Corning udviklede en mere renset "medicinsk kvalitet 360 flydende silicone", og selv om dette produkt ikke oprindeligt var beregnet til at blive injiceret, blev det snart benyttet til injektion i menne-25 sker i hele verden.

2 DK 173020 B1

De første rapporter om komplikationer i tilfælde af injiceret silicone indbefattet legemsfremmede granulomer forekom i 19645.1 1965 beskrev Ben-Hur og Neuman6 silicono-maen, som var en svulstlignende dannelse, der udvikledes efter injektion af silicone 360 i rotter.

5 I 1965 bestemte the U.S. Food and Drug Administration (F.D.A.), at den kliniske anvendelse af injicerbar silicone var en "lægemiddelanvendelse", og syv forskere autoriseredes til at anvende siliconevæske som en erstatning for blødt væv. Efter at have gjort rede for deres kliniske erfaringer med injicerbar silicone - Dow Coming - MDX 4.4011, konkluderede de, at silicone MDX 4.4011 kan fremkalde en inflammatorisk reaktion, 10 der resulterer i rødme og ecchymosis, der kan bekæmpes med antibiotika og cortiko-steroider. Delvis resorption og vandring kan finde sted, men kan undgås ved hjælp af gentagne injektioner af små mængder7·*·9·,0·11·l2·13. Selv om få komplikationer har været omtalt i forbindelse med MDX 4.4011, er mange komplikationer blevet beskrevet efter injektion af flydende silicone med en ukendt renhedagrad14. Selv om nogle få personer 15 stadig får injiceret silicone med gode resultater og få komplikationer, vil materialets ikke-tilgivende natur, hvis det anvendes ukorrekt, sandsynligvis hindre dets almindelig udbredte anvendelse.

Oksekollagen har for nylig vundet almindelig udbredt anvendelse som et injicerbait materiale til forstærkning af blødt væv.

20 Kollagen er det dyriske legemes vigtigste ekstra cellulare strukturelle protein. Mindst syv typer pattedyrskollagen er blevet beskrevet. Deres fælles karakteristikum er en trestrenget spiral bestående af 3 polypeptidkæder, der kaldesα-kæder. Alle kæder har den samme konfiguration, men afviger i henseende til sammensætningen og rækkefølgen af deres aminosyrer. Dette fører til forskellige typer afa-kæder, men de har alle glycin i 25 hver tredje af aminosyresekvensens stillinger. Dette muliggør forekomst af spiralkonfor-mationen. Type I kollagen er sammensat af toal-kæder og en a2-kæde og er det vigtigste ekstracellulare materiale i hud, sene og ben. Når klinisk personale taler om "kolla- 3 DK 173020 B1 gen", refererer de sædvanligvis til type I. Type Π kollagen findes i brask og den viotrøse ("viotreous") væske. Type ΠΙ kollagen findes i hurtigt voksende væv, især ung og helende hud. Kollagen af typerne IV og V findes i epithel-basalmembran14.

De vigtigste molekylære arter ud over kollagen, der findes i den ekstracellulare grund-5 masse, indbefatter de ikke kollagenøse strukturelle glycoproteiner, elas tin, og proteoglycanerae. De strukturelle glycoproteiner består af fibronekdn og laminin. Fibro* nektin findes i både plasma- og vævsfonner og er i stand til at reagere med andre komponenter i den ekstracellulære grundmasse. For nylig foreslog Wartiovaara, at en anden funktion af fibronektin består i at opsonisere kollagen eller fibrin og ved hjælp af denne 10 mekanisme regulere den cellulære fordøjelse af disse substraterts. Laminin findes i alle basalmembraner. Proteoglykaner er karakteriseret ved en proteinkeme, der er knyttet til glycoaminoglykansidekæder,5,6·,7·1^ Når kollagen anvendes som et biologisk materiale, er det vigtigt at benytte det i den reneste og krystallinske form med henblik på at eliminere de ikke-kollagenøse proteiner, 15 der er langt mere virksomme antigener. Når først den inflammatoriske cyklus er stimuleret, finder resorptionen af kollagen sted ved infiltrering af inflammatoriske celler, først og fremmest makrofager og i mindre omfang granulocyter. Disse celler indeholder kollagenase, der virker fordøj ende pA kollagen19. Houch og Chang viste, at hudkollagen i sig selv var kemotaktisk og blev endnu mere aktivt ved fordøjelse med vævskollagenase 20 til mindre peptidfragmenter20. Kemotropisme er tiltrækningen af levende protoplasma til kemiske stimuli, hvorved cellerne tiltrækkes (positiv hæmotaksis) eller frastødes (negativ kemotaksis) af syrer, alkalier eller andre stoffer, der udviser kemiske egenskaber. Postlethwaite et al.21 viste, at forskellige kollagentyper, deresα-kæder samt små peptider dannet ved kollagenasefordøjelse alle var kemotaksiske overfor deimale fi-25 broblaster. De konkluderede, at den kemotaktiske vandring af fibroblaster til stedet for vævsbeskadigelse eller teoretisk injiceret kollagen kan reguleres ved hjælp af det solubiliserede kollagen eller dets nedbrydningsprodukter. Et kollagenimplantat ville således ikke forblive hvilende i vævet, men en kompleks række begivenheder kan finde 4 DK 173020 B1 sted. Først kunne kollagenimplantatet blive invaderet af inflammation og fibroblaster, og under kontinuert resorption kunne det fremme en inflammatorisk reaktion forårsaget af dets nedbrydningsprodukters kemotaktiske egenskaber. Kollagenmetabolismens område er således ikke blot vigtig for kollagen og andre materialer til injektion i blødt væv, S men også for både normal og unormal sårheling (dvs. hypertrofisk arrethed og keloider)l(u0’2t.Det injicerbare kollagen, der for nylig vandt almindelig udbredt anvendelse, fik markedsføringsgodkendelse som en indretning (ikke et lægemiddel) af the Food and Drug Administration i 1981. Dette materiale, der sælges under navnet "Zyderm"® kollagenimpantat, er et renset oksekollagen. Ca. 95 % består af type I kollagen, og de 10 resterende 5% består af type ΙΠ kollagen. Kollagenet undergår proteolytisk hydrolyse i telopeptiddelen til nedsættelse af dets antigenicitet. Materialet suspenderes i fysiologisk saltvandspuffer, 0,3 % lidocain tilsættes, og materiale emballeres i sprøjter, der er parate til injektion gennem kanyler med lille lysning.

Den mest umiddelbare bekymring hos de fleste plastiske kirurger er oksekollagenets 15 skæbne efter injektion. "Zyderm"11! indeholdende 35 mg/ml kollagen nedbrydes hurtigt af vævskollagenaser og resorberes i løbet af nogle måneder. "Zyderm"®II indeholdende 65 mg/ml kollagen og således næsten dobbelt så stor en koncentration af kollagen varer længere, men følger den samme skæbne som "Zyderm"®I. "Zyplast"· blev for ganske nylig introduceret indeholdende 35 mg/ml kollagen, der var tværbundet med glutaralde-20 hyd. "Zyplast"* nedbrydes også til sidst med tiden. Kligman22 sammenlignede for nylig den biologiske skæbne for så vidt angår "Zyderm"®-kollagen og "Zyplast"®-kollagen efter implantering i frivillige menneskers ryg. De rapporterede, at medens "Zy-derm"®-kollagen tilsyneladende blev resorberet af værtsvævet i løbet af nogle måneder fra implantation, var "Zyplast”® mere bestandigt Fibroblaster infiltrerede 25 "Zyplast"®-kollagenet og aflejrede værtskollagen. Burke et al.23 rapporterede, at "Zy-derm"®-kollagen stimulerer en reaktion, der resulterer i implantatnedbrydning og erstatning med nydannet værtskollagen).

5 DK 173020 B1

Et yderligere område med forvirring omkring "ZydernT®I-kollagen, "Zy- derm"-®II-kolIagen og "Zyplast"®-kollagen er kollagenprocenten i hver. " Zyderm" ®I-kolIagen og "Zyplast"*-koIlagen indeholder 35 mg/ml (3,5% kollagen), medens "Zyderm"®n indeholder 65 mg/ml (6,5 % kollagen).

5 En ringe procentdel patienter, der modtager enten "Zyderm"®!- kollagen, "Zy-derm"®II-kollagen eller NZyplast"®-kollagen, i det følgende omtalt som oksekollage-nimplantater(BCI), har udviklet uheldige reaktioner af immunnatur. Den sikre anvendelse af disse implantater er baseret på den rapporterede lave immunogenisitet af oksekolla-genet. Dette kontraindikeres imidlertid i patienter med en autoimmunsygdomshistorie.

10 Hudforsøg kræves før modtagelse af BCI. Kun patienter med negative hudforsøg efter 4 uger bør få behandlingsinjektioneme. The Collagen Corporation anfører, at ca. 3% af patienterne har en positiv hudtestreaktion, der er karakteriseret ved ødem, hærd- ning, erythem, kløe eller ømhed på injektionsstedet. Uheldige eller skadelige generelle behandlingsreaktioner er blevet opgivet fra færre end 1 % til flere end 5 %. De er karakteri-15 seret ved nældefeber, muskelsmerter, ledsmerter og en anafylaktoid reaktion23,24. En dramatisk stigning i forekomsten af anti-BCI-antistoffer i kredsløbet hos patienter med alvorlige BCI-behandlingsreaktioner er blevet registreret sammenlignet med serumprøver fra ubehandlede personer eller behandlede patienter, der lider af uheldige eller skadelige reaktioner. BCI er et svagt antigen, men er stadig et fremmed protein. Det er blevet 20 behandlet på en sådan måde, at telopeptideme spaltes for at gøre det mindre immuno-gent, men molekylets spiraldel bevarer sine antigene steder. De hvilende strukturer, der genkendes af den celleformidlede immunologiske mekanisme, viser sig at ligge inden i kollagenmolekylemes tredobbelte spirallegeme. Der har været en temmelig stor bekymring med hensyn til gentagen udsættelse af patienter for disse antigener og deres lang-25 stidsvirkninger24·25,26.

Alt i alt er der som følge af manglerne ved BCI inklusive manglen på bestandighed, behovet for gentagne injektioner og alvorlig bekymring for uheldige reaktioner, behov for nye injicerbare materialer til forstærkning af blødt væv. Den fore- liggende opfinde!· 6 DK 173020 B1 se angår injicerbare materialer til forstærkning af blødt væv og fremgangsmåder til fremstilling deraf, der afhjælper ulemperne ved BCI og andre hidtil kendte injicerbare materialer.

Foruden den ovenfor omtalte kendte teknik omhandler US patentskrift nr. 4.361.552 en 5 fremgangsmåde til behandling af et sår eller en forbrænding med en amnionforbinding hidrørende fra enhver egnet dyreart (mennesker, kvæg, grise, etc.), der bin- des eller stabiliseres ved hjælp af toksiske kemiske midler, såsom glutaraldehydopløsninger eller andre fikserende eller garvende opløsninger, så at proteinerne deraf tværbindes. Et antal US patentskrifter er anført og opregnet i dette patentskrift.

10 Beskrivelsen til GB patentansøgning nr. 8133375, der blev publiceret 22. juni 1983, omhandler et i det væsentlige amnionfrit præparat til anvendelse ved behandling af sår, hvilket præparat hidrører fra et kulturmedium, hvori amnion er blevet dyrket, idet den omhandlede amnion fortrinsvis er menneskeamnion.

Den foreliggende opfindelse angår et injicerbart blødtvævsraateriale, med hvilket proble-15 merne forbundet med xenogene oksekilder er blevet elimineret, problemet vedrørende mangel på bestandighed og behov for gentagen injektion er blevet rettet mod at gøre det mindre følsomt overfor nedbrydning, og til hvilket udgangsmaterialet står til rådighed i ubegrænsede mængder og til lav pris.

Det injicerbare materiale til forstærkning af blødt væv omfatter en steriliseret blanding 20 af type I- og type Ill-collagen, der er ekstraheret ved proteolytisk fordøjelse af bestanddele fra human placenta bestående af uopløselig amnion, opløselig amnion eller opløselig chorion og kombinationer deraf, og det er homogeniseret med henblik på at passere gennem en kirurgisk kanyle. Det homogeniserede materiale bør fortrinsvis kunne passere gennem en kirurgisk kanyle med 30 i standardmål (0,318 mm diameter) med henblik på 25 undgåelse af ubehag, og om ønsket kan et analgetikum være tilsat. Ifølge et aspekt ved opfindelsen bestråles materialet med mindst 0,20 M rad (2,0 kJ/kg) med henblik på 7 DK 173020 B1 sterilisering og tværbinding, idet et foretrukket interval er fra ca. 0,25 M rad til ca. 2,0 M rad (2,5 U/kg til 20 kJ/kg). Det i egeblikket foretrukne injicerbare materiale til forstærkning af blødt væv er bestrålet opløselig amnion.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af et sådant injicerbart blødtvævsma-5 teriale omfatter sterilisering af en blanding af type I- og type Hi-collagen, der er ekstraheret ved proteolytisk fordøjelse af bestanddele fra human placenta bestående af uopløselig amnion, opløselig amnion eller opløselig chorion og kombinationer deraf, og homogenisering i tilstrækkelig grad, så at det kan passere gennem en kirurgisk kanyle og fortrinsvis gennem en kirurgisk kanyle med 30 i standardmål (0,318 mm diameter).

10 Sterilisering af kollagenmolekyleme gennemføres fortrinsvis vedy-bestråling, som også tværbinder dem. Mindst 0,20 M rad (2,0 kJ/kg) er nødvendig til sterilisering af disse materialer, og det i øjeblikket foretrukne interval er fra ca. 0,25 M rad til ca. 2,0 M rad (2,5 kJ/kg til 20 kJ/kg). Om ønsket kan et analgetikum være sat dl det homogeniserede injicerbare blødtvævsmateriale.

15 Materialet ifølge opfindelsen kan anvendes dl korrektion af blødtvævskonturdefekter ved at injicere det injicerbare blødtvævs- materiale ifølge opfindelsen i en patient Et antal injektioner af små mængder af blødtvævsmaterialet er fordelagtigt mulige, eftersom også små mængder persisterer. Dette tilvejebringer en større grænseflade mellem vært og implantat muliggør hurtigere assimilering i vævet, eftersom midten af implantatet ikke 20 er langt fra værtsvævets påvirkninger.

Den foreliggende opfindelse tager følgelig sigte på at angive et injicerbart, steriliseret blødtvævsmateriale, hvormed uheldige eller skadelige allergiske reaktioner elimineres, som har langvarig bestandighed og ringe inflammation, som kan injiceres gennem en kanyle med standardmål 30 (0,318 mm diameter), og hvor γ-bestråling i et aspekt ved 25 opfindelsen anvendes til både sterilisering af materialet og til forøgelse af omfanget af tværbinding af kollagenet uden anvendelse af toksiske tværbindingsmidler.

8 DK 173020 B1

Et yderligere formål med opfindelsen er at tilvejebringe et injicerbart steriliseret blødt-vævsmateriale fra human placenta bestående af en steriliseret blanding af type I- og type IH-coIlagen, der er ekstraheret ved proteolytisk fordøjelse af uopløselig amnion, opløselig amnion eller opløselig chorion og kombinationer deraf, hvilket materiale er tilstræk-5 kelig homogeniseret til at passere gennem en kirurgisk kanyle, såsom en kanyle med standardmål 30 (0,318 mm diameter), og ifølge et aspekt ved opfindelsen renses og tværbindes ved hjælp af γ-bestråling uden anvendelse af toksiske kemikalier.

Et yderligere formål med den foreliggende opfindelse er at fremstille et injicerbart blødtvævsmateriale, med hvilket uheldige eller skadelige allergiske reaktioner elimi-10 neres, hvorved γ -bestråling anvendes til både at sterilisere materialet og forøge omfanget af tværbinding, og hvorved omfanget af vævsbestandighed kan reguleres ved at variere omfanget af tværbinding.

Et yderligere formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af et blødt, injicerbart forstærkningsmateriale, der har de ovenfor 15 nævnte fordele, ved homogenisering af en steriliseret blanding af type I- og type ΠΙ-collagen, der er ekstraheret ved proteolytisk fordøjelse af uopløselig amnion, opløselig amnion eller opløselig chorion eller kombinationer deraf hidrørende fra en human placenta, så at materialet kan passere gennem en kirurgisk kanyle, fortrinsvis en kirurgisk kanyle med standardmål 30 (0,318 mm diameter), samt tværbinding af materialets 20 kollagenmolekyler ved hjælp af γ-bestråling med mindst 0,20 M rad (2,0 kJ/kg) og fortrinsvis i intervallet fra 0,25 M rad til 2,0 M rad (2,5 kJ/kg til 20 kJ/kg).

Et yderligere fonnål med opfindelsen består i at tilvejebringe materialer til anvendelse ved rekonturering af blødt væv ved injektion i mennesker af materiale fra en human placenta, der omfatter en steriliseret blanding af type I- og type ΙΠ-collagen, der er 25 ekstraheret ved proteolytisk fordøjelse af uopløselig amnion, opløselig amnion eller opløselig chorion eller kombinationer deraf, og som er steriliseret og homogeniseret i et sådant omfang, at det kan injiceres ved hjælp af en kirurgisk kanyle, fortrinsvis en 9 DK 173020 B1 kirurgisk kanyle med standardmål 30 (0,318 mm diameter), og hvilket materiale ifølge et aspekt ved opfindelsen er steriliseret og har fået sine kollagenmolekyler tværbundet ved hjælp af γ-bestråling.

Endnu et formål med opfindelsen består i at tilvejebringe materialer til anvendelse ved S en sådan metode til rekonturering af blødt væv ved injektion i mennesker af et sådant injicerbart materiale i små mængder til opnåelse af god grænseflade mellem vært og implantat og muliggøre hurtigere assimilering i vævet og samtidigt opnå god bestandighed.

Andre og yderligere formål, træk og fordele ved opfindelsen fremgår af beskrivelsen og 10 kravene.

Humane fosterhinder blev valgt som udgangsmateriale for det injicerbare materiale til forstærkning af blødt væv til mennesker med henblik på på rekonturering af blødt væv, eftersom de eliminerer de allergiske problemer, der er forekommet i forbindelse med xenogene kilder, dvs. oksekilder, de humane placentaer står til rådighed i relativt ube-15 grænsede mængder og er en rig kollagenkilde, placentaer fås til lav pris, og amnion har haft omfattende lægelige anvendelser begyndende næsten 90 år tilbage til en lang række medicinske og kirurgiske anvendelser.

Fosterhinderne er komplekse biokemiske strukturer, der kan udvikles til et eller flere forskellige injicerbare blødtvævsmaterialer. De har fysiske og biologiske egenskaber, 20 der kan modificeres til at opfylde forskellige kliniske behov.

De foretrukne bestanddele af humane fosterhinder er uopløselig amnion, opløselig amnion, opløseligt chorion eller kombinationer deraf. De homogeniseres til at passere gennem en kirurgisk kanyle. Selv om injektion af materialerne til forstærkning af blødt væv gennem en kinirgisk kanyle med standardmål 25 (0,556 ram diameter) er 25 tilfredsstillende til kliniske formil for at undgå ubehag, homogeniseres materialet for- 10 DK 173020 B1 trinsvis således, at det kan passere og kan injiceres gennem en kirurgisk kanyle med standardmål 30 (0,318 mm diameter).

Ifølge et aspekt ved opfindelsen tværbindes det injicerbare materiale ved hjælp af γ-bestråling uden anvendelse af kemiske tværbindingsmidler, såsom glutaraldehyd, der 5 er toksiske, γ-bestrålingen bør være på mindst 0,20 M rad (2,0 kJ/kg) til sterilisering af materialet, eftersom alle bakterier, svampe og vira inklusive AIDS ødelægges ved 0,20 M rad. Fortrinsvis bestråles materialet med fra 0,25 til 2,0 M rad (2,5 til 20 kJ/kg) til sterilisering og tværbinding af kollagenmolekyleme.

Om ønsket kan et analgedkum, såsom lidokain, sættes til det injicerbare materiale.

10 Med henblik på fremstilling af det bløde injicerbare materiale indsamledes friske placentaer, og amnion'en separeres manuelt fra chorion'en, såsom ved hjælp af fingerseparation. Både amnion'en og chorion'en renses derpå for eventuelle tilbageværende blod-klumper eller materialerester. Med henblik på kortvarig lagring anbringes amnion'en og chorion'en i en antibiotisk opløsning, f.eks. linomycin 3 g/10 ml, amfotericin B 50 15 mg/10 ml, neomycinsulfat 0,5 g/10 ml, polymyxin B-sulfat 500.000 enheder/10 ml, i 1 1 normal saltopløsning, indtil oparbejdning finder sted.

Kollagen blev ekstraheret under anvendelse af begrænset proteolytisk fordøjelse med pepsin. Kort fortalt blev væv homogeniseret i 0,5 M eddikesyre, pH-værdien blev indstillet til 2,5 med HC1, og præparatet blev fordøjet to gange med pepsin (10 mg 20 pepsin/g vådt væv) natten over. En kombinationsmetode med selektiv udfældning fra neutralt salt-opløsningsmiddel og syreopløsningsmidler blev benyttet til rensning af kollagenet. Renset kollagen blev rekonstitueret ved dialyse mod natrium- phosphatpuffer med lav ionstyrke (pH 7,2) ved 15-17eC. Lidokain blev tilsat til en slutkoncentration på 0,3%. Alle procedurer blev udført ved 4-8°C, selv om andre egnede temperaturer kan 25 anvendes.

11 DK 173020 B1

Oparbejdning af uopløselig amnion

En i øjeblikket foretrukken metode til oparbejdning af amnion omfatter dekantering af antibiotikumet fra amnion'en, tilsætning af S ml koldt destilleret vand til hver amnion og homogenisering af amnion'en i ca. 15 min. i en Polytron homogenisator. Den homo-5 geniserede amnion centrifugeres derpå ved 8.000 x g i 15 min. ved 4eC, den overliggende væske bortkastes, og præcipitatet vaskes til fjernelse af lipiderne, såsom 5 gange med acetone. Præcipitatet vejes derpå, og pepsin (Sigma, 1:10.000, fra svinemaveslimhinde) og 3,0 molær eddikesyre per amnion blev tilsat, 15 ml eller mere i tilfælde af ekstra store amnion'er, og præcipitatet blev homogeniseret i ca. 5 min. i polytron.

10 Man lod blandingen henstå i 18 timer ved 4°C, centrifugerede ved 100.000 x g i 1 time ved 4°C, den overliggende væske bortkastedes, præcipitatet blev vejet, og derpå blev pepsin- og homogeniseringstrinnene gentaget og den overliggende væske bortkastet.

Oparbejdning af opløselig amnion

En i øjeblikket foretrukken måde at oparbejde opløselige amnion’ er på omfatter bortskyl-15 ning af antibiotika fra amnion' eme med deioniseret vandtilsætning af 5 ml koldt destilleret vand til hver amnion, homogenisering i ca. 15 min. i polytron og centrifugering ved 8.000 x g i 15 min. ved 4°C. Den overliggende væske blev bortkastet, og lipider fjernedes fra præcipitatet ved vaskning tre gange med acetone, og præcipitatet blev vejet

Pepsin (Sigma, 1:10.000, fra svinemaveslimhinde) blev sat til præcipitatet (1:100 vægt/-20 vægt), og 100 ml 0,5 molær eddikesyre per amnion blev tilsat, mere hvis amnion'erne er ekstra store, og der homogeniseredes derpå i ca. 10 min. i polytron. Man lod pepsinet ekstrahere kollagen fra præcipitatet i 18 timer ved 4°C, og derpå centrifugeredes ved 100.000 x g i 1 time ved 4°C under bibeholdelse af både præcipitatet og den overliggende væske. Den overliggende væske blev atter vejet og pepsin- og eddikesyretilsæt 12 DK 173020 B1 ningstrinnene, homogenisering, pepsinekstraktion af kollagen samt centrifugering gentages derpå.

De overliggende væsker fra den første og den anden ekstraktion kombineres, og 10 molær NaOH tilsættes dråbevis til indstilling af pH-værdien til fra 7,0 til 7,2. Man lader 5 blandingen henstå i 2 timer ved 4°C, centrifugerer ved 100.000 x g i 45 min. ved 4°C og bortkaster præcipitatet. NaCl sættes til den overliggende væske til 3,0 molær koncentration, og man lader henstå i 2 timer ved 4°C, centrifugerer ved 100.000 x g i 45 min. ved 4eC, vejer præcipitatet og tilsætter lidokain til en koncentration på 0,3 %.

Oparbejdning af opløselig amnion med yderligere rensning 10 En for tiden fordrukken tndode til oparbejdning og yderligere rensning af opløselig amnion omfatter udskylning af antibiotiket fra amnion'en med deioniserd vand, opskæring af amnion'eme til ca. 2 cm x 2 cm og kortvarig vaskning deraf med acetone, gennemblødning af dem i 0,3 M eddikesyre (pH indstil- ld til 2,5 med HC1), homogenisering med polytron i ca. 15 min., tilsætning af pepsin (1:100 pepsin/stivnet væv) (1 mg 15 pepsin/1 ml opløsning) og omrøring ved 4°C natten over og centrifugering som ovenfor anført, idet den overliggende væske bibeholdes. Pepsin blev atter tilsat som tidligere anført, og der omrørtes ved 4°C natten over, centrifugeredes, og den overliggende væske fra begge centrifugeringstrin blev kombine- ret og NaCl tilsat til 2 M, hvorpå man lod henstå natten over ved 4eC og atter centrifugerede, bortkastede den overliggende 20 væske og bibeholdt præcipitatd.

Præcipitatet blev renset ved opløsning deraf i 0,5 M eddikesyre, centrifugering, bortkastning af præcipitat og tilsætning af NaG indtil 2 M til den overliggende væske, og man lod denne henstå natten over ved 4°C, centrifugerede atter og bortkastede den overliggende væske. Det resulterende præcipitat blev opløst i 0,5 M eddikesyre, atter centrifu-25 gerd, og præcipitatd blev bortkastet. Den overliggende væske blev grundigt dialyserd mod 0,02 M Na2HP04 i 48 timer med hyppige udskiftninger af dialysevæske, centrifu- 13 DK 173020 B1 geredes, og den overliggende væske blev bortkastet, præcipitatet blev vejet, og fast lido-kain, HC1 blev tilsat til 0,30% under mekanisk omrøring.

Oparbejdning af chorion

Ved en i øjeblikket foretrukken metode til oparbejdning af opløselig chorion blev anti-5 biotikaene bortskyllet lira chorion'en med deioniseret vand, chorion'en blev udskåret i enheder på ca. 2 cm x 2 cm og vasket kortvarigt med acetone samt derpå gennemblødt med 0,5 M eddikesyre, der var blevet indstillet til pH 2,5 med HC1. Vævet blev derpå homogeniseret med polytron til fine partikler i ca. 15 min., pepsin blev tilsat, og der blev centrifugeret som ovenfor anført under tilbageholdelse af den overliggende væske.

10 Pepsin- og centrifugeringstrinnene blev derpå gentaget, den overliggende væske for hvert af disse trin blev kombineret, og NaCl blev riisat indtil 2 M, hvorpå der henstilledes natten over ved 4°C og derpå atter blev centrifugeret med bortkastning af den overliggende væske.

Med henblik på rensning opløstes præcipitatet i 0,5 M eddikesyre, centrifugeredes, og 15 præcipitatet bortkastedes. NaCl blev sat til den overliggende væske til 2 M, og der blev henstillet natten over ved 4° C og derpå atter centrifugeret, og den overliggende væske blev bortkastet. Præcipitatet blev opløst i 0,5 M eddikesyre, der centrifugeredes, og der blev dialyseret grundigt mod 0,02 M Na2HP04 i 48 rimer med hyppige udskiftnin- ger af dialysevæske, hvorpå der atter centrifugeredes, den overliggende væske bortkastedes, 20 og præcipitatet blev vejet. Fast lidokain, HC1 blev sat til præcipitatet indtil 0,30% under mekanisk omrøring.

Tværbinding og sterilisering

15 cm3 af hvert af de ovennævnte resulterende præcipitater blev anbragt i 20 cm3 serum-flasker med krympelukker og placeret i CE137 radioaktiv kilde i variende tidsrum med 25 henblik på at de skulle modtage 0,25 M rad (2,5 kJ/kg), 0,5 M rad (5,0 kJ/kg), 1,0 M

14 DK 173020 B1 rad (10 kJ/kg) og 2,0 M rad (20 kJ/kg), som tjente det dobbelte formål at sterilisere materialet og tværbinde kollagenet.

Eksempel 1

Flere grupper af kollagenekstrakter blev rekonstitueret i phosphatpufret saltopløsning og 5 anbragt i glasrør samt bestrålet med 1779 curie (6,58 x 1013 S'1) cæsium-y-strålekilde i en dosis på 1.000 rad/min (0,167 J kg"1 S'1)· Dosen var 0,25 M rad (2,5 kJ/kg). Bestråling blev foretaget ved stuetemperatur.

Tabel 1

De undersøgte grupper var som følger: 10 Snippe_ 1. Opløselig amnion med 0,25 m rad (2,5 kJ/kg).

2. Opløselig amnion uden stråling.

3. Uopløselig amnion med 0,25 M rad (2,5 kJ/kg).

4. Uopløslig amnion uden stråling.

15 5. Uopløselig amnion + opløselig amnion (1:1) med 0,25 M rad (2,5 kJ/kg).

6. Uopløselig amnion + opløselig amnion (1:1) uden stråling.

7. Opløselig chorion med 0,25 M rad (2,5 kJ/kg).

8. Opløselig chorion uden stråling.

9. Opløselig chorion + opløselig amnion (1:1) med 0,25 M rad (2,5 kJ/kg).

20 10. Opløselig korion + opløselig amnion (1:1) uden stråling.

Prøver fra hver gruppe blev udsat for aerobe, anaerobe og svampekulturer. Ingen af grupperne udviste vækst hverken før eller efter bestråling.

120 unge Sprague-Dawley-rotter med en vægt mellem 200 og 300 g blev benyttet til dyreinjektioneme. Tolv gmpper dyr blev undersøgt indbefattende grupper, som fik 15 DK 173020 B1 injiceret "Zyderm"*II og "Zyplast"· Der var 10 rotter i hver gruppe. 0,2 ml injicerbart materiale blev injiceret perkutant i deres rygge under panniculus camosus på tre forskellige steder. Prøver blev høstet fra 5 rotter i hver gruppe efter 1 måned og efter 6 måneder.

5 Prøver blev fikseret i 10% pufret formalin og senere indstøbt i paraffin. En serie snit blev fremstillet og farvet med hæmatoxylin-eosin (H&E). Resultater blev sammenlignet under anvendelse af en uafhængig stab af patologer.

Den histologiske bedømmelse af implantater afslørede ligheder i alle forsøgsgrupperne med undtagelse af den uopløselige amnion, som vil blive diskuteret i det følgende.

10 Specielt var ingen inflammatorisk reaktion tydelig, og ingen indkapsling forekom.

Fibrocytisk indgroning foreligger efter 30 dage og er mere fremrykket centripetalt efter 180 dage. Neovaskularisering forelå i et variabelt omfang efter 180 dage. Graden af både fibrocytisk indgroning og neovaskularisering var større end den der findes med "Zyderm"*II og "Zyplast"· efter 180 dage.

15 Den uopløselige amniongruppe udviste heller ikke nogen inflammation eller indkapsling, men udtalt neovaskularisering og fibrocytisk indgroning. En yderligere iagttagelse var tilstede- værelsen af nogle få adipocyter efter 30 dage. Efter 180 dage var de adipocyter, der først forekom på implantatets periferi, blevet spredt gennem implantatet. Dette fænomen er blevet iagttaget af andre2i:a.

20 En kvantitativ analyse (måling af de nøjagtige dimensioner af bestandigt implantat) var meget vanskelig at foretage. Derfor udførtes en foreløbig kvalitativ undersøgelse af bestandighed. Antallet af implantater, der synligt var til stede i de overlevende rotter efter 6 måneder, blev simpelthen talt. Tabel 2 viser, at den opløselig amniongruppe udviste meget god bestandighed efter 6 måneder. Den ikke-bestrålede opløselige amnion 25 havde alle implantater til stede efter 6 måneder, og den bestrålede opløselige amnion havde 11 ud af 15. Den uopløselige gruppe udviste også god bestandighed i både de 16 DK 173020 B1 bestrålede og ikke-bestrålede grupper. Nogle af grupperne med kombinationer af materialer, især opløselig chorion, havde mindre bestandighed efter bestråling.

.Tabel 2

BESTANDIGHED AF BLØDTVÆVSFORSTÆRKNING 5 INJEKTIONER EFTER 6 MANEDER

DYREFORSØGSGRUPPE 1-10, "ZYDERM"®TI OG "ZYPLAST"· 12 3 4 koncentration antal rotter, injektioner til

Gruppe af kollagen (mg/ml) overlevende/ stede efter 6 10 injicerede måneder/samlet _antal injicerede 1* opl. Am 51 5/5 11/15 2 opl. Am 37,2 5/5 15/15 3* Uopl. Am 23,5 5/5 9/15 15 4 Uopl. Am 22,2 5/5 13/15 5* Uopl. Am & 40,4 4/5 3/12 opl. Am 6 Uopl. Am & 40,5 5/5 15/15 7* Opl. Ch 40,3 5/5 2/15 20 8 Opl. Ch 55,8 2/5 6/6 9* Opl. Am & 52,8 3/5 0/9 opl. Ch 10 Opl. Am & 58,6 5/5 15/15 opl. Ch 25 11 "Zyderm"®II 65 2/5 6/6 12 "Zyplast"· 35 4/5 12/12

Bemærkning: * prøve blev bestrålet med 0,25 M rad (2,5 kJ/kg) γ-stråling.

Talrige histologiske undersøgelser med mellemrum fra en til seks måneder har vist fibrocytisk indgroning samt neovaskularisering uden nogen inflammation. Iagttagelsen 30 af adipocytinkorporering i de uopløselige amnioniraplantater er meget interessant, men man er ude af stand til at forklare, hvorfor den finder sted. Stromal infiltration af fedt 17 DK 173020 B1 er tidligere blevet iagttaget af andre27,28 og er et mærkeligt fænomen af ukendt natur. Akkumulation af forøgede fedtmængder finder lejlighedsvis sted i visse vævs og organers mellemvæv. Robbins og AngeP giver den forklaring, at de multipotentielle fi-broblaster i mellemrummet formodentlig bliver fyldt med lipid og i virkeligheden om-5 dannes til "fedme"-fedtceller. Stromal infiltration med fedt har tendens til at blive for-bundet med stærk fedme eller med mangel på pareokymale celler, men korrelationerne er ufuldstændige. Hjertet og pankreas er oftest involveret

Det faktum, at der kun var nogle få adipocyter efter 30 dage og et forøget antal efter 180 dage kunne synes at indikere, at et fænomen mindende om det ovenfor beskrevne fore- 10 kom. Stimulationen af ny adipocytaflejring frembyder en interessant og ny mulig vej til forstærkning af blødt væv.Biokemisk analyse har vist renheden af det injicerbare humane amnion- og chorionkollagen. PAGE-elektroforesen og aminosyre- analysen har vist, at HAC har et typisk kollagenelektroforesemønster og en aminosyresammensætning som en blanding af kollagen af type I og ΙΠ.

15 De bakterielle kollagenase-fordøjelsesresultater viste, at intet ikke-kollagenprotein eksisterede i injicerbart humant amnion- og chorionkollagen. Ved immunoaftryksunder-søgelse påvistes intet tilbageværende fibronektin og laminin i kollagenproduktet ifølge den foreliggende opfindelse. Det antages, at den høje renhed af HAC medvirkede dl den lave immunologiske reaktion i rottemodellen.

20 Mængden af type ΙΠ kollagen i forhold til type I kollagen er meget større i injicerbart humant amnionkollagen (43:57) end i "Zyderm"· og "Zyplast"· (5:95). Type ΠΙ kollagen har disulfatbindinger mellem kæderne, medens type I kollagen ikke har, så at type I kollagen efter behandling ved hjælp af pepsinekstraktion eksisterer i form af en blanding af α-, 6- og γ-kæder, medens type ΠΙ kollagen hovedsagelig eksisterer iy-formen.

25 Der er fremsat den påstand, at jo større tværbindingen er, jo længere vil bestandigheden af type ΠΙ kollagen i amnionkollagen vise sig at være som en vigtig faktor ved vurdering af det mest effektive kollagen til forstærkning af blødt væv.

18 DK 173020 B1

Undersøgelser af cellebiologi viste, at γ-bestrålet humant amnionkollagen ikke havde nogen cytotoksisk virkning på cellevækst og på celleopførsel. Celler, der vokser på bestrålet humant amnionkollagensubstrat, har et normalt morfologisk udseende og aktive pseudopodier. Ved forsøg omfattende celletal og [3H] fandtes ingen signifikante forskel-5 le blandt de celler, der vokser på bestrålet humant amnionkollagen og "Vitrogen"·, "Zyderm”® og ikke bestrålet humant amnionkollagen.

Den biokemiske karakterisering af de forskellige injicerbare humane amnionkollagener med henblik på renhedsbestemmelse samt forholdet mellem kollagentyper indbefattede polyacrylamidgel- elektroforese (PAGE), densitometri, kollagenasefordøjelse, amino-10 syreanalyse (AAA), immunoaftryk, elektronmikroskopi (EM), kollagenasesensitivitetsa-nalyse og hydroxyprolinanalyse. Ingen detaljeret beskrivelse gives eller anses for nødvendig vedrørende disse forskellige procedurer, eftersom de alle er konventionelle.

Gode resultater kan opnås med γ-bestråling med mindst 0,20 M rad (2,0 U/kg) og i intemllet fra 0,25 M rad (2,5 kJ/kg) til 2,0 M rad (20 kJ/kg). Enhver kombination af 15 amnion'eme og chorion kan anvendes med gode resultater.

Den ovenfor omtalte dyreundersøgelse er en fortrinlig model for injektion af det injicerbare materiale i mennesker.

Den foreliggende opfindelse er derfor velegnet og beregnet til opnåelse af de formål og resultater og har de træk og fordele, der er nævnt, tilligemed andre deri iboende.

20 Selv om de i øjeblikket foretrukne eksempler er blevet anført med henblik på redegørelse derfor, kan ændringer foretages deri, som ligger indenfor opfindelsens ånd, således som defi- neret af de efterfølgende kravs rammer.

19 DK 173020 B1

Litteratursteder 1. Gersuny, O: Ueber sine subeutane prothese. Z. Heilkunde. 9:1, 1900.

2. Heidingsfeld, ML: Histopathology of paraffin prosthesis. J. Cutan Dis 24:513, 1958.

5 3. Conway, H; Goulian, D: Experience with an injectable silastic RTU as a subcutaneous prosthetic material. Plast Reconstr Surg 32:294, 1963.

4. Rees, TD; Platt, J; Ballantyne, DL: An investigation of cutaneous response to dimethylpolysiloxanes (silicone liquid) in animals and humans. A preliminary report.

Plast Reconstr Surg 35:131, 1965.

10 5. Sternberg, TH; Ashley, FL; Wines, LH; Lehman, R: Gewebereaktionen auf injizi-erte Flussige Siliciumverbindungen. Hautarzt 15:281, 1964.

6. Ben-Hur, N; Neuman, Z: Siliconoma, another cutaneous response to the dimcthyl-polysiloxane. Plast Reconstr Surg 36:629, 1965.

7. Ashley, FL, Braley, S, mcNail, EG: The current status of silicone injection therapy.

15 Surg Clin North Am 51:501, 1971.

8. Ashley, FL, Thomson, DP, Henderson, T: Augmentation of surface contour by subcutaneous injections of silicone fluid, plast Reconstr Surg 51:8, 1973.

9. Blocksma, R: Experience with dimethylpolysiolxane fluid in soft tissue augmentation. Plast Reconstr Surg 48:564, 1971.

20 DK 173020 B1 10. Milojevie, B: Complications after silicone injection therapy in aesthetic plastic surgery. Aesth Plast Surg 6:203, 1982.

11. Rees, TD, Ashley, FL: Treatment of facial atrophy with liquid silicone. Am J Surg 111:531, 1966.

5 12. Rees, TD, Cobum, FJ: Silicone treatment of partial lipodystrophy. JAMA 230:868, 1974.

13. Pearl, RM, Laub, DR, Kaplan, EN: Complications following silicone injections for augmentation of the contours of the face. Plast Reconstr Surg 61:888, 1978.

14. Sage, H: Collagens of basement membranes, j invest Dermatol 79:515, 1982.

10 15. Wartiovaara, J, et al, Appearance of fibronectin during differentiation of mouse teratocarcinoraa in vitro, nature (London), 272, 355, 1978.

16. Chvapil, M: Reconstituted Collagen, Biology of Collagen. Vudik, A, and Vuust, J, eds. Academic press, Londa, 1980, 313.

17. Kurkinen, M, Alitals, R, Hedman K and Vaheri, A: Fibronectin, Procollagen and 15 the Peniccilin matrix in Normal and Transformed Fibroblast Cultures. Biology of Collagen, Vudik, A and Vuust, j, eds., Academic press, London, 1980, 223.

18. Williams, DF: Biocompatibility of Tlsue Analogs, Volume I, 1985.

19. Horwitz, Al, Hance, AO, and Crystal, RG: Granulocyte collagenase. Selective degradation of Type I relative to Type ΙΠ collagen, proc natl Acad Sci, U.S.A., 74: 20 897, 1977.

21 DK 173020 B1 20. Houck, J and Chang, C: The chemotactic properties of the products of collagenoly-sis. proc Soc Exp Biol med 138, 69, 1971.

21. Postlethwaite, AZ; Seyer, JM; and kang, AA: Chemotactic attraction of human fibroblasts to type I, Π and ΙΠ collagens and collagen-derived peptides, proc natl Acad 5 SciU.S.A75, 871, 1978.

22. Kligman, AM; Armstrong, RC: Histologic response to intradermal Zyderm® and Zyplast® (glutaraldehyde cross-linked) collagen in humans. J Dermatol Surg Oncol 12:351-357, 1986.

23. Burke, KE; Naughton, G; Cassai, N: A histological, immunological, and electron 10 microscopic study of bovine collagen implants in the human. Ann Plast Surg 14.515- 522, 1985.

24. Siegle, RJ; McCoy, JP; Schade, W, et al: Intradermal implantation of bovine collagen, humoral immune responses associated with clinical reactions. Arch Dermatol 120:183-187, 1984.

15 25. McCoy, JP, et al: Characterization of the humoral immune response to bovine collagen implants. Arch Dermatol 121:990-940, August, 1985.

26. Adelmann, BC; The structural basis of cell mediated immunological reactions of collagen. Immunology 23:739, 1972.

27. Armstrong, R, Cooperman, LS, and paikinson, TA: Injectable collagen for soft 20 tissue augmentation, national lhstritutes of Health Consensus Panel Meeting, in Contemporary Biomateriale: Material and Host Response, Clinical Application, new Technology, and Legal Aspects, Baretos, JW, and Eden, M, eds., Noyes, Park Ridge, new Jersey 1984.

22 DK 173020 B1 28. Sabelman, E, Biology, Biotechnology, and Biocompatibility of Collagen, in Biocompatibility of Tisue Analogs, Volume I. Williams, DF, ed. 1985.

29. Robbins, SL, Angell, m: Basic Pathology, Secondary Edition, page 19, 1976.

Claims (12)

1. Injicerbart materiale til forstærkning af blødt væv, kendetegnet ved, at det omfatter en steriliseret blanding af type I- og type ΙΠ-cbllagen, der er ekstraheret ved S proteolytisk fordøjelse af bestanddele Ha human placenta bestående af uopløselig amnion, opløselig amnion eller opløselig chorion og kombinationer deraf, hvilket materiale er homogeniseret til at passere gennem en kirurgisk kanyle.

2. Injicerbart materiale dl forstærkning af blødt væv ifølge krav 1, kendetegnet ved, at materialet er homogeniseret dl at passere gennem en kirurgisk kanyle med stan- 10 dardmål 30 (0,318 mm diameter).

3. Injicerbart materiale dl forstærkning af blødt væv ifølge krav 1 eller 2, k e n -d e t e g n e t ved, at den valgte bestanddel fra human placenta er opløselig amnion.

4. Injicerbart materiale dl forstærkning af blødt væv ifølge krav 1 til 3, k e n-detegnet ved, at materialet er tværbundet ved hjælp af γ-bestråling. IS S. Injicerbart materiale til forstærkning af blødt væv ifølge krav 4, kendetegnet ved, at γ-bestrålingen er på mindst 0,20 M rad (2,0 kj/kg).

6. Injicerbart materiale dl forstærkning af blødt væv ifølge krav 4, kendetegnet ved, at γ-bestrålingen ligger i intervallet fra 0,25 M rad til 2,0 M rad (2,5 kJ/kg dl 20 kJ/kg).

7. Injicerbart materiale dl forstærkning af blødt væv ifølge krav 1 til 6, k e n-d e t e g n e t ved, at det indbefatter et analgetikum. DK 173020 B1

8. Fremgangsmåde dl fremsdlling af et injicerbart materiale dl forstærkning af blødt væv, kendetegnet ved, at den omfatter sterilisering af en blanding af type I- og type ΙΠ-collagen, der er ekstraheret ved proteolytisk fordøjelse af bestanddele fra humant placenta bestående af uopløselig amnion, opløselig amnion eller opløselig chorion og S kombinationer deraf samt homogenisering af materialet i tilstrækkelig grad dl passage gennem en kirurgisk kanyle med et standardmål på mindst 25 (0,556 mm diameter).

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at materialet homogeniseres tilstrækkeligt dl at passere gennem en kirurgisk kanyle med standardmål 30 (0,318 mm diameter).

10. Fremgangsmåde dl fremsdlling af et injicerbart blødtvævsmateriale ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at den omfatter tværbinding af materialets kollagenmo-lekyler ved hjælp af γ-bestråling.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, aty-bestrålingen er på mindst 0,20 M rad (2,0 kJ/kg).

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, aty-bestrål ingen ligger i intervallet fra 0,25 M rad til 2,0 M rad (2,5 kJ/kg dl 20 kJ/kg).

13. Fremgangsmåde ifølge krav 8 til 12, kendetegnet ved, at den omfatter tilsætning af et analgetikum til det homogeniserede materiale. 20