DK175228B1

DK175228B1 - Anvendelse af 4H-1-benzopyran-4-on-derivater til fremstilling af et lægemiddel med en virkning mod tumorer

Info

Publication number: DK175228B1
Application number: DK198905372A
Authority: DK
Inventors: Gerhard Dickneite; Bansi Lal; Richard Helmut Rupp; Hans Harald Sedlacek; Joerg Czech; Ramchandra Ganapati Naik
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-10-28
Filing date: 1989-10-27
Publication date: 2004-07-19
Also published as: IE893481L; PT92145A; IE69982B1; PT92145B; JP2879910B2; EP0366061B1; CA1336715C; ES2084593T3; AU628409B2; KR900006325A; GR3018739T3; HK1006167A1; ATE133170T1; DE58909573D1; CY2026A; DE3836676A1; DK537289A; AU4384189A; EP0366061A1; JPH02178225A

Description

i DK 175228 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af 4H--l-benzopyran-4-on-derivater til fremstilling af et lægemiddel med en virkning mod tumorer.

Benzopyranderivater er allerede kendt fra EP patent-5 skrift nr. 137.193 og fra DE offentliggørelsesskrift nr. 3.612.337. I det sidstnævnte skrift beskrives der forbindelser med den almene formel I5 r^ScH 2>n 10 p a) R3 -lTI 0 i hvilken substituenterne R1-R5 samt m og n har de angivne 15 betydninger. Disse forbindelser har en betændelseshæmmende, analgetisk og immun-modulerende virkning.

Det har nu overraskende vist sig, at bestemte 4H-1--benzopyran-4-on-derivater inhiberer onkogen-kodende kinaser og dermed egner sig til bekæmpelse af tumorlidelser.

20 Ekspressionen af onkogener i en pattedyrscelle ind træder med overgangen fra den normale til den transformerede celletype, der dernæst bliver til en cancercelle. Transformationen fremkaldes ved infektion af en celle med et retrovirus. Et godt kendt eksempel er infektionen af høns med 25 Rous-Sarkom-virus, der derefter udvikler cancer. Det tilsvarende onkogen, der er ansvarligt for den ondartede transformation, betegnes sosm "SRC"-(Sarcom)-genet, jf. J.S. Brugge, R.L. Erikson, Nature 269, 346-348 (1977). Mange til dato kendte onkogener er karakteriseret ved ekspressionen 30 af et protein med kinaseaktivitet. Enzymerne katalyserer overførslen af den endestillede phosphatgruppe i ATP på en aminosyre. I modsætning til mange andre proteinkinaser, der overfører phosphatgruppen på en seryl- eller threonylgruppe, phosphorylerer de fleste onkogen-kodende kinaser en tyrosyl-35 gruppe i proteinkæden. Bortset herfra er det kendt, at produkter af onkogener, nemlig produkterne af v-mos-, v-mil-

I DK 175228 B1 I

I 2 I

I og v-raf-onkogenet, er i besiddelse af serin/threonin-speci- I

I fik proteinkinaseaktivitet, jf. K. Moiling et al., Nature I

I (London) 312. 558-561 (1984) og B. Singh et al., Journal of I

I Virology 60, 1149-1152 (1986). I

I 5 Tyrosinkinaseaktivitet eksprimeres også i vækstfak- ' I

I torreceptorer. Nye erkendelser viser nu, at væksten af mange I

I tumorer afhænger af nærværelsen af vækstfaktorer såsom epi- I

I derm vækstfaktor (EGF), transformerende vækstfaktor a (TGFa) I

I eller blodplade-afledt vækstfaktor (PDGF), jf. A.S. Goustin, I

I 10 G.D. Shipley, H.L. Moses, Cancer Research 46, 1015-1029 I

I (1986). I tilslutning til bindingen af vækstfaktoren til I

I dens receptor stimuleres tyrosinkinasen, der er en egen- I

I bestanddel af vækstfaktorreceptoren. I

I Af en inhibitor af tyrosinkinase og måske af serin/- I

I 15 threonin-kinase kunne man således forvente en inhibering af I

I tumorvækst og tumorudbredelse, og en sådan inhibitor kunne I

I anvendes ved tumorterapi. I

I Den foreliggende opfindelse angår således anvendelsen I

I af 4H-l-benzopyran-4-on-derivater med den almene formel I I

I 20 til fremstilling af et lægemiddel med en virkning mod tumo- I

I rer. Formlen I har følgende udseende: I

I I

SICH2>n I

ID I

T I

i hvilken 0

I R2 betyder hydrogen, alkyl med 1-6 carbonatomer, aryl-C^- I

I -C4-alkyl, substitueret C^Cg-alkyl, C3-C6-cycloalkyl, en I

I 30 C3-C^-heterocyclisk ring med 1, 2 eller 3 heteroatomer, I

I f.eks. N, S, 0 eller deres vilkårlige kombinationer, C^-C^- I

I -cycloalkyl-C1-C4-alkyl, C2-Cg-alkenyl, C2-Cg-alkynyl, aryl, I

I herunder polycycliske ringe, aromatiske heterocycliske grup- I

I per, substitueret aryl, carboxyl eller en aldehyd- eller I

I 35 C00-C1-C4-alkylgruppe, en primær amino-, alkylamino-, ar- I

I alkylamino-, dialkylamino-, amido-, arylamino-, diarylamino- I

DK 175228 B1 3 gruppe eller -CP^O-C!-C4-alkyl; R2 betyder hydrogen eller C]_-C3-alkyl; R3 er ens og betyder OH eller OCH3; R4 betyder hydroxy; 5 R5 betyder CH3; m betyder tallet 2; og n betyder tallet 1; samt disse forbindelsers farmakologisk uskadelige syreadditionssalte .

10 De her omhandlede forbindelser har to asymmetriske centre, et ved forbindelsesstedet for den nitrogen-hetero-cycliske ring med benzopyrandelen (C-4'), og det andet ved det ved R4 substituerede carbonatom (C-3 *), idet to optiske isomerpar er mulige. Definitionen af de her omhandlede for-15 bindeiser omfatter alle mulige stereoisomere og deres blandinger. Ganske specielt omfattet er de racemiske former og de isolerede optiske isomere med den angivne aktivitet. De to racemater kan adskilles ved fysiske metoder, f.eks. ved fraktioneret krystallisation. De enkelte optiske isomere 20 kan fås ud fra racematerne ved standardmetoder, f.eks. saltdannelse med en optisk aktiv syre og påfølgende krystallisation .

Egnede alkylgrupper i betydningen R^ er f.eks. lige-kædede eller forgrenede grupper med op til 6, fortrinsvis 25 op til 5 carbonatomer, f.eks. methyl-, ethyl-, propyl-, isopropyl-, tert.butyl-, pentyl- eller isopentylgrupper.

Egnede substituerede alkylgrupper R^ er f.eks. halo-genalkyl, f.eks. trifluormethyl, hydroxyalkyl, f.eks. hy-droxyethyl, eller carboxyalkyl, f.eks. carboxyethyl.

3 0 Egnede eksempler på en cycloalkylgruppe R^ med 3-6 carbonatomer er cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl eller cyclohexyl. Cyclopropylmethyl er et eksempel på en cycloal-kylalkylgruppe.

Et eksempel på en aralkylgruppe R^ er en phenylalkyl-35 gruppe, i hvilken phenylgruppen er usubstitueret eller substitueret en eller flere gange med substituenter såsom halo-

I DK 175228 B1 I

I I

I gen, Ci-C4-alkyl, C2-C4-alkoxy, nitro eller en trifluor- I

I methylgruppe, en aminogruppe eller en substitueret amino- I

I gruppe. . I

I Et eksempel på en arylgruppe er en phenylgruppe, I

I 5 der er usubstitueret eller substitueret en eller flere gange I

I med substituenter såsom halogen, ci_C4-alkyl, -C4-alkoxy, I

I hydroxy, carboxy, COO-alkyl, CONH2, CONH-alkyl, C0N(alkyl)2, I

I nitro eller trifluormethyl, amino, C2-C4-alkylamino, di-C^- I

I C4-alkylamino, aromatiske heterocycliske grupper, f.eks. I

I 10 pyridylgrupper, og polycycliske aromatiske grupper, f.eks. I

I naphthylgrupper. I

I Et egnet eksempel på en al kyl aminogruppe R]_ er gruppen I

I n"NR6R7' i hvilken n betyder 1-3, og Rg og R7 betyder I

I alkyl og har samme betydning som ovenfor angivet med hensyn I

I 15 til alkyl i betydningen R^-Rg. Desuden kan Rg og R7 sammen I

I med det nitrogenatom, hvortil de er bundet, danne en hetero- I

I cyclisk ring med ét eller flere heteroatomer. Egnede eksemp- I

I ler på heterocycliske ringe, der dannes af Rg og R7 sammen I

I med det nitrogenatom, hvortil de er bundet, er piperidin, I

I 20 pyrrolidin, morpholin, piperazin eller imidazol, der er I

I usubstitueret eller kan være substitueret i en eller flere I

I stillinger med C2-C4-alkyl, C2-C4-alkoxy, aryl eller en I

I hydroxy- eller aminogruppe. I

I Egnede eksempler på salte af de her omhandlede for- I

I 25 bindeiser med uorganiske eller organiske syrer er hydro- I

I chloridet, hydrobromidet, sulfatet, phosphatet, acetatet, I

I oxalatet, tartratet, citratet, maleinatet eller fumaratet. I

I Ifølge opfindelsen foretrækkes anvendelsen af for- I

I bindeiserne med den almene formel I

I 30 R\s I

I ho ''ηρ I

I i^fTVR2 I

I 35 i hvilken OH 0 I

I Rl' r2 °9 r5 har den i krav 2 angivne betydning, samt disse I

DK 175228 B1 5 forbindelsers fysiologisk uskadelige syreadditionssalte.

Ganske særligt foretrækkes anvendelsen af forbindelser med formlen la ifølge krav 2, hvilke forbindelser er ejendommelige ved, at betyder phenyl, thienyl, pyridyl, chlor-5 phenyl, dichlorphenyl, methylphenyl, aminophenyl, bromphenyl, hydroxyphenyl eller naphthyl, R2 betyder hydrogen, og R5 betyder methyl, samt disse forbindelsers farmakologisk u-skadelige syreadditionssalte.

Fremstillingen af disse forbindelser kan f.eks. ske 10 som beskrevet i EP patentskrift nr. 157.193 eller i DE offentliggørelsesskrift nr 3.612.337.

Foretrukne forbindelser, der særligt egner sig til anvendelsen ifølge opfindelsen, er f.eks. følgende: (±)-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-thienyl)-8-[4-(3-hydroxy-1-meth-15 yl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on, (-)-cis-5,7-dihydroxy-2-phenyl-8-[4-(3-hydroxy-1-methyl)--piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, (±)-cis-5,7-dihydroxy-2-phenyl-8-[4-(3-hydroxy-1-methyl)--piperidinyl]-4H-1-benzopyran-4-on-hydrochlorid, 20 (-)-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-pyridyl)-8-[4-(3-hydroxy-1-meth yl) -piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, (±)-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-pyridyl)-8-[4-(3-hydroxy-l-meth-yl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, (+)-cis-5,7-dihydroxy-2-(3-pyridyl)-8-[4-(3-hydroxy-1-meth-25 yl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, (+)-cis-5,7-dihydroxy-2-(4-pyridyl)-8-[4-(3-hydroxy-l-meth-yl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, (-)-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-chlorphenyl)-8-[4-(3-hydroxy-1--methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, 30 ( + )- cis-5,7-dihydroxy-2-(2-chlorphenyl)-8-[4-(3 -hydroxy-1--methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, (±)-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-chlorphenyl)-8-[4-(3-hydroxy-l--methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, ( + )-cis-5,7-dihydroxy-2-(2,5-dichlorphenyl)-8 - [4-(3-hydroxy-35 -1-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, ( + )-cis-5,7-dihydroxy-2-(2,4-dichlorphenyl)-8- [4-(3-hydroxy-

I DK 175228 B1 I

I 6 I

I -1-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, I

I (±)-cis-5,7-dihydroxy-2-(4-methylphenyl)-8-[4-(3-hydroxy-l- I

I -methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, I

I (±)-cis-5,7-dihydroxy-2-{3-methylphenyl)-8-[4-(3-hydroxy-l- I

I 5 -methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, I

I (±)-cis-5,7-dihydroxy-2-{4-aminophenyl)-8-[4-(3-hydroxy- I

I 1-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, I

I ( + )-cis-5,7-dihydroxy-2-(3-bromphenyl)-8-[4-(3-hydroxy-l- I

I -methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, I

I 10 (+)-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-naphthyl)-8-[4-(3-hydroxy-l- I

I -methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid, I

I { + )-cis-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-8-[4-(3-hydroxy-l- I

I -methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on og I

I (±)-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxyphenyl)-8- [4-(3-hydroxy-l- I

I 15 -methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on. I

I Yderligere her omhandlede 4H-l-benzopyran-4-on-deri- I

I vater eller forbindelser, der særligt egner sig til den her I

I omhandlede anvendelse, er anført i de følgende tabeller I I

I og II med tilhørende fysiske data. Tabel I vedrører forbin- I

I 20 delserne med den almene formel I

I ch3 I

I ORb 0 I

I og tabel II vedrører forbindelserne med den almene formel I

I 30 I

I ch3 I

i R9° I

I 35 l 11 j I

I ORq 0 i DK 175228 B1 7

TABEL I

Forb. Rj R2 R4 Rg Rg X Smp. Optisk _(°C) drejning IH H OH Η H 298 (sønderd'.) (+) 2 Η H OH CH3 CH3 HC1, 1,5H20 173-175 (+) 3 CH3 H OH Η H HC1, 237-240 (+) 4 CH3 H OH Η H HC1, 241-43 ( + ) 5 CH3 H OH Η H HC1, 241-42 (-) 6 CH3 H OH H CH3 HC1, 230-232 (+) 7 CH3 H OH CH3 CH3 2HC1, 2H20 236-239 (+) 9 C2H5 H OH Η H HC1, 1,5H20 230-233 (+) 10 C2H5 H OH CH3 CH3 HC1, 1,5H20 240-242 (+) 11 n-C3H7 CH3 OH Η H 191-192 ' (+) 12 n-C3H7 H OH Η H HC1, 190-192 (+) 13 n-C3H? H OH Η H HC1, 0,5H20 197-200 (+) 14 n-C3H7 H OH Η H HC1, 0,5H20 198-201 (-) 15 n-C4Hg H OH Η H HC1, H20 157-159 (+) 16 CH3 CH3 OH Η H H20 232-233 (+) 17 2-Pyridyl H OH Η H HC1, 0,SH20 229°C (+) 18 3-Pyridyl H OH Η H 2HC1, 2H20 278-280 (+) 19 4-Pyridyl H OH Η H 2HC1, 1,5H20 236-238 (+) 20 C02H H OH CH3 CH3 H20 >340 (+) 21 2-Thienyl H OH Η H 2H20 243-244 (+) 22 2-Thienyl H OH CH3 CH3 - 207-208 (+) 23 2-Pyridyl H OH Η H 2HC1,2H20 220-228 (-) 24 β-Styryl H OH Η H HC1, 1,5Η£0 >300 (+) 25 1-Naphthyl H OH Η H HC1, H20 195-200 (+) 26 2-Naphtyl H OH Η H HC1, 0,5H20 280-282 (+) 27 (2-Chlor- H OH Η H HC1 270-275 (+) phenyl )-methyl

I DK 175228 B1 I

I si

I TABEL II I

I Forb. R^g Rg Rg χ Smp. Optisk I

I__(°C)_drejning I

I 28 Η Η H HC1, 2H20 273-275 (+) I

I 29 4-N02 Η H HC1, 3H20 249 (sønderd.) (+) ' I

I 30 4-N02 CH3 CH3 HC1, 2H20 257-260 (") (+) I

I 31 2-Cl HH HC1, H20 198-200 (+) I

I 32 2-C1 CH3 CH3 1,5HC1, H20 190-191 (+) I

I 33 4-NH2 Η H 2HC1, 2H20 240-242 (+) I

I 31 3,5-Dimethoxy CH3 CH3 2HC1, 2H20 180-182 (+) I

I 32, 4-Br Η H HC1, 2H20 215 (+) I

I 33 4-C1 Η H HC1, 1,5H20 225 (+) I

I 34 2,4-Dichlor Η H HC1, 2,5H20 165-166 (+) I

I 35 4-F HH HC1, H20 285-287 (+) I

I 36 2-F HH HC1, 2H20 263-265 (+) I

I 37 4-Methyl Η H HC1, 1,5H20 247-49 (+) I

I 38 3,5-Oihydroxy Η H HC1, 3H20 300-302 (+) I

I 39 3-Cl Η H HC1, 2H20 288-290 (+) I

I 40 3-Methyl Η H HC1, 2H20 268 (+) I

I 41 2-Methyl Η H 204-205 (+) I

I 42 2-Cl Η H HC1, 2H20 190-192 (+) I

I 43 H HH HC1 269-271 (+) I

I 44 3-Br HH HC1, 2H20 285 (+) I

I 45 3-C02Me CH3 CH3 1.5HC1, 3H20 235 (+) I

I 46 2,5-Dichlor Η H HC1, H20 251-252 (+) I

I 47 3-COOH CH3 CH3 HC1, 1,5H20 270 (+) ' I

I 48 2-Cl Η H HC1, 1,5H20 190-194 (-) I

I 49 H HH HC1, 0,5H20 266-269 (-) I

I 50 Η Η H HC1 270-271 (+) I

I 51 4-OH Η H H20 > 340 (+) I

I 52 4-Phenyl Η H HC1 240-242 (+) I

I 53 2-Br Η H 1,5H20 250-252 (+) I

I 54 2-OH HH H20 265-270 (+) I

DK 175228 B1 9

Fremstillingen af nogle af de ifølge opfindelsen anvendelige forbindelser samt fremstillingen af de nødvendige udgangsstoffer er udførligt beskrevet i DE offentliggørelsesskrift nr. 3.612.337. En fremgangsmåde til fremstilling 5 af forbindelserne er ejendommelig ved, at man omsætter en forbindelse med den almene formel l5 UI)

10 rXr'-'OH

R3 4C J

o i hvilken R4 betyder hydroxy eller acetoxy, og R3, R5, n og m har de ovenfor angivne betydninger, f.eks. med et alkali-15 metal og alkylesteren af en syre med formlen R^-COOalkyl, hvor R^ har den i forbindelse med formlen I angivne betydning, til dannelse af en diketon med den almene formel 5* Χ(ΟΗ2)η 20 /kJ (III) 4 -’m

O

hvorpå den dannede forbindelse ved omsætning med en mineral-25 syre ringsluttes til en forbindelse med formlen Ib, i hvilken Rj_, R3, R5, m og n har dé ovenfor angivne betydninger, R4 betyder en hydroxy- eller acetoxygruppe, og R2 betyder hydrogen, hvorpå om ønsket en forbindelse med formlen Ib, i hvilken R5 betyder CH3, efter beskyttelse af hydroxygrupperne, 30 omsættes med bromcyan, og den dannede forbindelse omsættes surt eller alkalisk til en forbindelse med formlen Ib, i hvilken R5 betyder hydrogen, eventuelt en forbindelse med formlen Ib, i hvilken R5 betyder hydrogen, omsættes med egnede elektrofile reagenser såsom halogenider, syrechlori-35 der, tosylater eller enoner, til forbindelser med formlen Ib, i hvilken R5 betyder usubstitueret eller substitueret

DK 175228 B1 I

10 I

Ci-Cg-alkyl, aryl--Ci-C4-alkyl, C3~Cg-cycloalkyl eller C3- I

Cg-cycloalkyl-C1-C4~alkyl, og en forbindelse med formlen I

Ib, i hvilken R2 betyder hydrogen, eventuelt omsættes med I

et sekundært aminhydrochlorid og paraformaldehyd til en I

5 forbindelse med formlen Ib, i hvilken R2 betyder dialkyl- I

aminomethyl, eller en forbindelse med formlen Ib, i hvilken I

R2 betyder hydrogen, eventuelt nitreres til en forbindelse I

med formlen Ib, i hvilken R2 betyder N02, og en forbindelse I

med formlen Ib, i hvilken R2 betyder N02, eventuelt hydro- I

10 generes til en forbindelse med formlen Ib, i hvilken R2 I

betyder en aminogruppe. I

Betingelserne for de enkelte reaktionstrin er de I

samme som beskrevet i DE offentliggørelsesskrift nr. I

3.612.337. En særlig foretrukken metode til fremstilling af I

15 de her omhandlede forbindelser er omsætningen af en for- I

bindelse med den almene formel I

CHo I

1 J (IV) I

20 '-"Y I

VVCH3 I

h3co o I

25 i hvilken R betyder H, med en forbindelse med formlen I

Rx-COO X I

i hvilken X betyder hydrogen eller halogen, fortrinsvis I

30 hydrogen eller chlor. Denne esterificering finder sted under I

alment kendte betingelser, f.eks. som beskrevet i Organicum, I

VEB, Deutscher Verlag der wissenschaften, 15. oplag, Berlin I

1977, kapitel D7. De således dannede estere behandles med I

baser, f.eks. natriumhydrid, fortrinsvis i aprotiske opløs- I

35 ningsmidler, f.eks. tetrahydrofuran, dioxan eller N,N-di- I

methylformamid, i en indifferent atmosfære, hvorved der I

11 DK 175228 B1 dannes diketoner, som almindeligvis ikke isoleres. Den beskrevne omsætning illustreres nærmere i de følgende eksempler.

De her omhandlede forbindelser er i besiddelse af 5 farmakologiske egenskaber, og de inhiberer navnlig onkogen--kodende kinaser, f.eks. tyrosinkinase, serin/threoninkinase og vækstfaktorreceptor-tyrosinkinase, og det kan således forventes, at de inhiberer væksten og udbredelsen af tumorer og kan anvendes ved tumorterapi.

10 Anvendelsen ifølge opfindelsen af 4H-l-benzopyran-4- -on-derivaterne sker på i og for sig kendt, for fagmanden gængs måde. Som lægemiddel anvendes en virksom mængde af det nævnte virksomme stof, enten i sig selv eller fortrinsvis i kombination med egnede farmaceutiske hjælpestoffer i form 15 af tabletter, dragées, kapsler, suppositorier, emulsioner, suspensioner eller opløsninger, idet indholdet af det virksomme stof kan andrage op til ca. 95%, fortrinsvis mellem 10 og 75%.

yderligere hjælpestoffer, der er egnet til den ønskede 20 lægemiddelsammensætning, er kendt for fagmanden på grundlag af dennes almene viden. Ud over tablethjælpestoffer, opløsningsmidler, geldannere, suppositoriegrundlag og andre bærere for virksom stof kan der f.eks. anvendes antioxidanter, dispergeringsmidler, emulgatorer, skumdæmpende midler, smags-25 korrigerende midler, konserveringsmidler, opløsningsformidlere eller farvestoffer.

Det virksomme stof kan indgives oralt, paranteralt, intravenøst eller rektalt, idet den intravenøse indgivelse foretrækkes. Til en oral anvendelsesform blandes det nævnte 30 virksomme stof eventuelt med yderligere aktive forbindelser med de dertil egende tilsætningsstoffer, f.eks. bærestoffer, stabilisatorer eller indifferente fortyndingsmidler, og bringes ved hjælp af gængse metoder på egnede indgivelsesformer, f.eks. tabletter, dragées, stikkapsler samt vandige, alkoho-35 liske eller olieagtige suspensioner eller opløsninger. Som indifferente bærestoffer kan der f.eks. anvendes gummi ara-

I DK 175228 B1 I

I 12 I

I bicum, magnesiumoxid, mælkesukker, glucose eller stivelse, I

I navnlig majsstivelse. Fremstillingen af præparatet kan ske I

I såvel som tør- som fugtigt granulat. Som olieagtige bære- I

I stoffer eller opløsningsmidler kommer f.eks. vegetabilske I

5 eller animalske olier i betragtning, f.eks. solsikkeolie I

I eller levertran. I

I Til subkutan eller intravenøs indgivelse bringes det I

I virksomme stof om ønsket sammen med de dertil gængse stoffer, I

I f.eks. opløsningsformidlere, emulgatorer eller yderligere I

I 10 hjælpestoffer, i opløsning,· suspension eller emulsion. Som I

I opløsningsmidler kan der f.eks. anvendes vand, fysiologisk I

I kogesaltopløsning eller alkoholer, f.eks. ethanol, propanol I

I eller glycerol, samt endvidere også sukkeropløsninger, f.eks. I

I glucose- eller mannitolopløsninger, eller også en blanding I

I 15 af de forskellige nævnte opløsningsmidler. I

I Den dosis af 4H-l-benzopyran-4-on-derivater, der I

I skal indgives, kan strække sig over et bredt område. Som en I

I daglig dosis til indgivelse skal der vælges en sådan, der I

I er afpasset efter den ønskede virkning. Pr. patient indgives I

I 20 der fortrinsvis dagligt fra ca. 20 til ca. 1000 mg, fortrins- I

I vis intravenøst. Der kan om nødvendigt også dagligt indgives I

I doser, der ligger lavere eller højere, idet en maksimal I

I mængde på 2000 mg kun bør overskrides kortvarigt. I

I De farmakologiske egenskaber af -de her omhandlede I

I 25 forbindelser er bekræftet ved de i det følgende beskrevne I

I farmakologiske forsøg, der er udført med de her omhandlede I

I forbindelser og deres salte. De opnåede resultater fremgår I

I af den følgende tabel III. I 1

30 AFPRØVNINGSMETODER I

I Tvrosinkinase-inhiberingsforsøg I

I Afprøvningsmetode: I

Udgangsmaterialet til tyrosinkinase-aktiviteten er I

I rotte-tumorcellelinien RR 1022 (ATCC CCL47), der dyrkes i I

I 35 RPMI 164 0-medium +10% FCS. Denne cellelinie er transformeret I

I med RSV (Rous-Sarkom-virus) og indeholder onkogenproduktet I

DK 175228 B1 13 PP60v'src, der er i besiddelse af tyrosinkinase-aktivitet.

Cellerne dyrkes næsten til konfluens, vaskes med PBS (phosphat-bufret saltopløsning), afskrabes fra kulturkolben, vaskes to gange med hver gang 0,85%'s NaCl-opløsning og 5 centrifugeres ved 200 x G.

Der tilsættes derefter 100 μΐ puffer (10% glycerol, 2 5 mM tris-HCl, pH = 7,4, 10 mM KCl, 1 mM EDTA, 1% Triton® X-100, et tensid fra firmaet Rohm & Haas, Philadelphia, USA, 2 mM PMSF (phenylmethyl-sulfonyl-fluorid) , 100 kalli-10 krein-inaktiverende enheder aprotinin pr. ml og 2 mM dithio-treitol) pr. 1 x 106 celler til lyse af cellerne. Efter 5 minutter ved 4°C centrifugeres lysatet i 10 minutter ved 10.000 x G, og den ovenstående væske anvendes som udgangsmateriale til tyrosinkinase-aktivitet.

15 Tyrosinkinase-aktiviteten af lysatet måles med poly

(Glu, Tyr), 4:1, som substrat. Inhibitoren forinkuberes med cellelysat, substrat (2 mg/ml) og Mg2 + (10 mM) i 100 mM

HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsyre), pH

= 7,2, og reaktionen begyndes ved tilsætning af ύ-32Ρ-ΑΤΡ 20 (40 μΜ) . Efter 15 minutter ved 30°C fældes substratet med 10% TCA (trichloreddikesyre), filtreres på en millititer-- filtreringsplade (Millipore Corporation, Mass., USA), vaskes og tørres. Indbygningen af 32P konstateres ved hjælp af en væskescintillationstæller.

25 Resultater:

Stofferne afprøves ved en maksimal koncentration på 45 μg/ml og fortyndes trinvis i forholdet 1:10. IC50 betegner den koncentration, ved hvilken 50% af udgangsenzymaktiviteten hæmmes, jfr. tabel III.

30

Afprøvning af 31.51-cAMP-afhænaig proteinkinasehæmning Forsøgsbeskrivelse:

Den katalytiske underenhed af den cAMP-afhængige proteinkinase (Sigma) rekonstitueres som beskrevet af Sigma 35 (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA). Enzymaktiviteten måles med Kemptid (Sigma) (Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-

I DK 175228 B1 I

I 14 I

I -Gly) som substrat. Inhibitoren forinkuberes med enzym, I

I substrat (190 μΜ) , Mg2 + (5 mM) , 0,25 mg BSA pr. ml og 3,75 I

I mM mercaptoethanol i 50 mM MOPS (4-morpholinpropansulfon- I

I syre), pH = 6,9. Reaktionen begyndes ved tilsætning af I

I 5 -r-^2P ATP (40 μΜ) . Efter 15 minutter ved 30°C anbringes en I

I alikvot del på p81-ionbytterpapir (2 x 2 cm; Whatman Paper I

I Ltd., Storbritannien), neddyppes i 75 mM H3PO4, vaskes og I

I tørres, og indbygningen af -*2P måles ved hjælp af en væske- I

I scintillationstæller. I

I 10 Resultater: I

I Resultaterne udtrykkes som procent hæmning af udgangs- I

I enzymaktiviteten ved en inhibitorkoncentration på 45 μg/ml, I

I jfr. tabel III. I

15 DK 175228 B1

TABEL III

Formel Ic,

i hvilken R2 = Rg = H og R4 = OH

Ri X Forte'gn"for IC50 i %-Hæmning af den optiske μg/ml c-AMP-afhæn- drejning pp60 v-src gig protein- ' -kinase ved 45 Mg/inl in-hibitorkon- ____centration 2-Thiophenyl - (+) 1,7 14 2-Bromphenyl - (+) 22,3 63 (2-Chlorpheny1)- HCl (+) >45,0 69 methyl

Phenyl HCl (-) 5,7 46 2-Chlorphenyl HCl (+) 9,2 27 2- Fluorphenyl HCl (+) 28,0 0 4-Methylphenyl HCl (+) 2,7 55 3- Pyridyl HCl {+) 10,6 0 2-Pyridyl HCl (+) 34,8 0

Phenyl HCl (+) 0,7 13 4- Pyridyl HCl (+) 4,2 12 n-Propyl HCl (±) 45,0 0 2-Chlorphenyl HCl (+) 3,3 29

Ethyl HCl { + ) >45,0 0

Phenyl HCl (+) 1,9 48 4-Bromphenyl HCl (+) 3,4 65 4-Biphenyl HCl (+) 39,0 37 n-Butyl HCl (+) 0,0 ikke bestemt 2-Pyridyl HCl {-) 7,8 6 2-Naphthyl HCl (+) 3,4 0 4-Fluorphenyl HCl (+J 2,7 25 4-Chlorphenyl HCl (+) 1,6 37 n-Propyl HCl (-) >45,0 5

Det følgende eksempel tjener til illustration af opfindelsen.

DK 175228 B1 I

16 I

SRC-Tumorforsøg: I

Enkeltcellesuspensioner (cellekultur A 549 eller I

isolerede humane Tumor Xenografts LXF 529) i vævsklæber I

(Beriplast®, Behringwerke AG) fortyndes i forholdet 1:2 med I

5 RPMI 1640-medium og suppleres med 15% FCS til en cellekon- I

centration på 107 celler pr. 50 μΐ. Denne suspension opsuges I

hurtiges i 50 μΐ-glaskapillarrør (diameter 1,5 mm), hvis I

indre vægge er fugtet med en thrombin/CaCl2-opløsning (500 I

enheder thrombin i 1 ml 40 mmol CaCl2)- I

10 Efter størkning af celle-fibrin-blandingen (ca. 5 I

minutter ved stuetemperatur) transporteres fibrinnetværket I

ved hjælp af lufttryk ud af glaskapillarrørene til en petri- I

skål. I

Fibrinnetværket udskæres i 2 mm store dele (ca. 5 x I

15 105 celler pr. stk.), og delene opbevares indtil implanta- I

tionen i RPMI 1640-medium, suppleret med 15% FCS. I

Et enkelt fibrinstykke implanteres under nyrekapslen I

af en hårløs mus, og derefter måles to på hverandre vinkel- I

rette diametre af det implanterede stykke ved hjælp af et I

20 mikroskop med okular-mikrometer (dag 0). TumorstørreIsen I

måles ved hjælp af formlen I

V = a x b I

25 hvor· V betegner tumorstørrelsen, I

a betegner den største diameter og I

b betegner diameteren vinkelret på a. I

Forsøgsforbindelsen indgives intravenøst eller per- I

oralt dagligt på dagene nr. 2 - 15 i den maksimalt tålelige I

30 dosis (MVD) og en dosis, der andrager 2/3 af MVD-værdien I

ifølge for-forsøgene. Der anvendes 5 mus pr. gruppe. I

Den 21. dag efter implantationen aflives dyrene, I

nyrerne udpræpareres, og tumorstørrelserne måles på ny. I

Virkningen af forsøgsforbindelsen bestemmes på basis af I

35 tumorvæksthæmningen. I

DK 175228 B1 17

Den relative tumorstørrelse bestemmes ved hjælp af den følgende formel: 5 v* ^ i hvilken

Vt betegner tumorstørrelsen ved afslutningen af forsøget (dag 21) , og 10 V0 betegner tumor-/fibrinstørrelsen på implantationsdagen.

Derefter relateres den gennemsnitlige relative tumorstørrelse for den behandlede gruppe (VT) til den tilsvarende gennemsnitlige tumorstørrelse for kontrolgruppen (Vc) iføl-ge følgende formel:

VT

T/C % = tz— x 100

VC

20

Den statistiske signifikans (p >0,05) for den anti-tumorale virkning bestemmes ved hjælp af Wilcoxon U-forsøgene .

Forsøgsresultaterne fremgår af den følgende tabel IV.

18 I

DK 175228 B1 I

TABEL IV I

Forsøgsfor- Tumor Dosis Behandlingsvarighed I

bmdelse (mg/kg/dag) (dage) T/C I

_;__(¾) ' I

broncho- I

gent I

carcinom I

Eks. 17 LXF 529 25 i.v. 2-15 81 n.s. I

35 i.v. 2-15 67 I

A549 35 i.v. 2-15 70 I

100 p.o. 2-15 73 I

Eks. 9 LXF 529 2 i.v. 2-15 59 I

4 i.v. 2-15 51 I

Eks. 19 LXF 529 100 i.v. 2-15 98 n.s. I

150 i.v. 2-15 80 I

n.s. = ikke signifikant (p >0/05) I

DK 175228 B1 19

Eksempel 1 ( + )-cis-5.7-Dimethoxy-2-(2-thienyl)-8-(4-(3-acetoxy-1-methyl) -pjperidinvll-4H-l-ben20pyran-4-on

Til en opløsning af 3,0 g (+)-cis-3-acetoxy-l-methyl-5 -4-(3-acetyl-4,6-dimethoxy-2-hydroxy)-phenylperidin med formlen IV, i hvilken R betyder C0CH3, i 30 ml tør pyridin sættes der 2,73 g 2-thiophencarboxylsyre ved 0°C, og derefter 2,2 ml POCI3. Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur. Der sættes langsomt 50 ml vand til reak-10 tionsblandingen, og reaktionsopløsningen gøres senere alkalisk ved tilsætning af natriumcarbonatopløsning (pH = 8) . Reaktionsblandingen ekstraheres med 3 x 40 ml eddikeester.

De forenede organiske ekstrakter vaskes med vand, tørres med vandfrit natriumsulfat, og opløsningsmidlet fjernes 15 under vakuum. Remanensen chromatograferes på silicagel (4%

MeOH i CHCI3), og der fås et udbytte på 2,7 g (±)-cis-3--acetoxy-l-methyl-4- (3-acetyl-4,6-dimethoxy-2- (2-thienyloxy) --phenyl)-piperidin med smp. 153-154°C.

Denne forbindelse optages i 50 ml tør dioxan, der 20 tilsættes 5 ækvivalenter natriumhydrid, og blandingen omrøres i 4 timer ved 40°C. Der tilsættes 10 ml MeOH til sønderdeling af overskydende natriumhydrid, og der tilledes tør HCl-gas, indtil opløsningens pH-værdi tydeligt er sur.. Reaktionsblandingen oparbejdes ved tilsætning af iskold natriumcarbonat-25 opløsning, og det fremkomne faste produkt skilles fra ved filtrering. Den yderligere rensning gennemføres ved hjælp af søjlechromatografi (silicagel, 2% MeOH, 1% NH4OH i CHCI3) , og der fås 2,50 g (+)-cis-5,7-dimethoxy-2-(2-thienyl)-8-[4-- (3-acetoxy-1-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on med 30 smp. 207-208°C.

Analogt med eksempel 1 fremstilles følgende forbindelser:

Eksempel 2 35 ( + )-cis-5,7-dihydroxy-2-(phenyl) -8-(4-(3-hydroxy-l- -methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid.

I DK 175228 B1 I

I 20 I

I Eksempel 3 I I (-)-cis-5,7-dihydroxy-2-phenyl-8-[4-(3-hydroxy-1- I I -methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid. I

I 5 Eksempel 4 I I (+)-cis-5,7-dihydroxy-2-phenyl-8-[4-(3-hydroxy-l- I I -methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid. I

I Eksempel 5 I I 10 (-)-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-pyridyl)-8 -[4-(3-hydroxy- I I -1-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid. I

I Eksempel 6 I I (+)-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-pyridyl)-8-[4-(3-hydroxy- I I 15 -l-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid. I

I Eksempel 7 I I (±)-cis-5,7-dihydroxy-2-(3-pyridyl)-8-[4-(3-hydroxy- I I -l-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid. I

I 20 I

I Eksempel 8 I I ( + )-cis-5,7-dihydroxy-2-(4-pyridyl)-8-[4-(3-hydroxy- I I -l-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid. I

I 25 Eksempel 9 I I (-)-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-chlorphenyl)-8-[4-(3-hydr-, I I oxy-l-methyl) -piperidinyl] -4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid. I

I Eksempel 10 I I 30 ( + )-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-chlorphenyl)-8-[4-(3-hydr- I I oxy-l-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid. I

I Eksempel 11 I

I ( + )-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-chlorphenyl)-8- [4-(3-hydr- I

I 35 oxy-l-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid. I

21 DK 175228 B1

Eksempel 12 ( + )-cis-5,7-dihydroxy-2-(2,5-dichlorphenyl)-8-[4-(3--hydroxy-1-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydro-chlorid.

5 , Eksempel 13 ( + )-cis-5,7-dihydroxy-2-(2,4-dichlorphenyl)-8-[4-(3--hydroxy-1-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydro-chlorid.

10

Eksempel 14 ( + )-cis-5,7-dihydroxy-2-(4-methylphenyl)-8- [4- (3--hydroxy-l-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydro-chlorid.

15

Eksempel 15 (±) -cis-5,7-dihydroxy-2-{3-methylphenyl)-8- [4- {3--hydroxy-1-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydro- chlorid.

20

Eksempel 16 ( + )- cis-5,7-dihydroxy-2-(4-aminophenyl)-8-[4-(3-hydr-oxy-l-methyl) -.piperidinyl] -4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid.

25 Eksempel 17 (±)-cis-5,7-dihydroxy-2-(3-bromphenyl)-8-[4-{3-hydr-oxy-l-methyl) -piperidinyl] -4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid.

Eksempel 18 30 (±)-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-naphthyl)-8- [4-(3-hydroxy- -1-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on-hydrochlorid.

Eksempel 19 ( + )- cis-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-8 - [4-(3- 35 -hydroxy-1-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on.

I DK 175228 B1 I

I 22 I

I Eksempel 20 I

I ( + )-cis-5,7-dihydroxy-2-(2-hydroxyphenyl)-8-[4-(3- I

I -hydroxy-1-methyl)-piperidinyl]-4H-l-benzopyran-4-on. I

I 5 Eksempel 21 I

I Opløsninger af virksomt stof, der er egnet til injek- I

I tion, indeholder de i det følgende angivne bestanddele og I

I kan fremstilles på i og for sig kendt måde, idet stofferne I

I blandes med hinanden og fyldes på sterile ampuller. Injek- I

I 10 tionsopløsningerne tjener til antitumor-behandling i en I

I dosis på 1-2 injektionsenheder (1 injektionsenhed = 1 ampul) I

I pr. dag. I

I Bestanddele (pr. ampul) Vægt I

I 15 (+)-cis-5,7-dimethoxy-2-(2-thienyl)- I

I -B-[4-(3-acetoxy-1-methyl)-piperidinyl]- I

I -4H-l-benzopyran-4-on 200 mg I

I Natriumchlorid 50 mg I

I Methylparaben 5 mg I

I 20 Sterilt vand 5 mg I

Claims

2. Anvendelse af forbindelser ifølge krav 1 med den almene formel I DK 175228 B1 I i -- wi; I OH o I I- i hvilken "I I R]_ betyder hydrogen eller C]_-C3-alkyl, naphthyl, eventuelt I I med halogen, C1-C4-alkyl, C1-C4-alkoxy, hydroxy, carboxy, I I 10 COO-Alkyl, CONH2, CONH-Alkyl, CON(Alkyl)2, nitro, trifluor- I I methyl, amino, C^-C4-alkylamino, di-Ci-C4-alkylamino, aroma- I I tiske heterocykler, såsom pyridylgrupper, og polycykliske I I aromatiske grupper, såsom naphthylgrupper, substitueret I I aryl eller en Cj-Cg-heterocyklisk gruppe,· I I 15 R2 betyder hydrogen eller ^-C3-alkyl; og I I R5 betyder CH3; I I eller deres farmakologisk uskadelige syreadditionssalte. I
3. Anvendelse af forbindelser med formlen la ifølge I I krav 2, kendetegnet ved, at R^ betyder phenyl, I I 20 thienyl, pyridyl, chlorphenyl, dichlorphenyl, methylphenyl, I I aminophenyl, bromphenyl, hydroxyphenyl eller naphthyl, R2 I I betyder hydrogen; og R5 betyder methyl; eller disse forbin- I I delsers farmakologisk uskadelige syreadditionssalte. I I I