DE10113513A1 - Kombinationspräparat zur Prophylaxe und/oder Therapie von Nervenzell- und/oder Gliazellschäden durch ein neues Behandlungsverfahren - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Erzeugnis, enthaltend mindestens einen Kinase-Inhibitor (A), der nur eine geringe oder keine hemmende Aktivität auf Raf aufweist und mindestens einen neurotrophen Faktor (B) und/oder mindestens eine Substanz (C), welche in der Lage ist, die zelluläre Bildung und/oder die Freisetzung eines oder mehrerer neurotropher Faktoren (B) zu verstärken und/oder zu bewirken als Kombinationspräparat zur Anwendung in der Prophylaxe und/oder Therapie von Nervenzell- und/oder Gliazellschäden.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Erzeugnis, enthaltend mindestens einen Kinase-Inhibitor (A), der nur eine geringe oder keine hemmende Aktivität auf Raf aufweist, mindestens einen neurotrophen Faktor (B) und/oder mindestens eine Substanz (C), welche in der Lage ist, die zelluläre Bildung und/oder die Frei­ setzung eines oder mehrerer neurotropher Faktoren (B) zu verstärken und/oder bewirken und welche zusätzlich zu oder anstelle des neurotrophen Faktors (B) mit dem Kinase-Inhibitor (A) kombinierbar ist, als Kombinationspräparat zur Anwen­ dung in der Prophylaxe und/oder Therapie von Nervenzell- und/oder Gliazell­ schäden.

Die Degeneration von Nervenzellfortsätzen und das Absterben von neuronalen Zellen ist ein wesentliches Charakteristikum von akuten und chronischen neuro­ degenerativen Erkrankungen. Die Frage, wie Nervenzellen sterben, ist in allen Einzelheiten bislang noch nicht ausreichend verstanden. Gleichermaßen unver­ standen sind die Mechanismen für die Aufrechterhaltung von Nervenzellfortsät­ zen, besonders von Axonen.

Jedoch ist bekannt, daß Nervenzellen für ihr Überleben, und für das Auswachsen und die Aufrechterhaltung ihrer Nervenzellfortsätze eine trophische Unterstützung benötigen.

Es ist auch bekannt, daß Nervenzellen, gleichgültig ob sie eine sensorische oder motorische Funktion haben, nur in Anwesenheit einer Anzahl von sogenannten neurotrophen Faktoren überleben können. Ein Entzug dieser neurotrophen Fakto­ ren führt zumindest in der Zellkultur zur verstärkten Expression von proapopto­ tisch wirkenden Proteinen, wie beispielsweise p38, JNK und Fas-L (Le-Niculescu et al Mol Cell Biol 19(1): 751-763, 1999).

Die neurotrophen Faktoren stellen Mitglieder unterschiedlicher Familien dar. Zu ihnen gehören die Neurotrophine, wie beispielsweise der Brain Derived Neu­ rotrophic Factor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), NT-4/5, NT-6 (Götz et al Na­ ture 372: 266-269, 1994) und der Nerve Growth Factor (NGF) (Kaplan und Miller, Curr. Opin. Neurobiol. 10: 381-291, 2000), des weiteren der Ciliary Neu­ rotrophic Factor (CNTF), Stöckli et al., Nature 342: 920-923, 1989; J Cell Biol 115: 447-459, 1991), der Leukemia-Inhibitory Factor (LIF), das Cardiotrophin-1 (CT-1) (Pennica et al., Neuron 17: 63-74, 1996), der Insulin like Growth Factor (IGF) (Hughes et al., J Neurosci Res 36(6): 663-671,1993; Arakawa et al J Neu­ rosci 10: 3507-3515, 1990), das Insulin (Ryu et al. J Neurobiol 39(4): 536-546, 1999), der Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) (Mama und Klein, Nat. Neurosci. 2: 213-217, 1999), der Gliacell Derived Neurotrophic Factor (GDNF) (Yan et al., Nature 373: 341-344, 1995; Oppenheim et al., Nature 373: 344-346, 1995; Hen­ derson et al., Science 266: 1062-1064, 1994; Lin et al., Science 260: 1130-1132, 1993; Balok et al., Curr. Opin. Neurobiol. 10: 103-110, 2000), das Neurturin (Kotzbauer et al Nature 384: 467-470, 1996), das Artemin (Baloh et al., Neuron 21: 1291-302, 1998), das Persephin (Milbrandt et al., Neuron 20: 245-253, 1998), das Midkine (Owada et al., J Neurochem 73(5): 2084-2092, 1999) und ein neues Mitglied der Transforming Growth Factor Familie, das GDF-15 (Kriegelstein und Unsicker WO 00/70051)

Derartige neurotrophe Faktoren wirken durch Bindung an und Aktivierung von Tyrosin-Kinase-Rezeptoren. So binden beispielsweise

• - NGF mit hoher Affinität an den Receptor trkA,
• - BDNF und NT-4/5 an trkB und
• - NT-3 an trkC (Glass und Yancopoulos, Trends Cell Biol 3: 262-268, 1993).
• - CNTF bindet an einen Rezeptorkomplex aus drei Untereinheiten, dem Re­ zeptor-a, gp130 und dem LIF-Rezeptor-b. An diesen Rezeptorkomplex bindet auch LIF und CT-1.
• - IGF, Insulin, Midkine wie auch GDNF binden an ihre jeweiligen spezifischen Rezeptoren.

Von diesen unterschiedlichen Rezeptoren für neurotrophe Faktoren wird das Ak­ tivierungssignal über im Zytoplasma vorhandene signaltransduzierende Proteine in den Zellkern übertragen. Mehrere Signalübertragungswege sind hierbei in Neu­ ronen bekannt. Zu ihnen gehören antiapoptotisch wirkende Aktivierungswege, wie beispielsweise der PI-3K-AKT-Signalübertragungsweg und der Ras-Raf- Übertragungsweg. Beide Aktivierungswege sind vernetzt durch aktiviertes RAS, ein Protein, welches in dem Raf-Übertragungsweg eine Schlüsselrolle einnimmt (Yuan und Yankner, Nature 407: 802-809, 2000). Zusätzliche Raf-abhängige Sig­ nalübertragungswege sind der Bag-1-C-Raf Signalweg (Wang et al., PNAS USA 93: 7063-7068, 1996) und der Rap-1-B-Raf-cAMP Signalweg (Grewal et al., J. Biol. Chem. 275: 3722-3728, 2000).

Zu ihnen gehören jedoch auch proapoptotisch wirkende Aktivierungswege, wie die durch ASK stimulierten p38 - oder JNK Übertragungswege (Sedlacek Drug 59(3): 435-476, 2000).

Ein Entzug dieser neurotrophen Faktoren führt in Nervenzellen, zumindest in der Zellkultur, zur verstärkten Expression von proapoptotisch wirkenden Proteinen, wie beispielsweise p38, JNK und Fas-L (Le-Niculescu et al., Mol Cell Biol 19(1): 751-763, 1999). In beschränktem Ausmaß kann der Entzug eines bestimmten neu­ rotrophen Faktors durch die Zugabe eines anderen neurotrophen Faktors kompen­ siert werden (Russel et al., J Neurobiol 36(4): 455-467, 1998). Desweiteren ist bekannt, daß die Kombination von unterschiedlichen neurotrophen Faktoren eine additive oder synergistische antiapoptotische Wirkung auf Nervenzellen haben kann (Kobayashi und Matsuoka Neuroreport 11: 2541-2545, 2000).

Das Muster der von den unterschiedlichen Nervenzellen exprimierten Rezeptoren bestimmt die Zellspezifität der unterschiedlichen neurotrophen Faktoren: So wirkt NGF neurotroph auf die peripheren sympathischen und auf eine Subpopulation von sensiblen Nervenzellen, zeigt jedoch keine Wirkung auf motorische Nerven­ zellen. Auf motorische Nervenzellen wirken jedoch BDNF, NT-3 und NT-4 (Griesbeck et al., J Neurosci Res 42: 21-33, 1995; Henderson et al., Nature 363: 266-270, 1993; Sendtner et al Nature 360: 757-758, 1992) wie auch CNTF (Sendtner et al., 1990), LIF, CT-1, IGF, Insulin, GDNF und Neurturin. Darü­ berhinaus induziert BDNF das Neuritenwachstum in cortikalen, pyramidalen Neuronen (McAllister et al., Neuron 17: 1057-1064, 1996; Neuron 18: 756-778, 1997) und in Purkinje Neuronen (Baptista et al., Neuron 12: 243-260, 1994).

Die Expression von Rezeptoren für neurotrophe Faktoren ist nicht auf Zellen des Nevensystems beschränkt. So können beispielsweise Osteoblasten trk-A und trk- B ausbilden und hierdurch durch autokrin und/oder parakrin gebildetes NGF und BDNF zur Proliferation stimuliert werden (Mogi et al., Life Sci 67(10): 1197- 1206, 2000). Phäochromozytomzellen (Zell-Linie PC12) reagieren auf NGF mit der Ausbildung von Neuriten-ähnlichen Fortsätzen, ein Phänomen, welches durch Zugabe von Inhibitoren der Zellproliferation, wie beispielsweise durch Rapamy­ cin, Ciclopirox oder Flavopiridol gesteigert werden kann (Parker et al Neu­ ropharmacology 39(10): 1913-1919, 2000). Weitere orthotope wie auch ektope Expressionen von Rezeptoren für neurotrophe Faktoren auf Zellen von unterschiedlichen Geweben wie auch auf Tumorzellen sind seit Längerem bekannt (Sedlacek Drug 59(3): 435-476, 2000).

Ein wesentliches Ergebnis der Aktivierung von neuronalen Zellen und Gliazellen durch neurotrophe Faktoren ist die verstärkte Expression von intrazellulären Pro­ teinen, welche die Zellen vor dem kontrollierten Zelltod schützen (Newmeyer und Green, Neuron 21: 653-655, 1998; Wiese et al., Nature Neurosci. 2: 978-893, 1999). Zu diesen Proteinen zählen die Inhibitoren der IAP/ITA Familie, insbeson­ dere IAP-1, IAP-2, x-IAP und Survivin. Proteine der IAP/ITA Familie hemmen die Aktivierung von Procaspase-9 (Deveraux et al., EMBO J. 17: 2215-2223, 1998), die ihrerseits aktiviert wird durch Cytochrome-C und Apaf 1. Des weiteren hemmen Proteine der IAP/ITA Familie die Funktion der aktivierten Caspasen-3, - 6 und -7 und können auch hierdurch die durch diese Enzyme bewirkte Apoptose inhibieren (Devereaux et al., Nature 388: 300-304, 1997; Roy et al., EMBO J. 16: 6914-6925, 1997). Transfektion von IAP-Expressionsplasmide in isolierte senso­ rische oder sympathische Nervenzellen kann den Zelltod, der durch Entzug von NGF ausgelöst wird, verhindern. Allerdings ist der Effekt von IAPs auf das Neu­ ritenwachstum wesentlich geringer als der von NGF und anderen neurotrophen Faktoren (Wiese et al., Nature Neurosci 2: 978-893,1999). Mitglieder der IAP- Familie können somit eine Überlebenswirkung vermitteln, sind aber nur in gerin­ gem Maße an dem Auswachsen und der Aufrechterhaltung von Nervenfortsätzen beteiligt. Dies weist darauf hin, daß NGF und andere neurotrophe Faktoren Sig­ nalwege anschalten, die verschieden sind zu denjenigen der IAP-Familie.

Akt, ein Protein des PI-3K-AKT-Signalübertragungsweges, hat drei zelluläre I­ somere, von denen Akt-3 besonders in Neuronen exprimiert ist (Datta et al., Ge­ nes Dev. 13: 2905-2927, 1999). Für den Raf-Signalübertragungsweg in Säuger­ zellen spielen drei unterschiedliche Raf-Proteine eine besondere Rolle: C-Raf (auch Raf-1 genannt), A-Raf und B-Raf. Von B-Raf existieren mehrere durch un­ terschiedliches Splicen entstandenen Formen. In Zellen des zentralen Nervensystems ist vorwiegend B-Raf und C-Raf vorhanden und aktiv, weniger das A-Raf (Morice et al., Eur. J. Neurosci. 11: 1995-2006, 1999, Dugan et al., J Biol Chem 274: 25842-25848, 1999).

B-Rafund C-Raf sind nicht nur in Neuronen, sondern auch in Gliazellen nachzu­ weisen (Mikaly et al., Brain Res. 27: 225-238, 1993; Mikaly und Rapp, Acta Histochem. 96: 155-164, 1994).

Obwohl relativ gut geklärt ist, wie Neurotrophine und/oder eine Membrandepola­ risation Signaltransduktionswege aktivieren, die das Überleben von Nervenzellen sichern, ist weitgehend fraglich, welche Mechanismen bei neurodegenerativen Erkrankungen zur Dysfunktion und zum Sterben von Nervenzellen führen. Expe­ rimentelle Untersuchungen (Übersicht bei Yuan und Yankner, Nature 407: 802- 809, 2000) geben Anhaltspunkte, daß das Sterben von Nervenzellen beispielswei­ se ausgelöst werden kann durch

• - die relative Aktivierung von proapoptotischen Faktoren innerhalb der Nerven­ zelle, beispielsweise durch mangelnde Phosphorylierung und Inaktivierung von proapoptotischen Proteinen (Bad, besonders jedoch von Bax) im Rahmen der AKT- und/oder Raf-Signaltransduktionswege,
• - die mangelnde Aktivierung (beispielsweise im Rahmen des Raf- Signaltransduktionsweges) von Transkriptionsfaktoren, welche die Transkrip­ tion von Genen aktivieren, welche antiapoptotische Proteine (z. B. Bcl-2, be­ sonders jedoch Bcl-XL) exprimieren,
• - die Schädigung von Mitochondrien mit der Freisetzung von Cytochrome C und der Aktivierung von proapoptotischen Enzymen (Caspasen) beispielswei­ se durch abnormale Proteinstrukturen oder Aggregate,
• - durch Aktivierung von proapoptotischen Signalkaskaden (im Besonderen ASK und damit p38 und JNK) durch Neurotrophine beispielsweise über den Neurotrophin-Rezeptor p75 NTR,
• - durch oxidative Schädigungen, NO-Überproduktion oder durch enzymatische Fehlfunktionen, z. B. durch Mutationen der Superoxiddismutase (SOD),
• - durch Synthese proapoptotischer Stoffwechselprodukte, wie advanced glyco­ silation endproducts (AGEPs)
• - durch Hochregulierung und Aktivierung von cyclinabhängigen Kinasen (Gio­ vanni et al., J Biol Chemistry 274/27: 19011-19016, 1999), Park et al. Neuro­ biol.Aging 21: 771-781, 2000), welche in entscheidendem Maße an der Regu­ lierung der Zellteilung beteiligt sind und/oder
• - durch pathologische Proteinspaltung an physiologischen Membranen, die z. B. zur Produktion von β-Amyloid führen, sowie durch spezifische pathophysio­ logische Prozesse, welche die Änderung der Faltung und Struktur von Memb­ ranproteinen von einer alpha- zu einer beta-Struktur bewirken, wie dieses z. B. bei Prionenerkrankungen zu beobachten ist.

In Anbetracht dieser vielfältigen Möglichkeiten für das Sterben von Nervenzellen ist es bislang äußerst schwierig gewesen, Verfahren zu entwickeln, um das Ster­ ben von Nervenzellen zu verhüten oder zu behandeln. So ist es bislang nicht möglich gewesen, den Einfluß von neurotrophen Wachstumsfaktoren auf Nerven­ zellen derart zu steuern, das ausschließlich antiapoptotische und nicht auch proa­ poptotische Signaltransduktionswege aktiviert werden. Beispielsweise kann BDNF die durch Stichstoffmonoxyd bewirkte Nervenzellschädigung drastisch verstärken (Ishikawa et al., J Neurochem 75(2): 494-502, 2000). In klinischen Untersuchungen an Patienten mit amyotropher Lateralsklerose ergab die subkuta­ ne Verabreichung von rekombinant hergestelltem menschlichem CNTF keine eindeutige therapeutische Wirksamkeit, jedoch derartig starke Nebenwirkungen, daß die Dosis nicht erhöht werden konnte (CNTF Treatment Study Group, Neu­ rology 46(5): 1244-1249, 1996) und die Studie beendet werden mußte.

In einem weiteren Forschungsansatz wurde versucht, mit Hilfe von Immunophi­ lin-bindenden Substanzen (wie beispielsweise Rapamycin, FK506, GPI-1046, Cyclosporin A und Analoge dieser Substanzen) Schädigungen von Nervenzellen zu verhindern oder zu mindern. Die Ergebnisse in Zellkulturexperimenten mit Phaeochromocytomzellen (PC12), neuronalen Zellen und am Tier waren jedoch widersprüchlich (Parker et al., Neuropharmacology 39 (10): 1913-1919, 2000; Costantini and Isacson, Exp.Neurol. 164(1): 60-70, 2000; Madsen et al., Exp.Neurol. 154(2): 673-683, 1998; Gold Drug Metab Rev 31(3): 649-663, 1999; Gold et al., Exp Neurol 147(2): 269-278, 1997; Steiner et al., PNAS USA, 94(5): 2019-2024, 1997). Diejenigen Untersuchergruppen, welche Wirksamkeit in ihren Modellen finden konnten, führten diese Wirksamkeit zurück auf eine Inhibition der Zellteilung (Parker et al., Neuropharmacology 39(10): 1913-1919, 2000), eine Beeinträchtigung des Corticoidrezeptors und von Hsp-90 (Gold et al., Drug Metab Rev 31(3): 649-663, 1999), eine Inhibition des Calcineurins (Marioka et al., Prog Neurobiol 58(1): 1-30, 1999, eine verstärkte Expression des neuronalen, "growth associated" Faktors (GAP 43, Madsen Exp.Neurol 154(2): 673-683, 1998), eine Inhibition von Proteinphosphatasen und/oder eine Stimulation der Proteinkinase C (Audesirk et al., Brain Res Dev Brain Res 102(2): 247-260, 1997.

Für einige Substanzen konnten in Tiermodellen Anhaltspunkte für eine therapeu­ tische Wirkung gefunden werden (Parker et al., Neuropharmacology 39(10): 1913-1919, 2000, Madsen et al., Exp Neurol 154(2): 673-683, 1998, Gold et al., Exp Neurol 147(2): 269-278,1997, Steiner et al PNAS USA 94(5): 2019-2024, 1997). Im Gegensatz hierzu sind bislang nach klinischer Verabreichung von Im­ munphilin-bindenden Arzeimittel, wie beispielsweise Cyclosporin A, Rapamycin oder FK506 zur Immunsuppression keine neuroprotektiven Wirkungen an den behandelten Patienten zu beobachten gewesen.

Es konnte desweiteren gezeigt werden, daß Inhibitoren der Zellproliferation, wie beispielsweise solche, welche cyclinabhängige Kinasen hemmen (wie beispiels­ weise Flavopiridol, Roscovitin oder Olomoucin (Park et al., J Biol Chemistry 271: 21898-21905, 1996; Maas et al., J Neurochem 70(4): 1401-1410, 1998) oder auch andersartige Inhibitoren der Zellproliferation (wie beispielsweise Chloro­ phenylthio-cAMP, N-acetylcystein, Deferoxamin, Ciclopirox oder Mimosin, Park et al., 17: 1256-1270, 1997), oder ausgewählte Immunphilin-bindende Substanzen (wie beispielsweise Rapamycin, Parker et aL, Neuropharmacology 39(10): 1913- 1919, 2000), in der Lage sind, Phäochromozytomzellen (PC12) oder Nervenzellen in der Zellkultur vor dem Einfluß von zellschädigenden Substanzen zu schützen.

Inhibitoren von apoptotischen Proteinen, im speziellen von Caspasen (Park et al., J. Neurosccience 18: 830-840, 1998) können zwar die schnelle Apoptose von ge­ schädigten Nervenzellen verhindern, jedoch nicht den verzögert auftretenden Zelltod.

Substanzen, welche in diesen Experimenten benutzt wurden, um Nervenzellen zu schädigen und zu deren Apoptose führen, sind beispielsweise die Zytostatika Camptothecin, Cytosin-Arabinosid, Etoposid, Teniposid oder Mitoxanthron (Park et al., J Neuroscience 17: 1256-1270, 1997), oder das proapoptotische B-Amyloid Protein (Giovanni et al., J Biol Chemistry 274/27: 19011-19016, 1999, Park et al., Neurobiol Aging 21, 771-781, 2000). Anhaltspunkte liegen vor, daß die a­ poptotische Wirkung dieser Substanzen im wesentlichen darauf beruht, daß sie in Nervenzellen zu einer verstärkten Expression von cyclinabhängigen Kinasen (CDKs) und proapoptotischen Signalproteinen wie p38 und JNK führen (Court­ ney und Coffey, Eur J Neurosci 11(3): 1073-1084, 1999).

Als Mechanismus für die Nervenzell-schützende Wirkung von Inhibitoren der Zellproliferation wurde postuliert, daß sie die verstärkte Aktivität von CDKs und/oder von proapoptotisch wirkenden signaltransduzierenden Kinasen (verur­ sacht beispielsweise durch nervenzellschädigende Substanzen) über wahrschein­ lich unterschiedliche Wege reduzieren können. Beispielsweise wird angenommen, daß die Nervenzell-schützende Wirkung von Inhibitoren der Zellproliferation wie Flavopiridol auf eine direkte Hemmung der CDKs (insbesonders von cdk4 und cdk6) beruht. Diese Hemmung bewirkt in Konsequenz eine Inhibition der Phosphorylierung von pRB und P107 und damit ein Hemmung der transskriptio­ nellen Aktivität von E2F/Dp (Sedlacek, Critic. Rev. Onc./Heam, 37(2001).

Dagegen spricht, daß für Butyrolactone-1 (ein relativ hoch spezifischer CDK- Inhibitor) keine schützende Wirkung auf Nervenzellen nachgewiesen werden konnte (Maas et al., J Neurochem 70(4): 1401-1410, 1998) und Staurosporine (ein breit wirkender Kinaseinhibitor) in Nervenzellen Apoptose induziert (Thomas und Mayle Brain Res 884(1-2): 163-173, 2000).

Andererseits scheint Cycloheximid durch Hemmung der Proteinsynthese die A­ poptose von Nervenzellen nach Behandlung mit Ara-C (und die hierdurch ver­ stärkte Expression von proapoptotischen Proteinen wie p38 und JNK) zu reduzie­ ren.

Die klinische Anwendung der bislang bekannten antiproliferativen und Nerven­ zellkulturen unter den jeweiligen experimentellen Bedingungen schützenden Sub­ stanzen wird in erheblichem Maße eingeschränkt durch ihre Toxizität wie auch durch das Risiko, daß diese Substanzen auch in Anwesenheit von neurotrophen Substanzen Nervenzellen schädigen können.

So wurden einige Inhibitoren der Cyclinabhängigen Kinasen wegen ihrer an­ tiproliferativen Wirksamkeit bereits an Tumorpatienten geprüft. In diesen Studien ergab sich als Dosis-begrenzende Toxizität beispielsweise für Flavopiridol starke wässerige Duchfälle, und nach deren erfolgreichen pharmakologischen Behand­ lung, starke Blutdrucksenkungen (Senderowicz et al., J Clin Oncol 16: 2986-2999, 1998).

Eine Behandlung mit Kinase-Inhibitoren birgt zudem das Risiko in sich, daß in Nervenzellen nicht nur proaptotisch wirkende Kinasen (wie beispielsweise die an der Zellteilung beteiligten cyclinabhängige Kinasen [CDK]) inhibiert werden, sondern auch antiapoptotisch wirkende Kinasen, beispielsweise signaltransduzie­ rende Kinasen wie B-Raf (Wiese et al., Nature Neurobiol 4: 137-142, 2001) oder aber solche wie beispielsweise PKC, deren Hemmung zu einer Verminderung der Funktion und des Axonwachstums von Nervenzellen führen (Audesirk et al., Brain Res Dev Brain Res 102(2): 247-260, 1997). Die Hemmung derartiger, das Überleben und die Funktion von Nervenzellen unterstützender Kinasen durch Ki­ nase-Inhibitoren, sollte die Schädigung von Nervenzellen eher verstärken. So ist von Staurosporin (einem Inhibitor von einer Reihe von Kinasen einschließlich von CDKs) bekannt, daß er die Apoptose von Nervenzellen verstärkt (Thomas und Mayle Brain Res 884(1-2): 163-173, 2000; Lankiewicz et al., J Biol Chem 275(22): 17064-17071, 2000; Choi et al., J Neurochem 74(4): 1621-1626, 2000). Wortmannin, ein Kinase-Inhibitor mit besonderer Aktivität auf die Phosphatidyli­ nositol 3-Kinase, hemmt die antiapoptotische Aktivität von IGF-1 (Yamaguchi et al., J Biol Chem Oct 27, 2000). Flavopiridol hemmt nicht nur die CDKs, sondern auch rezeptorassoziierte Kinasen wie PKC sehr effektiv (Sedlacek et al., Int J Oncol 9: 1143-1168, 1996; Sedlacek, Crit Rev Oncol Hematol 2000). Durch die Hemmung solcher antiapoptotischer Kinasen könnte die Verabreichung von Fla­ vopiridol das Risiko einer Nervenzellschädigung in sich bergen. In diesem Zu­ sammenhang ist zu berücksichtigen, daß eine isolierte Hemmung der PKC das Neuritenwachstum hemmen kann und es so möglicherweise auch zu trophischen Störungen in den Nervenzellfortsätzen kommt, welche die neurodegenerativen Veränderungen verstärken.

Für den therapeutischen Effekt von Kinase-Inhibitoren wie auch für jede andere, möglicherweise Nervenzellen schützende Substanz, ist demzufolge bedeutsam, in welchem Ausmaß sie in klinisch relevanten Zielzellen Neuritenwachstum­ fördende und/oder -hemmende Mechanismen beeinflussen kann, ob sie bei­ spielsweise in der Lage ist, das Axonwachstum von Motoneuronen, sensorischen Neuronen, dopaminergen Neuronen, Purkinjezellen, cholinergen Projektionsneu­ ronen und retinalen Ganglionzellen zu fördern oder zu hemmen.

Eine Kombination von Flavopiridol mit geringen Konzentrationen von NGF führt an Phäochromozytomzellen (wie den PC 12-Zellen) zu einem Auswachsen von Neuriten ähnlichen Fortsätzen (Parker et al., Neuropharmacoly 39(10): 1913- 1919, 2000). Dieser Effekt war jedoch nicht spezifisch für Flavopiridol als Kina­ se-Inhibitor, er konnte auch bei Verwendung anderer Inhibitoren der Zellprolife­ ration, wie beispielsweise Rapamycin oder Ciclopirox gesehen werden, nicht je­ doch bei solchen Immunophilin-bindenden Substanzen wie FK506 oder GPI- 1046, welche keine Inhibitoren der Zellproliferation darstellen. Desweiteren war dieser Effekt auf Nervenzellen nicht übertragbar. So zeigten FK506 (wie auch Rapamycin) eine neuroprotektive Wirksamkeit bei der cerebralen Ischämie in der Ratte, nicht dagegen GPI-1046.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Behandlung von Nervenzellen oder von Gliazellen mit einer Kombination von Kinase-Inhibitoren, die keine oder nur eine geringe Hemmung der B-Raf-Kinase bewirken (Kinase-Inhibitor (A)) mit Substanzen, welche selbst eine neurotrophische Wirkung aufweisen (neurotropher Faktor (B)) und/oder mit Substanzen, welche die Bildung und/oder Freisetzung von neurotrophen Faktoren (B) verstärken und/oder bewirken (Substanz C), die Überlebensrate von Nervenzellen und zwar von sensorischen und wie auch von motorischen Neuronen deutlich erhöht, deren Widerstandsfähigkeit gegen nerven­ zellschädigende Substanzen vermehrt, das spezifische Axonwachstum dieser Ner­ venzellen erhöht, die Funktion der Nervenzellen verbessert und/oder die Todes­ rate von Nervenzellen nach Einwirkung nervenzellschädigender Substanzen ver­ mindert.

Die Schutzwirkung dieser Kombination von Kinase-Inhibitor (A) und/oder neu­ rotrophem Faktor (B) und/oder Substanz (C) auf Nervenzellen ist deutlich stärker als die Wirksamkeit der Einzelsubstanzen. Insbesondere in Gegenwart eines en­ zymatisch funktionsfähigen B-Rafs und vor allem bei einer zusätzlich erhöhten Expression Mitgliedern der IAP Genfamilie. Eine Erhöhung der Expression er­ folgt über PI-3K, AKT und NFkB vermittelte Signalwege. So hat die Kombinati­ on von Kinase-Inhibitor (A) und neurotrophem Faktor (B) geringe oder keine Wirkung auf Nervenzellen, welche nicht B-Raf, aber C-Raf exprimieren.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Erzeugnis, enthaltend mindestens einen Kinase-Inhibitor (A), der nur eine geringe oder keine hemmende Aktivität auf Raf aufweist und

• a) mindestens einen neurotrophen Faktor (B) und/oder
• b) mindestens eine Substanz (C), welche in der Lage ist, die zelluläre Bildung und/oder die Freisetzung eines oder mehrerer neurotropher Faktoren (B) zu verstärken und/oder zu bewirken

als Kombinationspräparat in Form eines Gemisches oder als einzelne Kompo­ nenten zur gleichzeitigen oder zeitlich unterschiedlichen Anwendung an unter­ schiedlichen oder gleichen Orten in der Prophylaxe und/oder Therapie von Ner­ venzell- und/oder Gliazellschäden.

Grundsätzlich ist es für die erfindungsgemäße Wirkung des Erzeugnisses uner­ heblich, ob das Erzeugnis mit den Nerven- und/oder Gliazellen am gleichen oder an unterschiedlichen Orten, als einzelne Komponenten oder als Gemisch, gleich­ zeitig oder zu unterschiedlichen Zeiten, vorzugsweise innerhalb von 6 Stunden, besonders bevorzugt innerhalb von 12 Stunden, insbesondere innerhalb von 24 Stunden, vor allem innerhalb von 48 Stunden, beispielsweise gleichzeitig mit ei­ ner Mischung aus Kinase-Inhibitor (A) mit neurotrophem Faktor (B) und/oder Substanz (C), oder zuerst mit Kinase-Inhibitor (A) und nachfolgend mit neu­ rotrophem Faktor (B) und/oder Substanz (C) oder zuerst mit neurotrophem Faktor (B) und/oder Substanz (C) und nachfolgend mit Kinase-Inhibitor (A) in Kontakt gebracht wird.

Vorzugsweise wird die Vorbehandlung mit Kinase-Inhibitor (A) oder die gleich­ zeitige Behandlung mit Kinase-Inhibitor (A) und/oder neurotrophem Faktor (B) und/oder Substanz (C) durchgeführt.

Bevorzugt für die Wirkung und die Wahl der Verabreichung ist, daß die erste Substanz in der zu behandelnden Nervenzelle noch wirksam ist, wenn die zweite Substanz verabreicht wird. Dies ist in der Regel gegeben, wenn der Abstand zwi­ schen der Verabreichung der ersten Substanz und der zweiten Substanz vorzugs­ weise bis zu 6 Stunden, besonders bevorzugt bis zu 12 Stunden, insbesondere bis zu 24 Stunden, vor allem bis zu 48 Stunden beträgt.

Das Inkontaktbringen kann durch Zugabe der Substanzen beispielsweise in das Nährmedium einer Nervenzell- oder Gliazellkultur erfolgen, oder durch lokale oder systemische Verabreichung der Substanzen in einen Organismus.

Eine lokale Verabreichung im Sinne dieser Erfindung kann beispielsweise in eine Wundhöhle, auf die Haut, in eine Körperöffnung, in eine Körperhöhle, wie bei­ spielsweise in die Brust- oder Bauchhöhle, oder in ein Organ, insbesondere in das Gehirn, in den Rückenmarkskanal, in ein Gelenk, in das Binde- oder Muskelge­ webe erfolgen. Eine systemische Verabreichung kann oral, rektal oder in den Kreislauf, beispielsweise intravenös oder intraarteriell, erfolgen.

Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens lässt sich an Hand der Funktion von Nervenzellen nachweisen.

Unter Funktion von Nervenzellen wird beispielsweise die Reizleitung sowie alle daran beteiligten biochemischen und/oder elektrochemischen Prozesse verstan­ den. Desweiteren umfasst die Funktion von Nervenzellen das morphologisch er­ fassbare Wachstum von Neuriten bzw. Axonen und von Dendriten. Insbesondere umfasst der Begriff Funktion von Nervenzellen das Überleben von Nervenzellen.

Das Absterben von Nervenzellen kann beispielsweise durch in vitro- Testverfahren, mit denen Apoptose nachgewiesen werden kann, beobachtet wer­ den. Solche Testverfahren sind beispielsweise "Tunnel-Assay" (Gavrielli et al., J. Cell Biol., 119: 493-501, 1992; Gold et al., Lab.Invest. 71: 219-225, 1994), Chromatinfragmentierung (Götz et al., Hum. Mol. Genet. 9: 2479-2489, 2000), Zählung von überlebenden und absterbenden Nervenzellen (Arakawa et al., J. Neurosci. 10, 3507-3515, 1990), die Verwendung von Testsubstanzen zur Quanti­ fizierung des Zelltods in Zellkultur (Uliasz und Hewett, J. Neurosci. Methods 100, 157-163, 2000), Quantifizierung der Expression von Zelltod-assoziierten Genen in Nervenzellen wie Cyclinen (Timsit et al., Eur. J. Neurosci. 11, 263-278, 1999) und Bestimmung des neuronalen Zelltods nach Zugabe von Aß (Iwasaki et al., Mol. Psych. 1, 65-71, 1996) oder nach Induktion von oxidativem Stress (Manev et al., Exp. Neurol. 133, 198-206, 1995).

Zellen des Nervensystems im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Gliazellen oder neuronale Zellen, beispielsweise sensorische und sympathische neuronale Zellen, motorische neuronale Zellen, cholinerge Neurone des basalen Vorderhirns, dopaminerge Nervenzellen des Mittelhirns (Substantia nigra), Körnerzellen und Purkinje-Zellen des Kleinhirns und des Hippocampus, retinale Ganglienzellen und Photorezeptoren sowie neuronale Stammzellen.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Kinase-Inhibitoren (A) mit gerin­ ger oder keiner hemmenden Aktivität auf B-Raf Kinase-inhibierende Derivate des 4H-1-Benzopyran. Beispiele für derartige Derivate sind in den Patentschriften EP 0137193 und EP 366061 ausführlich dargestellt und die Struktur- Wirkungsbeziehung für diese Derivate wurde von Sedlacek et al., Int J Oncol 9: 1143-1168, 1996) im Detail beschrieben. Die in diesen Patentschriften beispiel­ haft dargestellten Derivate des Flavopiridols und das Flavopiridol selber (Sedla­ cek et al., Int J Oncol 9: 1143-1168, 1996) sind ausdrücklich Gegenstand dieser Erfindung.

In einer weiteren Ausführungsform sind die Kinase-Inhibitoren (A) Flavopiridol­ derivate, dargestellt von Kim et al., J Med Chem 43(22): 4126-4134, 2000, insbe­ sondere Thio-Flavopiridol und Oxy-Flavopiridol. Desweiteren sind Beispiele für Kinase-Inhibitoren (A) das von Ebendal (WO 00/50030) dargestellte 2-(2-Amino- 3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H-(1)benzopyran.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Kinase-Inhibitoren (A)

• - 7,12-Dihydro-indolo (3,2-d)(1) Benzazepin-6(5H)-one (NSC 664704 Saus­ ville et al., Pharmacol.Ther. 82(2-3): 285-292, 1999),
• - Kinase-Inhibitoren, wie beispielsweise 7OH-Staurosporine und ihre Kinase­ inhibierenden Derivate, Butyrolactone, Roscovitine, Purvalanol A, Emodin, Anilinoquin-azoline (PD-168393 und PD 169414) und Phenylaminopyrimidine (STI 571, CGP 78850, CP 358774, CP59326 und CGP 60474), Trioylimidazole (1-779450), wie insgesamt von Meijer et al., Parmacol. Ther. 82(2-3): 297-284, 1999 und von Sedlacek et al., int J Oncol 9: 1143-1168, 1996 bzw. von Sedlacek, Drug 59(3): 435-476, 2000) dargestellt,
• - Paullone (Zaharevitz et al., Cancer Res. 59, 2566-2569, 1999),
• - SB203580 [4-(4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl)1H- imidazol, (Ishikawa et al., J Neurochem 75(2): 494-502, 2000, Harada und Sugimoto, Jpn J Pharmacol 79(3) 369-378, 1999)],
• - 1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(2aminophenylthio) butadien [U0126, (Favata et al., J BIOL Chem 273(29): 18623-18632, 1998; DeSilva et al., J Immunol 160: 4175-4181, 1998)],
• - 2-2'-amino-3'-methoxyphenyl(-oxanaphtalen-4-on) [PD098059, (Dudley et al., PNAS USA 92: 7686-7686, 1995)],
• - 2-(2-chlor-4-jod-phenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluor-benzamid [PD184352, (Sebolt-Leopold et al., Nature Med 5: 810-816, 1999)],
• - bis-ethylthiomethyl, [CEP-1347 (KT7515) (Maroney et al., J Neurochem 73(5): 1901-1912, 1999)], Analog von Indobarbazol [(K252a) (Saporito et al., J Pharmacol Exr Ther 288: 421-427, 1999)]
• - Tetrapyrrolische Makrocyclen, wie beispielsweise 5,10,15,20- Tetraarylporphyrin und 5,10,15-Triarylcorrol (Aviezer et al., WO 00/27379) und/oder
• - Pyrimidonderivate, welche die tau-Proteinkinase inhibieren und von Ando et al., WO 00/18758 ausführlich dargestellt wurden.

Vorzugsweise wird zum Schutze und/oder zur Therapie von Nervenzellschädi­ gungen der Kinase-Inhibitor (A) in einmaliger Dosis, besonders bevorzugt in mehrmaliger Dosis verabreicht, welche geringer sind als die maximal tolerable Dosis (MTD) der jeweiligen Substanz für den Menschen. Vorzugsweise wird eine Dosis gewählt, welche die Hälfte der MTD beträgt. Beispielsweise liegt für die Infusion von Flavopiridol die MTD am Tumorpatienten bei 50 mg/m²/dx³ (Sen­ derowicz et al., J Clin Oncol 16(9): 2986-2999, 1998). Für die Anwendung am Menschen ist Flavopiridol somit vorzugsweise in einer Dosis von 0,1-50 mg/m², besonders bevorzugt von 5-30 mg/m², insbesondere von 25 mg/m² täglich zu vera­ breichen. Die Tagesdosis kann einmalig am Tag oder in mehrere Teilportionen aufgeteilt über den Tag hinweg in etwa gleichen Zeitabständen verabreicht wer­ den.

Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung des Kinase-Inhibitors (A) entweder lokal oder systemisch, beispielsweise nur an einem Tag oder über mehrere Tage täglich oder an jedem zweiten oder dritten Tag über mehrere Wochen, bis die therapeuti­ sche Wirkung sichtbar wird. Bevorzugt wird eine Behandlung von zwei bis 25 Wochen Dauer in Kombination mit dem neurotrophem Faktor (B) und/oder mit Substanz (C) gewählt.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind neurotrophe Faktoren (B) beispiels­ weise

• - die Neurotrophine BDNF und Varianten von BDNF (Barde et al., US 5438121, Bailey et al., WO 91/03568), NT-3, NT-4/5, NT-6 oder Varianten der NT und NGF, wie beispielsweise das NNT-1 (Chang, US 5,741,772),
• - CNTF und Varianten des CNTF (DiMarco und Laufer WO 98/01149),
• - LIF, CT-1, IGF-1, Insulin, Midkine, HGF, GDNF, Artemin, Persephin, GDF- 15 oder Neurturin.

Diese neurotrophen Faktoren (B) werden entsprechend dem Stand der Technik bevorzugt mit Hilfe der rekombinanten DNS-Technologie hergestellt. Vorzugs­ weise werden die neurotrophen Faktoren (B) lokal oder systemisch verabreicht, in einer Dosis, welche unterhalb der MTD liegt, besonders bevorzugt etwa die Hälfte der MTD beträgt. Beispielsweise liegt für CNTF nach subkutaner Verabreichung jeden zweiten Tag über 9 Monate die MTD bei etwa 30 mg/kg Körpergewicht. Vorzugsweise wird beispielsweise CNTF oder CT-1 oder CLC/NNT-1 in einer Dosis von 0,1-30 mg/kg, besonders bevorzugt von 2-25 mg/kg, desweiteren be­ vorzugt von 5-20 mg/kg, insbesonere von 15 mg/kg verabreicht. Die Verabrei­ chung der Tagesdosis für den neurotrophen Faktor (B) erfolgt einmalig oder in Teilportionen in etwa gleichen Zeitabständen über den Tag hinweg. Der neu­ rotrophe Faktor (B) kann einmalig oder täglich oder jeden zweiten, dritten, vier­ ten, fünften, oder sechsten Tag oder einmal pro Woche verabreicht werden. Die Behandlungsdauer richtet sich ähnlich wie bei dem Kinase-Inhibitor (A) nach der klinischen Wirkung. Vorzugsweise wird eine Behandlungsdauer von 2 Wochen bis 25 Wochen in Kombination mit einem Kinase-Inhibitor (A) gewählt.

Vorzugsweise wird der neurotrophe Faktor (B), beispielsweise in Form eines re­ kombinant hergestellten Proteins, durch geeignete Medikamentenpumpsysteme in den Subarachnoidalraum (wie beschrieben von Dittrich et al., Exp Neurol 141: 225-239, 1996) in ein Organ oder Gewebe, wie beispielsweise in das Gehirn oder in die Muskulatur, oder systemisch, beispielsweise in das Blutgefäßsystem, verab­ reicht.

In einer weiteren Ausführungsform liegt der neurotrophe Faktor (B) nicht als Protein, sondern als Nukleotidsequenz vor, welche für den neurotrophen Faktor kodiert. Derartige Nukleotidsequenzen werden mit, dem Fachmann bekannten, Methoden entweder in Plasmide oder in virale Vektoren, beispielsweise adenovi­ rale Vektoren (z. B. beschrieben von Gravel et al., Nature Medicine 3: 765-770, 1997; Cayouette et al. J Neurosci 18: 9282-9293, 1998) oder retrovirale Vektoren oder Vektoren, welche von anderen Viren abstammen (beispielsweise AAV, oder HIV), beispielsweise Lentiviren, insbesondere von solchen Viren, welche einen Tropismus für Nervenzellen (z. B. HPV) oder Muskelzellen aufweisen, eingefügt.

Plasmide oder virale Vektoren werden mit geigneten Hilfsmitteln, beispielsweise Protease-Inhibitoren, Detergentien, Puffer, und/oder Transfektionsreagenzien, wie z. B. kationische Lipide oder kationische Polymere vermischt und dem Organis­ mus ergänzend zu den neurotrophen Proteinen oder anstelle von den neurotrophen Proteine verabreicht.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind Substanzen (C) alle Substanzen, die die intrazelluläre Bildung und/oder die Freisetzung von neurotrophen Faktoren stimulieren. Zu diesen Substanzen gehören beispielsweise

• - Cytokine und Interleukine (IL), insbesondere auch solche, welche Makropha­ gen, Lymphozyten, Nervenzellen und/oder Gliazellen stimulieren wie bei­ spielsweise IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, TNF-alpha, Interferon (IFN) -alpha, -beta, und -gamma, GM-CSF, M-CSF, (Hughes et al., Brain Res Mol Brain Res 53: 138-151, 1998; Laurenzi et al., Eur J Biochem 223: 733-744, 1994),
• - Melanocortin und Analoge hiervon, beispielsweise Org 2766 (Dyer et al., Peptides 16: 515-522, 1995),
• - Toluene (Gotohda et al., Horm Metab Res 32: 301-305, 2000),
• - D1/D2 Dopamin-Agonisten, beispielsweise Apomorphine (Ohta et al., BBRC 272: 18-22, 2000),
• - Beta-adrenerge Agonisten, beispielsweise Isoproteronol (Barouch et al., J Neuroimmunol 103: 112-121, 2000),
• - Neurotransmitter, beispielsweise Substanz P (Barouch et al., J Neuroimmunol 103: 112-121, 2000),
• - Catechol und Catechol-Derivate, beispielsweise 4-Methylcatechol (Nitta et al., J Pharmacol Exp Ther 291: 1276-1283, 1999),
• - Diterpenoide, beispielsweise Scabronin-A und Scabronin-B (Obara et al., Eur J Pharmacol 370: 79-84, 1999),
• - Forskolin und Forskolinderivate, beispielsweise NKH 477 (Morinobu et al., J Neurochem 72: 2198-2205, 1999),
• - Agonisten für cholinerge Rezeptoren, beispielsweise Nikotin, Carbachol und Pilocarpin (French et al., Brain Res Mol Brain Res 67: 124-136, 1999),
• - Dihydro-Kaffeesäureamid-Derivate, (Fukazawa et al., WO 92/02490),
• - Optische Isomere von 2-Methyl-spiro(1,3-oxathiolan-5,3)-quinuclidin, (Fisher et al., EP 303391),
• - Quinolin-Säure (Rocamora et al., Brain Res Mol Brain Res 26: 89-98, 1994),
• - Agonisten für den Glutamat-Receptor, beispielsweise Quisqualat, Kainat, Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionat (AMPA) oder N- methyl-D-aspartat (NMDA) (Bessho et al., Brain Res Mol Brain Res 18: 201- 208, 1993),
• - Agonisten für AMPA, beispielsweise beschrieben von Henrich-Noack et al., DE 195 13 630,
• - 2,6-diphenyl substituierte Pyridin-Derivate, beispielsweise beschrieben von Hanabusa et al., WO 94/27604,
• - Ribavirine und Ribavirin-Derivate, beispielsweise 1-(beta-D-ribofuranosyl)- 1H-1,2,4-triazol (Gage et al., WO 00/30656),
• - Retinoide, beispielsweise Retinsäure (Wion et al., BBRC 149: 510-514, 1987)
• - Biguanid-Derivate, beispielsweise Metformin,
• - Sulfonyl-Harnstoff-Derivate, beispielsweise Glibenclamid, Glimepirid, Glic­ lacid, Glibornurid, Gliquidon, Glisoxid Pioglitazon, Rosiglitazonmaelat und/oder Repaglinid
• - Tolbutamid und/oder
• - Aldose-Reduktase-Inhibitoren, beispielsweise beschrieben von Longo und Mizisin, WO 98/42324,

Substanz (C) wird vorzugsweise in einer Dosis verabreicht, welche unterhalb der Maximal tolerablen Dosis (MTD), beispielsweise für den Menschen liegt. Beson­ ders bevorzugt wird eine Dosis im Bereich von 5%-90% der MTD, desweiteren bevorzugt von 10%-60%, insbesondere von 50% der MTD gewählt.

Bevorzugt werden jeweils eine oder mehrere unterschiedliche Kinase- Inhibitor(en) (A) und neurotrophe(r) Faktor(en) (B) und/oder Substanz(en) (C) verabreicht.

Vorzugsweise wird das Erzeugnis, enthaltend den Kinase-Inhibitor (A) und den neurotrophen Faktor (B) und/oder die Substanz (C) bei Störungen der Funktion von Zellen des zentralen oder peripheren Nervensystems verabreicht, beispiels­ weise bei Cerebraler Ischemie (Schlaganfall), Amyeotropher Lateralsklerose (ALS), Alzheimer Erkrankung, Nervenläsionen, Multiple Sklerose, Morbus Par­ kinson, Diabetischer Neuropathie, Spinaler Muskelatrophie und/oder Prione­ nerkrankungen, wie z. B. Creutzfeld-Jakob Erkrankung.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfin­ dungsgemäßen Erzeugnisses, bei dem mindestens ein Kinase-Inhibitor (A) mit mindestens einem neurotropher Faktor (B) und/oder mindestens einer Substanz (C) in geeigneter Weise kombiniert wird.

Eine weitere Ausführungsform ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Er­ zeugnisses zur Prophylaxe und/oder Therapie von Nervenzell- und/oder Gliazell­ schäden.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Erzeugnisses, bei der mindestens ein Kinase-Inhibitor (A) mit mindestens einem neurotrophen Faktor (B) und/oder mindestens einer Substanz (C) mit Nervenzel­ len und/oder Gliazellen in Kontakt gebracht werden.

Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren mit dem ein erfindungsgemäßes Erzeugnis in vitro mit Nervenzellen und/oder Gliazellen in Kontakt gebracht wird.

Beispiel 1 Isolierung und Kultivierung von Neuronen

b-raf (+/-) heterozygote oder c-raf (+/-) heterozygote Elterntiere wurden rückge­ kreuzt (Wojnowski et al., Mech. Dev. 76: 141-149, 1998; Nature Genet. 16: 293- 297, 1997). Von Embryonen im Alter von 12,5 Tagen, die homozygot für b-raf (- /-) oder c-raf (-/-) waren, wurden spinale Motoneurone mit Hilfe der Panningtech­ nik (Metzger et al., J. Neurosci. 18: 1735-1742, 1998) unter Verwendung eines monoklonalen Ratte-anti p75-Antikörpers (Chemicon, Hofheim, Deutschland) isoliert. Hierzu wurden die ventrolateralen Teile des lumbalen Rückenmarks me­ chanisch zerkleinert, in Hepespuffer-Lösung (enthaltend 10 µM 2- Mercaptoethanol) übertragen und mit Trypsin (0,05%, 10 min) inkubiert. Die Ein­ zelzellsuspension im Überstand wurde in eine mit dem anti p75-Antikörper be­ schichteten Kulturschale überführt und bei Raumtemperatur für 30 min. inkubiert.

Nachfolgend wurden die einzelnen Kulturschalen gewaschen, anschließend die anhaftenden Zellen von der Kulturplatte durch 0,8% Kochsalzlösung enthaltend 35 mM KCl und 1 µM 2-Mercaptoethanol abgelöst.

Die so gewonnen Zellen wurden in einer Dichte von 2000 Zellen/cm² in Kultur­ platten (Greiner, Nürtingen, Deutschland), die mit Polyornithin und Laminin vor­ beschichtet waren, ausgesät. Die Zellen wurden bei 37°C in Neurobasalmedium (Life Technologies, ergänzt mit B27-Supplement, 10% Pferdeserum, 500 µM Glutamax und 50 µg/ml Apotransferrin) und in einer 5% CO₂ Atmosphäre gehal­ ten. 50% des Zellkulturmediums wurden am Tag 1 und nachfolgend jeden 2. Tag ersetzt.

Die Analyse der mRNA für IAP-1, IAP-2, x-IAP und t-IAP (survivin) wurde mit Hilfe der RT-PCR durchgeführt. RNA wurde mittels Trizol-Reagenz (Life- Technologies, Karlsruhe) isoliert und je 10 ng Total-RNA wurde für eine RT-PCR Reaktion eingesetzt. Die Primer-Sequenzen zur Amplifikation von IAP-1, IAP-2, x-IAP und t-IAP (survivin) waren wie folgt:
IAP-1f: 5'-TACTACATAGGACCTGGAGA-3',
IAP-1r: 5'-CCCACCATCACAGCAAAA-3', annealing 55°C;
IAP-2f: 5'-GGAGAAGAAAATGCTGACCC-3',
IAP-2r: 5'-GCTTGTAAGGGTATCTGTGT-3' annealing 55°C;
x-IAPf: 5'-TGCAAGAGCTGGATTTTATG-3',
x-IAPr: 5'-CCCGATCTGGCAGCTGTACC-3' annealing 55°C;
tIAP (survivin) f: 5'-CCA GAT CTG GCA GCT GTA CC-3',
tIAP (survivin) r: 5'-GCC AGC TGC TCA ATT GAC TG-3', annealing 64°C.

Als Kontrolle für die Integrität der RNA wurde ein Teil der β-Actin mRNA mit folgenden Primern amplifiziert: β-actinf: 5'-GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG- 3', β-actinr: 5'-CTCTTTAATGTCACGCACGATTTC-3', annealing 64°C. Die RT-PCR wurde entsprechend dem Protokoll des Herstellers mit Random- Hexamer Primern durchgeführt. Die PCR-Amplifikation wurde wie folgt durchge­ führt: 94°C, 30 sec, indizierte annealing Temperaturen, 1 min. 72°C, 1 min. IAP-1 und t-IAP (survivin) wurden für 33 and 35 Zyklen, IAP-2 und x-IAP für 28 und 30 Zyklen und β-actin für 26 und 28 Zyklen. Die RT-PCR an RNA von E12.5- Gehirnen von b-raf und c-raf +/- Verpaarungen ergab eine deutliche Verminderung um durchschnittlich 60% bzw. 55% für IAP-1 bei b-rafund c-raf -/- Emb­ ryonen im Vergleich zur Wildtyp Kontrolle, von 52% für IAP-2 bei b-raf -/- und 46% für x-IAP bei b-raf -/- Embryonen im Vergleich zur Wildtyp Kontrolle. Die Expressionsunterschiede von IAP-2 und x-IAP bei c-raf -/-, sowie t-IAP bei b-raf -/- und c-raf -/- waren statistisch nicht signifikant unterschiedlich im Vergleich zur Wildtyp Kontrolle.

Von Embryonen im Alter von 12,5 Tagen, die homozygot waren für b-raf (-/-) oder c-raf (-/-), wurden desweiteren sensorische Neurone isoliert. Hierzu wurden dorsale Wurzelganglien isoliert, in PBS und mit Trypsin (0,05% in Hepespuffer) für 30 min. inkubiert. Die Trypsinverdauung wurde durch Zugabe von L15- Medium enthaltend 10% Pferdeserum gestoppt und nachfolgend die Zellen in Kulturplatten für 3-4 Stunden ausplattiert. Zellen im Überstand wurden zentrifu­ giert (10 min. 400 g) und das Zellsediment genauso wie bereits für spinale Moto­ neurone beschrieben im Neurobasalmedium gehalten.

Beispiel 2 Isolierung und Kultivierung von neuronalen Stammzellen

Neurale Stammzellen wurden aus dem Gehirn von normalen, b-raf (-/-) oder c-raf (-/-) defizienten Mausembryonen isoliert. Der Bereich des Vorderhirns wurde unter einem Präparationsmikroskop entnommen, in weiter entwickelten Embryo­ nen auch der Bereich des Hippocampus und der periventrikulären Zone. Diese Gehirnareale wurden dann in 200 µl HBSS (Hanks balanced salt solution (HBSS, Life Technologies (Karlsruhe), transferiert, mit 0,1% Trypsin (Endkonzentration in HBSS) für 10 min bei 37°C, inkubiert, die Reaktion mit 0,1% Trypsin-Inhibitor (Trypsin-Inhibitor aus egg yolk sack (Sigma, Deisenhofen), Stammlösung: I % in HBSS/25 mM HEPES) Endkonzentration in HBSS abgestoppt. Dann wurden die Zellen 10x mit einer 200 µl Pipette trituriert und in Medium [(Neurobasal- Medium (Life Technologies), B27 Supplement (Life Technologies Stock 50x, EK 1x) Glutamax II (Life Technologies Stock 100x, EK 1x), basicFGF (20 ng/ml), EGF (20 ng/ml)1] in ein Volumen von 5 ml überführt. Die dissoziierten Zellen wurden in Sarstedt Schalen (50 ml) kultiviert (Brutschrank, 37°C, 5% CO₂ feuch­ tigkeitsgesättigte Atmosphäre), das Medium alle zwei Tage gewechselt. Die Zel­ len wuchsen als Embroid Bodies und attachieren nicht, daher wurden die Zellen zum Mediumwechsel in ein Falcon-Röhrchen überführt und 5 min bei 400 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Zellsediment trituriert und in frisches Medium aufgenommen. Spätestens nach 3 Passagen bildeten sich gro­ ße Embroid Bodies, die trypsiniert (s. o.) und in niedriger Zelldichte (max. 10000 Zellen/Platte) auf 10 cm Schalen (Sarstedt) plattiert werden konnten. Einzelzellen wurden dann gepickt und zunächst in 96er Platten, später in 24er und 12 weil Platten expandiert. Diese Einzelzellklone neuraler Stammzellen konnten dann auf ihre Differenzierungskapazität hin untersucht und anschließend in Testverfahren eingesetzt werden.

Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, wurden die Zellen auch als Linien etabliert und für spätere Experimente eingefroren und gelagert.

Das Einfrieren der neuralen Stammzellen erfolgte nach Standardprotokoll, d. h. nach der Zentrifugation wurden die Zellen in Medium mit 10% DMSO aufge­ nommen und mit 1°C/min zunächst auf -86 C abgekühlt (im MrFrosti) um dann im flüssigen N₂ bei -186°C gelagert zu werden.

Beispiel 3 Wirkung von neurotrophen Faktoren in Kombination mit einem Kinase-Inhibitor auf Neuronen

Hinzugegeben werden:

• - zu Motoneuronen als neurotrophische Faktoren GDNF, BDNF und CNTF (jeweils 0,1; 0,3; 0,5; oder 1 ng/ml) und
  zu sensorischen Neuronen NGF (0,1; 0,3; 0,5; Oder 1 ng/ml), entweder jeweils alleine oder in Kombination mit dem Kinase-Inhibitor Flavopiridol (Konzent­ ration von 0,1; 0,3; 0,5 µM; Struktur, Molekulargewicht von Flavopiridol sie­ he Sedlacek et al., Int J Oncol 9: 1143-1168, 1996; Sedlacek, Critic Rev Oncol Hematol 2000)
• - oder Flavopiridol in Kombination mit Pilocarpin (Konzentration von 0,01; 0,1 und 0,3 µM).

In einer weiteren Kontrollgruppe wird zu den neuronalen Zellen nur Flavopiridol jeweils in der angegebenen Konzentrationen hinzugegeben.

In Kontrollkulturen normaler embryonaler Neuronen überleben nach 3 Tagen oh­ ne Zugabe der jeweiligen neurotrophen Wachstumsfaktoren nur ca. 10-25% der Zellen, mit Zugabe der jeweiligen Wachstumsfaktoren konzentrationsabhängig jedoch etwa 30-70% der ursprünglich eingesäten neuronalen Zellen.

Zugabe von Flavopiridol bewirkt eine geringe Steigerung der Überlebensrate (konzentrationsabhängig überleben 20-40% der Zellen). Die stärkste Erhöhung der Überlebensrate kann bei der Kombination von Wachstumsfaktoren, Flavopiri­ dol und Pilocarpin oder bei der Kombination von Flavopiridol mit Pilocarpin ge­ sehen werden (konzentrationsabhängig überleben zwischen 40-90% der Zellen). Die Kombinationen von neurotrophen Wachstumsfaktor (neurotropher Faktor (B)), Flavopiridol (Kinase-Inhibitor (A)) und Pilocarpin (Substanz (C)) oder Fla­ vopiridol (Kinase-Inhibitor (A)) und Pilocarpin (Substanz (C)) hat ihren stärksten synergistischen Effekt bei geringen Konzentrationen der Wachstumsfaktoren oder bei geringen Konzentrationen von Flavopiridol (Kinase-Inhibitor (A)) und hohen Konzentrationen der jeweils anderen Substanz.

Während neuronale Zellkulturen von c-raf (-/-), c-raf (+/-) oder b-raf (+/-) defi­ zienten Embryonen diesbezüglich keinen Unterschied zu Kulturen von normalen Embryonen aufweisen, kann kein Effekt neurotropher Faktoren alleine auf das Überleben von Motoneuronen oder sensorischen Neuronen von b-raf (-/-) defi­ zienten Embryonen nachgewiesen werden. Bei b-raf (-/-) defizienten Neuronen liegt die Überlebensrate nach 3 Tagen Zellkultur mit oder ohne neurotropher Faktoren (B) bei Werten, die kleiner als 3% der eingesäten Neuronen sind. Die Kombination von neurotrophen Wachstumsfaktoren mit Flavopiridol führte hier­ bei nur zu einer geringen Erhöhung der Überlebensrate.

Mit diesem Versuch kann belegen, daß das erfindungsgemäße Erzeugnis mit Ver­ abreichung eines Kinase-Inhibitors (A), der Raf, im speziellen B-Raf nicht oder nur gering inhibiert, in Kombination mit einem neurotrophen Faktor (B) das Ü­ berleben von neuronalen Zellen fördert und sie vor schädigenden Einflüssen schützt.

Beispiel 4 Wirkung des Verfahrens an b-raf (-/-) Zellen, in welche b-raf transfiziert wurde

Als weiteren Beleg für die Abhängigkeit der Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Erzeugnisses von einem enzymatisch aktiven B-Raf Protein werden sensorische neuronale b-raf (-/-) Zellen mit einem Plasmid (pCDNA3), das den offenen Lese­ rahmen des B-Raf Gens enthält (Wojnowski et al. Mech. Dev. 91: 97-104 (2000) oder mit einem LacZ-Expressionsplasmid mit der von Wiese et al., (Nature Neu­ rosci. 2: 987-983, 1999) angegebenen Methode transfiziert und das Überleben der so transfizierten Neuronen in Abhängigkeit von der Zugabe des Kinase-Inhibitors (A) (Flavopiridol) und des neurotrophen Faktors (B) oder der Kombination von Kinase-Inhibitor (A) und neurotrophem Faktor (B) (in Konzentrationen wie oben angeführt) und der Kombination beider Substanzen mit Pilokarpin (Substanz (C)) in der Zellkultur ermittelt.

Während nicht-transfizierte und mit dem LacZ-Expressionsplasmid transfizierte b-raf (-/-) defiziente Neuronen in Zellkultur mit und ohne neurotrophen Faktor (B) bzw. mit und ohne Kinase-Inhibitor (A), Flavopiridol, oder der Kombination von Kinase-Inhibitor (A) und neurotrophem Faktor (B) in beträchtlichem Ausmaß sterben, erweisen sich b-raf (-/-) defiziente Neuronen, die mit einem das b-raf Gen enthaltene Plasmid transfiziert wurden, als überlebensfähig. Immunfluoreszen­ suntersuchungen an überlebenden b-raf (-/-) defizienten neuronalen Zellen, die mit einem das b-raf Gen enthaltenden Plasmid transfiziert worden waren, ergaben mit einem für das B-Raf Protein spezifischen Antikörper (Sithanandam et al., On­ cogene 5: 1775-1780, 1990), daß diese Zellen das B-Raf Protein enthielten. Die Behandlung dieser transfizierten Zellen mit der Kombination von Kinase-Inhibitor (A) und neurotrophem Faktor (B) führt zu einer gleich hohen Überlebensrate, wie die Behandlung von normalen neuronalen Zellen mit der gleichen Kombination von Kinase-Inhibitor (A) und neurotrophem Faktor (B) und/oder Substanz (C).

Diese Untersuchungen zeigen, daß die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Er­ zeugnisses abhängig ist von einem enzymatisch funktionsfähigem B-Rafund daß die Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Erzeugnis, enthaltend mindestens einen Kinase-Inhibitor (A), der nicht oder nur gering B-Raf inhibiert, und min­ destens einem neurotrophen Faktor (B) und/oder mindestens einer Substanz (C)), das Überleben von Nerven- und/oder Gliazellen fördert und sie demzufolge vor schädigenden Einflüssen schützt.

Claims (16)

1. Erzeugnis, enthaltend mindestens einen Kinase-Inhibitor (A), der nur eine geringe oder keine hemmende Aktivität auf Raf aufweist, und

• a) mindestens einen neurotrophen Faktor (B) und/oder
• b) mindestens eine Substanz (C), welche in der Lage ist, die zelluläre Bildung und/oder die Freisetzung eines oder mehrerer neurotropher Faktoren (B) zu verstärken und/oder zu bewirken

als Kombinationspräparat in Form eines Gemisches oder als einzelne Komponenten zur gleichzeitigen oder zeitlich unterschiedlichen Anwen­ dung an unterschiedlichen oder gleichen Orten in der Prophylaxe und/oder Therapie von Nervenzell- und/oder Gliazellschäden.

2. Erzeugnis nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Kinase-Inhibitor (A), ausgewählt aus einer Gruppe von Kinase- Inhibitoren, umfassend Derivate des 4H-1-Benzopyran-4, enthalten ist.

3. Erzeugnis nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Kinase- Inhibitor (A) ein 2-(2-Amino-3-methoxyphenyl)-4-oxo-4H-(1)benzopyran, Flavopiridol und/oder Derivate des Flavopiridols ist.

4. Erzeugnis nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Kina­ se-Inhibitor (A) ein Thio-Flavopiridol und/oder Oxy Flavopiridol ist.

5. Erzeugnis nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Kinase- Inhibitor (A) ein 7,12-Dihydroindolo(3,2-d)(1) Benzazepin-6(5H)-on, 7OH-Staurosporin und/oder ihre Kinaseinhibierenden Derivate, Butyro­ lacton, Roscovitin, Purvalanol A, Emodin, Anilinoquin-azolin, Phenyla­ mino-pyrimidin, Trioylimidazol, Paullon, tetrapyrrolische Macrocyclen, 4- (4-Fluorophenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-5-(4-pyridyl) 1H-imidazol, 1,4-Diamino-2,3-dicyano-1,4-bis(Zaminophenylthio) butadien, 2-2'- amino-3'-methoxyphenyl(-oxanaphtalen-4-on), 2-(2-chlor-4 jod­ phenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluor-benzamid, bis­ ethylthiomethyl (Analog von Indocarbazol) und/oder Pyrimidonderivat ist.

6. Erzeugnis nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Kinase- Inhibitor (A) ein 5,10,15,20-tetraarylporphyrin und/oder 5,10,15- triarylcorrol ist.

7. Erzeugnis nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der neurotrophe Faktor (B) ein neurotrophes Protein ist, insbesondere ein Neurotrophin und/oder eine Variante des neurotrophen Proteins ist.

8. Erzeugnis nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der neurotrophe Faktor (B) ein BDNF, NT-3, NT 4/5, NT-6 und/oder NGF, CNTF, LIF, CT-1, IGF, Insulin, Midkine, HGF, GDNF, GDF-15 und/oder Neurturin ist.

9. Erzeugnis nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der neurotrophe Faktor (B) eine Nukleotidsequenz darstellt, kodierend für ein neurotrophes Protein.

10. Erzeugnis nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotid­ sequenz in ein Plasmid oder in einen viralen Vektor integriert ist.

11. Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz (C) ein Cytokin, Interleukin und/oder Interferon, Toluen, D1/D2 Dopamin-Agonist, Beta-adrenergische Agonist, Neurotransmitter, Ribavirin und/oder Ribavirin-Derivat, Catechol und/oder Catechol- Derivat, Diterpenoid, Aldose-Reduktase-Inhibitor, Forskolin, Agonist des cholinergen Rezeptors, Melanocortin, Quinolinsäure, 2-Methyl-spiro(1,3- oxathiolan-5,3)-quinuclidin, Agonist für den Glutamatrezeptor, AMPA- Agonist, 2,6-Diphenyl substituierte Pyridin-Derivat, Dihydro-Kaffeesäure­ amid-Derivat, Biguanid-Derivat, Sulfonylharnstoffderivat, Tolbutamid und/oder Retinoid ist.

12. Erzeugnis nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz (C) ein IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, TNF-alpha, GM-CSF,M-CSF, IFN- alpha, IFN-beta; IFN-gamma, Apomorphin, Isoproterenol, Substanz P, 1- (beta-D-ribofuranosyl)-1H-1,2,4-Triazol, 4-Methylcatechol, Scabronine A und B, NKH 477, Nikotin, Carbachol und Pilocarpin, Org2766, optische I­ somere von 2-Methyl-spiro(1,3-oxathiolan-5,3)-quinuclidin, Quisqualat, Kainat, Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionat (AMPA) und Nmethyl-D-aspartat (NMDA), Metformin, Glibenclamid, Glimepirid, Gliclazid, Glibornid, Gliquidon, Glisoxepid, Pioglitazon, Rosiglitazonmaleat und/oder Retinsäure ist.

13. Verfahren zur Herstellung eines Erzeugnisses nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Kinase-Inhibitor (A) mit mindestens einem neurotrophen Faktor (B) und/oder mindestens einer Substanz (C) in geeigneter Weise kombiniert wird.

14. Verwendung eines Erzeugnisses nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Prophylaxe und/oder Therapie von Nervenzell- und/oder Gliazellschäden.

15. Verwendung eines Erzeugnisses nach einem der Ansprüche 1 bis 8, da­ durch gekennzeichnet, daß mindestens ein Kinase-Inhibitor (A) mit min­ destens einem neurotrophen Faktor (B) und/oder mindestens einer Sub­ stanz (C) mit Nervenzellen und/oder Gliazellen in Kontakt gebracht wer­ den.

16. Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß ein Erzeugnis nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in vitro mit Nervenzellen und/oder Gliazellen in Kon­ takt gebracht werden.