DK162604B - Fremgangsmaade til fremstilling af humant immuninterferon samt farmaceutiske praeparater indeholdende immuninterferon fremstillet ved fremgangsmaaden ifoelge opfindelsen og anvendelse af humant interferon fremstillet ved fremgangsmaaden ifoelge opfindelsen til fremstilling af et terapeutisk middel - Google Patents

Description

i

DK 162604 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af intakt rekombinant humant immuninterferon, der i det væsentlige er fri for proteolytiske fragmenter deraf, hvilken fremgangsmåde omfatter ekstraktion af det intakte rekombinante humane immuninterferon 5 fra transformerede mikroorganismer, der indeholder dette protein, ved hjalp af en proteaseinhibitor såsom guanidin-HCl, der inhiberer protease- eller enzymaktivitet, men ikke påvirker immuninterferonets biologiske aktivitet og rensning af det resulterende ekstraherede interferon under anvendelse af hidtil ukendte monoklonale antistoffer 10 for immuninterferon, samt farmaceutiske præparater, der indeholder humant immuninterferon fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Det humane immuninterferon har fortrinsvis aminosyresekvensen:

Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu 15 Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp

Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu

Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met

Gin Ser Gin Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser 20 Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe

Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu

Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val

Gin Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gin Val Met

Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg 25 Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala

Ser Gin.

Sekvensen kan eventuelt indeholde en yderligere methioninrest ved aminoterminalen.

I den hidtil kendte teknik er der beskrevet forskellige metoder til 30 udførelse af ekstraktion og rensning af den familie af antivirale proteiner, som er kendt som interferon. Til dato kendes tre hovedklasser af interferon: IFN-α (leukocyt), ΙΈΈ-β (fibroblast) og IFN-γ (immun). Selv om de forskellige interferonklasser kan være beslægtede, hvad angår antiviral aktivitet, antiproliferativ aktivitet eller

DK 162604 B

2 deres struktur, har det i den hidtil kendte teknik ikke været muligt at udvikle en ensartet fremgangsmåde til ekstraktion og rensning af alle disse klasser. Faktisk fungerer mange af de processer, som er nyttige til ekstraktion og rensning af leukocytinterferon fra en rå 5 blanding af andre proteiner og cellerester, ikke til ekstraktion og rensning af fibroblast eller immuninterferon ud fra den samme slags præparation.

Ekstraktions trinnet i de hidtil kendte rensningsprocesser har typisk indebåret enten mekanisk (dvs. sonifikering) eller kemisk lyse af 10 mikroorganismer, som har dannet, ofte ved hjælp af rekombinansteknik-ker, det ønskede "fremmede" protein. Imidlertid frigives der under denne mekaniske eller kemiske lysemetode også forskellige celleproteaser i blandingen. Disse proteaser er derefter fri til enzymatisk at indvirke på og nedbryde det fremmede protein i blandingen. Disse pro-15 teaser kan derfor hindre eller ihhibere rensningen til homogenitet af den fuldstændige eller modne og biologisk aktive form af det "fremmede" protein.

Et formål med den foreliggende opfindelse er derfor at tilvejebringe en metode, som overvinder begrænsningerne ved de hidtil kendte eks-20 traktions- og rensningsteknikker, hvorved fås den intakte sekvensform af immuninterferon, og hvorved fragmenter fra proteolytisk nedbrydning elimineres fra det oprensede immuninterferonpræparat, og en homogen og intakt form af immuninterferon opnås.

Den kendte teknik fremgår af følgende patentskrifter: 25 DK patentansøgning nr. 5699/82 angår rekombinante peptider, som med hensyn til aminosyresekvens svarer til humant immuninterferon, men som er klart forskellige fra humant immuninterferon med hensyn til fysiologisk aktivitet, se fx side 4, linie 14-18. Et oprenset produkt opnås ikke.

30 EP offentliggørelsesskrift nr. 77.670 angår et polypeptid, der omfatter modent humant immuninterferons aminosyresekvens. Patentskriftet omtaler ikke nogen proteolytiske fragmenter af humant immuninterferon eller anvendelsen af en proteaseirihibitor ved isoleringen af

DK 162604 B

3 humant immuninterferon fra transformanterne. Da der ikke anvendes en sådan inhibitor ved fremgangsmåden ifølge dette patentskrift, vil der optræde proteolyse, og som følge heraf vil proteolytiske fragmenter af humant immuninterferon uundgåeligt være tilstede i de præparater, 5 der opnås ved fremgangsmåden ifølge dette patentskrift.

EP offentliggørelsesskrift nr. 88.540 beskriver kloning og ekspression af humane interferon-lignende peptider, men beskriver ikke en fremgangsmåde til fremstilling af human immuninterferon, der i det væsentligste er fri for proteolytiske fragmenter.

10 Det har nu vist sig, at i tilfælde af immuninterferon giver ekstraktion og rensning ved en hvilken som helst af de sædvanlige teknikker, som er beskrevet i den kendte teknik, ikke et fuldstændig homogent præparat af immuninterferon med en intakt eller fuldstændig aminosy-resekvens. Rekombinansteknologien er kun for nylig blevet udviklet 15 til det punkt, hvor det er muligt at få tilstrækkelige mængder rIFN-γ til, at det kan karakteriseres, og dets aminosyresekvens bestemmes.

Når sædvanlige hidtil kendte teknikker anvendtes til at ekstrahere rIFN-y-præparater, og det rensede materiales aminosyresekvens blev bestemt, blev det opdaget, at det rensede præparat faktisk omfattede 20 forskellige, beslægtede proteinarter med forskellig molekylvægt. Det er endvidere ved aminosyresekventering nu erkendt, at disse proteinarter faktisk er den intakte sekvensform af immuninterferon sammen med et flertal af fragmenter af det intakte sekvensprotein. Selv om det nu er erkendt, at den hidtil kendte blanding indeholdt både 25 intakt immuninterferonprotein og fragmenter deraf, har det overraskende vist sig, at en bestanddel af denne blanding tilsyneladende også har bevaret biologisk aktivitet.

Ekstraktionen af rIFN-γ kan udføres ved hjælp af sonifikering eller kemisk lyse. Imidlertid bliver rIFN-γ (hvis DNA-basesekvens og den 30 aminosyresekvens, der udledes derfra, er beskrevet i reference 1) nedbrudt i sonifikerings- eller kemisk lyseekstraktionstrinnet. Sonifikering af frosne celler gav imidlertid primært 15K rIFN-γ, dvs. rIFNy, hvorfra de C-terminale aminosyrerester nr. 132-146 blev fjernet. Denne nedbrydning kan forhindres ved anvendelse af et ekstrak-35 tionsreagens såsom guanidin-HCl, som ikke påvirker den biologiske

DK 162604 B

4 aktivitet eller aminosyresekvens af rIFN-7 under ekstraktionsbetingelserne. Det har endvidere overraskende vist sig, at immuninterferon bevarer sin biologiske aktivitet efter et guanidin-HCl-ekstraktions -trin, selv om guanidin-HCl ødelægger den biologiske aktivitet, når 5 det sættes til et renset immuninterferonpræparat.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås derfor en intakt og komplet sekvensform af rekombinant humant immuninterferon. Dette protein fås fra en præparation af transformerede mikroorganismer, der indeholder det, ved behandling af de transformerede mikroorganismer 10 med et reagens (eller en blanding af reagenser) såsom guanidin-HCl, et proteindenaturerende middel, der inhiberer protease- eller enzymaktivitet under ekstraktionen, men som ikke påvirker aktiviteten af det ønskede protein under ekstraktionsbetingelseme. Renset rIFN-7 fås sluttelig ved at anbringe ekstraktionssupematanten, fortrinsvis 15 efter hensigtsmæssig fortynding, direkte på et rensningsorgan, fortrinsvis en monoklonal antistofsøjle. Disse ekstraktions- og rensningsprocesser kan automatiseres til storproduktion. Således gør opfindelsen det for første gang muligt at gøre store mængder af homogent IFN-7 tilgængelige, og den vil således muliggøre omfattende 20 kliniske forsøg, biologiske undersøgelser, røntgenkrystallografi og struktur-funktionsundersøgelser. Det antiproteolytiske middel ifølge opfindelsen kan være et hvilket som helst guanidinsalt. Blandt sådanne guanidinsalte findes salte med organiske syrer såsom fx eddikesyre eller med mineralsyrer såsom hydrohalogenider, dvs. hydrobromid, 25 hydrochlorid, hydrofluorid og hydroiodid. Det foretrukne guanidinsalt er guanidin-hydrochlorid. Koncentrationen af guanidinsalt til behandling af mikroorganismerne er ikke kritisk, idet enhver effektiv mængde kan anvendes. Det foretrækkes imidlertid, at der anvendes en 3-7M opløsning af guanidinsaltet til behandling af mikroorganismerne, 30 og at der anvendes ca. 3-9 volumen af saltopløsningen pr. gram transformerede mikroorganismer. Koncentrationen af saltet kan opnås ved at opløse saltet i et opløsningsmiddel såsom vand eller vandige buffere såsom ammoniumacetat, pyridin/eddikesyre og lignende. Det er også tænkeligt, at der ved udøvelse af opfindelsen kan anvendes andre 35 proteaseinhibitorreagenser såsom urea og thiocyanat.

DK 162604B

5

Yderligere foretrukne udførelsesformer er belyst ved nedenstående beskrivelse og eksempler.

Rekombinant humanimmuninterferon, som dannes i E. colL, ekstraheres fortrinsvis fra frossent cellepasta med 7M guanidin-HCl og renses med 5 rensningsmidler, fortrinsvis med en hidtil ukendt monoklonal antistofaffinitetssøjle. Det rensede interferon med en tilsyneladende molekylvægt på 18.000 daltons (18K) ved SDS-PAGE er vundet med guani-din, hvorimod der isoleres arter med lavere molekylvægt (større arter ca, 15.000 daltons, 15K) ved sonifikering i fraværelse af guanidi-10 nekstraktion. Aminoterminalsekvenserne af både det 18K og 15K store protein stemte overens med den sekvens, som kunne forudsiges fra det DNA, der koder for dette humane immuninterferonprotein.

DNA-Sekvensen af 18K immuninterferon, som det anvendes i nærværende beskrivelse, har følgende formel:

15 X

AGGAGGAATTC ATG TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAG CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT MT GGA ACT

CTT TTC TTA GGC ATT TTG MG MT TGG AM GAG GAG AGT GAC AGA AM ATA

20 ATG CAG AGC CM ATT GTC TCC TTT TAC TTC AM CTT TTT AM MC TTT AM

GAT GAC CAG AGC ATC CM MG AGT GTG GAG ACC ATC MG GM GAC ATG MT

GTC MG TTT TTC MT AGC MC AM MG AM CGA GAT GAC TTC GM MG CTG

ACT MT TAT TCG GTA ACT GAC TTG MT GTC CM CGC AM GCA ATA CAT GM

CTC ATC CM GTG ATG GCT GM CTG TCG CCA GCA GCT AM ACA GGG MG CGA

25 AM AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG TM

Y

hvor nucleotideme under "X" koder for ribosombindingsstedet og translationsstartsignalet, og nucleotideme over "Y" koder for trans-30 lationsstopsignalet.

Den C-terminale sekvens, der blev bestemt ved analyse og sekventering af det rensede C-terminalpeptid frigivet fra det 18K rIFN-γ, svarede til den forudsagte aminosyresekvens af rIFN-γ, hvilket viser, at 18K-arten er det intakte molekyle. Aminosyresekvensen af 18K immuninter

DK 162604 B

6 feron, som det anvendes i nærværende beskrivelse, har følgende formel:

Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr

Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly 5 Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gin Ser Gin

Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser

Ile Gin Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe

Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser

Val Thr Asp Leu Asn Val Gin Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gin Val 10 Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gin

Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gin

Aminoterminalen af immuninterferonproteinet kan være karakteriseret ved en yderligere methionin (Met) rest. Således omfatter intakt 18K rIFN-γ polypep tider, der starter med enten methionin eller cys tein 15 ved aminoterminalen, og blandinger deraf.

I en fore trukken udførelsesform for opfindelsen er den mikroorganisme, der anvendes som modtageren i fermenteringsprocedurerne, og med mindre andet er angivet, mikroorganismen Escherichia coli K-12 stamme 294, som beskrevet i britisk patentskrift nr. 2.055.382A, og som er 20 deponeret i American Type Culture Collection den 28. oktober, 1978, med deponeringsnummeret 31446. Endvidere blev alt det i nærværende ansøgning beskrevne rekombinante DNA-arbejde udført i overensstemmelse med de af National Institute of Health angivne retningslinjer.

Opfindelsen omfatter imidlertid anvendelsen af ikke blot E. coli K-12 25 stamme 294, som nævnt ovenfor, men også andre kendte E. coli-stammer såsom E. coli MA210 eller E. coli RR1 (ATCC nr. 31343), eller andre mikroorganismer, hvoraf mange er offentligt tilgængelige eller deponeret og tilgængelige fra anerkendte mikroorganismedeponeringsinstitutioner såsom American Type Culture Collection (jfr. ATCC's kata-30 log).

Det hidtil ukendte immuninterferon kan anvendes til de samme formål som de andre immuninterferoner, fx til profylakse eller behandling af virale eller neoplastiske lidelser eller til behandling af immuno-

DK 162604 B

7 suppressive tilstande. Det kan administreres i og som farmaceutisk acceptable orale, injicerbare eller topiske præparater og veje. Doser og dosismængder kan være parallelle med dem, der for tiden anvendes i kliniske anvendelser af de kendte interferoner, typisk ca. 1-200 x 5 10® enheder daglig. Disse farmaceutiske præparater indeholdende det humane interferon fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen indeholder immuninterferonet sammen med et kompatibelt farmaceutisk acceptabelt bæremateriale. Der kan anvendes et hvilket som helst sædvanligt bæremateriale. Bærematerialet kan være et organisk eller 10 uorganisk inert bæremateriale, som egner sig til enteral, percutan eller parenteral administration. Egnede bærere omfatter vand, gelatine, gummi arabicum, lactose, stivelse, magnesiumstearat, talkum, vegetabilske olier, polyalkylenglycoler, vaseline og lignende. Endvidere kan de farmaceutiske præparater indeholde andre farmaceutisk 15 aktive midler. Yderligere tilsætningsstoffer såsom smagsstoffer, konserveringsmidler, stabiliseringsatorer, emulgatorer, puffere og lignende kan tilsættes i overensstemmelse med accepteret praksis for fremstilling af farmaceutiske præparater.

De farmaceutiske præparater kan fremstilles i en hvilken som helst 20 sædvanlig form, herunder a) i fast form til oral administration såsom tabletter, kapsler, piller, pulvere, granuler og lignende; b) i flydende form til oral administration såsom opløsninger, sirupper, suspensioner, eliksirer og lignende; c) præparater til parenteral administration såsom sterile opløsninger, suspensioner eller emulsioner; 25 og d) præparater til topisk administration såsom opløsninger, suspensioner, salver, cremer, geléer, mikroniserede pulvere, aerosoler og lignende. De farmaceutiske præparater kan steriliseres og/eller kan indeholde adjuvanser såsom konserveringsmidler, stabilisatorer, be-fugtningsmidler, emulgatorer, salte til variering af det osmotiske 30 tryk og/eller puffere.

Parenterale dosisformer kan være infusioner eller injicerbare opløsninger, som kan injiceres intravenøst eller intramuskulært. Disse præparater kan også indeholde andre lægemiddelaktive stoffer. Yderligere tilsætningsstoffer såsom konserveringsmidler, stabiliserings-35 atorer, emulgatorer, puffere og lignende kan tilsættes i overens-

DK 162604 B

8 stemmelse med accepteret praksis for fremstilling af farmaceutiske præparater.

Opfindelsen belyses nærmere under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-5 PAGE) af renset rekombinant humant immuninterferon vinder reducerende betingelser (A; 0,7M /3-mercaptoethanol) og ikke-reducerende betingelser (B) , fig. 2 viser en sammenligning mellem den forudsagte aminosyresekvens af rekombinant humant immuninterferon og den faktiske DNA-sekvens af 10 15K og 18K rIFN-γ-arterne, fig. 3 viser HPLC-adskillelse af C-terminale peptider af 15K og 18K rIFN-7 efter CNBr-behandling, og fig. 4 viser et tryptisk peptidkort over 18K rIFN-7.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.

15 EKSEMPEL 1

Syntese af et bærerprotein-polypeptidcomplex, der anvendes som antigen

Polypeptidet H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH blev forbundet med tyroglobulin (TG) som beskrevet af 20 Goodfriend et al., Science 144, 1964, s. 1334.

Selve peptidet kan fremstilles ved sædvanlige metoder til peptidsyntese. Enten fastfase- eller flydende fase-metoden kan anvendes, selv om flydende fase-syntesemetoden i mange tilfælde er fordelagtig.

Sådanne peptidsyntesemetoder er beskrevet i fx Schroder og Lubke, 25 The Peptides, bind 1, Academic Press, New York, USA, 1966 eller

Izumiya et al., Peptide Syntheses, Maruzen, Tokyo, Japan, 1975 eller Haruaki Yajima, Experiments in Biochemistry, bind 1, Tokyo Kagaku Dojin, 1977, s. 207-400 og omfatter bl.a. azidmetoden, chloridmeto-den, syrearihydridmetoden, blandet syreanhydridmetoden, DCC-metoden, 30 aktiv estermetoden, metoden, ved hvilken der anvendes Woodward-rea-

DK 162604 B

9 gens K, carbodiimidazolmetoden, oxidations-reduktionsmetoden og DCC/additiv-(fx HONB, HOBt, HOSu)metoden.

En detaljeret beskrivelse af fremstillingen af 131-146-fragmentet af IFN-y findes i europæisk offentliggørelsskrift nr. 103 898.

5 2,5 mg af polypeptidet blev blandet med 3,75 mg TG, og efter tilsæt ning af 2 ml 50 mM phosphatpuffer blev blandingen omrørt grundigt i isvand. Dertil sattes gradvis og dråbevis en opløsning af 30,4 mg carbodiimid-hydrochlorid i 200 ml destilleret vand. Derefter blev blandingen omrørt i isvand i 3 timer. Efter at reaktionen var løbet 10 til ende, foretoges dialyse mod destilleret vand i tilstrækkelig grad efterfulgt af lyofilisering, hvilket gav 4,7 mg af et proteincomplex.

EKSEMPEL 2

Fremstilling af enzymbundet antigen til enzymimmunoassay (EIA) til antistofdetektering 15 Det enzymbundne antigen EIA blev fremstillet i henhold til Kitagawa et al., Journal of Biochemistry 79, 1976, s. 233.

i) Indføring af en maleimidogruppe i polypeptidet

Det i eksempel 1 vundne polypeptid (350 nanomol) blev opløst i 1 ml 100 mM phosphatpuffer (pH-værdi 6,8), og opløsningen sattes til en 20 opløsning af 585 /tg (1,75 /tmol) N-(4-carboxycyclohexylmethyl)male-imid-N-hydroxy-succinimidester i 70 μΐ N,N-dimethylformamid. Blandingen blev omrørt ved 30®C i 30 minutter. Efter at reaktionen var løbet til ende, foretoges fraktionering under anvendelse af en Sepha-dex® G-25-søjle, hvilket gav 185 nanomol af en polypeptidfraktion, i 25 hvilken maleimidogruppen var indført.

DK 162604 B

10 ii) Forbindelse af det maleimidogruppeholdige polypeptid med /J-D-ga-lactosidase

Det maleimidoholdige polypeptid (16,5 nanomol) blev blandet med 3,3 nanomol /J-D-galactosidase. Efter 18 timers reaktion ved 4°C tilsattes 5 412,5 nanomol /3-mercaptoethanol for at standse reaktionen. Det β-Ό- galactosidaseforbundne polypeptid blev fraktioneret på en Sepharose® 6B-søjle og anvendt i nedenstående forsøg.

EKSEMPEL 3 Immunisering 10 6 BALB/C-hunmus, der var 7-8 uger gamle, blev subcutant inokuleret med 40 pg hver (på basis af proteinet) af det i eksempel 1 fremstillede proteincomplex som antigen grundigt blandet med Freund's komplette adjuvans (primær immunisering). 2 uger efter den primære immunisering blev musene igen subcutant inokuleret med antigenet i 15 samme dosis som ovenfor grundigt blandet med Freund's ukomplette adjuvans (sekundære immunisering). Yderligere 2 uger senere blev der foretaget en tredje immunisering på samme måde som den sekundære immunisering. 6 dage efter den tredje immunisering blev der taget partielle blodprøver fra musene, og serumantistoftiterne blev bestemt 20 ved den nedenfor beskrevne EIA-metode (jfr. Immnopharmacology, 1 1978, s. 3). Musen med nummeret y-2 gav den højeste antistoftiter og blev underkastet endelig immunisering ved intravenøs inokulering med 120 pg af antigenet opløst i 0,5 ml vandig natriumchlorid. Antistof-titerdataene for hver mus er vist i tabel 1.

DK 162604 B

11 TABEL 1

Antipeptid-antistoftitere i imminiserede mus B/T (X) 5 Mus nr. Primær immuni- Sekundær im- Tredje immunise- sering 1) munisering 2) ring 3) 7-1 - 4) N.D. 34,5 2 N.D. 5) 19,3 35,3 10 3 - N.D. 24,7 4 N.D. 1,3 1,7 5 N.D. 1,8 5,0 6 - N.D. 0,8

Normal 15 mus 0,6 0,1 N.D.

1) Serumfortyndingsforhold: 1:1000 2) Serumfortyndingsforhold: 1:6300 3) Serumfortyndingsforhold: 1:7800 20 4) -: ikke detekterbar 5) N.D.: ikke bestemt B/T: (Blindet enzymaktivitet/tilsat enzymaktivitet i alt) x 100 EIA-Metoden

Detekteringen af antistofaktivitet i serum fra mus immuniseret med 25 det i eksempel 2 vundne proteincomplex eller i hybridomasupernatanten blev udført ved EIA-metoden (Immunology 1, 1978, s. 3). Således blev serummet eller hybridomasupernatanten fortyndet med puffer A (20 mM Na2HP04, 100 mM NaCl, 0,1% NaN3> 1 mM MgCl2, pH-værdi 7,0), en 100 /il's portion af fortyndingen blev blandet med 100 μΐ af det enzym-30 bundne polypeptidderivat (eksempel 2), og reaktionen lodes forløbe ved 24eC i 24 timer. Derefter tilsattes 100 /ti 3%'s cellulose forbundet med kanin-anti-muse-IgG, og reaktionen lodes forløbe ved 24 °C i 4 timer. Efter at reaktionen var løbet til ende, blev cellulosen vasket godt med puffer A indeholdende 0,5% Tween® 20, hvorefter der

DK 162604 B

12 tilsattes 500 μΐ 20 /xg/ml 4-methylumbelliferyl-/3-D-galac tosid, og efter 2 timers reaktion ved 37° C tilsattes 3 ml 100 mM carbonatpuffer (pH- værdi 10,5) for at standse reaktionen. Fluorescensintensiteten blev målt ved hjælp af et fluorometer (excitation: 365 nm; emission: 5 450 nm).

EKSEMPEL 4 Cellefusion

Tre dage efter den endelige immunisering, som beskrevet i eksempel 3, blev milten fjernet fra 7-2-musen, filtreret gennem en rustfri sigte 10 tinder tryk og suspenderet i Eagle's minimale essentielle medium (MEM), hvilket gav en miltcellesuspension. Til cellefusion anvendtes BALB/C musederiverede P3-x63.Ag8.Ul (P3U1) myelomaceller (Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1978, s. 1). Cellefusion blev udført ved den originale metode, beskrevet af K5hler og Milstein 15 i Nature 256, 1975, s. 495-497. Miltceller og P3Ul-celler blev således vasket separat tre gange med serumfrit MEM og blandet i et forhold på 5:1 (antal celler). Blandingen blev centrifugeret ved 800 omdrejninger pr. minut i 15 minutter, hvorved cellerne blev bundfældet. Efter omhyggelig fjernelse af supernatanten blev cellerne 20 løsnet let, der tilsattes 0,3 ml 45%'s polyethylenglycol (PEG) 6000 (Koch-Light), og blandingen lodes henstå i en varm vandbeholder, som blev holdt ved 37°C i 7 minutter, således at der fremkaldtes celle-fusion. Derefter tilsattes MEM med en hastighed af 2 ml pr. minut.

Efter tilsætning af i alt 12 ml MEM blev den resulterende blanding 25 centrifugeret ved 600 omdrejninger pr. minut i 15 minutter efterfulgt af fjernelse af supernatanten. Cellebundfaldet blev suspenderet i RPMI-1640 medium beriget med 10%'s føtalt kalveserum (RPMI1640-10FCS) i en koncentration af 2 x 10^ P3Ul-celler/ml, og hver af 144 brønde på 24 brøndes multiskåle (Linbro) blev podet med 1 ml af 30 suspensionen. Efter podning blev cellerne inkuberet ved 37°C i en 5%'s carbondioxidgasinkubator. Efter 24 timer blev en HAT-selektiv kultur startet ved tilsætning af RPMI1640-10FCS-medium beriget med HAT-medium (1 x 10-½ hypoxanthin, 4 x 10-½ aminopterin, 1,6 x 10-¾ thymidin) i en mængde af 1 ml pr. brønd. Den HAT-selektive kultur

DK 162604 B

13 fortsattes, medens 1 ml af det gamle medium blev erstattet med 1 ml HAT-medium 3, 5 og 7 dage efter, at kulturen var startet. Væksten af hybridomaceller blev bemærket 10-14 dage efter cellefusion. Da dyrkningsvæsken blev gul (ca. 1 x 10® celler/ml), blev supernatanten 5 indsamlet og undersøgt for tilstedeværelse af antistof ved EIA-metoden. På denne måde blev supernatanter fra 141 brønde, i hvilke hybri-domavækst var blevet bemærket, undersøgt. 2 brønde (7 2-11 og 7 2-100) viste intens antistofaktivitet, og to andre brønde (7 2-62 og 7 2-70) havde svag antistofaktivitet.

10 EKSEMPEL 5 Kloning

Hybridomaceller fra 3 brønde (7 2-11, 7 2-62 og 7 2-100), som var positive i antistofaktivitet blev klonet ved den begrænsende fortyndingsmetode. Således blev hybridomaceller suspenderet i RPMI1640-15 20FCS i en koncentration på mindst 2 hybridomaceller/ml, og suspensionen blev fordelt i 0,1 ml's portioner i brøndene på en mikroplade med 96 brønde. I denne fordeling tilsattes 5 x 10^ BALB/C-musethymo-cyter pr. brønd som foderceller ("feeder cells"). Som følge heraf iagttoges celleformering efter ca. 2 uger. Supernatanten blev deref-20 ter indsamlet og undersøgt for tilstedeværelsen af antistoffer ved EIA-metoden, som beskrevet i eksempel 3. Antistofaktivitet blev bemærket i 8 ud af 19 kloner fra 7 2-11-brønden, i 3 ud af 54 kloner fra 7 2-62-brønden og i 5 ud af 47 kloner fra 7 2-100-brønden (tabel II).

DK 162604 B

14

Tabel II

Antipeptid-antistofaktivitet af klonede hybridomaceller

Hybridoma nr. B/T (%) 5 7 2-11: 1 68 2 31 3 63 6 68 10 7 67 9 69 12 42 18 60 15 7 2-62: 14 20 16 21 34 16 20 7 2-100: 2 69 3 70 16 56 25 56 25 25 80 46 33

Hyperimmunt museserum 35 30 _

DK 162604 B

15 EKSEMPEL 6

Monoklonale antistoffers bindingsevne til IFN-7

Monoklonale antistoffers bindingsevne til I FN-7 blev bestemt ved følgende metode. Til 300 plitex af en 3Z's opløsning af cellulose for-5 bundet med kanin-antimuse-IgG-antistof sattes 300 juliter af kultursu-pernatanten af hver af 2 eller 3 klonede cellelinjer fra hver af 7 2-11, γ 2-62 og 7 2-100-brøndene, og reaktionen lodes forløbe ved stuetemperatur i 12-20 timer. Derefter blev cellulosen grundigt vasket med fysiologisk saltopløsning, og hertil sattes 550 U/ml IFN-7, der 10 var fremstillet som beskrevet nedenfor. Efter 3-4 timers reaktion blev supematanten indsamlet, og det ved nedenstående fremgangsmåde fremstillede IFN-7 tilsattes. Efter 3-4 timers reaktion blev superna-tanten indsamlet, og INF-7-aktiviteten deri blev bestemt ved den cytopatiske effekts (CPE)-aflæsningsmetode under anvendelse af en 15 mikroplade [Applied Microbiology 16, 1968, s. 1706]. 50 μΐ MEM blev således anbragt i hver brønd på en mikroplade med 96 brønde, og 50 /iliter af IFN-prøven sattes til den første brønd efterfulgt af to ganges seriefortynding. Til hver af de således fremstillede brønde sattes 50 eliter af en WISH-cellesuspension (4 x 10^ celler/ml) i 20 20%'s FCS- holdigt MEM, og inkubation blev udført i en carbondioxid- gasinkubator ved 37°C i 24 timer. Derefter sattes 50 /xliter af en vesiculær stomatitisviruspræparation (New Jersey-stamme) indstillet til en koncentration på 2000TCID^q (TCID^: gennemsnitlig vævskulturinficerende dosis) til hver brønd, og inkubationen blev udført i 25 en carbondioxidinkubator ved 37eC. Ca. 35 timer senere, da celler i den IFN-prøvefri brønd viste et 100%'s CPE, blev hver brønd mikroskopisk undersøgt til bedømmelse af CPE, og den reciprokke værdi af fortyndingsfaktoren for IFN-prøven i den brønd, hvori der iagttoges 50%'s CPE, blev betegnet som IFN-titeret.

30 Den anvendte IFN-7-prøve af den supernatant, som blev indsamlet 72 timer efter stimulering af humane perifere lymphocyter med 40 pg/ml t concanavalin A og 15 ng/ml 12-0-tetra-decanoylphorbol-13-acetat. Hver ml af denne kultursupematant indeholdt 4400 enheder humant INF-7 (varme- og syrelabil). Hvis der er antistoffer, som har bindingsevne 35 til IFN-7, til stede i den klonede cellekultur-supernatant, bør det

DK 162604 B

16 tilsatte IFN-γ binde til antistofferne på cellulose, og reduktion i supernatantens INF-γ-aktivitet bør forekomme. Som følge heraf bemærkedes for klonen γ 2-11 en relativ intens bindingsaktivitet til INF-γ, og 50-75% af det tilsatte IFN-γ (550 U/ml) blev bundet til 5 antistoffer (tabel III).

Tabel III

Monoklonale antistoffers absorption af IFN-γ-aktivitet

Hybridomakultur Tilbagebleven IFN-aktivitet (U/ml) 10 Forsøg 1 Forsøg 2 γ 2-11,1 138 275 γ 2-11,2 207 N.D.

γ 2-11,6 N.D. 275 15 γ 2-62,2 275 550 γ 2-62,3 275 550 γ 2-100,2 550 N.D.

γ 2-100,3 550 N.D.

550 550 20 _ EKSEMPEL 7

Ascitesdannelse ved hjælp af monoklonale antistof-dannende hybri-domaceller

Ascitesdannelse blev forårsaget ved intraperitoneal inokulering af 25 BALB/c-mus, som forud var behandlet intraperitonealt med 0,5 ml mineralolie, med 1 x 10^ γ 2-11,1-klonceller, der var i stand til at danne antistoffer med I FN - γ -b indende aktivitet. 10 dage efter intraperitoneal administration af hybridomaceller, blev ascitesvæsken udtaget og undersøgt for antistofaktivitet i op til 10^ ganges fortyn-30 ding. Medens antistofaktiviteten af den tilsvarende kloncellekultur-supernatant var detekteret i op til 10^ ganges fortynding, førte

DK 162604 B

17 dannelsen af ascites (asciticering) til en ca. 1000 ganges forøgelse i antistofaktiviteten.

EKSEMPEL 8

Monoklonal antistofrensning 5 Under anvendelse af 4 ml af den i eksempel 7 vundne ascitesvæske som udgangsmateriale blev monoklonal antis tof rensning udført ved den af Staehelin et al., Journal of Biological Chemistry 256, 1981, s. 9750 beskrevne metode. Ascitesvæsken blev således først centrifugeret ved 10.000 rpm i 15 minutter for at fjerne fibrinlignende stoffer derfra 10 og blev derefter fortyndet med phosphatpufret saltopløsning (PBS: 8,1 mM NaH2P04, 1,5 mM KH2P04, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl; pH-værdi 7,2) til en koncentration, ved hvilken den ultraviolette absorption ved 280 nm (A28o) omr^et fra 12-14. Derefter sattes mættet vandigt ammoni umsulfat til den fortyndede prøve, hvilket gav en sulfatkoncentration 15 på 47%. Blandingen blev omrørt ved 4°C i 60 minutter for at forårsage udsaltning og blev derefter centrifugeret (10.000 rpm, 15 minutter), hvilket gav et bundfald. Bundfaldet blev opløst i 20 mM tris-puffer (pH-værdi 7,9) indeholdende 50 mM NaCl og dialyseret mod 2 liter af den samme puffer. 2 timer senere blev dialyseopløsningen erstattet 20 med en frisk 2 liters portion af samme opløsning, og dialysen fortsattes i yderligere 15 timer. Derefter blev bundfaldet fjernet ved centrifugering ved 10.000 rpm i 15 minutter, og supernatanten blev indstillet til en sådan koncentration, at A2gQ-værdien blev 20-30.

Denne prøve blev underkastet fraktionering på en DEAE-cellulosesøj le 25 (8 ml, Whatman DE,^), der var ækvilibreret med en tilstrækkelig mængde tris-puffer (pH-værdi 7,9) indeholdende 50 mM NaCl, idet eluering foretoges med tris-puffer indeholdende 50 mM NaCl med en strømningshastighed på 1,5 ml/minut. Under disse betingelser blev antis tof aktiviteten hovedsagelig detekteret i eff luentfraktioner. Det 30 blev bekræftet, at den rensede prøve er antistof, ved den af Laemmli et al., Nature 227, 1970, s. 680 beskrevne SDS-PAGE-metode. Nogle af de fraktioner, der vandtes ved ammoniumsulfatudsaltning og DEAE-cellulosefraktionering blev således hver især underkastet reduktion med 2-mercaptoethanol efterfulgt af 17%'s SDS-gelelektroforese ved

DK 162604 B

18 30 volt i 24 timer. I overensstemmelse med antis tofaktivi te tstoppene bemærkedes to bånd i stillinger, som svarede til molekylvægte på ca.

55 kilodaltons (H-kæde) og ca. 28 kilodaltons (L-kæde). Den således rensede antistoffraktion 17 blev undersøgt for IFN-7-bindende aktivi-5 tet ved tilsætning af IFN-7 (2200 U/ml). Det viste sig således, at ca. 50% af INF-7 blev bundet til antistoffet (tabel IV).

Tabel IV

Prøve Fortynding Tilbagebleven IFN-aktivitet (TJ/ml) 10 _ γ 2-11,1 fraktion 17 10-1 1100 10-2 1100 ΙΟ-3 2200 10'4 2200 15 Anti-IgE monoklonalt antistof 10"^· 2200 10-2 2200 10"3 2200 10'4 2200 20 _ EKSEMPEL 9

Underklasse, hvortil monoklonale antistoffer tilhører

Den rensede antistoffraktion 17 (eksempel 8) blev fortyndet 10 gange og underkastet immunoudfældningsreaktion i agar (Ouchterlony-test: 25 Immunological Methods, Gel-Diffusion Techniques, Blackwell, Oxford, 1964) under anvendelse af gede-antimuse-IgGl-, -G2a-, -G2b- og- G3-antistoffer (Miles), således at den IgG-underklasse, som 7 2-11.1-monoklonale antistoffer eventuelt tilhører, kunne identificeres. Et enkelt distinkt bånd blev fundet mellem det monoklonale antistof og 30 gede-antimuse-IgG2b-antistoffet, hvorimod der ikke var nogen bånddannelse mellem det monoklonale antistof og andre anti-antistoffer.

DK 162604 B

19

Det monoklonale antistof viste sig således at tilhøre IgG2b (tabel V).

Tabel V

Monoklonal antistofunderklasse 5 Antigen Antistof Udfældningskurve

Monoklonalt antistof ifølge opfindelsen (fraktion 17) anti-IgGl 10 (fraktion 17) anti-IgG2a (fraktion 17) anti-IgG2b + (fraktion 17) anti-IgG3 EKSEMPEL 10 15 25 ml (65,3 mg) af det monoklonale antistof fra effluentfraktioneme, der blev renset som beskrevet i eksempel 8, blev dialyseret natten over mod 0,1M NaHC03 (pH-værdi 8,3). Separat blev 25 ml AFFI-GEL 10 (Bio-Rad) grundigt vasket med vand under anvendelse af et glasfilter, suspenderet i 0,1M NaHCOj (pH-værdi 8,3) og blandet med det oven-20 nævnte antistof. Blandingen blev nænsomt omrørt ved 4°C i 4 timer for at forårsage reaktionen og lodes derefter henstå ved 4°C natten over. AFFI-GEL 10 blev vasket grundigt med 0,1M NaHC03 (pH-værdi 8,3) under anvendelse af et glasfilter. Til gelen sattes 25 ml af en opløsning (pH-værdi 8,0), der indeholdt 0,1M ethanolamin og 0,15M NaCl.

25 Blandingen blev rystet ved 4eC i 1 time for at blokere eventuelle tilbageblevne uomsatte aktive grupper. Derefter blev gelen vasket grundigt med PBS og suspenderet i 25 ml 0,1% NaN3>holdigt PBS. Suspensionen blev lagret ved 4°C. Baseret på mængden af det tilsatte antistof og mængden af antistoffet i det udvundne filtrat viste det 30 sig, at antistoffet var konjugeret til gelen i en mængde på 2,35 mg/ml gel. En søjle blev pakket med det således vundne reaktionsprodukt og anvendt som antistofsøj le.

DK 162604 B

20 EKSEMPEL 11 E. coli RR1 (pRK148cItg> pRC231/IFI-900) (konstruktionen af denne rekombinantorganisme er detaljeret beskrevet i europæisk offentliggørelsesskrift nr. 99084) blev anvendt til rIFN-7-fremstilling. Plasmi-5 deme pRK248cI og pRC231/IFI-900 indeholdt henholdsvis den tempera-turfølsomme λ-repressor og IFN-7-gen. Ekspression af rIFN-7-genet var under kontrol af PL-promo toren.

Ovematskulturer af E. coli RRI (pRK248cIfcs, pRC231/IFI-900) blev dyrket i LB-væske ved 30°C. 1 liter af overnatskulturen blev fortyn-10 det til 10 liter med M- 9-minimalmedium, der indeholdt casaminosyrer.

I logaritmisk vækstfase blev kulturen skiftet fra 30°C til 42°C og fortsatte med at vokse ved 42eC i 2-3 timer. Bakterier blev høstet ved centrifugering, og bakteriepelletterne blev lagret ved -20°C, indtil de skulle bruges. Alle fermenteringer og metoder blev udført i 15 henhold til National Institutes of Health's retningslinjer for rekom-binant-DNA-arbej de.

Monoklonale antistoffer blev fremstillet imod det syntetiske 131-146 C-terminale peptid af rIFN-7 på den ovenfor beskrevne måde. Det monoklonale antistof Mo 7 2-11,1 blev anvendt til rensning af rIFN-7.

20 Den monoklonale antistofsøj le blev fremstillet som beskrevet i eksempel 10.

14

Carboxymethylering af rIFN-7 med C-iodeddikesyre blev udført i nærværelse af 6M guanidin-HCl som beskrevet i reference 3. Overskydende reagens blev fjernet ved HPLC på en C8-reversfasesøjle. Car-25 boxypeptidasenedbrydning blev udført i 0,2M NH4HCO3 som beskrevet i reference 4.

rIFN-7 blev behandlet med CNBr (100 ganges molært overskud i forhold til methionin) i 70%'s myresyre som beskrevet i reference 5. CNBr-peptider blev adskilt ved HPLC på en C-18 reversfasesøjle. Der an-30 vendtes en lineær gradient af 0-70%'s CH3CN i 0,1%'s trifluoreddike-syre til peptideluering.

DK 162604 B

21

Protein- eller peptidprøver blev hydrolyseret i 20-24 timer i forseglede, med N2-skyllede, lufttomme rør i konstant kogende HC1 indeholdende 4% thioglycolsyre. Aminosyreanalyser blev udført under anvendelse af et fluorescamin-aminosyreanalyseapparat som beskrevet i 5 reference 6.

Et ABI (Applied Biosystem, Inc.) gasfase-sekventeringsapparat 470A blev anvendt til sekvensanalyser af carboxymethylerede proteiner som beskrevet i reference 7. Prøver af PTH-aminosyrer blev identificeret ved reversfase-HPLC på en ultrakugle-ODS-søjle som beskrevet i re-10 ference 8.

Alle rensningstrin blev udført ved 4°C. Frosne celler (25 g) blev suspenderet i 3 volumen (75 ml) 7M guanidin-HCl (pH-værdi 7). Blandingen blev omrørt i 1 time og derefter centrifugeret i 1 time ved 30.000 x g. Supematanten blev fortyndet 10 gange med Dulbecco's 15 phosphatpufrede saltopløsning (PBS) eller 0,15M natriumboratpuffer (pH-værdi 9,5) og derefter centrifugeret i 30 minutter ved 30.000 x g. Alternativt blev frosne celler (25 g) suspenderet i 1,5 volumen (37,5 ml) 0,15M natriumboratpuffer (pH-værdi 9,5) og omrørt i 1 time. Blandingen blev sonikeret 5 gange i 30 sekunder og derefter 20 centrifugeret i 1 time ved 30.000 x g. Supernatanteme fra enten guanidin-HCl-ekstraktion eller sonifikering blev blandet med 25 ml silica i 1 time på et roterende rysteapparat og forvasket med PBS.

Blandingen blev hældt på en søjle, og søjlen blev vasket med 20-30 søjlevolumen 1M NaCl. Søjlen blev derefter elueret med 0,5M tetra-25 methylammoniumchlorid i 0,01M natriumboratpuffer (pH-værdi 8,0).

Interferonaktivitet blev elueret i ca. 200 ml og delt i fire puljer.

Hver pulje blev hældt på et monoklonalt antistof (γ 2-11.1-affinitetssøjle) (4 ml lejevolumen) ækvilibreret med PBS. Efter vask med 10 søjlevolumen PBS-puffer, blev søjlen elueret med enten 1M guanidin-30 HC1 eller 50%'s ethylenglycol indeholdende 1M NaCl og 20 mM natrium-phosphatpuffer (pH-værdi 7,0). Interferonaktiviteten blev elueret i de første 20 ml.

SDS-PAGE blev udført som beskrevet af Laemmli (reference 9). Protein blev bestemt ved fluorescamin-analyse med krystallinsk bovint serum-35 albumin som sammenligningsstandard. Interferonaktiviteten blev be-

DK 162604 B

22 stemt ved et cytopatisk effekt-inhiberingsassay med vesicular stoma-titisvirus og humane WISH-celler som beskrevet i reference 10. Alle interferontitre er udtrykt i sammenligningseriheder/ml kalibreret mod sammenligningsstandarden af delvis renset immuninterferon.

5 Et resumé af ekstraktionsrensningsmetoden er givet i tabel VI (side 24). Det samlede udbytte var 25-32%, og rensningen var ca. 100-769 gange med en gennemsnitlig specifik aktivitet på 1 x 10^ eriheder/mg.

Det samlede udbytte af rIFN-γ var 3-4 gange højere ved guanidineks-traktion. SDS-PAGE af det sidste rensningstrin er vist i fig. 1. Det 10 materiale, som blev renset ved guanidinekstraktion, viste et enkelt bånd ved ca. 18.000 daltons (18K rIFN-γ), hvorimod materialet fra sonifikeringsmetoden gav et hovedbånd ved ca. 15.000 daltons (15K rIFN-γ) og et mindre bånd ved ca. 17.000 daltons) (fig. 1A). På en ikke-reducerende gel blev der dannet dimerer og oligomerer af rIFN-7 15 (fig. IB).

18K rIFN-γ var homogent, og amino syre sammensætningen stemte overens med den aminosyresammensstning, som var forudsagt ud fra DNA- sekvensen. Aminosyresammensætningen af 15K og 18K rIFN-γ er anført i tabel VII. Flere hundrede picomol reduceret og carboxymethyleret 15K og 18K 20 protein blev underkastet Edman-nedbrydning i et automatisk gasfase-protein/peptidsekventeringsapparat. De aminosyre-N-terminale sekvenser er de første 32 og 26 rester med henholdsvis 15K og 18K proteiner stemte overens med den sekvens, som var forudsagt ud fra DNA-sekven-14 sen (fig. 2). C-Carboxymethylerede cysteiner blev detekteret i 25 første og tredje cyclus af sekvensanalyseme. Der blev ikke detekteret noget N-terminalt methionin. N-terminal sekvensanalyse af 18K og 15K af rIFN-7 viste, at sekvensen af dette område af begge proteiner er identisk med den sekvens, som kunne forudsiges ud fra DNA-sekvensen. De C-terminale peptider er også blevet karakteriseret for 30 at bestemme, om der er foregået nogen sletninger eller ændringer i dette område. Aminosyreanalyse af carboxypeptidase A (CPA)-nedbrydningsblanding viste, at serin og/eller glutamin (C-terminale aminosyrer) blev afgivet fra det 18K-rIFN-7, hvorimod 15K rIFN-7 ikke blev nedbrudt af CPA under samme betingelser. Eftersom Ser-Gln er den 35 C-terminale sekvens af rIFN-7, syntes 18K-arten at have den intakte

DK 162604 B

23 C-terminal, hvorimod 15K-arten har en anden C-terminalrest (Lys), som ikke spaltes af CPA.

Disse C-terminale rester, som er forudsagt ud fra DNA- sekvenserne, blev yderligere bekræftet ved at analysere og sekventere de C-ter-5 minale peptider efter CNBr-behandling. C-terminale peptider blev separeret på HPLC C-18 reversfasesøjlen (fig. 3). Der vandtes en distinkt peptidspids (spids II) elueret fra den tidlige del af gradienten, fra 15K rIFN-γ, og dette peptid var fraværende fra CNBr-ned-brydningsblandingen af 18K rIFN-γ. Aminosyreanalyse af dette peptid 10 viste, at dette peptid ikke har noget homoserin eller homoserinlac-ton, og derfor må være det C-terminale CNBr-peptid af 15K-proteinet.

Baseret på aminosyreanalyse (tabel VIII) svarede dette peptid til aminosyrerest nr. 121-131 af IFN-7 (intet arginin var detektebart).

Sekvensen af de 11 aminosyrer blev bekræftet ved sekvensanalyse (fig.

15 2). Ved 18K rIFN-γ opnåedes en relativt bred spids i den tidlige del af elueringen. Denne spids blev yderligere delt i to spidser ved hjælp af en lav gradient. Aminosyreanalyserne viste, at den første spids er det CNBr-C-terminale peptid af 18K-proteinet (tabel VIII), og aminosyresammensætningen svarer til aminosyrerest nr. 138-146.

20 Sekvensen af de 9 aminosyrer blev bekræftet ved sekvensbestemmelse (fig. 2). 15K-proteinets C-terminale aminosyre blev bestemt til at være lys in.

Disse resultater viser, at 18K-arten var det intakte rIFN-7-molekyle, hvorimod 15K-arten var et proteolytisk produkt. Peptidbindingen mel-25 lem aminosyreresteme nr. 131 og nr. 132 (Lys-Arg) var spaltet på 15K-arten.

EKSEMPEL 12

Tryptisk peptidkort over 18K rIFN-7

Der blev udført tryptisk peptidkortlægning af 18K rIFN-7. 18K rIFN-7 30 (43 μg) blev nedbrudt med TPCK-trypsin (1,1 μg, Worthington (USA)) ved 37®C i 18 timer i 147 /iliter 25 mM ammoniumacetat-NaOH (pH-værdi 8,0). Til spaltningsblandingen sattes 0,6 μϋΐβΓ 2-mercaptoethanol,

DK 162604 B

24 og inkubationen fortsatte i 2 timer. For at standse reaktionen tilsattes 53 μΐ 1%'s trifluoreddikesyre (TFA). Hele spaltningsprøven blev chromatograferet på en Ultrasphere -oc tylsøj le (5 μπι, 4,6 x 250 nm Altex, (USA)) ækvilibreres med 0,02% TFA-5% CH3CN. Eluering 5 blev udført ved 1,0 ml/minut ved hjælp af en lineær gradient af 5-70%'s CH3CN ved 30°C. Effluenten blev overvåget ved den fluorimetri-ske metode under anvendelse af fluorescamin. Det resulterende kort er vist i fig. 4.

EKSEMPEL 13 10 Bestemmelse af den C-terminale aminosyre af 18K rIFN-7

Den C-terminale aminosyre af 18K rIFN-γ blev bestemt ved hydrazino-lyse under anvendelse af den af Narita et al. (J. Biochem. 59, Tokyo, 1966, s. 170) beskrevne metode. 185 /xg 18K rIFN-γ blev opvarmet ved 100°C i 6 timer med vandfrit hydrazin. Det lyofiliserede hydrazin-15 lysat blev opløst i vand, og der tilsattes benzaldehyd. Blandingen blev grundigt rystet i 1 time ved stuetemperatur og derefter centrifugeret. Supematanten blev lyoffliseret og underkastet aminosyreana-lyse. Der blev imidlertid ikke detekteret nogen aminosyre. Dette resultat stemmer overens med, at 18K-artens C-terminale aminosyre er 20 glutamin.

DK 162604 B

25

Tabel VI

Rensning af rIFN-7

Rensningstrin Total- Total Specifik ak- Rensning Udbytprotein aktivitet tivitet en- gange te % 5 mg enheder heder/mg I. Guanidinekstraktion

Supernatant 2,806 2,5x10** 9x10^ - 100

Siliciumdioxid 98 1,0x10s lxlO6 11 40 10 Monoklonalt antistof 8 0,8xl08 lxlO7 110 32 II. Sonifikering

Supernatant 6,136 8,0xl07 1,3x10^ - 100

Siliciumdioxid 87 4,5xl07 5,2xl06 400 56 15 Monoklonalt antistof 2 2,0xl07 Ι,ΟχΙΟ7 769 25

DK 162604 B

26

Tabel VII

Amino syres ammensætning af 15K og 18K rIFN-y (Restantal) 18K (1-146) 15K (1-131) 5 Asp 20,9 (20) 19,9 (20)

Thr 5,1 (5) 4,9 (5)

Ser 9,8 (11) 6,7 (9)

Glu 18,5 (18) 15,1 (16)

Pro * (2) * (2) 10 Gly 5,9 (5) 5,6 (4)

Ala 8,2 (8) 7,3 (7)

Cys * (2) * (2)

Val 9,1 (8) 9,1 (8)

Met 4,7 (4) 3,8 (3) 15 Ile 7,2 (7) 6,6 (7)

Leu 10,5 (10) 9,6 (9)

Tyr 5,5 (5) 4,8 (5)

Phe 10,3 (10) 8,2 (9)

His 1,8 (2) 2,5 (2) 20 Lys 19,9 (20) 16,9 (19)

Arg 8,6 (8) 5,6 (3)

Trp * (1) * (1)

Tal i parentes angiver den beregnede mængde rester ud fra DNA-sekvensen.

25 * Værdier ikke bestemt.

DK 162604 B

27

Tabel VIII

CNBr-C-terminale peptider af 15K og 18K 15K 18K

Thr 0,9 (1) 5 Ser 1,1 (1) 0,84 (1)

Glu 1,1 (1) 1,1 (1)

Pro * (1)

Gly 1,5 (1) 1,3 (1)

Ala 2,4 (3) 1,1 (1) 10 Leu 1,0 (1) 1,1 (1)

Phe 1,0 (1)

Lys 1,9 (2) 2,8 (3)

Stilling i sekven- 15 sen 121-131 138-146

Tal i parentes angiver det beregnede restantal ud fra DNA-sekvensen.

* Ikke bestemt.

Referencer 1. Gray, P.W., et al., Nature 295, 1982, s. 503-508 20 2. Stahelin, T., et al., J. Biol. Chem. 256, 1981, s. 9750-9754 3. Allen, G., Sequencing of Protein and Peptides, North-Holland Publishing Co., Amsterdam, New York, 1981, s. 30-31 4. Amber, R.P., Methods In Enzymology 11, 1967, s. 436-445 5. Wolfe, R.A. og Stein, S., Modem Methods In Pharmacology, Alan 25 R. Liss, Inc., New York, N.Y., 1982, s. 55-77 6. Stein, S. og Brink, L., Methods In Enzymology 79, 1981, s. 20-25 7. Hewick, R.M., Hunkapillar, M.W., Hodd, L.E. og Dreyer, W.I., J.

Biol. Chem. 256, 1981, s. 7990-7997 8. Hawke, D., Yuan, P-M., og Shively, J.E., Anal. Biochem. 120, 30 1982, s. 302-311 9. Laemmli, U.K., Nature 227, 1970, s. 680-685

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af intakt rekombinant humant immun-5 interferon, der i det væsentlige er fri for proteolytiske fragmenter deraf, fra transformerede mikroorganismer, der indeholder dette protein, kendetegnet ved, at det intakte rekombinante humane immuninterferon ekstraheres fra de transformerede mikroorganismer ved 10 hjælp af en proteaseinhibitor, og det resulterende ekstraherede interferon renses under anvendelse af monoklonale antistoffer.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det rekombinante humane immuninterferon har amino syres ekvens en:

15 Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gin Ser Gin Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe

20 Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gin Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gin Val Met

25 Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gin Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gin.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det rekombinante humane immuninterfe-30 ron indeholder en yderligere methioninrest ved amino terminalen. DK 162604 B

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at proteaseinhibitoren er et guanidin-salt.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, 5 kendetegnet ved, at proteaseinhibitoren er guanidin-HCl.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved, at guanidinsaltet er i opløsning.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at de transformede mikroorganismer sus- 10 penderes i en opløsning af guanidin-HCl.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at opløsningens guanidin-HCl-koncentra-I tion er mindst 4M.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7 eller 8, 15 kendetegnet ved, at der anvendes mindst 3 volumen af guanidinsaltopløsningen for hvert gram transformeret mikroorganisme.

10. Farmaceutiske præparater, kendetegnet ved, at de som det aktive stof indeholder humant immuninterferon fremstillet ved fremgangsmåden ifølge et 20 hvilket som helst af kravene 1-9 og en inert farmaceutisk acceptabel bærer.

10. Rubinstein, S., Familletti, P.C., og Pestka, S., J. Virol. 37, 1981, s. 755-758.

11. Anvendelsen af humant interferon fremstillet ved fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9 som terapeutisk middel.