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JPH0740925B2 - 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド - Google Patents

新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド

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Publication number
JPH0740925B2
JPH0740925B2 JP58042042A JP4204283A JPH0740925B2 JP H0740925 B2 JPH0740925 B2 JP H0740925B2 JP 58042042 A JP58042042 A JP 58042042A JP 4204283 A JP4204283 A JP 4204283A JP H0740925 B2 JPH0740925 B2 JP H0740925B2
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JP
Japan
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lys
ser
dna
leu
phe
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Expired - Lifetime
Application number
JP58042042A
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English (en)
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JPS59167596A (ja
Inventor
菁莪 伊藤
達也 西
維紹 谷口
晴夫 菅野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Japanese Foundation for Cancer Research
Original Assignee
Japanese Foundation for Cancer Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26381690&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH0740925(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
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Priority to AU25619/84A priority patent/AU2561984A/en
Priority to ES530597A priority patent/ES530597A0/es
Publication of JPS59167596A publication Critical patent/JPS59167596A/ja
Priority to JP4207840A priority patent/JPH05320200A/ja
Publication of JPH0740925B2 publication Critical patent/JPH0740925B2/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なヒトインターフェロン−γポリペプチ
ド、該ポリペプチドをコードするDNA断片を組み込んだ
組換え体プラスミドおよび該プラスミドを含む微生物を
用いるヒトインターフェロン−γポリペプチドの製造法
に関する。
インターフェロン（以下IFNと略記する）は、大別してI
FN−α,IFN−βおよびIFN−γの３種類が知られてお
り、主としてIFN−αは白血球細胞,IFN−βは線維芽細
胞,IFN−γはＴ−リンパ球により生産される。これらの
IFNは抗ウイルス作用のみならず、ナチュラルキラー細
胞やマクロファージの活性化作用，抗腫瘍作用など多く
の生物活性を示す物質として注目を集めている。しかし
ながら、白血球、培養細胞から分離する従来の方法で
は、十分な量を供給することが困難であった。
近年急速に発展している組換えDNA技術はIFNのように高
等生物の細胞では生産量が少なく分離が困難な物質を微
生物で大量に生産することを可能にした。例えば、IFN
−βとIFN−αに関しては、それぞれのmRNAが細胞より
抽出され、これに相補的なDNA（cDNA）が酵素的に合成
され、二重鎖DNAとして適当なプラスミドに挿入され
て、大腸菌にクローン化されている〔谷口ら:Proc.Jap.
Acad.,55（Ｂ）,464〜469（1979）；長田ら:Nature 28
4,316−320（1980）〕。
IFN−γに関しては、動物細胞実験において他のIFNより
強い細胞増殖阻止作用を有することが示され〔B.Y.Rubi
n and S.L.Gupta:Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,77,5928−2
932（1980）〕、最近、IFN−γDNAの１つを大腸菌にク
ローン化し、その塩基配列を決めたことが報告されてい
る〔P.W.Grayら:Nature295,503（1982）〕 本発明者らは、組換えDNA技術を用い、ヒトIFN−γポリ
ペプチドを大量に供給するために研究を重ねた結果、上
記既知のIFN−γとは異なる塩基配列を有する新規なIFN
−γDNAを組み込んだ組換え体を用いることにより、微
生物とくに大腸菌で該IFN−γDNAが発現することを見出
し本発明を完成するに至った。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明は、新規なヒトIFN−γDNAを組み込んだ組換え体
プラスミド，該プラスミドを含む微生物、該微生物を用
いる新規なヒトIFN−γポリペプチドの製造法ならびに
該ヒトIFN−γポリペプチド自体を提供することを目的
とする。
本発明の組換え体プラスミドの造成は以下のとおりに行
なう。
新規ヒトIFN−γDNAとしては、本発明者らによってクロ
ーン化されたpIFNγ−G4を用いることができる。pIFNγ
−G4は大腸菌に挿入され、ATCC39123として米国アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されて
いる。
pIFNγ−G4中のIFN−γDNAはマキサム・ギルバート法
〔Proc.Natl.Acad.Sci.,74,560（1977）〕により決定さ
れた第３図に示す塩基配列を有している。
pIFNγ−G4中のヒトIFN−γcDNAを公知のIFN−γDNA
〔P.W.Grayら:Nature 295,503（1982）〕と比較すると
成熟ヒトIFN−γポリペプチドのＮ末端より９番目のア
ミノ酸（リジン）をコードしている最初の塩基であるア
デニン〔Gray et.al.,Nature 295,503（1982）〕がpIFN
−γG4cDNAにおいては対応塩基がシトシンとなっている
ので、このような遺伝子がコードするヒトIFN−γポリ
ペプチドのＮ末端より９番目のアミノ酸はリジンではな
くグルタミンに置換ることになる。従ってpIFNγ−G4は
新規なヒトIFN−γポリペプチドをコードしていること
は明白である。
さらに、pIFNγ−G4は25番目の塩基がＣであるため、制
限酵素Rsa Iに体する制限部位を有する。すなわち、pIF
Nγ−G4の５′末端から22〜25番目にGTACなる塩基配列
があり、Rsa Iは矢印で示した部位（GT↓AC）で、DNAを
切断する。
公知のIFN−γ遺伝子のなかで、IFN−γポリペプチドを
コードするDNA領域にRsa I部位を有するものは知られて
いないので、pIFNγ−G4は新規なヒトIFN−γポリペプ
チドをコードするDNAを含む。従ってpIFNγ−G4を用い
て造成した組換え体プラスミドはすべて新規な組換え体
である。
IFN−γDNAを組み込むプラスミドとしては、大腸菌中で
該DNAが発現できるものならどのプラスミドでも使うこ
とができる。好ましくは、適当なプロモーター、例えば
trp系,lac系のプロモーターの下流に外来DNAを挿入する
ことができ、しかもシャイン−ダルガノ配列（以下SD配
列と略記する）と開始コドン（ATG）の間を適当な距
離、たとえば６〜18塩基対に調節したプラスミドを用い
ることができる。具体的に好的なプラスミドとしては、
本発明者らによって造成されたpKYP−10,pKYP−11,pKYP
−12〔特願昭56−213193（特開昭58−110600）〕などが
あげられる。これら発現ベクターの製造法は参考例１に
示すが、これらはいずれもトリプトファン・プロモータ
ー（以下Ptrpと略記する）を有する発現ベクターであ
る。
第１図に示したようにして、pKYP−11とpIFNγ−G4から
組換え体プラスミドpGC−７を得る。すなわち、pKYP−1
1のHind III,BamH I部位に、Pvu IIおよびHind IIIで消
化し低融点ゲル電気泳動法〔L.Wieslander,Analytical
Biochemistry 98,305（1979）〕で精製したpIFNγ−G4
の断片を挿入し、組換え体プラスミドpGC−７を得る。
ついで、第２図に示すように、pGC−７をBstN IおよびS
al Iで切断し、IFN−γDNAを低融点ゲル電気泳動法で精
製し、合成DNAを介してPtrpを有する発現ベクターpKYP
−10のHInd III,Sal I部位にクローン換化し、組換え体
プラスミドpGKA−２を得る。
本発明のIFN−γポリペプチドは以下のとおりに製造で
きる。
すなわち、pGKA−２を用いて大腸菌Ｋ−12HB101〔S.N.C
ohenら:Proc.Natl.Acad.Sci.,69,2110（1972）〕を形質
転換させ、アンピシリン耐性ApR以下同じ）のコロニー
の中からpGKA−２を有する大腸菌を選び出す。pGKA−２
を有する大腸菌を培地に培養することにより培養物中に
IFN−γポリペプチドを生成させることができる。
ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにIFN−
γポリペプチドの生産に好適なものならば合成培地，天
然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース，フラクトース，ラクトー
ス，グリセロール，マンニトール，ソルビトールなど
が、 窒素源としては、NH4Cl,（NH4）2SO4,カザミノ酸，酵母
エキス，ポリペプトン，肉エキス、バクトトリプトン，
コーン・スティープ・リカーなどが、 その他の栄養源としては、NH2HPO4,K2HPO4,KH2PO4,NaC
l,MgSO4,VitB1,MgCl2などが使用できる。
培養はpH5.5−8.5,温度18−40℃で通気撹拌培養により
行なわれる。
培養 ５〜90時間で培養菌体中にヒトIFN−γポリペプ
チドが蓄積するので、培養物から菌体を集菌し、菌体を
リゾチーム処理後、凍結、融解を繰返して菌体を破砕
し、遠心して得られる上清から通常のポリペプチドの抽
出方法に従ってポリペプチドを採取する。
ヒトIFN−γの定量はアームストロングの方法〔J.A.Arm
strongら:Appl.Microbiol.21,723−725（1971）〕に従
って行なう。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例1. 発現ベクターｐ−KYP−11へのヒトIFN−γDNAの組み込
み： プラスミドpIFNγ−G4〔3.6キロベース（以下キロベー
スをKbと略記する）〕６μｇを20mMトリス塩酸（pH7.
5）、10mM MgCl2 10mMジチオスレイトールおよび50mM N
aClを含む全量50μの溶液に溶かし、制限酵素Pvu II
（宝酒造社製、以下制限酵素については特記しない限り
すべて宝酒造社製）12単位とHind III 12単位を加え、3
7℃で４時間消化反応を行なった。反応液を65℃、７分
間加熱処理して酵素を失活させ、低融点アガロースゲル
電気泳動法にて精製し、1.3KbのヒトIFN−γDNAを含むD
NA断片1.2μｇを得た。
別にpKYP−11の４μｇを20mMトリス−塩酸（pH7.5）、1
0mM MgCl2、10mMジチオスレイトールおよび50mM NaClを
含む全量40μの溶液に溶かし、BamH Iを８単位加え、
37℃で３時間消化反応を行なった。反応液を65℃、５分
間加熱して酵素を失活させた。これにdATP、dCTP、dGT
P、dTTPを各々30μＭになるように加え、さらに８単位
の大腸菌DNAポリメラーゼＩ（Klenow断片、New England
Biolabs社製、１μ）を加えて15℃で１時間埋め込み
（fill in）反応させた。DNAポリメラーゼＩを失活させ
るため68℃で15分間加熱処理後、Hind III 10単位を加
え37℃でさらに３時間消化反応してから、再び65℃で５
分間加熱し、Hind IIIを失活させた。このようにして得
たプラスミドpKYP−11の消化反応液より低融点アガロー
スゲル電気泳動法にて精製し、Ptrpを含む約4.7KbのDNA
断片約2.5μｇを得た。
ヒトIFN−γDNAを含むDNA断片（1.3Kb）0.5μｇとプラ
スミドpKYP−11より得たPtrpを含む約4.7KbのDNA断片1.
0μｇを20mMトリス−HCl（pH7.5）、6mM MgCl2、5mMジ
チオスレイトールおよび500μMATPを含む溶液20μに
溶かし、T4DNAリガーゼ（New England Biolabs社製）４
単位を加え、４℃で18時間結合反応を行なった得られた
組換え体プラスミドの混合物を用いて常法通り大腸菌HB
101株を形質転換し、ApRのコロニーを得た。このコロニ
ーの培養液よりプラスミドを分離し、第１図に示したpG
C−７を得た。pGC−７の構造は、Hind III、BamH I、Hp
a I、Sal I、EcoR IおよびCla Iで消化後、アガロース
ゲル電気泳動により確認した。PGC−７を含む大腸菌菌
株は工業技術院微生物工業技術研究所（以下微工研と略
記する）にEscherichia coli IGC−７（FERM BP−49
7）として寄託されている。
実施例2. 組換え体プラスミドpGKA−２の造成： 実施例１により得られたpGC−7DNA6μｇを20mMトリス−
HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトールお
よび10mM NaClを含む全量50μの溶液に溶かし、制限
酵素BstN I（New England Biolabs社製）12単位を加
え、60℃で３時間反応させた。次いでNaClを150mMとな
るように加え、Sal I 8単位を加えて37℃でさらに３時
間消化反応を行なった。再び65℃で５分間加熱してSal
Iを失活させ、低融点アガロースゲル電気泳動法にて精
製し、ヒトIFN−γDNAの大部分を含む約1125塩基対（以
下bpと略記する）のDNA断片約0.8μｇを得た。
別にpKYP−10の３μｇを20mMトリス−HCl（pH7.5）、10
mM MgCl2、10mMジチオスレイトールおよび100mM NaClを
含む全量40μの溶液に溶かし、制限酵素Hind IIIとSa
l Iを各々６単位ずつ加え、37℃で３時間消化反応を行
なった。65℃で５分間加熱してHind IIIとSal Iを失活
させた。この消化反応液を低融点アガロースゲル電気泳
動法にて精製し、Ptrpを含む約4.1KbのDNA断片約1.8μ
ｇを得た。
一方、精製ヒトIFN−γポリペプチドのＮ末端はCysであ
るので、成熟IFN−γDNAを発現させるためには、５′末
端のTGT（Cys）の直前に開始コドン（ATG）を付与する
必要があること、またPtrpの下流のSD−配列とATGとの
距離は、６〜18bpの間の適当な長さが必要であることな
どの理由から、下記のDNAリンカーを合成した。
まず、１本鎖DNA、18−merと15−merを通常のトリエス
テル法〔R.Creaら:Proc.Natl.Acad.Sci.,75,5765（197
8）〕により合成した。18−merおよび15−merの各々２
μｇを50mMトリス−HCl（pH7.5）、10mM MgCl2、5mMジ
チオスレイトール、0.1mM EDTAおよび1mM ATPを含む全
量20μの溶液に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ
30単位（ベーリンガー・マンハイム社製）を加えて、37
℃で60分間リン酸化反応を行なった。
リン酸化した18−merと15−merを２μｇずつ混合し、70
℃で５分間加熱後室温に放置してアニーリングを行なう
ことにより上記構造を有するDNAリンカーを得た。
上記で得たpGC−７由来のBstN I−Sal I断片（1125bp）
0.4μｇと発現ベクターpKYP−10をHind IIIとSal Iで消
化して得たDNA断片（4.1Kb）1.0μｇを20mMトリス−HCl
（pH7.5）、6mM MgCl2、5mMジチオスレイトールおよび5
00μMATPを含む全量25μを溶液に溶かし、この混合溶
液に上記DNAリンカーを約0.1μｇ加えた。この混合液に
さらにT4DNAリガーゼ６単位を加え、４℃で17時間結合
反応を行なった。得られた組換え体プラスミドの混合物
を用いて、常法通り、大腸菌HB101を形質転換し、ApRの
コロニーを得た。このコロニーの培養液よりプラスミド
を分離し、第２図に示したpGKA−２を得た。pGKA−２の
構造は、EcoR I、Cla I、Hind III、BstN I、Sal Iで消
化後、アガロースゲル電気泳動により確認した。プラス
ミドpGKA−２のSD−配列（AAGG）から開始コドン（AT
G）までの塩基配列は AAGGGTATCGATAAGCTTATG であることを、マキサム・ギルバートの方法〔A.M.Maxa
mら:Proc.Natl.Acad.Sci.,74,560（1977）〕で確認し
た。
pGKA−２のヒトIFN−γDNAはRsa I部位を有すること、
このDNAがコードするヒトIFN−γポリペプチドは９番目
のアミノ酸がグルタミン（Gln）である点で公知のもの
とは異なる。
さらに上記で用いた合成DNAは、P.W.Grayらが用いた合
成DNA とは下線の部分で異なる。このようにpGKA−２にはヒト
IFN−γをコードするDNA領域内に〔CCAGG〕なるBstN I
に対する制限酵素部位が存在し、pGKA−２はこの点でも
公知のものと異なる。またSD配列とATG間の距離と構造
は、大腸菌での蛋白質の発現に大きく影響するので重要
であるが、pGKA−２のSD−配列とATG間の塩基配列は公
知の組換え体プラスミドpIFN−γtrp48（P.W.Grayら）
のそれとは明らかに異なるものである。
pGKA−２を含む大腸菌は微工研にEscherichia coli IGK
A−２（FERM BP−496）として寄託されている。
実施例３ Escherichia coli IGC−７および同IGKA−２によるイン
ターフェロンの生産： 実施例１〜２で得た組換え体プラスミドpGC−７およびp
GKA−２をもつ大腸菌HB101株（それぞれIGC−7,IGKA−
２）をLG培地〔トリプトン10g、酵母エキス5g、NaCl5
g、グルコース2gを水１にとかしNaOHにてpHを7.0とす
る。〕で37℃、18時間培養し、この培養液0.2mlを10ml
のMCG培地〔Na2HPO4 0.6％、KH2PO4 0.3％、NaCl 0.5
％、NH4Cl 0.1％、グルコース0.5％、カザミノ酸0.5
％、MgSO4 1mM、ビタミンB1 4μg/mlpH7.2〕に接種し、
30℃で４〜８時間培養後、トリプトファン遺伝子のイン
デューサーであるインドールアクリル酸（以下IAAと略
す）を10μg/ml加え、さらに２〜12時間培養を設ける。
培養液を8000rpm、10分間遠心して集菌しい、30mM NaC
l、30mM Tris−HCl（pH7.5）緩衝液で洗浄する。洗浄菌
体を上記緩衝液1mlに懸濁し、200μｇのリゾチーム、0.
25M EDTA（エチレンジアミンテトラ酢酸）を５μ加え
て30分間０℃に放置した後、凍結・融解を３回くり返し
て菌体をこわす。これを15,000rpm、30分間遠心して上
清を得、上清中のインターフェロンの量をアームストロ
ングの方法に従って定量する〔アームストロング（J.A.
Armstrong）ら：アプライド・マイクロバイオロジー（A
ppl.Microbiol.）21巻723−725頁（1971）〕〔但し、ウ
イルスとしてはSindvis virus,動物細胞としてはヒト羊
膜細胞由来のエフエル・セル（FL cell）を用いた。〕 結果を第１表に示す。
参考例１ trpプロモーターを有するプラスミドベクタ
ーの造成： （ａ） トリプトファン形質導入ファージDNAの精製 λptrpファージであるλcI857trpED10〔以下、λtrpED
と略すG.F.Miazzariら:J.Bacteriol.133巻、1457頁（19
78）〕を大腸菌JA194株〔F-,λ-,▲ｒ- K▼，▲ｍ- K▼，
ΔtrpE5,leu6,J.CarbonらRecombinant Molecules p.355
（1977）Ravenpress〕に溶原化させることによって得ら
れる菌株、JA194（λtrpED）を42℃で30分培養すること
によってλtrpEDファージを誘発し、ファージ溶菌液を
調製する。このファージ液より塩化セシウム平衡密度勾
配遠心法〔山川ら「核酸の化学Ｉ」東京化学同人社p.54
−61、1974〕によってλファージを精製する。
次いでこのλファージより、山川らの方法〔核酸の化学
I.東京化学同人社、p62−65、1974〕に従いフェノール
処理とクロロホルム処理をして精製する。
（ｂ） trpプロモーターのプラスミドへのクローニン
グ λtrpEDファージDNAからtrpオペロンのクローン化は以
下のごとく行う。
すなわち、８μｇのλtrpED DNAを20mMトリス−HCl（pH
7.5）、75mM NaCl、10mM MgCl2、5mMジチオスレイトー
ル中て16単位のEcoR Iと16単位のHind IIIを加えて37
℃、２時間消化する。一方プラスミドpBR325DNA 1μｇ
も同様に２単位のEcoR Iと２単位のHind IIIで消化する
（最終容量30μ）。次いで、65℃、５分間加熱処理し
て反応を停止し、それぞれの消化したDNA溶液15μず
つを混合し、終濃度500μＭのATPと、T4 DNAリガーゼ５
単位（New England Biolab社製）を加え４℃18時間結合
反応を行なう。このようにしてえられるプラスミドの混
合物を用い大腸菌C600SF株〔キヤメロンら：プロシーデ
イングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス72巻、3416頁（1975年）〕を公知の方法〔S.
N.コーエンら：プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス69巻2110頁（1972
年）〕に従つて形質転換し、アンピシリン耐性
（Ap R）、テトラサイクリン耐性（Tc R）およびクロラム
フェニコール感受性（Cm S）を有する形質転換株を得
る。このようにして得られる大腸菌の形質転換株よりプ
ラスミドDNAを分離し、制限酵素EcoR I、Hind III、Hpa
Iで切断した結果、第４図（Ａ）に示す構造をもつこと
を確認し、pKYP−１と命名した。
トリプトファンプロモーターの下流にあるSD配列（AAG
G）の４塩基下流に制限酵素Taq Iで切断される部位があ
る。この事実を利用し、上記のプラスミドpKYP−１より
Taq IとEcoR Iで消化しトリプトファンプロモーターとS
D配列を含む2.6Kb（キロベース：以下同じ）のDNA断片
をアガロースゲル電気泳動法により精製する。この2.6K
bのDNA断片を第５図に示した方法により既知ベクターで
あるpBR322にクローン化する。すなわち、８μｇのpBR3
22に２単位のTaq Iを加え、10mM Tris−HCl（pH8.4）、
6mM MgCl2、100mM NaCl、6mM 2−メルカプトエタノール
を含む全量100μの反応液中45℃で60分、反応させ
る。Taq Iによる部分消化後、低融点アガロース・ゲル
電気泳動法〔L.ウイスランダー（Lars Wieslander）：
アナリテイカル・バイオケミストリー98巻305頁（1979
年）〕により4.36KbのDNA断片を精製し、さらにこのDNA
（約1.5μｇ）を３単位のEcoR Iを加えて、37℃、３時
間反応させて完全に消化した後、上と同様に低融点アガ
ロース・ゲル電気泳動により、約4.33KbのDNA断片（約
1.0μｇ）を得る。
次に12μｇのpKYP−1 DNAを上と同様に３単位のTaq Iを
加えて部分消化し、低融点アガロース・ゲル電気泳動法
で8.5KbのDNA断片（約２μｇ）を精製し、さらにこのDN
AをEcoR Iで完全消化することにより、2.6KbのDNA断
片、約0.5μｇを精製する。このようにして得たpBR322
の4.33Kb DNA（0.4μｇ）とpKYP−１の2.6Kb DNA断片
（0.25μｇ）を20mM Tris−HCl（pH7.6）、10mM MgC
l2、10mMジチオスレイトールを含む全量20μの反応液
中で、0.5mMのATPとT4DNAリガーゼ４単位を加え、４℃
で18時間、結合反応を行なう。このようにして得られる
組みかえプラスミドDNAを用い、大腸菌C600SF8株を形質
転換し、得られるApR,TcRの形質転換株がもつプラスミ
ドを分離精製する。このプラスミドDNAを６種の制限酵
素、EcoR I、Hind II、Cla I（ベーリンガー・マンハイ
ム社製）、Hpa I、Hinc II、BamH Iによって消化して、
プラスミドの構造解析を行なった結果、第４図（Ｂ）に
示した構造をもつこことを確認し、これをpKYP−５と命
名した。
（ｃ） trpプロモーターのポータブル化 上記のプラスミドベクターpKYP−５はSD配列の下流（１
〜20塩基以内）にCla I部位とHind III部位を有するの
でDNA導入ベクターとして充分使用可能である。しか
し、pKYP−5 DNA中にSD配列の直後のCla I部位以外にも
う１ケ所Cla I部位があること、およびpKYP−5 DNAから
EcoR IとHind IIIで切り出したtrp−プロモーターを含
む断片が2.65Kbとやゝ大きいのでより使いやすいように
するため第６図のようにしてさらに小さいトリプトファ
ンプロモーターを含むDNA断片を有するプラスミドを造
成する。すなわちpKYP−5 DNAをHpa IIとHind IIIで消
化して約340bp（ベースペアー）のDNA断片を精製し、こ
れをCla IとHind IIIで消化したpBR322に第６図のよう
に挿入し、pKYP−10を得る。pKYP−10の構造は制限酵素
EcoR I、Cla I、Hind III、Hpa Iで消化した後、アガロ
ースゲル電気泳動で確認する。
（ｄ） ２個以上のtrpプロモーターの連結 次にさらに強いプロモーター活性を有するプラスミドベ
クターの造成を目指して、trpプロモーターを２個連結
することを試みる。すなわち、第７図（Ａ）に示したよ
うに前項（ｃ）でのべたtrpプロモーターを含む約340bp
のDNA断片をCla IとHind IIIで消化したpKYP−10に挿入
し、pKYP−11を得る。同様の方法でtrpプロモーター３
個を同一方向に連結したpKYP−12〔第７図（Ｂ）〕も造
成し、EcoR I、Cla I、Hind III、Hpa Iで消化し構造を
確認する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドpGC−７の造成のフロー・シート
を示す。 第２図は、プラスミドpGKA−２の造成のフロー・シート
を示す。 第３図は、プラスミドpGKA−２中のヒトIFN−γDNA近傍
の塩基配列を示す。 第４図（Ａ）は、プラスミドpKYP−１の構造を、（Ｂ）
はpKYP−５の構造を示す。 第５図は、pKYP−５の造成のフロー・シートを示す。 第６図は、pKYP−10の造成のフロー・シートを示す。 第７図（Ａ）は、pKYP−11の造成のフロー・シートを、
（Ｂ）はpKYP−12の構造を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭60−126299（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．295（1982．２. 11）Ｐ．503−508 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ，ｖｏｌ．10，ｎｏ．12（1982) Ｐ．3605−3611

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列を有するヒトインター
    フェロン−γポリペプチドをコードするDNA断片がベク
    ターpKYP−10のトリプトファンプロモーターの下流に組
    み込まれた組換え体プラスミドを含むエシェリシア・コ
    リ（Escherichia coli）。 CYS TYR CYS GLN ASP PRO TYR VAL GLN GLU ALA GLU ASN LEU LYS LYS TYR PHE ASN ALA GLY HIS SER ASP VAL ALA ASP ASN GLY THR LEU PHE LEU GLY ILE LEU LYS ASN TRP LYS GLU GLU SER ASP ARG LYS ILE MET GLN SER GLN ILE VAL SER PHE TYR PHE LYS LEU PHE LYS ASN PHE LYS ASP ASP GLN SER ILE GLN LYS SER VAL GLU THR ILE LYS GLU ASP MET ASN VAL LYS PHE PHE ASN SER ASN LYS LYS LYS ARG ASP ASP PHE GLU LYS LEU THR ASN TYR SER VAL THR ASP LEU ASN VAL GLN ARG LYS ALA ILE HIS GLU LEU ILE GLN VAL MET ALA GLU LEU SER PRO ALA ALA LYS THR GLY LYS ARG LYS ARG SER GLN MET LEU PHE ARG GLY ARG ARG ALA SER GLN
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5582824A (en) * 1981-10-19 1996-12-10 Genentech, Inc. Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
ZA846554B (en) * 1983-09-20 1985-04-24 Hoffmann La Roche Immune interferon and method for its purification
US4855238A (en) * 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
MX9203641A (es) * 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
JP2003513681A (ja) 1999-11-12 2003-04-15 マキシゲン・ホールディングス・リミテッド インターフェロンガンマ・コンジュゲート
CN1309423C (zh) 1999-11-12 2007-04-11 马克西根控股公司 干扰素γ偶联物
US7038015B2 (en) 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
US7524931B2 (en) 2002-07-03 2009-04-28 Maxygen Holdings Ltd. Full-length interferon gamma polypeptide variants
WO2014168064A1 (ja) 2013-04-10 2014-10-16 国立大学法人浜松医科大学 Ｌｉｘ１ｌ高発現腫瘍細胞の増殖阻害方法、及び腫瘍細胞増殖抑制ペプチド

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL65475A0 (en) * 1981-04-17 1982-07-30 Meloy Lab Production of immune interferon and its mrna
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
JPS58110548A (ja) * 1981-12-24 1983-07-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチド
JPS58110600A (ja) * 1981-12-25 1983-07-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒトβ型インタ−フエロン遺伝子を含む組みかえ体プラスミド
EP0088540A3 (en) * 1982-02-22 1984-10-17 Biogen, Inc. Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides
IL68100A0 (en) * 1982-03-24 1983-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Novel dna and use thereof
JPH0787797B2 (ja) * 1982-05-20 1995-09-27 サントリー株式会社 ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法
US4582800A (en) * 1982-07-12 1986-04-15 Hoffmann-La Roche Inc. Novel vectors and method for controlling interferon expression
IL69851A0 (en) * 1982-09-30 1983-12-30 Japan Found Cancer Novel dna and recombinant plasmid containing the same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．２９５（１９８２．２．１１）Ｐ．５０３−５０８
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．１０，ｎｏ．１２（１９８２）Ｐ．３６０５−３６１１

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