DK161887B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af en r-isomer af en 3-aryloxy-3-phenylpropylamin og farmaceutisk accetable salte heraf - Google Patents

Description

DK 1 6 1 887 B

Opfindelsen angår en analogi fremgangsmåde til fremstilling af en hidtil ukendt R-isomer af en 3-aryloxy-3-phenylpropylamin og farmaceutisk acceptable salte heraf, hvilken isomer har vist sig at være specielt effektiv som antidepressivt middel.

5 I USA patentskrift nr. 4 018 895 anføres det, at 3-aryloxy-3-phenylpropylaminer udviser antidepressive egenskaber. Faktisk omtales den racemiske form af forbindelserne ifølge opfindelsen i det ovennævnte ^ USA patentskrift. I Biochem Pharm, 25_, 1979 - 183 (1976) diskuteres aktiviteten af et andet racemat fra det ovennævnte USA patentskrift, nærmere bestemt \-methyl-3-(2-methoxyphenoxy)-3-phenylpropylarnin, hy -drochlorid. Som det måtte forventes, har (-)- og (+)-^ enantiomerene af denne forbindelse samme virkning.

Det har imidlertid overraskende vist sig, at (-'-en-antiomeren af N-methyl-3-(2-methylphenoxy)-3-phenyl-propylamin er væsentligt mere aktiv end (+)-enantio- 20 meren, og den udviser endvidere en mindre grad af an-ticholinerge bivirkninger.

Således er den ifølge opfindelsen fremstillede enantiomer af forbindelsen med formlen 25

A

I II

_ V* /\ f 3Q #s (CHs) CHs (I) 9=^l CHa og dennes farmaceutisk acceptable salte særdeles effektive antidepressive midler.

35

DK 161887B

2

Det har nu vist sig, at (-)-enantiomeren med formlen I udviser absolut R-stereokemi.

Betegnelsen "farmaceutisk acceptable salte" omfatter sådanne syreadditionssalte, som ikke er toxiske eller 5 på anden måde er farmakologisk uacceptable. Sådanne salte omfatter eksempelvis hydrochlorid, nitrat, phosphat, sulfat, hydrobromid, pyrosulfat, sulfit, metaphosphat, acetat, propionat, caprylat, formiat, phthalat, citrat og lactat.

10 Man foretrækker almindeligvis at anvende forbindelsen med formlen I på saltform, idet man specielt foretrækker hydrochloridet.

der, idet man eksempelvis kan opløse basen i ether og 15 tilsætte en tilnærmelsesvis ækvivalent mængde af en passende syre.

Den omhandlede forbindelse kan fremstilles ved at resolvere det tilsvarende racemat, der eksempelvis er fremstillet som beskrevet i USA patentskrift nr.

20 4 018 895.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes således en fremgangsmåde til fremstilling ‘af (-)-enantiomeren af forbindelsen med den i kravets indledning anførte formel I eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, og 25 fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes L(+)-mandelsyre. De foretrukne stærke baser er hydroxider af metaller fra gruppe ja, såsom natrium- eller kalium-30 3

DK 161887 B

hydroxid eller ammoniumhydroxid.

Resolutionen bør gennemføres i et inert organisk opløsningsmiddel, fortrinsvis i et ikke-polært eller moderat polært opløsningsmiddel, således som det vil 5 blive nærmere uddybet i det følgende. Det foretrækkes, at resolutionen gennemføres ved, at man først opløser racematet med formlen I i et opløsningsmiddel, såsom en ether, f. eks. tetrahydrofuran, dioxan, dimethoxy-ethan eller diethylether, en alkohol, f. eks. cyclohe-10 xanol, ethanol eller butanol, en alkan, f. eks. pen- tan, hexan eller octan, en ester såsom ethylacetat, methylacetat, ethylbutyrat eller methylbenzoat, en halogenalkan såsom dichlormethan, chloroform eller 1,2-dibromethan eller et aromatisk carbonhydrid, f. eks.

15 benzen, toluen, ethylbenzen eller xylen. Det foretræk kes, at man anvender ethere som opløsningsmidler, i særdeleshed diethylether. Til opløsningen af racematet sættes en opløsning eller suspension af den optisk aktive syre i et passende organisk opløsningsmiddel eller 20 suspensionsmedium såsom benzen, toluen eller xylen, fortrinsvis toluen. Reaktionsblandingen omrøres derefter ved en temperatur i området fra omkring 0 °C til 100 °C, fortrinsvis 0 til 50 °C, idet man specielt foretrækker omgivelsestemperaturen, og herved bundfælder det ønskede salt. Det rå salt underkastes fortrinsvis en del-25 vis rensning ved omkrystallisation.

Det foretrækkes, at det rå produkt opløses i en blanding af dichlormethan og ethylacetat, hvorefter det udfældes ved afdestillation af dichlormethanen indtil krystaldannelse, hvorpå der tilsættes diethylether 50 til fuldstændig krystallisation. Derefter opløser man mandelsyresaltet i vand og omdanner det til den fri base ved at gøre det basisk. Man foretrækker at isolere produktet ved at ekstrahere det fra den vandige opløs-

DK 16188 7 B

4 ning, f. eks. ved hjælp af en ether, og danne det ønskede salt, hvis man ønsker et sådant, i etheropløs-ningen.

— ........D.en foretrukne mængde ( + )-mandelsyre er et halvt mol pr.

5 mol racemat, men mængder på mellem ca. et halvt mol og ca. 1 mol kan anvendes. Anvendelse af syremængder på over 1 mol er økonomisk ufordelagtigt.

Den foretrukne fremgangsmåde til fremstilling af race-matet med formlen I omfatter en demethylering af det 10 tilsvarende dimethylamino-derivat med formlen / Λ\\ /CHs \0/-T(C^-\h5 iC) fCri= v hvilken fremgangsmåde ligeledes er beskrevet i USA patentskrift nr. 4 018 895. Det vil være velkendt for fagmanden, at der findes· et start antal metoder, ved hvilke denne demethylering kan gennemføres. Imidlertid har 15 det vist sig, at denne demethylering med fordel kan gen nemføres ved at erstatte en af N-methylgrupperne med en phenoxyformylgruppe ved omsætning med phenylchlor-formiat og derefter fjerne denne gruppe ved hydrolyse med en vandig base såsom natriumhydroxid. Denne demethy-20 leringsreaktion kan gennemføres ved temperaturer på mellem 50 og 150 °C.

De efterfølgende præparationer og eksempler demonstrerer yderligere fremstillingen af de omhandlede forbindelser med formlen I.

DK 161887 B

5

Præparation 1

Methyl-[3-(2-methylphenoxy)-3-phenylpropyl]-carbamid-syrephenylester___________

En opløsning af 192 g (0,741 Μ) N,N-dimethyl-y -5 (2-methylphenoxy)benzenpropanamin i 500 ml toluen blev op varmet under tilbagesvaling, hvorefter der dråbevis i løbet af 45 minutter blev tilsat 123 g (0,785 M) phenylchlorformiat. Tilsætningshastigheden af phenyl-chlorformiat blev indstillet således, at man opnåede 10 en regelmæssig tilbagesvalingshastighed, samtidig med, at skumningen af reaktionsopløsningen som følge af dannelse af methylenchlorid blev begrænset. Efter fuldstændig tilsætning af phenylchlorformiat blev reaktions-blandingen opvarmet under tilbagesvaling i 1 time, hvor-15 efter den blev omrørt ved omgivelsestemperatur i 16 timer.

Derefter blev reaktionsblandingen fortyndet med methylenchlorid (1 liter), og den organiske fase blev vasket med en 10% natriumhydroxidopløsning, med en mættet natrium-20 chloridopløsning, med 1 N saltsyre og endelig med en mæt tet natriumchloridopløsning. Den oprindelige basiske vandige fase blev genekstraheret med methylenchlorid og derefter vasket med 1 N saltsyre og derefter med en mættet natriumchloridopløsning.

25 De kombinerede organiske ekstrakter blev tørret ved omrøring over vandfrit natriumsulfat, hvorefter de blev koncentreret i vakuum. Titelforbindelsen blev krystalliseret ved triturering med hexan og derefter omkrystalliseret ved opløsning af krystallerne i diethyl-30 ether (begrænset opløselighed) og methylenchlorid (høj opløselighed), hvorefter man tilsatte hexan under samtidig afdestillering af de mere flygtige opløsnings- 6

DK 161887B

midler, hvorved volumenet koncentreredes til omkring 1 liter.

Det racemiske produkt blev opsamlet og tørret, og det ______ havde en vægt på 228 g (85¾ udbytte) og et smelte- 5 punkt på 72 - 76 °C.

Præparation 2 N-Methyl-3-(2-methylphenoxy)-3-phenylpropylamin, hydro-chlorid__

Til en opløsning af 210 g (0,54 M) methyl-[3-(2-methyl-10 phenoxy)-3-phenylpropy1 ]-carbamidsyrephenylester i 890 ml propylenglycol sattes på en gang en opløsning af 214 g (5,35 M) natriumhydroxid i 890 ml vand. Den resulterende opløsning blev omrørt og opvarmet under tilbagesvaling i 20 timer (ved en reaktionstemperatur på omkring 110 °C).

15 Derefter blev opløsningen afkølet til 25 °C, der til sattes 2500 ml vand, og opløsningen blev ekstraheret med toluen (3 x 400 ml). De kombinerede toluenekstrakter blev tørret over vandfrit magnesiumsulfat og koncentreret i vakuum til en gummi.

20 Det gummiagtige koncentrat blev opløst i 1 liter to luen, og den resulterende opløsning blev behandlet med gasformigt hydrogenchlorid, indtil den reagerede surt. Opløsningens surhedsgrad blev kontrolleret ved at udtage en prøve, tilsætte vand og måle pH-værdien 25 af den vandige fase.

Der konstateredes ikke noget bundfald af titelforbindelsen, og man koncentrerede derfor toluenopløsningen

DK 161887 B

7 til tørhed i vakuum. Den viskose inddampningsrest blev tritureret med ether, indtil den var krystallinsk, hvorefter den blev opsamlet og vasket med ether. Titel-forbindelsen blev omkrystalliseret fra methylenchlo-5 rid og ethylacetat ved bortdestillation af methylen- chloridet. Det opnåede produkt vejede 135 g (85?ί udbytte), og smeltepunktet var 132 - 135 °C. Tyndtlagschromato-grafi på en plade med silicagel og ved anvendelse af chloroform, methanol og koncentreret ammoniumhydroxid 10 (50:1:0,0) viste en enkelt plet.

Analyse beregnet for 0^^^1^2^001: C 69,77, H 7,60, N 4,80 Fundet: C 69,68, H 7,34, N 4,64.

EKSEMPEL 1 (-)-N-Methyl-3-(2-methylphenoxy)-3-phenylpropylamin, 15 hydrochlorid_

En opløsning af 469 g racemisk N-methyl-3-(2-methyl-phenoxy )-3-phenylpropylamin, hydrochlorid i 1500 ml vand blev gjort basisk med natriumcarbonat, hvorefter den blev ekstraheret 2 gange med 1 liter diethylether.

20 Etherekstrakterne blev kombineret, vasket med vand og tørret over vandfrit magnesiumsulfat. Til den tørre opløsning sattes 122 g L(+)-mandelsyre i 2 liter toluen, og blandingen blev omrørt ved omgivelsestemperatur i 112 timer. Derefter blev blandingen filtreret 25 og de faste stoffer blev vasket med diethylether til opnåelse af 167 g af mandelsyresaltet af (-)-N-methyl-3- (2-methylphenoxy)-3-phenylpropylamin. Produktet blev om-krystalliseret fra 2 liter af en blanding (1:1 efter volumen) af dichlormethan og ethylacetat, idet man bortkogte dichlormethanen, indtil udfældningen begynd-30 te, hvorefter man fortyndede blandingen med 1 liter diethylether. Det resulterende rensede mellemprodukt 8

DK 16188 7 B

vejede 148 g.

748 g af mandelsyresaltet, fremstillet ved gentagne præparationer som illustreret ovenfor, blev opløst i _______..... 1. liter methanol, og opløsningen blev fortyndet med 1 5 liter vand, der havde omgivelsestemperatur. Den resul terende opslæmning blev gjort basisk med en natrium-carbonatopløsning, hvorefter den blev ekstraheret med 2 x 500 ml diethylether og derefter med 2x1 liter ethylacetat. De organiske faser blev kombineret, og 10 blandingen blev vasket med mættet vandig natriumchlo- rid og derefter tørret over natriumsulfat og magnesiumsulfat. Derpå blæstes gasformig hydrogenchlorid igennem opløsningen til udfældning af det ønskede produkt i form af et hydrochloridsalt. Det faste stof blev op-15 samlet ved filtrering og tørret til opnåelse af 510 g (-)-N-methyl-3-(2-methylphenoxy)-3-phenylpropylamin, hydrochlorid. Produktet blev renset ved opløsning i 200 ml dichlormethan efterfulgt af en tørring over magnesiumsulfat . Den tørre opløsning blev filtreret og 20 derefter fortyndet med ethylacetat- Blandingen blev op varmet med henblik på at bortkoge dichlormethanen, og produktet, som herved udkrystalliserede, blev isoleret ved filtrering. Mængden af produktet var 486 g, og det havde et smeltepunkt på 166 - 168 °C. Den optiske 25 rotation, målt som en opløsning (10 mg/ml) i methanol, var cip5= -38,1°, a^5 = -177,26°.

EKSEMPEL 2 (-)-N-methyl-3-(2-methylphenoxy)-3-phenylpropylamin, hydrochlorid_ 30 800 g racemisk N-methyl-3-(2-methylphenoxy)-3-phenyl- propylamin, hydrochlorid, blev opløst i 2 liter vand og blev gjort basisk med natriumcarbonat. Opløsningen

DK 161887 B

9 blev ekstraheret 2 gange med 2 liter diethylether, og etheropløsningen blev tørret over vandfrit magnesiumsulfat. Til opløsningen sattes en suspension af 209 g L(+)-mandelsyre i 200 ml xylen, og blandingen blev om-5 rørt ved omgivelsestemperatur i 22 timer. Det faste stof blev derefter opsamlet og tørret til opnåelse af 372 g urent (-)-mandelsyresalt med smeltepunkt 126 -128 °C. Det urene salt blev opløst i 4 liter af en blanding af dichlormethan og ethylacetat (1:1 efter volumen), og blandingen blev kogt forsigtigt, indtil IC bundfældningen begyndte. Derefter tilsattes 1,5 liter diethylether, og blandingen afkøledes og filtreredes til opnåelse af 359 g af (-)-mandelsyresaltet med smeltepunkt 128 - 129 °C. Produktet blev på ny omkrystalliseret fra det samme opløsningsmiddelsystem, hvilket gav 326 g meget rent mandelsyresalt med smeltepunkt 128 -15 129 °C.

Det oven for fremstillede rensede salt blev opløst i 2 liter vand, og opløsningen blev gjort basisk med natriumcarbonat. Den basiske opløsning blev ekstraheret 2 gange med 1 liter diethylether, og de organiske faser blev kombineret og tørret over vandfrit 20 natriumsulfat. Derefter blæstes gasformig hydrogenchlo- rid igennem opløsningen under omrøring, indtil opløsningen udviste sur reaktion på pH-papir. Derefter udfældede hydrochloridsaltet, og dette blev opsamlet og omkrystalliseret ved, at man opløste det i 500 ml dichlormethan, tilsatte 1,5 liter ethylacetat og kogte 25 blandingen forsigtigt, indtil udfældningen begyndte.

På dette tidspunkt tilsattes 1 liter diethylether. Blandingen blev derefter afkølet og filtreret, og de faste stoffer blev tørret til opnåelse af 209 g (-)-N-methy1-phenoxy)-3-phenylpropylamin, hydrochlorid , smp. 165 -50 168 °C. Produktet blev omkrystalliseret fra det samme opløsningsmiddelsystem, hvilket gav 180 g meget rent

DK 161887 B

10 (-)-N-methyl-3-(2-methylphenoxy)-3-phenylpropylamin, hydrochloric!, smp. 163 - 167 °C. Den optiske rotation, målt som en opløsning (10 mg/ml) i methanol, var o^5= -37,6°, o^5= -181,3°.

5 .....“ EKSEMPEL 3 (-)-N-methyl-3-(2-methylphenoxy)-3-phenylpropylamin, hydrochlorid__________________ 3,05 g racemisk N-methyl-3-(2-methylphenoxy)-3-phenyl-propylamin, hydrochlorid, blev opløst i 50 ml vand og 1G blev gjort basisk med natriumbicarbonat. Opløsningen blev ekstraheret med 3 x 50 ml diethylether, og de kombinerede organiske faser blev vasket 2 gange med 20 ml vand. Opløsningen blev tørret over magnesiumsulfat og koncentreret under vakuum til et fast stof.' 15 Inddampningsresten blev opløst i 100 ml benzen-, og der tilsattes 1,5 g L(+)-mandelsyre. Opløsningen blev igen omrørt i 64 timer ved 23 °C, og den blev derefter koncentreret under vakuum til et fast stof, hvortil der sattes 100 ml xylen, som opløste inddampningsresten.

20 Opløsningen fik lov at henstå, indtil et bundfald ud skiltes. det faste stof blev opsamlet ved filtrering og omkrystalliseret fra 20 ml xylen. Derefter blev produktet suspenderet i vand og gjort basisk med ammonium-hydroxid til opnåelse af den fri base, som blev efcstra-25 heret med 2 x 20 ml diethylether. De organiske faser blev vasket med 2 x 50 ml vand, tørret over magnesiumsulfat og behandlet med gasformigt hydrogenchlorid til fremstilling af hydrochloridet, som udfældede spontant og blev filtreret fra opløsningen. Produktet blev omkrystalli-30 seret fra 10 ml dichlormethan og 30 ml ethylacetat ved tilsætning af 50 ml diethylether. Der opnåedes 90 mg af det ønskede produkt med smeltepunkt 156 - 157 °C.

Den optiske rotation, målt som beskrevet ovenfor, var

DK 161887 B

11 α£5= -29,3°, «3^5= -146,2°.

Testprocedurer såvel in vivo som in vitro har været anvendt til at bestemme effektiviteten og sikkerheden af den ifølge opfindelsen fremstillede forbindelse (afprø-5 vet som hydrochloridsalt). Det vil forstås, at der er ud viklet en gruppe af biokemiske forsøg, som anvendes til at forudsige antidepressive virkninger. Der kan i denne forbindelse henvises til 2 artikler, nemlig Adolphe et al-, The Neoropharmacology of Depression, Diseases of ID the Nervous System, 841 - 846 (1977) og Spencer, Review ofthe Pharmacology og Existing Antidepressants, Br. J.

Clin. Pharmac. 4^ 57S - 68S (1977). Disse artikler forklarer tydeligt mekanismen ved depression, som optræder, når nervesystemet bliver ude af stand til at overføre 15 impulser imellem neuroner i passende antal og med pas sende hastigheder. En af de væsentligste årsager til depression har vist sig at være en tilstand, hvori der er en utilstrækkelig mængde monoaminer til stede i centralnervesystemet. De mest betydningsfulde af disse aminer 20 er norepinephrin, serotonin og 3,4-di'nydroxyphenyl- ethylamin (dopamin. En klasse af medikamenter, som benævnes monoamin-optagelses-inhibitorer, har vist sig at være virksomme til forbedring af denne tilstand, tilsyneladende ved at inhibere den genoptagelse af ami-25 nerne, som foretages af synapserne, der er de nerve- terminaler, hvorfra aminerne blev frigivet.

Forbindelsen med formlen I tilhører klassen af monoamin-optagelses-inhibitorer, hvilket også gælder for det racemat, hvorfra forbindelsen isoleres, iføl-30 ge USA patentskrift nr. 4 018 895. De i det følgende be skrevne forsøg viser den bemærkelsesværdige effektivitet af forbindelsen med formlen I som monoamin-opta- gelses-inhibitor sammenlignet med racematet, hvorfra den er isoleret, og den tilsvarende (+)-enan- 12

DK 161 887 B

tiomer.

Inhiberingen af monoamin-optagelsen blev målt ved den oven for beskrevne metode in vitro udviklet af Wong og Bymaster. Ued denne metode anvendes hanrotter af stam-5 men Sprague-Dau/ley, som vejede 110 til 150 g. Rotterne blev dræbt ved halshugning, og hele hjerner blev udtaget og dissekeret. Rå præparater af synaptosomer blev fremstillet fra 10¾ homogenater af specifikke områder af hjernen i 0,32 M saccharose og 10 mM glucose ved differen-10 tial centrifugering, svarende til metoden beskrevet af

Gray og Whittaker, J. Anat. 96^, 79 (1962).

Synaptosomernes optagelse af [^Hjmonoaminer blev bestemt på følgende måde: En portion af et synaptosom-præparat ækvivalent med 1 mg protein blev inkuberet ved 37 °C i 15 5 minutter i 1 eller 3 ml Krebs bicarbonatmedium inde holdende yderligere 10 mM glucose, 0,1 mM iproniazid,

1 mM ascorbinsyre, 0,17 mM ethylendiamintetraeddike-syre og [^Hjmonoamin i en specificeret koncentration. In-kuberingsblandingerne blev øjeblikkeligt fortyndet med 20 2 ml isafkølet Krebs bicarbonatpuffer indeholdende 1 mM

ikke-radioaktiv monoamin. Synaptosomerne blev opsamlet ved centrifugering og ved hjælp af 5 ml kold puffer overført til hætteflasker indeholdende 10 ml scintil-lationsvæske. Radioaktiviteten blev målt med et væske-25 scintillationsspektrometer, og mængden af monoamin, som var akkumuleret af synaptosomerne ved 4 °0, repræsenterede baggrundstællingen og blev trukket fra de resultater, der opnåedes for hver prøve.

Synaptosomer isoleret fra hypothalamus viste sig at ak-kumulere [ H ]norepinephrin ved 3,9 x 10 mol/mg pro-30 tein, når forsøgets gennemførtes uden tilstedeværelse af medikamenter i kontroleksperimenterne. En tilsætning af forbindelsen med formlen I til synaptosompræparatet

DK 161887 B

13 reducerede optagelsen af monoamin, således som det fremgår af den følgende tabel:

Koncentration Optagelse 1 x 10~^M 3,1 x HT12 mol/mg protein 2 2,2 3 3,1 10 1,4 30 1,0 50 0,9 100 0,8

De oven for angivne data blev indført på en logaritmisk skala med henblik på at bestemme den koncentration af 5 forbindelsen, som inhiberede halvdelen af optagelses- aktiviteten. Denne værdi (IC^g-værdien) var 4 x 10 M.

Den samme test blev udført på (+)-enantiomeren af forbindelsen roed formlen I samt på den racemiske blanding. IC^o“værclieri for ( + )-enantiomeren var 40 x 10 M, og vær-10 dien for den racemiske blanding var 9 x 10-^ M. Styrken af forbindelsen med formlen I med hensyn til in-hibering af optagelsen af norepinphrin er således omkring 10 gange så stor som styrken af den tilsvarende (+)-enatiomer.

15 Virkningen af forbindelsen med formlen I på optagel- 3 3 sen af [ Hjserotonin og [ H]dopamin blev ligeledes bestemt ved den samme testmetode, idet man anvendte synap-tosomer isoleret fra corpus striatum til bestemmelsen af dopaminoptagelsen og synaptosomer fra hjernebarken til 20 bestemmelsen af serotoninoptagelsen. Det viste sig, at forbindelsen med formlen I inhiberer optagelsen af norepinphrin væsentligt mere effektivt end den inhiberer optagelsen af de to andre monoaminer. IC^g-værdierne for 14

DK 161887 B

optagelsen af dopamin og serotonin var henholdsvis 4 og 1 x 10'6 M.

Forbindelsen med formlen I er således selektiv i sin virkning, eftersom den inhiberer optagelsen af nor-5 epinphrin væsentligt mere effektivt end den inhiberer optagelsen af andre monoaminer. Mange effektive anti-depressive midler inhiberer ligeledes optagelsen af norepinphrin mest effektivt.

Forbindelsen med formlen I har ligeledes været af-10 prøvet på levende dyr med henblik på at bestemme dens evne til at inhibere optagelsen af norepinphrin. Forsøgsdyrene var hanrotter af stammen Sprague-Dawley, der vejede 110 til 150 g. Rotterne blev behandlet i grupper på 5 med testforbindelsen i de angivne doser 15 og med de angivne hyppigheder, hvorefter de blev dræbt ved halshugning. Hypothalamus blev udtaget fra hver hjerne og homogeniseret i et medium som beskrevet i den oven for anførte test in vitro. Man anvendte prøver af homogenatet indeholdende 1 mg protein, og inkuba-20 tionstiderne, mediet og temperaturen svarede til det ovenfor beskrevne.

> / Når forbindelsen med formlen I blev indgivet intra-peritonealt 1 time før aflivningen i mængder på 1, 3 og 10 mg/kg, viste det sig, at optagelsen af L H] nor-25 epinphrin blev reduceret med henholdsvis 35, 58 og 68% i forhold til kontrolværdien. ED^g-værdien beregnedes til 2,1 mg/kg, idet man udregnede gennemsnittet af 3 uafhængige bestemmelser. ED^g-værdierne blev også bestemt for (+)-enantiomeren og racematet og viste sig 30 at være henholdsvis 6,3 og 3,4 mg/kg.

De opnåede data blev også udtrykt på en anden måde, idet man grafisk optegnede forbindelsens blodniveau 3

DK 161887 B

15 imod hastigheden af [ H]norepinephrin-optagelsen.

Denne grafiske fremstilling viste, at ED^g-koncentratio-nen i blodplasma var omkring 14 x 10 ^ g/ml for forbindelsen med formlen I. EDg-værdien for (+)-en-5 antiomeren var på samme basis 110 x 10 ^ g/ml, med andre ord næsten 8 gange så høj.

Varigheden af inhiberingen af norepinephrin-optagelsen, som skyldes forbindelsen med formlen I, blev observeret ved at aflive dyr, som modtog 10 mg/kg af for-10 bindeisen, på tidspunkter op til 4 timer efter indgi velsen af forbindelsen. Det viste sig, at den maksimale inhibering af norepinephrin-optagelsen i dette eksperiment var mere end 80?ά, og at inhiberingen forblev tilnærmelsesvis konstant i 2 timer. 4 timer efter indgi-15 velsen var inhiberingen omkring 65¾. I modsætning her til gav ( + )-enantiomeren en maksimal inhibering 70?ό, og denne inhibering var faldet til henholdsvis 50 og 35¾ i den anden og den fjerde time.

Det neurotoxiske middel 6-hydroxydopamin har den egen-20 skab, at det ødelægger de norepinephrinerge terminaler i det centrale og perifere nervesystem. Det viste sig, at 3 dage efter, at en hanrotte af stammen Sprague-Da\i/ley var blevet injiceret intraventriculært med 6-hydroxydopamin, faldt den optagelse af norepinephrin, som 25 skyldes synaptomer af hypothalamo, fra en hastighed på 5,6 x 10 til en hastighed på 2,2 x 10 mol/mg protein.

Når forbindelsen med formlen I blev indgivet intra-peritonealt inden injiceringen med 6-hydroxydopamin, blev hastighederne af norepinphrin-optagelsen ikke re-30 duceret så kraftigt. Doser på 1, 3 og 6 mg/kg reducerede inhiberingen af optagelsen med henholdsvis 15, 43 og 70¾. ED^g-værdien blev beregnet til 4 mg/kg. ED^g-værdien af (+)-enantiomeren blev vurderet på samme måde og viste sig at være omkring 22 mg/kg.

DK 161887 B

16

Forbindelsen med formlen I er evalueret i et testsystem in vitro med henblik på at bestemme dens an-ticholinerge virkning.

På basis af resultaterne af denne undersøgelse er den 5 . anticholinergiske virkning af forbindelsen med form len I væsentligt mindre end virkningen af.den tilsvarende (+)-enantiomer eller af racematet. Den anticholinerge virkning er en skadelig bivirkning, som kendetegner mange medikamenter. Forsøgene blev udført 10 på strimler (2 mm x 30 mm) af friske luftrør fra mar svin. Strimlerne blev suspenderet i organbade (10 ml) indeholdende en fysiologisk saltopløsning ved 37,5 °C og beluftet med en blanding af 5% carbondioxid og 95% oxygen. Luftrørsstrimlerne blev fastknyttet til isome-triske transducere forbundet til et automatisk regi-15 streringsudstyr, og de fik lov at ækvilibrere under en belastning på 2 g i mindst 2 timer, inden medikamentet blev tilsat. Dosis-responskurver blev opnået ved at sætte stigende koncentrationer af medikamentet til badet, idet koncentrationerne hver gang forøgedes ca.

20 3 gange. Koncentrationen af medikamentet forøgedes først, når den foregående koncentration havde produceret sit maksimale respons og forblev konstant.

De konsekutive dosis-responskurver for et givet væv var i alle tilfælde adskilt med 1 time, hvorunder man foretog en udvaskning med frisk fysiologisk saltopløs-25 ning for at sikre en maksimal udvaskning af medika mentet.

Dissociationskonstanterne blev bestemt ved anvendelse af acetylcholin som agonist. Ved denne metode bestemte man de koncentrationsforhold for acetylcholin, som gav lige stor respons i nærværelse og i fravær af forbindelse sen med formlen I, ved forskellige koncentrationer af forbindelsen. Man afsatte logaritmen af (dosisfor-

DK 161887 B

17 holdet - 1) imod den negative logaritme af den molære koncentration af forbindelsen, og herved opnåedes en ret linie, hvis hældning i alle tilfælde var tæt på den teoretiske enhedsværdi. Beregningsmetoden er udførligt disku-5 teret af Arunlakshana og Schild, Some Quantitative Uses of Drug Antagonists, Brit. J. Pharmacol. 1Λ, 48 - 58 (1959).

Ud fra de grafiske afbildninger blev den negative logaritme af dissociationskonstanten for forbindelsen ifølge opfindelsen bestemt til at være 5,26, og de tilsvaren-10 de værdier for (+)-enantiomeren og racematet bestemtes til henholdsvis 6,04 og 5,72. Dette svarer til, at den anticholinerge virkning af forbindelsen med formlen I kun er en 1/6 af aktiviteten af (+)-enantiomeren og kun 1/3 af aktiviteten af racematet. Sandsynligheden for anticholinerge bivirkninger hidrørende fra forbindelsen 15 med formlen I er således meget mindre end tilfældet er med den tilsvarende (+)-enatiomer eller det tilsvarende racemat.

Til vurdering af antidepressivt virkende midler kan man anvende en hypotermi-antagonisme-test med apomorphin, 20 eftersom det har vist sig, at antidepressive midler modvirker den reduktion i legemstemperatur, som fremkaldes af apomorfin. Denne test udføres på følgende måde: Man injicerede mus med en dosis apomorfin, som reducerede legemstemperaturen (målt rektalt) med omkring 4 °C. Forbindelsen med formlen I blev injice-25 ret intraperitonealt 30 minutter inden injektionen med apomorfin, og legemstemperaturen blev målt 30 minutter efter injektionen med apomorfin. Forbindelsen med formlen I gav en antagonisme på 50% af hypotermienen ved indgivelse af en dosis på 0,16 mg/kg. Forbindelsen var således væsentligt mere aktiv end den tilsvarende (+)-30 enantiomer, som først gav en antagonisme på 50¾ ved en dosering på 2,26 mg/kg.

DK 161887 B

18

En lignende test gennemførtes ved at indgive apomor-t'inen intraperitonealt, mens forbindelsen med formlen I blev indgivet oralt. Det.viste sig, at den højeste antagonisme, som kunne frembringes af forbindelsen med 5 formlen I i en dosis på 1 mg/kg, var 35%. Den tilsva rende (+)-enantiomer gav en antagonisme på 50%, men først ved et dosisniveau på 3 mg/kg.

En anden test, som forbindelsen blev underkastet, var beregnet på at bestemme de elektrofysiologiske virk-10 ninger i det ledende væv i hundehjerter, hvilket væv undertiden benævnes Purkinje's fibre. Det viste sig, at forbindelsen med formlen I begrænsede stigningshastigheden og varigheden af aktionspotentialet ved en koncentration på 8 x 10 ^ M, hvorimod (+)-enantio-15 meren først var effektiv ved en koncentration på 37 x 10-^ M. Racematet udviste først en lignende effektivitet ved en koncentration på 18 x 10 ^ M.

Man har undersøgt den akutte toxicitet ved at injicere forbindelsen med formlen I i store doser i mus. Det 20 viste sig, at der ikke indtraf nogen dødsfald ved doser på under 90 mg/kg, hverken med forbindelsen ifølge op--------- findelsen eller med dennes (+)-enantiomer. I lavere doseringer frembragte forbindelsen tydelige indvirkninger på centralnervesystemet, hvilke indvirkninger forsvandt 25 hurtigt, nærmere bestemt i løbet af 40 til 60 minutter.

De virkninger, som frembragtes af tilsvarende doser af (+)-enatiomeren, var lignende, men de varede væsentligt længere. F. eks. var de mus, som blev behandlet med (+)-enatiomeren i en dosis på 60 mg/kg, stadig i stimu-30 leret tilstand 5 timer efter indgivelsen.

Forbindelsen med formlen I anvendes som antide-pressivt middel ved en metode, som består i at indgive en patient, der lider af depression, en effektiv dosis

DK 161 387 B

19 af forbindelsen. Effektive antidepressivt virkende doser forefindes i området fra omkring 0,1 til omkring 25 mg/kg svarende til mellem ca. 6 mg og ca. 1500 mg pr. dag som en total dosering for et menneske. Det foretrukne 5 dosisområde ligger på mellem ca. 0,5 og ca. 5 mg/kg eller fra omkring 30 til omkring 300 mg pr. dag for et menneske. Forbindelsen kan indgives to eller flere gange pr. dag ved at opdele doseringen på passende vis til hver indgivelse, eller forbindelsen kan indgives på en gang.

10 Indgivelsesvejen for forbindelsen er ikke kritisk. Det har vist sig, at forbindelsen absorberes oralt, og man foretrækker således almindeligvis oral indgivelse på grund af bekvemmeligheden af denne indgivelsesform. Imidlertid kan man også effektivt indgive forbindelsen subcutant, 15 ved injektion eller i særlige tilfælde ad andre ind giveslesveje, f. eks. i form af tabletter til anbringelse under tungen eller form af suppositorier.

Farmaceutiske midler, hvormed man kan indgive forbindelsen, kan formuleres ved metoder, der er velkendte 20 inden for den farmaceutiske kemi. Når man ønsker at an vende oral indgivelse, er det almindeligvis mest be-bekvemt og økonomisk at fremstille et tablet eller en kapsel indeholdende forbindelsen. Kapsler indeholdende forbindelsen fremstilles på sædvanlig måde, idet man sim-25 pelt hen fortynder forbindelsen med et farmaceutisk accceptabelt bærestof -og fylder den ønskede mængde på en kapsel af passende størrelse.

Som det vil være velkendt for farmaceuter, er tabletter noget vanskeligere at fremstille, men de kan dog frem-30 stilles ved såvel direkte kompression som ved granu leringskompression. Som de efterfølgende eksempler illustrerer, kan man anvende de sædvanlige typer af fortyndingsmidler, excipienser, smøremidler og binde-midler ved fremstillingen af tabletter indeholdende 20

DK 1618 8 7 B

forbindelsen fremstillet ifølge opfindelsen.

Når man skal fremstille flydende doseringsformer, er det naturligvis en fordel, at forbindelsen foreligger i form af et vandopløseligt salt. Sådanne salte kan 5 være opløst i vand til injektionsbrug, eller de kan være opløst i vand, der er tilsat passende smagsstoffer og blandet med farmaceutisk acceptable konserveringsmidler, således at forbindelsen kan indgives oralt som en eliksir.

1C Man foretrækker at formulere forbindelsen til oral ind givelse, og blandt sådanne formuleringer foretrækker man tabletter og kapsler. Formuleringer, der afgiver mellem ca. 5 og ca. 500 mg pr. dosisenhed, er specielt nyttige. Man foretrækker dosisenheder, der afgiver mellem ca. 10 og ca. 100 mg.

15 1 det følgende er anført eksempler på typiske formule ringer i samtlige tilfælde foreligger forbindelsen som hydrochloridsalt.

Kapsler

Til 5 mg pr. kapsel_

Aktiv forbindelse 5 mg

Pregelatineret stivelse NF 295 mg

Forbindelsen og stivelsen blandes grundigt og fyldes . på hårde gelatine kapsler.

til 25 mg pr. kapsel

Aktiv forbindelse 25 mg

Mikrokrystallinsk cellulose NF 123,4 mg

Pregelatineret stivelse NF 36,1 mg

Siliconevæske 1,9 mg

DK 161887 B

21

Siliconevæsken blandes grundigt med en del af excipien-serne. Forbindelsen og resten af excipienserne tilsættes, og samtlige ingredienser blandes herefter grundigt. Blandingen fyldes på hårde gelatinekapsler.

Til 50 mg pr. kapsel

Aktiv forbindelse 50 mg

Pregelatineret stivelse NF 168,4 mg

Stivelse NF 82,9 mg

Siliconevæske 1,6 mg

Fremstillingen forløber på samme måde som for 25 mg kapslerne.

Til 500 mg pr. kapsel

Aktiv forbindelse 500 mg

Pregelatineret stivelse NF 400 mg

Forbindelsen og stivelsen blandes grundigt og fyldes på hårde gelatinekapsler.

Tabletter

Aktiv forbindelse 10 mg

Mikrokrystallinsk cellulose NF 233,7 mg

Stivelse NF 45,0 mg

Stearinsyre NF 6,0 mg

Magnesiumstearat NF 3,0 mg

Kolloidt siliciumdioxid NF 0,9 mg

Forbindelsen og de andre ingredienser blandes grundigt og presses til tabletter.

DK 161887 B

22

Forbindelsen og de andre ingredienser blandes grundigt og pressestiltabletter.

Små kugler - til 25 mg pr. tablet

Aktiv forbindelse 25 mg

Mikrokrystallinsk cellulose NF 249,7 mg

Lactose USP 25,0 mg

Pregelatineret stivelse NF 10,0 mg

Stearinsyre NF 8,0 mg

Magnesiumstearat NF 3,3 mg

Kolloidt siliciumdioxid NF 2,4 mg

Den aktive forbindelse, lactose, den pregelatinerede stivelse, 30¾ af den mikrokrystallinske cellulose, 80¾ af 3 stearinsyren og 50¾ af det kolloide siliciumdioxid blandes grundigt og presses til små kugler. Disse kugler sigtes til dannelse af granula, som sammen med magnesiumstearatet og den resterende mikrokrystallinske cellulose, stearinsyren og det kolloide siliciumdioxid 10 blandes grundigt og presses til tabletter.

Fugtig granulering - til 50 mg pr. tablet:

Aktiv forbindelse 50 mg

Dibasisk calciumphosphat USP 112,9 mg

Lactose USP 105,0 mg

Mikrokrystallinsk cellulose NF 60,0 mg

Stivelse NF 9,0 mg

Stearinsyre NF 4,5 mg

Magnesiumstearat NF 1,5 mg

Den aktive forbindelse blandes grundigt med det dibasiske calciumphosphat og lactosen, hvorefter blandingen omdannes en fugtig masse ved hjælp af en blanding (1:1)

DK 161 887 B

23 af denatureret alkohol og renset vand. Den fugtige masse filtreres og tørres, og den tørre masse sigtes til dannelse af et granulat. Dette granulat blandes grundigt med den mikrokrystallinske cellulose, sti-5 velsen, stearinsyren og magnesiumstearatet, hvorefter blandingen presses til tabletter.

Claims (1)

1. DK 16188 7 B Analogi fremgangsmåde til fremstilling af (-)-enan-5 tiomeren af forbindelsen med formlen A i I! /•^\ V O-CH (CH2 ) a—NH—CH3 (X) Ih3 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, k e n -15 detegnet ved, at man (a) omsætter den racemiske form af forbindelsen med formel I med en L(+)-mandelsyre til dannelse af en blanding af (+)(-)- og (+)(+)-mandelsyresaltene, 20 (b) skiller ( + )(-)-mandelsyresaltet fra ’( + )( + )-mandel-syresaltet ved fraktioneret krystallisation, (c) omsætter det herved opnåede (+)(-)-mandelsyresalt 25 med en stærk base til frigivelse af (-)-basen med for mel I, og (d) om ønsket omdanner den således opnåede frie base til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. 30 35