DK169409B1 - Vanduopløselige, farmaceutisk acceptable salte af substituerede derivater af rapamycin og farmaceutisk præparat indeholdende et sådant salt - Google Patents

Description

i DK 169409 B1 ... Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte, vandopløselige, farmaceutisk acceptable salte af i 28- og 43-stillingen disubstitueret rapamycin samt et farmaceutisk præparat indeholdende sådanne salte.

5 Rapamycin er en kendt forbindelse beskrevet i US- patentskrift nr. 3.929.992 og 3.993.749. Endvidere er mono-og diacylderivater deraf beskrevet i US-patentskrift nr. 4.316.885. De foretrukne acylgrupper er aliphatiske grupper med 2-6 carbonatomer, især acetyl. Disse kendte acylderivater 10 kan ikke danne salte, og de er ikke vandopløselige.

Rapamycin er beskrevet i BE-patentskrift nr. 877.700 som værende anvendeligt til behandling af tumorer. Rapamycin er imidlertid kun meget lidt opløseligt i vand, dvs. 20 μg/ml, og specielle injicerbare formuleringer er blevet 15 udviklet til indgivelse til patienter, som beskrevet i EP-patentskrift nr. 41.795. Disse formuleringer fremstilles ved opløsning af rapamycin i et lavtkogende, organisk opløsningsmiddel (acetone, methanol, ethanol). Opløsningen blandes med et ikke-ionisk, overfladeaktivt middel, f.eks. polyoxy-20 ethyleret, hydrogeneret ricinusolie. De resulterende formuleringer er ikke fuldt tilfredsstillende af forskellige grunde. Således er de kun sparsomt opløselige i vand. Dernæst giver de overfladeaktive midler, specielt de polyoxyethyle-rede, hydrogenerede ricinusolier, irritations- og toksici-25 tetsproblemer, og det samme gælder for de organiske opløsningsmidler. Følgeligt er der et behov for et rapamycinderi-vat eller et farmaceutisk forstadium til rapamycin, som er lettere opløseligt i vand til dannelse af en sikker, injicer-bar opløsning, og som er lige så virksomt som rapamycin 30 ved behandling af tumorer.

Det har nu vist sig, at der kan syntetiseres vandopløselige, farmaceutisk acceptable salte af derivater af rapamycin. Disse salte repræsenterer forstadier til rapamycin og nedbrydes til rapamycin i nærværelse af humant plasma og 35 animalske vævshomogenisater. De her omhandlede farmaceutiske forstadier til rapamycin muliggør tilvejebringelsen af et DK 169409 B1 2 værdifuldt, farmaceutisk injicerbart præparat til behandling af tumorer i mennesker.

De her omhandlede, vandopløselige, farmaceutisk acceptable salte er salte af derivater af rapamycin, som er disub-5 stitueret i 28- og 43-stillingen i rapamycinstrukturen. Stillingsangivelserne er baseret på en strukturfastlæggelse beskrevet af Findlay et al. i Can. J. of Chem. 58, 579 (1980) og vist nedenfor.

"i" ° Π i i5 Ηγ^Η °'V'' \ _/0“ch5 "'ΧΌξ * ^ 20 De omhandlede salte af disubstituerede rapamycinderi- vater er ejendommelige ved, at substituent erne hver især har formlen 25 0 Rn II /

-C-(CH2)m-N

\ *2 30 hvor m er 1-3, og og R2 hver især er hydrogen eller en alkylgruppe med 1-3 carbonatomer, eller R^ og R2 danner sammen med'det nitrogen, 35 de er knyttet til, en pyrrolidino- eller piperidinoring.

Foretrukne vandopløselige salte af rapamycinderivater ifølge den foreliggende opfindelse er dem, hvor R-^ og R2 hver især er alkyl med 1-3 carbonatomer.

Et rapamycinderivat, der er disubstitueret i 28- og 3 DK 169409 B1 43-stillingen med en acylaminosubstituent med formlen 0 Ri 5 II /

”C"(CH2)m-N

\ *2.

hvor m, og R2 har de ovenfor angivne betydninger, frem-10 stilles ved, at man acylerer rapamycin med et acyleringsmid-del indeholdende den ovenfor viste acylaminosubstituent.

Acyleringen kan udføres ved hjælp af standardacyle-ringsmetoder, fortrinsvis under neutrale betingelser. Acyleringsmidlet kan være en syre, et syrehalogenid (dvs. chlorid 15 eller bromid), et syreanhydrid eller en aktiveret ester af acylaminosubstituenten. Syreformen af acylaminosubstituenten foretrækkes som acyleringsmiddel i nærværelse af et egnet koblingsmiddel. Det særlige koblingsmiddel kan være mest virksomt i nærværelse af en katalysator og/eller et syrebin-20 dende middel. Eksempler på foretrukne koblingsmidler er N,N1-dicyclohexylcarbodiimid, l,l'-carbonyldiimidazol, di-ethylazodicarboxylat, 2,21-dithiopyridin og N,N-diisopropyl-carbodiimid. Diethylazodicarboxylat og 2,2·-dithiopyridin kræver anvendelse af en katalysator, såsom triphenylphosphin.

25 Med disse to koblingsmidler og triphenylphosphin som katalysator foretrækkes et ikke-chloreret opløsningsmiddel, såsom en vandfri ether, f.eks. tetrahydrofuran. Med andre koblingsmidler foretrækkes almindeligvis anvendelsen af et syrebindende middel, såsom 4-dimethylaminopyridin eller 4-pyrroli-30 dinopyridin. Med sidstnævnte koblingsmidler og katalysatorer kan anvendes et sådant opløsningsmiddel som vandfrit methy-lenchlorid eller chloroform. Med syrehalogenidet (fortrinsvis syrechlorid). foretrækkes en tertiær amin, såsom pyridin eller triethylamin, som katalysator af typen' syrebindende 35 middel, og der kan anvendes et sådant opløsningsmiddel som vandfrit methylenchlorid eller chloroform.

I en foretrukket udførelsesform udføres acyleringen ved omsætning af rapamycin med en syre med formel (III) DK 169409 B1 4 O R-i II / H0C(CH2)mN (III) \ 5 R2 hvor m, R^ og R2 har de ovenfor angivne betydninger, i nærværelse af et koblingsmiddel, f.eks. et carbodiimid, såsom dicyclohexylcarbodiimid eller diisopropylcarbodiimid, eller carbonyldiimidazol. Fortrinsvis anvendes en katalysator, 10 såsom 4-dimethylaminopyridin eller 4-pyrrol idinopyridin, sammen med sådanne koblingsmidler. I en sådan reaktion er acyleringsmidlet en aktiveret ester dannet ud fra syren med formel (III) og carbodiimid-koblingsmidlet. Koblingsmidler, herunder carbodiimider, og metoder til anvendelse deraf er 15 kendte i teknikken, idet de i stor udstrækning anvendes i peptidkemien, se f.eks. E. Schroder & K. Lubke, "The Peptides", bind 1, Academic Press, New York & London 1965, og Mr. Bodanszky & M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, 1966 Interscience USA.

20 Hvis én eller begge R^ og R2 er hydrogen, foretrækkes beskyttelse af aminfunktionen i acyleringsmidlet ved hjælp af en beskyttende gruppe, som kan fjernes under neutrale betingelser. Hvis én eller begge R^ og R2 er hydrogen, kan aminfunktionen i et sådant acyleringsmiddel f.eks. beskyttes 25 ved anvendelse af syrechlorid-hydrochloridet af acylaminosub-stituenten som acyleringsmiddel.

Syrechlorid-hydrochlorid-acyleringsmidlet kan fremstilles på kendt måde ved omsætning af syreformen af acyleringsmidlet med 1 ækvivalent hydrogenchloridgas og derefter 30 med 1 ækvivalent phosphorpentachlorid. Disse reaktioner kan udføres i vandfrit methylenchlorid. Syrechlorid-hydrochlorid-produktet kan udvindes som et bundfald eller udfældes fra toluen, hexan eller cyclohexan. Acyleringen under anvendelse af syrechlorid-hydrochloridet kan udføres på kendt måde 35 under anvendelse af en svag base, såsom pyridinurinstof, dimethylanilin eller trimethylamin som syrebindende middel.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også et injicerbart, farmaceutisk præparat, som er ejendommeligt DK 169409 B1 5 ved, .at det indeholder et farmaceutisk acceptabelt bærestof og et vandopløseligt, farmaceutisk acceptabelt salt ifølge den foreliggende opfindelse. Vand eller et hvilket som helst vandbaseret bærestof, der er kendt i teknikken, kan anvendes, 5 f.eks. destilleret vand, vand indeholdende 5 vægt-% dextrose (D5W) eller en fysiologisk acceptabel saltopløsning, som skal have en pH-værdi i det neutrale område, f.eks. en normal saltopløsning eller en laetatopløsning ifølge Ringer.

Fremstillingen af typiske vandopløselige, farmaceuti-10 ske forstadier til rapamycin ifølge den foreliggende opfindelse er illustreret i eksemplerne.

Eksempel 1

Syntese af bis- f28.43) -N.N-dimethvlqlvcinatester af rapamycin 15 Til en opløsning af 27 g (29,5 mmol) rapamycin i 500 ml methylenchlorid sættes 6 g (58 mmol) N,N-dimethylglycin, 14 g (67,8 mmol) dicyclohexylcarbodiimid og 750 mg 4-dimeth-ylaminopyridin (katalysator) , og blandingen omrøres magnetisk ved stuetemperatur natten over under en nitrogenatmosfære.

20 Dicyclohexylurinstoffet frafiltreres og vaskes med methylenchlorid. Denne opløsning koncentreres i vakuum og optages i ether, hvorpå der vaskes to gange med en mættet natriumhydrogencarbonatopløsning. Det organiske lag tørres med magnesiumsulfat og filtreres gennem et lag florisil 25 (4,,xl”) og elueres med ether, hvorved man efter fordampning af opløsningsmidlet får 28,3 g hvidt skum. Denne blanding kromatograferes på en Water Prep. 500A (to silicagelsøj-ler) og elueres med blandinger af 10% acetone/ethylacetat og derpå med acetone, hvorved der fås 3 g udgangsrapamycin 30 i form af et skum, 13 g blanding af 43-ester og N,N-dimeth-ylglycylurinstof i form af et skum, 4 g 28-ester i form af et skum og 5 g 28,43-diester i form af et skum.

4,9 g (4,52 mmol) af 28,43-diesteren i -form af den fri base opløses i ether, og til den klare opløsning sættes 35 193 ml (9,06 mmol) etherisk methansulfonsyreopløsning, som DK 169409 B1 6 indeholder 4,5 mg methansulfonsyre pr. ml opløsning. Det dannede hvide bundfald frafiltreres og vaskes grundigt med ether, hvorved man får 5,1 g af den ønskede forbindelse i form af et gråhvidt pulver.

5 Der foretages L.C.-analyse på en C18 Novapak-søjle (15 cm x 3,9 mm) under anvendelse af 80% methanol/20% 0,01 Μ NH4H2PO4, pH 3,5 som mobil fase (FR = 1 ml/min., UV 280 nm). Resultaterne indicerer en blanding af rotamerer (10:1) med den overvejende mængde isomer ved 11,05 min. og den 10 mindre mængde isomer ved 20,8 min.

Fri Base: N.M.R. (400 MHz. CPC13^: «5 0,87 (d, 3H) , 0,92 (d, 3H) , 0,98 (d, 3H) , 1,03 (d, 3H), 1,07 (d, 3H), 1,62 (s, 3H), 1,72 (s, 15 3H) , 2,28 (s, 6H) , 2,33 (s, 6H) , 3,12 (s, 3H) , 3,30 (s, 3H), 3,34 (s, 3H), 3,82 (d, IH), 4,75 (m, IH), 5,35 (d, IH).

Salt: N.M.R. (400 MHz, CDCI3) : δ 2,80 (s, 6H, 2 X CH3S03“) , 3,03 20 (s, 6H, (CH3)2N+), 3,03 (s, 6H, (CH3)2N+), 3,13 (s, 3H, OCH3), 3,35 (s, 6H, 2 x 0CH3), 3,81 (d, IH), 4,00 (m, 4H, 2 XN+CH2), 4,80 (m, IH, CH-OCO), 5,44 (d, IH, CH-OCO).

Elementæranalvse for CHN: 25 Beregnet for C61H101N3O21S2 C 57,39 H 7,97 N 3,29

Fundet C 55,21 H 8,27 N 3,00 MS r-FAB^: M-H ved 1083 30 Opløselighed i vand ved 25°C: 40 mg/ml.

Eksempel 2

Syntese af hvdrochloridet af bis-(28.431-N.N-diethvJannnn)-propionatester af rapamvcin 35 Til en opløsning af 10 g (10,9 mmol) rapamycin i 250 ml methylenchlorid sættes 6,0 g (33 mmol) 3-(N,N-diethyl- DK 169409 B1 7 amino->propionsyre-hydrochlorid, 7,42 g (35,6 mmol) dicyclo-hexylcarbodiimid og 500 mg 4-dimethylaminopyridin (katalysator) , og blandingen omrøres magnetisk ved stuetemperatur i 48 timer under en nitrogenatmosfære.

5 Dicyclohexylurinstoffet frafiltreres og vaskes med methylenchlorid. Filtratet koncentreres i vakuum, og det som remanens fremkomne hydrochloridsalt tritureres med en blanding af ethylacetat og ether. Det uopløselige materiale fordeles mellem ethylacetat og mættet natriumhydrogencar-10 bonatopløsning. Det organiske lag isoleres, vaskes med mættet natriumchloridopløsning, tørres med magnesiumsulfat og koncentreres i vakuum, hvorved man får 15 g skumformigt produkt. Blandingen chromatograferes på en Water Prep. 500A (to si-licagelsøjler) og elueres med en 50/50-blanding af ethyl-15 acetat og acetone, hvorved man først får 1,9 g af 43-mono-esteren og derefter 4,7 g af 28,43-diesteren (udbytte = 37%) i form af et hvidt skum efter inddampning til tørhed.

225 mg (19,3 mmol) af diesteren opløses i 20 ml ether, og til den klare opløsning sættes 38 mmol (1,96 ækvivalenter) 20 0,01 N etherisk saltsyre. Det dannede dihydrochloridsalt isoleres ved filtrering, vaskes med ether og tørres i høj-vakuum i 48 timer, hvorved man får 190 mg af den ønskede forbindelse i form af et hvidt fast stof (udbytte = 79%). Massespektret indicerer en molekylion på 1167 for den fri 25 base. Opløseligheden i vand ved 25°C er 30 mg/ml.

Claims (7)

1. Vandopløselige, farmaceutisk acceptable salte af i 28- og 43-stillingen disubstitueret rapamycin, kendetegnet ved, at substituenterne hver især har form- 5 len O Ri II / -C-(CH2)m-N 10 \ *2 hvor m er 1-3, og R<L og R2 hver især er hydrogen eller en alkylgruppe med 1-3 15 carbonatomer, eller og R2 danner sammen med det nitrogen, de er knyttet til, en pyrrolidino- eller piperidinoring.

2. Vandopløseligt salt ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^ og R2 hver især er en alkylgruppe med 1-3 carbonatomer.

3. Vandopløseligt salt ifølge krav 2, kende tegnet ved, at R^ og R2 betyder methyl eller ethyl.

4. Vandopløseligt salt ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at m er 1 eller 2.

5. Vandopløseligt salt ifølge krav 1, kende tegnet ved, at substituenterne hver især er O CH3 II /

30 -C-CH2N \ ch3

6. Salt ifølge krav 4, kendetegnet ved, at det er methansulfonsyresaltet.

7. Injicerbart, farmaceutisk præparat, kende tegnet ved, at det indeholder et farmaceutisk acceptabelt bærestof og et vandopløseligt, farmaceutisk acceptabelt salt ifølge kravene 1-6. 40