DK167928B1 - Enzym-resistente immunomodulatoriske thymopoietin- eller spleninanaloge peptider og deres farmaceutisk acceptable syre- eller baseadditionssalte samt fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Description

i DK 167928 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte immunomodulato-riske thymopoietin- eller spleninanaloge peptider og deres farmaceutisk acceptable syre- eller baseadditionssalte med forbedret modstandsdygtighed over for enzymatisk nedbrydning i kroppen. Opfindelsen angår også en 5 fremgangsmåde til fremstilling af ovennævnte peptider. j USA-patentskrifterne nr. 4.190.646 og 4.261.886 omhandler forskel lige pentapeptider med aktivitet, som ligner aktiviteten af det langkædede polypeptid kendt som thymopoietin, der er beskrevet i USA-patentskri fterne nr. 4.002.740 og 4.077.949. Den biologiske aktivitet af visse 10 af disse peptider er beskrevet i en artikel af M.E. Weksler, et al., J.

Exp. Med. 148: 996-1006 (1978). Publiceret europæisk patentansøgning nr. 25.897 og USA-patentskrift nr. 4.361.673 omhandler også forskellige peptider, som siges at have aktivitet som ligner thymopoeitins. Thymopoei-tin III, også kendt som "splenin", er et lignende peptid isoleret fra 15 kalvemilt. Audhya, et al., Biochemistry, 20, 6195-6200 (1981). Dette materiale stimulerer induktion af både T-celler og B-celler.

Der henvises til de ovenfor nævnte patentskrifter og artikler med hensyn til en diskussion af andet baggrundsmateriale og de biologiske processer, som er involveret i den foreliggende opfindelse.

20 Selvom disse kendte peptider er nyttige p.g.a. deres immunomodula-toriske aktivitet, har det vist sig, at de ødelægges hurtigt af enzymer både in vitro og in vivo efter administrering til en dyrisk eller menneskelig recipient. Se fx. Int. J. Pept. and Protein Res., 14, 479-484 (1979), ibid, 22:187-193 (1983).

25 Europæisk patentansøgning, publ. nr. 0018182, omhandler peptider med formlen

A-X-Z-Y-B

hvor A er O-C-NH-(CH0) -CLL-C0- eller H.N-C-NH-iCH.) -CH.-CO-2 ' Z'm 2 Z II v Z'm i Z

30 II II I

NH NH NHR

X er en passende neutral, al i fati sk eller aromatisk aminosyrerest, fx valgt blandt ALA, 2-Me-ALA, GLY, LEU, ILE, LYS, THR, SER, PHE, MET, D-ALA, D-LEU, D-ILE, D-LYS, D-THR, allo-THR, D-SER, D-PHE, D-MET og SAR, 35 Z er HN-CH-CO- , (ί)η

COOH

2 DK 167928 B1 Y er GLY, SER, THR, LEU, ILE, VAL eller SAR, B er TYR-R', D-TYR-R', decarboxy-TYR, eller

NH-CH-CHg- @ -OH, ih er 3 eller 4, n er 1, 2 eller 3, R"' er 5 I

CH20R"' hydrogen, C-^-Cy al kyl, Cg-C^ aryl eller C^-Cy alkanoyl, og R og R' er substituenter, som ikke i væsentlig grad påvirker peptidernes biologiske aktivitet, forudsat at R-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-R' er udelukket. Peptiderne 10 er i stand til at inducere differentiering af T-lymphocyter, men ikke af komplement-receptor (CR+) B-lymphocyter.

Europæisk patentansøgning, publ. nr. 0037246, omhandler polypeptid-er med formlen R-Xj-LYS-Xg-VAL-Xg-Rj 15 hvor R er hydrogen, alkanoyl med 1-4 carbonatomer eller aroyl med 6-10 carbonatomer,

Xj er L-Arg, D-Arg eller D-homoarginin, Χ^ er Asn, Gin eller N-substituerede carboxamider deraf, 20 X5 er L- eller D-Tyr, L- eller D-Phe, L- eller D-Trp, L- eller D-Leu, L- eller D-Met, D-Met-ol-oxid eller D-Phe-ol, og

Rj er amino, monoal kyl amino med 1-4 carbonatomer, di al kyl amino, hvor hvert al kyl har 1-4 carbonatomer, hydroxy, alkoxy med 1-4 carbonatomer, 25 /—λ r-Λ r~—\ _ r~~\ -N NC Η,, -N S, .N S -0 ,, -N 0, i / V v_i \_f eller \__y de fuldt beskyttede peptid-harpiks mellemprodukter deraf, og farmaceutisk acceptable salte deraf. Peptiderne er i stand til at inducere 30 differentiering af T-lymphocyter.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer peptider, som er mere modstandsdygtige over for enzymatisk nedbrydning i kroppen end peptiderne ifølge den tidligere teknik og de er derfor terapeutisk mere værdifulde materialer.

35 Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte peptider med følgende formel: R-V-W-X-Y-Z-R1 (I) 3 DK 167928 B1 eller et farmaceutisk acceptabelt syre- eller baseadditi onssalt deraf, hvori R er H, NH2, R2-NH, CHgNH eller pyro-GLU-NH, hvor R2 er et lavere al kyl carbonyl radikal valgt blandt formyl, acetyl, propionyl og 5 succinoyl, 0 V er -CH-C-10 (CH2)3

NH

C=NH

15 ' I

nh2, som enten L- eller D-isomer, hvis R er forskellig fra H, A 0

20 . I II

W er PRO, dehydro-PRO eller -NH-C-C-0, denne sidste enten som L-

B

eller D-isomer, 25 A er lavere al kyl, B er H, hvis A er C4_g lavere al kyl og er ellers Cj_3 lavere al kyl, eller A og B danner tilsammen -(CH2)4- eller -(CH2)g-, X er D-ASP, ASP, D-GLU eller GLU, 30 Y er GLY, VAL, LEU, nor-LEU, PHE, ILE, LYS, GLN, GLU, ALA, D-VAL, D-LEU, D-nor-LEU, D-PHE, D-ILE, D-LYS, D-GLN, D-GLU eller D-ALA, E CH2<0\oH 35 1 er 11 L er -N-CH-C- »

II

o D er H, 3-chlor eller 3-nitro, E er H eller Cj 3 lavere al kyl, 4 DK 167928 B1

R" O R" O

R1 er OH, NHR\ -NH-CH-C-OH eller -NH-CH-C-NHR"', og R" og R"' uafhængigt af hinanden er H eller lavere alkyl, 5 under forudsætning af, at ikke mere end én blandt V, X og Y er en D-aminosyre. Både D- og L-isomere omfattes af den foreliggende opfindelse, selvom L-isomeren foretrækkes.

Det har overraskende vist sig, at de omhandlede peptider besidder thymopoeitin-lignende eller splenin-lignende aktivitet og at de p.g.a.

10 tilstedeværelsen af W-gruppen i 2-posi tionen er modstandsdygtige over for angreb af endo- og exopeptidaser og trypsin-1ignende enzymer i serum.

I dens bredeste aspekt tilvejebringer den foreliggende opfindelse peptider med følgende formel: 15 R-V-W-X-Y-Z-R1 (I) eller farmaceutisk acceptable syre- eller baseadditionssalte deraf, hvori R, V, W, X, Z og R* er som ovenfor defineret.

20 Foretrukne peptider ifølge den foreliggende opfindelse er sådanne o med formel (I), hvori R er R -NH og W er PRO eller AIB. Mere foretrukne 2 peptider er sådanne med formel (I), hvori R-V er R -ARG, W er PRO eller AIB, X er ASP eller GLU, Y er GLY eller en L-aminosyre som tidligere defineret, Z er TYR eller D-substitueret TYR og R* er OH eller NH£. Endnu 25 mere foretrukne peptider er sådanne med formel (I), hvori R-V er acetyl-ARG, W er PRO eller AIB, X er ASP eller GLU, Y er GLY eller en L-aminosyre som tidligere defineret, Z er TYR eller D-substitueret TYR og R* er NHg. Det mest foretrukne peptid er N-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-NHg.

Som anvendt heri omfatter udtrykket "lavere al kyl" forgrenede og 30 ligekædede mættede carbonhydrider med fra 1-6 carbonatomer såsom methyl, .ethyl, propyl, isopropyl, pentyl, hexyl o.l. R omfatter formyl og lavere al kyl carbonyl grupper såsom acetyl, propionyl, succinoyl o.l.

Repræsentative D-substituenter, som forøger surheden af phenol protonen i Z-aminosyreresten, er fx. 3-chlor og 3-nitro. Fagmanden vil 35 vide, at andre elektron-tiltrækkende grupper, især i 3-stillingen i phenyl ringen på Z, vil forøge surheden af phenol protonen, ligesom dette .vil være tilfældet for grupper, der stabiliserer phenoxidionen, der fremkommer ved donering af phenol protonen.

Som syrer, der kan danne salte med disse peptider, kan nævnes uor- 5 DK 167928 B1 ganiske syrer såsom hydrogenchlorid, hydrogenbromid, perchlorsyre, salpetersyre, rhodanbrintesyre, svovlsyre, phosphorsyre o.l. og organiske syrer som myresyre, eddikesyre, propionsyre, glycol syre, mælkesyre, py-rodruesyre, oxalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, antra-5 nil syre, kanel syre, naphtha!ensulfonsyre, sul fanil syre eller lignende.

Baser, som kan danne salte med disse peptider, omfatter uorganiske baser såsom natriumhydroxid, ammoniumhydroxid, kaliumhydroxid o.l. og organiske baser såsom mono-, di- og trialkyl- og -arylaminer (fx. tri-ethylamin, diisopropylamin, methylamin, dimethylamin o.l) og eventuelt 10 substituerede ethanolaminer (fx. ethanolamin, diethanolamin o.l.).

I beskrivelsen og kravene identificeres aminosyrekomponenterne i peptiderne og visse materialer, som anvendes til deres fremstilling, af bekvemmelighedsgrunde ved hjælp af forkortelser. Disse forkortelser er som følger: 15

Aminosyre Forkorte!se

α-methylalanin AIB

cycloleucin CLE

4-methyl-leucin 4-methyl-LEU

20 glycin GLY

L-alanin ALA

D-alanin D-ALA

.L-arginin ARG

D-arginin D-ARG

25 L-asparaginsyre ASP

D-asparaginsyre D-ASP

L-dehydroprolin dehydroPRO

L-glutaminsyre GLU

D-glutaminsyre D-GLU

30 L-glutamin GLN

D-glutamin D-GLN

L-isoleucin ILE

D-isoleucin D-ILE

L-leucin LEU

35 €-leucin D-LEU

L-lysin LYS

D-lysin D-LYS

L-norleucin nor-LEU

D-norleucin D-nor-LEU

6 DK 167928 B1

Aminosyre Forkortelse

* L-prolin PRO

L-tyrosin TYR

L-val in VAL

5 D-valin D-VAL

Udtrykket "dehydroPRO" omfatter 2,3-dehydroPRO, 3,4-dehydroPRO og 4.5- dehydroPRO, idet 3,4-dehydroPRO foretrækkes.

Peptiderne ifølge opfindelsen kan almindeligvis fremstilles ved 10 kendt teknik. Peptiderne kan bekvemt fremstilles ved fastfasesyntese-teknikken, som først blev beskrevet af Merrifield i Journal of the American Chemical Society, 85, 2149-2154 (1963). Sådanne fremgangsmåder omtales også i visse af de ovennævnte tidligere patentskrifter. Andre teknikker kan findes fx. i M. Bodansky, et al., Peptide Synthesis, John 15 Wiley & Sons, 2nd edition, 1976. Passende beskyttende grupper, som kan benyttes i sådanne synteser, og deres forkortelser kan findes i denne tekst såvel som i "Protective Groups in Organic Chemistry", J.F.W.

McOmie, Editor, Plenum Press, New York, 1973. De almindelige beskyttende grupper, som anvendes heri, er t-butyloxycarbonyl(BOC), benzyl(BZL), t-20 amyloxycarbonyl(AOC), tosyl (TOS), o-bromphenylmethoxycarbony(BrZ) og 2.6- dichlorbenzyl (BzlC^).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 10's kendetegnende del angivne.

Peptiderne ifølge opfindelsen, hvori X er ASP eller D-ASP, har vist 25 sig at udvise biologisk aktivitet, som ligner thymopoietins, som omtales i de ovenfor omtalte USA-patentskrifter og artikler, mens sådanne, hvori X er GLU eller D-GLU, har vist sig at udvise biologisk aktivitet, som ligner splenins. Forbindelserne ifølge opfindelsen testedes ved hjælp af induktionstestproceduren ifølge Scheid, et al., J. Exp. Med. 147, 1727-30 1743 (1978) og også ved hjælp af en receptortestprocedure, som er beregnet til måling af fortrængning af radioaktivt mærket thymopoeitin fra et receptorsted af testpeptiderne. Et positivt resultat i induktionstesten indikerer, at testpeptidet har samme evne som thymopoeitin eller splenin til at inducere prekursorceller til hhv. immunokompetente T-celler eller 35 T-celler og B-celler. Et positivt resultat i receptortesten antyder testpeptidets evne til at binde til thymopoeitinreceptorsteder og således deres thymopoeitinlignende aktivitet. De omhandlede peptider er positive i induktionstesten, mens sådanne, hvori X er ASP eller D-ASP, er positive i receptortesten.

7 DK 167928 B1

Peptiderne ifølge opfindelsen, hvori X er ASP eller D-ASP, udmærker sig ved deres evne til at inducere selektiv differentiering af Thy-1+ T-celler (men ikke Lyb-2+ B-celler). Thy-1 er et differentieringslloanti-gen, som er til stede i T-celler, men ikke i B-celler, hvorimod Lyb-2 er 5 et differentierings-alloantigen, som er til stede i B-celler, men ikke i T-celler. In vitro studier af disse peptider i induktionstesten viser, at de har samme induktionsspecificitet som thymopoietin. Dvs. at de inducerer differentieringen af Thy-Γ celler til Thy-1+ celler, men at de ikke inducerer differentieringen af Lyb-2~ celler til Lyb-2+ B-celler.

10 Peptiderne ifølge opfindelsen, hvori X er GLU eller D-GLU, udmærker sig ved deres evne til at inducere differentieringen af Thy-Γ celler til Thy-1+ T-celler og også Lyb-2’ til Lyb-2+ B-celler.

Som bemærket ovenfor, har det vist sig, at den tidligere tekniks peptidfragmenter af thymopoeitin og splenin og analoger deraf bliver 15 meget hurtigt nedbrudt enzymatisk i dyr eller mennesker, hvortil de administreres. Halveringstiden for thymopentin (thymopoeitinfragment 32-36) i serum er blevet bestemt til ca. et minut. Splenopentin (det tilsvarende fragment af splenin) er også meget udsat for enzymatisk nedbrydning. De omhandlede peptider udviser imidlertid en væsentligt 20 forøget modstandsdygtighed over for enzymatisk nedbrydning, op til 1.000 gange eller mere i forhold til thymopentin. Denne væsentligt forøgede stabilitet af de omhandlede peptider er godtgjort over for isolerede enzymer fra både dyr (fx. leucinaminopeptidase af både cytosol og mi krosomal oprindelse og carboxypeptidase A, B og C) og over for menneskeligt 25 serum. Illustrative stabilitatsdata vises i de følgende tabeller.

Tabel 1

Peptiders stabilitet over for leucinaminopeptidase 30 Peptid Inkuberingstid, som er nødvendig _for 50% nedbrydning* (minutter)

Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH 15 (thymopentin)

Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-OH 230 35 N-acetyl-Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-M^ >1400

Arg-Ai b-Asp-Val-Tyr-0H 1400

Arg-Cle-Asp-Val-Tyr-OH >1400

O

* 1 x 10 M peptid og 3 enheder/ml porcin LAP-cytosol i 50 mM Tris 8 DK 167928 B1 pH 8,5 puffer med 5 mM MgCl2 ved 37°C.

Tabel 2

Peptiders stabilitet over for carboxypeptidase A 5

Peptid Inkuberingstid, som er nødvendig ______ for 50% nedbrydning* (minutter)

Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH 18

Arg-Aib-Asp-Val-Tyr-OH 26 10 Arg-Aib-Asp-Val-Tyr-^ >450

Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-NH2 >450 N-acetyl -Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-NH2 >1500 _3 * 1 x 10 M peptid og 0,05 enheder/ml kalvecarboxypeptidase 15 A i pH 8,5 boratpuffer ved 37°C.

Tabel 3

Peptiders stabilitet over for humant serum 20 Peptid Inkuberingstid, som er nødvendig __for 50% nedbrydning* (minutter)

Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH 1,5

Arg-Aib-Asp-Val-Tyr-OH 32 N-acetyl-Arg-Aib-Asp-Val-Tyr-OH 40 25 Arg-Aib-Asp-Val-Tyr-NH2 ingen nedbrydning i løbet af 30 minutter N-acetyl-Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-OH 38

Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-NH2 >20 N-acetyl-Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-NH2 ingen nedbrydning i løbet 30 af 30 minutter * 1 pg/rnl peptid i frisk humant serum ved 37°C.

Før den foreliggende opfindelse var det fuldstændig uventet, at man 35 kunne fremstille peptider, som ville have ækvivalent eller forøget thy-mopoeitin-lignende eller splenin-lignende aktivitet og også med i det væsentligste forøget modstandsdygtighed over for enzymatisk nedbrydning.

Det har faktisk vist sig, at mange substituenter i 2-stillingen ødelægger eller signifikant formindsker aktiviteten, mens aktiviteten bibehol- 9 DK 167928 B1 des med mange andre substitutioner i 2-sti 11 i ngen uden at de giver enzym-modstandsdygtighed. Kun med de heri beskrevne substituenter i 2-stillingen tilvejebringes peptider, som samtidig besidder ækvivalent eller forøget biologisk aktivitet og i det væsentlige forøget modstands-5 dygtighed over for enzymatisk nedbrydning sammenlignet med fx. thymopo-eitin.

Som følge af disse egenskaber ved de omhandlede peptider er de terapeutisk værdifulde i behandlingen af mennesker og dyr, idet de er i stand til at inducere differentieringen af lymfopoietiske stamceller fra 10 det hæmopoietiske væv til thymus-afledte celler (T-celler), som er i stand til at indgå i legemets immunreaktion. Som følge heraf antages de omhandlede peptider at have talrige terapeutiske anvendelser. Da forbindelserne er i stand til at udføre visse af de angivne funktioner af thymus, har de primært anvendelse inden for forskellige thymiske funk-15 tions- og immunitetsområder. En sådan anvendelse er behandlingen af DiGeorge-syndrom, en tilstand, hvor der er et medfødt fravær af thymus. Injektion af et af de omhandlede peptider vil afhjælpe denne mangel. Som følge af de omhandlede peptiders modstandsdygtighed over for enzymatisk nedbrydning er de mere terapeutisk effektive end peptider ifølge den 20 tidligere teknik med thymopoietin-lignende aktivitet.

Ydermere betragtes de omhandlede peptider som værdifulde til at assistere ved legemets kollektive immunitet ved at vil forøge eller assistere med terapeutisk stimulering af cellulær immunitet, hvorved de bliver værdifulde til behandlingen af sygdomme, som involverer kronisk 25 infektion såsom svampe- eller mycoplasma-infektioner, tuberkulose, spedalskhed, akutte og kroniske virusinfektioner o.l.

De omhandlede forbindelser antages almindeligvis at være nyttige inden for ethvert område, hvor cellulær immunitet har betydning såsom ved det ovennævnte DiGeorge-syndrom. Når der således er et overskud af 30 antistofproduktion p.g.a. ubalancerede T-celler og B-celler, kan de omhandlede peptider korrigere denne tilstand ved at stimulere T-celle-produktion. De forventes således at være af terapeutisk anvendelse ved visse autoimmun-sygdomme, hvor skadelige antistoffer dannes, såsom systemisk lupus erythematosis, rheumatoid artritis eller lignende.

35 Inden for de bredeste anvendelsesmuligheder af de omhandlede forbindelser er de værdifulde til regulering af en patients immunsystem, dvs. et menneske eller et dyr, som behøver en sådan regulering. Som anvendt heri, betyder udtrykket "regulering", at de omhandlede forbindelser får immunsystemet til at vende tilbage fra en unormal sygelig 10 DK 167928 B1 tilstand til en normal afbalanceret tilstand. Mens denne regulering meget vel kan finde store anvendelsesmuligheder i helbredelsen af immunologiske mangler (fx. DiGeorge-syndrom), er den også anvendelig til helbredelse af tilstande med overskud af immunologisk aktivitet (fx.

5 autoimmun-sygdomme).

Til fremstilling af farmaceutiske præparater forenes et peptid med formel (I) eller et base- eller syreadditionssalt deraf, som den aktive bestanddel, i intim blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer ifølge konventionelle farmaceutiske sammenblandingsteknikker. Denne bærer kan 10 antage en række forskellige former i afhængighed af den til administrering ønskede præparatform, fx. sub-lingual, rektal, nasal, oral eller parenteral. Til fremstilling af præparaterne på oral dosisform kan ethvert af de sædvanlige farmaceutiske medier anvendes som fx. vand, olier, alkoholer, smagsmidler, konserveringsmidler, farvemidler o.1. i 15 tilfælde af orale flydende præparater (fx. suspensioner, eleksirer og opløsninger) eller bærere såsom stivelsesarter, sukkerarter, fortyndere, granuleringsmidler, smøremidler, bindemidler, desintegreringsmidler o.1. i tilfælde af orale faste præparater (fx. pulvere, kapsler og tabletter). Former med kontrolleret frigørelse kan også anvendes. P.g.a. admi-20 nistreringsletheden repræsenterer tabletter og kapsler den mest fordelagtige orale enhedsdosisform, i hvilket tilfælde der naturligvis anvendes faste farmaceutiske bærere. Om ønsket kan tabletterne sukker- eller enterisk overtrækkes ved hjælp af standardteknikker.

Til parenterale præparater vil bæreren sædvanligvis omfatte sterilt 25 vand, selvom andre bestanddele, fx. for at fremme opløselighed, kan tilsættes. Injicerbare suspensioner kan også fremstilles, i hvilket tilfælde der kan anvendes passende flydende bærere, suspensionsmidler o.l.

De omhandlede peptider er almindeligvis aktive, når de administreres i mængder over ca. 10 μg/kg legemsvægt. Til behandling af DiGeorge-syndrom 30 kan peptiderne administreres i en mængde på ca. 10 til ca. 100 μg/kg legemsvægt. Det samme område af dosismængder kan almindeligvis anvendes i behandlingen af de andre nævnte sygdomme eller tilstande.

De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere. I eksemplerne og i hele beskrivelsen er dele vægtdele, med mindre andet er angivet.

35

Eksempel 1 N--Acetyl-Arginyl-Prolyl-Asparagyl-Valyl-Tyrosin-amid

Peptidet syntetiseredes ved en fastfasemetode. Syntesen begyndtes med 4,16 g p-methylbenzhydrylaminharpiks med et substitutionsniveau på 11 DK 167928 B1 0,39 mmol per gram og følgende aminosyrederivater kobledes trinvis med hjælp af dicyclohexylcarbodiimid-hydroxybenzotriazol: B0C(BrZ)Tyr, B0C-Val, B0C-(0-Bzl)Asp, BOC-Pro og A0C-(Ng-tosyl)Arg. Tyrosin genkobledes.

Amyloxycarbonylgruppen fjernedes med tri fluoreddikesyre, harpiksen neu-5 tral i seredes med di isopropyl ethyl amin og aminen acetyleredes med 15% eddikesyreanhydrid i dimethyl formamid. Efter vaskning og tørring vejede harpiksen 6,08 g.

Paptidet spaltedes fra harpiksen med 60 ml flydende HF, som indeholdt 6 ml m-cresol, ved 0°C i 75 minutter. HF fjernedes under reduceret 10 tryk. Remanensen vaskedes med ethyl acetat og ether, dernæst ekstrahere-des peptidet fra harpiksen med 100 ml 5% eddikesyre. Det lyofiliserede ekstrakt vejede 1,042 g.

En 475 mg portion af det rå peptid rensedes ved kromatografi på en 2,6 x 100 cm "SP-Sephadex" kolonne, som elueredes med 50 ml 0,05 M ammo-15 niumacetat pH 5 per time. Fraktionerne 98-122 (10 ml hver) samledes og lyofi liseredes, hvilket gav 462 mg produkt, mere end 99% rent.

HPLC: rt = 9,1 minutter med 12% CH3CN-0,01 M NH^OAc pH 5 ved 1,5 ml/minut på Whatman Porasil Clg.

20 TLC, silicagel 60:

Rf 0,26 3:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20 Rf 0,43 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyr Rf 0,64 1:1 TFE:NH40H

25 Aminosyreanalyse:

Asp, 0,99; Pro, 1,00; Val, 1,00; Tyr, 0,99; Arg, 1,01; 70% peptid. Eksempel 2 N--Acetyl-Argi nyl -Prolyl-Asparaqyl-GIutamyl -Tyrosin 30 Peptidet fremstilledes ved en fastfasemetode, idet der startedes med B0C-Tyr(0BzlCl2)-harpiksester (2536-138, 0,32 meg/g, 3,2 g).

De følgende standardrutiner anvendtes:

Afbeskyttelse - 15 ml 50% TFA/CH2C12 i 1 minut, dernæst 15 ml 50% TFA/CH2C12 i 30 minutter.

35 Vaskning - 15 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver efterfulgt af 15 ml iPrOH i 1 minut, dernæst 15 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver.

Neutralisering - 15 ml 5% DIEA/CHgCT2 to gange i 2,5 minutter hver. Sammenkobling - 3,0 mmol af den beskyttede aminosyre (0,46 g) og HOBT opløstes i 2 ml DMF og fortyndedes dernæst med 13 ml CHgCl^ DCC

12 DK 167928 B1 (0,62 g) opløstes i 3 ml CH2C12· Reaktionstiden var 2 timer.

En sammenkobling for hver var nødvendigt for BOCa-Bzl^-Glu, B0Ca-Bzl^-Asp, BOC-Pro og A0Ca-Tosg-Arg. Efter den sluttelige afbeskyttelse acetyleredes harpikspeptidet i 60 minutter under anvendelse af 10% 5 (vol/vol) AC20 i 15 ml DMF og DMAP (300 mg).

Harpiksen spaltedes i HF/anisol (30 ml/6 ml) i 60 minutter ved 0°C.

Den spaltede harpiksremanens bratkøledes med Et20, filtreredes og det faste stof ekstraheredes med 100 ml 8% HOAc i 30 minutter. Efter filtrering lyofili seredes filtratet, hvilket gav 3219-69HF, 1,23 g.

10 Råpeptidet rensedes på "Sephadex DEAE" (2,6 x 90 cm kolonne, 3 1, 0,2 M NH4HC03, pH 7,8, efterfulgt af 2 1, 0,33 M NH4HC03 , pH 7,8, som eluent, strømningshastighed 75 ml/time, 13 ml/fraktion, detektion ved 277 nm). Fraktionerne 214-236 opsamledes og lyofili seredes, hvilket gav den ønskede forbindelse som et farveløst fast stof, 450 mg, 53%.

15

Aminosyreanal.yse

Aminosyre Forhold

Arg 1,00

Pro 1,04 20 Asp 0,99 85,1% peptidindhold

Glu 1,00

Tyr 0,98

Tyndtlagskromatografi: silicagel G, 250 μ 25

Eluent 3:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H2O 0731 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyridin 0,45 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,60 30

Eksempel 3 N--Succinoy1 -Arg i ny 1 -Prolyl -Asparagyl -Valyl -Tyrosin

Peptidet fremstilledes ved en fastfasemetode, idet der startedes med BOC-Tyr-(BzlCl2)-harpiksester (0,32 meg/g, 3,2 g). De følgende 35 standardrutiner anvendtes:

Afbeskyttelse - 15 ml 50% TFA/CH2C12 i 1 minut, dernæst 15 ml 50% TFA/CH2C12 i 30 minutter.

Vaskning - 15 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver efterfulgt af 15 ml iPrOH i 1 minut, dernæst 15 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver.

13 DK 167928 B1

Neutralisering - 15 ml 5% DIEA/CH2C12 to gange i 2,5 minutter hver. Sammenkobling - 3,0 mmol af den beskyttede aminosyre (0,46 g) og HOBT opløstes i 2 ml DMF og fortyndedes dernæst med 13 ml CHgCl2. DCC (0,62 g) opløstes i 3 ml CH2C12. Reaktionsblandingen omrørtes i 2 timer.

5 Harpiksen sammenkobl edes i rækkefølge en gang med BOC-Val, to gange med BOCa-Bzl^-Asp og en gang hver med BOC-Pro, A0Ca-Tos^-Arg og p-Anisyl-succinat.

Harpiksen spaltedes i HF/anisol (30 ml/7 ml) i 1 time ved 0°C. Harpiksremanensen bratkøledes med Et^O og filtreredes. De faste stoffer 10 ekstraheredes med 1% NH^OH (100 ml) i 1 time, filtreredes og ekstraksen lyofili seredes, hvilket gav 0,88 g 3219-72HF som et farveløst, sprødt skum.

Råpeptidet rensedes på "Sephadex DEAE" (2,6 x 90 cm kolonne, 0,33 M NH^HCOg, pH 7,8, som eluent, 75 ml/time, 13 ml/fraktion, detektion ved 15 276 nm). Fraktionerne 103-122 samledes i en pøl og lyofili seredes, hvilket gav den ønskede forbindelse som et farveløst fast stof, 710 mg, 78%.

Aminosyreanalyse

Aminosyre Forhold 20 Arg 1,01

Pro 1,02

Asp 0,99 82,7% peptidindhold

Val 1,00

Tyr 0,97 25

Tyndtlagskromatografi: silicagel G, 250 μ

Eluent 3:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20 0751 30 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyridin 0,54 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,61

Eksempel 4 N--Formyl-Argi ny1-Prolyl-Asparagyl-Valyl-Tyrosin 35 Titel forbi ndel sen fremstilledes ved en fastfasemetode, idet der startedes med BOC-Tyr (BzlCl2) harpiksester (0,32 meg/g, 4,7 g).

De følgende standardrutiner anvendtes:

Afbeskytte!se - 25 ml 50% TFA/CH2C12 i 1 minut, dernæst 25 ml 50% TFA/CH2C12 i 30 minutter.

14 DK 167928 B1

Vaskning - 25 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver efterfulgt af 25 ml iPrOH i 1 minut, dernæst 25 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver. Neutralisering - 25 ml 5% DIEA/CH2C12 to gange i 2,5 minutter hver. Sammenkobling - 4,5 mmol af den beskyttede aminosyre (0,69 g) og 5 HOBT (0,46 g) opløstes i 3 ml DMF og fortyndedes dernæst med 25 ml CH2C12· DCC (0,93 g) opløstes i 5 ml CH2C12, sattes til blandingen af reaktanter og harpiks og omrørtes i 2 timer.

Harpiksen sammenkobl edes i rækkefølge en gang med BOC-Val, BOC -Bzl^-Asp, BOC-Pro og A0Ca-Tos^-Arg. Harpiksen afbeskyttedes dernæst, 10 neutraliseredes og formyleredes med p-nitrophenylformi at (RC, 1,0 g), diemthylaminopyridin (0,3 g) i CH2C12 i 16 timer.

Harpiksen vaskedes, lufttørredes og spaltedes med HF/anisol (30 ml/5 ml) i I time ved 0°C. Harpiksremanensen bratkøledes med Et20 og filtreredes. De faste stoffer ekstraheredes med 1% NH40H (100 ml) og 15 lyofiliseredes, hvilket gav 1,54 g råpeptid.

Råpeptidet rensedes på "Sephadex DEAE" (2,6 x 85 cm kolonne, 0,1 M NH^HCOg, pH 7,8, som eluent, strømningshastighed 100 ml/time, 13 ml/fraktion, detektion ved 280 nm). Fraktionerne 136-170 opsamledes og lyofiliseredes, hvilket gav den ønskede forbindelse, 725 mg, 71%.

20

Aminos.yreanalyse

Aminosyre Forhold

Arg 1,04

Pro 0,95 25 Asp 1,01 100% peptidindhold

Val 1,02

Tyr 0,98

Tyndt!agskromatografi: silicagel G, 250 30

Eluent 1:1 trifluorethanol:NH^OH 0764 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyridin 0,50 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,60 35

Eksempel 5 N--Acetyl-Arginyl-Pro!yl-Asparaqyl-Isoleucyl-Tyrosin, opløst

Titel forbi ndel sen fremstilledes ved en fastfasemetode, idet der startedes med B0C-Tyr-(BzlCl2)-harpiksester (0,32 meg/g, 2,4 g).

15 DK 167928 B1

De følgende standardrutiner anvendtes:

Afbeskyttelse - 20 ml 50% TFA/CH^Clg i 1 minut, dernæst 20 ml 50% TFA/CHC1 i 30 minutter.

Vaskning - 20 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver efterfulgt af 20 ml 5 iPrOH i 1 minut, dernæst 20 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver.

Neutralisering - 20 ml 5% DIEA/C^Cl^ to gange i 2,5 minutter hver. Sammenkobling - 3,0 mmol af den beskyttede aminosyre (0,46 g) og HOBT opløstes i 2 ml DMF og fortyndedes dernæst med 13 ml CH2C12* DCC (0,62 g) opløstes i 3 ml CH2C12, sattes til blandingen af reaktanter og 10 harpiks og omrørtes i 2 timer.

Harpiksen sammenkobl edes i rækkefølge en gang med BOC-Ile 1/2 Η,,Ο, BOCa-Bzl^-Asp, BOC-Pro og AOCa-Tosg-Arg. Efter afbeskyttelse acyleredes harpiksen med Ac^O (1,8 ml) og DMAP (0,3 g) i DMF (15 ml) i 2 timer. Harpiksen vaskedes, lufttørredes og spaltedes i HF/anisol (30 ml/4 ml) i 15 1 time ved 0°C.

Harpiksremanensen bratkøledes med Et20 og filtreredes. De faste stoffer ekstraheredes med 1% NH^OH (100 ml) i 1 time, filtreredes og ekstrakten lyofili seredes, hvilket gav 2,1 g 3219-87 HF som et farveløst fast stof.

20 Råpeptidet rensedes på "Sephadex DEAE" (2,6 x 85 cm kolonne, 0,1 M NH^HCOj, pH 7,5, 80 ml/time, 11 ml/fraktion, detektion ved 287 nm). Fraktionerne 135-160 samledes og lyofiliseredes to gange, hvilket gav den ønskede forbindelse som et farveløst fast stof, 432 mg, 65% udbytte.

25 Aminosyreanalvse

Aminosyre Forhold

Arg 1,01

Pro 1,02

Asp 1,00 70,5% peptidindhold 30 Ile 0,94

Tyr 0,99

Tyndtlagskromatografi: silicagel G, 250 μ

Eluent Rf 35 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,42 5:5:3:1 Et0Ac:Pyr:H20:H0Ac 0,49 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:Pyr 0,53

Eksempel 6 16 DK 167928 B1 N--Acetyl -D-Arqinyl -Prolyl -Asparagyl -Valyl -Tyrosin

Titelforbindelsen fremstilledes som følger: N-t-butyloxycarbonyl-Prolyl -(ff-benzyl)Asparagyl-Valyl-Tyrosin-5 benzyl ester

Til 100 ml methylenchlorid og 50 ml mættet natriumbicarbonatop-løsning sattes 9,40 g 03-Bzl) Asp-Val-Tyr-OBzl-trifluoracetat. Der tilsattes en lille mængde dimethyl formamid for at opløse peptidet.

Lagene adskiltes og det organiske lag ekstraheredes med mættet na-10 triumbicarbonatopløsning. Det organiske lag tørredes over vandfrit natriumsulfat, volumenet reduceredes dernæst til ca. 50 ml ved ro-tationsinddampning. Denne opløsning sattes til 2,80 g N-t-butyloxy-carbonyl-Prolin. Opløsningen nedkøledes til 5° og der tilsattes 2,70 g dicyclohexylcarbodiimid i 15 ml methylenchlorid. Blandingen omrørtes 15 ved 5° i 1 time og henstod dernæst ved 15° i 16 timer. Reaktionsblandingen reduceredes til et lille volumen ved rotationsinddampning. 150 ml ethylacetat sattes til remanensen og blandingen filtreredes. Filtratet ekstraheredes med vand, 10% citronsyreopløsning og mættet natriumbicar-bonatopløsning. Tørring og fjernelse af opløsningsmiddel gav 10,97 g af 20 et glas. Produktet omkrystalliseredes fra ethylacetat-hexan, hvilket gav 8,85 g, smp. 74-76°. Omkrystallisation fra ethylacetat-petroleumsether under let opvarmning gav 7,73 g, smp. 75-78°. TLC, silicagel 60: 0,68 med 9:1 CH2Cl2:MeOH.

25 N--t-butyloxycarbonyl-(N^-Tosyl)-D-arginyl-Prolyl -(ff-benzyl)-Asparagyl-Valyl-Tyrosin-benzylester

Til 2,31 g B0C-Pro-(/J-Bzl)Asp-Val-TyrOBzl sattes 20 ml 4,0 N HC1 i dioxan. Efter omrøring i 1 time fjernedes det meste af opløsningsmidlet ved rotationsinddampning. Tilsætning af ether til rema-30 nensen gav et fast stof, der filtreredes og vaskedes med ether. Saltet blandedes med 1,20 g N-t-butyloxycarbonyl(N^-tosyl)-D-Argi-nin i 20 ml 3:1 methylenchlorid-dimethylformamid. Opløsningen nedkøl edes til 5° og der tilsattes 0,61 ml di isopropyl ethyl ami η, 0,30 g 1-hydroxybenzotriazol og 0,58 g dicyclohexylcarbodiimid. Blandingen 35 omrørtes ved 5° i 30 minutter og henstod dernæst ved stuetemperatur i 16 timer. Reaktionsblandingen filtreredes og opløsningsmidlet fjernedes ved rotationsinddampning. Til remanensen sattes ethylacetat og vand. Lagene adskiltes og det organiske lag ekstraheredes med '10% citronsyreopløsning, mættet natriumbicarbonatopløsning og mættet 17 DK 167928 B1 natriumchloridopløsning. Fjernelse af opløsningsmiddel gav et glas, der .omkrystalli seredes fra ethylacetat-petroleumsether. Produktet opnåedes fra opløsningen som en gummi, men størknede til et hvidt pulver, når det tritureredes med petroleumsether. Produktet vejede 1,84 g.

5 N~-Acet,yl - (N^-tos.yl) -D-Arginyl -Prolyl - (fl-benzyl lAsparagyl -Val.yl -Tyrosin-benzylester

En 0,87 g portion af det beskyttede pentapeptid behandledes med 20 ml 50% tri fluoreddikesyre i methylenchlorid i 30 minutter. Fjernelse af 10 opløsningsmiddel og tilsætning af ether til remanensen gav et fast stof. Produktet opløstes i 10 ml dimethyl formamid, der tilsattes 0,15 ml di-isopropylethylamin efterfulgt af 0,5 ml eddikesyreanhydrid og 0,1 g 4-dimethylaminopyridin og blandingen omrørtes i 45 minutter. Det meste af opløsningsmidlet afdampedes. Til remanensen sattes 0,5 N natriumbicar-15 bonatopløsning, hvilket resulterede i en creme-agtig suspension. Der tilsattes ethyl acetat og det organiske lag ekstraheredes med vand, 10% citronsyreopløsning og mættet natriumchloridopløsning. Fjernelse af opløsningsmiddel gav en gummi, der vejede 0,69 g. Dette materiale afbe-skyttedes uden rensning.

20 N--acety1 -D-Arginyl - Prolyl -Asparagyl -Val.yl -Tyrosin 0,69 g beskyttet peptid anbragtes i en reaktionsbeholder af Teflon. Der tilsattes 3 ml m-cresol og 30 ml HF og blandingen omrørtes ved 0° i 1 time. HF fjernedes under vakuum. Peptidet udfældedes med 25 ethylacetat-ether og vaskedes med dette opløsningsmiddel. Peptidet opløstes i 3% eddikesyre og lyofili seredes. Produktet vejede 276 mg.

Peptidet rensedes ved kromatografi på en 1,6 x 60 cm "DEAE-Sepha-dex" kolonne, som elueredes med 0,10 N ammoniumbicarbonat, pH 8,0. Der opsamledes 120 dråber/fraktion. Hovedkomponenten eluerede med toppen 30 centreret i fraktion 82. Toppens sidste halvdel indeholdt en urenhed, hvilket vistes ved hjælp af HPLC. Fraktioner 77-82 kombineredes og lyofil i seredes. Produktet vejede 65 mg.

HPLC, Whatman C^g-Porasil: rt = 8,8 min. med 8% CH^CN-O,01 M

35 NH^OAc pH 5 ved 1,5 ml/min.

TLC, silicagel GF, 250 u:

Rf Opløsningsmiddelsystem 0736 3:1:1 n-BuOH:HOAc:H20 18 DK 167928 B1 0,67 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,55 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyr

Aminosyreanalyse 5 Asp, 1,01; Pro, 0,99; Val, 0,99; Tyr, 1,01; Arg, 1,02; 100% peptid.

Eksempel 7 N--Acetyl-Argi ny1-Prolyl-Asparaqyl-Phenylal any!-Tyrosin

Pepti det syntetiseredes ved en fastfasemetode på en "Beckman 10 990B Automatic Peptide Synthesizer". 50% trifluoreddikesyre-methylen-chlorid anvendtes til afbeskyttelse, 5% di isopropyl ethylamin i CH2C12 til neutralisering og dicyclohexylcarbodiimid/l-hydroxybenzotriazol •til sammenkobling. Der anvendtes følgende udgangsmaterialer: 2.00 g B0C-(Cl2Bzl)-Tyr-harpiksester, 0,32 meq/g, 0,51 g BOC-Phe, 2 x 15 0,62 g B0C-(/?-Bzl)Asp, 0,42 g BOC-Pro og 0,85 g AOC-(Ng-tosyl)Arg. Efter inkorporering af Arg afbeskyttedes harpiksen, neutraliseredes og omsattes med 5 ml eddikesyreanhydrid i 20 ml dimethyl formamid i 20 minutter. Remanensen vaskedes og tørredes, vægten var 2,73 g.

Peptidharpiksen behandledes med 30 ml HF og 3 ml m-cresol ved 0° i 20 50 minutter. Efter afdampning af HF vaskedes produktet med ethyl acetat og ether. Peptidet ekstraheredes med 100 ml 5% eddikesyre. Den filtrerede opløsning lyofili seredes, hvilket gav 798 mg råt produkt.

En 389 mg portion af råpeptidet rensedes ved kromatografi på en 1,6 x 60 cm "DEAE-Sephadex" kolonne, som elueredes med 0,10 N NH^HCOg, pH 25 8,0. Der opsamledes fraktioner på 150 dråber hver. Fraktionerne 75-86 kombineredes og lyofili seredes. Produktet vejede 171 mg. HPLC viste kun spor af urenhed, rt 8,2 min. med 12,5% CHgCN-0,01 M NH^OAc, pH 5, ved 2.0 ml per min. på "Whatman C^g-Porasil" analytisk kolonne.

30 TLC, silicagel 60: R.p Opløsningsmiddel system 0721 3:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20 0,48 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyr 35 0,59 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:EtoAc

Aminosyreanalyse

Asp, 0,96; Pro, 1,00; Tyr, 1,01; Phe, 1,01; Arg, 1,02; 100% peptid.

19 DK 167928 B1

Eksempel 8 N--Acety1-Arginyl-Prolyl-Asparaqyl-Glutaminyl-Tyrosin

Peptidet syntetiseredes ved en fastfasemetode. Harpiksen afbeskyttedes med 50% tri fluoreddikesyre i methylenchlorid, neutralisere-5 des med 5% di isopropyl ethyl amin i methylenchlorid og sammenkobledes med dicyclohexylcarbodiimid og 1-hydroxybenzotriazol med undtagelse af Gin, der inkorporeredes ved hjælp af p-nitrophenylester deraf. Der anvendtes de følgende udgangsmaterialer: 2,00 g N-t-butyloxycarbonyl-(0-dichlorbenzyl)-Tyrosin-harpiksester, 0,32 mækv./g, 0,94 g N-t-butyloxy-10 carbonyl-GIutamin-p-nitrophenylester, 0,62 g N-t-butyloxycarbonyl-(/J-benzyl)-Asparaginsyre, 0,41 g N-t-butyl-oxycarbonyl-Prolin og 0,85 Na-t-butyloxycarbonyl(N^-tosyl)-Arginin. Gin og Asp sammenkobl edes igen.

Efter inkorporering af Arg afbeskyttedes harpiksen, neutraliseredes og omsattes med 5 ml eddikesyreanhydrid og 1,25 ml di isopropyl ethyl amin i 15 20 ml dimethyl formamid i 20 minutter. Efter vaskning vakuumtørredes remanensen, hvilket gav 2,75 g.

Peptidet spaltedes med 30 ml HF og 3 ml m-cresol ved 0° i 1 time.

HF fjernedes under vakuum og remanensen vaskedes med ethyl acetat og ether. Peptidet ekstraheredes med 150 ml 2% eddikesyre. Det filtrerede 20 ekstrakt lyofiliseredes, hvilket gav 688 mg produkt.

Produktet rensedes ved kromatografi på en 2,6 x 90 cm "DEAE-Sephadex" kolonne, som elueredes med 1,2 1 0,10 M ammoniumbicar-bonat, pH 8,0, dernæst med 0,20 M pH 8 puffer. Fraktionerne af hovedtoppen (λ 278 nm), der var ren ifølge HPLC, kombineredes og 25 lyofili seredes. Produktet vejede 288 mg.

TLC, silicaqel 60: R.p Opløsningsmiddel system 30 0717 3:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20 0,31 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyr 0,36 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:EtoAc

Aminosyreanalyse 35 Asp, 0,99; Glx, 0,99; Pro, 1,03; Tyr, 0,98; Arg, 1,01; 100% peptid.

Eksempel 9 N--Acetyl-Arginyl-Prolyl-Asparaqyl-Valyl-D-Tyrosin Titel forbi ndel sen fremstilledes som følger: 20 DK 167928 B1 BQC-D-Tyr(2BrZ)-Q-CHo-harpiks

Chlormethyleretfpolymer (0,88 mækv./g, 1,13 g, 1 mmol) og vandfrit KF (0,17 g, 3 mmol) sattes til en opløsning af B0C-D-Tyr(2BrZ) (0,74 g, 1,5 mmol) i 4 ml DMF i en rundbundet kolbe udstyret med en topophængt 5 omrører. Reaktionsblandingen omrørtes ved 50°C i 24 timer. Harpiksen frafiltreredes og vaskedes med DMF (3 x 25 ml), 50% DMF/HgO (3 x 25 ml), 50% EtOH/HgO (3 x 25 ml) og EtOH (3 x 25 ml). Substitutionen af BOC-D-Tyr(2BrZ) på harpiksen var 0,35 mmol per gram harpiks baseret på aminosyreanalyse.

10 AQC-Arg(Tos)-Pro-Asp-(0Bzl)-Val-D-Tyr(2BrZ)-0-CH,,-harpiks AOC-Arg (Tos) -Pro-Asp (OBzl) -Val -D-Tyr (2BrZ) -0-CH,,-harpi ks syntetiseredes manuelt ved en fastfasemetode. Aminosyrederivaterne og DCC anvendtes i tredobbelt overskud med et ækvivalent HOBT 15 tilsat til de følgende sammenkoblinger: Aoc-Arg(Tos), Boc-Pro, Boc-Asp(OBzl) og BOC-Val. Udover DCC/HOBT-sammenkobl ingerne var det nødvendigt, at på forhånd dannede symmetriske anhydridsammen-koblinger for at sikre en fuldstændig omsætning af BOC-Val og BOC-Asp(OBzl). Anhydriderne dannedes før sammenkobling ved tilsætning 20 af 1,5 ækv. DCC til 3 ækv. aminosyrederivat ved 0° i 1 time. DCC frafiltreredes før tilsætning til harpikspeptidet. Der anvendtes det følgende synteseprogram: I. 50% TFA/CH2C12 (2 min., 15 min.) 25 2. CH2C12 (2 x 2 min.) 3. 50% TFA/CH2C12 (25 min.) 4. CH2C12 (3x2 min.) 5. isopropanol (2 x 1 min.) 6. CH2C12 (4x2 min.) 30 7. 7% DIEA/CHgCl2 (1x3 min.); 2. behandling (2 min., 5 min.) 8. CHgCl2 (2 x 2 min.) 9. 7% DIEA/CH2C12 (3 min., 4 min.) 10. CH2C12 (5x2 min.) II. koble næste aminosyre i CH2C12 35 12. blande i 5 minutter 13. tilsætte DCC og HOBt i CH2C12/DMF (10:1) 14. blande natten over 15. CH2C12 (5 x 2 min.) 15. ninhydrintest (hvis omsætning ikke er fuldstændig, gentages trin 7- 16).

21 DK 167928 B1 AOC-gruppen på Arg fjernedes med 50% TA/CH^C^ før acetylering.

5 Ac-Arq(Tos)-Pro-Asp(OBzl l-Val-D-Tyr^BrZl-O-CHo-harpiks TFA Arg (Tos)-Pro-Asp(0Bzl)-Val-D-Tyr(2BrZ)-0-CH2-R (~1 mmol) om-rørtes i en rundbundet kolbe med eddikesyreanhydrid (1,02 g, 10 mmol) i to timer ved stuetemperatur i 1:1 DMF/pyridinopløsning. Den acetylerede peptidharpiks overførtes til en sintret glastragt og vaskedes med DMF.

10 Produktet tørredes i vakuum, hvilket gav 1,17 g rå acetyleret peptidharpiks.

HF-spaltninq

Ac-Arg(Tos)-Pro-Asp(0Bzl)-Val-D-Tyr(2BrZ)-O-CHg-harpi ks (1,17 g) spaltedes med 12 ml HF i nærværelse af 10% anisol ved 0°C i 1 time. Pep-15 tidharpiksen overførtes til en sintret glastragt og vaskedes grundigt med ether. Peptidet ekstraheredes med 10% HOAc/H^O (5 x 10 ml) og dernæst med H^O og lyofili seredes, hvilket gav 210 mg peptid.

Rensning af Ac-Arq-Pro-Asp-Val-D-Tyr 20 Den rå Ac-Arg-Pro-Asp-Val-D-Tyr kromatograferedes på en "Sephadex SPC-25" kolonne (2,5 cm x 100 cm), som var blevet ækvilibreret med 0,05 M NH^OAc (pH 4,5). Strømningshastigheden var 61 ml/time og der opsamledes fraktioner på 12 ml/rør. UV-monitoren sattes på λ=277 nm. Det ønskede produkt elueredes mellem rør 23-28. Fraktionerne samledes og 25 lyofili seredes, hvilket gav 140 mg peptid (25% peptid).

Afsaltning af Ac-Arg-Pro-Asp-Val-D-Tyr

Da gentagen lyofili sering af den rensede Ac-Arg-Pro-Asp-Val-D-Tyr ikke forøgede peptidindholdet, anvendtes en "Sephadex G-10" 30 kolonne til afsaltning af peptidet. Kolonnen ækvilibreredes med H^0 og kørtes med en strømningshastighed på 30 ml/time. Fraktioner på 10 ml/rør opsamledes med UV-monitoren sat på 207 nm til detektion af produktet. Peptidet eluerede mellem fraktioner 21-31. Disse fraktioner samledes og lyofili seredes, hvilket gav 130 mg af et meget 35 hygroskopt materiale (33% peptid).

Tyndtlagskromatoqrafi, silicaqel F60, 200 u

Rf Opløsningsmiddelsystem 22 DK 167928 B1 0,43 n-BuOH/HOAc/HgO/pyr - 15:3:12:10 0,60 n-BuOH/HOAc/H^O/EtOAC - 1:1:1:1

Aminosyreanalyse: 5

Syrehydrolyse Asp, 0,99; Pro, 0,98; Val, 1,03; Tyr, 0,97;

Arg, 1,02.

Leucinaminopeptidase (LAP) nedbrydning: Asp, 0,00; Pro, 0,00;

Val, 0,00; Tyr, 0,00; Arg, 0,00; (0,00 betyder, at der ikke blev 10 iagttaget frigjort aminosyre).

Eksempel 10 N--Acetyl -Arginyl-Prolyl-Asparagyl-Valyl-Tyrosin

Titelforbindelsen fremstilledes ved en fastfasemetode, idet der 15 startedes med B0C-Tyr(BzlCl g)-harpiksester (6,50 g, 0,32 mækv./g).

Der anvendtes de følgende standardrutiner:

Af beskyttelse - 40 ml 50% TFA/CHgClg i 1 minut, dernæst 40 ml 50% TFA/Ch^Cl^ i 30 minutter.

20 Vaskning - 40 ml CHgC^ to gange i 1 minut hver efterfulgt af 40 ml iPrOH i 1 minut, dernæst 40 ml CHgClg to gange i 1 minut hver.

Neutralisering - 40 ml 5% DIEA/CH^Clg to gange i 2,5 minutter hver. Sammenkobling - 6,0 mmol af den beskyttede aminosyre (0,92 g) og HOBT opløstes i 3 ml DMF og fortyndedes dernæst med 27 ml CHgClg. DCC 25 (1,24 g) opløstes i 5 ml CHgClg» sattes til blandingen af reaktanter og harpiks og der omrørtes i 2 timer.

Harpiksen sammenkobl edes i rækkefølge en gang hver med BOC-Val, BOC-Bzl^-Asp og BOC-Pro. Halvdelen af harpiksen opbevaredes og resten sammenkobl edes med A0Ca-Tos^-Arg. Efter afbeskyttelse acetyleredes 30 peptidet en gang med 10% ACgO i 1:1 DMF: CH2C1^ (30 ml) og DMAP (400 mg) i 60 minutter. Harpiksen vaskedes, lufttørredes og spaltedes i HF/anisol (30 ml/8 ml) i 1 time ved 0°C.

Harpiksremanensen bratkøledes i EtgO og filtreredes. De faste stoffer ekstraheredes med 10% HOAc (100 ml) i 1 time, filtreredes og 35 ekstrakten lyofil i seredes, hvilket gav produktet som et farveløst fast stof.

Råpeptidet rensedes på "QAE-Sephadex" (2,6 x 88 cm kolonne, 41, 0,05 til 0,3 M NH^HCOg gradient, pH 7,2, 100 ml/time, 9 ml/fraktion, detektion ved 278 nm). Fraktionerne 120-140 samledes og lyofiliseredes.

23 DK 167928 B1

Det resterende peptid afsaltedes på "G-1+ Sephadex" (2,6 x 85 cm kolonne, 1% HOAc som eluent). Det lyofiliserede acetylpentapeptid vejede 830 mg.

5 Aminosyreanalyse

Aminosyre Forhold

Arg 1,03

Pro 0,99

Asp 1,00 75,1% peptidindhold 10 Val 1,00

Tyr 0,97

Tyndtlagskromatografi: silicagel G, 250 μ 15 Opløsningsmiddel system 15:3:12:10 n-BuOH: HOAc :1^0: pyri din 0,56 1:1:1:1 n-BuOH:HOAc:H20:Et0Ac 0,62 3:1:1 n-BuOH:HOAc:H20 0,51 20 Eksempel 11

Arqinvl -D-Prolyl -Asparagyl - Val.yl -Tyrosin

Titel forbi ndel sen fremstilledes som følger: N-t-butyl oxycarbon.yl -D-Prol.yl -(ff-benzyl )Asparagy1 -Val.yl -Tyrosin-25 benzyl ester

Til 4,00 g TFA-(/J-Bzl )Asp-Val-Tyr-OBzl (indeholdende 15% overskydende TFA) sattes 40 ml methylenchlorid og 40 ml mættet natriumbicarbonatopløsning. Blandingen omrørtes kraftigt og lagene adskiltes dernæst. Det organiske lag ekstraheredes med bicarbonat-30 opløsning og tørredes dernæst. Fjernelse af opløsningsmiddel gav et hvidt fast stof. Dette materiale opløstes i 45 ml 8:1 CH2C12:DMF.

Der sattes 1,08 g N-t-butyloxycarbonyl-D-Prolin (Peninsula) og 0,1 g 1-hydroxybenzotriazol til opløsningen. Opløsningen afkøledes på et isbad og der tilsattes 1,03 g dicyclohexylcarbodiimid. Blandingen 35 omrørtes på isbadet i 90 minutter og i 90 minutter ved stuetemperatur. Bundfaldet frafiltreredes. Filtratet ekstraheredes med 10% citronsyreopløsning, vand og mættet natriumbicarbonatopløsning. Fjernelse af opløsningsmiddel gav et glas, der omkrystalli seredes fra ethylacetat-hexan. Produktet vejede 3,33 g, smp. 82-88° (dek.).

24 DK 167928 B1

Tri-benzyl oxycarbonyl -Arginyl -D-Prolyl -(ft-benzyl )Asparagyl -Valyl -Tyrosi n-benzyl ester

Til 3,31 g af det ovenfor beskyttede tetrapeptid sattes 40 ml 50% trifluoreddikesyre i methylenchlorid. Efter omrøring i 30 minutter af-5 dampedes opløsningsmidlet og ether sattes til remanensen. Det faste produkt opløstes i ethyl acetat under tilsætning af en lille mængde methanol. Opløsningen ekstraheredes to gange med mættet natriumbicarbo-natopløsning. Det faste stof fra fjernelsen af opløsningsmidlet fra det organiske lag opløstes i 10 ml DMF og sattes til en opløsning af 2,77 g 10 tri benzyloxycarbonyl-argi nin (Bachem) i 5 ml DMF. Opløsningen afkøledes på et isbad og der tilsattes 0,66 g 1-hydroxybenzotriazol efterfulgt af 0,89 g dicyclohexylcarbodiimid. Reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i 16 timer. Det meste af opløsningsmidlet fjernedes under vakuum. Der sattes ethyl acetat til remanensen og de uopløselige bestand-15 dele frafiltreredes. Filtratet ekstraheredes med 10% citronsyreopløsning og to gange med mættet natriumbicarbonatopløsning. Tørring og fjernelse af opløsningsmiddel gav et tykt olieprodukt. Dette materiale kromatogra-feredes på "Silicagel 60" med en gradient af 3-10% methanol i methylen-chlorid. Der opnåedes et farveløst glasprodukt, der vejede 4,14 g.

20

Arginyl-D-Prolyl-Asparagyl-Valyl-Tyrosin

En 1,66 g portion af det beskyttede pentapeptid hydrogeneredes med 1 ml myresyre i 20 ml methanol over 0,5 g palladium-sort. Efter 4 timers kraftig omrøring frafiltreredes katalysatoren og opløsningsmidlet fjer-25 nedes fra filtratet ved rotationsinddampning. Remanensen opløstes i 5% vandig eddikesyre og lyofiliseredes. Produktet vejede 889 mg.

Peptidet rensedes ved kromatografi på en 2,6 x 95 cm "DEAE-Sephadex” kolonne. Nogle materialer, der ikke blev opløst i 0,25 M NH^HCOg, pH 8,0, frafi 1 treredes og filtratet hældtes på kolonnen.

30 Kolonnen elueredes med denne puffer ved 100 ml/time og der opsamledes 10 ml's fraktioner. Hovedkomponenten opsamledes i fraktionerne 142-156. Det lyofiliserede produkt vejede 634 mg.

HPLC: rt - 6,5 min. med 8% CH3CN - 0,01 M NH40Ac pH 5 ved 1,5 ml/min. på "Whatman Cjg-Porasil".

35 TLC: Silicagel GF, 250 μ R^ Opløsningsmiddel system 0742 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 5 25 DK 167928 B1 0,34 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyr

0,53 1:1 TFE:NH4OH

Aminosyreanalyse

Asp, 0,99; Pro, 0,98; Val, 1,01; Tyr, 1,00; Arg, 1,03; 94% peptid.

Eksempel 12 10 N--Acet,yl-Arqinyl-Prolyl-Asparagyl-Valyl-Tyrosin-N-Isobutylanrid

Titel forbi ndel sen fremstilledes som følger: A. Til en omrørt opløsning af Pro-OCH^iHCl (55,2 g, 33,3 mmol), A0Ca-Tosg-Arg (89,6%, 16,4 g, 33,3 mmol) og 1-hydroxybenzo- 15 triazol (HOBT, 5,10 g, 33,3 mmol) i DMF (15 ml) og CHgCl2 (50 ml) ved 0°C sattes N-methylmorpholin (NMM, 385 ml, 1,1 ækv.). Dernæst tilsattes dråbevis en opløsning af DCC (6,88 g, 1,0 ækv.) i C^Clg (10 ml). Efter 5 minutter opvarmedes reaktionsblandingen til stuetemperatur og omrørtes i 90 minutter. Det resulterende faste stof 20 frafiltreredes og filtratet inddampedes, hvilket gav en gul olie. Denne olie suspenderedes i EtOAc (200 ml) og filtreredes igen. Opløsningen vaskedes to gange med mættet vandig NaHC03, en gang med H20, en gang med 10% citronsyre og en gang med mættet saltvand. Det organiske lag tørredes over Na2S04, filtreredes og inddampedes, hvilket gav 17,90 g af et 25 farveløst skum. Reaktionsblandingen rensedes i 3 lige portioner ved lynkromatografi (5 x 15 cm kolonne, 5:3 CH2C12:acetone som eluent), hvilket gav methyl-Ng-Tosyl-Na-t-amyloxycarbonyl-arginyl-prolinat (produkt A) som et farveløst glas, 13,41 g, 73%.

B. Til en omrørt opløsning af produkt A (5,54 g, 10,0 mmol)

30 i CH30H (25 ml) ved 5°C sattes afkølet H20 (20 ml) og 2,00 M NaOH

(vandigt) (5,00 ml, 10,0 mmol). Den resulterende farveløse opløsning holdtes ved 5-10°C i 18 timer og opvarmedes dernæst til stuetemperatur i 1 time. Opløsningen inddampedes til ca. 25 ml, indstilledes til pH 9,8 og ekstraheredes en gang med Et20. Den vandige remanens behandledes med 35 fast citronsyre til pH 2,8 og mættedes dernæst med NaCl. De organiske lag ekstraheredes tre gange med EtOAc, kombineredes, tilbage-vaskedes en gang med mættet saltvand, tørredes over Na2S04, filtreredes og inddampedes, hvilket gav Ng-Tosyl-Na-t-amyloxycarbonyl-arginyl-prolin (produkt B) som et farveløst fast stof, 5,30 g, 98%, smp. 114-115°C.

26 DK 167928 B1 C. Til en omrørt opløsning af BOC-Tyr(BrZ) (4,94 g, 10,0 mmol) i EtOAc (40 ml) sattes N-methylmorpholin (NMM, 1,21 ml, 1,1 ækv.). Opløsningen afkøledes til -20°C og iBuOCOCl (1,33 ml, 1,02 ækv.) tilsattes dråbevis. En tyk masse, der ikke kunne omrøres, 5 dannedes efter ca. 10 minutter. Reaktionsblandingen opvarmedes til stuetemperatur, fortyndedes med EtOAc (150 ml) og vaskedes en gang med 1^0, en gang med 10% citronsyre, en gang med f^O, en gang med mættet vandigt NaHCOj og en gang med mættet saltvand. Det organiske lag tørredes over MgSO^, filtreredes og inddampedes, hvilket gav N-t-10 butyloxycarbonyl-0-(2-brombenzyloxycarbonyl)-tyrosin-N-isobutylamid (produkt C) som et farveløst fast stof, der var tilstrækkelig rent til yderligere brug, 5,10 g, 93%.

D. Til produkt C (4,19 g, 7,63 mmol) sattes 50% TFA/CH2C12 (14 ml). Efter omrøring i 40 minutter inddampedes opløsningen ved en 15 temperatur under 30°C og holdtes under vakuum natten over, hvilket gav produkt Dl som en gul olie, 5,65 g.

Til en omrørt opløsning af BOC-Val (1,66, 1,00 ækv.) i EtOAc (24 ml) ved -20°C sattes NMM (0,92 ml, 1,1 ækv.) og dernæst dråbevis i BuOCOCl (1,00 ml, 1,02 ækv.) Efter 20 minutter tilsattes en opløsning af 20 produkt Dl og NMM (1,97 ml) i EtOAc (5 ml) og reaktionsblandingen opvarmedes til -5°C. Efter 30 minutter havde der dannet sig et omfangrigt bundfald. Reaktionen standsedes med H20, og der ekstraheredes tre gange med EtOAc. De organiske ekstrakter kombineredes og vaskedes en gang med mættet vandigt NaHCO^, en gang med H20, en gang med 10% citronsyre og en 25 gang med mættet saltvand. Efter tørring over MgSO^ filtreredes ekstrakten og inddampedes. Det resulterende fast stof tritureredes med varm Et20, filtreredes og tørredes, hvilket gav N-t-butyloxycarbonyl-valyl-0-(2-brombenzyloxycarbonyl)-tyrosin-N-isobutylamid (produkt D) som et farveløst fast stof, 4,21 g, 85%, smp. 175-176°C.

30 E. Til produkt D (1,95 g, 3,00 mmol) sattes 4,5 M HC1 i dioxan (5 ml). Efter 1 time inddampedes opløsningen og remanensen lyofiliseredes fra dioxan, hvilket gav 1,60 g af et flokkulent fast stof, produkt El.

Til en omrørt opløsning af Na-B0C-/J-Bzl-Asp (0,884 g, 1,0 ækv.) i DMF (5 ml) ved -15°C sattes NMM (0,33 ml) og dernæst i BuOCOCl (0,36 35 ml). Efter 15 minutter tilsattes en opløsning af produkt El og NMM (0,3 ml) i DMF (2 ml), reaktionsblandingen omrørtes og fik lov til at varme op til stuetemperatur. Tri pepti det udfældedes med mættet vandig NaHCO,, ft ^ vaskedes med H20 og filtreredes. Omkrystallisation fra EtOAc gav N -t-butyloxycarbonyl-/9-benzyl-asparagyl-valyl-0-(2-brombenzyloxycarbonyl)- 27 DK 167928 B1 tyrosin-N-isobutylamid (produkt E) som et farveløst fast stof, 1,90 g, 74%.

F. Til produkt E (1,71 g, 2,00 mmol) sattes 4,5 M HC1 i dioxan (3 ml). Efter 1 time inddampedes opløsningen og remanensen lyofili seredes 1 5 fra dioxan, hvilket gav 1,46 g af et farveløst fast stof. Dette stof op-slæmmedes i DMF (3 ml) og der tilsattes di isopropyl ethylamin (DIEA, 0,34 ml), HOBT (0,28 g) og AOCa-Tos^-Arg-Pro (produkt B) (0,98 g). DCC (0,38 g) tilsattes dernæst og reaktionsblandingen omrørtes i 2 timer. Opslæmningen filtreredes og filtratet bratkøledes med halvmættet vandig NaHCOj 10 (50 ml). De resulterende faste stoffer frafiltreredes, optoges i EtOAc og vaskedes med H?0, 10% citronsyre og mættet saltvand. Den organiske fase tørredes over Na^O^, filtreredes og inddampedes, hvilket gav N -t-amyloxycarbonyl-N^-tosyl-argi nyl-prolyl-Ø-benzyl-asparagyl-valyl-0-(2-brombenzyloxycarbonyl)-tyrosin-N-isobutylamid (produkt F) som et lyse-15 gult fast stof, 1,91 g, 75%.

G. Til produkt F (1,85 g, 1,45 mmol) sattes 50% TFA/CH2C12 (4 ml). Efter 30 minutter inddampedes opløsningen i kulde og tritureredes med Et20, hvilket gav et farveløst fast stof, 2,35 g. Til dette faste stof satte NMM (0,64 ml), DMAP (0,12 g) og DMF (5 ml). Ac20 (0,5 ml) tilsat- 20 tes dernæst og den resulterende dyb-gule opløsning omrørtes i 1 time. Reaktionen standsedes med halvmættet NaHCO^-opløsning. Det resulterende ravgule bundfald opsamledes, vaskedes med 10% citronsyre, H20 og lufttørredes, hvilket gav Ntt-acetyl-Ng-tosyl-arginyl-prolyl-j3-benzyl-asparagyl-valyl-0-(2-brombenzyl oxycarbonyl)-tyrosin-N-isobutylamid (produkt 25 G), 1,34 g, 77%.

H. Det beskyttede pentapeptid, produkt G (1,34 g), spaltedes med HF/anisol (30 ml/6 ml) i 1 time ved 0°. Remanensen bratkøledes med Et20 og ekstraheredes en gang med 10% HOAc (100 ml) og en gang med 1% NH^OH (100 ml). De vandige ekstrakter kombineredes og lyofili seredes, hvilket 30 gav et gult fast stof, 0,65 g.

Råpeptidet rensedes på "SPC25-Sephadex" (2,6 x 90 cm kolonne, 0,8 M pH 4,8 Et^NHOAc som eluent, strømningshastighed 70 ml/time, 8 ml/frak-tion, detektion ved 278 nm). Fraktionerne 91-114 opsamledes og lyofili-seredes, hvilket gav titel forbi ndel sen, 285 mg, som et farveløst fast 35 stof.

Aminosyreanalyse

Aminosyre Forhold 28 DK 167928 B1

Arg 1,01

Pro 1,02

Asp 1,01 57,4% peptidindhold

Val 1,00 5 Tyr 0,95

Tyndtlagskromatografi: sil icage! G, 250 μ

Eluent Rp 10 15:3:12:10 n-BuOH:H0Ac:H2O:pyridin 0,67 1:1 trifluorethanol:NH40H 0,90 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,67

Eksempel 13 15 N--Acetyl-Arginy!-Prolyl-Asparagyl-Alany!-Tyrosin

Titel forbi ndel sen fremstilledes ved en fastfasemetode, idet der startedes med BOC-Tyr-(BzlCl2)-harpiksester (0,32 mækv./g, 3,2 g). De følgende standardrutiner anvendtes:

Afbeskyttelse - 15 ml 50% TFA/CH2C12 i 1 minut, dernæst 15 20 ml 50% TFA/CH2C12 i 30 minutter.

Vaskning - 15 ml CH^Cl2 to gange i 1 minut hver efterfulgt af 15 ml iPrOH i 1 minut, dernæst 15 ml CHgCl2 to gange i 1 minut hver.

Neutralisering - 15 ml 5% DIEA/CH2C12 to gange i 2,5 minutter 25 hver.

Sammenkobling - 3,0 mmol af den beskyttede aminosyre (0,46 g) og HOBT opløstes i 2 ml DMF og fortyndedes dernæst med 13 ml CH2C1g. DCC (0,62 g) opløstes i 3 ml CHgCl2, sattes til blandingen af reaktanter og harpiks og der omrørtes i 2 timer.

30 Harpiksen sammenkobl edes i rækkefølge en gang med BOC-Ala, B0Ca-Bzl^-Asp, BOC-Pro og A0Ca-Tos^-Arg. Efter afbeskyttelse acyleredes harpikspeptidet to gange med 14% Ac20 i CHgCl2 og DMAP (60 mg) i 30 minutter.

Harpiksen spaltedes med HF/anisol (40 ml/10 ml) i 1 time ved 35 0°C. Harpiksremanensen bratkøledes med Et20 og filtreredes. De faste stoffer ekstraheredes med 100 ml 10% HOAc i 1 time, filtreredes og filtratet lyofili seredes, hvilket gav 1,08 g råt produkt.

Råpeptidet rensedes på "Sephadex DEAE" (2,6 x 90 cm kolonne, 0,1 M NH^HCOg, pH 7,8, som eluent, strømningshastighed 70 ml/ 29 DK 167928 B1 time, 1,5 ml/fraktion, detektion ved 280 nm). Fraktionerne 175-220 opsaml edes og lyofili seredes, hvilket gav titel forbi ndel sen, 560 mg, 55%.

5 Aminos.yreanalyse

Aminosyre Forhold

Arg 1,01

Pro 1,02

Asp 1,00 55,9% peptidindhold 10 Ala 0,98

Tyr 0,98

Tyndtlagskromatografi: Sil i cage! G, 250/i 15 Eluent 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyridin 0,49 4:1:5 n-Bu0H:H0Ac:H20, øvre fase 0,23 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,59

Eksempel 14 20 Arginyl-a-aminoisobutyryl -Asparaqyl-Valyl-Tyrosin Titelforbindelsen fremstilledes som følger: N-t-butyloxycarbonyl-α-aminoisobutyryl -(ff-benzyl)-Asparaqyl-Valyl-Tyrosin-benzylester 25 Den fri amin opnåedes ud fra 2,10 g (Æ-Bzl)Asp-Val-TyrOBzl-tri- fluoracetat ved neutralisering med vandig base og ekstraktion oven i ethylacetat. Fjernelse af opløsningsmiddel gav 1,90 g fast stof, der opløstes i 25 ml methylenchlorid under tilsætning af 0,49 g 1-hydroxybenzotriazol i 5 ml DMF. Opløsningen afkøledes til 5° og der 30 tilsattes 0,65 g N-t-butyloxycarbonyl-a-aminoisosmørsyre efterfulgt af 0,66 g dicyclohexylcarbodiimid. Blandingen omrørtes ved 5° i 30 minutter og henstod dernæst ved stuetemperatur i 16 timer. Reaktionsblandingen filtreredes og filtratet ekstraheredes med vand, fortyndedes dernæst med methylenchlorid og ekstraheredes to gange 35 med mættet natriumbicarbonatopløsning. Tørring over vandfrit magnesiumsulfat og fjernelse af opløsningsmiddel gav en olie, der rensedes ved lynkromatografi på "Silicagel 60", der først elueredes med 1% methanol i methylenchlorid, dernæst med 5% MeOH-CH2Cl2. Hovedproduktet, et farveløst glas, vejede 1,75 g.

30 DK 167928 B1 t r j benZy-| oxycarbonyl -Arg i nyl-a-ami no i sosmørsyre - (β- benzyl -Asparaqyl -Valyl -Tyrosin-benzyl ester

Til 1,75 g BOC-Aib-(/J-Bzl)-Asp-Val-TyrOBzl sattes 25 ml 4,5 5 N HC1 i dioxan og opløsningen omrørtes i 50 minutter. Volumenet reduceredes ved rotationsinddampning og ether sattes til remanensen. Bundfaldet frafiltreredes og vaskedes med ether. Den fri amin opnåedes ud fra saltet ved neutralisering med vandig base og ekstraktion oven i methylenchlorid. Fjernelse af opløsningmsiddel gav 1,36 g far-10 veløst glas.

Tetrapeptidet opløstes i 10 ml methylenchlorid og sattes til en opløsning af 1,27 g Ntt,5,i,,-tribenzyloxycarbonyl-arginin og 0,34 g 1-hydroxybenzotriazol i 5 ml DMF. Opløsningen afkøledes på et isbad og der tilsattes en opløsning af 0,45 g dicyclohexylcarbodiimid i 5 15 ml CHgClg - Blandingen omrørtes på isbadet i 30 minutter, dernæst ved stuetemperatur i 3½ time. Reaktionsblandingen fortyndedes med methylenchlorid og filtreredes. Filtratet ekstraheredes med vand, to gange med mættet natriumbicarbonatopløsning, 10% citronsyreopløs-ning og mættet natriumchloridopiøsning. Efter tørring afdampedes 20 opløsningsmidlet, hvilket gav en olie. Produktet rensedes ved lynkromatografi på "Silicagel 60" med 98:2 CHgC^MeOH som eluent. Hovedproduktet var en gummi, der vejede 2,06 g. NMR-spektret var korrekt for Z3-Arg-Aib-03-Bzl)-Asp-Val-TyrOBzl og viste, at produktet var et DMF-solvat, 3 mol per mol peptid.

25

Arginyl-a-aminoisobutyryl-Asparaqyl-Valyl-Tyrosin 1,75 g beskyttet pentapeptid hydrogeneredes ved 226 kPa (40 psi) hydrogen over 10% palladium-på-carbon under anvendelse af 9:1 methanol-lN vandig eddikesyre som opløsningsmiddel. Efter ryst-30 ning i 18 timer på et "Parr"-apparat filtreredes blandingen og katalysatoren vaskedes med vand. Methanol en fjernedes fra filtratet under reduceret tryk. Remanensen fortyndedes med 5% eddikesyre og lyofili seredes. Produktet vejede 687 mg.

Peptidet rensedes ved kromatografi på en "SP-Sephadex" kolon-35 ne (2,6 x 90 cm), som elueredes med 0,10 N ammoniumacetat, pH 5.

Noget materiale, som var uopløseligt i denne puffer, frafiltreredes før opløsningen hældtes på kolonnen. Hovedkomponenten elueredes i fraktionerne 70-92 (10 ml hver). De ifølge HPLC rene fraktioner 78-92 kombineredes og lyofili seredes, hvilket gav 725 mg af titel forbindel sen.

31 DK 167928 B1 TLC, sil i cage! 60 R^ Opløsningsmiddel system 5 0732 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,33 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyr 0,13 3:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20

Aminosyreanalyse 10

Asp, 0,99; Val, 1,01; Tyr, 1,00; Arg, 1,02; Aib, 1,01; 57,7% peptid.

Eksempel 15 N--Acetyl-Argi n yl- Prolyl -Asparagyl-Valyl-Tyros i n-N-Methyl ami d 15 Ti tel forbi ndel sen fremstilledes på følgende måde: A. BOC-Val-Tyr-NHCH,

En 500 ml 3-halset rundbundet kolbe monteredes med et gastilledningsrør og en tøris-afkølet fingerkondensator med tørrerør. Kol-20 ben fyldtes med BOC-Val-Tyr-OBzl (6,95 g, 14,8 mmol) og Et20 (250 ml). Methylamin (ca. 20 g) bobledes i den omrørte opslæmning. Der dannedes hurtigt en farveløs opløsning. Efter 1 time tilproppedes kolben og opbevaredes ved stuetemperatur i 101 timer. De resulterende faste stoffer frafiltreredes og supernatantopløsningen inddam-25 pedes til tørhed. De kombinerede faste stoffer tritureredes i varmt EtOAc, filtreredes og lufttørredes, hvilket gav BOC-Val-Tyr-NHCH^ (produkt A), 5,03 g, 86%.

B. B0C-(Bz1^)Asp-Val-T.yr-NHCH: 30 Til en omrørt opløsning af 4,5 M HC1 i dioxan (7 ml) sattes produkt A (2,75 g, 7,00 mmol). Efter 1 time inddampedes opløsningen under reduceret tryk. Remanensen opløstes i H20 og lyofili seredes, hvilket gav HCl-Val-Tyr-NHCH^ (produkt Bl), 2,28 g, 99%.

Til en omrørt opløsning af produkt Bl (2,28 g, 6,91 mmol) og 35 BOC-(Bzl^)-Asp succinimidester (2,90 g, 6,90 mmol) i DMF (5 ml) sattes N-methylmorpholin (NMM, 0,85 ml). Den resulterende svagt gule opløsning omrørtes i 24 timer og bratkøledes dernæst med 5% citronsyre (150 ml). De faste stoffer opsamledes, vaskedes med mættet vandig NaHCO^, H20 og Et20. Det lysegule faste stof lufttørre- 32 DK 167928 B1 des og omkrystalli seredes fra Et0Ac/CH30H, hvilket gav produkt B, 3,45 g, 84%.

C. BOC- Pro- (Bzl/?)Asp-Val -Tyr-NHCH^ 5 Til en omrørt opløsning af 4,5 M HCT i dioxan (10 ml) sattes produkt B (2,80 g, 4,68 mmol). Efter 1 time inddampedes opløsningen under reduceret tryk. Remanensen opløstes i HgO og lyofili seredes, hvilket gav HC1:(Bzl^)-Asp-Val-Tyr-NHCH3 (produkt Cl), 2,36 g, 92 %.

Til en omrørt opløsning af produkt Cl (2,31 g, 4,32 mmol) og BOC-10 Pro-hydroxysuccinimidester (1,35 g, 4,32 mmol) i DMF (10 ml) sattes NMM (0,55 ml). Denne opløsning omrørtes i 22 timer og bratkøledes dernæst med mættet vandig NaHC03> De faste stoffer opsamledes, vaskedes med H20, 10% citronsyre og H20. Det lysegule faste stof lufttørredes og omkrystalliseredes fra EtOAc, hvilket gav produkt C, 2,32 g, 77%.

15 D. HCl.(N0j)Arq-Pro-(Bz1^)Asp-Val-Tvr-NHCH:

Til en omrørt opløsning af 4,5 M HC1 i dioxan (5 ml) sattes produkt C (2,02 g, 2,90 mmol). Et bundfald dannedes efter ca. 10 minutter. Efter 1 time inddampedes opslæmningen under reduceret tryk. Remanensen 20 opløstes i H^O og lyofi liseredes, hvilket gav HC1.Pro-(Bzl^)Asp-Val-Tyr-NHCH, (produkt Dl), 1,75 g, 95%, som et farveløst pulver.

yy

Til en omrørt opløsning af produkt Dl (1,73 g, 2,74 mmol), (BOC -N0|)Arg (87,9%, 0,99 g, 2,73 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (HOBT, 0,42 g) og NMM (0,33 ml) i DMF (5 ml) sattes dicyclohexylcarbodiimid (DCC, 25 0,56 g). Et bundfald dannedes efter 5 minutter. Efter 3 timer filtreredes reaktionsblandingen og filtratet behandledes med mættet vandig NaHC03· De resulterende faste stoffer opsamledes, vaskedes med H20, 10% citronsyre og H20. Det farveløse faste stof lufttørredes og tritureredes med varm EtOAc, hvilket gav B0C(N0|)Arg-Pro(Bzl^)-Asp-Val-Tyr-NHCH3 30 (produkt D2), 2,04 g, 83%.

Til en omrørt opløsning af 4,5 M HC1 i dioxan (5 ml) sattes produkt D2 (1,92 g). Efter 1 time inddampedes den pasta-agtige reaktionsblanding under reduceret tryk. Remanensen opløstes i H20 og lyofili seredes, hvilket gav produkt D, 1,64 g, 92%.

35 E. Ac--Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-NHCH3

Til en omrørt opløsning af produkt D (1,61 g, 1,93 mmol) og N-acet-oxy-succinimid (0,33 g) i DMF (5 ml) sattes DIEA (0,71 ml). Efter 3 timer inddampedes blandingen under reduceret tryk. Efter behandling af 33 DK 167928 B1 remanensen med H20 og dekantering opløstes det resulterende faste stof i 50% vandigt HOAc (100 ml). Efter rensning af opløsningen med N2 tilsattes 0,5 g 10% Pd/C og blandingen underkastedes hydrogenering på et "Parr"-apparat (500 ml beholder, PQ=425,6 kPa (47,0 psig)). Efter 68 5 timer filtreredes reaktionsblandingen gennem et Micropore-filter, inddampedes under reduceret tryk, opløstes i H^O og lyofili seredes. Den resulterende rå remanens (produkt El) vejede 1,21 g.

Det rå acetylerede pentapeptid rensedes begyndelsesvis på "Sephadex SPC-25" (2,6 x 85 cm kolonne, 0,05 M NH^OAc, pH 4,5, strømningshastighed 10 100 ml/time, 10 ml/fraktion). Fraktionerne 38-75 samledes og lyofilise-redes, hvilket gav 3219-18201, 600 mg. P.g.a. den lave renhed (92% ifølge HPLC), kromatograferedes halvdelen deraf igen på "Sephadex DEAE" (2,6 x 81 cm kolonne, 0,03 M NH^HCOg, pH 8,9, strømningshastighed 100 ml/time, 10 ml/fraktion). Fraktionerne 40-50 samledes og lyofiliseredes, 15 hvilket gav titelforbindelsen, 375 mg, 49%.

Aminosyreanalyse

Aminosyre Forhold

Arg 0,99 20 Pro 1,01

Asp 1,03 89,2% peptid

Val 1,01

Tyr 0,97 25 Tyndt!agskromatografi:

Eluent 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyridin 0,53 ~ 1:1:1:1 n-BuOH:HOAc:H20:EtOAc 0,19 30 3:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20 0,17

Eksempel 16 N--Acetyl -Arginyl -Prolyl -GI utamyl -Val.yl -Tyrosinamid

Titelforbindelsen fremstilledes ved fastfasemetoden, idet der 35 startedes med p-methylbenzhydrylaminharpiks (U.S. Biochemical 31578, 4,0 g, 0,25 meg/g). De følgende standardrutiner anvendtes:

Afbeskyttelse - 30 ml 50% TFA/CH2C12 i 1 minut, dernæst 30 ml 50% TFA/CH^CI2 i 30 minutter.

Vaskn ing - 30 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver efterfulgt af 30 ml 34 DK 167928 B1 iPrOH i 1 minut, dernæst 30 ml CHgCl^ to gange i 1 minut hver.

Neutral i sering - 30 ml 5% DIEA/CH^Clg to gange i 2,5 minutter hver. Sammenkobling - 3,0 mmol af den beskyttede aminosyre (0,46 g) og HOBT opløstes i 3 ml DMF og fortyndedes dernæst med 27 ml CH2C12· DCC 5 (0,62 g) opløstes i 5 ml CH2C12, sattes til blandingen af reaktanter og harpiks og omrørtes i 2 timer.

Harpiksen sammenkobl edes i rækkefølge en gang med BOC-Val, BOC-Bzl^-Glu,B0C-Pro og A0Ca-Tos9-Arg. Efter afbeskyttelse acyleredes harpikspeptidet en gang med 10% Ac20 i 1:1 DMF:CH^Cl2 og DMAP (60 mg) i 10 60 minutter. Harpiksen vaskedes, lufttørredes og spaltedes i HF/anisol (30 ml/8 ml) i 1 time ved 0°C.

Harpiksremanensen bratkøledes med Et20 og filtreredes. De faste stoffer ekstraheredes med 0,3% NH^OH (100 ml) i 1 time, filtreredes og ekstrakten lyofili seredes, hvilket gav råpeptidet som et farveløst fast 15 stof, 378 mg.

Råpeptidet rensedes først på "SPC25 Sephadex" (2,6 x 83 cm kolonne, 0,03 M NH^OAc, pH 4,5, 75 ml/time, 10 ml/fraktion, detektion ved 278 nm). Fraktionerne 140-172 samledes og lyofili seredes, hvilket gav et lyofilat.

20 Lyofilatet kromatograferedes igen på "DEAE Sephadex" (2,6 x 89 cm kolonne, 0,03 M NH^OAc, pH 8,9, 75 ml/time, 10 ml/fraktion, detektion ved 278 nm). Fraktionerne 36-46 samledes i en pøl og lyo-filiseredes, hvilket gav titelforbindelsen, 210 mg.

25 Aminosyreanalyse

Aminosyre Forhold

Arg 1,00

Pro 1,02

Glu 1,02 92,2% peptidindhold 30 Val 0,99

Tyr 0,98

Tyndtlagskromatografi: Sil icagel G, 250 β

Eluent 35 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyridin 0,53 1:1:1:1 n-BuOH:HOAc:H20:EtOAc 0,33 5:5:3:1 Et0Ac:H20:Pyr:H0Ac 0,72

Eksempel 17 35 DK 167928 B1 N--Acetyl -D-Arginyl -Prolyl -Asparag.yl -Valyl -Tyrosinamid T i telpept idet syntetiseredes ved fastfasemetoden på en "Beckman 990B Automatic Peptide Synthesizer". Syntesen startedes med 4,00 g p-methylbenzhydrylaminharpiks, substitutionsniveau 0,25 mmol per 5 gram. 50% tri fluoreddikesyre i methylenchlorid anvendtes i afbeskyt-tel sestrinnet, 5% di isopropyl ethyl amin i CH2C12 i neutraliseringstrinnet og DCC-HOBT i sammenkoblingstrinnet. De følgende aminosyre-derivater sammenkobl edes sekventielt med harpiksen: BOC-Tyr(BrZ), BOC-Val, BOC-Asp(jS-Bzl), BOC-Pro og BOC-D-Arg (Ng-tosyl). Ef-10 ter inkorporering af D-Arg afbeskyttedes harpiksen, neutraliseredes og omsattes med eddikesyreanhydrid i dimethyl formamid med dimethyl -pyridin som katalysator. Harpiksen vaskedes og tørredes under vakuum.

Den tørre harpiks vejede 5,15 g.

Peptidet spaltedes fra harpiksen med 50 ml HF indeholdende 5 15 ml m-cresol ved 0° i 1 time. Efter vakuum-fjernelse af HF vaskedes remanensen med ethyl acetat og ether. Peptidet ekstraheredes med 100 ml 5% vandig eddikesyre. Ekstrakten lyofili seredes, hvilket gav 658 mg råpeptid.

Peptidet rensedes ved kromatografi to gange på ionbytterhar-20 piks. Den første eluering gennemførtes på en "DEAE-Sephadex" kolonne (2,6 x 100 cm) med 0,05 M NH^HCO-j, pH 8,0. Fraktionerne 57-66 (10 ml hver) samledes og lyofi liseredes. 572 mg produkt hældtes på "SP-Sephadex" 2,6 x 90 cm kolonne og elueredes med 0,02 M NH^OAc, pH 4,6. Fraktioner på 7,5 ml opsamledes. Hovedtoppen op-25 deltes i tre afskæringer: fraktionerne 190-215, 216-240 og 241-285.

Lyofili seringsudbyttet og renheden (HPLC) af disse afskæringer var hhv. 48 mg (98,8%), 107 mg (98,4%), 232 mg (97,3%)).

TLC, Sil i cage! 60: 30 Rf Opløsningsmiddel system 0,19 3:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20 0,44 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyr 0,81 3:2:1 pyr:H0Ac:H20 35 Aminosyreanalyse

Asp, 0,99; Pro, 1,02; Val, 1,03; Tyr, 0,96; Arg, 1,01; 80,5% peptid.

Eksempel 18 36 DK 167928 B1 N--Acetyl-Arqinyl-a-Aminoisobutyryl-Asparaqyl-Valyl-Tyrosinamid Titel forbindel sen fremstilledes ved fastfasemetoden, idet der startedes med p-methylbenzhydrylaminharpiks (U.S. Biochemical 31578, 6,83 g, 0,3 mækv./g). Der anvendtes de følgende standardrutiner: 5

Afbeskyttelse - 50 ml 50% TFA/Cf^Cl,, i 1 minut, dernæst 50 ml 50% TFA/Cf^C^ i 30 minutter.

Vaskning - 50 ml CH^Clg to gange i 1 minut hver efterfulgt af 50 ml iPrOH i 1 minut, dernæst 50 ml to gange i 1 minut hver.

10 Neutralisering - 50 ml 5% DIEA/CH2C12 to gange i 2,5 minutter hver. Sammenkobling - 5,0 mmol af den beskyttede aminosyre og HOBT (0,77 g) opløstes i 4 ml DMF og fortyndedes dernæst med 41 ml CHgC^. DCC (1,03 g) opløstes i 5 ml CH2CT2, sattes til blandingen af reaktanter og harpiks og omrørtes i 2 timer.

15 Harpiksen sammenkobl edes i rækkefølge en gang med BOC-Val, BOC-

Bzl^-Asp, BOC-Aib og to gange med A0Ca-Tos^-Arg. Efter afbeskyttelse acyleredes halvdelen af harpikspeptidet en gang med 10% Ac20 i 1:1 DMF:CH2C12 (30 ml) og DMAP (400 mg) i 60 minutter. Harpiksen vaskedes, lufttørredes og spaltedes i HF/anisol (30 ml/8 ml) i 1 time ved 0°C.

20 Harpiksremanensen bratkøledes med Et20 og filtreredes. De faste stoffer ekstraheredes med 1% NH^OH (100 ml) i 1 time, filtreredes og ekstrakten lyofili seredes, hvilket gav råpeptid som et farveløst fast stof, 425 mg.

Råpeptidet rensedes på "Sephadex DEAE" (2,6 x 85 cm kolonne, 25 0,03 M NH^HCOg, upufret, 75 ml/time, 7 ml/fraktion, detektion ved 270 nm). Fraktionerne 79-95 samledes og lyofil i seredes, hvilket gav titel forbi ndel sen, 260 mg.

Aminosyreanalyse 30 Aminosyre Forhold

Arg 1,02

Aib 0,89

Asp 1,00 84,8% peptidindhold

Val 1,02 35 Tyr 1,00

Tyndtlagskromatografi: Si li cage! G, 250/z

Eluent Rf 37 DK 167928 B1 15:3:12:10 n-BuOH:HOAc:H20:pyridin 0,61 1:1:1:1 n-BuOH:HOAc:H20:EtOAc 0,57 4:2:3:1 n-BuOH:HOAc:H20:pyridin 0,71 5 Eksempel 19

Argin.y1-tt-Aminoisobut.yr.yl-Asparag.y1-Va1yl-T.yrosinamid

Titelforbindelsen fremstilledes ved fastfasemetoden som beskrevet i eksempel 18. Den resulterende harpiks vaskedes, lufttørredes og spaltedes i HF/anisol (30 ml/8ml) i 1 time ved 0°C.

10 Harpiksremanensen bratkøledes med Et20 og filtreredes. De faste stoffer ekstraheredes med 10% HOAc (100 ml), filtreredes og ekstrakten lyofi liseredes, hvilket gav råpeptid som et farveløst fast stof, 385 mg.

Råpeptidet rensedes på "CM Sephadex" (2,6 x 80 cm kolonne, 21 0,10 M upufret NH^OAc, dernæst 0,2 M NH^OAc, 75 ml/time, 12 ml/fraktion, 15 detektion ved 278 nm).

Fraktionerne 62-99 samledes og lyofi li seredes, hvilket gav titel-forbindelsen, 435 ml, 50% udbytte.

Aminosyreanalyse 20 Aminosyre Forhold

Arg 1,02

Aib 0,95

Asp 0,97 58,3% peptidindhold

Val 1,01 25 Tyr 1,00

Tyndtlagskromatografi: Silicagel G, 250/i

Eluent 30 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H2O:pyridin 0,55 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,56 4:2:3:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyridin 0,72

Eksempel 20 35 N--Acetyl-Arqinyl-3,4-deh,ydro-Prolyl-Asparaqyl-Valyl-Tyrosinamid Titel forbi ndel sen fremstilledes som følger: B0C-3,4-dehydro-Prolin 3,4-dehydro-Pro (200 mg, 1,76 mmol) opløstes i dioxan/H20 (8 38 DK 167928 B1 ml, 2:1). Til denne opløsning sattes 1 N NaOH (1,8 ml) og di-t-bu-tyldicarbonat (436 mg, 2 mmol) ved 0°C under omrøring. Blandingen omrørtes dernæst ved stuetemperatur natten over. Dioxan fjernedes og til den tilbageblevne vandfase sattes ethyl acetat (20 ml). Bland-5 ingen afkøledes på et isbad, gjordes sur til pH 2,0 med 0,5 N HC1 og overførtes til en separationstragt. Det organiske lag fraskiltes og det vandige lag ekstraheredes to gange med EtOAc (2 x 20 ml).

Den samlede organiske fase tørredes over NagSO^ og filtreredes. Opløsningsmidlet fjernedes og den resterende remanens tørredes og 10 anvendtes uden yderligere rensning.

N--Acetyl -Arqinyl -3,4-dehydro-Prolyl -Asparagyl-Val yl -Tyrosinamid Peptidet syntetiseredes på en (p-methyl)benzhydrylaminharpiks (2 g harpiks, substitution af 0,25 mmol NH2 per g harpiks) ved 15 fastfasemetoden. Inkorporeringen af BOC-Tyr-(Bzl), BOC-Val, BOC- 3,4-dehydro-Pro og AOC-Arg(Tos) gennemførtes ved hjælp af DCC-sammenkobling. Sammenkoblingen overvågedes ved hjælp af kvalitativ ninhydrin-test. Acetyleringen af argi nin udførtes med 50% eddike-syreanhydrid/pyridin (15 ml) og DMAP (15 mg). Peptidylharpiksen 20 vaskedes dernæst grundigt med DMF og CHgCl^ og tørredes. Den tørrede peptidylharpiks (2 g) spaltedes med HF/anisol (20 ml, 9:1) ved 0°C i 1 time. Peptid-harpiksblandingen vaskedes med ether (3 x 20 ml). Efter lyofilisering påførtes peptidet en "Sephadex SPC-25" kolonne (50 cm x 0,9 cm), som ækvibrileredes med 0,02 M NH^OAc, pH 4,6. Strømningshastig-25 heden var 80 ml/time og fraktioner på 12 ml opsamledes. Produktet elue-redes mellem rør 22-38, som samledes og lyofili seredes.

Det lyofiliserede materiale rensedes igen på "Sephadex SPC-25" kolonne (60 cm x 2,5 cm), som ækvibrileredes med 0,02 M NH^0Ac,pH 4,5- 6,8 under de samme betingelser som ovenfor beskrevet. Peptidet elueredes 30 mellem rør 55-75, som samledes i pøl og lyofili seredes, hvilket gav 80 mg af titel produktet.

TLC: Silicagel F60 35 Rf Eluent 0,45 n-Bu0H:H0Ac:H20:Pyr 15:3:12:10 0,27 n-Bu0H:H0Ac:H20 3:1:1

Aminosyreanalyse 39 DK 167928 B1

Asp, 1,04; Val, 1,00; Tyr, 0,85; Arg, 0,96; 3,4-dehydro-Pro, 1,00 peptidindhold: 72%; hygroskopisk materiale 3,4-dehydro-Pro elueredes tæt ved Asp-remanensen i analysen og har en meget lav KF-værdi.

5 HPLC: "Whatman Parti sil-ODS" kolonne 10% CH3CN/0,02 M NH40Ac, pH 4,6 Strømningshastighed: 2 ml/min 10 Peptidet var 99,7 rent og havde en retentionstid på 14,3 minutter.

Eksempel 21

Arqinyl-Prolyl-Asparagyl-Valyl-Tyrosinamid

Titel forbindel sen fremstilledes som følger: 15 Z-Arg(Z,Z)-Pro-Asp(0Bzl)-Va1-Tyr-NH^

Til en opløsning af HC1 Pro-AspfOBzlJ-Val-Tyr-W^ (0,5 g, 0,7 mmol) i DMF (15 ml) sattes DIEA (0,14 ml, 0,7 mmol) og Z-Arg(Z,Z)-0Np (0,7 g, 1 mmol) ved 0°C under omrøring. Blandingen omrørtes ved stuetemperatur weekenden over. Opløsningsmidlet fjernedes på "Rotavapor". Remanensen 20 tri tureredes med ether og filtreredes. Det fast stof omkrystalliseredes fra CH^OH og CHgClg/ether/petroleumsether-blanding, hvilket gav 0,59 g produkt; Rf 0,78 (n-BuOH/HOAcA^O = 3:1:1; Si 1 i cage!; 200 μ); *H-NMR (DMSO-dg) viste tilstedeværelsen af en Z-Arg(Z,Z)-del.

25 Arg-Pro-Asp-Val-Tyr-NH^ Z-Arg(Z,Z)-Pro-Asp(OBzl)-Val-Tyr-NH2 (0,5 g) hydrogeneredes med Pd-sort (0,5 g) og ammoniumformi at (0,5 g) i CH3OH (40 ml) natten over. Katalysatoren frafiltreredes og filtratet fjernedes på en rotationsinddamper. Remanensen opløstes i HgO og lyofilisere-30 des. Råpeptidet anbragtes dernæst på en "Sephadex DEAE" kolonne (60 cm x 2,5 cm) og elueredes med 0,01 M NH4HC03, pH 7,9. Strømningshastigheden var 90 ml/time og der opsamledes fraktioner af 10 ml. Peptidet elueredes mellem rør 17-29, som samledes og lyofi 1 i seredes , hvilket gav 290 mg af titelproduktet.

TLC: Si 1 i cage! F 60

Eluent 35 40 DK 167928 B1

Rfj = 0,32 n-Bu0H:H0Ac:H20:Pyr = 15:3:12:10 Rfn = 0,05 n-Bu0H:H0Ac:H20 = 3:1:1

Aminosyreanslyse 5 Arg, 1,01; Pro, 1,01; Asp, 1,00; Val, 1,01; Tyr, 0,97 peptid indhold: 71%.

HPLC: "Whatman Partisil-ODS" kolonne 10% CH3CN/0,02 M KH2P04 puffer (pH 3,5)

Strømningshastighed: 3 ml/min.

10

Peptidet havde en retentionstid på 6,3 minutter og var 99,5% rent. Eksempel 22 N--Acetyl -Arginyl -2-Aminoisobutyryl -Asparaqyl -Valyl -Tyrosin 15 Titel forbindel sen fremstilledes ved fastfasemetoden, idet der startedes med BOC(Brz)Tyr-benzylesterharpiks (4,56 g, 0,44 mækv./g). De følgende standardrutiner anvendtes:

Afbeskyttelse - 50 ml 50% TFA/CH2C12 i 5 minutter, dernæst 50 ml 50% TFA/CH2C12 i 20 minutter.

20 Vaskning - 50 ml CHgCl2 to gange i 1 minut hver efterfulgt af 50 ml iPrOH i 1 minut, dernæst 50 ml CHgCl2 to gange i 1 minut hver. Neutralisering - 50 ml 5% DIEA/CH2C12 to gange i 2,5 minutter hver. Normal sammenkobling - 6 mmol af den beskyttede aminosyre og HOBT (0,92 g) opløstes i 4 ml DMF og fortyndedes dernæst med 41 25 ml CH2C12· DCC (1,24 g) opløstes i 5 ml CH2C12, sattes til blandingen af reaktanter og harpiks og der omrørtes i 2 timer.

Symmetrisk anhydridsammenkobling - 6 mmol af den beskyttede aminosyre opløstes i 20:1 CH2C12:DMF (21 ml) og afkøledes til 0°C. DCC (0,83 g) tilsattes dernæst og reaktionsblandingen omrørtes i 30 minutter.

30 Efter filtrering sattes filtratet til harpiksen og omrørtes i 20 timer. Harpiksen sammenkobl edes i rækkefølge en gang med BOC-Val, B0C(Bzl)^-Asp, BOC-Aib og A0Ctt-Tosg-Arg. Harpiksen sammenkobl edes igen en gang med A0Ca-Tos^-Arg symmetrisk anhydrid.

Efter afbeskyttelse acyleredes harpikspeptidet en gang med 10% Ac o 35 i 1:1 DMF:CH2C12 (20 ml) og DMAP (300 mg) i 60 minutter. Harpiksen ^ vaskedes, lufttørredes og spaltedes i HF/anisol (30 ml/8 ml) i 60 minutter ved 0°C.

Harpiksremanensen bratkøledes med Et20 og filtreredes. De faste stoffer ekstraheredes i 1% NH^OH (100 ml) i 1 time, filtreredes og 41 DK 167928 B1 ekstrakten lyofiliseredes, hvilket gav råpeptid som et farveløst fast stof, 600 mg.

Råpept1det rensedes på "Sephadex DEAE" (2,6 x 86 cm kolonne, 0,15 M NH^HCOgs upufret, strømningshastighed 100 ml/ time, 12,5 ml/fraktion, 5 detektion ved 277 nm). Fraktionerne 109-119 samledes og lyofiliseredes, hvilket gav titel forbi ndel sen, 230 mg.

Aminosyreanalyse

Aminosyre Forhold 10 Arg 0,98

Aib 1,02

Asp 1,00 64,4% peptidindhold

Val 1,03

Tyr 0,97 15

Tyndtlagskromatografi: Silicagel G, 250/z

Eluent 4:1 trifluorethanol:NH4OH 0735 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,62 20 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyridin 0,52

Eksempel 23

Arginyl -Cycloleucyl-Asparagyl-Valyl-Tyrosin

Titelforbindelsen fremstilledes ved fastfasemetoden, idet der 25 startedes med Boc(Bzl^Asp-Val-Tyr(BrZ) benzyl esterharpiks (2,65 g, ca.

1,0 mækv.). De følgende standardrutiner anvendtes:

Afbeskytte!se - 40 ml 50% TFA/CH^Clg i 5 minutter, dernæst 40 ml 50% TFA/CH2C12 i 20 minutter.

Vaskning - 40 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver efterfulgt af 30 40 ml iPrOH i 1 minut, dernæst 40 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver.

Neutralisering - 40 ml 5% DIEA/CH2C12 to gange i 2,5 minutter hver. Sammenkoblingsprocedure 1: - 5,0 mmol af den beskyttede aminosyre og HOBT (0,77 g) opløstes i 4 ml DMF og fortyndedes dernæst med 36 ml CHgClg. DCC (1,03 g) opløstes i 5 ml CH2C12, sattes til 35 blandingen af reaktanter og harpiks og der omrørtes i 16 timer.

Procedure 2: - 8,0 mmol af den beskyttede aminosyre opløstes i 40 ml CH2C12 og 1 ml DMF og afkøledes til 0°C. DCC (0,83 g) tilsattes dernæst og reaktionsblandingen omrørtes i 30 minutter. De faste stoffer frafiltreredes og filtratet sattes til harpiksen og der 42 DK 167928 B1 omrørtes i 3 timer.

Procedure 3: - 5,0 mmol af den beskyttede aminosyre som aktiv ester og HOBT (0,77 g) opløstes i 20 ml DMF og 20 ml CH2C12- Denne opløsning sattes til harpiksen og der omrørtes i 24 timer.

5 Procedure 4: - 5,0 mmol af den beskyttede aminosyre som aktiv ester og DMAP (0,5 g) opløstes i 20 ml DMF og 20 ml CH2C12· Denne opløsning sattes til harpiksen og der omrørtes i 68 timer.

Harpiksen sammenkobl edes i rækkefølge en gang med Boc-Cle ved hjælp af procedure 1, Z^-Arg-0Np ved hjælp af procedure 3,

^ Λ Q

10 sammenkobl edes igen en gang med A0C -Tosy-Arg ved hjælp af procedure 2 og til slut med Z2~Arg-0Np ved hjælp af procedure 4. Efter afbeskyttelse vaskedes, lufttørredes og spaltedes harpiksen i HF/anisol (30 ml/8 ml) i 60 minutter ved 0°C.

Harpiksremanensen bratkøledes med Et^O og filtreredes. De fa-15 ste stoffer ekstraheredes i 1% NH^OH (100 ml) i 1 time, filtreredes, indstilledes til pH 6 med HOAc og ekstrakten lyofili seredes, hvilket gav råpeptid som et farveløst fast stof, 720 mg.

Råpeptidet rensedes på "Sephadex DEAE" (2,6 x 85 cm kolonne, 0,12 M NH^HCOg, upufret, strømningshastighed 100 ml/ time, 12,5 20 ml/fraktion, detektion ved 206 nm). Fraktionerne 317-370 samledes og lyofili seredes, hvilket gav det ønskede materiale. Peptidet afsalte-des på "G-10 Sephadex" (2,6 x 83 cm kolonne, 1% HOAc som eluent, strømningshastighed 3 ml/time, 4 ml/fraktion, detektion ved 277 nm). Fraktionerne 78-105 samledes og lyofili seredes, hvilket gav titelfor-25 bindeisen, 395 mg.

Aminosyreanalyse

Aminosyre Forhold

Arg 1,00 30 Cle 1,05

Asp 0,98 75,8% peptidindhold

Val 1,00

Tyr 0,98

Tyndtlagskromatografi: Silicagel G, 250/i 35

Eluent R^· 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20:pyridin 0,55 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,60 4:1 trifluorethanol:NH^0H 0,21 43 DK 167928 B1

Eksempel 24 N--Acetyl-Argi nyl-Prolyl-Asparagyl-Valyl-Tyrosyl-Glyci nami d

Titelforbindelsen fremstilledes ved fastfasemetoden, idet der 5 startedes med p-methylbenzhydrylaminharpiks (U.S. Biochemical 31578, 4,2 g, 0,25 mækv./g). De følgende standardrutiner anvendtes: Afbeskyttelse - 40 ml 50% TFA/CH^C^ i 1 minut, dernæst 50 ml 40% TFA/CH2C12 i 30 minutter.

Vaskning - 40 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver efterfulgt af 10 40 ml iPrOH i 1 minut, dernæst 40 ml CH2C12 to gange i 1 minut hver.

Neutralisering - 40 ml 5% DIEA/CH2C12 to gange i 2,5 minutter hver. Sammenkobling - 3,0 mmol af den beskyttede aminosyre og HOBT (0,46 g) opløstes i 2 ml DMF og fortyndedes dernæst med 28 ml CH2C12. DCC (0,62 g) opløstes i 5 ml ZW^C\^, sattes til blandingen af reaktanter og 15 harpiks og der omrørtes i 2 timer.

Harpiksen sammenkobl edes i rækkefølge en gang med BOC-Gly BOC-Tyr (BrZ), BOC-Val, BOC-Bzl^-Asp, BOC-Pro og A0Ca-Tosg-Arg. Efter afbeskyttelse acetyleredes harpikspeptidet en gang med 10% Ac20 i 1: DMF:CH2C12 (18 ml) og DMAP (0,3 g) i 60 minutter.

20 Harpiksen vaskedes, lufttørredes og spaltedes i HF/anisol (30 ml/8 ml) i 1 time ved 0°C.

Harpiksremanensen bratkøledes med Et20 og filtreredes. De faste stoffer ekstraheredes med 0,3% NH^OH (100 ml) i 1 time, filtreredes og ekstrakten lyofili seredes, hvilket gav råpeptid som et farveløst fast 25 stof, 720 mg.

Råpeptidet rensedes på "Sephadex DEAE" (2,6 x 89 cm kolonne, 0,03 M NH^HCOg, upufret, 75 ml/ time, 7 ml/fraktion, detektion ved 278 nm). Fraktionerne 42-52 samledes og lyofiliseredes, hvilket gav titel forbi ndel sen, 425 mg.

30 Aminosyreanalyse

Aminosyre Forhold

Arg 1,03

Pro 1,01

Asp 0,99 79,5% peptidindhold 35 Val 0,99

Tyr 1,01

Gly 0,97

Tyndtlagskromatografi: Silicagel G, 250 μ 44 DK 167928 B1

Eluent 3:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20 0723 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,59 5 4:2:3:1 n-Bu0H:H0Ac:H20-pyridin 0,71

Eksempel 25

Ved at følge fremgangsmåder til peptidfremstilling, der ligner de i eksemplerne 1-24 anvendte fremgangsmåder, fremstilledes følgende: A. Na-Acetyl-Arginyl-Prolyl-Asparagyl-Valyl-N-a-methyl-Ty-10 rosin, opløst.

Aminosyreanalyse: Arg 1,02, Pro 1,00, Asp 1,00, Val 1,04, 73,5% peptidindhold.

Tyndtlagskromatografi: Si 1 i cage! G 250 F, hård overflade.

15 Eluent 3:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20 0750 4:2:3:1 n-Bu0H:H0Ac:H20-pyridin 0,74 2:2:1 CHCl3:MeOH:konc. NH40H 0,76 20 B. Arginyl-4-methyl-Leucyl-Asparagyl-Valyl-Tyrosin, opløst.

Aminosyreanalyse: Asp 1,00, Val 1,00, Tyr 0,96, Arg 1,00, 4-me-Leu 0,96, 93,0% peptidindhold.

Tyndtlagskromatografi: Silicagel 60 25 ' Eluent R^ 1:1:1:1 n-Bu0H:H0Ac:H20:Et0Ac 0,60 15:3:12:10 n-Bu0H:H0Ac:H20: Pyridin 0,48 4:2:3:1 n-Bu0H:H0Ac:H20-pyridin 0,61 30 Eksempel 26 Induktionstest

Prothymocyter (Thy-1’) og pro-Lyb-2-celler opkoncentreredes sammen fra B6-lyb-2.1 kongenisk musemilt ved hjælp af BSA-densitetsgradient-centrifugering (Pathocyte 5, Miles Laboratories, parti 35, 1 ml af 35 35:29:26:23:18:12%). Grænsefladelagene 26:23 og 23:28 samledes og Thy-1+ og Lyb-2+ celler fjernedes ved omsætning med monoklonale Thy-1.2 og Lyb- 2.1 antistoffer og vedhæftning til plader dækket med affinitetsrenset kanin-anti-muse-F(ab)2· De vaskedes non-adhærente celler anvendtes i begge tests. Denne udgangspopulation indeholder 30-40% prothymocyter og 45 DK 167928 B1 30-40% pro-Lyb-2-celler (som vides at udgøre separate, men forbundne g prækursor-populationer). 5 x 10 celler/0,5 ml RPMI 1640 inkuberedes i 5 ml plastikrør med lige så store volumener af inducer i seriefortyndinger i RPMI 1640 i en befugtet 5% ^-atmosfære i 3 timer. Cellerne testedes 5 dernæst separat for Thy-1 og Lyb-2.1-tegn med monoklonale antistoffer i optimal koncentration ved Protein-A-SRBC-fremgangsmåden ifølge Scheid og Triglia, Immunogenet., 9, 423-433 (1979) (kontroller uden inducer giver <5% inducerede celler). De omhandlede peptider stimulerer induktion af Thy-1+ celler (T-celler) og betegnes således som besiddende biologisk 10 aktivitet. De omhandlede peptider, hvori X er GLU eller D-GLU, stimulerer også induktion af Lyb-2.1+ celler (B-celler) såvel som T-celler. Til sammenligning stimulerer et kontrolpeptid TYR-ARG-LYS-ASP-VAL-OH ikke induktion af hverken T-celler eller B-celler.

15 Eksempel 27 Receptortest

Materialer - CEM-celleli ni er opnåedes fra The American Type Culture Collection. 3-nitro-2-pyridinsulfonylchlorid og 2-pyridinthiol-l-oxid tilvejebragtes af Dr. Rei Matsueda, Sanyo Laboratories, Tokyo. RPM1-20 1640, kalvefosterserum og L-glutamin opnåedes fra Gibco, gentamycin fra Schering og lectin-bundne agarosekorn fra Vector Laboratoeries. Sephadex erhvervedes fra Pharmacia Fine Chemicals, kanin-anti-thymopoietin-anti-stof fra Accurate Chemical Scientific Corp., ubiquitin fra Peninsula Laboratory og humant IgG fra Miles Laboratories. Alle andre kemikalier 25 erhvervedes fra almindelige kommercielle kilder og var af reagensrenhed.

De anvendte forkortelser er: PBS, phosphat-pufret saltvand; TCA, trichloreddikesyre; SDS, natriumdodecylsul fat; Con A, concanavilin A; TP, thymopoietin; PEG, polyethylenglycol; BSA, kalveserumalbumin; I.P., intraperitoneal; PMSF, phenylmethyl sulfonylfluorid; FTS, faktor thymin 30 serique; CRF, corticotropin-frigørende faktor; ACTH, adrenocortitropi sk hormon; Hepes, N-2-hydroxyethyl-piperazin-N-2-ethansulfonsyre.

Cyklisk nukleotidtest - CEM-celleli ni en dyrkedes i forskellige tidsperioder og høstedes som beskrevet nedenfor. Cellerne vaskedes tre gange med PBS, resuspenderedes i RPMI-1640 i en koncentration 35 på 3,12 x 107 celler/ml og fik lov til at komme i ligevægt ved 37°C i 30 minutter før tilsætning af 100 ng kalvethymopoietin (25 μ1, 4,0 /ig/ml) til 1 ml celler. Inkuberingen fortsattes i 4-5 minutter i et rysteflaskebad og afsluttedes dernæst ved tilsætning af 1 ml iskold 10% TCA med homogenisering og lydbehandling for at frigøre cykliske 46 DK 167928 B1 nukleotider. Suspensionen centrifugeredes ved 3000 g i 20 minutter ved 4°C. Bundfaldet opløstes i 0,1 N NaOH og proteinindholdet bestemtes ved en fremgangsmåde ifølge Cadman, et al., Anal. Biochem, 96, 21-23. TCA fjernedes fra supernatanten ved ekstraktion fire gange 5 med 5 ml vand mættet med di ethyl ether. Efter den sidste ekstraktion fjernedes tilbageblevne spor af ether ved opvarmning på et 50°C varmt vandbad i 10 minutter. Prøven lyofi liseredes og genopløstes i 50 mM acetatpuffer, pH 6,2, til radioimmuntest for cykliske nukleotider.

Fremstilling af membran-qlycoprotein - CEM humane lymfoide 10 cellelinier dyrkedes i RPMI-1640 suppleret med 10% varme-inaktiveret kalvefosterserum, 2 mM kalvefosterserum, 2 mM L-glutamin og 50 jug/ml gentamycin ved 37°C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% C09 til en slutdensitet på 3-4 x 10 celler/ml. Ved denne koncentration var cellerne i den tidlige stationære fase på vækstkurven og skønnedes at 15 være mere end 90% levedygtige ved trypanblå-udelukkelse.

Membran-glycoproteiner fremstilledes ved en modifikation af teknikken ifølge Hedo, et al., Biochem, 20, 3385-3393. Cellerne vaskedes en gang med PBS og suspenderedes i 40% saccharose, 50 mM Hepes, 1% EDTA, 0,1% 0-pheanthrolin og 1 mM PMSF (i methanol), 20 pH 7,8, og homogeniseredes i et glas-homogeniseringsapparat ved stuetemperatur. Den samledes suspension underkastedes dernæst lydbehandling ved hjælp af en cellesprængnings-sonikator med en tragtanordning (model W-225R) ved 35°C i 10 minutter. Suspensionen centrifugeredes ved 600 g i 10 minutter ved 4°C i en "Sorval-GLC-3" 25 centrifuge og supernatanten centrifugeredes igen ved 20.000 g i en "Sorval 5B" centrifuge ved 4°C i 3 minutter. Den rå membranfraktion opnået fra denne pellet suspenderedes i 50 mM Hepes, 10 mM MgSO^ og 1 mM PMSF, pH 7,8, med en slutproteinkoncentration på 5 mg/ml. Opløsning af proteinet udførtes ved omrøring af suspensionen i 2 timer ved 25°C i 30 nærværelse af 1% "Triton-X-100n (slutkoncentration) og 0,1% "brij-96" (polyoxyethylen 10, oleylether) (slutkoncentration). Suspensionen centrifugeredes ved 2.000 g i 2 timer ved 4°C og supernatanten opbevaredes ved -70°C. Den opløselige proteinkoncentration måltes i overensstemmelse med teknikken ifølge Cadman, et al. under anvendelse af BSA 35 som standard med puffer som en kontrol.

Hvedespireagglutinin eller ricinus communis agglutinin-I anvendtes til rensning af receptorproteinet. Alle lecitinkorn opbevaredes ved 4°C med deres tilsvarende monosaccharidinhibitorer (300 mM).

Til hver rensning pakkedes 2 ml lectin-agarose i en kolonne 47 DK 167928 B1 med 1 cm's diameter og vaskedes ved stuetemperatur med 25 ml 0,15 M NaCl, 50 mM Hepes, 0,1% "Triton Χ-Γ og 0,01% SDS, pH 7,8.

Kolonnerne vaskedes med 200 ml 0,15 M NaCl, 50 mM Hepes og 0,1% "Triton X-100", pH 7,8, efterfulgt af en slutvask med denne 5 puffer indeholdende 10 mM MgSO^. PMSF (1 mM) sattes til alle puffersystemer. Opløste membranproteiner (-10 mg) sendtes 5 gange gennem de enkelte kolonner. Kolonnen vaskedes dernæst med 100 ml 0,15 M NaCl, 50 mM Hepes, 10 mM MgSO og 0,1% "Triton X-100", pH 7,8, ved 4°C. Monosaccharidinhibitorer ved en koncentration på 10 400 mM i 3 ml vaskepuffer anvendtes til de enkelte kolonne-eluering-er; N-acetylglucosamin til hvedespireaggultinin og /J-methyl-D-galaktosid til ricinus communis agglutinin-I. Monosacchariderne påførtes kolonnen, som stoppedes i 30-40 minutter for at tillade ligevægt og elueredes dernæst yderligere. Proteineluatet dialyseredes over for 500 15 ml 50 mM Hepes, 10 mM MgS04 og 0,1% "Triton X-100", pH 7,8, ved 4°C.

Fremstilling af radioaktivt mærket thymopoietin - Thymopoietin opløstes i 2,0 M natriumcarbonat-bicarbonat puffer, pH 9,8, for at opnå frie aminogrupper. 3-nitro-2-pyridinsulfonylchlorid i dioxan (10:1 mol) sattes til thymopoietinopløsningen og omrørtes i 5 timer 20 ved 20°C. Efter tilsætning af vand fracentrifugeredes uopløseligt materiale. Det beskyttede peptid rensedes under anvendelse af "Se- phadex G-25" kromatografi efterfulgt af digestion med post-prolin spaltningsenzym for at fjerne ΝΗ,-endeblokeret prolin. Methyl 3,5 125 ^ di( I)iodhydroxybenzimidat (4000 Ci/mM) opnåedes i en koncentra-25 tion på 5,5 mCi/ml i methanol og inddampedes til tørhed. Den iode-rede imidoester (1,4 nM) omsattes med beskyttet thymopoietin (5 /ig, 0,9 nM) i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Wood, et al.,

Anal. Biochem., 69, 339-349, med følgende modifikationer. Reaktionen udførtes i 500 /il 0,16 M boratpuffer, pH 9,1, i 24 timer ved 30 4°C. Omsætningen standsedes ved tilsætning af 500 /il 2 M citrat-phosphatpuffer, pH 5,5, ved 4°C. Prøven kromatograferedes på en "Biogel P-10" kolonne med natriumpyrophosphat, pH 7,5 (15 dråber/ fraktion) ved 4°C for at udskille frit i od.

Det i oderede peptid opløstes i vand og behandlede med 2-pyri-35 dinthiol-l-oxid (10:1 mol) i 5 timer ved stuetemperatur for at fjerne de beskyttende grupper. Det mærkede peptid rensedes på en "Biogel P-10" kolonne. Tre radioaktive toppe opnåedes, hvoraf de første to var immunoaktive over for kanin-anti-thymopoietin-antistof. Den første top påførtes en 1 x 60 cm kolonne af "DEAE-Sephadex A-25", 48 DK 167928 B1 som var blevet ækvilibreret med 50 mM Tris-puffer, pH 7,0. Iode-ringsblandingen elueredes med denne puffer under anvendelse af en lineær gradient af øgende ionstyrke fra ækvilibreringskoncentrationen op til 1,0 M. Radioaktiviteten af hver fraktion bestemtes under an-5 vendelse af et "LKB 1280 Ultra-gamma"-spektrometer.

Fraktioner med topradioaktivitet fra hver oprensningsskema analyseredes for binding med overskud af antithymopoietin-antistof. Fraktionerne fra top II (fraktionerne 35-45) fra "DEAE-Sephadex A-25" kolonnen udviste den højeste specifikke binding og anvendtes derefter i 10 radioreceptortesten.

Ioderet thymopoietin bibeholdt biologisk aktivitet som bestemt ved testning af dets effekt i en neuromuskulær test (Goldstein, Nature, 247, 11-14 (1974) og dets effekt på syntese af cyklisk GMP i CEM-celler. Bindingstest - Testpufferen fremstilledes ved tilsætning af 12 15 g Hepes, 1,2 g MgSO^ og 1,2 g BSA til 1000 ml gias-destilleret vand.

En pH på 7,65 opnåedes under anvendelse af 1 N NaOH. Forrådsstandardopløsningen fremstilledes under anvendelse af testpuffer og anvendtes i 1 uge. Testen udførtes i 12 x 75 mm glastestrør ved tilsætning af 100 μΐ standardopløsning, 25 μΐ receptorprotein (150-200 20 /ig/ml), 25 μΐ 125I-TP (80.000 cpm), 20 μΐ 1% "Triton X-100" og der fyldtes op til 200 μ1 med testpuffer. Efter inkubering i 18 timer ved 4°C tilsattes 200 μΐ humant IgG (1,5 mg/ml) som bærer og 200 /il 35% PEG-8000 i PBS, pH 7,56, der blandedes og inkuberedes i 30 minutter på is. Rørene centrifugeredes og remanensen vaskedes med 25 10% PEG i PBS, pH 7,3, og taltes i en "LKB-gamma"-tæller.

Radioaktiviteten i bundfaldet i nærværelse af 1 mg/ml ikke radioaktivt thymopoietin toges som repræsentant for ikke-specifik binding. TCA sattes til supernatenten (slutkoncentration 5%) og udfældelig radioaktivitet måltes. I alle tilfælde oversteg dette 95%, hvilket 125 30 indikerer minimal frigørelse af frit I fra sporstoffet.

Konkurrenceforsøq - Efter den ovennævnte bindingstestprocedure inkuberedes 2,3 x 10"^ M 12^I-TP med 4 g bindingsprotein og testpeptid.

125

Inkuberingen fortsattes i 12 timer, og frit og bundet I-TP bestemtes som ovenfor. De følgende repræsentative forbindelser ifølge opfindelsen 35 forårsagede fortrængning på mindst 50% af det, som forårsages af thymopoietin ved selvfortrængning i ækvivalente koncentrationer: Ν-α-acetyl-ARG-PR0-ASP-GLN-TYR-0H, N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-ALA-TYR-OH, 49 DK 167928 B1 Ν-α-acetyl-ARG-PRO-ASP-GLU-TYR-OH, N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-ILE-TYR-OH, N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-LYS-TYR-OH, N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-NH2, 5 ARG-AIB-ASP-VAL-TYR-OH, N-a-acetyl-ARG-PR0-ASP-VAL-TYR-NHCH3, desamino-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-NH,,, Ν-α-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-OH, og N-a-formyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-OH.

10

Til sammenligning kan det nævnes, at andre peptider såsom insulin, glucagon, væksthormon, somatostatin, ^-endorphin, FTS, ACTH, CRF og ubiquitin ikke fremkaldte nogen detekterbar fortrængning.

Claims (10)

1. Thymopoietin- eller spleninanalogt peptid med formlen R-V-W-X-Y-Z-R1 5 KENDETEGNET ved, at R er H, NH2, RZ-NH, CHgNH eller pyro-GLU-NH, hvor R2 er et lavere al kyl carbonyl radikal valgt blandt formyl, acetyl, propionyl og succinoyl, 10 0 II V er -CH-C- (ch2)3

15 I NH C=NH

20 NH2, som enten L- eller D-isomer, hvis R er forskellig fra H, A 0 25. er PRO, dehydro-PRO eller -NH-C-C-0, denne sidste enten som L- B eller D-isomer, A er 1avere al kyl, 30. er H, hvis A er g lavere al kyl og er ellers C^_3 lavere al kyl, eller A og B danner tilsammen -(CH2)^- eller -(CH2)g-, X er D-ASP, ASP, D-GLU eller GLU, Y er GLY, VAL, LEU, nor-LEU, PHE, ILE, LYS, GLN, GLU, ALA, D-VAL,

35 D-LEU, D-nor-LEU, D-PHE, D-ILE, D-LYS, D-GLN, D-GLU eller D-ALA, E CH2<0>OH Z er U -N-CH-C- II O 51 DK 167928 B1 D er H, 3-chlor eller 3-nitro, E er H eller C13 lavere al kyl, R" O R" O I II 11

2. Peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at R-V er R^-ARG eller R^-D-ARG, hvor R^ er som defineret i krav 1, W er PRO eller AIB, samt farmaceutisk acceptable syre- eller base-additionssalte deraf.

3. Peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at 1 7

15 R-V er R -ARG, hvor R er som defineret i krav 1, W er PRO eller AIB, X er ASP eller GLU, Y er GLY, VAL, LEU, nor-LEU, PHE, ILE, LYS, GLN, GLU eller ALA, R* er OH eller NH2, 20 samt farmaceutisk acceptable syre- eller base-additionssalte deraf.

4. Peptid ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at R-V er acetyl-ARG og R1 er NH2.

5 N-tt-acetyl-D-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-NH2, og Ν-α-acetyl-ARG-AIB-ASP-VAL-TYR-NH2.

5. Peptid ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at det er N-a-acetyl-ARG- pro-asp-val-tyr-nh2.

5 R1 er OH, NHR", -NH-CH-C-OH eller -NH-CH-C-NHR"', og R" og R"' uafhængigt af hinanden er H eller lavere al kyl, under forudsætning af, at ikke mere end én blandt V, X og Y er en D-aminosyre, samt farmaceutisk acceptable syre- eller base-additionssalte deraf.

6. Peptid ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at det er N-a-acetyl-ARG- PRO-ASP-GLU-TYR-OH.

7. Peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at det er valgt blandt ARG-AIB-ASP-VAL-TYR-OH, arg-pro-asp-val-tyr-nh2,

30 ARG-CLE-ASP-VAL-TYR-OH, ARG-D-PRO-ASP-VAL-TYR-OH, N-a-acetyl-ARG-3,4-dehydro-PRO-ASP-VAL-TYR-NH2, arg-aib-asp-val-tyr-nh2, Ν-α-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-GLY-NH2, og 35 ARG-4-methyl-LEU-ASP-VAL-TYR-OH.

8. Peptid ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at det er valgt blandt N-a-acetyl-D-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-OH, N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-D-TYR-OH, 52 DK 167928 B1 Ν-α-acetyl -ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-NH-CH2-CH-CH3, CH3 Ν-α-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-NH-CH3,

9. Peptid ifølge krav 3, KENDETEGNET ved, at det er valgt blandt Ν-α-succinoyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-OH, N-a-formyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-OH, 10 Ν-α-acetyl-ARG-PRO-ASP-ILE-TYR-OH, N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-PHE-TYR-OH, N-a-acetyl-ARG-PRO-ASP-GLN-TYR-OH, Ν-α-acetyl -ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-OH, N-tt-acetyl-ARG-PRO-ASP-ALA-TYR-OH,

15 N-a-acetyl-ARG-PRO-GLU-VAL-TYR-NH2, Ν-α-acetyl-ARG-AIB-ASP-VAL-TYR-OH, og Ν-α-acetyl-ARG-PRO-ASP-VAL-TYR-N-a-methyl-TYR-OH.

10. Fremgangsmåde til fremstilling af et peptid ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at man esterificerer en Z-aminosyre, som er beskyttet 20 på dens aminogruppe, til en uopløselig harpikspolymer ved hjælp af covalent binding, fjerner den aminobeskyttende gruppe fra Z-aminosyre-delen, omsætter med en Y-aminosyre, som er beskyttet på dens aminogrup-per, for at koble Y-aminosyren til Z-harpiksen, fjerner den a-amino-be-skyttende gruppe fra Y-aminosyredelen, omsætter med X-aminosyre, som er 25 beskyttet på dens aminogruppe, for at koble X-aminosyren til Y-Z-har-piksen, fjerner den aminobeskyttende gruppe fra X-aminosyredelen, omsætter med en W-aminosyre, som er beskyttet på dens aminogruppe, for at koble W-aminosyren til X-Y-Z-harpiksen, fjerner den aminobeskyttende gruppe fra W-aminosyredelen, omsætter med en N-R-substitueret W-amino-30 syre, som er beskyttet på dens aminogrupper, for at koble den N-R-sub-stituerede W-aminosyre til W-X-Y-Z-harpiksen, spalter harpiksen fra pep-tidet med en syre (R' = OH), ammoniak (R* = NH2) eller en passende amin og fjerner alle beskyttende grupper, og om ønsket omdanner det vundne peptid til et farmaceutisk acceptabelt syre- eller baseadditionssalt 35 deraf.