SE446866B - Sett att framstella en aktiv polypeptid med formaga att inducera differentiering av bade t-lymfocyter och komplementreceptor (cr?72+) b-lymfocyter - Google Patents

Description

446 866 _» Beskrivning av teknikens ståndpunkt Det är väl känt att många polypeptider har isolerats från olika djurorgan, Intill sista ârtiondet har emellertid mycket litet va- rit känt om tymus, ett organ, som hos människan omfattar ca 0,8% av kroppsvikten vid födseln, även om tidigare den hypotesen har uppställts, att det i tymus skulle finnas en neuromuskulär blocke- ringssubstans. Trots ett utpräglat intresse för möjliga funktioner hos tymus och tidiga spekulationer och experiment har hittills myc- ket litet varit känt beträffande tymusfunktionen. Man inser emel- lertid numera att tymus är ett organ med både epitelföreningar (en- dokrina) och lymfoidföreningar (immunologiska) och att tymus såle- des är involverad i kroppens immunfunktioner. Tymus är känt som ett organ, bestående av ett epitelstroma, härrörande från tredje gren- bâgen, och lymfocyter, härrörande från stamcellerna, som har sitt ursprung i hemopoesvävnader, Goldstein et al., "The Human Thymus“, Heinemann, London, 1969. Lymfocyter utvecklas inom tymus och lämnar densamma som mogna tymus-avledda celler, kallade T-celler, vilka cirkulerar till blodet, lymfan, mjälten och lymfknutarna. Induce- ringen av stamcellutveckling inom tymus förefaller förmedlas av sek- retion av epitelceller hos tymus men svårigheter med bioförsök har tidigare förhindrat en fullständig isolering och strukturbestämning av eventuellt närvarande hormoner.

Det har varit känt under en tid att tymus är inbegripen i kroppens immunitetsförsvar och stort intresse har därför visats substanser, som har isolerats från tymus. I sammanhanget har under senare år publicerats ett relativt stort antal artiklar, baserade på vetenskap- liga arbeten i samband med material, som föreligger inom nötkrea- turstymus. I själva verket har vi själva publicerat ett antal ar- tiklar med anknytning till forskning på detta omrâde. Hit hörande publikationer kan återfinnas exempelvis i The Lancet, 20 juli 1968, sid. 119-122; Triangle, vol. 11, nr. 1, sid. 7-14, 1972; Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 183, sid. 230-240, 1971; Clinical and Experimental Immunology, vol. 4, nr. 2, sid. 181-189, 1969; Nature, vol. 247, sid. 11-14, 1974; Proceedings of the Natio- nal Academy of Sciences USA, vol. 71, sid. 1474-1478, 1974; Cell, vol. 5, sid. 361-365 och 367-370, 1975; Lancet, vol. 2, sid. 256- 259, 1975; Proceddings of the National Academy of Sciences USA, vol. 72, sid. 11-15, 1975; Biochemistry, vol. 14, sid. 2212-2218, 1974 samt Nature, vol. 255, sid. 423-424, 1975. 446 866 I artikeln av Goldstein och Manganaro i Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 183, sid. 230-240, 1971, beskrives fö- rekomsten av en tymus-polypeptid, som förorsakar myastenisk neu- romuskulär blockering hos djur, vilket tillstånd är analogt med sjukdomen myastenia gravis hos människa. I artikeln beskrives vi- dare att två skilda effekter förorsakas av separata polypeptider i nötkreaturstymus. En av dessa polypeptider, kallad "thymotoxin“, förmodas förorsaka myositis men det anges vidare att denna poly- peptid inte har isolerats även om den förefaller vara en polypeptid med molekylvikt ca 7000, med starkt positiv nettoladdning och vida- re att den kvarhålles av CM-Sephadex vid pH 8,0.

I publikationen “Nature", 247, 11, 4 januari 1975, beskrives produk- ter, identifierade som Thymin I och Thymin II, vilka har befunnits vara nya polypeptider, isolerade från nötkreaturstymus, vilka upp- visar speciell användbarhet inom olika terapeutiska områden. Ef- tersom liknande namn används för andra produkter, som isoleras från tymus enligt tidigare känd teknik, betecknas dessa Thymin I- och Thymin II-produkter numera som Thymopoietin I och Thymopoietin II.

Dessa produkter och förfaranden beskrives i amerikanska patentan- sökningen 606 843.

I amerikanska patentet 4 002 602 beskrives längkedjiga polypepti- der, vilka även har beskrivits i Ubiquitous Immunopoietic Polypep- tide (UBIP). Denna peptid har senare fått benämningen Ubiquitin.

Denna polypeptid är en sådan med 74 aminosyror, vilken kännetecknas av sin förmåga att in vitro i nanogram-koncentrationer inducera utveckling av både T-cell- och B-cell-immunocyter från prekursorer, som föreligger i benmärg eller mjälte. Polypeptiden är således an- vändbar inom terapeutiska områden, innefattande tymus- eller immu- nitetsbrister eller -fel och liknande.

I amerikanska patentet 4 002 740 beskrives syntetiserade tridekapep- tidkompositioner, vilka förmår inducera utveckling av T-lymfocyter men inte komplementreceptorn B-lymfocyter. Denna polypeptid uppvi- sar således många av egenskaperna hos lângkedjiga polypeptider, som isolerats och kallats thymopoietin i ovan nämnda amerikanska patentansökan 606 843.

Föreliggande uppfinning avser en syntetiserad polypeptid med fem 446 _866 ” 4 aminosyror, vilken uppvisar en bestämd sekvens såsom aktiv del och vilken har befunnits uppvisa många av kännetecknen hos den làngked- jiga polypeptiden, som isolerats och benämnts Ubiquitous Immuno- poietic Polypeptide (UBIP) i ovan nämnda publikationer och ameri- kanska patentskriften 4 002 602.

Sammanfattning av uppfinningen Föreliggande uppfinning avser följaktligen att åstadkomma nya poly- peptider med viktiga biologiska egenskaper, dvs polypeptider, som i nanogram-koncentrationer förmår inducera utveckling ("differen- tiation“) av både T-prekursor-celler och B-prekursor-celler, vilka polypeptider därigenom blir mycket användbara inom immunitetssyste- met hos människor och djur.

Vid framställningen av polypeptiden enligt uppfinningen bildas hartsmellanprodukter, vilka uppvisar följande sekvens: R1 R2 I I d-R3-X-Y-Z-GLN-LYS-harts.

Såväl denna peptid-mellanprodukt, befriad från hartset och övriga skyddsqrupper, varvid X, Y och Z har ovan angiven betydelse och R1, R2 och R3 betecknar skyddsgrupper hos aminosyrorna, vilka grupper anges i den mánde är nödvändiga, som hartset är en fast polymer, vilken verkar som bärare för reaktionen.

De nya pentapeptiderna, innehållande den ovan angivna nya sekven- sen enligt uppfinningen, kan beskrivas medelst följande allmänna formel: R-X-Y-Z-GLN-LYS-R' II där X, Y och Z har ovan angiven betydelse och R och R' är substi- tuenter hos pentapeptidsekvensen, vilka substituenter inte nämn- värt påverkar den biologiska aktiviteten hos den aktiva bassekven- sen. Härmed skall förstås att aminosyrorna i ändläge hos denna pentapeptidkedja kan vara modifierade utan att man överskrider upp- finningens ram, om funktionella grupper eller derivat (R och R') anbringas på dessa i ändläge befintliga aminosyror utan att väsent- ligt påverka den biologiska aktiviteten hos molekylen. Aminosyra- och karboxylsyragrupperna i ändläge är således inte väsentliga för den biologiska_aktiviteten hos pentapeptiden såsom hos nâgra poly- 446 866 peptider. Inom uppfinnigens ram faller således dessa pentapeptider, vilka är osubstituerade i ändläge och sådana vilka är substitue- rade i ändläge med en eller flera funktionella grupper, som inte väsentligt påverkar den här beskrivna biologiska aktiviteten.

Av det ovan sagda förstår man att dessa funktionella grupper kan innefatta grupper erhållna vid normal substitution såsom acylering av den fria aminogruppen och amidering av den fria karboxylsyra- gruppen liksom substitution av ytterligare aminosyror och polypepti- der. I dessa avseenden förefaller pentapeptiderna enligt uppfin- ningen att vara unika, eftersom de uppvisar samma biologiska akti- vitet som långkedjiga naturliga peptider, hos vilka denna pentapep- tidsekvens utgör en del eller förekommer. Man kan således utgå ifrån att aktivitetsegenskaperna hos molekylen alstras genom ste- reoisomeri hos molekylen, dvs genom den speciella "buktningen" av molekylen. I detta avseende skall förstås att polypeptidbindningar inte är styva utan flexibla och kan föreligga som band, spiraler och liknande. Följaktligen är hela molekylen flexibel och kommer att "buktas“ pâ ett visst sätt. Enligt föreliggande uppfinning har man upptäckt att pentapeptiden “buktar sig" på samma sätt som den långkedjiga naturliga polypeptiden och därför uppvisar samma biolo- giska egenskaper. Av denna orsak kan pentapeptiden substitueras med olika funktionella grupper så länge substituenterna inte väsent- ligt påverkar den biologiska aktiviteten eller motverkar eller in- griper i molekylens naturliga "buktning".

Molekylens förmåga att bibehålla sin biologiska aktivitet och na- turliga buktning belyses klart av det faktum, att pentapeptidsek- vensen enligt uppfinningen uppvisar samma biologiska egenskaper som den naturliga peptid med 74 aminosyror,vilken beskrivits under namnet Ubiquitin i amerikanska patentet 4 002 602. Hos denna lång- kedjiga polypeptid kan pentapeptiden enligt föreliggande uppfinning identififeras inom molekylen men endast i kombination med övriga där beskrivna aminosyror. Nämnda patent utgör emellertid ett di- rekt bevis för att pentapeptiden enligt föreliggande uppfinning svarar för den aktiva delen, eftersom de biologiska egenskaperna är desamma och aminosyrorna och peptidkedjorna, som substituerats~ på aminosyrorna i ändläge, påverkar inte de biologiska egenskaper- na hos pentapeptid-basfragmentet. 446 866 Med beaktande av det ovan anförda skall det därför förstås - “ utan att det faller inom det som begäres skydd för i kraven - att R och R' i formel II kan vara varje substituent, som inte nämnvärt påverkar den biologiska aktiviteten hos den aktiva bas- sekvensen. Således kan, endast som belysande exempel, R och R' vara vilken som helst av följande substituenter: .ß i R_' 'väte OH c1-C7-alkyl NH2 C5-C12-aryl NHR7 C6-C20-alkaryl N(R7)2 C6-C20-aralkyl OR7 C1~C7~alkanoyl C 2-C7-alkenyl C2-C7-alkinyl varvid R7 betecknar C1-C7-alkyl, C2 C6-C20-aryl, C6-C20-aralkyl eller C6-C20-alkaryl.

-C7-alkenyl, C2-C7-alkinyl, Såsom påpekats ovan kan R och R' emellertid även utgöra neutrala aminosyragrupper eller rester av polypeptidkedjor med 1-20 kolato- mer. Följande grupper är belysande exempel: 5 ål _AsP GLU SER SER LEU THR SER-Asp LEU Lsu-saa-ASP His LEU-ASP VAL Lau-san ARG GLU-san GLU-THR GLU-SER-LEU GLU-SER-THR GLU-SER-THR~LEU GLU-SER-THR-LEU-HIS GLU-SER-THR-LEU~HIS-LEU GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU 446 866 RI GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG~LEU GLU~SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG-LEU-ARG.

Som syror, vilka förmår bilda salter med pentapeptiderna, kan näm- nas oorganiska syror såsom klorvätesyra, bromvätesyra, perklorsy- ra, salpetersyra, tiocyansyra, svavelsyra, fosforsyra etc. och organiska syror såsom myrsyra, ättiksyra, propionsyra, glykolsyra, mjölksyra, druvsyra, oxalsyra, malonsyra, bärnstenssyra, maleinsy- ra, fumarsyra, antranilsyra, kanelsyra, naftalensulfonsyra och sul- fanylsyra.

I ovan angivna struktur betecknas aminosyrakomponenterna hos pep- tiden i det följande för enkelhetens skull med föfixmtningar. Dessa förkortningar är följande: Aminosyra Förkortad beteckning L-tyrosin TYR L-asparagin ASN L-asparaginsyra ASP L-isoleucin ILE L-serin SER L-glutamin GLN L-leucin LEU L-lysin LYS L-glutamin GLU L-treonin THR L-histidin HIS L~valin VAL L-arginin ARG L-alananin ALA Polypeptiderna enligt uppfinningen är sådana med 5 aminoSYr°r och de har befunnits uppvisa liknande egenskaper som polypeptiden med 74 aminosyror, benämnd Ubiquitin (eller UBIP), som isolerats från nötkreaturstymus enligt uppgifter i amerikanska patentet nr. 4 002 602. Peptiderna enligt föreliggande uppfinning kännetecknas speciellt av sin förmåga att inducera selektiv utveckling av T-pre- kursorceller liksom även B-prekursorceller i nanogramkoncentratio- fler . 446 866 .v Man har funnit att polypeptiderna enligt uppfinningen inducerar utveckling av immunocyt-prekursorceller in vitro på samma sätt som de långkedjiga polypeptider, som beskrivits i amerikanska patentet 4 002 602. Polypeptiderna enligt föreliggande uppfinning har såle- des - även i nanogramkoncentrationer - befunnits inducera utveckling av både T-prekursorceller, påvisade och uppmätta genom bildandet av tymus-utvecklingsantigenen TL och THY-1 (6), liksom B-prekursorcel- ler, påvisade och utmätta genom bildandet av komplementreceptorer, ett utmärkande tecken på B-celler.

För underlättande av förståelsen av vikten av de biologiska utveck- lingskännetecknen hos polypeotiderna enligt uppfinningen bör det påpekas att funktionen hos tymus, sedd i relation till immuniteten, i vidaste förståelse kan beskrivas som produktion av tymus-avledda celler, eller lymfocyter, vilka kallas T-celler. T-celler utgör en betydande del av totala recirkulerande små lymfocyter. T-celler upp- ,visar immunologisk specifitet och är direkt inbegripna i det cellför- medlade immungensvaret (såsom "homograft"-gensvar) som effektor- celler. T-celler utsöndrar emellertid inte kroppsvätske-antikroppar, eftersom dessa antikroppar utsöndras av celler, härrörande direkt från benmärgen, oberoende av inverkan av tymus och dessa sistnämnda celler betecknas B-celler. För många antigener erfordrar emellertid B-celler närvaro av lämpligt reaktiva T-celler innan de kan produ- cera antikroppar. Mekanismen för denna cellsamverkningsprocess är inte helt klarlagd.

Utgående från ovanstående förklaring kan det sägas att tymus - be- träffande dess mekanism - är nödvändig för utvecklingen av cellim- munitet och många kroppsvätske-antikroppsgensvar och tymus påver- kar dessa system genom att det inom tymus induceras utveckling av hemopoes-stamceller till T-celler. Den induktiva påverkningen för- medlas via utsöndring av epitelceller från tymus, dvs tymushormoner.

För förståelse av tymusmekanismen och cellsystemet hos lymfocyter samt cirkulationen av lymfocyter i kroppen bör det ytterligare på- pekas att stamceller bildas i benmärgen och når tymus via blod- strömmen. Inom tymus utvecklas (differentieras) stamceller till im- munologiskt kompetenta T-celler, vilka migrerar till blodströmmen och tillsammans med B-celler cirkulerar mellan vävnaderna, lymfor- na och blodströmmen. 446 866 Kroppens celler, som avsöndrar antikroppar, utvecklas även från hemopoes-stamceller men deras utveckling (differentiering) bestäm- mes inte av tymus. De betecknas således benmärgs-avledda celler eller B-celler. Hos fåglar utvecklas de i ett organ analogt med tymus, som kallas Fabricius Bursa. Hos däggdjur har man inte upp- täckt något analogt organ och man förmodar att B-celler utvecklas inom benmärgen. De fysiologiska substanser, som dikterar denna ut- veckling, är fortfarande helt okända.

Såsom påpekats ovan är polypeptiderna enligt uppfinningen terapeu- tiskt värdefulla vid behandling av människor och djur. Eftersom de nya polypeptiderna uppvisar förmåga att inducera utveckling av lym- fopoes-stamceller, härrörande från hemopoes-vävnader, till tymus- -härledda celler eller T-celler, vilka är inbegripna i kroppens im- munförsvar och även vid induceringen av utvecklingen av B-celler, kan man säga att produkterna enligt föreliggande uppfinning uppvisar mångsidig terapeutisk användbarhet. Eftersom föreningarna uppvisar förmåga att åstadkomma vissa av de beskrivna funktionerna hos tymus kan de i första hand användas inom olika tymusfunktion- och immuni- tetsområden. Ett primärt appliceringsområde är vid behandling av DiGeorge-syndrom, ett tillstånd, vid vilket det föreligger en med- född frånvaro av tymus. Injektion av polypeptiderna enligt förelig- gande uppfinning avhjälper detta fel. En annan applicering är vid behandling av agammaglobulinemi, som baserar sig på en defekt hos kroppens förmenta B-cell-utvecklingshormon. Injektion av polypepti- derna enligt uppfinningen avhjälper detta fel. På grund av de biolo- giska egenskaperna är polypeptiderna enligt uppfinningen, vilka är extremt aktiva vid låga koncentrationer, värdefulla vid medhjälp till kroppens totala immunförsvar genom att de ökar eller bidrar till den terapeutiska stimuleringen av cellimmuniteten och kropps- vätskeimmuniteten och därigenom blir värdefulla vid behandling av sjukdomar, innefattande kronisk infektion in vivo, t.ex. svampin- fektioner eller mykoplasmainfektioner, tuberkulos, spetälska, akuta och kroniska virusinfektioner och liknande. Vidare kan peptiderna anses vara värdefulla inom varje omrâde som berör cell- eller kropps- vätskeimmunitet, och speciellt då det föreligger bristfälligheter eller fel i immuniteten såsom vid ovan nämnda DiGeorge-syndrom.

Baserat på polypeptidernas egenskaper är de in vitro värdefulla för inducering av utvecklingen av ytantigener av T-celler, vid induce- 446 866 _» 10 ring av utveckling av funktionell kapacitet för uppnâende av gen- svar mot mitogener och antigener och cellsamverkan vid ökning av förmågan hos B-celler att alstra antikroppar. Polypeptiderna är in vitro användbara för inducering av utveckling av B-celler, påvis- bar genom utvecklingen av ytreceptorer för komplement. Peptiderna är även användbara för inhibering av okontrollerad tillväxt av lymfocyter, vilka kan pâverkas med Ubiquitin. En viktig egenskap hos polypeptiden är dess in vivo-förmåga att återställa celler med T-cell-karakteristika och även dess in vivo-förmåga att återställa celler med B-cell-karakteristika.

En ytterligare viktig egenskap hos peptiderna enligt uppfinningen är deras höga aktivitet i mycket låga koncentrationer. Man har så- ledes funnit att peptiderna är aktiva i koncentrationer av från 10 nanogram per milliliter och är maximalt aktiva vid koncentrationer av från ca 0,05 - 1 mikrogram per milliliter. Bäraren kan vara vil- ken som helst känd bärare för detta ändamål, inklusive normala salt- lösningar, företrädesvis med ett protein-utspädningsmedel såsom bo- vin-serumalbumin för förebyggande av adsorptionsförluster till glas- väggar vid dessa låga koncentrationer. Peptiderna enligt uppfinnin- gen är aktiva vid en koncentration av över ca 0,1 mg/kg kroppsvikt.

För behandling av DiGeorge-syndrom kan polypeptiderna administreras i en mängd av ca 0,1 - 10 mg/kg kroppsvikt. I allmänhet kan samma doseringsstorlek användas vid behandling av övriga Omnämnda tillstånd eller sjukdomar.

Polypeptiderna enligt uppfinningen framställes analogt med beskriv- ningen av Merrifield i "Journal of American Chemical Society", 85, sid. 2149-2154, 1963. Syntesen innefattar stegvis addition av skyd- dade aminosyror till en växande peptidkedja, som är bunden medelst kovalenta bindningar till ett fast harts. Vid detta förfarande av- lägsnas reagenser och biprodukter genom filtrering och omkristalli- sering av mellanprodukter kan undvikas. Metodens allmänna tillämpning är beroende av anslutningen av den första aminosyran hos kedjan till en fast polymer medelst en kovalent bindning och additionen av ef- terföljande aminosyror, en åt gången vid ett stegvist förfarande, tills önskad sekvens uppnåtts. Slutligen avlägsnas peptiden från den fasta bäraren och skyddsgrupperna avlägsnas. Vid metoden erhål- les en växande peptidkedja, ansluten till en fullständigt olöslig fast partikel, så att peptidkedjan på ett lämpligt och enkelt sätt 446 866 11 kan filtreras och tvättas fri från reagenser och biprodukter.

Aminosyrorna kan vara anslutna till vilken som helst lämplig poly- mer, som endast behöver vara olöslig i de använda lösningsmedlen och uppvisar stabil fysikalisk form, som möjliggör god filtrerbar- het. Den måste innehålla en funktionell grupp, till vilken den förs- ta skyddade aminosyran kan fast bindas medelst en kovalent bindning.

Olika polymerer lämpar sig för detta ändamål, t.ex. cellulosa, poly- vinylalkohol, polymetakrylat och sulfonerad polystyren men vid syn- tesen enligt uppfinningen använder man en klormetylerad sampolymer av styren och divinylbensen.

De olika funktionella grupperna hos aminosyran, vilka var aktiva men vilka inte skulle ingå i reaktionerna, skyddades genom hela reak- tionen medelst konventionella skyddsgrupper av det slag som använ- des inom polypeptidkemin. Således skyddades de funktionella grupper- na hos tyrosin och lysin medelst skyddsgrupper, som kunde avlägsnas efter uppnådd fullständig sekvens utan att menligt påverka den slut- liga polypeptidprodukten. Syntesen utfördes som en modifiering av syntesmetoden i fast fas genom att fluorescamin användes för bestäm- ning av huvuvida kopplingen var fullständig genom pâvisande av po- sitiv fluorescens (se Felix et al., Analyt. Biochem. 52, 377, 1973).

Om en fullständig koppling inte indikeras, upprepas kopplingen med samma skyddade aminosyra före skyddsgruppavlägsnandet.

Den allmänna proceduren innefattar till en början förestring av L- -lysin, vars aminogrupper skyddats, till hartset i absolut alkohol innehållande en amin. Det kopplade aminosyrahartset filtrerades, tvättades med alkohol och vatten och torkades. Skyddsgruppen hos a-aminogruppen hos lysin-aminosyran (t.ex. t-BOC, dvs t-butyloxi- karbonyl) avlägsnades därefter utan att övriga skyddsgrupper pâver- kades. Det resulterande kopplade aminosyrahartset, uppvisande den fria aminogruppen, reagerades därefter med skyddad L-glutamin, fö- reträdesvis d-tBOC-L-glutamin, i och för koppling av L-glutaminen.

Reaktionerna upprepades därefter med skyddad L-isoleucin, L-aspa- ragin och L-tyrosin, tills den fullständiga molekylen hade uppnåtts.

Sekvensen av reaktioner utfördes enligt följande schema: 446 866 12 Herta H2 a-BOC-Lys-OH Ra a-BOC-Lys-harts å avlägsnande av oc-amino-skyddsgrupp 2 H-IUS-harts la-Boc-L-Gln Ra cx-BOC-Gln-Lys-harts avlägsnande av a-amino-skyddsgrupp Ra Hi-Gln-Lys-harts a-BOC-Ile~0H V H2 a-BOG-Ile-Gln-Lys-harts avlägsnande av a-amíno-skyddsgrupp v Ra H-Ile-Gln-Lys-harts cx-BOC-Asn-OH R 2 I a-BOC-Asn-Ilà-Gln-Lfgrs-harts avlägsnande av oz-amino-slqyddsgrupp R v 2 H-Asn-Ile-Gln-Lys-harts Tf: a-R -Tyr- OH R BR ' 'l -2 04-35-Tyr-Asn-Ile-Gln-Lås-harts avlägsnande av samtliga skyddsgrupper HÄ-Tyr-Asn-Il e-Gln-Lys-OH I ovanstående sekvens av reaktioner är R1 och R2 skyddsgrupper hos olika reaktiva sidokedjor hos aminosyrorna, vilka inte pâ- verkas eller avlägsnas då skyddsgruppen hos a-aminogruppen av- lägsnas för möjlíggörande av ytterligare reaktion och oL-R3 är en 446 866 - 13 skyddsgrupp hos a-aminogruppen. I det ovan beskrivna mellanprodukt- -pentapeptidhartset betecknar R1 företrädesvis en skyddsgrupp så- som O-2,6-diklorbensyl medan R2 företrädesvis betecknar e-2-klor- bensyloxikarbonyl och R3 företrädesvis betecknar t-butyloxikarbo- nyl. Hartset kan vara vilket som helst av ovan nämnda hartser, som lämpar sig i processen. I ovan angivna serier av reaktioner fram- ställdes peptiderna, där ALA insatts.i stället för TYR, ASN eller ILE, på liknande sätt.

Sedan man uppnått den slutliga mellanprodukten spjälkades peptid- hartset i och för avlägsnande av R1-, R2- och R3-skyddsgrupperna och hartset. Skyddsgrupperna avlägsnades pâ konventionellt sätt, t.ex. genom behandling med vattenfritt fluorväte, och den resulte- rande fria peptiden uppsamlades.

Ehuru en föredragen metod för framställning av polypeptiderna en- ligt uppfinningen är med användning av en olöslig, fast polymer, såsom beskrivits av Merrifield, kan även andra framställningssätt tillämpas. Således kan exempelvis ett annat fast substrat användas såsom ett N-mety1-benshydrylaminharts eller benshydrylaminharts, vilket är fördelaktigt under vissa betingelser. Vid detta förfaran- de binds den C-terminala aminosyran direkt till hartset och den slutliga peptiden kan separeras från substratet i HF för bildning av C-terminala amider.

Metoder för användning av ett N-metyl-benshydrylaminharts har be- skrivits av Manahan et al. i Biochemical and Biophysical Research Communications, 48, 1100-1105 (1972). Metoder för användning av ett benshydrylaminharts har beskrivits av J. Rivier et al. i Journal of Medical Chemistry 1973, vol. 16, p. 545-549.

Olika derivat av den grundläggande pentapeptiden kan även framstäl- las med användning av i och för sig kända metoder. Vid framställ- ningen av sådana derivat är det uppenbarligen nödvändigt att bloc- kera funktionella grupper, som skulle kunna påverka reaktionssek- vensen, i och för erhållande av den önskade produkten. Exempelvis bör a-karbonsyragruppen hos asparaginsyra eller a-aminogruppen hos lysin blockeras under framställningen av dessa derivat.

Såsom framhâllits ovan är det vid genomföringen av förfarandet nöd- vändigt att skydda eller blockera aminogrupperna i syfte att kont- 446 866 - 14 rollera reaktionen och erhålla önskade produkter. Lämpliga amino- skyddsgrupper, som kan användas, innefattar saltbildningsgrupper för skydd av starkt basiska aminogrupper eller uretanskyddsgrup- per såsom bensyloxikarbonyl och t-butyloxikarbonyl. Företrädesvis använder man tert.-butyloxikarbonyl (tBOC) eller t-amyloxikarbonyl (AOC) för skydd av a-aminogruppen hos aminosyrorna som undergår reaktion vid karboxyländen av molekylen, eftersom BOC och AOC (t- -amyloxikarbonyl)-skyddsgrupper lätt kan avlägsnas efter en sådan reaktion och före det efterföljande steget (där sådan u-aminogrupp själv undergår reaktion) medelst relativt mild inverkan av syror (t.ex. trifluorättiksyra), vilken behandling annars inte påverkar grupper, som används för skydd av andra reaktiva sidokedjor. Det skall således förstås att a-aminogrupperna kan skyddas genom reak- tion med en godtycklig substans, som kommer att skydda aminogrupper- na för efterföljande reaktion(er) men som senare kan avlägsnas un- der betingelser, som inte i övrigt påverkar molekylen. Exempel pâ sådana substanser är organiska karbonsyraderivat, som acylerar ami- nogruppen.

Generellt kan vilken som helst av aminogrupperna skyddas genom re- aktion med en förening, innehållande en grupp med formeln: o II R-o-c- där R betecknar en grupp, som skyddar aminogruppen från att ingå i en efterföljande kopplingsreaktion och som kan avlägsnas utan att annars påverka molekylen. R betecknar således rak eller grenad alkyl, som eventuellt är omättad, företrädesvis med 1-10 kolatomer, vidare aryl, företrädesvis med 6-15 kolatomer, cykloalkyl, företrä- desvis med 5-8 kolatomer, aralkyl med företrädesvis 7-18 kolatomer, alkaryl med företrädesvis 7-18 kolatomer eller en heterocyklisk grupp, t.ex. isonikotinyl. Aryl-, aralkyl- och alkarylgrupperna kan även vara ytterligare substituerade med t.ex. en eller flera alkyl- grupper med 1-4 kolatomer. Föredragna betydelser av R innefattar tert.-butyl, tert.-amyl, fenyl, tolyl, xylyl och bensyl. Speciellt föredragna specifika aminskyddsgrupper innefattar bensyloxikarbo- nyl, substituerad bensyloxikarbonyl, där fenylringen är substitue- rad med en eller flera halogenatomer, t.ex. med klor eller brom, vidare nitro, lägre alkoxi, t.ex. metoxi, lägre alkyl, tert.-butyl- 446 866 » 15 oxikarbonyl, tert.-amyloxikarbonyl, cyklohexyloxikarbonyl, vinyl- oxikarbonyl, adamantyloxikarbonyl, bifenylisopropoxikarbonyl och liknande. Andra skyddsgrupper vilka kan användas är isonikitonyl- oxikarbonyl, ftaloyl, para-tolylsulfonyl, formyl och liknande.

Vid genomföringen av den generella processen enligt uppfinningen uppbygges peptiden genom reaktion av den fria u-aminogruppen med en förening, som uppvisar skyddade aminogrupper. För reaktionen eller kopplingen aktiveras föreningen, som skall ingå reaktion, vid karb- oxylgruppen så att denna därefter kan reagera med den fria u-amino- gruppen hos den anslutna peptidkedjan. För erhållande av aktivering kan karboxylgruppen omvandlas till varje reaktiv grupp såsom en estergrupp, anhydridgrupp, azidgrupp, syrakloridgrupp eller liknande.

Under dessa reaktioner innehåller aminosyragruppen både aminogrupper och karboxylgrupper och vanligtvis ingår en grupp i reaktion medan den andra är skyddad. Före kopplingssteget avlägsnas skyddsgruppen hos a- eller ändaminogruppen hos den "attackerade" peptiden under betingelser, som inte nämnvärt påverkar övriga skyddsgrupper, t.ex. gruppen vid e-aminogruppen hos lysinmolekylen. Föredragen procedur för genomföring av detta steg är mild acidolys, t.ex. genom reaktion med trifluorättiksyra vid rumstemperatur.

Som man lätt inser resulterar ovan beskrivna processteg i framställ- ning av den specifika pentapeptiden med följande formel: H-TYR-ASN-ILE-GLN~LYS-OH.

Denna pentapeptid innefattar även den grundläggande aktiva polypep- tidsekvensen enligt uppfinningen. Den substituerade pentapeptiden med formeln II, där TYR- och LYS-aminogrupper i ändläge kan vara yt- terligare substituerade på ovan angivet sätt, framställes därefter genom reaktion av denna grundläggande pentapeptid med lämpliga rea- genser för framställning av önskade derivat. Reaktioner av denna typ såsom acylering, förestring, amidering och liknande, är givetvis i och för sig väl kända. Andra aminosyror, dvs aminosyragrupper, som inte påverkar den biologiska aktiviteten hos den grundläggande pentapeptidmolekylen, adderas sedan till peptidkedjan medelst samma sekvens av reaktioner som den enligt vilken pentapeptiden synteti- serades vid båda ändarna av peptidkedjan. 446 866 _, 16 Nedan följande exempel belyser uppfinningen utan att dock begrän- sa densamma. I exemplen och genomgående i beskrivningen avses med "delar" viktdelar såvida inte annat specificeras.

Exempel 1 Vid framställning av polypeptiden enligt uppfinningen utgick man från följande kommersiellt tillgängliga substanser: d-BOC-L-glutamin-0-nitrofenylester a-BOC-E-2-klor-bensyloxikarbonyl-L-lysin a-BOC-asparagin a-BOC-L-isoleucin u-BOC-O-2,6-diklorbensyl-L-tyrosin.

I dessa reagenser är BOC lika med t-butyloxikarbonyl. “Sequenal“- grade-reagenser för aminosyrasekvensbestämningar, dicyklohexyl- -karbodiimid, fluorescamin och hartset var även kommersiellt till- egängliga produkter. Det använda hartset var ett polystyren-divinyl- bensen-harts, 200-400 mesh kornstorlek, innehållande 1% divinylben- sen och 0,75 mM klor per gram harts.

Vid framställningen av polypeptiden förestrades 2 mnml a-BOC-e- -2-klorbensyloxikarbonyl-L-lysin till 2 mmol klormetylerat harts i absolut alkohol, innehållande 1 mM trietylamin, under 24 timmar vid 80°C. Det resulterande kopplade aminosyrahartset filtrerades, tvät- tades med absolut alkohol och torkades. Därefter kopplades på lik- nande sätt övriga a-BOC-aminosyror till den icke skyddade d-amino- gruppen hos peptidhartset i riktig ordningsföljd för att resultera i polypeptiden enligt uppfinningen med användning av ekvivalenta mängder dicyklohexylkarbødiimid med undantag för d-BOC-L-glutamin- -O~nitrofenylester, som kopplades direkt. Efter varje kopplingsre- aktion testades en alikvot harts med fluorescamín och om positiv fluorescens pâvisadeS,bedömdes kopplingen som ofullständig och upp- repades med samma skyddande aminosyra. Som ett resultat av de oli- ka kopplingsreaktionerna erhölls pentapeptid-harts-mellanprodukten.

Detta peptid-harts spjälkades och de skyddande grupperna avlägsna- des i en Kelf-spjälkningsapparatur (Peninsula Laboratories, Inc.) med användning av vattenfritt fluorväte vid 0°C under 60 minuter med 1,2 ml anisol per gram peptid-harts som rengöringsmedel. Pep- tidblandningen lyofiliserades och tvättades med vattenfri eter och n ,........ __... . . _.. -...... 446 866 J 17 peptiden kromatograferades över P-6 Bio-Gel i 1 N ättiksyra. Den resulterande polypeptiden hade enligt analys 94% renhet och upp- visade följande sekvens: H-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-OH.

Exempel 2 För bestämning av aktiviteten och egenskaperna hos polypeptiden utfördes bestämningar med friska 5-6 veckor gamla nu/nu-möss av bå- da könen, varvid mössen uppföddes i BALB/c-miljö (thymocyter lika med Thy-1,2-ytantigen) och hölls under konventionella betingelser.

För antisera framställdes anti-Thy-1,2-sera i Thy-1-kongeniala möss.

För alstrande in vitro av Thy-1+-T-cell- eller CR+-B-cell-utveck- ling utfördes induceringen av thymocyt-utveckling från prothymocy- tes in vitro såsom beskrivits av Komuro och Boyse (Lanset 1, 740, 1973) med användning av bildningen Thy-1,2 som ett kännetecken på- T-cell-utveckling. Induceringen av CR+-B-cell-utveckling från CR-- -B-cellprekursorer in vitro utfördes under liknande betingelser, varvid som försökskriterium tillämpades Cšïfi-cellernas kapacitet att binda fårerythrocyter, belagda med subagglutineringsmängder av ka- ninantikroppar och icke-lytiskt komplement. Mjältcellpopylationer från friska nu/nu-möss fraktionerade i diskontinuerliga bovinserum- albumin-gradienter, användes som källa för de båda prekursortyper- na (Thy-1- och CR-), eftersom de uppvisar endast mycket få eller inga Thy-1+-celler och lågt antal CR+-celler.

Som ett resultat av denna bestämning fann man att polypeptiden ut- vecklade en selektivitet av verkningar liknande den hos Ubiquitin vid inducering av utveckling av T-lymfocyter och av komplementre- ceptor (CR+) B-lymfocyter. Pentapeptiden inducerade utveckling av Thy-1+-T-celler i koncentrationer från 10 ng till 1 pg/ml och in- ducerade även utveckling av CR+-B-celler i koncentrationer av från 10 ng till 1 pg/ml.

Exempel 3 och 4 ÉëɶEÉl_§ Den enligt exempel 1 framställda pentapeptiden behandlades - medan den fortfarande var kopplad till hartset - med trifluorättiksyra i deklormetan för avlägsnande av t-BOC-skyddsgruppen från tyrosin- delen. Den resulterande peptiden acylerades därefter med ättiksyra- 446 866 J 18 anhydrid och separerades därefter från hartssubstratet, varefter alla skyddsgrupper avlägsnades med HF. Följande acylerade derivat framställdes på detta sätt: A. CH3CO-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-OH E§eæe2ë_ë För erhållande av det amiderade derivatet av pentapeptiden enligt exempel 1 framställdes den skyddade pentapeptiden med användning av ett benshydrylaminharts som substrat, varvid metoden enligt J.

Rivier et al., som omnämnts ovan, följdes. Det amiderade derivatet erhölls genom spjälkning av den skyddade pentapeptiden, anknuten till bashartset, genom reaktion med vätefluorid.

Den amiderade pentapeptiden hade följande formel: B. H~TYR-ASN-ILE~GLN-LYS-NH2 För identifiering använde man tunnskiktskromatografi och elektro- fores, som gav följande analysdata.

Tunnskiktskromatografi: Prov: 30 pg silikagel (Brinkman-glasskiva 5 x 20 cm, 0,25 mm tjocklek) 1 R; : n-BuOH : pyridin : HOAC : H20 30 : 15 : 3 : 12 Rš : EtOAc : pyridin : HOAC : H20 5 : 5 : 1 : Rf : EtOAc : n-BuOH : HOAC : H20 1 : 1 : 1 : 1 Sprayreagens: Pauly, Ninhydrin och I2.

TLC Elektrofores 1 2 peptiden vandra- ' 3 Förening _Rf Rf Rf de mot katoden Ac-TYR-AsN-ILE-GLN-Lys 0,47 0,87 0,54 - 1,35 cm 'rYR-AsN-ILE-GLN-Lys-NHZ 0,48 0,87 0,37 - 6,60 cm Elektrofores: Whatman 3 mm papper (11,5 cm x 56,5 cm) Prov: 100 pg pH 5,6, pyridin-acetat-buffertlösning 1000 V, 1 timme.

Sprayreagens: Pauly och Ninhydrin. 446 866 ” 19 Den acetylerade pentapeptiden från exempel 3 uppvisade - då den användes i en koncentration av 1 pg/ml i 14%-ig Twomey-lösning - maximum- och minimum-aktiviteter jämförbara med desamma för bas- pentapeptiden enligt exempel 1.

Den amiderade pentapeptiden från exempel 4 uppvisade - då den an- vändes i en koncentration av 1 pg/ml i 6%-ig Twomey-lösning - en aktivitet som var jämförbar med densamma för baspentapeptiden en- ligt exempel 1.

Exempel 5 Bas-pentapeptiden som framställdes enligt exempel 1, spjälkades - medan den fortfarande var bunden till hartset - från hartset genom transförestring med natriummetoxid i metanol under transförestrings- betingelser. Efter avlägsnande av skyddsgrupperna erhölls den för- estrade produkten med följande formel: H-TYR-ASN-ILE-GLN~LYS-ÜCH3.

Exempel 6 Dietylaminderivatet av pentapeptiden, framställd enligt exempel 1, framställdes från metylestern enligt exempel 5. Vid denna reaktion fick metylestern enligt exempel 5 reagera med dietylamin i dimetyl- formamidlösning för åstadkommande av följande diamino-substituerade amid: H-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-N(CZH5)2.

Detta dietylaminderivat kan även framställas genom reaktion av bas- -pentapeptiden enligt exempel 1 - medan den fortfarande är anknu- ten till hartssubstratet - genom spjälkning av peptiden från hart- set genom reaktion med dietylamin. Den resulterande produkten efter avlägsnande från hartset och avlägsnande av skyddsgrupperna är di- etylamid-derivatet.

Exempel 7 Enligt detta exempel framställdes N-etyltyrosinderivatet av bas- -pentapeptiden enligt exempel 1 genom reaktion med etylbromid.

För utförande av reaktionen förblev d-aminogruppen hos lysin-delen blockerad medelst en a-2-klorbensyloxikarbonylgrupp men den TYR- -terminala aminogruppen frigjordes genom reaktion med trifluorättik- syra i deklormetan. Den blockerade mellanprodukten fick därefter 446 866 J 20 reagera med stökiometrisk mängd etylbromid under alkyleringsbe- tingelser. Skyddsgruppen avlägsnades därefter från LYS-a~amino- syran för erhållande av den substituerade polypeptiden med följan- de formel: CZHS-NH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOH.

Exempel 8 Enligt detta exempel framställdes det amiderade derivatet av etyl- amino-polypeptiden enligt exempel 7. Reaktionerna enligt exempel 7 genomfördes medan bas-pentapeptiden fick förbli kopplad till harts- substratet och N-etylderivatet framställdes utan spjälkning från 7 substratet. Därefter spjälkades denna mellanprodukt, som var anknu- ten till hartssubstratet, från hartset medelst vattenfri ammoniak i dimetylformamid-lösningsmedel för åstadkommande av aminopolypep- tiden med följande formel: C2H5NH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-CONH2.

Exempel 9 Enligt detta exempel spjälkades den enligt exempel 3 framställda acylerade pentapeptiden - medan den fortfarande var anknuten till hartssubstratet - genom reaktion med vattenfri ammoniak under ami- deringsbetingelser för frigöring av föreningen och efter avlägsnan- de av skyddsgrupperna erhölls följande polypeptid: CH CONH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-CONH2-. 3 Exempel 10 - 21 Med användning av ovan beskrivet reaktionsförfarande för förläng- ning av polypeptidkedjan framställdes följande polypeptider, vilka innehåller den aktiva aminosyrasekvensen men vilka är substituera- de vid amino- och karboxyländgrupperna med R och R' för åstadkomman- de av den grundläggande aminosyran med formeln: R-NH-TYR-ASN-ILE-GLN~LYS-COR' som är substituerad med aminosyror enligt nedanstående tabell, Exempel nr. R R' 10 ASP OH 11 SER-ASP OH 12 LEU~SERfASP OH 13 LEU-SER-ASP GLU 14 LEU-SER-ASP GLU-SER 446 866 21 Exempel nr. R R' 15 LEU-SER-ASP GLU-SER-THR 16 LEU-SER-ASP GEU-SER-THR-LEU 17 LEU-SER-ASP GLU-SER-THR-LEU-HIS 18 LEU-SER-ASP GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU 19 ASP GLU LEU 20 ASP GLU-SER 21 LEU-SER-ASP GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU- -VAL-LEU~ARG De enligt exemplen 5 - 21 framställda polypeptidderivaten bibehöll sin biologiska aktivitet såsom beskrivits ovan för den grundläggan- de aminosyrasekvensen.

Exempel 22, 23 och 24 Med användning av det i exempel 1 beskrivna sekvensförfarandet fram- ställdes följande pentapeptider: Exempel 22 H-ALA-ASN-ILE-GLN-LYS-OH Exempel 23 H-TYR-ALA-ILE-GLN-LYS-OH Exempel 24 H-TYR-ASN~ALA-GLN-LYS-OH För bestämning av den farmakologiska aktiviteten och karakteristika för dessa pentapeptider tillämpade man induktion av Th-1 (T-cell)- -antigen med kycklingsbenmärg för användning som försök med pepti- der med en koncentration av 1 pg/ml. Metoden är beskriven i Science, Brand et al., vol. 193, sid. 319-321, juli 1976. Vid denna metod fraktionerades sammanförda celler från lårben och tibiotarsus hos nykläckta kycklingar av stammen SC (Hy-Line) genom ultracentrifiuge- ring i en femskikts diskontinuerlig bovinserumalbumin (BSA)-gradient (11). Celler från varje ytskikt tvättades och suspenderades i och för inkubering vid en koncentration av 5 x 10 celler per milliliter med peptid (0,1 pg/ml) i RPMI 1630 medium med tillägg av 15 mM Hepes, 5% y-globulinfritt fetalkalvserum, deoxiribonukleas (14-18 enheter/ml), heparin (5 enheter/ml), penicillin (100 enheter/ml) och streptomycin (100 pg/ml). Kontrollprov inkuberades med BSA (1 pg/ml) eller med enbart medium. Efter inkubering testades cel- leflfilvid ett cytotoxicitetsförsök med användning av kycklings- och marssvinskomplement-fraktioner. Proportionen av Bu-1t- eller Th-1+- -celler i varje skikt beräknades som cytotoxicitetsindex 100 x 446 866 = 22 (a-b)/a, varvid a och b är procenthalter livskraftiga celler i komplementkontrollen resp. testpreparatet. Procenthalten inducera- de celler erhålles genom subtrahering av medelvärdena för kont- rollinkubationerna utan induceringsmedel (vanligtvis 1-3%) från medelvärdena för testinduktionerna.

Som ett resultat av denna karakterisering befanns pentapeptiderna enligt exemplen 22, 23 och 24 uppvisa följande procentuella induk- tioner av Th-1 (T-cell)-antigen hos kycklingsbenmärg.

Exemgel nr. % induktion 22 12 23 15 24 21 Uppfinningen har hittills beskrivits medelst belysande utförings- exempel. Det är emellertid uppenbart att man kan företaga olika variationer utan att överskrida uppfinningstanken.

Claims (4)

10 15 20 25 30 . 3. Sätt enligt krav 1, 446 866 to PäCêIlIKIaV

1. Sätt att framställa en aktiv polypeptid med förmåga att índucera dífferentieríng av både T-lynfocyter och komplement- receptor (CR+) B-lymfocyter, vilken polypeptíd uppvisar sek- e " vensen X-Y-Z-Gln-Lys där X är Tyr eller Ala. Y är Asn eller Ala och Z är Ile eller Ala. (l) förestríng av L-lysín. uppvisande skyddade anínogrupper, till en olöslíg hartspolymer medelst,kovalent bindning. k ä n n e t e c k n a d av följande steg: (2) avlägsnande av a-amíno~skyddsgruppen från L-lysin-delen. (3) reaktion med en a-amíno-skyddad L-glutanín för koppling av L-glutamínen till L-lysín-hartset. (4) avlägsnande av a-amíno-skyddsgruppen från L-glutamín- -delen. (5) reaktion med a-amíno-skyddad L-ísoleucin eller L-alanín för koppling av L-isoleucín eller L-alanín till L-glutamín-L- -lysin-hartset. (6) avlägsnande av a-amíno-skyddsgruppen och reaktion med en a-amino-skyddad L-asparagín eller L-alanín för koppling av L-asparagin eller L-alanin till L-ísoleucín- eller L-alanin-L- -glutamin-L-lysín-hartset. (7) avlägsnande av a~amíno-skyddsgruppen och reaktion med en a-amino-skyddad L-tyrosín eller L~alanin för koppling av L-tyrosín eller L-alanín till L-asparagin- eller L-alanin-L- -íso1eucin~ eller L-alanín-L-glutanin-L-lysín-narts. (8) avlägsnande av alla anino-skyddsgrupper från peptiden och (9) separeríng av polypeptíden från hartspolyneren.

2. Sätt enligt krav l. k ä n n e t e c k n a t av att reak- tíva sidokedjor hos de reagerande auinosyrorna skyddas undere reaktionen. k ä n n e t e c k n a t av att narts- polymeren väljes ur gruppen bestående av cellulosa. polyvínyl- _ 24 446 866 _» alkohol. polymetakrylat. sulfonerad polystyren och en klor- metylerad sampolymer av styren och divínylbensen.

3.

4. Sätt enligt krav 1. k ä n n e t e c k n a t av att poly- peptíden uppvisar sekvensen Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys.