DK164408B - Vaeksthormonfrigivende faktorforbindelser, forbindelserne til anvendelse som terapeutikum, fremgangsmaade til fremstilling af forbindelserne, farmaceutiske praeparater, der indeholder en effektiv maengde af en saadan forbindelse samt anvendelse af forbindelsen - Google Patents
Vaeksthormonfrigivende faktorforbindelser, forbindelserne til anvendelse som terapeutikum, fremgangsmaade til fremstilling af forbindelserne, farmaceutiske praeparater, der indeholder en effektiv maengde af en saadan forbindelse samt anvendelse af forbindelsen Download PDFInfo
- Publication number
- DK164408B DK164408B DK433485A DK433485A DK164408B DK 164408 B DK164408 B DK 164408B DK 433485 A DK433485 A DK 433485A DK 433485 A DK433485 A DK 433485A DK 164408 B DK164408 B DK 164408B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- ala
- grf
- leu
- arg
- gln
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims description 7
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title description 2
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 title 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 87
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 87
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 claims description 84
- 102000038461 Growth Hormone-Releasing Hormone Human genes 0.000 claims description 83
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 claims description 81
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 69
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 52
- KFGRVLINLVVMJA-MITYVQBRSA-N chembl440262 Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 KFGRVLINLVVMJA-MITYVQBRSA-N 0.000 claims description 45
- 108010056001 somatotropin releasing hormone (1-29) Proteins 0.000 claims description 44
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 28
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 24
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims description 20
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 17
- -1 B A compound Chemical class 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 6
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 claims description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 4
- GDFAOVXKHJXLEI-GSVOUGTGSA-N (2r)-2-(methylamino)propanoic acid Chemical compound CN[C@H](C)C(O)=O GDFAOVXKHJXLEI-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 3
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 claims description 2
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims 1
- 101000825742 Homo sapiens Somatoliberin Proteins 0.000 description 77
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 60
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 54
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 34
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 31
- MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(N)C1=CC=CC=C1 MGHPNCMVUAKAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 29
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 29
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 229910000040 hydrogen fluoride Inorganic materials 0.000 description 24
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 20
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 19
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 16
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 15
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 10
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- SHDMMLFAFLZUEV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1,1-diphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(NC)C1=CC=CC=C1 SHDMMLFAFLZUEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N (2s)-5-[amino-[(4-methylphenyl)sulfonylamino]methylidene]azaniumyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoate Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C=C1 WBIIPXYJAMICNU-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N Dimethyl sulfide Chemical compound CSC QMMFVYPAHWMCMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 5
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 4
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N p-cresol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1 IWDCLRJOBJJRNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000003068 pituitary dwarfism Diseases 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N alpha-mercaptoacetic acid Natural products OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 101000825768 Bos taurus Somatoliberin Proteins 0.000 description 2
- 125000000030 D-alanine group Chemical group [H]N([H])[C@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N N(alpha)-t-butoxycarbonyl-L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C MDXGYYOJGPFFJL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 101000868151 Rattus norvegicus Somatotropin Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013058 crude material Substances 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000012958 reprocessing Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XYLOFRFPOPXJOQ-UHFFFAOYSA-N 2-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-3-(piperazine-1-carbonyl)pyrazol-1-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound O=C(Cn1cc(c(n1)C(=O)N1CCNCC1)-c1cnc(NC2Cc3ccccc3C2)nc1)N1CCc2n[nH]nc2C1 XYLOFRFPOPXJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101000825744 Mus musculus Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710180316 Protease 2 Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- BLAKAEFIFWAFGH-UHFFFAOYSA-N acetyl acetate;pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1.CC(=O)OC(C)=O BLAKAEFIFWAFGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001164 bioregulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-M phloretate Chemical compound OC1=CC=C(CCC([O-])=O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- 238000013385 tryptic peptide mapping Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/12—Growth hormone, growth factor other than t-cell or b-cell growth factor, and growth hormone releasing factor; related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
i
DK 164408 B
Opfindelsen angår hidtil ukendte væksthormonfrigivende faktor(GRF)-forbindelser med den almene formel I, forbindelserne til anvendelse som terapeutikum, fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne, farmaceutiske præparater, der indeholder en effektiv mængde af en 5 sådan forbindelse samt anvendelse af forbindelsen til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af vækstrelaterede lidelser, der er karakteriserede ved væksthormondeficienser hos mennesker, eller til behandling af dyr for at fremme deres vækst.
Væksthormonfrigivende faktor (GRF) er for nylig blevet isoleret fra 10 human "islet"-celletumor og strukturelt karakteriseret af Dr. Guille-min og dennes medarbejdere ved Salk Institute (Science 218, 5. november 1982, s. 585-587). Selv om isoleringen og karakteriseringen af GRF er blevet forsøgt i flere årtier, har det hidtil været uden held som følge af forekomsten af GRF i meget små mængder. Human hypothala-15 musvæksthormon-frigivende faktor (hGRF) har nu vist sig at have samme struktur som GRF, der er isoleret fra "islet"-celletumor (Bohlen et al., Blochem. Biophys. Res. Comm. 114, 1983, s. 930-936).
Rivier et al., Nature 300, 1982, s. 276-278 og Guillemin et al.,
Science 218, 1982, s. 585-587, har beskrevet strukturen af henholds-20 vis GRF(l-40) og GRF(l-44) og påvist, at GRF er specifik for frigivelsen af væksthormon. Disse to former af GRF er identiske ved amino (NH2*)-terminalen, men er forskellige i afslutningspunktet for carboxy(COOH)-terminalen. GRF(l-44) er yderligere karakteriseret ved at have en amidgruppe ved carboxy terminal en. Ri vier et al. har på-25 vist, at den biologiske aktivitet af GRF forefindes i molekylets NH2-terminale del, og den fulde iboende aktivitet og styrke blev påvist med GRF(l-29)-NH2 vitro.
Lance et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 119, 1984, s. 265-272, har vist, at GRF(l-29)-NH2 med substitutioner af udvalgte aminosyrer i 30 stilling 1, 2 og 3 forårsager forøget frigivelse af væksthormon (GH) både hos svin og rotter in vivo. I USA-patentskrift nr. 4.518.586 beskrives forskellige syntestiske GRF-peptider, herunder substitutionen af D-Ala i stilling 15. Tilsvarende beskrives i USA-patentskrift nr. 4.528.190, der er udstedt den 9. juli 1985, forskellige GRF-ana-35 loge, herunder substitutionen af D-Ala i stilling 15.
DK 164408 B
2 I modsætning hertil er forbindelserne ifølge opfindelsen, når disse er substitueret med Ala i 15-stillingen, substitueret med L-Ala.
Vækst hos dyr reguleres formodentlig af en kaskade af bio-regulerende molekyler. Hypothalamus danner GRF, som inducerer hypofysens frigi-5 velse af væksthormon. Små mængder GRF har vist sig at forårsage betydelig frigivelse fra hypofysen af væksthormon i blodet. Således har GRF stor terapeutisk anvendelighed i de tilfælde, hvor væksthormon er indikeret. Fx kan GRF anvendes ved behandlingen af hypofysær dværgvækst, diabetes som følge af abnormaliteter i væksthormondannel-10 se, fremme af sårheling, behandling af brandsår og forhaling af ældningsprocessen. Tilsvarende er GRF anvendeligt inden for landbruget. Eksempler på landbrugsmæssig anvendelse omfatter forøget kødproduktion hos fjerkræ og dyr, der opdrættes til føde såsom svin, kvæg og lignende for at muliggøre tidligere markedsføring eller for 15 at frembringe større dyr inden for det samme fodringstidsrum eller for at forbedre forholdet mellem magert kød og fedt. GRF kan også stimulere mælkeproduktion hos malkekøer og ægproduktion hos høns.
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte peptider med den almene formel I
20 12 ® ^ R-R-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr- 3 154 20
Arg-R -Val-Leu-R -Gln-Leu-Ser-Ala-Arg- 1 25 5 ,
Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R -Ser-R -X
hvor R*· betegner Tyr, D-Tyr, desltt^-Tyr, Ac-Tyr eller His; R^ betegner Ala, D-Ala eller N-methyl-D-Ala; R^ betegner Lys eller 25 Ala; R^ betegner Ala, Leu, Val, Ile, Nle, Nval, β-kla eller α-Aminoisosmørsyre; R^ betegner Met, Leu, Nle eller Ile; R^ betegner en aminosyresekvens valgt fra Arg-Gln-Gln-Gly-Ser-Ans-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu og fragmenter deraf, hvor sekvensen er reduceret i antal med 1-15 aminosyrerester fra 30 carboxyenden, og X betegner enten OH eller NH2, og hvor alle aminosyrer er L-aminosyrer medmindre andet specifikt er angivet,
DK 164408 B
3 farmaceutisk acceptable syre- eller baseadditionssalte deraf og farmaceutiske præparater, som indeholder disse forbindelser.
Farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er kendetegnet ved at indeholde GRF-analoge ifølge krav 1 med fra niogtyve (29) op til 5 fireogfyrre (44) aminosyrerester og en ikke-toxisk, inert farmaceutisk eller veterinært acceptabelt flydende eller fast bærer. Sådanne farmaceutiske præparater kan anvendes inden for såvel human som veterinær klinisk medicin til administration til terapeutiske og/eller diagnostiske formål. De kan endvidere anvendes til at fremme 10 væksten af varm- og koldblodede dyr.
Peptiderne ifølge opfindelsen kan anvendes ved fremgangsmåder til stimulering af frigivelsen af væksthormon fra hypofysen til anvendelse i de ovennævnte behandlinger.
I nedenstående beskrivelse og krav betegner udtrykket "GRF" human-15 væksthormonf rigivende faktor, som er et polypeptid med aminosyresek- vens (Science 218, 5. november 1982, s. 585) 1 5 10 15 H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Giy·" 20 25 30
Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln- 35 40
Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH , 2 eller biologisk aktive fragmenter deraf med i det mindste de første 20 29 aminosyrer fra polypeptidet i fuld længde, og som udviser vækst- hormonfrigivende aktivitet. I overensstemmelse med sædvanlig praksis er den N-terminale aminogruppe vist til venstre, og den C-terminale carboxygruppe er vist til højre. "Aminosyre" betegner en af de naturligt forekommende aminosyrer, som typisk findes i proteiner, såsom 25 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys,
Met, Phe, Tyr, Pro, Trp og His. "Nle" betegner norleucin, og "Nval" betegner norvalin. Når aminosyreresten har isomere former, er amino-syrens L-form vist, medmindre andet specifikt er angivet. Suffikserne
DK 164408 B
4 "-OH" og "-NH2" efter "GRF" betegner henholdsvis de frie syre- og amidformer af polypeptidet. I tilfælde af, at ingen af suffikserne er anvendt, skal udtrykket omfatte begge former. GRF-analoge er vist ved at angive den substituerede aminosyre i parentes før "GRF"; dvs. fx 5 "(Ala^)GRF" betegner et polypeptid med en aminosyresekvens, der svarer til GRF, hvor glycin i stilling 15 er blevet substitueret med en alaninrest. Tal i parentes efter "GRF" betegner fragmenter af polypeptidet i fuld længde ved at angive amino syreres ternes positionstal, fx betegner GRF(l-29) et fragment, der har de første 29 10 aminosyrer af hele sekvensen.
Den foreliggende opfindelse er baseret på den erkendelse, at glycin-resten i stilling 15 af GRF-molekylet kan erstattes med en anden, hensigtsmæssigt udvalgt aminosyre, som danner en GRF-analog med forøget biologisk styrke ved at stimulere frigivelsen af væksthormon 15 fra hypofysen. Aminosyrer, der er indsat i stilling 15, kan vælges blandt hydrofobe aminosyrer såsom Ala, Leu, Val, Ile, Nle og Nval. a-Aminoisosmørsyre (α-Aib) og ^-Alanin (/3-Ala) kan også indsættes i stilling 15. GRF-analoge, hvor de hydrofobe aminosyrer såsom alanin, valin eller leucin er indsat i stilling 15, har især vist sig at have 20 forøget biologisk aktivitet ved at bevirke frigivelse af væksthormon fra hypofysen.
Der kan anvendes forskellige velkendte metoder til udvælgelse af en bestemt aminosyre til indsætning i GRF i en bestemt stilling. En sådan metode er at udvælge en erstatningsaminosyre således, at det 25 resulterende polypeptids sekundære struktur modificeres eller dets amphifile karakter ændres som vist ved helicitets- og hydropatheci-tetsanalyse, og endvidere reducerer den lethedsgrad, med hvilken det resulterende polypeptid nedbrydes proteolytisk. Helicitets- og hydro-pathecitetsanalyser udføres ved velkendte sædvanlige metoder. 1 2 3 4 5 6
Yderligere erstatninger med hensigtsmæssigt udvalgte aminosyrer i 2 stilling 15 i GRF-fragmenter med varierende længde fra ca. 29 amino 3 syrer til mindre end 44 aminosyrer har også vist sig at have forøget 4 biologisk aktivitet ved at forøge GH-frigivelse fra hypofysen. Især 5 har erstatning med hensigtsmæssigt udvalgte aminosyrer i stilling 15 6 i GRF(l-29) vist sig at have forøget biologisk aktivitet.
DK 164408B
5
Yderligere erstatninger med hensigtsmæssigt udvalgte aminosyrer i andre udvalgte stillinger i GRF-molekylet samtidig med erstatningen i 15-stillingen, hvorved fås en multierstattet GRF-analog, gav peptider med biologisk styrke ved at bevirke frigivelse af GH fra hypofysen.
5 Udvalgte stillinger af GRF-peptidet til en anden erstatning omfatter, men er ikke begrænset til, 1-, 2-, 12- eller 27-stillingen. Udvalgte aminosyrer til indsætning i hensigtsmæssigt udvalgte stillinger omfatter tyrosin, desNH2-tyrosin, Ac-tyrosin, histidin, lysin, alanin, /?-alanin og D-aminosyrer af de beskrevne aminosyrer. Erstatninger i 10 hver af de udvalgte stillinger udover erstatningen i 15-stillingen kan give et disubstitueret, trisubstitueret eller tetrasubstitueret polypeptid.
Udover erstatningen i 15-stillingen har syren eller amidet af GRF i fuld længde (1-44), det 29 aminosyrer lange GRF(l-29) eller en GRF, 15 som er større end ca. 29 aminosyrer og mindre end ca. 44 aminosyrer i længde, vist sig at have en forøget biologisk aktivitet. Især GRF(l-44)- og GRF(1-29)-syren og amidet, hvor en hensigtsmæssigt udvalgt aminosyre er indsat i 15-stillingen, vist sig at have forøget biologisk aktivitet.
20 Repræsentative forbindelser ifølge opfindelsen omfatter: [Ala15]GRF(l-29)-NH2 [Ala12, Ala15]GRF(l-29)-NH2 [Leu15]GRF(l-29)-NH2 [Val15]GRF(l-29)-NH2 25 [D-Ala2, Ala15]GRF(l-29)-NH2 [/8-Ala15]GRF(l-29)-NH2 [a-Aib15]GRF(l-29)-NH2
[Ala15]GRF(l-29)-OH [Leu15]GRF(l-29)-OH 30 [Val15]GRF(l-29)-OH
[Ala15]GRF(l-44)-NH2 [Leu15]GRF(l-44)-NH2 [Val15]GRF(l-44)-NH2
DK 164408 B
6 [desNH2-Tyr1, Ala15]GRF(l-29)-NH2 [D-Tyr1, Ala15]GRF(l-29)-NH2 [Ac-Tyr1, Ala15]GRF(i-29)-NH2
Selv om de beskrevne modifikationer er fra den sekvens, som omfatter 5 humanvæksthormonafgivende faktor (hGRF), kan tilsvarende modifikatio ner foretages med porcinvæksthormonafgivende faktor (pGRF), bovin-vaeksthormonafgivende faktor (bGRF), ovinvæksthormonafgivende faktor (oGRF) og caprinvæksthormonaf givende faktor (cGRF).
Polypeptidet ifølge opfindelsen kan fremstilles i henhold til vel-10 kendte metoder, dvs. ved fastfasepeptidsynteseteknikker, opløstfase-peptidsyntese eller rekombinante DNA-metoder. Den for nylig udviklede rekombinante DNA-teknik kan anvendes til at fremstille analoge, der kun indeholder de "almindelige" aminosyrerester, eller til at fremstille den del af en analog, der kun indeholder de "almindelige" 15 aminosyrerester, som derefter kan kobles til et kort N-terminalpeptid.
Peptider kan fremstilles ved fastfasesyntese, således som det er beskrevet af Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 1963, s. 2149, selv om der kan anvendes andre ækvivalente kemiske synteser, som er kendte 20 for fagfolk. Fastfasesyntese påbegyndes fra peptidets C-terminale ende ved kobling af en beskyttet aminosyre til en hensigtsmæssig harpiks. Der kan fremstilles et udgangsmateriale ved at fastgøre en aminobeskyttet aminosyre via en benzylesterbinding til en chlormethy-leret harpiks eller en hydroxymethylharpiks eller via en amidbinding 25 til en benzhydrylamin (BHA)-harpiks eller methylbenzhydrylamin (MBHA)-harpiks. Harpikserne er kommercielt tilgængelige, og fremstillingen deraf er kendt for fagfolk.
Syreformen af de hidtil ukendte analoge kan fremstilles ved fast-fasepeptidsyntesemetoden under anvendelse af en benzylesterharpiks 30 som fast bærer. Polypeptidet kan oprenses til homogenitet ved præparativ høj tryksvæskechromatografi (HPLC) og påvises derefter at være homogent ved to analytiske HPLC-systerner, isoelektrisk fokusering og høj spændings-tyndtlagselektrophorese. Der kan foretages amino syreanalyse for at bekræfte den forventede aminosyresammensæt-
DK 164408 B
7 ning. De tilsvarende amider kan fremstilles under anvendelse af benzhydrylamin- eller methylbenzhydrylamiriharpiks som det faste underlag til fastfasepeptidsyntese. Fagfolk vil forstå, at når der anvendes BHA- eller MBHA-harpiks, medfører behandlingen med vandfrit 5 HF til fjernelse af polypeptidet fra det faste underlag et polypeptid med en terminalamidgruppe.
En C-terminalaminosyre, fx Arg, beskyttes i Na-amino- og sidekædede guanidino stillingerne med hensigtsmæssigt udvalgte beskyttelsesgrupper, fx med henholdsvis t-butyloxycarbonyl (Boc) og p-toluensulfonyl 10 (Tos). Derefter kan Boc-Arg(Tos)-OH kobles til benzhydrylaminharpiks under anvendelse af dicyclohexylcarbodiimid (DCG) ved ca. 25°C i 2 timer under omrøring. Efter kobling af den med Boc beskyttede aminosyre til harpiksunderlaget fjernes α-aminobeskyttelsesgruppen under anvendelse af trifluoreddikesyre (TFA) i methylenchlorid eller TFA 15 alene. Afbeskyttelsen foretages ved en temperatur mellem ca. 0eC og stuetemperatur.
Efter fjernelse af α-aminobeskyttelsesgruppen fra den til harpiksunderlaget bundne aminosyre kobles de andre Boc-beskyttede aminosyrer trinvis i den ønskede rækkefølge. I stedet for at tilsætte hver 20 aminosyre for sig kan to eller flere aminosyrer kobles sammen på en hensigtsmæssig måde, før de sættes til fastfasesyntheseapparatet. Hensigtsmæssige koblingsreagenser er kendte for fagfolk; DCC er særlig velegnet.
Hver beskyttet aminosyre eller aminosyresekvens indføres i fastfase-25 syntheseapparatet i et overskud, og koblingen kan udføres i et medium af dimethylformamid (DMF) eller methylenchlorid (CH2CI2) eller blandinger deraf. I tilfælde, hvor der forekommer utilstrækkelig kobling, gentages koblingsproceduren før fjernelse af N“-aminobeskyttelses-gruppen før koblingen af næste aminosyre. Den heldige udførelse af 30 koblingsreaktionen i hvert syntesetrin kan overvåges. En foretrukken metode til overvågning af syntesen er ninhydrinreaktionen. Koblingsreaktionerne kan udføres automatisk, fx på en Vega 250 Peptide Synthesizer.
DK 164408 B
8
Spaltning af det færdige peptid fra harpiksen kan udføres under anvendelse af metoder, der er velkendte inden for peptidkemien, fortrinsvis under anvendelse af vandfrit flydende hydrogenfluorid (HF) . Omsætningen med hydrogenfluorid i nærværelse af p-cresol og dimethyl-5 sulfid ved 0°C il time kan efterfølges af en anden reaktion med hydrogenfluorid i nærværelse af p-cresol i 2 timer ved 0eC.
Den foreliggende opfindelse angår således også en fremgangsmåde til fremstilling af de væksthormon frigivende faktor (GFR)-forbindelser med den almene formel I som defineret ovenfor og farmaceutisk accept-10 able syre- eller baseadditionssalte deraf. Denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at a) beskyttelsesgrupperne på et hensigtsmæssigt beskyttet polypeptid med tilsvarende aminosyresekvens, hvilket polypeptid er blevet syntetiseret ved opløsningsfasepeptidsyntese, fraspaltes ved sædvanlige 15 metoder, eller b) et hensigtsmæssigt s idekæde-beskyttet harpiksbundet polypeptid med tilsvarende aminosyresekvens, hvilket polypeptid er blevet syntetiseret ved fastfasepeptidsyntese, omsættes med vandfrit flydende HF, 20 og den vundne forbindelse med den almene formel I om ønsket omdannes til et farmaceutisk acceptabelt syre- eller baseadditionssalt.
Oprensning af polypeptiderne ifølge opfindelsen kan udføres under anvendelse af metoder, som er velkendte inden for peptidkemien. Som angivet ovenfor kan de her omhandlede polypeptider oprenses under 25 anvendelse af præparativ HPLG; imidlertid kan der også anvendes andre kendte chromatografiske metoder såsom gelpermations-, ionbytnings- og fordelingschromatografi eller modstrømsfordeling.
Polypeptiderne ifølge opfindelsen har væksthormonfrigivende aktivitet. Farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen indeholder en GRF-30 analog med den almene formel I eller et ikke-toxisk salt af en sådan forbindelse dispergeret i en farmaceutisk eller veterinært acceptabel flydende eller fast bærer. Sådanne farmaceutiske præparater kan an-
DK 164408 B
9 vendes til terapeutiske eller diagnostiske formål inden for såvel human som veterinær klinisk medicin. Fx kan de anvendes til behandling af vækstrelaterede lidelser såsom hypofysær dværgvækst og diabetes, der er en følge af abnormalitet i væksthormondannelse. De kan 5 endvidere også anvendes til at stimulere væksten eller forøge foderudnyttelsen hos dyr, der opdrættes til kødproduktion, forøge mælkeproduktionen og stimulere ægproduktionen.
Hensigtsmæssige doser af polypeptideme ifølge opfindelsen, der skal administreres, varierer noget afhængigt af den enkelte patient og den 10 lidelse, som skal behandles. Fagfolk vil være i stand til at bestemme hensigtsmæssige doser baseret på de kendte cirkulationsniveauer af væksthormon, som er forbundet med normal vækst, og polypeptidets væksthormonfrigivende aktivitet.
Forbindelser ifølge opfindelsen inducerede en frigivelse af væksthor-15 mon in vitro, der var fem (5) gange større end GRF i (1-44). Disse analoge kan derfor administreres i væsentligt mindre doser, end hvis den væksthormonfrigivende faktor blev indgivet til samme formål. Det er velkendt inden for teknikken, at behandling af vækstrelaterede lidelser nødvendiggør varierende doser fra individ til individ af-20 hængig af graden af utilstrækkelig væksthormondannelse. Generelt kan der anvendes et dosisområde på fra 0,04 /zg/kg/dag til ca. 1,0 /zg/kg/-dag baseret på patientens legemsvægt til stimulation af frigivelsen af væksthormon. De doser, der anvendes til at stimulere vækstaktivitet hos husdyr, vil være væsentligt højere (pr. kilo legemsvægt) end 25 de doser, der anvendes til at genvinde normalvækst i tilfælde af væksthormondeficiens såsom hypofysær dværgvækst hos mennesker. Til husdyr kan der generelt anvendes en dosis i området fra ca. 0,4 /zg/kg/dag til ca. 10 /zg/kg/dag subcutant til stimulation af frigivelsen af væksthormon fra hypofysen. 1 2 3 4 5 6
Ifølge opfindelsen er der således tilvejebragt forbindelser med 2 formlen I til brug som terapeutikum samt anvendelse af forbindelserne 3 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af 4 vækstrelaterede lidelser, der er karakteriserede ved utilstrækkelig 5 dannelse af væksthormon. Den terapeutiske anvendelse omfatter admini- 6 stration af en mængde af anologene ifølge opfindelsen, der er til-
DK 164408 B
10 strækkelig til at stimulere dannelsen af væksthormon i niveauer, der er forbundet med normal vækst.
Normale niveauer af væksthormon kan variere betydeligt fra individ til individ, og for et hvilket som helst givet individ varierer 5 niveauerne af cirkulerende væksthormon betydeligt i løbet af dagen.
Hos voksne mennesker er normale serumniveauer af væksthormon blevet beskrevet til at variere fra ca. 0-10 nanogram/ml. Hos børn er normale serumniveauer af væksthormon blevet beskrevet at variere fra ca.
0-20 nanogram/ml.
10 For at behandle hypofysær dværgvækst effektivt med de beskrevne analoge, administreres behandling i den normale vækstperiode. Hos piger strækker denne periode sig generelt ikke langt ud over menstruationens begyndelse. Således bør behandlingen af piger udføres i alderen ca. 12-16 år afhængig af individet. Hos drenge kan stimulationen af 15 vækst fortsætte i et betydeligt længere tidsrum udover puberteten.
Således vil effektiv behandling af drenge normalt være mulig op til ca. 18-19 år og i visse individuelle tilfælde op til ca. 25 år.
Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til forøgelse af dyrs væksthastighed ved administration af en mængde af analogen, der er til-20 strækkelig til at stimulere dannelsen af væksthormon i et niveau, som er højere end det, der er forbundet med normal vækst.
Polypeptiderne ifølge opfindelsen kan administreres i form af humane eller veterinære farmaceutiske præparater, der kan fremstilles ved sædvanlige farmaceutiske formuleringsteknikker. Der kan anvendes 25 præparater, som egner sig til oral, intravenøs, subcutan, intramusku-lær, intraperitoneal eller intranasal administration. En hensigtsmæssig dosisform til farmaceutisk anvendelse er fra ca. 0,01 til ca.
0,5 mg af en forbindelse ifølge opfindelsen, der kan lyofiliseres til rekonstitution med sterilt vand eller saltopløsning. Præparatet bør 30 holdes ved en pH under ca. 8,0 for at bevare analogens stabilitet. Serumalbumin fra den art, der behandles (fx human serumalbumin i tilfælde af mennesker, bovinserumalbumin i tilfælde af køer osv.), kan også være til stede sammen med andre kendte farmaceutiske adju-vanser.
DK 164408 B
11
Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.
I eksemplerne blev der anvendt optisk aktive beskyttede aminosyrer i L-konfiguration, medmindre andet specifikt er angivet. De beskyttede aminosyrer blev undersøgt ved tyndtlagschromatografi på silicagel 5 G-plader og elueret med chlor/Ν,Ν,Ν' ,N'-tetramethyl-4,4'-diamino-diphenylmethan (TDM). Smeltepunkter blev bestemt på et Thomas-Ho-over-apparat (ukorrigeret), og optisk rotation blev målt i en med kappe forsynet 10-centimeters celle på en Perkin-Elmer model 141 polarimeter og bragt i overensstemmelse med de accepterede værdier.
10 Aminosyreanalyse blev udført på et Waters aminosyreanalyseapparat.
I eksemplerne anvendes følgende forkortelser til at betegne forskellige beskyttelsesgrupper og reagenser: BOC - t-butyloxycarbonyl Z - benzyloxycarbonyl 15 2C1Z = 2-chlorbenzyloxycarbonyl
Bzl = benzyl 2,6-Cl2-Bzl - 2,6-dichlorbenzyl
Tos — p-toluensulfonyl DCC « dicyclohexylcarbodiimid 20 BHA =* benzhydrylamin DMF - dimethylformamid TFA - trifluoreddikesyre TGA - thioglycolsyre
Analogene ifølge opfindelsen blev fremstillet ved sekventiel kobling 25 af aminosyrer under anvendelse af en kommercielt tilgængelig automatiseret fastfasepeptidsynthesizer (Vega 250 Peptide Synthesizer). l^-Boc-aminosyrer blev anvendt i syntesen.
Trifunktionelle aminosyrer blev beskyttet som I^-Boc-LysiZClZ), I^-Boc-AspCOBzl), i^-Boc-GluiOBzl), I^-Boc-SeriBzl), l^-Boc-ThriBzl), 30 Na-Boc-Tyr(2,6-Cl2- Bzl) og P^-Boc-ArgiTos).
Fremstilling af Boc-Arg(Tos) -benzhydrylamin-harpiks
DK 164408 B
EKSEMPEL 1 12 40,44 g BHA-harpiks, (0,5 mmol/g, 20,22 mmol) blev koblet med 34,6 g Boc-Arg-(Tos)-OH (80,7 mmol) i 250 ml 25%'s DMF-CH2C12 med 16,78 g 5 DCC (81,4 mmol) i 2 timer efterfulgt af tilsætning af 1%'s diisopro-pylethylamin og omsætning i yderligere 0,5 time. Den resulterende Boc-Arg(Tos)-BHA-harpiks blev vasket med 3 x 250 ml CH2C12, 3 x 250 ml MeOH, 3 x 250 ml CH2C12 og tørret. Koblings- og vaskeprocedurerne blev gentaget, og en portion blev hydrolyseret (1 ml 6M propions-10 yre/HCl ved 130®C i 2 timer). Aminosyreanalyse viste en substitution af 0,35 mmol Arg pr. gram harpiks. De resterende aminogrupper blev acetyleret med Ac20-pyridin. Udbytte: 48,88 g.
EKSEMPEL 2
Fremstilling af [Ala^]-hGRF(l-29)-BHA-harpiks 15 15,0 g Boc-Arg(Tos)-BHA-harpiks (5,25 mmol) som fremstillet i eksem pel 1 blev anbragt i reaktionsbeholderen af en Vega 250 Peptide Synthesizer, og fastfasesyntese blev udført ved den symmetriske anhy-dridprocedure i ialt 6 cycler, hvilket gav 21,74 g hGRF(23-29)-BHA-harpiks. En portion på 2,5 g (0,60 mmol) blev fjernet og underkastet 20 yderligere 10 cycler fastfasesyntese, hvilket gav 2,61 g hGRF(13-29)--BHA-harpiks. En portion på 1,3 g (0,30 mmol) blev underkastet fastfasesyntese i de resterende 12 cycler. Ved afslutningen af syntesen blev Boc-gruppen på den N-terminale aminosyrerest fjernet (TFA), og peptid-harpiksen, [Ala^^]hGRF(l-29)-BHA-harpiks, blev tørret, hvilket 25 gav 1,66 g.
DK 164408 B
EKSEMPEL 3 13
Fremstilling, oprensning og karakterisering af [Ala^]hGRF(l-29)-NH2
Den i eksempel 2 fremstillede [Ala^]hGRF(l-29)-BHA-harpiks (1,66 g) blev behandlet med vandfrit flydende HF under anvendelse af de af Tam 5 et al., Tetrahedron Lett. 23, 1982, s. 2939-2942, beskrevne modificerede betingelser, 10%'s p-cresol, 65%'s dimethylsulfid og 25%'s HF (total volumen: 20 ml) ved 0“C i 1 time og inddampet. Dette blev efterfulgt af en anden reaktion med 10%'s p-cresol og 90%'s HF (total volumen: 20 ml) ved 0°C i 2 timer. HF blev inddampet ved 0eC, og den 10 rå peptid- og harpiksblanding blev tritureret med EtOAc, ekstraheret med TFA og inddampet, og remanensen blev tritureret med ether og tørret. Råmaterialet (1,01 g) blev opløst i 10 ml vand (indeholdende 0,5% TFA), filtreret (0,45 μ type HA Millipore-filter) og anbragt på en Whatman Partisil M-20 0DS-3-søjle (2 x 50 cm). Søjlen blev elueret 15 (6 ml/min.) med et opløsningsmiddelsystem bestående af CH3CN (inde holdende 0,25% TFA) og vand (indeholdende 0,5% TFA) i en lineær gradientmetode fra 10 til 32% CH3CN i 120 minutter og holdt ved 32% i yderligere 60 minutter. Søjlen blev derefter elueret med en lineær gradient fra 32% CH3CN (0,25% TFA)-H20 (0,5% TFA) til 38% CH3CN 20 (0,25% TFA)-H20 (0,5% TFA) i 90 minutter. Flowhastigheden blev holdt ved 6 ml/min., fraktioner blev indsamlet (2 min./fraktion), og prøver blev analyseret ved analytisk HPLC. Produktet kom frem i fraktioner 136-140 (252-270 min), hvilke fraktioner blev kombineret, inddampet og lyofiliseret, hvilket gav rent [Ala^]GRF(l-29)-NH2, udbytte: 71,3 25 mg (7,05%). Fraktioner før og efter det centrale skæringspunkt blev kombineret, inddampet og lyofiliseret, hvilket gav 53 mg halvrent produkt, som ikke blev oparbejdet yderligere.
Produktet viste sig at være homogent ved analytisk HPLC og høj spændings -tyndtlagselektrophorese (R^rg>= 0,33). Tryptisk peptidkortlæg-30 ning med analytisk HPLC svarede til kortlægningen af GRF(l-29)-NH2 med en smule forskellige retentionstider for de tryptiske fragmenter, der omfattede resterne 12-20 og 13-20 som forventet. Aminosyreanalyse (6N HC1 indeholdende 1% thioglycolsyre, 110°C, 24 timer): Asp, 3,30;
Thr, 1,07; Ser, 2,85; Glu, 2,10; Ala, 3,82; Val, 0,90; Met, 0,98; 35 Ile, 1,87; Leu, 4,11; Tyr, 1,97;; Phe, 0,90; Lys, 2,02; Arg, 3,12.
Fremstilling af [Ala^»15]hGRF(l-29)-BHA-harpiks EKSEMPEL 4
DK 164408 B
14
Den i eksempel 1 fremstillede Boc-Arg(Tos)-BHA-harpiks (5 g, 1,75 mmol) blev underkastet 4 cycler af fastfasepeptidsyntese (som i ek-5 sempel 2), hvilket gav 6,1 g beskyttet hGRF(25-29)-BHA-harpiks. En portion på 2 g blev fjernet og underkastet yderligere 24 cycler fastfasesyntese. Boc-gruppen på den N-terminale aminosyrerest blev fjernet (TFA), og den sidekade-beskyttede peptidharpiks [Ala^.15]. hGRF(1-29)-BHA-harpiks blev tørret, hvilket gav 2,34 g.
10 EKSEMPEL 5
Fremstilling, oprensning og karakterisering af [Ala^>15]hGRF- (1-29)-NH2
Den i eksempel 4 fremstillede [Ala^>^]hGRF(l-29)-BHA-harpiks (2,34 g) blev behandlet med vandfrit flydende HF (som i eksempel 3), og der 15 vandtes 1,15 g rå [Ala^’^]hGRF(l-29)-NH2. Råproduktet blev underkastet HPLC-oprensning (som i eksempel 3), og det ønskede produkt fremkom i fraktioner 138-141, som blev kombineret, inddampet og lyofiliseret; udbytte: 56 mg [Ala^’^]hGRF(l-29) -NH2, der viste sig at være homogen ved analytisk HPLC. Aminosyresammensætning (hydrolyse 20 i 6N HCl-thioglycolsyre, 110°C, 24 timer): Asp, 3,18; Thr, 0,99; Ser, 2,81; Glu, 2,17; Ala, 5,18; Val, 0,92; Met, 1,05; Ile, 1,92; Leu, 4,27; Tyr, 2,07; Phe, 0,92; Lys, 1,04; Arg, 3,20.
EKSEMPEL 6
Fremstilling af [Leu^]hGRF(l-29) -NH2 25 De resterende 4,1 g hGRF(25-29)-BHA-harpiks fra eksempel 4 blev underkastet 9 cycler fastfasepeptidsyntese, hvilket gav 6,0 g (1,14 mmol) beskyttet hGRF(16-29)-BHA-harpiks. En portion (1,5 g, 0,28 mmol) blev yderligere underkastet 15 cycler fastfasesyntese, behand-
DK 164408 B
15 let med TFA og tørret, hvilket gav 0,98 g rå sidekæde-beskyttet [Leu^]hGRF(l-29)-BHA-harpiks. Efter HF-spaltning (som i eksempel 3) og efterfølgende oparbejdning vandtes 536 mg rå [Leu^]hGRF-(1-29)-1¾¾. En 200 mg portion af dette materiale blev opløst i 10 ml 5 0,025% TFA (H2O), filtreret og anbragt på dobbelte (i serier) Syn- chropak-søjler (RP-P, 1 x 25 cm), og søjlerne blev elueret (2 ml/-min.) med et opløsningsmiddelsystem bestående af CH3CN (indeholdende 0,025% TFA) og vand (indeholdende 0,025% TFA) i en lineær gradient fra 25 til 40% CH3CN i 120 minutter. Fraktioner (2 min/fraktion) blev 10 indsamlet, og alikvoter analyseret i HPLC. Det ønskede produkt fremkom i fraktioner 24-26, der blev kombineret, inddampet og lyofili-seret; udbytte: 9,9 mg. Produktet, [Leu^]hGRF(l-29)-1¾¾, viste sig at være homogent ved analytisk HPLC. Aminosyresammensætning (hydrolyse i 6N HC1-TGA, 110°C, 24 timer): Asp, 3,10; Thr, 0,96; Ser, 2,82; 15 Glu, 2,09; Ala, 3,10; Val, 0,99; Met, 1,02; Ile, 1,91; Leu, 5,19;
Tyr, 1,93; Phe, 0,92; Lys, 1,98; Arg, 3,07.
EKSEMPEL 7
Fremstiling af [Val15]hGRF(l-29)-NH2
Den i eksempel 6 fremstillede beskyttede hGRF(16-29)-BHA-harpiks (1,5 20 g, 0,28 mmol) blev underkastet 15 cycler fastfasepeptidsyntese, behandlet med TFA og tørret, hvilket gav 1,3 g sidekædet beskyttet [ Val·^ ]hGRF( 1 -29) -BHA-harpiks. Spaltning med vandfrit HF (som i eksempel 3) og efterfølgende oparbejdning gav 625 mg [Val^]hGRF(l-29)--NH2. En portion på 200 mg blev underkastet HPLC-oprensning (som i 25 eksempel 6), og der vandtes 7,0 mg oprenset [Val^]hGRF(l-29)-NH2.
Produktet viste sig at være homogent ved analytisk HPLC. Aminosyresammensætning (hydrolyse i 6N HCl-TGA, 110eC, 24 timer): Asp, 2,99;
Thr, 0,97; Ser, 2,78; Glu, 2,09; Ala, 3,07; Val, 1,98; Met, 0,97;
Ile, 1,93; Leu, 4,16; Tyr, 2,02; Phe, 0,96; Lys, 1,99; Arg, 3,08.
Fremstilling af [D-Ala2, Ala^]hGRF(l-29) -NH2
DK 164408 B
EKSEMPEL 8 16
Den i eksempel 6 fremstillede beskyttede hGRF(16-29) -BHA-harpiks (3 g, 0,57 mmol) blev underkastet 13 cycler fastfasepeptidsyntese, 5 hvilket gav 3,6 g beskyttet [Ala1-5JhGRF(3-29)-BHA-harpiks. En portion på 1 g (0,16 mmol) blev underkastet 2 cycler fastfasesyntese og behandlet med TFA, hvilket gav 1,02 g [D-Ala2, Ala1·5]hGRF( 1-29)-BHA-harpiks. Spaltning fra harpiksen med vandfrit HF som beskrevet i eksempel 3 og efterfølgenden oparbejdning gav 575 mg råt [D-Ala2, 10 Ala15]hGRF(l-29)-NH2.
En portion på 200 mg blev underkastet HPLC-oprensning (som i eksempel 6), og der vandtes 18,3 mg oprenset [D-Ala2, Ala1-5]hGRF(l-29)-NH2.
Produktet viste sig at være homogent ved analytisk HPLC. Aminosyre -sammensætning (hydrolyse i 6N HC1-TGA, 110eC, 24 timer): Asp, 3,05; 15 Thr, 0,93; Ser, 2,57; Glu, 2,04; Ala, 4,27; Val, 0,99; Met, 0,98;
Ile, 1,93; Leu, 4,16; Tyr, 1,98; Phe, 0,97; Lys, 2,00; Arg, 3,08.
EKSEMPEL 9
Fremstilling af [Ala1-5]hGRF(l-29) -harpiks 3,0 g Boc-Arg(Tos)-harpiks (Bachem, 0,615 mmol) blev anbragt i reak-20 tionsbeholderen på en Vega 1000 Peptide Synthesizer, og der udførtes fastfasepeptidsyntese ved den symmetriske anhydridprocedure i ialt 13 cycler, hvilket gav hGRF(16-29)-harpiks (4,4 g). En portion på 1 g (0,13 mmol) blev underkastet yderligere 15 cycler fastfasesyntese.
Ved afslutningen af syntesen blev Boc-gruppen på den N-terminale 25 aminosyrerest (TFA) fjernet, og peptid-harpiksen, [Ala1-5]hGRF(l-29)-harpiks, blev tørret, hvilket gav 1,66 g.
DK 164408 B
EKSEMPEL 10 17
Fremstilling, oprensning og karakterisering af [Ala^^]hGRF(l-29)-OH
Den i eksempel 9 fremstillede [Ala^]hGRF(l-29)-harpiks (1,66 g) blev behandlet med vandfrit HF som i eksempel 3, og der vandtes 262 mg rå 5 [Ala^-^]hGRF(l-29)-OH. Råmaterialet blev opløst i 4 ml 0,1%'s TFA
(H2O), filtreret og anbragt på en Nucleosil Cl8-søjle (1 x 50 cm).
Søjlen blev elueret (3 ml/min.) med et opløsningsmiddelsystem bestående af CH3CN (indeholdende 0,1% TFA) og vand (indeholdende 0,1% TFA) i en lineær gradient fra 20 til 40% CH3CN i 180 minutter. Frak-10 tioner (2 min.) blev indsamlet og analyseret i HPLC. Det ønskede produkt fremkom i fraktion 76 og blev inddampet og lyofiliseret; udbytte: 2,4 mg [Ala^]hGRF(l-29)-OH, der viste sig at være homogent ved analytisk HPLC. Aminosyreanalyse (hydrolyse i 6N HC1-thioglycolsyre, 110eC, 24 timer og 72 timer): Asp, 2,98; Thr, 0,97; Ser, 2,88; Glu, 15 2,15; Leu, 3,85; Tyr, 1,93; Arg, 2,95; Ala, 4,17; Val, 0,99; Met, 1,04; Ile, 1,91; Phe, 0,86; Lys, 2,02.
EKSEMPEL 11
Fremstilling af [Leu15]hGRF(l-29)-OH
En portion på 1 g hGRF(16-29)-harpiks (fra eksempel 9) blev underkas-20 tet yderligere 15 cycler fastfasesyntese som i eksempel 9. Udbytte: 1,16 g sidekæde-beskyttet [Leu^]hGRF(l-29) -harpiks. Efter spaltning af vandfrit HF (som i eksempel 3) og efterfølgende oparbejdning vandtes 388 mg rå [Leu^]hGRF(l-29)-OH. Oprensning ved HPLC som i eksempel 10 gav 4,4 mg halvrent [Leu^5]hGRF(l-29)-OH, der blev under-25 kastet yderligere oprensning som i eksempel 6. Det ønskede produkt fremkom i fraktioner 40-42; udbytte: 0,9 mg [Leu^]hGRF(l-29)-OH.
Produktet viste sig at være homogent ved analytisk HPLC. Aminosyre-analyse (hydrolyse i 6N HC1-TGA, 110DC, 24 timer og 72 timer): Asp, 3,06; Thr, 0,94; Ser, 2,95; Glu, 2,11; Ala, 3,05; Val, 0,99; Met, 30 0,94; Leu, 5,15; Tyr, 1,81; Arg, 3,02; Ile, 2,06; Phe, 0,85; Lys, 2,02.
EKSEMPEL 12
Fremstilling af [Val^]hGRF(l-29)-OH
DK 164408 B
18
En portion på 1 g hGRF(16-29)-harpiks (fra eksempel 9) blev underkastet yderligere 15 cycler fastfasepeptidsyntese som i eksempel 9. Ud-5 bytte: 1,30 g s idekæde-beskyttet [Val^]hGRF(l-29) -harpiks. Efter spaltning fra harpiksen med vandfrit flydende HF (som i eksempel 3) og oparbejdning vandtes 158 mg rå [Val^]hGRF(l-29)-OH. Oprensning som i eksempel 6 gav 4,6 mg halvoprenset produkt. Dette materiale blev yderligere oprenset som beskrevet i eksempel 10. Produktet, der 10 fremkom i fraktion 78 blev inddampet og lyofiliseret; udbytte: 1,8 mg [Val^]hGRF(l-29)-OH. Produktet viste sig at være homogent ved analytisk HPLC. Aminosyreanalyse (hydrolyse i 6N HC1-TGA, 110eC, 72 timer): Asp, 2,92; Glu, 2,00; Ala, 2,91; Val, 2,03; Met, 0,98; Phe, 0,87; Lys, 2,13; Leu, 4,14; Arg, 3,08 (hydrolyse i 6N HC1-TGA, 150eC, 15 1 time): Ile, 1,93; Tyr, 1,91.
EKSEMPEL 13
Syntese af Boc-Leu-MBHA-harpiks
Boc-Leu-MBHA-harpiks blev fremstillet ved kobling af Boc-Leu-0H
i (17,68 g, 83 mmol) til 70 g methylbenzhydrylaminharpiks (0,28 mækv/g) 20 som beskrevet i eksempel 1; udbytte: 72,87 g. Aminosyreanalyse viste en substitution af 0,23 mmol/g-harpiks.
EKSEMPEL 14
Fremstilling af [Ala^hGRFil·^) -MBHA-harpiks
Den i eksempel 13 fremstillede Boc-Leu-BHA-harpiks (78,87 g, 18,1 25 mmol) blev anbragt i reaktionsbeholderen på en Vega 296 Peptide Synthesizer, og fastfasesyntese blev udført i ialt 16 cycler, hvilket gav 37,65 g hGRF(28-44)-MBHA-harpiks. En portion på 5 g (0,75 mmol) blev fjernet og underkastet yderligere 12 cycler fastfasesyntese,
DK 164408 B
19 hvilket gav 5,15 g hGRF(28-44)-MBHA-harpiks. En portion på 1,7 g af dette materiale blev underkastet yderligere 15 cycler fastfasesyn-tese. Ved afslutningen af syntesen blev Boc-gruppen på den N-terminale aminosyrerest fjernet (TFA), og peptidharpiksen, [Ala^JhGRF-5 (l-44)-MBHA-harpiks, blev tørret, hvilket gav 1,73 g.
EKSEMPEL 15
Fremstilling af [Ala^]hGRF(l-44) -15¾
Den i eksempel 14 fremstillede [Ala^]hGRF(l-44)-MBHA-harpiks (0,85 g) blev behandlet med vandfrit flydende HF som beskrevet i eksempel 10 3; udbytte: 380 mg råt [Ala^]hGRF(l-44)-NH2. En portion på 190 mg blev underkastet oprensning som beskrevet i eksempel 6 (lineær gradient 15-35%). Det ønskede produkt fremkom i fraktioner 42-43, der blev kombineret, inddampet og lyofiliseret; udbytte: 10,5 mg [Ala^^]hGRF(l-44)-NH2- Produktet viste sig at være homogent ved an-15 alytisk HPLC. Aminosyresammensætning (hydrolyse i 6N HC1-TGA, 110°C, 24 timer og 72 timer): Asp, 4,00; Thr, 0,91; Ser, 3,69; Glu, 7,40;
Gly, 2,16; Ala, 6,00; Val, 0,97; Met, 0,93; Ile, 1,85; Leu, 5,25;
Tyr, 1,83; Phe, 0,85; Lys, 1,97; Arg, 6,16; Phe, 0,91.
EKSEMPEL 16 20 Syntese af [Leu^]hGRF(l-44)-15¾
En portion på 1,79 g af den i eksempel 14 fremstillede hGRF(16-44)-MBHA-harpiks blev underkastet yderligere 15 cycler fastfasesyntese som beskrevet i eksempel 14; udbytte: 1,67 g sidekæde-beskyttet [Leu^]hGRF(l-44)-MBHA-harpiks. Halvdelen af dette materiale blev 25 behandlet med flydende vandfrit HF som beskrevet i eksempel 3; udbytte: 400 mg rå [Leu^]hGRF(l-44)-15¾. 200 mg blev underkastet HPLC-o-prensning som beskrevet i eksempel 6 og 15. Det ønskede produkt fremkom i fraktioner 43 og 44, der blev kombineret, inddampet og lyofiliseret; udbytte: 11,0 mg [Leu^]hGRF(l-44)-NH2· Produktet viste 30 sig at være homogent ved analytisk HPLC. Aminosyresammensætning
DK 164408 B
20 (hydrolyse i 6N HC1-TGA, 110eC, 24 timer og 72 timer): Asp, 3,89;
Thr, 0,93; Ser, 3,67; Glu, 7,40; Gly, 2,15; Ala, 5,00; Val, 0,95;
Met, 0,98; Phe, 1,02.
EKSEMPEL 17 5 Fremstilling af [Ala^]GRF(l-38) -BHA-harpiks
Den i eksempel 1 fremstillede Boc-Arg(Tos)-BHA-harpiks kan anbringes i reaktionsbeholderen på en Vega 250 Peptide Synthesizer, og fast-fasesyntese kan udføres ved den symmetriske anhydridprocedure i ialt 16 cycler, hvilket giver GRF(22-38)-BHA-harpiks. En portion kan 10 fjernes og underkastes yderligere 6 cycler fastfasesyntese, hvilket giver GRF(16-38)-BHA-harpiks. En portion kan derefter omdannes ved fastfasesyntese i de resterende 15 cycler. Ved afslutningen af syntesen kan Boc-gruppen på den N-terminale aminosyrerest fjernes under anvendelse af TFA, og den vundne [Ala^]GRF(l-38) -BHA-harpiks kan 15 tørres.
EKSEMPEL 18
Fremstilling, oprensning og karakterisering af [Ala^]GRF(l-38)-NH2
Den i eksempel 17 fremstillede [Ala^5]GRF(l-38)-BHA-harpiks kan behandles med vandfrit flydende HF som beskrevet i eksempel 3. En por-20 tion kan derefter underkastes oprensning som i eksempel 6 (lineær gradient 15-35%). De fraktioner, som indeholder det ønskede produkt, kombineres, inddampes og lyofiliseres. Produktet kan derefter bedømmes for homogenitet ved analytisk HPLC og bekræftes ved aminosyre-analyse.
EKSEMPEL 19
DK 164408 B
21
Syntese af [Leu15]GRF(l-38)-NH2
En portion af den i eksempel 17 fremstillede GRF(16-38)-BHA-harpiks kan underkastes yderligere 15 cycler fastfasesyntese som i eksempel 5 17, hvilket giver beskyttet [Leu^5]GRF(l-38)-BHA-harpiks. En portion af dette materiale kan behandles med vandfrit flydende HF som i eksempel 3, hvorved fås råt [Leu^]GRF(l-38)-NH2. En portion af dette rå produkt kan derefter underkastes HPLC-oprensning som i eksempel 6 og 15. Fraktionerne, som indeholder det ønskede produkt, kan kom-10 bineres, inddampes og lyofiliseres. Produktet kan påvises at være homogent ved analytisk HPLC og bekræftes ved aminosyreanalyse.
EKSEMPEL 20
Syntese af [Ala^, Leu^]GRF(l-29)-NH2
Den i eksempel 1 fremstillede Boc-Arg(Tos) -BHA-harpiks kan anbringes 15 i reaktionsbeholderen på en Vega 250 Peptide Synthesizer, og fastfasesyntese kan udføres ved den symmetriske anhydridprocedure i ialt 2 cycler, hvilket giver GRF(28-29)-BHA-harpiks. En portion kan fjernes og kobles med Boc-Leu og derefter underkastes yderligere 10 cycler fastfasesyntese, hvorved fås [Leu^]GRF(16-29)-BHA-harpiks. En 20 portion kan derefter fjernes, kobles med Boc-Ala og underkastes de yderligere 14 cycler fastfasesyntese som beskrevet i eksempel 3.
EKSEMPEL 21
Fremstilling af [/9-Ala15]hGRF(l-29)-NH2
En portion på 1,68 g hGRF(16-29)BHA-harpiks (0,30 mmol) fra eksempel 25 6 blev underkastet 15 cycler fastfasepeptidsyntese, behandlet med TFA
og tørret, hvilket gav 1,93 g s idekæde-beskyttet [/J-Ala^]hGRF(l-29)--BHA-harpiks. Den beskyttede peptidharpiks blev underkastet spaltning med vandfrit HF som i eksempel 3, og efter den sædvanlige oparbejd-
DK 164408 B
22 ning vandtes 1,2 g råt [/J-Ala^]hGRF(l-29)-NH2* En portion på 200 mg (0,05 mmol) blev underkastet HPLC-oprensning som i eksempel 6, og der vandtes 35,5 mg [/?-Ala^ ]hGRF(l-29)-NH2· Produktet viste sig at være homogent ved analytisk HPLC. Aminosyresammensætning (hydrolyse i 6N 5 HCl-TGA, 150eC, 1 time): Asp, 3,13; Thr, 0,98; Ser, 2,95; Glu, 2,14;
Ala, 3,13; Met, 1,01; Tyr, 2,03; Lys, 1,99, (hydrolyse i 6N HCl-TGA, 110eC, 24 timer): Val, 1,09; Phe, 1,10; /J~Ala, 0,87; Arg, 2,94.
EKSEMPEL 22
Fremstilling af [desNH2-Tyr1]hGRF(l-29)-NH2 10 Den i eksempel 8 fremstillede hGRF(3-29)-BHA-harpiks (1,0 g, 0,13 mmol) blev underkastet 2 cycler fastfasepeptidsyntese, hvilket gav 1,26 g tdesNH2-Tyr^]hGRF(l-29)-BHA-harpiks. Spaltning fra harpiksen med HF som i eksempel 3 gav 0,79 g råt [ desNH2 " Tyr·*· ]hGRF( 1-29)-NH2.
En portion på 120 mg deraf blev underkastet HPLC-oprensning som i 15 eksempel 6, hvilket gav 19,5 mg [desNH2-Tyr*·]hGRF(1 -29)-NH2- Produktet viste sig at være homogent ved analytisk HPLC. Aminosyreanalyse (hydrolyse i 6N HCl-TGA, 110°C, 24 timer): Asp, 3,08; Thr, 0,98; Ser, 2,94; Glu, 2,13; Gly, 1,10; Ala, 3,31; Val, 1,01; Met, 1,01; Ile, 1,97; Leu, 4,29; Tyr, 1,04; Phe, 0,98; Lys, 1,99; Arg, 3,15.
20 EKSEMPEL 23
Fremstilling af [desN^-Tyr^·, D-Ala^, Ala^]hGRF(l-29)-NH2
En portion af den i eksempel 6 fremstillede hGRF(16-29)-BHA-harpiks (3,23 g, 0,58 mmol) blev underkastet 13 cycler fastfasepeptidsyntese, behandlet med TFA og tørret, hvilket gav [Ala^]hGRF(3-29) -BHA-har-25 piks. En portion på 1,798 g af den beskyttede peptidharpiks blev underkastet 2 cycler fastfasepeptidsyntese, hvor der successivt blev tilføjet D-Ala og 3-(4-hydroxyphenyl)propionat. Den beskyttede peptidharpiks (1,85 g) blev behandlet med HF som i eksempel 3, og råproduktet blev tørret, hvilket gav 0,827 g. En portion på 200 mg blev 30 underkastet HPLC-oprensning som i eksempel 6, hvilket gav 22,2 mg
DK 164408 B
23 [desNH2*Tyr^, D-Ala^, Ala^]hGRF(l-29)-NH2; udbytte: 9%. Produktet var homogent ved analytisk HPLC. Aminosyresammensætning (hydrolyse i 6N HC1-TGA, 110°C, 24 timer og 72 timer): Thr, 1,02; Ser, 2,798; Tyr, 1,00; Lys, 2,04; Arg, 3,13; Asp, 2,80; Glu, 2,10; Ala, 3,98; Val, 5 1,04; Met, 1,03; Ile, 1,85; Phe, 0,92.
EKSEMPEL 24
Fremstilling af [desNi^Tyr·1-, Ala^JhGRF(l-29) -NH2
En portion på 1,8 g [Ala^]hGRF(l-29)BHA-harpiks fra eksempel 2 blev underkastet 2 cycler peptidsyntese som beskrevet i eksempel 2. Den 10 beskyttede peptidharpiks blev spaltet med HF som beskrevet i eksempel 3, hvilket gav 0,79 g råpeptid. En portion på 200 mg blev underkastet HPLC-oprensning som beskrevet i eksempel 6, hvilket gav 13 mg (5% udbytte) [desNH2-Tyr*·, Ala*-5]hGRF(l-29)-NH2· Produktet viste sig at være homogent ved analytisk HPLC. Aminosyresammensætning (hydrolyse i 15 6N HC1-TGA, 150°C, 1 time og 72 timer): Asp, 3,00; Thr, 1,00; Ser, 3,00; Tyr, 0,99; Lys, 1,99; Arg, 3,04; Glu, 2,05; Ala, 4,25; Val, 0,99; Met, 0,92; Ile, 1,85; Leu, 3,97; Phe, 0,94.
EKSEMPEL 25
Fremstilling af [a-Aib^5]hGRF(l-29)-NH2 20 En portion på 1,68 g hGRF(16-29)BHA-harpiks (0,30 mmol) fra eksempel 6 blev underkastet 15 cycler fastfasepeptidsyntese, behandlet med TFA og tørret, hvilket gav 1,93 g sidekæde-beskyttet [a-Aib^]hGRF(l-29)--BHA-harpiks. Den beskyttede peptidharpiks blev underkastet spaltning med vandfrit HF som i eksempel 3, og efter den sædvanlige oparbejdn-25 ing vandtes råt [a-Aib^5]hGRF(l-29)-NH2· En portion på 200 mg blev underkastet HPLC-oprensning som i eksempel 6, og der vandtes [a-Aib]-hGRF(l-29)-NH2· Produktet viste sig at være homogent ved analytisk HPLC.
EKSEMPEL 26
DK 164408 B
24
Den biologiske aktivitet af de her omhandlede forbindelser blev sammenlignet med den biologiske aktivitet af syntetisk GRF(l-44)-NH2.
Den biologiske aktivitet af den syntetiske GRF(l-44)-NH2 var identisk 5 med aktiviteten af naturligt GRF(l-44)-NH2, der blev isoleret fra en human pancreastumor af et individ, der led af acromegali [Salk Institute standard I1GRF-NH2' (NL-A-10) ]. Assayet for biologisk aktivitet, der er baseret på evnen til at stimulere dannelsen af væksthormon i rottehypofyseceller i vævskultur, blev udført på følgende måde: 10 Hypofyser fra 30-40 Sprague-Dawley-hanrotter (175 g) blev fjernet aseptisk efter dekapitering. Forlapperne blev indsamlet, vasket 3 gange i steril Hepes-puffer (0,025M, pH 7,35) og dispergeret ved 37eC i 20-30 ml Hepes-puffer (pH 7,35) indeholdende collagenase (4 mg pr. ml) og Dispase (protease kvalitet II, 2 mg pr. ml). Efter nænsom vor-15 texering i 100-110 minutter og triturering ved hjælp af en Pasteur-pipette, blev de dispergerede celler adskilt ved centrifugering (150 x g, 4 min) og resuspenderet i Hepes-puffer indeholdende neuraminidase (8 g/ml) og 200 g/ml ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)-di-natriumsalt, pH 7,35, i 10 minutter. Cellerne blev vasket 2 gange med 20 udpladningsmedium og udpladet på multibrønd-plader (1,5 x 10^ celler pr. ml) under anvendelse af nedenstående definerede medium: F-12/-DMEM/BGJ (6:3:1, Gibco: 430-1700/430-1600/320-2591) med 2 g BSA/1, 2,38 g Hepes/1,50 mg PSN antibiotikablanding (Gibco Laboratories), 10 mg/1 transferrin (Sigma T2252) med 1,83 mg NazHCOj/l (Baker 3506).
25 Mediet i hver brønd blev tilsat enten en prøve af den hidtil tikendte GRF-analog eller naturligt GRF(l-44)-NH2 i koncentrationer i området 0,8-200 fmol pr. ml medium. Kontrolbrønde indeholdt ikke nogen tilsætning. Udpladningen blev udført med dette medium, hvortil der var sat 2% føtalt kalveserum, for at sikre hurtig fastgørelse af celler-30 ne. På 4. dagen blev cellerne vasket 2 gange med det definerede medium uden føtalt kalveserum. Endelig blev 900 pi defineret medium sat til hver brønd plus 100 pi af samme medium, der indeholdt hver individuel behandling in triplo. Efter 4 timers inkubation blev mediet indsamlet og fortyndet efter behov til udførelse af radioimmu-35 noassay (RIA) for rottevæksthormon. RIA for rottevæksthormon blev udført under anvendelse af Sinha's antimurine GH-immunserum og Natio-
DK 164408 B
25 nal Pituitary Agency's metode under anvendelse af protein A til udfældning af antistof/antigenkompleks.
Resultaterne af assayene var, at det hidtil ukendte (Ala^)GRF(l-29)-NH2 blev sammenlignet med GRF(1-29)NH2 og viste sig at være 5,1 gange 5 stærkere. De relative potenser i forhold til GRF(1-44)1¾ er vist i nedenstående tabel.
TABEL
Forbindelse nr. Relative potens 1) GRF (1-44)NH2 lo 2) [Alals]GRF(l-29)OH L5.
3) [Val15]GRF(l-29)NH2 L03 4) [Leu15] GRF(1-29)NH2 3·5 5) [Ala15] GRF(1-29)NH2 3.81 6) [β-Ala15] GRF(1-29)NH2 δ·56 7) [Aib15]GRF(l-29)NH2 3.7 8) [Ala12,Ala15]GRF(l-29)NH2 2.6 9) [desNH2Tyr1,Ala15]GRF(l-29)NH2 4.04 10) [desNH2Tyr1,Ala15,Met27]GRF(l-29)NH2 0.83 11) [desNH2Tyr 1,D-Ala2,Ala15]GRF( 1-29)NH2 4.70 12) [desNHjjTyr1,D-Ala2,Ala15 ,Met27]GRF(l-29)NH2 0.63 13) [Ala15 ,Nle27]GRF( 1-29)NH2 4.27 14) [D-Ala2,Ala15,Nle27]GRF( 1-29)NH2 1.47 15) [N-Me-D-Ala2,Ala15,Nle27]GRF(l-29)NH2 3.08 16) [desNH2Tyr1,D-Ala2,Ala15,Nle27]GRF(l-29)NH2 3.06 17) [desNH2Tyr1,N-Me-D-Ala2,Ala15,Nle27]GRF(l-29)NH2 1.82 18) [Leu15]GRF(l-29)OH 0.65 19) [Val15]GRF(l-29)OH ' 0.38 20) [D-Ala2,Ala15]GRF( 1-29)NH2 4.86
Claims (13)
1. Væksthormonfrigivende faktor (GRF)-forbindelse med den almene formel 1 12** ^ R ~R -Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr- 154 20
2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har den almene formel 1. is 10 R -R -Asp-Ala-Ile-Ptie-Thr-Asn-Ser-Tyr- 3 154 20 Arg-R -Val-Leu-R -Gln-Leu-Ser-Ala-Arg- 25 30 Lys-Leu-Leu~Gln-Asp-Ile-R -Ser-Arg-Gln-Gln-Gly- 35 40 Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-X hvor R1, R^, R3, R4, R5 og X har den i krav 1 anførte betydning. 20 DK 164408 B
3. Forbindelse ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den er [Ala15]GRF(l-44)-NH2, eller [ Leu15 ] GRF( 1 -44) -NH2.
4. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^ betegner Arg, og R1, R2, R^, R^, R^ og X har den i krav 1 anførte betydning.
5. Forbindelse ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den er 10 [Leu15]GRF(l-29)-NH2, [Val15]GRF(l-29)-NH2, [Leu15]GRF(l-29)-OH, [Val15]GRF(l-29)-OH, ' [j8-Ala15]GRF(l-29)-NH2, eller 15 [a-Aib15]GRF(l-29)-NH2.
5 Arg-R -Val-Leu-R -Gln-Leu-Ser-Ala-Arg- I 25 5 6 Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R -Ser-R-X hvor R*· betegner Tyr, D-Tyr, desN^-Tyr, Ac-Tyr eller His; betegner Ala, D-Ala eller N-methyl-D-Ala; R3 betegner Lys eller Ala; R4 betegner Ala, Leu, Val, Ile, Nle, Nval, /i-Ala eller 10 a-Amino isosmørsyre; R3 betegner Met, Leu, Nle eller Ile; R^ betegner en aminosyresekvens valgt blandt Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu og fragmenter deraf, hvor sekvensen er reduceret i antal med 1-15 aminosyrer es ter fra carboxylenden; og X betegner enten-OH eller NH2, og hvor alle 15 aminosyrer er L-aminosyrer medmindre andet specifikt er angivet. eller farmaceutisk acceptable syre- eller baseadditionssalte deraf.
6. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^ betegner Ala, og R1, R2, R^, R^, R^ og X har den i krav 1 anførte betydning.
7. Forbindelse ifølge krav 6, 20 kendetegnet ved, at den er [Ala15]GRF(l-29)-NH2, [Ala12, Ala15]GRF(1-29)-NH2, [D-Ala2, Ala15]GRF(l-29)-NH2, [Ala15]GRF(l-29)-OH, 25 [desNH2-Tyr1, Ala15]GRF(l-29)-NH2, eller [desNH2-Tyr1, D-Ala2, Ala15]GRF(l-29)-NH2.
8. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^ betegner Ala, R^ betegner Leu, R^ 30 betegner Arg, og R1, R2, R2 og X har den i krav 1 anførte betydning. DK 164408 B
9. Forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8 til anvendelse som terapeutikum, især til behandling af vækstrelaterede lidelser, som er karakteriserede ved væksthormondeficienser hos mennesker.
10. Forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at den anvendes til behandling af dyr for at fremme deres vækst.
11. Fremgangsmåde til fremstilling af væksthormonf rigivende faktor (GRF) -forbindelser med den almene formel I 10 1 2 5 10 R -R -Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr- 3 ^4 20 Arg-R -Val-Leu-R -Gln-Leu-Ser-Ala-Arg- 25 Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-R5-Ser-R6-X I hvor R*· betegner Tyr, D-Tyr, desNt^-Tyr, Ac-Tyr eller His; betegner Ala, D-Ala eller N-methyl-D-Ala; betegner Lys eller Ala; R4 betegner Ala, Leu, Val, Ile, Nle, Nval, /3-Ala eller 15 a-Aminoisosmørsyre; R-* betegner Met, Leu, Nle eller Ile; R® betegner en aminosyresekvens valgt blandt Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu og fragmenter deraf, hvor sekvensen er reduceret i antal med 1-15 aminosyrerester fra carboxylenden; og X betegner enten OH eller NH2, og hvor alle 20 aminosyrer er L-aminosyrer medmindre andet specifikt er angivet, eller farmaceutisk acceptable syre- eller baseadditionssalte deraf, kendetegnet ved, at a) beskyttelsesgrupperne på et hensigtsmæssigt beskyttet polypeptid med en tilsvarende aminosyresekvens, hvilket polypeptid er synte ti-25 seret ved opløsningsfasepeptidsyntese, fraspaltes under anvendelse af sædvanlige metoder, eller DK 164408 B b) et hensigtsmæssigt sidekæde-beskyttet harpiksbundet polypeptid med tilvarende aminosyresekvens, hvilket polypeptid er blevet syntetiseret ved fastfasepeptidsyntese, omsættes med vandfrit flydende HF, og den vundne forbindelse med den almene formel I om ønsket omdannes 5 til et farmaceutisk acceptabel syre- eller baseadditionssalt.
12. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en effektiv mængde af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8 og en ikke-toxisk farmaceutisk acceptabel flydende eller fast bærer. /·
13. Anvendelse af en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kra vene 1-8 til fremstilling af et terapeutisk præparat til behandling af vækstrelaterede lidelser, der er karakteriserede ved væksthormon-deficienser hos mennesker, eller til behandling af dyr for at fremme deres vækst.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/653,163 US4622312A (en) | 1984-09-24 | 1984-09-24 | Growth hormone releasing factor analogs |
| US65316384 | 1984-09-24 | ||
| US76289185 | 1985-08-06 | ||
| US06/762,891 US4649131A (en) | 1984-09-24 | 1985-08-06 | Growth hormone releasing factor analogs |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK433485D0 DK433485D0 (da) | 1985-09-24 |
| DK433485A DK433485A (da) | 1986-03-25 |
| DK164408B true DK164408B (da) | 1992-06-22 |
| DK164408C DK164408C (da) | 1992-11-09 |
Family
ID=27096450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK433485A DK164408C (da) | 1984-09-24 | 1985-09-24 | Vaeksthormonfrigivende faktorforbindelser, forbindelserne til anvendelse som terapeutikum, fremgangsmaade til fremstilling af forbindelserne, farmaceutiske praeparater, der indeholder en effektiv maengde af en saadan forbindelse samt anvendelse af forbindelsen |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4649131A (da) |
| EP (1) | EP0177819B1 (da) |
| JP (1) | JPH0674279B2 (da) |
| AU (1) | AU589373B2 (da) |
| CA (1) | CA1270598A (da) |
| DE (1) | DE3585867D1 (da) |
| DK (1) | DK164408C (da) |
| IE (1) | IE59240B1 (da) |
| IL (1) | IL76440A (da) |
| NZ (1) | NZ213566A (da) |
| PH (1) | PH23324A (da) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1271600A (en) * | 1985-01-07 | 1990-07-10 | David Howard Coy | Growth hormone-releasing peptides and method of treating mammals therewith |
| US4734399A (en) * | 1985-08-06 | 1988-03-29 | Hoffmann-La Roche Inc. | Growth hormone releasing factor analogs |
| US4689318A (en) * | 1985-08-29 | 1987-08-25 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs |
| US4880778A (en) * | 1986-05-12 | 1989-11-14 | Eastman Kodak Company | Combinations having synergistic growth hormone releasing activity and methods for use thereof |
| JPS63243096A (ja) * | 1987-03-27 | 1988-10-07 | Sumitomo Pharmaceut Co Ltd | ポリペプチドの製造法 |
| US5001223A (en) * | 1987-05-26 | 1991-03-19 | Merck & Co., Inc. | Parathyroid hormone antagonists with enhanced metabolic properties |
| US4839344A (en) * | 1987-06-12 | 1989-06-13 | Eastman Kodak Company | Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity |
| US4801456A (en) * | 1987-07-09 | 1989-01-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Growth hormone-releasing factor analogs |
| USRE33699E (en) * | 1987-07-09 | 1991-09-24 | International Minerals & Chemical Corp. | Growth hormone-releasing factor analogs |
| US4880777A (en) * | 1987-09-01 | 1989-11-14 | Eastman Kodak Company | Synthetic peptides having growth hormone releasing activity |
| ATE122357T1 (de) * | 1988-01-28 | 1995-05-15 | Polygen Holding Corp | Polypeptide mit hormonwachstumsbefreiender wirkung. |
| JPH03502324A (ja) * | 1988-01-29 | 1991-05-30 | ジ・アップジョン・カンパニー | Ｇｒｆ同族体 |
| US5168102A (en) * | 1988-03-18 | 1992-12-01 | University Of Delaware | Endocrine manipulation to improve body composition of poultry |
| US4929600A (en) * | 1988-03-18 | 1990-05-29 | University Of Deleware | Endocrine manipulation to improve body composition of poultry |
| US5023322A (en) * | 1988-08-31 | 1991-06-11 | Mta Kutatas-Es Szervezetelemzo Intezete | Analogs of growth hormone releasing factor (GRF) and a method for the preparation thereof |
| US5084442A (en) * | 1988-09-06 | 1992-01-28 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cyclic growth hormone releasing factor analogs and method for the manufacture thereof |
| US5756458A (en) * | 1989-06-16 | 1998-05-26 | Pharmacia & Upjohn Company | Stabilized potent GRF analogs |
| US5132401A (en) * | 1989-09-19 | 1992-07-21 | George Washington University, Office Of Sponsored Research | MB-35 a peptide enhancing the production of growth hormone and prolactin from the anterior pituitary |
| CA2082059A1 (en) * | 1990-05-04 | 1991-11-05 | David H. Coy | Synthetic grf analogs |
| NZ238748A (en) * | 1990-06-29 | 1993-09-27 | Hoffmann La Roche | Growth hormone releasing factor (grf) analogues |
| ATE119916T1 (de) * | 1990-12-10 | 1995-04-15 | Hoffmann La Roche | Verfahren zur enzymatischen herstellung von grf(1-44)nh2. |
| AU662731B2 (en) * | 1991-04-09 | 1995-09-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Growth hormone releasing factor analogs |
| US5262519A (en) * | 1991-05-15 | 1993-11-16 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF analogs XI |
| US5246920A (en) * | 1992-06-15 | 1993-09-21 | University Of South Florida | Treatment of hyperprolactinemia |
| US5811074A (en) * | 1992-06-29 | 1998-09-22 | University Of South Florida | Method of diagnosing pituitary dependent growth hormone deficiency |
| US5550212A (en) * | 1993-12-17 | 1996-08-27 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Analogues of hGH-RH(1-29)NH2 having antagonistic activity |
| JPH11503454A (ja) * | 1995-04-14 | 1999-03-26 | ジ アドミニストレイターズ オブ ザ チューレン エデュケイショナル ファンド | 成長ホルモン放出因子の類似体 |
| US5990084A (en) * | 1996-04-19 | 1999-11-23 | Novo Nordisk A/S | Compounds with growth hormone releasing properties |
| JP2000510453A (ja) * | 1996-04-19 | 2000-08-15 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 成長ホルモン遊離特性を有する化合物 |
| US8980249B2 (en) | 2010-06-03 | 2015-03-17 | University Of Miami | Agonists of growth hormone releasing hormone as effectors for survival and proliferation of pancreatic islets |
| US9079974B2 (en) | 2011-12-21 | 2015-07-14 | The University Of Miami | GH-RH analogs with potent agonistic effects |
| WO2014100816A2 (en) | 2012-12-21 | 2014-06-26 | University Of Miami | Ghrh agonists for islet cell transplantation and function and the treatment of diabetes |
| EP2934565B1 (en) | 2012-12-21 | 2019-03-13 | University of Miami | Ghrh agonists for the treatment of ischemic disorders |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4529595A (en) * | 1983-01-13 | 1985-07-16 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs |
| US4563352A (en) * | 1982-10-04 | 1986-01-07 | The Salk Institute For Biological Studies | Human pancreatic GRF |
| IL70530A (en) * | 1983-01-13 | 1986-09-30 | Salk Inst For Biological Studi | Synthetic peptides having growth hormone releasing factor activity and compositions containing them |
| US4518586A (en) * | 1983-01-13 | 1985-05-21 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs III |
| US4617149A (en) * | 1983-09-21 | 1986-10-14 | Eli Lilly And Company | Growth hormone release factor analogs |
| US4528190A (en) * | 1983-10-25 | 1985-07-09 | The Salk Institute For Biological Studies | GRF Analogs IV |
| US4562175A (en) * | 1984-02-03 | 1985-12-31 | Ding Chang | Synthetic peptides |
-
1985
- 1985-08-06 US US06/762,891 patent/US4649131A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-20 IL IL76440A patent/IL76440A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-09-20 NZ NZ213566A patent/NZ213566A/xx unknown
- 1985-09-20 DE DE8585111959T patent/DE3585867D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-20 EP EP85111959A patent/EP0177819B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-23 AU AU47683/85A patent/AU589373B2/en not_active Ceased
- 1985-09-23 CA CA000491353A patent/CA1270598A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-23 PH PH32820A patent/PH23324A/en unknown
- 1985-09-23 IE IE234185A patent/IE59240B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-09-24 JP JP60209032A patent/JPH0674279B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-24 DK DK433485A patent/DK164408C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ213566A (en) | 1989-01-06 |
| DK164408C (da) | 1992-11-09 |
| EP0177819B1 (en) | 1992-04-15 |
| IE59240B1 (en) | 1994-01-26 |
| IL76440A (en) | 1989-08-15 |
| JPH0674279B2 (ja) | 1994-09-21 |
| DE3585867D1 (de) | 1992-05-21 |
| DK433485A (da) | 1986-03-25 |
| CA1270598A (en) | 1990-06-19 |
| IE852341L (en) | 1986-03-24 |
| DK433485D0 (da) | 1985-09-24 |
| AU589373B2 (en) | 1989-10-12 |
| EP0177819A3 (en) | 1989-02-08 |
| EP0177819A2 (en) | 1986-04-16 |
| US4649131A (en) | 1987-03-10 |
| PH23324A (en) | 1989-07-14 |
| JPS61118400A (ja) | 1986-06-05 |
| IL76440A0 (en) | 1986-01-31 |
| AU4768385A (en) | 1986-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4649131A (en) | Growth hormone releasing factor analogs | |
| US4622312A (en) | Growth hormone releasing factor analogs | |
| AU662731B2 (en) | Growth hormone releasing factor analogs | |
| US5696089A (en) | Histidine substituted growth hormone releasing factor analogs | |
| CA1341207C (en) | Analogues of insulin-like growth factor-1 | |
| US5939386A (en) | Chimeric fatty body-pro-GRF (1-29) analogs with increased biological potency | |
| US5084442A (en) | Cyclic growth hormone releasing factor analogs and method for the manufacture thereof | |
| KR0138907B1 (ko) | 합성 펩티드 | |
| US4734399A (en) | Growth hormone releasing factor analogs | |
| CA1254000A (en) | Growth hormone releasing factor analogs | |
| EP0188214A2 (en) | Novel growth hormone-releasing peptides and method of treating mammals therewith | |
| JP2715472B2 (ja) | 環式ペプチド | |
| RU2096416C1 (ru) | Производные пептидов - аналоги grf или их нетоксичные соли | |
| US4732972A (en) | Polypeptides having growth hormone releasing activity | |
| US4959352A (en) | Cyclic growth hormone releasing factor analogs and method for the manufacture thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |