DK150145B - Antigeniske peptider indeholdende 10-11 aminosyrerester - Google Patents

Description

150146

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte antigeniske peptider indeholdende 10-11 aminosyrerester, hvilke peptider er ejendommelige ved, at de har en af de i kravet angivne formler.

Det har været kendt i mange år, at pattedyrspermatozoer er 05 antigeniske. Senere er det blevet vist, at pattedyrsperma indeholder et antigenisk enzym kendt som C^-isozymet af lactatdehydroge-nase (LDH-X, LDH-C4). LDH-C4 er blevet isoleret i ren krystallinsk form fra musetestis, Goldberg (1972), J. Biol. Chem., 247:2044-2048. Enzymet har en molekylvægt pi 140.000 og er sam-10 mensat af fire identiske C underenheder. Aminosyresekvensen og den tredimensionelle struktur af LDH-C^ er blevet studeret og delvis bestemt af flere forskere, se Musick et al. (1976), J. Mol.

Biol., 104:659-668, og Wheat et al. (1977), Biochem. & Biophys.

Res. Comm., 74, Nr. 3:1066-1077. Wheat et al. bestemte sekvensen 15 af det essentielle thiolpeptid fra aminosyre 159 til 171 og fandt, at dette var næsten identisk med essentielle thiolpeptider fra andre hvirveldyr LDH isozymer.

I 1974 gav Dr. Erwin Goldberg en redegørelse for virkningerne af immunisering med LDH-X (LDH-C4) pi fertilitet, og fremsatte 20 den mulighed, at det "ved anvendelse af en defineret makromoleky-lær sperma komponent bliver muligt at klarlægge dens primære struktur i form af aminosyresekvens, specifikt at kortlægge den eller de antigeniske determinanter, der er ansvarlige for fremkaldelse af infertilitet, og derefter konstruere syntetiske peptider indeholdende 25 disse determinanter. Når man kan syntetisere et molekyle med sådanne egenskaber, muliggøres fertilitetskontrol ad immunologisk vej", Karolinska Symposia on Research Methods in Reproductive Endocrinology, 7th Symposia: Immunological Approaches to Fertility Control, Geneve, 1974, 202-222. Sådanne syntetiske antigeniske 30 peptider vedblev imidlertid at være et mål og ikke et resultat, selv om deres teoretiske ønskelighed var erkendt. I 1979 summerede Dr.

Erwin Goldberg teknikkens standpunkt som følger: "Som konklusion kræver immunoterapi til fødselskontrol i praksis mere end effektivitet, specificitet, reversibilitet og 35 fravær af systemisk bireaktion. Temmelig store mængder af an tigenet må være tilgængelige i utvetydigt ren form. Denne betingelse kan muligvis ikke opfyldes med et naturproduktenzym- 150145 2 antigen fra sperma elier testis. Antikonceptionel teknologi kræver snarere et syntetiserbart peptidfragment, der bibeholder antigenicitet og fremkalder et respons, der svækker fertilitet. Afslutning af de strukturelle analyser af LDH-C4 skulle mulig-05 gøre kortlægning af antigeniske determinanter og syntese af sådanne peptider til anvendelse ved en ny antikonceptionel teknologi", "Recent advances in Reproduction and Regulation of Fertility", G.P. Talwar, udgiver, Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979).

10 Det har nu vist sig, at stærkt antigeniske peptider kan frem stilles ved syntetisering af lineære sekvenser af aminosyrer, hvilke sekvenser menes at svare til aminosyresekvenser, der forefindes i det naturlige enzym LDH-C^. Disse sekvenser indbefatter serin-leu-cin-asparagin-prolin-alanin-isoleucin-glycin-threonin-asparaginsyre-15 fysin, der menes at svare til LDH-C4 aminosyrerne 211 til 220. Denne sekvens svarer dog ikke til den publicerede foreløbige kortlægning af LDH-C4, se Musick et al. (25. august 1979), J. Biol.

Chem., 254, nr. 16:7621-7623.

Blandt forbindelser, der indbefatter den ovenfor identificerede 20 antigeniske sekvens, er følgende specifikke forbindelser: (m) N-Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-lle-Gly-Thr-Asp-Lys-C, og (n) N-Cys-Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-lle-Gly-Thr-Asp-Lys-C.

I de foregående formler betegner bogstavet "N" N-terminal aminosyren, mens bogstavet "C" betegner C-termina! aminosyren.

25 Gly repræsenterer giycin, og Leu, Ile, Asn, Pro, Asp, Lys, Ser,

Cys, Ala og Thr repræsenterer henholdsvis L-aminosyreformerne af leucin, isoleucin, asparagin, prolin, asparaginsyre, lysin, serin, cystein, alanin og threonin. Som man vil bemærke, indeholder forbindelse (n) samme antigeniske sekvens som forbindelse (m), bortset 30 fra, at cystein er tilføjet ved N-terminalenden for at lette koblingen til proteiner ved fremstilling af antigeniske vacciner.

Peptidforbindelserne ifølge opfindelsen kan syntetiseres ud fra de aminosyrer, hvoraf de er opbygget. Syntesen kan for eksempel udføres ved Merrifield fastfase-metoden som beskrevet i J.A.C.S.

35 85:2149-2154 (1963). Denne fastfase-metode til syntetisering af ami nosyresekvenser er også beskrevet i Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis (W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1969), pp.

150145 3 r 1-4. Ved denne fremgangsmåde fastgøres C-terminal-aminosyren ly-sin ti! chlormethylerede polystyren-divinylbenzencopolymer-perler.

Derefter tilføjes hver efterfølgende aminosyre med passende beskyttelsesgrupper sekventielt til den voksende kæde. Den a-amino-be-05 skyttende gruppe kan for eksempel, som beskrevet i Merryfield-ar-tiklen, være en carbobenzoxygruppe. Ved hjælp af kobling, afbe-skyttelse og kobling af den næste aminosyre kan den ønskede amino-syresekvens og kædelængde frembringes. Som et afsluttende trin fjernes den beskyttende gruppe fra N-terminal-aminosyren og even-10 tuelle sidekædebeskyttelsesgrupper, og C-terminal-aminosyren spaltes fra harpiksen under anvendelse af et passende reagens, såsom tri-fluoreddikesyre og hydrogenbromid. De ovenfor beskrevne forbindelser (m) og (n) fremstilles ved denne syntesemetode til brug ved reduktion af pattedyrs fertilitet.

15 For at udnytte antigeniske peptider ifølge opfindelsen i fertili tetsreducerende vacciner, bringes peptidet i forbindelse med et bærermolekyle, som fortrinsvis er et protein, der selv fremkalder et antigenisk respons og som kan administreres sikkert. For eksempel kan peptidet kobles til tetanustoxoid til administrering ved intra-20 muskulær injektion. For eksempel giver en blanding af 1 μ mol tetanustoxoid, 60 μ mol antigenisk peptid og 18 millimol 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid,hydrochlorid omsat i vand (pH 6) i 12 timer ved stuetemperatur og 24 timer ved 4° et produkt, der indeholder 3,5 mol peptid/mol tetanustoxoid. Overskud af reaktanter 25 kan fjernes ved dialyse eller gelfiltrering, se Pique et al., Immuno-chemistry, 15:55-60 (1978). Alternativt kan peptidet kobles under anvendelse af bisdiazoteret benzidin (Bassiri et al., Endocrinology, 90:722 (1972)) eller glutaraldehyd.

Til intramuskulær injektion kan det koblede peptid suspenderes 30 j en steril isotonisk salineopløsning eller anden konventionel bærer og et adjuvans kan om ønsket tilsættes. En foretrukken anvendelse af en sådan vaccine er til administrering til kvinder. Der vil dannes antistoffer, som vil vise sig i ovidukt-fluiderne, hvorved der opnås en signifikant fertilitetsreduktion. Til dette formål vil mængden, 35 der skal administreres, variere fra ca. 1 til 10 mg af det antigeniske peptid.

150145 4

Peptidforbindelserne ifølge opfindelsen, deres fremstilling og deres antigeniske virkning illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler.

05 Eksempel 1

Fremstilling af lineært peptid Cys-Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-lle-Gly-Thr-Asp-Lys

Syntese af ovenstående peptid, heri omtalt som forbindelse (n), kan udføres ved anvendelse af fastfase-teknikker, der nu er 10 velkendte inden for området. Ved en foretrukken fremgangsmåde kobles aminobeskyttet lysin, der repræsenterer -COOH terminal-gruppen i ovenstående peptid, til en konventionel fastfase-peptid-synteseharpiks, såsom chlormethylpolystyren, der er tværbundet med 1 til 2% divinyl benzen. Den aminobeskyttende gruppe fjernes så 15 selektivt under anvendelse af et passende reagens, hvis art vil afhænge af den anvendte beskyttende gruppe. I den foretrukne udførelsesform anvendes t-butyloxycarbonylgruppen (Boc) til amino-gruppebeskyttelse, og 40% trifluoreddikesyre i methylenchlorid er det selektive afbeskyttelsesmiddel.

20 Efter afbeskyttelse behandles lysinharpiksen med beskyttet as- paraginsyre, fortrinsvis N-Boc-O-benzylasparginsyre, og dicyclo-hexylcarbodiimid på i og for sig kendt måde til dannelse af en peptidbinding mellem lysinrestens fri amino-gruppe og den beskyttede asparaginsyres carboxylgruppe.

25 Denne cyklus med afbeskyttelse og kobling med aminosy rederi- vater og dicyclohexylcarbodiimid gentages så med de resterende aminosyrer i sekvensrækkefølgen i ovennævnte peptid. Nogle af aminosyrerne kræver sidekædebeskyttelsesgrupper ud over alpha-aminobeskyttelsen. ' Sådanne aminosyrer og blokeringsgrupperne er 30 · som følger:

Cys(MBzl), Ser(oBzl), Thr(oBzl), Asp(oBzl), Lys(CI-z), hvori oBzl er benzyl, Mbzl er p-methoxybenzyl og Cl-z er o-chlor-benzyloxycarbonyl.

Fuldendelse af syntesen gav følgende peptid koblet til styren-35 divinylbenzencopolymerharpiksen: TFA-Cys(MBzl)-Ser(oBzI)-Leu-Asn-Pro-Ala-lle-Gly-Thr(oBzl)-

Asp(oBzl)-Lys(CI-z)-harpiks.

150145 5

Frakobling af peptidet fra harpiksen opnås véd behandling med flydende hydrogenfluorid under ledsagende fraspaltning af alle beskyttende grupper til frembringelse af det ønskede peptid.

05 Fastfase-syntese af

Cys(MBzl)-Ser(oBzl)-Leu-Asn-Pro-Ala-lle-Gly-Thr(oBzl)-Asp(oBzl)-

Lys(CI-z)-harpiks_

Knytning af N-Boc-Lys(CI-z) til chlormethylharpiks udførtes ved cæsiumsaltmetoden. En prøve af chlormethylharpiks (200 g) in-10 deholdende 0,74 mmol chlorid pr gram behandles med cæsiumsaltet af Boc-Lysin hidrørende fra neutralisation af N-Boc-Lys(Cl-z) med cæ-siumcarbonat. Ca. 73,8 g N-Boc-Lys(CI-z) opløses i 80% methanol og 20% vand og indstilles til pH 7,0 med ca. 29 g cæsiumcarbonat. Den resulterende opløsning tørres i en rotationsinddamper, hvorefter 15 den tørres yderligere tre gange efter tre tilsætninger af 100 ml xy-len. Til cæsiumsaltet af N-Boc-Lys(CI-z) sættes 200 g chlormethylharpiks som ovenfor og tilstrækkeligt 1-methyl-2-pyrrolidinon til at bringe det samlede volumen pi ca. 1,90 liter. Den resulterende blanding omrøres ved 55°C i 48 timer. Harpiksen vaskes så eksten-20 sivt med methanol efterfulgt af vand og derefter igen med methanol.

Harpiksen lufttørres og tørres så under vakuum. Efter spaltning af lysin fra harpiks med HF gav aminosyreanalyse en top svarende til 0,36 mmol/g.

En prøve af den netop beskrevne harpiks (5,5 g) underkaste-25 des følgende synteseprogram: (1) vask med tre 100 ml portioner methylenchlorid, (2) fjernelse af Boc-gruppen med 40% TFA i methylenchlorid under et minuts vask og en 20 minutters reaktionstid, (3) vask med tre 100 ml portioner methylenchlorid, (4) vask med to 100 ml portioner isopropa-30 . nol, (5) vask med tre 100 ml portioner methylenchlorid, (6) vask i et minut og neutralisation i 10 minutter med 100 ml portioner af 10% triethylamin i methylenchlorid, (7) vask med tre portioner af 100 ml methylenchlorid, (8) tilsætning af 2,5 ækvivalenter (7,2 mmol) Boc-aminosyre og 2,5 ækvivalenter (7,2 mmol) dicyclohexylcarbodiimid i 35 methylenchlorid og rystning i 2 timer, (9) vask med tre 100 ml portioner methylenchlorid, (10) vask med to 100 ml portioner isopropa-nol, (11) vask med tre 100 ml portioner methylenchlorid. Ovenstående cyklus gentoges for følgende N-beskyttede aminosyrer: 150145 6

Boc-Asp(oBzl) Boc-Leu

Boc-Thr(oBzl) Boc-Ser(oBzl)

Boc-Gly Boc-Cys(MBzl)

Boc-lle 05 Boc-Ala

Boc-Pro Boc-Asn

Den beskyttede peptidharpiks underkastedes afbeskyttelse, hvilket gav TFA-saitet af den afbeskyttede peptidharpiks. En por-10 tion af den tørrede harpiks (6 g) omrørtes i nærværelse af 6 ml anisol og 60 ml flydende HF ved 0°C i 1 time. HF fjernedes ved vakuum og den olieagtige remanens vaskedes med to 50 ml portioner ethylether. Peptidet ekstraheredes fra harpiksen med tre 50 ml portioner 1 molær eddikesyre, og de kombinerede filtrater lyofilisere-15 des.

Peptidet dimeriseredes ved omrøring af en opløsning i vand med pH 9,0 i tre dage i nærværelse af luft. Det lyofiliseredes si og underkastedes modstrømsfordeling i systemet 0,1% eddikesyre:butanol rpyridin i forholdet 11:5:3. De mest rene fraktioner rensedes 20 yderligere ved søjlechromatografi på carboxymethylcellulose under anvendelse af en ammoniumbicarbonatgradient fra 0,01 molær til 0,2 molær. De mest rene fraktioner underkastedes søjlechromatografi pi diethylaminoethylcellulose under anvendelse af en ammoniumbicarbonatgradient fra 0,01 molær til 0,05 molær. Det rene peptid lyofilise-25 redes, hvilket gav 77 mg.

Aminosyreanalyse af peptidet efter sur hydrolyse gav: lysin^ ammoniakg gg, asparaginsyre^ ^g, threonin^ seri%96' prolini,0' ' 9’yc?n1,00' alaninw, cystein^g, isoleucing gg og leucing g^. Tyndtlagschromatografi pi cellulose i 30 butanol:ethyiacetat:eddikesyre:vand i forholdene 1:1:1:1 gav en pi 0,64 med en mindre øvre plet. Når der anvendtes tyndtlagschromatografi på cellulose med butanol:pyridin:eddikesyre:vand i forholdene 15:10:3:12, var Rf 0,45, også med en mindre øvre plet. Papirelektroforese på "Whatman 3MM" papir med pyridinacetatpuffer 35 med pH 6,4 viste en enkelt plet i den neutrale position, R^. 0,20 i forhold til picrinsyre.

Forbindelse (m), der indeholder samme antigeniske sekvens som forbindelse (n), fremstilles og karakteriseres på tilsvarende måde.

150145 7

Forsøgsresultater

Rensede peptider indbefattende lineære aminosyresekvenser fra muse LDH-C^ fremstilledes på følgende måde:

Ren muse LDH-C4 reduceres og carboxymethyleres med iod-05 eddikesyre. Nedbrydning med trypsin. (4 vægt/vægtprocent) forløber i 4 timer i nærvær af 2M urinstof. Efter afsaltning på "Sepha-dex G-10" fraktioneres nedbrydningsproduktet på en "pBondapak C-|g" søjle (3,9 mm x 30 cm; Waters Associates) med en voksende acetonitrilgradient. Trifluoreddikesyre (0,04%) forefindes under hele 10 gradienten. Søjleeffluenten overvåges ved 214 nm, og fraktioner opsamles manuelt på grundlag af absorbanstoppe. Fraktioner tørres under en nitrogenstrøm og lyofiliseres for vand. Renhed vurderes i so krati sk i samme chromatografiske system, og peptider renses igen efter behov. Efter hydrolyse (6N HCI, 107°, 40 timer) bestemmes 15 aminosyresammensætninger ved reversfasechromatografi af o-pthalal-dehydderivater. Se Hiil et al. (1979), Anal. Chem. 41:1338-1341. Aminosyresekvenser blev bestemt ved manuel Édman-nedbrydning.

Se Tarr (1977) i Methods in Enzymology, Vol. 47, side 335-357, og Tarr (1981) Anal. Biochem. 111:27-32.

20 Et af de fraskilte rensede peptider betegnedes Peptid G-4 og havde en aminosyresekvens svarende til aminosyrerne 211-220 i nativ· muse LDH-C4« Peptid G-4 var sammensat af følgende aminosyrer (fra N-terminal til C-terminal): Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-lle-Gly-Thr-Asp-Lys.

25 Antistofbinding med peptid G-4 blev bestemt ved en fast ma- trixradioimmunoanalyseprocedure som beskrevet af Pierre et al.

(1976), J. Exp. Med. 144:1254-1262. Peptidet blev anbragt som belægning pi væggene af en polyvinylchloridmikrotiterplade ved inkubation natten over ved 4°C af en opløsning indeholdende 5 nmol 30 peptid i 100 μΙ 0,04M NaP04, 0,14M NaCI (PBS) i hver fordybning.

Hver fordybning vaskedes med 200 μΙ/fordybning .10% hesteserum i PBS og inkuberedes i samme opløsning i 1 time. Efter vask inkuberedes pladen med 50 μΙ af gammaglobulinfraktionen af sammenblandede kaninantimuse LDH-C. sera. Efter 4 timers inkubation vaske- ** 125 35 des pladen og inkuberedes derefter med 100 μΙ/fordybning I- gedeantikaningammaglobulin ved 4°C i 16 timer. Efter omfattende vask bestemtes bindingsradioaktivitet under anvendelse af en gammatæller.

8 1501A5

Det bestemte bindingsaktivitetsniveau for peptid G-4 er anført i nedenstående tabel A.

TABEL A 05

Niveau af peptidbinding til kaninantimuse LDH-C^ sera (2) (3)

Peptid Sekvensv J Antistofbinding (cpm)v G-4(1) 211-220 1706 10 (11 v J Ser-Leu-Asn-Pro-Ala-ile-Gly-Thr-Asp-Lys (21 v J i nativ muse LDH-C.

(31 4

Udtrykt i tælleværdier pr. minut (cpm) 15 De foranstående data viser, at peptid G-4 har højt antigenici- tetsniveau, som svarer til tilsvarende antigeniske områder i nativ LDH-C^. Den immunogene evne af peptid G-4 påvistes også ved konjugering af peptidet med okseserumalbumin som bærer og immunisering af kaniner med konjugatet til frembringelse af et anti-LDH-C^ 20 serum. Dette antiserum fandtes at være stærkt aktivt overfor nativ LDH-C^„ Hver kanin injiceret med G-4-konjugatet frembragte antistoffer, som var specifikke for nativ LDH-C^.