NO830241L - Antigenisk lineaere peptidforbindelser. - Google Patents

Abstract

Nye antigeniske peptidforbindelser omfatter sekvenser av aminosyrer som fremstilles syntetisk, men som antas å svare til sekvenser av enzymet LDH-C, som finnes i pattedyrsperma.. Disse forbindelser kan finne anvendelse i vaksiner for redusering av fruktbarheten hos pattedyr.

Description

Pattedyrspermatozoa har i mange år vært kjent for å være antigenisk. Nylig har det blitt vist at pattedyrsperma inneholder et antigenisk enzym, som er kjent som isozym av lactatdehydrogenase (LDH-X, LDH-C4). LDH-C4er blitt isolert i ren krystallinsk form fra musetestikler. Goldberg (1972)

J. Biol. Chem. 247:2044-2048. Enzymet har en molekylvekt på

140 000 og er sammensatt av fire idéntiské C underenheter. Aminosyrerekkefølgen og den tredimensjonale struktur av

LDH-C^er blitt undersøkt og delvis bestemt av et utåli forsk-ere. Se Musick et al (1976) J. Mol. Biol. 104:659-668 og Wheat et al (1977) Biochem.&Biophys. Res. Comm. , 74, No. 3:1066-1077. Wheat et al bestemte rekkefølgen av det essensielle thiolpeptid fra aminosyre 159 til 171, og fant denne

å være nærmest identisk med essensielle thiolpeptider fra andre LDH isozymer fra hvirveldyr.

I 1974 redegjorde dr. Erwin Goldberg for effekt av innvirkningen med LDH-X (LDH-C4) på fruktbarheten, og frem-satte den tanke at "ved å anvende en definert macromolekylær bestanddel av sperma blir det mulig å klarlegge dets primær-struktur uttrykt i aminosyrerekkefølgen, og kartlegge spesi-fikt de antigeniske determinanter som er ansvarlig for å fremkalle ufruktbarhet og deretter konstruere syntetiske peptider inneholdende disse determinater. Ved å være istand til å syntetisere et molekyl med slike egenskaper vil den immunologiske løsning av befruktningsreguleringen kunne være mulig." Karolinska Symposia on Research Methods in Reproduc-tive Endocrinology, 7th Symposia: Immunological Approaches to Fertility Control, Genev e, 1974 202-222 . Slike syntetiske, antigeniske peptider forble imidlertid et mål selvom deres teoretiske ønskelighet var erkjent. I 1979 oppsummerte dr. Erwin Goldberg teknikkens stand som følger: "Avslutningsvis, og av praktiske grunner krever immunoterapi for fødselskontroll mer enn effektivitet, spesifisitet, reversi-bilitet, og fravær av systemisk bireaksjon. Relativt store mengder av antigenet må være tilgjengelig i utvetydig ren form. Denne betingelse kan sannsynligvis ikke oppfylles av

et naturlig enzymantigenprodukt fra sperma eller testikler.

En befruktningshindrende teknologi krever et syntetiserbart peptidfragment som bibeholder antigenisitet og som fremkaller en respons som svekker befruktning. Fullførelse av den struk-turelle analyse av LDH-C^skulle kunne muliggjøre kartlegging av antigeniske determinanter og syntese av slike peptider for bruk i en ny befruktningshindrende teknologi".

"Recent advances in Reproduction and Regulation of Fertility," G.P. Talwar, editor, Elsevier/North Hoiland Biomedical Press

(1979).

Det er nå funnet at sterkt antigeniske peptider kan fremstilles ved syntetisering av lineære sekvenser av aminosyrer, hvilke sekvenser er antatt å svare til aminosyrerekke-følgen tilstedeværende i det naturlige enzym LDH-C^. Disse sekvenser innbefatter glutaminsyre-glutamin-leuciri-isoleucin-glutamin-aspargin-leucin-valin-prolin-glutaminsyre-aspartinsyre-iysin som er antatt å svare til de LDH-C^aminosyrene 5 til 16; isoleucin-serin-glycin-fenylalanin-prolin-valin-glycin-arginin, som er antatt å svare til LDH-C^aminosyrene 152 til 159; og serin-leucin-asparagin-prolin-alanin-isoleucin-glycin-threonin-aspartin^yre -lysin, som er antatt å svare til LDH-C4aminosyrene 211 til 220. Sekvens 152

til 159 svarer til den publiserte foreløpige kartlegging av LDH-C^, men sekvensene 5 til 16 og 211 til 220 gjør ikke det. Se Musick et al (August 25, 1979), J. Biol. Chem. 254, No. 16:7621-7623.

Forbindelser som utgjør de ovenfor identifiserte antigeniske sekvenser innbefatter følgende spesifikke forbindelser:

I de foregående formler ' angir bokgstaven "N" N-endeaminosyren, mens bokstaven "C" angir C-endeaminosyren.

Gly betegner glycin og Gly, Gin, Leu, Ile, Asn, Val, Pro,

Asp, Lys, Ser, Arg, Cys, Phe, Ala og Thr representerer L-aminosyref ornuene av glutaminsyre, glutamin, leucin, isoleucin, asparagin, valin, prolin, aspartihsyre, lysin, serin, arginin, cystein, fenylalanin, alanin, og threonin. Som det fremgår innbefatter forbindelsene (a) til (h) den 12 aminosyres"ekvens som starter méd glutaminsyre og ender med glycin, som er antatt å svare til aminosyrer 5 til 16 i LDH-C4. De ytterligere aminosyrer i forbindelser (b), (c) og (d) er antatt å svare til de neste aminosyrer i LDH-C^, dvs. nr. 16, 17 og 18. Forbindelse (d) vil derfor inneholde aminosyrene av sekvens 5 - 18. Forbindelsene (e) til (h) innbefatter de samme antigeniske sekvenser som forbindelser (a) til (e), mens cystein har blitt addert ved N-enden for å lette koplingen.av disse forbindelser til proteiner ved fremstilling av antigeniske vaksiner. På lignende måte inneholder forbindelse (n) den samme antigeniske sekvens som forbindelse (m) med det unntak at cystein er blitt addert til N-enden for samme., formål,

Forbindelser (i) til (e) innbefatter den 8 aminosyresekvens som starter med isoleucin og ender med valin. For forbindelse (j) er valin addert til C-enden for å virke son en avstandsaminosyre og derfor forøke immunogenisiteten. Dette vil bevege det antigeniske bindingssete ytterligere bort fra den fri carboxylgruppe. Alternativt eller i tillegg kan glycin adderes til N-~enden for å tjene som en avstandsaminosyre for å forbedre immunogenesiteten slik som det er tilveiebragt i henholdsvis forbindelsene (H) og (1)• Andre aminosyrer kan på lignende måte anvendes som avstandsaminosyrer ved endene av de ovenfor beskrevne antigeniske sekvenser. Som det vil fremgå for fagmannen innen immunologi, kan envidere andre C- og N-ende-aminosyrer substitueres samtidig som man bibeholder eller forøker antigenisiteten. Be foretrukne forbindelser er imidlertid de ovenfor angitte. Det er antatt at forbindelser (a) til (h) er særlig effektive.

Peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen kan syntetiseres fra deres aminosyrer. Eksempelvis kan syntesen utføres ved Merrifield fast-fasemetode, som beskrevet i J.A.C.S. 85:2149-2154 (1963). Denne fast-fase-metode for syntetisering av sekvenser av aminosyrer er også beskrevet i Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis (W.H. Freeman and Co., San Francisco, 196 9) side 1 - 4 . Ved denne prosedyre bindes C-endeaminosyren slik som lysin for . forbindelse (a) og (e) eller leucin for forbindelse (b) og (f), til klormethylert polystyren-divinylbenzen-copolymerperler. Hver etterfølgende aminosyre, med egnet beskyttende gruppe, adderes deretter i rekkefølge til den voksende kjedé. Som beskrevet i Merrifield artikkelen kan f.eks. den beskyttende gruppe være en carbobenz-oxygruppe. Ved kopling, avbeskyttelse og kopling av neste aminosyre kan den ønskede aminosyresekvens og kjedelengde produseres. Som sluttrinn fjernes den beskyttende gruppe fra N-endeaminosyren og C-endeaminosyren splittes av fra harpiksen, under anvendelse av et egnet reagens,slik som trifluoreddiksyre og hydrogenbromid. Forbindelser (a) til (n) som ovenfor beskrevet, fremstilles ved denne synteseprose-dyre for anvendelse ved reduksjon av fruktbarheten til pattedyr.

For anvendelse av de antigeniske peptider ifølge oppfinnelsen' i form av fruktbarhetsreduserende vaksiner, konju-geres peptidet til et bærermolekyl som fortrinnsvis ér et protein som i seg selv fremkaller en antigen respons og som trygt kan administreres. F.eks. kan peptidet koples til tetanustoxoid for administrering av intramuskulær-.. injeksjon.

■Eksempelvis gir en blanding av 1 ycromol tetanustoxoid, 60 y.cromol antigenisk peptid og 18 millimol l-ethyl-3- (3-di-methylaminopropyl) carbodiimid hydroklorid omsatt omsatt i vann (pH 6) i 12 timer ved romtemperatur og 24 timer ved 4°C et produkt inneholdende 3,5 mol peptid/mol tetanustoxoid. Overskudd av reaktanter kan fjernes ved dialyse eller gél-filterering. Se Pique et al, Immunochemistry, 15: 55-60 (1978). Alternativt kan peptidet koples under anvendelse av bisdiåzo-tisert benzidin (Bassiri et al, Endocrinoloqy, 90: 722 (1972)) eller glutaraldehyd.

I intramuskulær injeksjon kan det koplete peptid suspen-deres i en steril isotonisk saltløsning, eller annen konvensjonell bærer, og om ønsket kan et hjelpestoff være innbefattet.

I en foretrukket anvendelse av en slik vaksine er for administrering til kvinner. Antistoffer vil bli dannet, hvilke vil komme tilsyne i oviductvæskene og derved bevirke en signi-fikant reduksjon i fruktbarhet. For dette formål vil den mengde som skal administreres variere fra 1 til 10 mg av det antigeniske peptid.

Peptidforbindelsene ifølge oppfinnelsen og deres fremstilling er ytterligere illustrert i de etterfølgende eksempler.

Eksempel I

Fremstilling av lineært peptid Cys- Glu- Gln- Leu- Ile- Gln- Asn-Leu- Val- Pro- Glu- Asp- Lys

Syntesen av det ovenfor angitte peptid, heretter angitt som forbindelse (e) kan utføres under anvendelse av fast fase-teknikker som nå er vel kjent innen faget. Ved en foretrukket prosedyre koples aminobeskyttet lysin, som representerer -COOH endegruppen i det ovenfor angitte peptid, til en konvensjonell fast fase peptid-synteseharpiks slik som klormethylpolystyren tverrbundet med 1 til 2% divinylbenzen. Den aminobeskyttende gruppe fjernes deretter selektivt under anvendelse av et egnet reagens hvis natur vil avhenge av den anvendte beskyttende gruppe. I den foretrukne utførelsesform anvendes t-butyloxycarbonyl (Boe) gruppen for aminogruppebeskyttelse og 40% trifluoreddiksyre i methylenklorid er det selektive

avbeskyttelsesmiddel.

Etter avbeskyttelsen. behandles valin-harpiksen med beskyttet aspartinsyre, fortrinnsvis N-Boc-O-benzyl-aspartinsyre, og " dicyclohexylcarbodiimid på kjent måte for å danne en peptidbinding mellom den fri aminogruppe av lysinresten og carboxylgruppen av beskyttet aspartinsyre.

Syklusen med avbeskyttelse og kopling med aminosyre-derivater og dicyclohexylcarbodiimid gjentas deretter med resten av aminosyrene i den rekkefølge som i det ovenfor angitte peptid. Enkelte av aminosyrene krevet sidekjede-blokkerende grupper ved siden av a-amino beskyttelsen.

Slike aminosyrer og de blokkerende grupper er som følger:

Cys(MBzl), Glu(oBzl), Asp(oBzl), Lys(Cl-z) hvori-oBzl er benzyl, Cl-z

er o-klorbenzyloxycarbonyl og MBzl er methoxybenzyl.

Fullførelse av syntesen ga følgende peptid koplet til styrendivinylbenzen-copolymerharpiks: TFA-Cys(MBzl)Glu(oBzl)-Gln-Leu-Ile-Gln-Asn-Leu-Val-Pro-Glu(oBzl)-Asp(oBzl)-Lys(Cl-z)-Res.

Avkopling av peptidet fra harpiksen utføres ved behandling med væskeformig hydrogenfluorid med ledsagende splitt-

ing av alle beskyttende grupper under dannelse av det ønsk-

ede peptid.

East- f, asesyntese av N- Bpc- Lys, ( Cl- z) harpiks

Binding av N-Boc-Lys(Cl-Z) til klormethylharpiksen ble utført ved cesiumsaltmetoden. En prøve av klormethylharpiksen

(200 g) inneholdende 0,74 mmol klorid pr. gram ble behandlet

med cesiumsalt av Boc-Lys-(Cl-z) resulterende fra nøytralis-ering av Boc-Lysin med cesiumcarbonat. Ca. 73,8 g Boc-Lysin ble løst i 80% methanol og 20% vann og justert til pH 7,0

med ca. 2 9 g ceciumcarbonat. Den resulterende løsning ble tørket på en rotasjonsfordamper, ble deretter tørket ytterligere tre ganger etter tre tilsetninger av 100 milliliter xylen. Til cesiumsaltet av Boc-Lys(Cl-z) ble tilsatt 200 g klormethylharpiks som ovenfor angitt og tilstrekkelig l-methyl-2-pyrrolidinon til et totalvolum på 1,90 liter.

Den resulterende blanding ble omrørt ved 55°C i 48 timer. Harpiksen ble deretter vasket grundig med methanol, deretter med vann og igjen med methanol. Harpiksen ble lufttørket og deretter tørket under vakuum. Etter splitting av lysin fra harpiksen med HF, ga aminosyreanalyse en topp svarende til 0,36 mmol/gm.

En prøve av den beskrevne harpiks (6,0 g) ble underkastet følgende synteseplan:

(1) vaske med tre 100 ml.porsjoner av methylenklorid:

(2) fjern Boc-gruppen med 40% TFA i methylenklorid i 1 min. vaskeperiodé-og 2 0 min. • reaksjonstid; (3) vask med tre 100 ml porsjoner : methylenklorid; (4) vask med to 100 ml porsjoner isopropanol; (5) vask' med tre 100 ml porsjoner methylenklorid; (6) 1 min. vask og 10 min. nøytralisering med 100 ml porsjoner av<10%>triethylamin i methylenklorid; (7) vask med tre porsjoner av 100 ml methylenklorid; (8) tilsett 2,5 ekvivalenter (7,2 mmol) Boc-aminosyre og 2,5 ekvivalenter (7,2 mmol) dicyclohexylcarbodiimid i methylenklorid og rist i 2 timer; (9) vaske med tre 100 ml porsjoner methylenklorid; (10) vask med to 100 ml porsjoner isopropanol;

(11) vask., med tre 100 ml porsjoner methylenklorid.

Den ovenfor angitte syklus ble gjentatt for de etterfølgende N-beskyttede aminosyrer:

Boe-Arg(Tos)

Boc-Gly

Boc-Val

Boc-Pro

Boc-Phe

Boc-Gly

Boc-Ser(oBZl)

Boc-Ile

Boc-Gly

Den beskyttede peptidharpiks ble underkastet avbeskyttelse under dannelse av TFA saltet av den beskyttede peptidharpiks. Den tørrende harpiks ble omrørt i nærvær av 6 ml anisol og

60 ml væskeformig HF ved 0°C i 1 time. HF ble fjernet under vakuum og det oljeaktige residuum ble vasket med to 50 ml porsjoner ethylether. Peptidet ble ekstrahert fra harpiksen med tre 50 ml porsjoner 1 molar eddiksyre og de kombinerte filtrater ble lyofilisert under dannelse av 8,66 g urent peptid. En prøve (1,5 g) ble renset ved 250 overføringer i en mostrømsfordelingsapparatur og gjenvinninga av-.egnede fraksjoner ga 0,994 g meget godt renset peptid. Løsnings-middelsystemet for den ovenfor angitte fraksjonering var butanol: eddiksyre: vann i forhold på 4:1:5.

Aminosyreanalyse av peptidet etter syrehydrolyse ga:.

<Arg>1.00'<Ser>1.03'<Pro>1.01'<G1>^3.05'<V>al2.08'<I>le0.98'<Phe>1.03. Peptidet ga enkle flekker i to systemer med silicagel tynn-skikts kromatografi. Disse systemer var det øvre lag av butanol: eddiksyre: vann i forholdet 4:1:5 og systemet kloroform: methanol: vann i forholdet 60:30:5. R f verdien for peptidet i de to systemer var 0,2 0 og 0,32. På papirelektroforese ga peptidet en enkel flekkvandring til katoden med med R^sammenlignet med picrinsyre på 0,54. Elektroforese-betingelser var Whatman 3MM papir med pryridin-acetatbuffer ved pH 5,6.

Forbindelser (a) til (d) og (f) til (h) inneholdende

den samme antigeniske sekvens som forbindelser (e) ble fremstilt på samme måte ogkarakterisertpå samme måte.

Eksempel II

Fremstilling av lineært peptid

Gly- Ile- Ser- Gly- Phe- Pro- Val- Gly- Arg- Val

Syntese av de ovenfor angitte peptid heretter angitt som forbindelse (iJ kan utføres under anvendelse fast faseteknikker som nå er vel kjent innen faget. Ved en foretrukket prosedyre koples aminobeskyttet valin, representerende -G00H endegruppen av det ovenfor angitte peptid til en konvensjonell fast fase-peptidsynteseharpiks slik som klormethylpolystyren tverrbundet med 1 til 2% divinylbenzen. Den aminobeskyttende gruppe fjernes deretter selektivt under anvendelse av et egnet reagens hvis natur vil være avhengig av den anvendte beskyttende gruppe. I den foretrukne utførelsesform anvendes t-butyloxycarbonyl (Boe) gruppen for aminogruppebe-skytteise og 40% trifluoreddiksyre i methylenklorid er det selektive avbeskyttelsesmiddel.

Etter avbeskyttelsen behandles valin-harpiksen med beskyttet arginin, fortrinnsvis N-Boc-N -tosylarginin og dicyclohexylcarbodiimid på kjent måte under dannelse av en peptidbinding mellom den fri aminogruppe i valinresten og carboxylgruppen i det beskyttede ariginin.

Syklusen med avbeskyttelse og kopling med aminosyre-derivater og dicyclohexylcarbodiimid gjentas deretter med resten av aminosyrene i samme rekkefølge som i det ovenfor angitte peptid. Enkelte av aminosyrene krevet sidekjede-blokkerende grupper ved siden av a-aminobeskyttelsen. Slike aminosyrer og de blokkerende grupper '"er som følger: Ser(oBzl) og Arg(Tos) hvor oBzl er benzyl og Tos er guanidino-p-toluensulfonyl.

Fullførelsen av syntesen ga følgende decapeptid

koplet til styrendivinylbenzen-copolymerharpiksen:

TFA Gly-Ile-Ser-(oBzl)-Gly-Phe-Pro-Val-Gly-Arg(Tos)-Val-harpiks.

Avkopling av peptidet fra harpiksen utføres ved med væskeformig hydrogenfluorid med ledsagende splitting av alle beskyttende grupper under dannelse av det ønskede peptid.

Fast fase-syntese av Gly- Ile- Ser- Gly- Phe- Pro- Val- Gly-Arg- Val

N- Boc- Val- harpiks

Binding av N-Boc-Valin til klormethylharpiks. ble ut-ført ved cesiumsalt metoden. En prøve av klormethylharpiks (200 g) inneholdende 0,74 mmol klorid pr. g ble behandlet med cesiumsaltet av Boc-Valin resulterende fra nøytraliser-ing av Boc-Valin med cesiumcarbonat. Ca. 38,6 g Boc-Valin ble løst i 80% methanol og 20% vann og ble-justert til pH 7,0 med ca. 2 9 g cesiumcarbonat. Den resulterende løsning ble tørket på en rotasjonsfordamper, ble deretter tørket ytterligere tre ganger etter tre tilsetninger av 100 imi xylen. Til cesiumsaltet Boc-Valin ble tilsatt 200 g klormethylharpiks som ovenfor angitt og tilstrekkelig l-methyl-2-pyrro-lidinon til et totalvolum på 1,90 1. Den resulterende blanding ble omrørt ved 55°C i 48 timer. Harpiksen ble deretter vasket grundig med methanol, deretter med vann og igjen med methanol. Harpiksen ble lufttørket og' deretter tørket under vakuum. Etter splitting av valin fra harpiksen med HF ga aminosyreanalyse en topp svarende til 0,48 mmol/gm.

En prøve av den beskrevne harpiks (6,0 g) ble underkastet følgende synteseplan: (1) vask med tre 100 ml porsjoner methylenklorid; (2) fjerning av Boc-gruppen med 4 9% TFA i methylenklorid i 1 min. vaskeperiode og 20. min. reaksjonstid; (3) vask med tre 100 ml porsjoner med methylenklorid; (4) vask med to 100 ml porsjoner isopropanol; (5) vask med tre 100 ml porsjoner methylenklorid; (6) 1 min. vask og 10 min. nøytralisering med 100 ml porsjoner med 10% triethylamin i methylenklorid; (7) vask med tre porsjoner av 100 ml methylenklorid; (8) tilsett 2,5 ekvivalenter (7,2 mmol) av Boc-aminosyre og 2,5 ekvivalenter (7,2 mmol) dicyclohexylcarbodimid i methylenklorid og rist i 2 timer;

(9) vaske med tre 100 ml porsjoner med methylenklorid; (10) vask med to 100 ml porsjoner isopropanol; (11) vask med tre'100.ml porsjoner med methylenklorid. Den ovenfor angitte syklus ble gjentatt for følgende N-beskyttede aminosyrer.:

Den beskyttede peptidharpiks ble underkastet avbeskyttelse under dannelse av TFA-saltet av den beskyttede peptidharpiks. Den tørrede harpiks (5,88 g) ble omrørt i nærvær av 6 ml anisol og 60 ml væskeformig HF ved 0°C i 1 time. HF ble fjernet med vakuum og.det oljeaktige residuum ble vaskeé"med to 50 ml porsjoner méthylether. Peptidet ble ekstrahert fra harpiksen med tre 50 ml porsjoner 1 molar eddiksyre, og kombinerte filtrater ble lyofilisert under dannelse av 2,27 g urent peptid. Dette ble renset ved 250 overføringer i en motstrømsfordelingsapparatur. Løsnings-middelsystemet for den ovenfor angitte fraksjonering var butanol: eddiksyre: vann ved forhold på 4:1:5.

Delvis rensede fraksjoner fra motstrømsfordelings-apparaturen ble ytterligere renset ved kolonnekromatografi på diethylaminoethylcellulose med en lineær gradient på

0,01 til 0,5 molar ammoniumbicarbonat under dannelse av 356 mg ren peptid.

Aminosyreanalyse av det rene peptid etter syrehydrolyse ga: Lyslf02, ammoniak2^87, Asp2/16, Glu^82,<Pr>o0>96, Cys^85,<Val>0,97'<Ile>0,79'<LeU>l,85'

Dette peptid ga en enkel flekk med en Rf på 0,89

ved cellulosetynnskiktskromatografi med et løsningsmiddel-system av butanol: ethylacetat: eddiksyre: vann på 1:1:1.

Forbindelser (i) til (k) inneholdende den samme antigeniske sekvens som forbindelse (1) ble fremstilt på samme måte ogkarakterisertpå samme måte.

Eksempel III

Fremstilling av lineær peptid

Cys- Ser- Leu- Asn- Pro- Ala- Ile- Gly- Thr- Asp- Lys

Syntese av det ovenfor angitte peptid, heretter angitt som forbindelse (n) kan utføres under anvendelse av fast faseteknikker som nå er vel kjent innen faget. Ved en foretrukket prosedyre koples aminobeskyttet lysin, representerende -COOH endegruppen av det ovenfor angitte peptid, til en konvensjonell fast-peptidsynteseharpiks slik som klormethylpolystyren tverrbundet med 1 til 2% divinylbenzen. Den aminobeskyttende gruppe fjernes deretter selektivt under anvendelse av egnet reagens hvis natur vil avhenge av den anvendte beskyttende gruppe. I en foretrukket utførelses-form anvendes t-butyloxycarbonyl (Boe) gruppen for aminogruppe beskyttelse og 40% trifluoreddiksyre i methylenklorid er det selektive avbeskyttelsesmiddel.

Etter avbeskyttelsen behandles lysin med beskyttet aspartinsyre, fortrinnsvis N-Boc-O-Benzylaspartinsyre, og dicyclohexylcarbodiimid på kjent måte for å danne en peptidbinding mellom den fri aminogruppe i lysinresten og carboxylgruppen i den beskyttende aspartinsyre.

Syklusen med avbeskyttelse og kopling med aminosyre-derivater og dicyclohexylcarbodiimid gjentas deretter med resten av aminosyrene i samme rekkefølge som i det ovenfor angitte peptid. Enkelte av aminosyrene krever sidekjede blokkert med grupper ved siden av a-aminobeskyttelsen. Slike aminosyrer og de blokkerende grupper er som følger:

Cys(MBzl)

Ser-(oBzl) Thr(oBzl) Asp(oBzl) Lys(Cl-z) hvori

oBzl er benzyl og MBzl er p-methoxybenzyl og Cl-z er 0- klorbenzyloxycarbony1.

Fullførelse av syntesen ga følgende decapeptid koplet til styrendivinylbenzen-copolymerharpiksen: TFA-Cys(MBzl)Ser-(oBzl)-Leu-Asn-Pro-Ala-Ile-Gly-Thr (oBzl)-Asp(oBzl)-Lys(Cl-z)harpiks.

Avkopling av peptidet fra harpiksen ble utført ved behandling med væskeformig hydrogenfluorid med ledsagende splitting av alle beskyttende grupper under dannelse av det ønskede peptid.

Fast fasesyntese av

Cys(MBzl)-Ser(oBzl)-Leu-Asn-Pro-Ala-Ile-Gly-Thr(oBzl)Asp(oBzl)-Lys(Cl-z)harpiks.

Binding av N-Boc-Lys(Cl-z) til klormethylharpiks ble

.utført ved cesiumsaltmetoden. En prøve av klormethylharpiks (200 g) inneholdende 0,74 mmol klor pr. g behandlet med cesiumsaltet av Boc-Lysin resulterende fra nøytralisering av N-Boc-Lys(Cl-z) med cesiumcarbonat. Ca. 73,8 g N-Boc-Lys(Cl-z) bie løst i 80% methanol og 20% vann og justert til pH 7,0

med ca. 29 g cesiumcarbonat. Den resulterende løsning ble tørket på en rotasjonsfordamper, ble deretter tørket . ytterligere tre ganger etter tre tilsetninger av 100 ml xylen. Til cesiumsaltet av N-Boc-Lys(Cl-z) ble tilsatt 200 g klormethylharpiks som ovenfor angitt, og tilstrekkelig 1- methyl-2-pyrrolidinon til et totalvolum på 1,90 liter.

Den resulterende blanding ble omrørt ved 55°C i 48 timer. Harpiksen ble deretter vasket grundig med methanol, deretter med vann og igjen med methanol. Harpiksen ble lufttørket og deretter tørket under vakuum. Etter splitting av lysin fra harpiksen med HF ga aminosyreanalyse en topp svarende til o,36 mmol/gm.

En prøve av den beskrevne harpiks (5,5 g) ble underkastet følgende synteseplan: (1) vask med tre 100 ml porsjoner methylenklorid; (2) fjern Boc-gruppen med 40% TFA i methylenklorid i 1 min. vaskeperiode og 20 min. reaksjonsperiode; (3) vask med tre 100 ml porsjoner med methylenklorid; (4) vask med to 100 ml porsjoner isopropanol; (5) vask med tre 100 ml porsjoner med methylenklorid; (6) 1 min. vask og 10. min nøytralisering med 100 ml porsjoner 10% triethylamin i methylenklorid; (7) vask med tre porsjoner 100 ml methylenklorid; (8) tilsett 2,5 ekvivalenter (7,2 mmol) Boc-aminbsyre og 2,5 ekvivalenter (7,2 mmol)' dicyclohexylcarbodiimid i méthyleriklorid og rist i 2 timer; (<y>) vask med tre 100 ml porsjoner methylenklorid; (10) vask med to 100 ml porsjoner isopropanol;

(11) vask tre 100 ml porsjoner methylenklorid.

Den ovenfor angitte syklus ble gjentatt for følgende N-beskyttede aminosyrer:

Boe- Asp(oBzl) Boc-Leu

Boc-Thr(oBzl) Boc-Ser(oBzl)

Boc-Gly Boc-Cys(MBzl)

Boe-Ile

Boc-Ala

Boc-Pro

Boc-Asn

Den beskyttede peptidharpiks ble underkastet avbeskyttelse undér dannelse av TFA-saltet av den beskyttede peptidharpiks. Endel av den tørkede harpiks (6 g) ble omrørt i nærvær av

6 ml anisol og 60 ml- væskeformig HF ved 0°C i en time. HF

ble fjernet ved vakuum og det oljeaktige residuum ble vasket med to 50 ml porsjoner ethylether. Peptidet ble ekstrahert fra harpiksen med tre 50 ml porsjoner 1 molar eddiksyre, og de kombinerte filtrater ble lyofilisert.

Peptidet ble dimerisert ved.omrøring av en løsning

i vann ved pH 9,0 i 3 dager i nærvær av luft. Det ble deretter lyofilisert og underkastet en motstrømsfordeling i systemet.

0,1% eddiksyre: butanol:pyridin i forhold 11:5:3.

De reneste fraksjoner ble ytterligere renset ved kolonnekromatografi på carboxymethylcellulose under anvendelse av en gradient av ammoniumbicarbonat på fra 0,01 molar til 0,2 molar. De reneste fraksjoner ble underkastet kolonnekromatografi på diethylaminoethylcellulose under anvendelse av en ammoniumbicarbonatgradient . fra 0,01 til 0,05 molar. Det rene peptid ble lyofilisert under dannelse av 77 mg.

Aminosyreanalyse av peptidet etter hydrolyse ga: Lysin^ ^, ammonium^ 8(-, aspartinsyre^ ^.g, threonin^ £2's^r:'-nQ,96/ prolinl,o'glycinl,00'alanini/07'cystein0,98'isoleUcin0,86' og leucin^92.

Tynnskiktskromatografi på cellulose i butanol: ethylacetat: eddiksyre: vann i et forhold på 1:1:1:1 ga en R f på 0,64

med en. mindre øvre flekk. Ved tynnskiktskromatografi på cellulose med butanol:pyridin: eddiksyre: vann i et forhold på 15:10:3:12 ble det erholdt en R^på 0,45 også. med en mindre øvre flekk. Papirelektroforese på Whatman 3MM papir med pyridinacetatbuffer ved pH 6,4 viste en enkel flekk ved nøytral posisjon, R^ 0,20 i forhold til picrinsyre.

Forbindelse (m) inneholdende den samme antigeniske sekvens som forbindelse (n) ble fremstilt på samme måte ogkarakterisertpå samme måte.

Claims (7)

1. De antigeniske peptidforbindelser anordnet i en rekke-følge fra N til C av aminosyrer valgt fra klassen bestående av:

hvori Gly betegner glycin og Glu, Gin, Leu, Ile, Asn, Val, Pro, Asp, Lys, Ser, Arg, Cys, Phe, Ala, og Thr betegner L-aminosyreformene av glutaminsyre, glutamin7 leucin, isoleucin, asparagin, valin, prolin, aspartinsyre, lysin, serin, arginin, cycstein, fenylalanin, alanin og threonin.

2. Peptidforbindelser (a) til (h) ifølge krav 1, karakterisert ved at de innbefatter 12 aminosyresekvensen av (a).

3. Peptidforbindelser (é) ifølge krav 1.

4. Peptidforbindelser (i) .til (1) ifølge krav 1, karakterisert ved at de innbefatter 8 aminosyresekvensen av (i).

5. Peptidforbindelsen (1) ifølge krav 1.

6. Peptidforbindelsene (m) og (n) ifølge krav 1.

7. Peptidforbindelsen (n) ifølge krav 1.