DK159856B - Humaninsulinderivater og farmaceutiske praeparater, som indeholder disse derivater - Google Patents

Description

i

DK 159856 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte humaninsul inderivater og insulinpræparater, som har protraheret virkning, og som indeholder mindst et af de hidtil ukendte 5 humaninsulinderivater og, om ønsket, et andet insulin.

I alvorlige eller kroniske stadier behandles sygdommen diabetes sædvanligvis med injektionspræparater, som indeholder insulin, f.eks. svineinsulin, okseinsulin eller humaninsulin.

10 Opløselige insulinpræparater er sædvanligvis hurtigt virkende, men til gengæld ophører virkningen efter få timer. Det er derfor nødvendigt at give hyppige injektioner, normalt adskillige gange i døgnet.

For at overvinde denne ulempe har man · formuleret 15 insulinpræparater med protraheret virkning således, at virkningen opretholdes i adskillige timer eller endog op til 24 timer eller længere. Ved anvendelse af sådanne præparater med protraheret virkning kan nogle diabetespatienter nøjes med et lille antal injektioner, 20 f.eks. en enkelt eller to injektioner i løbet af 24 timer.

En sådan protraheret virkning kan opnås ved at omdanne insulinet til et tungtopløseligt salt, såsom zinkinsulin eller protamininsulin. De tungtopløselige insulinsalte anvendes i form af suspensioner, hvorfra insulinet gradvis 25 opløses, f.eks. efter subkutan injektion.

I den senere tid er andre metoder blevet anvendt til opnåelse af en protraheret virkning. Et eksempel herpå er indkapsling af insulinkrystaller i polymeriseret serumalbumin. Et andet eksempel er kontinuerligt virkende 30 doseringsapparater, såkaldte insulinpumper, som imidlertid kan være ukomfortable og indebære en risiko for patienten.

2

DK 159856 B

Insuliner, som almindeligvis anvendes i diabetesbehandlingen, såsom svine-, okse-, fåre- og humaninsulin, indeholder alle seks frie carboxylgrupper, nemlig i A4-, 5 A17-, A21-, B13-, B21- og B30-aminosyreresterne. Nummere ringen refererer til stillingerne i henholdsvis A- og B-kæden i insulin, startende fra N-terminalerne. Insulins biologiske virkning aftager sædvanligvis med stigende derivateriseringsgrad. Den biologiske virkning påvirkes 10 imidlertid overraskende lidt selv ved høje derivaterise-ringsgrader af de fri carboxylgrupper, men når alle seks frie carboxylgrupper er derivateriserede forsvinder den biologiske aktivitet dog fuldstændigt, jf. D. Levy: Biochem. Biophys. Acta, 310 (1973), side 406-415.

15 Fra beskrivelserne til DK-patentansøgning nr. 3582/84, nr. 3583/84 og nr. 3757/84 er det kendt at fremstille og anvende insulinderivater, hvor B-kædens C-terminal er forlænget med en organisk gruppe, som bærer mindst én positiv ladning, fortrinsvis Arg-OH eller Arg-Arg-OH.

20 Suspensionspræparater, som indeholder sådanne insulinderivater, udviser en protraheret virkning.

De foretrukne fremgangsmåder til fremstilling af de fra beskrivelsen til DK-patentansøgning nr. 3582/84 kendte insulinderivater i industriel målestok indebærer 25 imidlertid anvendelse af trypsinlignende enzymer, hvilket medfører, at de færdige præparater kan være kontamineret med enzymaktivitet, jf. fremstillingseksemplerne i beskrivelsen til DK-patentansøgning nr. 3757/84. Den protraherede virkning med de ovenfor omtalte 30 insulinderivater, hvor B-kædens C-terminal er forlænget med en organisk gruppe, som bærer mindst ei positiv ladning, skyldes udelukkende forlængelsen af B-kæden. Den forlængede B-kæde er imidlertid følsom over for enzymer, som spalter B-kæden, især ved B29-lysin, og den 35 protraherede virkning kan derfor ophæves. Denne enzymatiske spaltning kan også finde sted efter subkutan

DK 159856 B

3 injektion som anført i beskrivelsen til DK-patentansøgning nr. 3583/84, side 15, linie 18. Som følge af den enzymatiske virkning kan den protraherede virkning ved 5 præparater, som indeholder de ovenfor beskrevne insulinderivater, hvori B-kædens C-terminal er forlænget med en organisk gruppe, der bærer mindst én positiv ladning, variere betydeligt.

Det har nu overraskende vist sig, at man ved anvendelse af 10 humaninsulinderivater, hvori carboxylgruppen i en eller flere af de fire glutaminsyrerester i stillingerne A4, A17, B13 og B21 foreligger som methylester eller amid eller hvor en eller flere af disse glutaminsyrerester er erstattet med Ala, Thr eller Val, idet dog B13 er forskel-15 lig fra en glutaminrest, når derivatisering kun forekommer i B13-positionen, i insulinpræparater, især injektionspræparater, opnår en stabil og ønskelig langvarig protraheret virkning.

Med insulinpræparaterne ifølge opfindelsen kan man opret-20 holde insulinaktiviteten og samtidig opnå en overraskende stabil protraheret virkning. Denne protraherede virkning afhænger af egenskaberne af det specifikke derivat, f.eks. antallet af aminosyrerester, som indeholder en uladet sidekæde, og den kemiske sammensætning af den uladede 25 sidekæde. Det er således muligt at variere den protraherede virkning efter ønske. Det er en betydelig fordel og en ny egenskab ved insulinderivaterne ifølge opfindelsen, at den protraherede virkning er relativ ufølsom over for trypsinlignende aktivitet, uanset hvor denne trypsin-30 lignende aktivitet stammer fra, da B-kædens C-terminal ikke er forlænget, som det er tilfældet med de kendte insulinderivater.

I overensstemmelse hermed er humaninsulinderivaterne ifølge opfindelsen ejendommelige ved, at carboxylgruppen i 35 en eller flere af de fire glutaminsyrerester i positionerne A4, A17, B13 og B21 foreligger som methyl-

DK 159856 B

* 4 ester eller amid, eller at en eller flere af disse glutaminsyrerester er erstattet med Ala, Thr eller Val, idet dog B13 er forskellig fra en glutaminrest, når 5 derivatisering kun forekommer i B13-positionen.

Opfindelsen angår især humaninsulinderivater, som er ejendommelige ved, at carboxylgruppen i en eller to af de fire glutaminsyrerester i positionerne A4, A17, B13 og B21 foreligger som methylester eller amid, eller at en eller 10 to af disse glutaminsyrerester er erstattet med Ala, Thr eller Val, idet dog B13 er forskellig fra en glutaminrest, når derivatisering kun forekommer i B13-positionen.

Opfindelsen angår specielt humaninsulinderivater, som er 15 ejendommelige ved, at to af de fire glutaminsyrerester i positionerne A4, A17, B13 og B21 er erstattet med Ala, Thr eller Val.

Opfindelsen angår specielt humaninsulinderivater, som er ejendommelige ved, at carboxylgruppen i de to glutamin-20 syrerester i positionerne A4 og B21 begge foreligger som amid.

Opfindelsen angår specielt insulinderivater, hvori aminosyreresten i stilling B21 indeholder en uladet sidekæde.

25 Opfindelsen angår specielt insulinderivater, hvori carboxylgruppen i aminosyreresten i stilling A4 foreligger som amid.

Opfindelsen angår specielt insulinderivater, hvori carboxylgruppen i aminosyreresten i stilling B21 30 foreligger som amid.

Insulinpræparatet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder mindst ét humaninsulinderivat, hvor 5

DK 159856 B

carboxylgruppen i en eller flere af de fire glutamin-syrerester i positionerne A4, A17, B13 og B21 foreligger som methylester eller amid, eller at en eller flere af 5 disse glutaminsyrerester er erstattet med Ala, Thr eller Val, idet dog B13 er forskellig fra en glutaminrest, når derivatisering kun forekommer i B13-positionen, og, om ønsket, tillige et andet insulin med hurtigt indtrædende virkning.

10 En særlig fordelagtig udførelsesform for insulinpræparatet ifølge opfindelsen er et injektionspræparat, som indeholder en suspension af mindst et humaninsulinderivat ifølge opfindelsen i et isotonisk vandigt medium med pH-værdi i neutralområdet, og endvidere eventuelt 15 indeholder en puffer og/eller et konserveringsmiddel, og, om ønsket, et insulin eller insulinderivat med hurtigt indtrædende virkning.

I tilfælde af insulinafhængig diabetes består en ofte anvendt behandlingsform i to daglige injektioner af et 20 insulinpræparat med protraheret virkning, en injektion om morgenen og en om aftenen umiddelbart før sengetid, for at tilvejebringe en insulingrundkoncentration. Desuden indgives tre injektioner af et hurtigt virkende isulinpræparat før hovedmåltiderne. Ulempen ved denne 25 behandling er, at den sene injektion af det protraherede præparat kan bevirke en farlig lav glucosekoncentration i blodet i løbet af natten. Dette kan undgås ved at injicere et blandingspræparat af et protraheret og et hurtigt virkende insulin inden aftensmåltidet, hvorved 30 hypoglykæmi, såfremt det måtte forekomme, vil optræde i løbet af aftenen, hvorved det kan afbødes ved hjælp af et lille let mellemmåltid. Imidlertid vil denne behandlingsform ofte fremkalde hyperglykæmi om morgenen, da de mest anvendte insulinpræparater med protraheret 35 virkning, f.eks. "Insulatard"®, ikke har tilstrækkelig langvarig virkning til at undgå dette. Der er derfor et 6

DK 159856 B

behov for at forsyne diabetespatienten med insulinpræparater, som har længere virkning end de almindeligt anvendte præparater, især hvis en injektion af sådanne 5 præparater vil være tilstrækkelig til en eller endog flere dage. Humaninsulinderivatet ifølge opfindelsen fremkalder en protraheret insulinvirkning af længere varighed, end det er tilfældet med det almindeligt anvendte protraherede insulinpræparat "Insulatard"®, der indeholder protamin som 10 protraherende princip.

Opfindelsen angår især nedenstående specifikke forbindelser: (A4-gln)-humaninsulin (Al7-gin)-humaninsulin 15 (B21-gln)-humaninsulin humaninsu1in-Al7-methylester humaninsulin-B21-methylester (A4,Al7-gin)-humaninsulin (A4,B13-gln)-humaninsulin 20 (A4,B21-gln)-humaninsulin (Al7,B21-gln)-humaninsulin Når insulinpræparaterne ifølge opfindelsen indeholder et hurtigt virkende insulin, kan dette insulin eksempelvis være humaninsulin eller svineinsulin.

25 Humaninsulinderivaterne ifølge opfindelsen kan fremstilles på i og for sig kendt måde til omdannelse af en carboxylgruppe til en uladet gruppe, f.eks. ved esteri-ficering eller amidering. Således kan et insulinderivat, hvori en eller flere af carboxylgrupperne i stillingerne 30 A4, A17, B13 og B21 er methylerede, fremstilles ved f.eks.

at omsætte humaninsulin-B30-methylester i bortrifluorid/ methanol i et passende tidsrum, hvorpå de modificerede insulinderivater fraktioneres på en anionbytterkolonne ved svagt basisk pH-værdi. Produkterne fraktioneres og isole- 7

DK 159856 B

res ved præparativ HPLC, hvorpå B30-methylestergruppen fjernes ved forsigtig hydrolyse i en iskold 0,1 N natriumhydroxidopløsning.

5 Fremstillingen af humaninsulinderivaterne ifølge opfindelsen kan gennemføres under anvendelse af bioteknologiske fremgangsmåder. Nogle eller alle glutaminsyrerne i disse stillinger kan således erstattes med naturligt forekommende aminosyrer, som bærer en uladet 10 sidekæde, såsom glutamin.

Den foretrukne fremgangsmåde til fremstilling af disse modificerede insuliner er ved biosyntese, idet man ved ændring af blot en enkel base i det kodon i DNA-strengen, som koder for glutaminsyre, kan få dette kodon til at kode 15 for glutamin. Ved at ændre baser i DNA-strengen, som koder for insulin (eller proinsulin), er det således muligt at foretage modifikationer, som ville være vanskelige eller umulige at foretage ad kemisk vej på grund af begrænsninger med hensyn til isolering.

20 Der findes mange forskellige fremgangsmåder til fremstilling af humaninsulin ved biosyntese. Fælles for dem alle er, at DNA-strengen, der koder for enten hele proinsulinet, en modificeret form deraf eller A- og B-kæden hver for sig, indsættes i et ekspressionsplasmid, 25 som indeholder en egnet promotor. Ved transformation af dette system til en given værtsorganisme kan man fremstille et produkt, som kan omdannes til autentisk humaninsulin på kendt måde.

I det følgende beskrives nogle kendte metoder til 30 biosyntese af proinsulin eller A- og B-kæden og deres omdannelse til insulin.

Ved den velkendte Genentech-fremgangsmåde foretages intracellulær fremstilling af polypeptider i Escherichia 8

DK 159856 B

coli, hvor disse polypeptider er en fusion mellem 0-galactosidase og henholdsvis A- og B-kæden for insulin. Efter fermenteringen isoleres de to produkter, A- og 5 B-kæderne spaltes fra β-galactosidase med cyanogenbromid, hvorpå de sulfiterede kæder kombineres under reducerende betingelser i nærværelse af dithiothreitol ved en pH-værdi på 10,5. Til slut isoleres humaninsulin fra denne reaktionsblanding.

10 Ved fremgangsmåden beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 55.945 fremstilles produktet som et fusionsprotein med et andet protein adskilt af et spaltningssted. Dette kan være et proteasespaltningssted eller er sted, som spaltes kemisk (f.eks. methionin).

15 Genet for proinsulin klones eksempelvis som en genfusion med et andet protein ved hjælp af rekombinant-DNA-teknikker. Efter isolering af det kimære protein spaltes dette ved anvendelse af et egnet enzym eller CNBr, hvorpå det denaturerede proinsulin isoleres på en sulfiteret form.

20 Dette prdukt renatureres under reducerende betingelser med Ø-mercaptoethanol ved en pH-værdi på 10,5 som beskrevet af Frank, hvorpå der foretages spaltning med trypsin/CpB som beskrevet af Kemmler (1971). Det dannede insulin isoleres på kendt måde.

25 Endelig kan proinsulin fremstilles biosyntetisk ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 116.201. Ved denne fremgangsmåde uskilles proteiner til dyrkningsmediet ved anvendelse af a-faktorsysternet fra Saccharomyces 30 cerevisiae. Ved at indsætte genet for proinsulin i dette system kan proinsulin isoleres fra dyrkningsmediet ved anvendelse af systemet beskrevet i beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 3091/84. Herefter kan proinsulin omdannes til insulin ved de kendte metoder beskrevet 35 ovenfor.

9

DK 159856 B

Ved de ovenfor omtalte fremgangsmåder er produktet enten proinsulin eller A- og B-kæden hver for sig. Endvidere fremstilles disse produkter enten sammen med en 5 signal sekvens, der liar til formål at transportere produktet ud til celleoverfladen, hvor det spaltes, eller som en fusion med et protein, der skal stabilisere produktet.

Det er endvidere muligt at fremstille modificerede 10 proinsuliner ad biosyntetisk vej. Fra europæisk patentskrift nr. 68701 kendes sådanne proinsuliner, hvor C-kæden er modificeret ved hjælp af rekombinant-DNA-teknikker.

Precursorerne for humaninsulinderivaterne ifølge opfindelsen kan fremstilles biosyntetisk i en gærvært, som 15 udtrykker en DNA-sekvens, der koder for precursoren.

Til opnåelse af udskillelse i dyrkningsmediet kan DNA-sekvensen, som koder for insulinprecursoren, fusioneres til en anden DNA-sekvens, der koder for et signalpeptid, som er virksomt i gær. Udskillelse kan opnås ved 20 indsættelse af Saccharomyces cerevisiae MFarl-leader-sekvensen (Kurjan & Herskowitz, Cell 30, 933-943 (1982)) i ekspressionsplasmidet. Ved en foretrukket konstruktion anvendes DNA-sekvensen, der koder for hele MFal-leader-sekvensen inklusive det dibasiske sted LysArg, men 25 eksklusiv peptidsekvensen GluAlaGluAla, som er substratet for gærproteasen DPAP (dipeptidylaminopeptidase). På denne måde opnås en effektiv udskillelse af insulinprecursorer med den korrekte N-terminal.

DNA-sekvenser, som koder for modificerede insulin-30 precursorer, konstrueres ved hjælp af in vitro mutagenese på ekspressionskassetten, som er indeholdt i BamHi restriktionsfragmentet fra ekspressionsplasmidet pYGABA som vist i fig. 3. Plasmidet indeholder selektionsmarkører og replikationssignaler, som er virksomme i gær, 10

DK 159856 B

og har en længde på 1103 basepar. BamHI fragmentet indeholder GAPDH (glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase)-modstrømsområdet indeholdende promotorsekvenserne fra 5 position -389 til -1 ifølge Bitter og Egan, Gene 32, (1984) 263-274. Til 5'-enden af modstrømsområdet adderes BamHI linkere. Denne promotorsekvens fusioneres direkte til den af Kurjan & Herskowitz beskrevne sekvens, som koder for de 85 N-terminale aminosyrer i MFal-leader-10 sekvensen. MFal-leadersekvensen fusioneres direkte til kodningssekvensen for insulinprecursoren enkeltkædet des[ ThrB30 ]-humaninsulin (SCI), som er et syntetisk fremstillet gen med sekvensen TTCGTTAACCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGT- AAGCAATTGGTTGTGAACACACCAAGAGTGAACCAACTTCGAAACATGAACCAAACACCA-

PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyrLeuValCysGly- GAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGGGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTGT- CTTTCTCCAAAGAAGATGTGAGGTTTCCCATAACAACTTGTTACAACATGAAGATAAACA-

GluArgGlyPhePheTyrThrProLysGlylleValGluGlnCysCysThrSerlleCys-

Sall

TCTTTGTACCAATTGGAAAACTACTGTAACTAATAGCGTCG

AGAAACATGGTTAACCTTTTGATGACATTGATTATCGCAGCAGCT

SerLeuTyrGlnLeuGluAsnTyrCysAsnEndEnd 15 Det er også vist, at translationen af insulinprecursor-genet er afsluttet med to stopkodoner, og umiddelbart efter findes et Sall restriktionssted. Terminatorområdet er identisk med Sall-BamHI restriktionsfragmentet beskrevet i europæisk patentpublikation nr. 0 116 201 Al.

20 Sekvensen konstrueres udelukkende under anvendelse af standardteknikker.

11

DK 159856 B

De ovenfor omtalte insulinmodifikationer kan fremstilles ved at udtrykke den modificerede DNA-sekvens i et egnet ekspressionssystem. Ændringerne i DNA-sekvensen kan 5 foretages ved in vitro-mutagenisering af insulingenet under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Thomas A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, bind 82, side 448-492 (1985). Ved denne fremgangsmåde klones insulingenet i den enkeltstrengede DNA-bakteriofag M13. DNA fra denne fag 10 oprenses, og hertil anelleres en mutageniseringsprimer, typisk en 15-25-mer, som indeholder den givne mutation (en mismatch) samt en homologi på hver side af denne mutation. Herefter forlænges primeren ved hjælp af en DNA-polymerase i hele faggenomets længde, hvorved man får et 15 dobbeltstrenget molekyle, hvori den ene streng indeholder mutationen, og den anden streng indeholder vildtype-genet.

Ved transformation af dette molekyle i en Escherichia coli-celle, vil fagafkommet dels være fager, som indeholder vildtype-genet, dels fager, som indeholder 20 mutationen. Blandt disse fager kan man derefter screene for den ønskede type ved hybridisering med mutageniseringsprimeren til fagafkommets enkeltstrengede DNA. Primeren vil være helt homolog til den muterede streng, men vil være forskellig fra vildtypen ved et 25 enkelt nucleotid. Efter screeningen kan dobbeltstrenget DNA isoleres fra de Escherichia coli-celler, hvori fagen dyrkes, og det modificerede insulingen kan isoleres derfra. Dette gen genindsættes derefter i det oprindelige ekspressionssystem.

30 Insulinpræparaterne kan indeholde humaninsulinderivaterne ifølge opfindelsen som amorfe og/eller krystallinske suspensioner, det være sig enkeltvis eller i kombination med sådanne insulinderivater og/eller naturligt forekommende insuliner. Det har vist sig, at størsteparten 35 af disse derivater kan krystalliseres med zink, enten ved en pH-værdi, som er større end deres isoelektriske punkter, eller ved en pH-værdi omkring det isoelektriske 12

DK 159856 B

pH, når krystallisationsmediet indeholder en phenol. Det er også muligt at krystallisere insulinderivater ifølge opfindelsen i nærværelse af protamin eller et overskud af 5 zink, hvilket giver yderligere protraheret virkning. Når der i nogle af de efterfølgende sammenligningsforsøg med humaninsulinderivaterne ifølge opfindelsen opnås samme virkningsvarighed som med "Insulatard"®, viser dette resultat, at humaninsulinderivatet ifølge opfindelsen har 10 en mere langvarig virkning end insulinet i præparatet "Insulatard"®, der som protraherende komponent indeholder protamin, hvilket ikke er tilfældet med præparaterne, som indeholder humaninsulinderivaterne ifølge opfindelsen.

Den protraherede virkning af præparater indeholdende 15 insulinderivater ifølge opfindelsen skyldes den meget lave opløselighed af sådanne derivater ved fysiologisk pH. I den følgende tabel er vist opløseligheden af nogle derivater ved pH 7,3 i sammenligning med humant insulin:

Medium: 0,13 M Na-phosphatpuffer, 0,7% NaCl, 0,3% 20 m-cresol

Insulinindhold: 4 mg/ml

Opløselighed

Humaninsulin 100% (A4-gln)-humaninsulin ~ 1% 25 (B21-gln)-humaninsulin ~ 1% (A4,B21-gln)-humaninsulin ~ 0,1%

At terapeutiske præparater indeholdende insulinderivater ifølge opfindelsen udviser særlig stabilitet over for enzymatisk påvirkning illustreres af følgende forsøg: 30 Et præparat indeholdende 4 mg/ml (A4-gln)-humaninsulin som krystalsuspension i 13 mM Na-phosphatpuffer, 0,7% NaCl, 0,3% m-cresol ved pH 7,3 deles i 3 dele, som tilsættes 13

DK 159856 B

henholdsvis trypsin (4 /*g/ml), trypsin (40 /ig/ml) og plasmin (1 U/ml). Disse henstilles derpå ved 20°C under let bevægelse på et vuggebord, og der udtages prøver til 5 tiden 0 timer, 1 time, 2 timer og 19 timer. Efter centrifugering analyseres supernatanterne for indhold af insulin ved omvendt fasehøjtryksvæskekromatografi.

Det samme forsøg udføres med det fra DK-patentansøgning nr. 3582/84 kendte insulinderivat (B31-lys, B32-arg)- 10 humaninsulin.

Resultaterne af forsøgene er afbildet i grafisk form på tegningen i fig. 1. Det ses, at opløseligheden i præparatet indeholdende insulinderivatet kendt fra DK-patentansøgning nr. 3582/84 er tydeligt påvirket af den 15 enzymatiske aktivitet, i modsætning til opløseligheden i præparatet indeholdende insulinderivatet ifølge opfindelsen.

Opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

20 Eksempel 1

Fremstilling af humaninsulin-B21-methylester.

500 mg humaninsulin-B30-methylester opslæmmes i 50 ml tørt methanol. Der tilsættes 2,0 ml 20%’s v/r bortri-fluorid/methanol under omrøring. Efter henstand ved 25 stuetemperatur i 2 timer hældes suspensionen i 400 ml ether, og der centrifugeres ved 2500 x G ved 4eC i 20 minutter. Bundfaldet vaskes to gange med ether, opslæmmes atter i 150 ml ether, hvorefter opslæmningen inddampes i vakuum, og bundfaldet opløses i 50 ml 20 mM tris/HCl, 60 30 rumfangs-% ethanol, pH 8,25. Prøven sættes herefter på en 1,6 x 21 cm "Q-Sepharose"® CL-6B Fast Flow søjle, som er ækvilibreret med samme puffer. Efter isokratisk eluering i 14

DK 159856 B

1 time ved en strømningshastighed på 24 cm pr. time elueres med en natriumchloridgradient fra 0 til 0,1 M i løbet af de følgende 16 timer. Insulin-dimethylestertoppen 5 opdeles i tre hovedfraktioner.

Den først eluerede fraktion underkastes yderligere fraktionering på en 4 x 250 mm "LiChrosorb"® RP18-søjle (Merck 50333) ækvilibreret med 0,125 M ammoniumsulfatopløsning, pH-værdi 4,0, 38 rumfangs-% 10 acetonitril ved 45°C. Efter påsætning af 1-2 mg insulindimethylester eluerer hovedproteinfraktionen i løbet af 20-25 minutter ved en strømningshastighed på 12 cm pr. minut.

10 mg af den dannede insulin-dimethylester opløses i 1 ml 15 iskold 0,1 N natriumhydroxidopløsning. Reaktionsblandingen henstår ved 0°C i 5 minutter, hvorefter blandingen indstilles på pH-værdien 9 med saltsyre. Blandingen sættes på en 0,5 x 5 cm "Mono Q"®-anionbyttersøjle og fraktioneres i 30 minutter i 20 mM tris/HCl, 60 rumfangs-% 20 ethanol, pH 8,25 med en lineær natirumchloridgradient, der stiger til 0,1 M, ved en strømningshastighed på 5,1 cm pr. minut. Ethanolet fjernes i vakuum fra den fraktion, som indeholder humaninsulin-B21-methylester, hvorpå proteinet fælles ved en pH-værdi på 6,3. Udbytte: 7 mg.

25 Humaninsulin-B21-methylesteren karakteriseres ved plasmadesorptionsmassespektrometri, som viser den korrekte molekylvægt, og ved nedbrydning med S.Aureus-protease, hvorved den korrekte B21-esterstilling bekræftes.

Eksempel 2 30 Fremstilling af humaninsulin-A17-methylester.

Humaninsulin-A17-methylester isoleres og identificeres under avendelse af den i eksempel 1 beskrevne fremgangs- 15

DK 159856 B

måde, idet man dog anvender den næsteluerede insulin-dimethylesterfraktion isoleret fra anionbytterkromatogra-feringstrinnet til den videre fraktionering. Humaninsulin-5 Al7-methylester opnås i et udbytte på 6,5 mg. Humaninsulin-A17-methylesteren karakteriseres ved plasma-desorptionsmassespektroskopi, som viser den korrekte molekylvægt, samt ved nedbrydning med S.Aureus-protease, hvorved den korrekte A17-esterposition bekræftes.

10 Eksempel 3

Fremstilling af og biologisk virkning af præparat indeholdende humaninsulin-B21-methylester.

Der fremstilles 25 ml af et medium, som indeholder 1,6% (v/r) glycerol, 0,33% (v/r) m-cresol, 1/75 M natrium- 15 phosphat, pH-værdi 7,3. Opløsningen sterilfiltreres. 1,5 mg humaninsulin-B21-methylester, fremstillet som angivet i eksempel 1, opslæmees i 1,0 ml medium.

Ved subkutan indgift af dette zinkfri præparat i marsvin iagttages protraheret hypoglykæmi. Den opnåede 20 protraherede insulinvirkning er sammenlignelig med den hypoglykæmiske virkning, som iagttages efter injektion af standardprotamininsulinpræparatet "Insulatard"®.

Eksempel 4

Fremstilling af og biologisk virkning af et krystallinsk 25 insulinpræparat indeholdende humaninsulin-A17-methylester.

4,5 mg humaninsulin-A17-methylester opløses i 2,7 ml 0,015 M phosphorsyre. Der tilsættes 21 mg natriumchlorid og 4,1 μΐ vandig opløsning af 152 mM zinkchlorid. Opløsningen sterilfiltreres. Opløsningen indstilles på pH-værdien 8,0 30 under aseptiske betingelser med en steril vandig natriumhydroxidopløsning. Opløsningen genindstilles der- 16

DK 159856 B

efter på pH-værdien 7,3 med steril saltsyre, og under svag omrøring ved 21°C dannes der romboedriske krystaller med en middelstørrelse på 10 μία. Rumfanget indstilles til 3 ml 5 med sterilt vand.

Desuden fremstilles en steril opløsning af 3 ml 13,5 mM phosphorsyre tilsat 21 mg natriumchlorid og 9 μΐ m-cresol, og opløsningen indstilles pH-værdien 7,3 med en steril vandig natriumhydroxidopløsning. De to opløsninger hældes 10 sammen.

Den dannede suspension viser en kraftig protraheret hypoglykæmisk virkning på marsvin ved en dosering på 18 /xg/kg. Den opnåede protraherede insulinvirkning er mere langvarig end den protraherede virkning af det kendte 15 injektionspræparat "Insulatard"®. Arealet under blodsukkersænkningskurven viser, at insulinderivatet udviser næsten samme biologiske styrke som humaninsulin.

Eksempel 5

Fremstilling af humaninsulin-A4-gln.

20 150 mg human proinsulin-A4-gln, som er fremstillet ved en af de ovenfor omtalte biosyntetiske fremgangsmåder, opløses i 30 ml tris/hydrochlorid, pH-værdi 7,5, indeholdende 3 mg matrixbundet trypsin ("Trypsin-Sepharose"® Fast Flow). Blandingen henstår ved 25 stuetemperatur i 1 time, hvorpå harpiksen frafiltreres.

Det fremkomne des-B30-insulin-A4-gln isoleres ved fældning ved en pH-værdi på 6,3 og frysetørres. Proteinpulveret opløses i en blanding indeholdende 200 mg threoninmethyl-ester, 1000 μΐ ethanol og 400 μΐ destilleret vand.

30 Blandingen indstilles på pH-værdien 6,3 med eddikesyre, hvorpå der iblandes 1 mg matrixbundet trypsin. Efter henstand i 2 timer ved stuetemperatur med forsigtig omrøring udfældes proteinet efter filtrering ved tilsætning 10 rum- 17

DK 159856 B

fangsdele 2 propanol. Det tørrede bundfald genopløses i 20 mM tris/hydrochlorid, 60 rumfangs-% ethanol, pH-værdi 8,25, sættes på en 1,6 x 20 cm "Q-Sepharose"® CL-6B Fast 5 Flow-søjle, som er ækvilibreret med den samme puffer, og elueres med en lineær natriumchloridgradient fra 0 til 0,1 M i løbet af 15 timer ved en strømningshastighed på 24 cm pr. time. Ethanolen fjernes i vakuum fra fraktionen, som indeholder A4-gln-humaninsulin-B30-methylester, og 10 proteinet fældes ved indstilling af pH-værdien på 6,8. B30-Methylesteren hydrolyseres i 10 minutter i kold 0,1 M natriumhydroxidopløsning ved en proteinkoncentration på 10 mg/ml, hvorefter pH-værdien indstilles på 8,25. Proteinopløsningen sættes på en 1,6 x 20 cm "Q-Sepharose"® 15 CL-6B Fast Flow-søjle efter fortynding med 2 rumfang 20 mM tris/hydrochlorid, pH-værdi 8,25, hvorpå der elueres som beskrevet ovenfor. Proteinet fældes ved en pH-værdi på 6,3 efter fjernelse af ethanolen. Ved frysetørring fås 30 mg humaninsulin-A4-gln.

20 Produktets renhed bestemmes ved højtryksvæskekromatografi med omvendt fase, og produktets identitet bekræftes ved aminosyreanalyse, flertrins-Edmannedbrydning og plasmadesorptionsmassespektrometri.

Eksempel 6 25 Fremstilling af humaninsulin-B21-gln 1800 mg enkeltkædet (21-gln)-des(30-65)-humant proinsulin, som er fremstillet ved en af de ovenfor omtalte biosyntetiske fremgangsmåder, sættes til 350 ml suspension af 70 ml (sedimenteret volumen) matrix-bundet trypsin 30 (Trypsin-"Sepharose"® Fast Flow. 0,8 mg enzym pr. ml gel) i 0,05 M tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, 20% (volumen) ethanol, pH 8,1 (saltsyre), og blandingen omrøres let i 6 timer ved 4°C. Gelen frafiltreres, og filtratet indeholdende (B21-gln)-des(B30)-humaninsulin justeres til 18

DK 159856 B

pH 6,3. Det herved udfældede protein isoleres ved centrifugering og frysetørres. Proteinet genopløses i en blanding af 4 g threonin-methylester, 20 ml ethanol og 8 5 ml vand. pH justeres til 6,3 med eddikesyre og 32 ml Trypsin- "Sepharose"® tilsættes. Efter henstand i 2 timer ved 20°C under let omrøring, frafiltreres gelen og proteinet udfældes ved tilsætning af 10 volumener 2-propanol. Det lufttørrede bundfald genopløses i 0,02 M 10 tris(hydroxy- methyl)-aminomethan, 60% (volumen) ethanol, pH 8,25 (saltsyre), sættes på en 5 x 20 cm "Q-Sepharose"® CL-6B Fast Flow-kolonne, ækvilibreret med samme puffer og elueres derpå med en lineær NaCl-gradient i samme puffer fra 0 til 0,1 M over 15 timer med et flow på 500 ml pr.

15 time.

Ethanol fjernes i vakuum fra fraktionen indeholdende (B21-gln)-humaninsulin-B30-methylester, og proteinet udfældes ved indstilling af pH til 6,5. Efter centrifugering og frysetørring hydrolyseres methylesteren 20 i 10 minutter i koldt 0,1 M natriumhydroxid efterfulgt af justering af pH til 9. Opløsningen fortyndes med 2 volumener 0,02 M tris (hydroxymethyl )aminomethan pH 8,5 (saltsyre), og sættes på en 5 x 20 cm "Q-Sepharose"® CL-6B Fast Flow-kolonne, som derpå elueres som ovenfor anført.

25 Proteinet fældes ved justering af pH til 6,3 efter vakuumafdampning af ethanolen. 175 mg humaninsulin-B21-gln blev opnået efter frysetørring.

Identiteten af produktet blev bekræftet ved aminosyre-analyse samt ved nedbrydning med S.Aureus-protease efter-30 fulgt af flertrins-Edman-nedbrydning af brudstykkerne.

Eksempel 7

Fremstilling af humaninsulin-(A4,B21)-gin 250 mg enkeltkædet [(21,69)-gin) ]-des(30-65)-humant pro- 19

DK 159856 B

insulin, som er fremstillet ved en af de ovenfor omtalte biosyntetiske fremgangsmåder, sættes til 50 ml suspension af 10 ml (sedimenteret volumen) matrix-bundet trypsin 5 (Trypsin-"Sepharose"® Fast Flow, 0,8 mg enzym pr. ml gel) i 0,05 M triethylamin, 20% (volumen) ethanol, pH 9 (saltsyre), og blandingen omrøres let i 15 minutter ved 20°C. Gelen frafiltreres, og filtratet indeholdende [ (A4,B21)-gln ]-des(B30)-humaninsulin justeres til pH 6,5.

10 Det herved fældede protein isoleres ved centrifugering og frysetørres. Proteinet genopløses i en blanding af 500 mg threonin-methylester, 2,5 ml ethanol og 1 ml vand, og pH justeres til 6,3 med eddikesyre. 4 ml Trypsin-"Sepharose"® tilsættes og efter henstand i 2 timer ved 20°C under let 15 omrøring, fjernes gelen ved filtrering, og proteinet udfældes fra filtratet ved tilsætning af 10 volumener 2-propanol. Det lufttørrede bundfald genopløses i 0,02 M tris(hydroxymethyl)aminomethan. 60% (volumen) ethanol, pH

8,25 (saltsyre), sættes på en 1,6 x 20 cm kolonne af 20 "Q-Sepharose"® CL-6B Fast Flow, der er ækvilibreret med samme puffer og elueres derpå med en lineær NaCl-gradient i samme puffer fra 0 til 0,1 M over 15 timer med et flow på 50 ml pr. time.

Ethanolen fjernes i vakuum fra fraktionen indeholdende 25 [ (A4,B21)-gln ]-humaninsulin-B30-methylester, og proteinet udfældes ved justering af pH til 7. Efter centrifugering og frysetørring hydrolyseres methylesteren 10 minutter i koldt 0,1 M natriumhydroxid efterfulgt af justering af pH til 9,8. Opløsningen fortyndes med 2 volumener 0,02 M 30 tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH 9 (saltsyre), og sættes på en 1,6 x 20 cm "Q-Sepharose"® CL-6B Fast Flow-kolonne, som derpå elueres som ovenfor anført. Proteinet fældes ved justering af pH til 6,5 efter vakuumafdampning af ethanol. 20 mg [ (A4,B21)-gln ]-humaninsulin blev opnået 35 efter frysetørring.

20

DK 159856 B

Identiteten af produktet blev bekræftet ved aminosyreanalyse samt ved nedbrydning med S.Aureus-protease efterfulgt af flertrins-Edman-nedbrydning af 5 brudstykkerne.

Eksempel 8

15 mg humaninsulin-A4-gln, fremstillet som beskrevet i eksempel 5, opløses i 7 ml 20 mM dinatriumphosphat, 1,0% natriumchlorid, 0,3% m-cresol, idet pH justeres til 9 med 10 1 M natriumhydroxid. Efter tilsætning af 13 μΐ 0,1 M

zinkacetat omrøres let, til opløsningen er klar, hvorpå den sterilfiltreres. pH-Værdien indstilles derpå til 6,3 med steril saltsyre, hvorved insulinderivatet udkrystalliserer. Til slut efterfyldes til 10 ml med sterilfiltre-15 ret 0,3% m-cresol.

Ved subkutan injektion af den resulterende krystalsuspension i grise i en mængde på 12 μΐ pr. kg indtræder tidspunktet for den maksimale hypoglykæmiske virkning væsentligt senere end ved et kendt humaninsulinpræparat 20 ("Velosulin"®) og falder omtrent sammen med tidspunktet for den maksimale virkning af et kendt protraheret humaninsulinpræparat ("Insulatard"®). Tidsforløbet af virkningen er vist på tegningen i fig. 2.

Eksempel 9 25 15 mg humaninsulin-B21-gln, fremstillet som beskrevet i eksempel 6, opløses i 7 ml 20 mM dinatr iumphosphat, 1,0% natriumchlorid, 0,3% m-cresol, idet pH justeres til 9 med 1 M natriumhydroxid. Efter tilsætning af 13 μΐ 0,1 M zinkacetat omrøres let, til opløsningen er klar, hvorpå 30 den sterilfiltreres. pH-Værdien indstilles derpå til 6,3 med steril saltsyre, hvorved insulinderivatet udkrystalliserer. Til slut efterfyldes til 10 ml med sterilf iltreret 0,3% m-cresol.

21

DK 159856 B

Ved subkutan injektion af den resulterende krystalsuspension i grise i en mængde på 12 μΐ pr. kg indtræder tidspunktet for den maksimale hypoglykæmiske virkning 5 væsentligt senere end ved et kendt humaninsulinpræparat ("Velosulin"®) og falder omtrent sammen med tidspunktet for den maksimale virkning af et kendt protraheret humaninsulinpræparat ("Insulatard"®). Tidsforløbet af virkningen er vist på tegningen i fig. 2.

10 Eksempel 10

Konstruktion af et ekspressionsplasmid samt udtrykkelse af og oprensning af ΓGlnA4/Ί-SCI precursoren.

Ekspressionskassettten, som er indeholdt i ekspressions-plasmidet pYGABA (se fig. 3) på et BamHI restriktions-15 fragment, isoleres på følgende måde: Ekspressions pi asmidet inkuberes med restriktionsendonucleasen BamHI under følgende betingelser: 20 μς plasmid, 50 enh. BamHI, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i et rumfang på 100 μΐ. Der anvendes en temperatur på 20 37°C og en reaktionstid på 2 timer. De to DNA-fragmenter adskilles på en 1%'s agarosegel, og det ønskede fragment isoleres.

Ligering af M13 vektoren M13mpl8

Det isolerede restriktionsfragment ligeres til bacterio-25 fagvektoren M13mpl8, der ligedes er skåret med restriktionsendonucleasen BamHI i følgende reaktionsblanding: Fragment 0,2 μg, vektor 0,02 μgr 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2/ 10 mM DTT og 1 mM ATP i et rumfang på 20 μ±.

5 μΐ af denne blanding overføres til E. coli stamme 30 JM101. Tilstedeværelsen af fragmentet i vektoren og fragmentets orientering bestemmes ved restriktionsenzymkortlægning på dobbeltstrenget M13-DNA isoleret fra transformanterne.

DK 159856 B

22

Isolering af enkeltstrenget (ss) DNA (templet)

Fra den ovenfor beskrevne transformant isoleres ss-DNA i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet af Messing i 5 Gene, 19, 269-276 (1982).

51-Phosphorylering af mutageniseringsprimeren

Mutageniseringsprimeren med sekvensen 5'-ACAACATTGTTGAACAATACC-3' phosporyieres i 5'-enden i en reaktionsblanding på 30 μΐ, som indeholder 70 mM Tris-HCl, 10 pH 7,0, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol oligo-nucleotid og 3,6 enh. T4 polynucleotidkinase. Reaktionen gennemføres i 30 minutter ved 37°C, hvorpå enzymet inaktiveres ved inkubering af blandingen i 10 minutter ved 65°C.

15 Annellering af templat og phosphoryleret mutageniserings-primer

Annellering af templat og primer gennemføres i et rumfang på 10 μΐ indeholdende 0,5 pmol templat, 5 pmol primer, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 1 mM 20 DTT ved opvarmning i 10 minutter til 65°C og efterfølgende afkøling til 0°C.

Forlængelses/ligeringsreaktion

Til den ovenfor anførte reaktionsblanding sættes 10 μΐ af en blanding med følgende sammensætning: 0,3 mM dATP, 25 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3 mM JTTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 3 enh. T4 DNA ligase og 2,5 enh. Klenow-polymerase. Reaktionen gennemføres i 16 timer ved 16°C.

23

DK 159856 B

Transformation af JM101

Den ovenfor beskrevne reaktionsblanding transformeres i forskellige fortyndinger til CaCl2-behandlede E. coli 5 JM101 celler under anvendelse af standardteknikker og udplades i 2 x YT topagar på 2 x YT agarplader. (2 x YT = trypton 16 g/1, gærekstrakt 10 g/1, NaCl 5 g/1. 2 x YT topagar = 2 x YT tilsat 0,4% agarose og autoklaveret. 2 x YT agarplader = 2 x YT tilsat 2% agar og autoklaveret).

10 Pladerne inkuberes natten over ved 37°C.

Identificering af positive kloner Første mutageniseringstrin

Der anvendes den såkaldte "plaque-lift" hybridiserings-metode, som beskrives i det følgende: Et nitrocellulose-15 filter anbringes på en plade med en egnet plaque-tæthed, således at filteret fugtes. Filteret bades derefter i følgende opløsninger: 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH i 30 sek., 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 i 1 min., 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrat) til senere anvendelse.

20 Filteret tørres på 3 M filterpapir og opvarmes i 2 timer ved 80°C i et vakuumskab.

Mutageniseringsprimeren med sekvensen 5'-ACAACATTGTTGAACAATACC-31 mærkes radioaktivt i 5'-enden i 30 μΐ af en blanding indeholdende 70 mM Tris-HCl, pH 25 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10 pmol oligonucleotid, 20 pmol γ-32ρ_ΑΤΡ og 3,5 enh. T4 polynucleotidkinase. Blandingen inkuberes ved 37°C i 30 minutter og derpå ved 100°C i 5 minutter.

Det tørrede filter præhybridiseres i 2 timer ved 65°C i 6 30 x SSC, 0,2% okseserumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) og 50 μg/ml laksesperm DNA. Derefter sættes reaktionsblandingen 24

DK 159856 B

indeholdende den mærkede prøve til 15 ml frisk præhybridiseringsblanding, og filteret bades deri natten over ved 27°C under forsigtig rystning. Efter hybridise-5 ring vaskes filteret tre gange i perioder på 15 minutter i 2 x SSC + 0,1% SDS, hvorpå der autoradiograferes. Efter vask i den samme opløsning men ved en temperatur på 50°C og efterfølgende autoradiografering identificeres plagues, som indeholder DNA-sekvenser, der er komplementære til 10 mutageniseringsprimeren.

Da den identificerede klon er et resultat af en hetero-duplex, udplades plaguen igen. Hybridiseringen og identificeringen gentages.

Andet mutageniseringstrin 15 Der gås frem som beskrevet ovenfor for det første mutageniseringstrin, idet der dog som primer anvendes 5’-ACAGTAGTTTTGCAATTGGTA-3'.

Rensning af dobbeltstrenget M13-fag DNA

En genscreenet klon anvendes til inficering af E. coli 20 stamme JM101. En kultur indeholdende ca. 10^ fager og 5 kolonier JM101 dyrkes i 5 timer i 5 ml 2 x YT medium ved 37°C. Derefter oprenses dobbeltstrenget cirkulært DNA fra pelleten under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Birnboim og Doly, Nucleic Acis Res., 2, 1513 (1979).

25 Isolering af et restriktionsfragment, som indeholder modificeret insulinprecursor

Den ovenfor isolerede DNA-præparation (ca. 5 /tg) spaltes med 10 enh. af restriktionsendonucleasen BamHI i 60 μΐ 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgClg og 1 mM DTT i 30 2 timer ved 37°C. DNA-produkterne adskilles på en agarosegel, og fragmentet oprenses fra gelen.

25

DK 159856 B

Ligering til gærvektoren pAB24 (fig. 4)

Det isolerede restriktionsfragment ligeres til gærvektoren pAB24 spaltet med restriktionsendonucleasen BamHI i en 5 reaktionsblanding med følgende sammensætning: Fragment

0,2 /ig, vektor 0,02 /tg, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM

MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP i et samlet rumfang på 20 /ti.

5 /ti af denne reaktionsblanding anvendes til transformation af E. coli stamme MC1061, hvori det modificerede 10 ekspressionsplasmid identificeres og propageres. Plasmidet betegnes pYGAB-A4-A17-A og er identisk med pYGABA, bortset fra de ændrede kodoner.

Transformation af gær

Transformation af ekspressionspiasmidet til gærstammen 15 Saccharomyces cerevisiae JC482ApepÅLeu2cir° (ot, his4, pep4, ura3, leu2, cir°) gennemføres som beskrevet af Ito et al., J. Bact., vol. 153, No. 1, 163-168 (1983). De transformerede celler udplades på SC-ura medium (0,7% Yeast Nitrogen Base, 2,0% glucose, 0,5% casaminosyrer, 20 2,0% agar) til selektion af plasmidholdige celler.

Ekspression af precursor og isolering fra dyrkningsmedium Gær transformeret som beskrevet ovenfor propageres på Petri-piader indeholdende minimalmedium uden uracil i 48 timer ved 30°C. 100 ml rystekolber indeholdende mini-25 malmedium uden uracil + 5 g/1 casaminosyrer + 10 g/1 ravsyre + 30 g/1 glucose ved pH 5,0 inokuleres med en enkelt koloni fra petripladen. Kolberne rystes derpå ved 30°C i en inkubator i 72 timer.

Efter centrifugering sterilfiltreres 1 liter sammenblandet 30 supernatant, og der indstilles på pH 4-4,5 og en ledningsevne <10 mS ved tilsætning af 5 M HC1 og vand. Med et flow 26

DK 159856 B

på 120 ml/time sættes supernatanten derefter på en 1,6 x 6 cm søjle af "S-Sepharose"® FF, som forinden er blevet ækvilibreret med 50 mM eddikesyre, 50% (rumfang) ethanol 5 indstillet på pH 4,0 med NaOH. Søjlen vaskes med 60 ml puffer, og precursoren elueres ved hjælp af en lineær NaCl-gradient fra 0 til 0,365 M i 360 ml puffer med et flow på 10 ml/time. Eluatet opdeles i fraktioner på 4 ml og undersøges for UV-absorption. Precursorholdige fraktio-10 ner identificeres ved hjælp af RP-HPLC analyse og hældes sammen. Efter afsaltning på en "Sephadex"® G25-søjle i 1 M eddikesyre isoleres precursoren ved frysetørring.

Fremstilling af Γ GlnA4,A17 1-humaninsulin ud fra precursor 150 mg [ GlnA^,A17 ]-sci, fremstillet som beskrevet ovenfor, 15 sættes til 30 ml 50 mM TRIS/hydrochlorid 20% (rumfang) ethanol, pH 7,8, indeholdende 7,5 ml (bundfældet rumfang) Trypsin-"Sepharose"® Fast Flow (0,8 mg enzym/ml gel). Blandingen henstår med forsigtig omrøring ved 4°C i 16 timer, hvorefter harpiksen frafiltreres. Det dannede 20 [ GlnA4'A17 ]-des-(B30)-insulin isoleres ved fældning ved en pH-værdi på 6,3 og frysetørres. Proteinpulveret opløses i en blanding indeholdende 200 mg threoninmethylester, 1000 /ti ethanol og 400 μΐ destilleret vand. pH-Værdien indstilles på 6,3 med eddikesyre, og der iblandes 1 g 25 afvandet matrixbundet trypsingel. Efter henstand i 2 timer ved stuetemperatur med forsigtig omrøring fældes proteinet efter filtrering ved tilsætning af 10 rumfang 2-propanol.

Det tørre bundfald genopløses i 20 mM TRIS/HC1, 60 rum-fangs-% ethanol, pH-værdi 8,25, opløsningen sættes på en 30 1,6 x 20 cm Q-"Sepharose”® CL-6B Fast Flow søjle ækvili breret med pufferen, og der elueres med en lineær natrium-chloridgradient fra 0 til 0,1 M i løbet af 15 timer med en flowrate på 48 ml/time. Ethanolet fjernes i vakuum fra fraktionen, som indeholder [ GlnA^/]-humaninsulin-35 B30-methylester, og proteinet fældes ved indstilling af 27

DK 159856 B

pH-værdien til 6,8. B30-Methylesteren hydrolyseres i 10 minutter i kold 0,1 M natriumhydroxidopløsning ved en proteinkoncentration på 10 mg/ml, hvorefter pH-værdien 5 indstilles på 8,25. Proteinopløsningen sættes på en 1,6 x 20 cm Q-"Sepharose"® CL-6B Fast Flow søjle efter fortynding med 2 rumfang 20 mM TRIS/hydrochlorid, pH-værdi 8,25, og der elueres som beskrevet ovenfor. Proteinet fældes ved en pH-værdi på 6,3 efter fjernelse af ethanolet. 30 mg 10 [ GlnA4/A17 ]-humaninsulin fås efter frysetørring.

Produktets renhed bestemmes ved højtryksvæskekromatografi ved omvendt fase, og produktets identitet bekræftes ved flertrins Edman-nedbrydning og plasmadesorptionsmasse-spektrometri.

15 Konstruktion af et ekspressionsplasmid, udtrykkelse af og fremstilling af ΓGlnA4'B21 1-SCI precursor

Der gås frem på samme måde som beskrevet for [ GlnA4'Al?]-SCI precursoren, idet der dog i det andet mutageniserings-trin anvendes en mutageneriseringsprimer med sekvensen 20 5'-GAAACCTCTTTGACCACAAAC-31.

Fremstilling af ΓGlnA4/B211-humaninsulin ud fra precursor

Ud fra 200 mg [ GlnA4'B2l ]-sci opnås 25 mg [GlnA^,B21]» humaninsulin analogt med den ovenfor for [GlnA4/A17]-humaninsulin beskrevne fremgangsmåde.

25 Produktets renhed bestemmes ved højtryksvæskekromatografi med omvendt fase, og produktets identitet bekræftes ved hjælp af flertrins Edman-nedbrydning og plasmadesorptions-massespektrometri.

28

DK 159856 B

Formulering af injektionspræparat med protraheret virkning indeholdende en krystallinsk suspension af henholdsvis Γ GlnA^>A^ 1-humaninsulin og Γ GlnA^,B21 1-humaninsulin 5 60 μταοί humaninsulinanalog opløses i 70 ml 1%'s NaCl- opløsning indeholdende 0,5% m-cresol ved indstilling af pH-værdien på 9,7 med 1 M NaOH, og der tilsættes 325 μΐ 0. 1.M zinkacetat. Efter genindstillingen af pH-værdien på 9,7 indstilles rumfanget til 80 ml med vand, og opløsnin- 10 gen sterilfiltreres.

20 ml 65 mM NaH2P04-oplØsning indeholdende 0,3% m-cresol og indstillet på pH-værdien 6,0 med NaOH sterilfiltreres.

Under sterile betingelser blandes to opløsninger, og den dannede suspension henstår ved 20°C i 1 time med meget 15 forsigtig omrøring. Til slut indstilles pH-værdien på 7,3 med HC1.

Påvisning af protraheret virkning efter subkutan injektion i rotter ved hjælp af ekstern 7-tælling

Til forsøgene anvendes hunrotter (Wistar) med en legems-20 vægt på ca. 250 g og en alder på over 90 dage. Rotterne akklimatiseres i ca. 1 uge inden forsøget og har fri adgang til foder. I 4 dage inden forsøgets begyndelse gives rotterne en 20 mM vandig kaliumiodidopløsning som drikkevand.

25 Der anvendes følgende forsøgspræparater: 1. Suspensionspræparat indeholdende [ GlnA4,A17 ]-human-insulin.

2. Suspensionspræparat indeholdende [01^^,821^¾^^. insulin.

30 3. Opløsningspræparat indeholdende semisyntetisk human insulin ("Velosulin"®), 100 enh./ml.

29

DK 159856 B

Alle tre formuleringer indeholder desuden 50 μΟΙ/χαΙ af henholdsvis [mono-125I ]-insulinsporstof eller insulin-analogsporstof fremstillet ved standardioderingsmetoder 5 med radioaktivt iod.

Rotterne injiceres subkutant på bagsiden af låret med 50 μΐ præparat indeholdende 3,5 nmol insulinforbindelse og 2,5 μΟί [125χ ]-mærket sporstof. Under forsøgsperioden er rotterne immobiliseret i rotteholdere.

10 Sporstoffets forsvinden fra injektionsstederne, som er et mål for absorptionen af insulinforbindelsen fra det subkutane depot (jf. C.Binder: Absorption of Injected

Insulin, Munksgaard, København, 1969), måles under anvendelse af to stationære MIP-10 ratemetere og detek-15 torer E749 med 3 mm NaI-scintillationskrystaller med Be-vinduer og collimatorer med 60 synsvinkel og 10 mm åbninger (Raytronic). Ratemeterne er forbundet med Mini-recordere 121N (Raytronic). Detektorerne er fastgjort 2 cm over huden på injektionsstederne. Radioaktiviteten 20 måles over en 5 minutters periode 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8, 12 og 24 timer efter injektionen af præparatet.

Efter subtraktion af baggrundstællinger omregnes tællingerne til procent af begyndelsestællingen.

I fig. 5 er afbildet gennemsnitsværdierne for den 25 resterende radioaktivitet som funktion for tiden af hvert præparat. Når tidspunktet for 50% restaktivitet (T5Q%) anvendes som udtryk for den protraherede virkning, opnås følgende værdier fra kurverne: T50% 30 Præp. I ca. 4 timer

Præp. II ca. 6 timer Præp. III ca. 0,5 timer 30

DK 159856 B

Disse resultater viser, at præparaterne, som indeholder de to humaninsulinanaloger ifølge opfindelsen viser en udtalt protraheret virkning sammenlignet med præparatet indehol-5 dende humaninsulin.

Claims (14)

1. Humaninsulinderivat, kendetegnet ved, at carboxylgruppen i en eller flere af de fire glutamin-5 syrerester i positionerne A4, A17, B13 og B21 foreligger som methylester eller amid, eller at en eller flere af disse glutaminsyrerester er erstattet med Ala, Thr eller Val, idet dog B13 er forskellig fra en glutaminrest, når derivatisering kun forekommer i B13-positionen.

2. Humaninsulinderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at carboxylgruppen i en eller to af de fire glutaminsyrerester i positionerne A4, A17, B13 og B21 foreligger som methylester eller amid, eller at en eller to af disse glutaminsyrerester er erstattet med Ala, Thr 15 eller Val, idet dog B13 er forskellig fra en glutaminrest, når derivatisering kun forekommer i B13-positionen.

3. Humaninsulinderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at to af de fire glutaminsyrerester i positionerne A4, A17, B13 og B21 er erstattet med Ala, Thr eller Val.

4. Humaninsulinderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at carboxylgruppen i de to glutaminsyrerester i positionerne A4 og B21 begge foreligger som amid.

5. Humaninsulinderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at carboxylgruppen i glutaminsyreresten i position A4 25 foreligger som amid.

6. Humaninsulinderivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at carboxylgruppen i glutaminsyreresten i position B21 foreligger som amid.

7. Insulinpræparat, kendetegnet ved, at det inde-30 holder mindst ét insulinderivat ifølge krav 1, og, om ønsket, tillige et andet insulin med hurtigt indtrædende virkning. DK 159856 B

8. Insulinpræparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det indeholder mindst et insulinderivat ifølge krav 2.

9. Insulinpræparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, 5 at det indeholder et insulinderivat ifølge krav 3.

10. Insulinpræparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det indeholder et insulinderivat ifølge krav 4.

11. Insulinpræparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det indeholder et insulinderivat ifølge krav 5.

12. Insulinpræparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det indeholder et insulinderivat ifølge krav 6.

13. Insulinpræparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det tillige indeholder protamin.

14. Insulinpræparat ifølge krav 7, kendetegnet ved, 15 at det er et injektionspræparat, som har protraheret insulinvirkning, og som indeholder en suspension af mindst ét insulinderivat i et isotonisk vandigt medium med pH-værdi i neutralområdet, og endvidere eventuelt indeholder en puffer og/eller et konserveringsmiddel, og, 20 om ønsket, et insulin eller insulinderivat med hurtigt indtrædende virkning.