DK155500B

DK155500B - Fremgangsmaade til fremstilling af blodkoagulationsfremmende praeparater paa basis af humanproteiner

Info

Publication number: DK155500B
Application number: DK318581A
Authority: DK
Inventors: Johann Eibl; Otto Schwarz; Friedrich Elsinger; Anton Philapitsch
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1980-07-22
Filing date: 1981-07-16
Publication date: 1989-04-17
Also published as: NL8103329A; BE889640A; IT1142032B; HU188298B; NL190268B; FI812295L; NO157245B; AT368883B; ES504000A0; DK155500C; SE460174B; NO812500L; FI77048C; IT8123070A0; AR227194A1; DE3127318C2; DK318581A; FR2487199B1; FR2487199A1; SE8103759L

Description

i

DK 155500 B

Opfindelsen angår et blodkoagulationsfremmende præparat på basis af humanproteiner med et indhold af koagulationsfaktorerne II, VII/ IX og X og en faktor VIII-inhibitor-bypass-aktivitet.

5 Blodkoagulationsfremmende præparater med faktor VEII-inhibi-tor-bypass-aktivitet, der forkortes til "FEIBA" (Faktor Eight, Inhibitor-Bypassing-Activity) kendes. I AT-patentskrift 350.726 (svarende til US-patentskrift 4.160.025 henholdsvis DE-offentliggø-relsesskrift 2734821) er fremstillingen af et sådant præparat beskrevet.

10 De anvendes med godt resultat ved behandlingen af patienter, som lider af hæmofili, og hvis blod indeholder et mod faktor VIII rettet hæmmende stof (inhibitor). Den kemiske struktur af FEIBA-faktoren kendes endnu ikke. Man ved kun, at det drejer sig om et protein med en molekylvægt i nærheden af ca. 100.000.

15 Fremstillingen af præparatet ifølge de ovennævnte patentskrifter skete ved generering af human citrationholdig plasma uden nærværelse af frie calciumioner ved behandling med i vand uopløselige uorganiske koagulationsfysiologisk-overfladeaktive stoffer, såsom kiselgel eller kaolin, og efterfølgende adsorp-20 tion og eluering, hvorved der opnås en blanding af faktorerne II, VII, IX og X, faktoren FEIBA og andre proteiner, hvis sammensætning hidtil ikke er beskrevet.

Selv om præparatet ifølge DE-offentliggørelsesskrift 2734821 som nævnt har vist sig værdifuldt ved behandlingen af faktor vm-inhibitor-patienter, 25 er der brug for at udvide anvendelsesområdet og at forbedre tåleligheden af FEIBA-præparatet yderligere , specielt at reducere uønskede bireaktioner, såsom thrombogene og vasoaktive virkninger til et minimum.

Dette opnås ifølge opfindelsen med en fremgangsmåde til fremstilling af et 30 blodkoagulationsfremmende præparat på basis af humanproteiner med et indhold af koagulationsf aktorerne II, VII, IX og X °?Γ en faktor VIII-inihibi-tor-bypass-aktivitet, hvilket præparat er fri for thrombogen aktivitet indtil mindst 2 enheder

DK 155500 B

2 FEIBA pr. kg kanin i den thrombose-inducerende aktivitetstest ifølge Wessler, 5 er fri for kallikreinaktivitet og fri for prækållikrein- aktivator-aktivitet - målt i en vandig opløsning af præparatet med en FEIBA-koncentration indtil mindst 10 enheder pr. ml, affinitetskromatografisk på dextransulfat-agarose 10 ved hjælp af en NaCl-gradient kan separeres således, at proteinet med faktor IX-aktivitet elueres ved lavere NaCl-koncentration end proteinet med FEIB-aktivitet, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at humanplasma bliver behandlet med sulfaterede højpolymere carbohydrater og/eller med basiske ionbyttere, og proteinblandingen 1 5 med genereret FEIB-aktivitet bliver adsorberet, hvorpå det bliver udvundet ved eluering og koncentrering.

De ovenfor angivne egenskaber, nemlig at præparatet er fri 20 for thrombogen aktivitet og for kallikrein-aktivitet henholds vis for prækallikrein-aktivator-aktivitet - sidstnævnte er ansvarlig for de vasoaktive virkninger - betyder, at præparatet tåles særdeles godt. Den thromboseinducerende aktivitetstest og undersøgelserne af kallikrein-aktivitet og prækallikrein-akti-25 vator-aktivitet kendes af fagfolk. De beskrives nærmere i for bindelse med de efterfølgende eksempler.

Den tredje egenskab ved præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, separerbarheden ad affinitetskrcmatografisk vej på dextransulfat-30 agarose ved hjælp af en NaCl-gradient er eksempelvis vist på tegningens fig. 1. Den affinitetskromatografiske metode på dextransulfat-agarose kendes af fagfolk (D.S. Petter og C.

Prowse, Thrombosis Research LL (1977), 687-692). Herved kobles dextransulfat (molekylvægt 500.000) til CNBr-aktiveret 35

DK 155500 B

3

Sepharose 4 B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige). Den således udvundne dextransulfat-sepharose bringes i ligevægt i 0,4% trinatriumcitrat, 2H20-opløsning (pH-værdi 7,4) og fyldes i en søjle. Prøven, der skal undersøges, overføres til 5 søjlen og elueres derpå fraktioneret med en NaCl-opløsning i 0,4% trinatriumcitrat,2^0 (pH-værdi 7,4) med stigende NaCl-koncentration.

I fig. 1 er eluatets fraktionsnumre angivet på abscissen. På venstre ordinat er angivet aktiviteterne af koagulationsfaktorerne 10 i enheder pr. ml, og på den højre ordinat er angivet koncentrationen af natriumchloridgradienten i mol/liter. Det lineære forløb af gradienten er angivet som linie G. Som det fremgår af fig. 1, elueres proteinet med faktor IX-aktivitet i området fra 0,1 til 0,5 (molær) med et maksimum ved 0,3 (molær), pro-15 teinet med FEIB-aktivitet ved en NaCl-koncentration i området fra 0,3 til 0,5 (molær) med et maksimum ved 0,4 (molær). Den stigende NaCl-koncentration fremgår af NaCl-gradienten G, der går fra 0 molær til 0,65 molær NaCl.

For præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ind-20 holdet af globuliner ved elektroforetisk separering, som belyst i tegningens fig. 2. Den øverste del af fig. 2 viser separeringskurven for dextran-sulfat-sepharose-kromatografiens eluater af præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der indeholder proteinerne med faktor IX-aktivitet og FEIB-aktivitet, hvori-25 mod den nederste del af fig. 2 gengiver den elektroforetiske separeringskurve af et naturligt humanplasma. Det ses, at i dette eksempel udgør spidsværdien i a^globulinområdet 70% af det samlede protein. Til spidsværdien slutter sig i α-globulinområdet en skulder, som udgør 14% af det samlede proteinindhold, hvorpå der i til-30 slutning til skulderen i /3-globulinområdet følger en svag udpræget spids, som udgør 16% af det samlede protein.

En yderligere egenskab ved præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen består fordelagtigt i, at FEIB-aktiviteten efter 1 times inkubation i faktor VIII-inhibitorplasma stadig er 4

DK 155500B

mindst ca_. 50%. .Denne*"egenskab tyder på en mere langvarig virkning ved applikation til faktor VIII-inhibitor-patienter.

5 En yderligere egenskab ved præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen består hensigtsmæssigt i, at faktor IX-aktiviteten efter 1 times inkubation i faktor-.IX-mangelplasma stadig er bibeholdt i et omfang på mindst ca. 50%. Dette betyder, at præparatet kun indeholder lidt eller en meget ringe andel af aktiveret faktor IX. Det er kendt, at 10 aktiveret faktor IX bliver inaktiveret i humanplasma. Aktive ret faktor IX ville forårsage uheldige thrombogene virkninger, da i normaltilstanden kun ikke-aktiveret faktor IX eller alment ikke-aktiverede koagulationsfaktorer er til stede i blodet. Aktiveret faktor IX (faktor IXa) eller alment aktiverede koa-15 gulationsfaktorer dannes i ringe mængder efter kvæstelser for at opnå blodstandsning. Et overskud af aktiverede koagulationsfaktorer fører imidlertid til thromboser.

Af litteraturen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 74, nr. 7, 3028-3032, juli 1977, "In vitro and in vivo correlation of clotting protease activity: Effect of heparin" af S.N. Gitel, R.C. Stephenson og S. Wessler) kendes, at netop faktoren IXa besidder den højeste thrombogene virkning i forhold til andre aktiverede koagulationsfaktorer, såsom Xa og Ila (thrombin).

25

Endelig er det hensigtsmæssigt, at en egenskab ved det blodkoagulationsfremmende præparat fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i, at det har et indhold af inter-a-trypsin-inhibitor (ITI) på 0,05 til 5 mg pr. FEIBA-enhed.

30

Indholdet af ITI bevirker, at thrombogeniteten af præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er lav i Wessler-testen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er karakteriseret ved, at 35 humanplasma behandles med sulfaterede højpolymere carbohydrater og/eller med basiske ionbyttere, og at proteinblandingen bliver adsorberet med genereret FEIB-aktivitet, hvorpå det bliver udvundet ved eluering og koncentrering. Som eksempler på sulfa- 5

DK 155500B

og som eksempel på basiske ionbyttere kan nævnes DEAE-Sephadex, se eks. 1 og 2.

Ved gennemførelse af fremgangsmåden må det påses, at plasma-5 et eller reaktionskomponenterne bliver holdt fri for stoffer, som er i stand til at forøge antithrombin-III-aktiviteten, såsom heparin eller heparinoider.

Ifølge en udførelsesform for opfindelsen bliver plasmaet først i kort tid behandlet med sulfaterede højpolymere carbohydrater herpå adsorberes proteinblandingen med genereret PEIB-aktivitet på en ionbytter på dextranbasis og elueres og koncentreres umiddelbart derpå.

15

Ifølge en anden udførelsesform for opfindelsen behandles plasmaet med en ionbytter på dextranbasis, og efter mindst 2 timers indvirkning elueres den på ionbytteren adsorberede proteinblanding med genereret FEIB-aktivitet og koncentreres derpå. Ved 20 denne udførelsesform er genereringen af FEIB-aktiviteten afhængig af indvirkningstiden. Denne kan udgøre indtil 48 timer.

De anvendte fremstillingsforanstaltninger er ikke kritiske og kan variere inden for vide grænser. Således kan pH-værdien 25 ligge mellem 6 og 9, temperaturen ligge mellem 0°C og 40°C, de anvendte mængderdextransulfat udgøre 0,1-500 mg/liter plasma, og af DEAE-sephadex kan der anvendes 0,01-10 g/liter plasma.

Som udgangsmateriale for fremgangsmåden ifølge opfindelsen kommer der ikke blot naturlig humanplasma på tale, men også plasma- o 0 fraktioner, f.eks. kryosupernatant og Cohn-I-supernatant (8% alkohol).

Præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen og fremgangsmåden til fremstilling heraf belyses nærmere i 3 5 de efterfølgende eksempler, hvorhos der i tilslutning til eksemp-lernegéreångivetcde "ånvendtevibestemmelsdsmetoder oij.ii' tabelfbrm · anført de opnåede resultater.

6

DK 155500B

Eksempel 1 1000 liter frisk frosset human citratplasma optøes ved 0-4°C, og det derved resulterende kryobundfald fracentrifugeres ved 5 o 2 C. Den resulterende "Kryosupematant " tilsættes ved en naturlig pH-værdi på 7,7 10 g dextransulfat (molekylvægt 500.000) og omrøres i 15 minutter ved 4°C, hvorved stoffet FEIBA genereres.

Derpå tilsættes 500 g af ionbytteren DEAE-Sephadex A-50 10 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige), og der omrøres i 1/2 time ved 4°C, hvorved det genererede stof FEIBA sammen med prothrombinkompleksfaktorerne (II, VII, IX, X) og inaktive proteiner bliver adsorberet på det uopløselige DEAE-sephadex.

15 DEAE-sephadexet frasepareres umiddelbart efter adsorptionsbe handlingen ved centrifugering eller filtrering. Det overliggende plasma kan anvendes til udvinding af gamma-globulin og albumin.

20 DEAE-sephadexet underkastes en dobbelt vaskeproces. Derved bliver DEAE-sephadexet først omrørt med 50 liter af en opløsning bestående af 4 g/liter trinatriumcitrat, 21^0, 7 g/liter natrium-chlorid og 18 g/liter dinatriumhydrogenphosphat,12H20 i destilleret vand, pH-værdi 7,5, i 15 minutter ved 4°C. Efter fra-25 separering ved filtrering omrøres DEAE-sephadexet med 50 liter af en opløsning bestående af 4 g/liter trinatriumcitrat,2H2O og 7 g/liter natriumchlorid i destilleret vand, pH-værdi 7,5, i 15 minutter ved 4°C, og derpå frasepareres igen ved filtrering.

30 Til elueringen omrøres DEAE-sephadexet med 25 liter af en op løsning bestående af 30 g/liter natriumchlorid og 1 g/liter trinatriumcitrat,21^0 i destilleret vand, pH-værdi 7,0, i 20 minutter ved 4°C. Eluatet, der indeholder det genererede stof FEIBA, faktorerne af prothrombinkomplekset (II, VII, IX, X) 35 samt inaktivt protein, udvindes ved filtreringί DEAE-sephadexet kastes bort. Eluatet dialyseres natten over mod 1000 liter destilleret vand ved 4°C, indfryses og underkastes en første

DK 155500 B

7 lyofiliseringsbehandling. I det resulterende bulk-materiale bestemmes FEIB-aktiviteten, nemlig ifølge den i DE-of fentlig-gørelsesskrift 27 34 821 beskrevne metode.

5

Til fremstillingen af det farmaceutisk anvendelige præparat med FEIB-aktivitet opløses bulk-materialet i så meget destilleret pyrogenfrit vand, at FEIB-aktiviteten udgør mellem 10 og 50 FEIBA-enheder pr. ml (i det foreliggende tilfælde 25 FEIBA-10 enheder pr. ml). Efter tilsætning af de nødvendige salte til fremstillingen af isotonien og indstillingen af pH-værdien mellem 7,0 og 7,5 klares opløsningen gennem membranfilter og filtreres til sidst sterilt gennem et 0,2 pm membranfilter. Opløsningen fyldes under sterile betingelser med indtil 20 ml i hve 15 beholder, dybfryses og lyofiliseres.

Eksempel 2 o 1000 liter frisk frosset human citratplasma optøes ved 0-4 C, 20 og det derved resulterende kryobundfald frasepareres ved cen trifugering ved 2°C. Den resulterende "Kryosupernatant" tilsættes ved en naturlig pH-værdi på 7,7 500 g af anionbytteren DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala,

Sverige)' og omrøres i 1/2 time ved 4°C, hvorved prothrombin-25 kompleksfaktorerne (II, VII, IX, X) og inaktive proteiner bliver adsorberet på DEAE-sephadexet.

Derpå henstilles blandingen i 12 timer ved 4°C. I løbet af denne "kontakttid" genereres stoffet FEIBA.

30 DEAE-sephadexet fraskilles efter 12 timers "kontakttid" ved centrifugering eller filtrering. Det overliggende plasma kan anvendes til udvinding af gamma-globulin og albumin.

35 Den yderligere forarbejdning af DEAE-sephadexet (vask to gange, eluering etc.) sker på samme måde som beskrevet i eksempel 1.

DK 155500 B

8

Den thromboseinducerende aktivitetstest ifølge Wessler, som er beskrevet i litteraturen, blandt andet i J-Appl. Physiol. 14 5 (1959), 943-946, "Biologic assay of a thrombosis-inducing activity in human serum" af Standord Wessler, Stanley M. Reimer og Mindel C. Sheps bliver udført på følgende måde: Per test anvendes tre kaniner. Dyrene bedøves med nembutal. Efter yderligere lokalbedøvelse frilægges vena jugularis i hjertesiden. 10 I en afstand på 1-2 cm forberedes der to ligaturer.

Præparatet, der skal undersøges, injiceres nu i den ønskede dosis i den ørevene, som ligger over for den frilagte vena jugularis i løbet af 15 sekunder. 10-25 sekunder efter endt 15 injektion tiltrækkes de forberedte ligaturer. Den isolerede venesegment forbliver nu i 10 minutter in situ i kaninen.

Derpå fjernes venestykket fra dyret og udskæres i en petriskål i en 5% natriumcitratopløsning, og indholdet bestemmes efter følgende skema.

20 0 = ingen koagulation 1 = få makroskopisk synlige fibrinpartikler 2 = nogle små thromber 3 = to eller flere store thromber 25 4 = en enkelt thrombus, som udfylder hele det isolerede vene segment.

Testen betegnes som positiv i tilfælde af en 4-reaktion. For præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen 30 er det væsentligt, at der ved injektion af præparatet indehol dende indtil mindst to enheder FEIBA pr. kg forsøgsdyr ikke optræder nogen 4-reaktion.

Bestemmelsen af kallikrein-aktiviteten og prækallikrein-akti- vator-aktiviteten gennemføres på følgende måde.

3 5

Kallikrein: 1. Metode:

DK 155500 B

9

Kallikrein afspalter amidolytisk para-nitroanilin (pNA) af et specifikt chromogent substrat. Koncentrationen af pNA bliver målt fotometrisk ved en bølgelængde på 405 nm.

5 2. Reagenser:

Puffer: 20 Opløsning A: 3,03 g "TRIS" og 1,7 g imidazol opløses i 500 ml 0,1 N saltsyre og suppleres med vand til 1000 ml.

Opløsning B: 4,04 g "TRIS" og 2,27 g imidazol opløses i 500 ml 0,1 N saltsyre og suppleres med vand til 1000 ml.

15

Opløsning C: 11,69 g natriumchlorid opløses med vand til 1000 ml.

Opløsning A og opløsning B blandes, indtil der er opnået en pH- 20 værdi på 7,9. Denne blanding behandles med det samme volumen af opløsning C.

Chromogent substrat S-2302 (Firma Kabi, Stockholm): 25 H-D-prolyl-L-phenylalanyl-L-arginin-p-nitroanilid-dihydro- chlorid 1 millimolær opløsning af S 2302: 25 mg i 41 ml vand.

Prøve: 30

Prøven opløses i originalvolumenet, dvs. det volumen destilleret vand, som er nødvendigt til opløsning af lyofilisatet i slutbeholderen, og anvendes ufortyndet i testen.

3. Test: I et vandbad ved en temperatur på 37°C pipetteres i et lille plastrør 1,0 ml puffer, fortemperareret til 37°C, 0,1 ml prøve og 0,2 ml chromogent substrat S-2302. Denne blanding anbringes 35 10

DK 155500B

i et til 37°C tempereret fotometer, og forøgelsen af den optiske tæthed pr. minut (L OD/min) ved en bølgelængde på 405 nm ved en lagtykkelse på 10 ml måles. Aktiviteten af en prøve udtryk-5 kes i Δ OD/min.

Prækallikrein-aktivatori 1 o Metode: 10

Af et renset prækallikreinpræparat (PKK) genereres kallikrein (KK) ved hjælp af en prækallikreinaktivator (PKKA). Kallikreinet afspalter amidolytisk paranitroanilin (pNA) af et specifikt chromogent substrat. Koncentrationen af pNA måles fotometrisk ved en bølgelængde på 405 nm.

2„ Reagenser:

Puffer og chromogent substrat svarer til de ved kallikreinbe-2Q stemmeisen beskrevne reagenser.

Prækallikræinpræparat:

Fremstillingen af præparatet sker ifølge en af Harpel be-25 skrevet fremgangsmåde , der er modificeret af M.S. Horowitz (New York Blood Center). Derved bliver humant citratplasma behandlet ved hjælp af en DEAE-cellulose. Den ikke til DEAE-cellulose bundne fraktion indeholder prækallikreinet.

3Q Positiv kontrol (standard):

Som standard (= referenceværdi) anvendes et albuminpræparat fra Bureau of Biologies (BoB) Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland 20205, USA.' Dette præparat indeholder en 35 prækallikreinaktivator. Kallikreingenerering med denne BoB- standard udgør referenceværdien 1 henholdsvis bliver sat lig 100%.

DK 155500 B

11

Prøve:

Prøven bliver opløst i originalvolumenet og anvendes ufortyn-5 det i testen.

3. Test: I et vandbad ved en temperatur på 37°C bliver i et lille plastrør pipetteret 10 0,05 ml prækallikreipræparat 0,05 ml prøve a) Bob-standard til referenceværdien b) testprøve (i en anden testportion).

Efter en inkubationstid på 10 minutter ved 37°C pipetteres 0,7 ml pufferopløsning og 0,1 ml chromogent substrat S-2302.

Denne blanding anbringes i et til 37°C tempereret fotometer, og forøgelsen af den optiske tæthed pr. minut ( ΔOD/minut) ved en bølgelængde på 405 nm måles ved en lagtykkelse på 10 mm. Aktiviteten af en prøve (A OD/minut) bliver udtrykt faktorielt 2 0 - over for BoB-standarden med tallet 1 - henholdsvis i % af BoB-standarden.

Karakteriseringen af præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved hjælp af affinitetskromatografisk fra-25 separering af præparatet på dextransulfat-sepharose blev alle rede beskrevet i forbindelse med fig. 1.

Den elektroforetiske fraseparering af proteinerne med faktor IX-aktivitet og med FEIB-aktivitet, hvortil der bliver henvist 30 i forbindelse med fig, 2, kan gennemføres på følgende måde.

Som bærer for den elektroforetiske fraseparering af de forskellige proteiner tjener en celluloseacetatmembran , som er fugtet med elektroforesepufferen (pH-værdi 8,6, ionstyrke 0,075).

3 5 På denne membran påføres prøverne, der skal analyseres, sammen med et normalt humanplasma som standard, og heraf frasepareres i elektrisk felt; separeringen sker ved, at forskelligt ladede 12

DK 155500B

proteiner vandrer med forskellig hastighed i det elektriske felt. Til dette formål bliver den med prøverne forsynede membran behandlet i en speciel med elektroforesepuffer fyldt cel-5 le i 16-18 minutter ved en spænding på 250 volt og en strøm styrke i begyndelsen på 4-6 milliampere.

Efter endt separeringsbehandling gøres de forskellige proteiner synlige ved anbringelse af membranen i en fikserings- eller farveopløsning. Efter nogle skyllebade bliver membranen gjort gennemsigtig i et yderligere bad, anbragt på en glasplade og tørret i tørreskab ved 100°C.

Den tørrede membran bliver nu analyseret i en automatisk regi-15 strerende og integrerende densitometer og giver separerings kurver, således som det er vist i fig. 2. De forskellige proteiner fremstår derved som bånd af forskellig styrke, hvis arealer er proportionale med de tilsvarende proteiners relative procentværdier, hvorved disse arealer bliver bestemt gen-20 nem den automatiske integration af densitometeret.

Indordningen af de forskellige bånd eller proteiner af test-prøven under de definerede proteiner eller proteingrupper sker ved sammenligning med båndene af det som standard medanalysere-25 de normale humanplasma. Sidstnævnte bliver ved den elektro foretiske analyse opdelt i fem proteingrupper, som definitionsmæssigt - angivet i rækkefølge efter aftagende vandringshastigheder i det elektriske felt - bliver betegnet som følger: albumin, α-globulin, 3-globulin, fibrinogen og γ-globulin.

30

Definitionen af FEIBA-enheden samt bestemmelsen heraf (virkningstest) er beskrevet i litteraturen, nærmere bestemt i AT-patentskrift 350.726 (US-patentskrift 4.160.025, DE-offentliggørel-sesskrift 27 34 821). En FEIBA-enhed defineres således som den 35 FEIB-aktivitet, der forkorter den aktiverede partielle throm- boplastintid for et faktor VIII-inhibitorplasma med høj titer til halvdelen af blindværdien. Bestemmelsen af aktiviteten af koagulationsfaktorerne II, VII, IX og X er ligeledes beskrevet i den kendte litteratur. Således svarer 1 enhed faktor 13

DK 155500B

snit er indeholdti 1 ml friskt, humant citratplasma.

Bestemmelsen af restaktiviteten af FEIBA efter inkubation i faktor VIII-inhibitor-plasma gennemføres på følgende måde.

5 1. Reagenser:

Reagenserne, der skal anvendes, er beskrevet i forbindelse med bestemmelsen af FEIBA-enhederne (virkningstest) i AT-patent-skrift 350.726 (US-patentskrift 4.160.025, DE-offentliggørel-sesskrift 27 34 821).

2. Test: 15

Af et af 50 FEIBA-enheder/ml indstillet præparat fremstilles med en opløsning af 7 g/liter natriumchlorid og 7 g/liter natriumcitrat, 2H2O som fortyndingsmiddel følgende fortyndinger: 1:2, 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16, 1 : 32 og 1 : 64. Af disse seks 20 fortyndinger fremstilles til enhver tid en 1 : 10-fortynding i faktor VIII-inhibitor-plasma (0,05 ml forfortyndet prøve + 0,45 ml faktor VIII-inhibitor-plasma).

Disse 1 : 10-fortyndinger i faktor VIII-inhibitor-plasma ("inkuba- 2 5 tionsblandinger") bliver nu straks og efter 1 times inkubation o ved 37 C analyseret efter følgende testskema: 0,1 ml "inkubationsblanding" 0,1 ml phospholipid-kaolin-suspension inkuberet ved 37°C i 1 30 minut 0,1 ml m/40 calciumchlorid.

Tidsrummet fra calciumchloridtilsætningen indtil koagulationsdannelsen måles med et stopur ligesom i virkningstesten.

3 S

3. Beregning af restaktivitet:

DK 155500 B

14

Analogt med beskrivelsen i virkningstesten bliver der nu lavet en justeringskurve med koagulationstiderne af de straks bestemte fortyndinger (ufortyndet prøve = 50 FEIBA-enheder/ml).

5 Aktiviteterne (FEIBA-enheder/ml) af de i 1 time inkuberede for skellige fortyndinger beregnes nu under anvendelse af justeringskurven og udtrykkes i procent af de forskellige aktiviteter af de ikke inkuberede fortyndinger. Middelværdierne af de således beregnede aktiviteter giver så den gennemsnitlige rest-1° aktivitet af prøven efter 1 times inkubation udtrykt i procent af udgangsaktiviteten før inkubation.

Resultaterne for de i eksemplerne 1 og 2 fremstillede præparater er angivet i tabellen side 19 , nemlig 65% og 57%.

15

Bestemmelsen af restaktiviteten af faktor IX efter inkubation i faktor IX-mangelplasma gennemføres på følgende måde: 1. Reagenser: 20

Faktor IX-mangelplasma: citratplasma fra en patient med kraftig hæmofili B (faktor IX under 1%).

Phospholipid/kaolin -suspension: PTT-reagens (PTT = Partial 25 Thromboplastin Time) fra Firma Immuno Diagnostica Ges.m.b.H.

Til undersøgelsen blandes den nødvendige mængde faktor IX-mangelplasma med et tilsvarende volumen phospholipid/kaolin-suspension, hvorpå der inkuberes i 5 minutter ved 37°C og derpå i testperioden opbevares i et isbad.

30

Citrat-/kogsaltopløsning som fortyndingsmiddel for prøver*.

7 g/liter trina triumcitrat, 21^0, 7 g/liter natriumchlorid calciumchlorid m/20 (0,05 molær): opbevares ved 37°C i test- 35 . .

perioden.

2. Test: 15

DK 155500B

Af et til 50 faktor IX-enheder/ml indstillet præparat fremstilles syv geometriske fortyndinger (1 : 2, 1 : 4 etc. indtil 1 : 128) med citrat-/kogsaltopløsning. Af den ufortyndede 5 prøve samt af de syv geometriske fortyndinger fremstilles der til enhver tid en 1 : 10-fortynding i faktor IX-mangelplasma (0,05 ml forfortyndet prøve + 0,45 ml faktor IX-mangelplasma).

Disse 1 : 1O-fortyndinger i faktor IX-mangelplasma ("inkubations-10 blandinger") bliver nu straks og efter 1 times inkubation ved 37°C analyseret efter følgende testskema, hvorhos hver inkubationsblanding før bestemmelsen bliver fortyndet 1 : 10 med citrat-/kogsaltopløsning: 15 0,2 ml blanding af faktor IX-mangelplasma og phospholipid/kaolin 0,1 ml "inkubationsblanding", 1 : 10 fortyndet med citrat-/ kogsaltopløsning, inkubation ved 37°C i 1 minut 0,1 ml m/20 calciumchlorid.

20 Tiden fra calciumchloridtilsætningen,til der sker koagulation, måles med et stopur.

3. Beregning af restaktivitet: 25 Med koagulationstiderne af de straks bestemte fortyndinger indstilles en justeringskurve (ufortyndet prøve = 50 faktor IX-enheder/ml), idet man afbilder koagulationstiderne mod de tilsvarende fortyndinger på dobbelt logaritmisk millimeterpapir. Aktiviteterne (faktor IX-enheder/ml) af de i 1 time 30 inkuberede forskellige fortyndinger beregnes nu under anven delse af justeringskurven og udtrykkes i procent af de pågældende aktiviteter af de ikke inkuberede fortyndinger. Middelværdierne af de således beregnede aktiviteter giver så den gennemsnitlige restaktivitet af prøven efter 1 times inkubation 35 udtrykt i procent af udgangsaktiviteten før inkubation.

Immunologisk bestemmelse af inter-a-trypsin-inhibitorer (ITI)

DK 155500 B

16 1. Metode:

Bestemmelsen sker med Ouchterlony-teknikken, hvorved et speci-5 fikt antistof diffunderer mod en antigenholdig prøve i et agar medium. Antigenet reagerer specifikt med antistoffet og danner • et immunbundfaldsbånd, som vurderes som positiv reaktion.

2. Reagenser: 10

Antiserum mod ITI fra kaniner, Beringwerke AG, Marburg/Lahn, BRD

Agar: En opløsning af 1,25 g agar, 0,9 g natriumchlorid og 100 mg natriumazid i 100 ml vand koges op i kort tid, og den varme 15 homogene opløsning udhældes som plader med en lagtykkelse på ca.

2 mm. Den afkølede størknede gel får derpå i en afstand på 5 mm udstanset ca. 2 mm store huller i to rækker.

Standard henholdsvis prøve: 20

Som justeringsstof tjener en protein-standardserum fra Beringwerke med et defineret indhold af ITI. Af denne referenceserum fremstilles en geometrisk fortyndingsrække i fysiologisk natrium-chlorid-opløsning (9 g NaCl/liter).

25

Man går frem på tilsvarende måde med prøven, der skal undersøges.

3. Test: 30 I en hulrække i agarenjanbringes fortyndingerne af justeringsstoffet henholdsvis prøven, der skal undersøges. I den ved siden af anbragte hulrække pipetteres det ufortyndede specifikke antiserum. Den således belagte agarplade inkuberes i 15 timer ved 37°C. Derpå sker aflæsningen af immunudfældningerne.

3 5

DK 155500B

17 4. Beregning af ITI-koncentrationen:

Som målestok for ITI-koncentrationen af en prøve gælder sådanne 5 fortyndingstrin, hvor der netop endnu kan ses en udfældning ("Titer" af prøve). ITI-koncentrationen af prøven, der skal undersøges, beregnes på følgende måde: !^β·- a-^ x ITI-koncentration af standarden.

10 titer af standard ITI-koncentrationen angives i mg % (mg/100 ml).

De ifølge eksemplerne 1 og 2 fremstillede præparater havde efter gennemførelse af de ovenfor beskrevne bestemmelsesmetoder føl-15 gende karakteristiske værdier;

Kurverne på tegningernes fig. 1 og 2 svarer med hensyn til den . affinitetskromatografiske og elektroforetiske fraseparering til d 2Q efterfølgende angivelser i eksempel 2.

25 30 35

18 DK 155500B

ni Η Η i—I H

tn O O O U

_i (ji P (0 P (ti •ø. cn M S S S3 £ uL \

HH ft g g g S

cu cn o in -ΐ Η i .p ft h. kkvk rij oooo (Dg n oo o cn PQ m n m -i H Q) CN CN CN CN CN Η *·***·* H tn H oooo M fe ' '

Jj M CO rH

(Q N H CO

g

S O O

U_1

rH rH rH rH

_p O ϋ u u frt ίΰ its cd cd u tr. s a s a .

Ρ Ηί £4 β «3 ca cs ft \ g g g g ^ Η ft

sjQ) o co o cn h I λ Η ® H

ft ft >* <j N CO N N

l g vo in ^ co N1 W ^ ^ '

rtj φ CN CN CN CN CN H OOOO

pq cn Η i 1

Η M ft Ν' CO

Η Η H ro ft o - - ' H O O 1 β β

0) CD

-p Tti Ti

CQ i—I CD CD

CD -P > >

-P -P

I Ti -P -P

P fi CD CD

(ϋ ·Η Ρ P

H CD CD

tn tn Ρ P

cn β CD Ti η Ti h

CD -P tn CD CD CD (D

£ β o > > ,

M Ρ -Ρ -P

-P p -P (ti -P CD -P CD

rP -P ip x! CD -P CD -P

H g H -P> Ctiftp-Hp-H

g\grP CD P CD (D > (D > \ P \ g -p β tn tn ρ ·Ρ ρ ·Ρ

p CD p \ -PCD 0 I Η -Ρ Η -P

H CDTiCDP >tJ> +J 4J (ϋ X 0) ^ g TiCDTiCD -P O cdcti tti cd \ CD X! CD Ti -ΡΛ

P X! β X! CD Λ g O H CD X CD PQ

CD β (ϋ β Xi tti O PP-PH-PH

rp CD I CD β p Ή ^ω·Ρ··ΡΗ CD I H I CD β X! (ti tn β > ft > ft χ! Η Η X I CD -Ρ χιρ-ρ -ρ

β Η > Η X tn tn (DP-PrP-PH

CD ΟΡβ -p .p ,¾ (ti Xi tti 1 Ρ Ρ Ρ Ρ Λ Ο ·Η -Ρ X (ti g tti g ri! OOOO g Μ-Ι Ρ β CD I ·Ρ I ·Η ff) 4J-P+J+) Ο CD Ή d X Μ ffl Μ H ^ ,¾ Ai Μ Ρ -Η Μ ft! Η^Η^4 ft p (ti tti Ρ ΧίΡΟ ιρ »Ρ · Ρ ft] (ti

_ft_ft ft fa ft_Eh P P_<; ft ft S ft S

19 DK 155500 B

H

g, " S

H_l Q, o\o o\° o\P o\o o\° H

.g ο ·3· co o o r" tn \ φ I'- i—I H ^ P'

P to ; -R

S S

d P --- CO —-—--------- § —

P

m P H f β i.

cd a) 2

a ft H

Oj £ 0\0 o\P o\° o'P o\0 H

j. (2j ^ r' o o in o , H

O, tfl <X> Η H »XI <x> i λ: -21 f< H « n

H

H ____________________________!°_.

β •rj <u g +) 6

O <0 -H

P g P

Q, Φ CO

g to H

H-| -P Ή rl

β <D 4-1 CU fH

p [ cd td tyi Ή H p P É d > o p co •rl p -H p P <D fd

pH) P 0) Ή H

0) -P Μ P P X £U

L| -rl β Ρ Ή H r—1 P

id > i α) P 0) o Q, P tfl p a H g» P, Q) ρ Γζ) Ο <ί ·Ρ Ο β ·Ρ

tfl p -H PP CQ1 ptd P

(dtdCPP cu fd hh P g -H

pltoo) P > HH cdl P

1(-1(¾1¾¾ -rl-rl HH HW β

Η 0) Η > P > , Η H

Ρ Η > β -HP P · p · β

tfl Η Ο Ρ Ρ β Φ H CD Η -H

H P to P I P p w p tT> β β ·Η ·Η ·Η -Η (¾ . <υ ο - ι-n > ' > >1 to Ρ βββ β Φ Π β ·Η β ρ JJ Ο I ·Η Ή ·Η ·Η Ρ Ρ Ο Ρ Ο Ρ

Ρ ΙΡΧΗΗΗ Φ Ρ Ρ·Η Ρ·Η I

Ο Ο Η β β β Ρ-Η β Ρ β Ρ β

«η ρ.ρρρρπρβ Ρβ I

Ρ Η Ο Ο Ο -Ρ Η to Ρ tn Ρ Ρ Η ΡΗΗΗΗβββ Φ β Φ φ φ'β&ι&ι&ιΗ'δ HP ΡηΡ Ρ η i—1 φ I I I β Ρ ^ β β β Η g β β Ρ· Η Η ο\° Η ο\° Η Η

DK 155500 B

20 SAMMENLIGNINGSFORSØG:

Frisk frosset plasma optøs ved 4°C og kryobundfaldet frasepareres. Til kryosupernatanten blev tilsat 5 g/liter kaolin, 5 og omrøringen blev foretaget ved en naturlig pH-værdi på 7,8.

Derefter blev kaolinen frasepareret, og det genererede stof med faktor VIII-inhibitor-bypass-aktivitet blev sammen med faktorerne II, VII, IX og X af prothrombinkomplekset adsorberet på DEAE-sephadex.

10

Analogt som beskrevet i dansk patentansøgning nr. 3845/77, eksempel 1, tilsættes derefter 0,5 g DEAE-sephadex A-50 pr. liter kaolinsupernatant, og der omrøres 1/2 time ved +4°C. DEAE-sephadex fraskilles. Den ovenstående plasma kan anvendes 15 til udvinding af γ-globulin og albumin. DEAE-sephadex underkas tes en dobbelt vask med en trinatriumcitrat-natriumchloridop-løsning, idet der overholdes en pH-værdi på 7,5.

Med henblik på eluering omrøres DEAE-sephadex med 3% natrium-20 chlorid, 0,1% trinatriumcitrat, 2^0 (2% af det oprindelige plasmarumfang) i 20 minutter, og eluatet udvindes ved filtrering. Dette dialyseres natten over overfor 0,05% trinatriumcitrat, 2^0, 0,1% natriumchloridopløsning ved pH 7,0 og ved +4°C, fryses derefter og underkastes en første lyofilisering 25 (bulk). I bulk-materialet bestemmes FEIB-aktiviteten samt aktiviteten af prothrombinkompleksets faktorer.

Efter bestemmelse af FEIBA-enhederne blev begge produkter un-30 derkastet den thromboseinducerende aktivitetstest ifølge Wessler, som beskrevet side 8 i den foreliggende tekst. I hvert tilfælde blev to FEIBA-enheder pr. kg legemsvægt afprøvet på 3 kaniner, og der opnåedes følgende resultater: 35

Claims

21 DK 155500B FEIBA-præparat^fremstillet Γ3 = t0 eller flere store thromber ved fremgangsmaden ifølge 4 = en enkelt thrombus, som uddansk patentansøgning nr. ^ fylder hele det isolerede 3845/77 j venesegment g ^1 = få makroskopisk synlige fi- brinpartikler FEIBA-præparat fremstillet W = ingen koagulation ved fjremgangsmådenMifølge = ingen koagulation den foreliggende opfindelse = ingen koagulation. 10 Som det fremgår af disse forsøg, er den thrombogene aktivitet af præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse betydeligt mindre end af sammenligningspræparatet (ifølge patentansøgning nr. 3845/77). 15 Til sammenligning blev præparatet ifølge patentansøgning nr. 3845/77 også underkastet affinitetskromatografi på dextran-sulfatagarose. Den resulterende elueringskurve fremgår af fig. la. Her ses igen klart forskellen mellem forstadiepræparatet (sammen!igningspræparatet) og præparatet fremstillet ved frem-20 gangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Således elueres den maksimale faktor IX-aktivitet samtidig med den maksimale FEIB-aktivitet, når det drejer sig om forstadiepræparatet, mens den maksimale faktor IX-aktivitet i præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse 25 klart elueres før den maksimale FEIB-aktivitet. Det fremgår således tydeligt, at FEIBA-præparatet fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse ikke blot adskiller sig fra sammenligningspræparatet, men også har signifikante fordele i forhold hertil takket være en reduktion i 30 uønskede thrombogene og vasoaktive bivirkninger. Patentkrav . 35

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et blodkoagulationsfremmende præparat på basis af humanproteiner med et indhold af koagulationsfaktorerne II, VII, IX og X og en faktor VIII-inhib: tor-bvoass-aktivitet. hvilket nr^nerst DK 155500 B 22 er fri for thrombogen aktivitet indtil mindst to enheder FEIBA pr. kg kanin i den thromboseinducerende aktivitetstest ifølge Wessler, 5 er fri for kallikrein-aktivitet og fri for prækallikrein-aktivator-aktivitet - målt i en vandig opløsning af præparatet med en FEIBA-koncentration indtil mindst 10 enheder pr. ml, 10. affinitetskromatografisk på dextransulfat-agarose ved hjælp af en NaCl-gradient kan separeres således, at proteinet med faktor IX-aktivitet elueres ved lavere NaCl-koncentration end proteinet med FEIB-aktivitet, 15 kendetegnet ved, at humanplasma bliver behandlet med sulfaterede højpolymere carbohydrater og/eller med basiske ionbyttere, og proteinblandingen med genereret FEIB-aktivitet bliver adsorberet, hvorpå det bliver udvundet ved eluering og koncentrering. 20

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plasmaet først i kort tid bliver behandlet med sulfaterede højpolymere carbohydrater, hvorpå proteinblandingen med genereret FEIB-aktivitet bliver adsorberet på en ionbytter på dextran- 25 basis og umiddelbart derpå bliver elueret og koncentreret.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at plasmaet bliver behandlet med en ionbytter på dextranbasis og efter mindst to timers indvirkning elueres den på ionbyt- 30 teren adsorberede proteinblanding med genereret FEIB-aktivitet og derpå bliver koncentreret. 35