NL8103329A

NL8103329A - Bloedstollingsbevorderend preparaat op basis van humane proteinen, alsmede werkwijze ter bereiding daarvan.

Info

Publication number: NL8103329A
Application number: NL8103329A
Authority: NL
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1980-07-22
Filing date: 1981-07-13
Publication date: 1982-02-16
Also published as: DK318581A; FI77048B; DE3127318A1; ATA378180A; IT1142032B; FI77048C; FI812295L; FR2487199A1; IT8123070A0; SE460174B; DK155500C; AT368883B; LU83499A1; DE3127318C2; SE8103759L; NL190268C; BE889640A; DK155500B; NO157245C; GB2080312A

Description

i i VO 211¾. ' _ -1-

Bloedstollingsbevorderend preparaat op basis van humane proteïnen, alsmede -werkwijze ter bereiding daarvan

De uitvinding heeft betrekking op een bloedstollingsbevorderend preparaat op basis van humane proteïnen met een gehalte aan stollings-factoren II, VII, IX en C en een factor VlII-inhibitor-bypass-activiteit.

Bloedstollingsbevorderende preparaten met factor VlII-inhibitor-5 bypass-activiteit, afgekort "FEIBA" (Factor Eight Inhibitor-Bypass Activity) zijn bekend. In het .Amerikaanse octrooischrift 1ΐ·.ΐβ0.025 wordt de bereiding van een dergelijk preparaat beschreven. Dit wordt bij de behandeling van patiënten die aan hemofilie A lijden en waarvan het bloed een tegen factor VIII gerichte ranst of (inhibitor) bevat, met 10 succes toegepast. De chemische structuur van de FEIBA-factor is tot dusver onbekend. Men weet alleen, dat het een proteïne met een molecuulgewicht in een gebied van ongeveer 100.000 betreft. De bereiding van het preparaat volgens, het bovengenoemde octrooischrift vond plaats door vorming uit humaan, citraat-ionen-bevattend plasma in afwezigheid 15 van vrije calciumionen door behandeling met wateronoplosbare anorganische stollings-fysiologisch-oppervlakteactieve stoffen, zoals kiezelgel of kaolien» met aansluitende adsorptie en eluering, waarbij een mengsel van de factoren II, VII, IX en X, de factor FEIBA en andere proteïnen wordt verkregen, waarvan de samenstelling tot dusver niet is beschreven.

20 Hoewel, het preparaat volgens het .Amerikaanse octrooischrift

Ij·. 160.025 zoals vermeld bij de behandeling van factor VlII-inhïbitor-patiënten van waarde is gebleken, bestaat het streven het toepassingsgebied te verbreden en de verdraagbaarheid -van FEIBA-preparaten verder te verbeteren, in het bijzonder ongewenste nevenreacties, zoals thram-25 bogene en vaso-actieve werkingen, minimaal te maken.

Aan deze doeleinden wordt volgens de uitvinding voldaan door een bloedstollingsbevorderend preparaat op basis van humane proteïnen met een gehalte aan stoüingsf act oren II, VII, IX en X en een factor VlII-inhibitor-bypass-activiteit, welk preparaat daardoor is geken-30 merkt, dat - het vrij is van thrcmbogene activiteit tot aan ten minste 2 eenheden FEIBA per kg konijn in de trcmbose-indueerende activlteitsproef volgens 8103329

« I

-2- "" , Wessler, - dat het vrij is van kallikrein-activiteit en vrij van prekallikrein-activator-activiteit - gemeten in een waterige oplossing van het preparaat met een FEIBA-concentratie tot. aan ten minste 10 eenheden/ml 5 - dat het affiniteitschromatografisch aan dextransulfaat-agarose door middel van. een laCl-gradient zodanig isoleerbaar is, dat het proteïne met factor IX-activiteit bij verlaagde NaCl-concentratie .wordt geëlueerd als het proteïne met EEIBA-activiteit; - dat de het proteïne met factor IX-activiteit en het proteïne met 10’FEIBA-activiteit bevattende eluaten bij elektroforetische isolatie o- en g-globulinen bevatten, waarbij de isolatiekrcmme in het a-gebied een hoofdtop, overeenstsnmend met 60-d0% van de totale proteïne,. een daaraan, aansluitende schouder van 10-20$ van de totale proteïne, alsmede een zich aan het schoudervomig verloop van de isolatie-15 kromme aansluitende zwak gevormde top in het 3-globulinegebied, overeenstemmend met een gehalte van 10-20% van. het' totale proteïne, vertoont.

De voornoemde gedefinieerde eigenschappen, nl. dat het preparaat vrij is van trombogene activiteit en van kallikrein-activiteit resp.

20: van prekallikrein-activator-activiteit - welke laatste verantwoordelijk zijn voor de vaso-actieve werkingen - betekenen dat het preparaat een uitstekende verdraagzaamheid bezit. De trambose-inducerende activiteit sproef en de proeven op· kallikrein-activiteit en prekallikrein-activator-activiteit zijn aan de deskundigen bekend. Afzonderlijk 25 worden deze in aansluiting aan de voorbeelden nauwkeurig aangegeven.

Het derde kenmerk van het preparaat volgens de uitvinding, de isoleerbaarheid langs affiniteitschromatografische weg aan dextransul-faat-agarose door middel van een NaCl-gradiënt is in fig. 1 van de tekening aan de hand van een voorbeeld toegelicht. De methode van de 30 affiniteitschramatografie aan dextransulfaat-agarose is bekend (D.S. Pepper en C. Prowse, Thrombosis Research J_1_ (1977)9 687-692).

Hierbij wordt dextransulfaat (molecuulgewicht 500.000) aan CNBr-geacti-veerd sepharose hB (Pharmacia Fine Cheaicals A.B. Uppsala, Zweden) gekoppeld. Het aldus gewonnen dextransulfaat-sepharose wordt in 35 0 ,k% trinatriumcitraat .O^O-oplossing (pH 7,k) in. evenwicht gebracht en in een kolom gevuld. Het te onderzoeken monster wordt op de kolom overgebracht en aansluitend met een HaCl-oplossing in 0's trinatrium- 8103329 I « -3- - citraafc.2H20 (pH 7**0 met stijgende NaCl-concentratie gefractioneerd geelneerd.

In fig. 1 zijn op de X-as de fraetienummers van de eluaten aan-gegeven. Op de linker Y-as zijn de activiteiten van de stolling s-5 factoren in eenheden per ml aangegeven en op de rechter Y-as de concentratie van de natriumchloride-gradiënt. in mol/1. Het lineaire verloop van de gradient is als lijn G aangegeven. Zoals uit fig. 1 "blijkt, wordt het proteïne met factor IX-activiteit in het gehied van 0,1-0,5 (molair) met een maximum "bij 0,3 (molair), het proteïne 10 met FEI3-activiteit "bij een HaCl-coneentratie in het gebied van 0,3-0,5 (molair), met een maximum bij 0,k (molair) geëlueerd.

De stijgende HaCl-concentratie is herkenbaar aan de HaCl-gradient G, die van 0 tot 0,65 molair HaCI loopt.

Ten slotte is voor het preparaat van de uitvinding als vierde 15 eigenschap ook het gehalte aan globuline bij elektroforetische isolering kenmerkend, zoals in fig. 2 van de tekening wordt toegelicht.

Eet bovenste deel van fig. 2 toont de isoleringskranme van de, de proteïnen met factor IX-activiteit en FEIB-activiteit-bevattende, eluaten via dextransulfaat-sepharose-chromatografie volgens de .uitvinding ' 20 aan de hand van een voorbeeld, terwijl daarentegen het onderste deel van fig. 2 de elektroforetische isoleringskranme van een natief menselijk plasma weergeeft. Men zal opmerken dat in dit voorbeeld de hoofdtop in het a-globulinegebied 70# van het totale proteïne bedraagt. Aan de hoofdtop sluit zich in het α-globulinegebied een schouder 25 aan, die ik % van het totale proteïnegehalte uitmaakt, waarna vervolgens op de schouder in het 3-globulinegebied een zwak gevormde top volgt, die 16% van het totale proteïne bedraagt.

Een voordelig verder kenmerk van het preparaat volgens de uitvinding is, dat de FEIB-activiteit na een incubatie van 1 uur in 30 factor 7III-inhibitcrplasma ten minste voor 50# behouden blijft.

Deze eigenschap wijst op een lang aanhoudende werkzaamheid bij toediening aan factor VlII-inhïbitor-patiënten.

Een ander voordelig kenmerk van het preparaat volgens de uitvinding is dat de factor IX-activiteit na een incubatie van 1 uur in 35 factor IX-deficient plasma ten minste voor 50# blijft behouden. Dit betekent, dat het preparaat weinig of een zeer gering percentage geactiveerde factor IX bevat. Het is bekend dat geactiveerde factor IX in 8103329 • « humaan, plasma wordt geïnactiveerd. Geactiveerde factor IX zon nadelige trombogene werkingen veroorzaken. Uit de literatuur (Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, Vol. 7^·» Hr. 7* 3028-3032, Juli 1977? "In vitro and in vivo correlation of clotting protease activity: Effect of heparin” van 5 S.H. Gitel, R.C. Stephenson en S. Wessler) is het bekend, dat juist factor IXa ten opzichte van. andere geactiveerde stollingsfactoren, zoals Xa en Ila (trambine), de hoogste trcmbogene activiteit bezit.

Tenslotte is een voordelige eigenschap van de bloedstollings-bevorderende preparaten volgens de uitvinding, dat deze een gehalte 10 aan inter-a-trypsine-inhibitor (ITI) van 0,05-5 mg/FEIBA-eenheden bezitten.

Het gehalte aan ITI bewerkt dat de trcmbogeniteit van het pre- Γ paraat volgens de uitvinding in de Wessler-proef laag is.

De uitvinding aavat verder een werkwijze ter bereiding van de 15 nieuwe bloedstollingsbevorderende preparaten op basis van humane proteïnen met een gehalte aan stollingsf act oren II, VII, IX en X en een factor VlII-inhibitor-bypass-activiteit, welke werkwijze daardoor is gekenmerktdat humaan plasma met gesulfateerde hoogpolymere koolhydraten en/of met basische ionenuitwisselaars wordt behandeld 20 :en het proteïnemengsel met een gevormde FEIB-activiteit wordt geadsorbeerd, waarna het door elueren en concentreren wordt gewonnen.

Bij de uitvoering van de werkwijze moet men er op letten, dat het plasma resp. de reactiedeelnemers vrij worden gehouden van stoffen, die de anti-trombine-III-activiteit kunnen opvoeren, zoals heparine 25 of heparinoiden.

Volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt het plasma eerst met gesulfateerde hoogpolymere koolhydraten kortstondig behandeld, het proteïnemengsel met gevormde FEIB-activiteit hierna aan een ionenuitwisselaar op dextran-basis geadsorbeerd en onmiddellijk daarna ge-30 elueerd en geconcentreerd.

Volgens een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt het plasma met een ionenuitwisselaar op dextran-basis behandeld en na ten minste een inwerking van 2 uur het aan de ionenuitwisselaar geadsorbeerde protelnenengsel met gevormde FEIB-activiteit geelueerd en daarna 35 geconcentreerd. Bij deze uitvoeringsvorm is de opwekking van de FEIB-activiteit afhankelijk van de inwerkingsduur. Deze kan tot aan ^8 uur bedrageni 810 53 2 -5- - -¼

De toegepaste werkwijzeaaatr egelen zijn niet-kritisch en kannen binnen ruime grenzen schommelen; zo kan de pH-waarde tussen 6 en 9 liggen» de temperatuur 0 en ^0°C, de toegepaste hoeveelheden dextran-sulfaat kunnen 0,1-500 mg/1 plasma bedragen en ten opzichte van DEAE-5 sephadex kan men 0,1-10 g/1 plasma toepassen. Als uitgangsmateriaal voor de werkwijze van de uitvinding kernen niet alleen natief humaan plasma, maar ook piasmafracties, bij voorbeeld kryobovenlaag en de Cohn-I-bovenlaag (8¾ alcohol) in aanmerking.

Het preparaat volgens de uitvinding en de werkwijze ter berei-10 ding daarvan worden in de volgende voorbeelden nader toegelicht, waarbij in aansluiting aan de voorbeelden de toegepaste bepalingsmethoden worden toegelicht en de resultaten in tabellen worden samengevat.

Voorbeeld I

1000 1 vers ingevroren menselijk citraatplasma weiden bij 15 Q-+li-°C ontdooid en het daarbij verkregen cryo-neerslag door centrifugeren bij +2°C afgescheiden. Aan de resulterende "cryo-bovenlaag η werden bij een natieve pH-waarde van 7»T 10 g dextransulfaat (mclecuulgewicht 500.000) toegevoegd; er werd 15 minuten bij +b°C geroerd, waarbij de stof FKIBA werd gevormd. 1 20 Hierna werden 500 g van de anionenuitwisselaar DEAE-sephadex A-50 (Pharmacia Fine Chenicals A,B. Uppsala* Zweden) toegevoegd en er werd een half uur bij +U°C geroerd, waarna de gevormde stof FEIBA tezamen met de factoren van het protrcmbineccmplex (II, VII, IX en X) en inerte proteïnen aan het onoplosbare DEAE-sephadex werd geadsorbeerd.

25 Het DEAE-sephadex werd onmiddellijk na de adsorptietrap door centrifugeren of filtratie afgescheiden; het bovenstaande plasma kan voor het winnen van gamma-globuline en albumine worden toegepast.

Het DEAE-sephadex wordt aan een tweevoudig wasproces onderworpen; daarbij wordt het DEAE-sephadex eerst met 50 1 van een oplos-30 sing, bestaande uit k g/1 trinatriumcitraat.2H20, J g/1 natrium-chloride en 18 g/1 dinatriumwaterstoffosfaat. 12HgO in gedestilleerd water, pH-waarde T,5, gedurende 15 minuten bij +4°C geroerd. Na afscheiding door filtratie wordt het DEAE-sephadex met 50 1 van een oplossing, bestaande uit b g/1 trinatriumcitraat. 2^0 en 7 g/l natrium-35 chloride in gedestilleerd water, pH-waarde 7,5 gedurende 15 minuten bij +U°C geroerd en hierna weer door filtratie afgescheiden.

Ter eluering wordt het DEAE-sephadex met 25 1 van een oplossing, 81 03 3 2 9 !r * die "bestaat uit 30 g/1. natriumchloride en 1 g/1 trinatriumcitraat.2H20 in gedestilleerd water, pH-waarde 7»0, gedurende 20 minuten "bij +U°C geroerd. Het eluaat, dat de gevormde stof FEIBA, de factoren van het protrcmbineccmplex (II, VII, IX, X) alsmede inert proteïne 5 bevat, wordt door filtratie gewonnen, het DEAE-sephadex wordt afgevoerd. Het eluaat wordt gedurende de nacht tegen 1000 1 gedestilleerd water bij +1*°C gedialyseerd, hierna ingevroren en aan een eerste lyofyli-seringstrap onderworpen. In de verkregen massa wordt de FEIB-activiteit bepaald en wel. volgens de in het Amerikaanse octrooischrift U.160.025 10 beschreven methode.

Voor de bereiding van de phaamaceutisch toepasbare preparatenmet FEIB-activiteit wordt deze massa in zoveel gedestilleerd, pyrogeen-vrij water opgelost, dat de FEIB-activiteit tussen 10 en 50 FEIBA— eenheden/ml bedraagt (in het betreffende geval 25 FEIBA-eenheden/ml).

15 Ha toevoeging van de nodige zouten ter verkrijging van isotonie. en het· instellen van de pïï-waarde tussen 7»Q en 7»5 wordt de oplossing door een membraanfilter geklaard en tenslotte, door een 0,2 micrometer membraanfilter steriel gefiltreerd. 20 ml van de oplossing wordt onder steriele omstandigheden in de eindhouders gevuld., diepgevroren en 20 gelyofiliseerd.

Voorbeeld II

1000 1 vers ingevroren menselijk citraatplasma.werd bij 0-+U°C ontdooid en het daarbij verkregen cryo-neerslag door centrifugeren bij +2°C afgescheiden. Aan de verkregen "cryo-bovenlaag" werden bij 25 een natieve pH-waarde van 7*7 500 g van de anionenuitwisselaar DEAE-sephadex A-50 (van Pharmacia Fine Chaaicals A.B. Uppsala, Zweden) toegevoegd en er werd een half uur bij +U°C geroerd, waarbij de factoren van het protranbineccmplex (II, VII, IX, X) en inert proteïne aan het DEAE-sephadex werden geadsorbeerd.

30 Hierna liet men het mengsel 12 uur bij +4°C staan; gedurende deze "contacttijd" werd de stof FEIBA gevormd.

Het DEAE-sephadex werd na 12 uur "contacttijd" door centrifugeren of filtratie afgescheiden; het bovenstaande plasma kan voor het winnen van gamma-globuline en albumine worden toegepast.

35 De verdere verwerking van het DEAE-sephadex (tweemaal wassen, elueren, enz.) vindt op dezelfde wijze als in voorbeeld I beschreven, plaats.

8103329 -7- * _ » —

De trcmbose-inducerende activiteitsproef volgens Wessler, die in de literatuur en wel in J. Appl. Physiol. lj+ (1959), 9^3-9^-6, "Biologie assay of a thrcmbosis-inducing activity in human serum” door Stanford Wessler, Stanley M. Reimer en Mindel C. Sheps is 5 beschreven, wordt op de volgende wijze uitgevoerd:

Per proef werden 3 konijnen toegepast. De dieren werden met nembutal verdoofd; na een extra locale verdoving werd de vena jugular is aan de hartkant blootgelegd, op een afstand van 1-2 cm werden 2 ligaturen voorbereid.

10 Het te onderzoeken preparaat werd nu in de gewenste dosis tegenover de blootgelegde vena jugularis liggende oorvenen binnen 15 seconden geïnjecteerd. Binnen 10-25 seconden na het beëindigen van de injectie van het preparaat werden de voorbereide ligaturen toegetrokken.

Het geïsoleerde veensegment blijft nu 10 minuten in situ in de cavea.

15 Hierna wordt het veenstuk uit het dier verwijderd en in een petrischaal in een 5$*s natriumcitraatoplossing aan stukjes gesneden en de inhoud volgens het volgende schema geëvalueerd.

0 = geen stolsel..

1 = weinig macroscopisch zichtbare fibrinedeeltjes ; 20 2 = enige kleine trcmben 3 = twee of meer grote trcmben = een afzonderlijke, het totale geïsoleerde veensegment, opvullende trcmbus.

De proef werd in het geval van een ^-reactie als positief gewaar- 25 deerd. Voor het preparaat volgens de uitvinding is het wezenlijk, dat bij injectie van het preparaat, dat tot ten minste 2 eenheden FEIBA/kg proefdier bevat geen 4-reactie optreedt.

De bepaling van de kallikrein-activiteit en de prekallikrein- - - activator-activiteit wordt op de volgende wijze uitgevoerd.

30 Kaliikrein: 1. Methode:

Kaliikrein splitst para-nitrc-aniline (pM) amidolytisch van een specifiek chromogeen substraat af. De concentratie van pHA wordt fotometrisch bij een golflengte van 405 nm gemeten.

35 2. Reagentia:

Buffer:

Oplossing A: 3,03 g "TRIS" en 1,7 g imidazool worden in 500 ml 8103329 -8- ' ' __ 0,11 zoutzuur opgelost en met water tot 1000 ml aangevuld.

Oplossing B: g "TRIS" en 2,27 g imidazool worden in 500 ml 0,1 II zoutzuur opgelost en met water tot 1000 ml aangevuld.

Oplossing C: 11,69 g natriumchloride wordt met water tot 1000 ml 5 opgelost.

Oplossingen A en B worden zo lang gemengd, tot een pH-waarde van 7,9 is bereikt’. Dit mengsel wordt met het gelijke volume van oplossing C vermengd.

Chrcmogeen substraat S-2302 (firma Kabi, Stockholm): 10 H-D-Prolyl-L-fenylalanyl-L-arginine-p-nitroanilide-diwaterstof chloride 1 millimolaire oplossing van S-2302:25 mg in Ui ml water.

Monster.

Het monster· wordt in het oorspronkelijke volume opgelost en onverdund in de proef toegepast.

15 3. Proef.

In een waterbad bij een temperatuur van 37°C worden in een kunst-stofbuisje 1,0 ml. buffer op 37°C gebracht 0. 1.ml monster 20 0,2 ml chrcmogeen substraat S-2302 gepipetteerd. Dit mengsel wordt in een op 37°C getempereerde fotcmeter gebracht en de toename van de optische dichtheid per minuut ( Δ OD/Min) bij een golflengte van h-05 nm, bij een laagdikte van 10 mm, gemeten. De activiteit van het monster wordt in &0D/min uitgedrukt.

. 25 Prekallikrein-activator: 1. methode:

Uit een gezuiverd prekallikreinpreparaat (PKK) wordt door middel van een prekallikreinactivator (PKKA) kallikrein (KK) gevormd.

Het kallikrein splitst paranitroaniline (pNA) amidolytisch van een 30 specifiek chromcgeen substraat af. De concentratie van pNA wordt fotometrisch bij een golflengte van h-05 nm gemeten.

2. Reagentia:

Buffer- en chrcmogeen substraat kernen overeen met de bij de kallikrein-bepaling beschreven reagentia.

35 Prekallikreinpreparaat:

De bereiding van het preparaat vindt plaats volgens een voorschrift van Harpel, gemodificeerd door M.S. Horowitz (Hew York Blood 8103329 -9- _

Center). Daarbij wordt humaan citraatplasma met behulp van een DEAE-cellulose behandeld. De niet aan DEAE-cellulose gebonden fractie bevat het prekalTikrein.

Positieve controle (standaard): 5 Als standaard (referentiewaarde) wordt een albuminepreparaat van het Bureau of 3iologics (BoB) van de Food and Drug Administatioa, 3ethesda, Maryland, 20205, U.S.A. toegepast. Dit preparaat bevat een prekallikreinactivator. De kallikreinvorming met deze BoB-standaard stelt de referentiewaarde 1 voor resp. wordt aan 100,¾ gelijkgesteld.

10 Monster:

Het monster wordt in het oorspronkelijke volume opgelost en onverdund in de proef toëgepast.

3. Proef;

In een waterbad, bij een. temperatuur van 3T°C, worden in een 15 kunststofbuisje 0,05 ml prekallikreinpreparaat 0,05 ml monster a) BoE-standaard voor de referentiewaarde b) proefmonster (in een tweede proef charge) gepipetteerd. Ha een incubatie van 10 minuten bij 3T°C wordt j 20 0,T ml bufferoplossing 0,1 ml chrcmogeen substraat S-2302 gepipetteerd. Dit mengsel wordt in een op 37°C getempereerde fotaneter gebracht en de toename van de optische dichtheid per minuut (Δ 0D/min) bij een golflengte van ^05 urn, bij een laagdikte van 10 mm gemeten.

25 De activiteit van een minster (AOD/min) wordt factorsgewijze - ten opzichte van de BoB-standaard met een getal 1 - resp. in procent van de BoB-standaard, uitgedrukt.

De karakterisering van het preparaat van de uitvinding door affi-niteitschrcmatografische isolering van het preparaat aan dextransulfaat-30 sepharose werd reeds met fig. 1 beschreven.

De eiektroforetische isolering van de proteïnen met factor IX-activiteit en met FEIB-activiteit, waarnaar in verband met fig. 2 op is gewezen, kan op de volgende wijze worden uitgevoerd.

Als drager voor de eiektroforetische isolering van de verschil-35 lende proteïnen dient een celluloseacetaat-membraan, dat met de elektroforese buffer (pH 3,6, ionensterkte 0,075) is bevochtigd. Op dit membraan worden de te analyseren monsters - tezamen met een normaal 8103329 -10- ‘ τ . humaan plasma als standaard - aangebracht en hierop in een elektrisch veld geïsoleerd; de scheiding vindt plaats door dat de verschillend geladen proteïnen in het elektrische veld met verschillende snelheden.

"bewegen. Voor dit doel wordt de met het monster voorziene membraan 5 in een speciale, met elektroforesebuffer gevulde cel 16—1 β minuten hij een spanning van 250 Volt en k-6 m.Amp. beginstroomsterkte behandeld.

Na beëindiging van de scheidingstrap worden de verschillende proteïnen door het membraan in een fixeer- resp. kleur oplos sing in te 10 brengen, zichtbaar gemaakt.. Na enige spoelbaden wordt het membraan in een verder bad transparant gemaakt, op een glasplaat aangebracht en in een. droogkast bij 100°C gedroogd.

Het gedroogde maabraan wordt nu in een autcmatisch registrerende en. integrerende densitcmeter geanalyseerd en er worden investerings-15 krommen verkregen, zoals in fig. 2 voorgesteld. De-verschillende proteïnen verschijnen daarbij als verschillend sterke banden,, waarvan de oppervlakken evenredig zijn met de relatieve procentwaarden van de overeenkomende proteïnen,, waarbij deze vlakken door de automatische integratie van de. densitcmeter worden gemeten.

20 De toewijzing van de verschillende banden resp. proteïnen van het proefmonster aan gedefinieerde proteïnen resp. proteïnegroepen, vindt plaats door vergelijking met de banden van het als standaard meegeanalyseerde normale humane plasma. Dit laatste wordt bij een elektro-foretische analyse in 5 proteïnegroepen gesplitst, welke per definitie -25 in de volgorde van afnemende verplaatsingssnelheden in het elektrische veld - als volgt worden aangeduid: albumine, α-globuline, p-globuline, fibrinogeen en gamma-globuline.

De definitie van de FEIBA-eenheid, alsmede de bepaling daarvan (werkzaamheidsproef) is in de literatuur, en wel in het Merikaan.se oc-30 trooischrift 4.160.025 beschreven, De bepaling van de activiteit van de stollingsf actor en II, VII, IX en X is eveneens in de voornoemde literatuur beschreven.

De bepaling van de rest-activiteit van FSIBA na incubatie in factor VlII-inhibitor-plasma wordt op de volgende wijze uitgevoerd: 35 1. - Reagentia.

De toe te passen reagentia zijn in verbinding met de bepaling van de FEIBA-eenheden (werkzaamheidsproef) in het Amerikaanse octrooi- 81 0 3 3 2 9 -11- — schrift k.160.025 beschreven.

2. Rroef:

Van een op 50 FSIBA-eenheden/ml ingesteld preparaat -worden net een oplossing van J g/1 natriumchloride en T g/1 natriumcitraat .25^0 5 als ver donning smi ddel de volgende verdunningen bereid: 1:2» 1:^+, 1:8, 1:16, 1:32 en 1: 6^4-. Van deze zes ver'dunningen -wordt steeds een 1:10-verdunning in factor VlII-inhibitor-plasma bereid (0,05 ml voorverdunde monster + 0,^5 ml factor YlIIk-inhibitor-plasma). Deze 1:10-verdunningen in factor VlII-inhibitor-plasma ("incubatiemengsels") worden nu onmid-10 dellijk en na 1 uur incubatie bij 3T°C met bet volgende proef schema geanalyseerd: 0,1 ml ,rinc^batieπLengsel,, 0,1 ml fosfolipide-kaoline-suspensie 1 minuut bij 3T°C incuberen 0. 1 nlm/lfO calciumcbloride.

15 De tijdsduur van de calciumchloridetoevoeging tot aan de stolselvorming wordt met een stopwatch, zoals in de activiteitsproef gemeten.

3. Berekening van de rest-activiteit:

Analoog aan de beschrijving van de werkzaamheidsproef wordt ‘ 20 nu met de stollingstijden van de onmiddellijk bepaalde verdunningen een ijkkramme samengesteld (onverdund monster = 50 FEIBA-eenheden/ml).

De activiteiten (FEJBA-eenheden/ml) van de 1 uur geïncubeerde verschillende verdunningen worden nu onder toepassing van de ijkkrcmme berekend en uitgedrukt in procenten van de steeds aanwezige activiteiten 25 van de geïncubeerde verdunningen. De gemiddelde waarden van de aldus berekende activiteiten geven dan de gemiddelde rest-activiteit van het monster na een uur incubatie, uitgedrukt in procenten van de uitgangsactiviteit voor de incubatie, aan.

De bepaling van de rest-activiteit van factor IX na incubatie 30 in factor IX-defieient-plasma wordt op de volgende wijze uitgevoerd: 1. Reagentia:

Factor IX-deficientplasma: citraatplasma van een patiënt met sterke hemofilie B (factor IX onder 1 fa).

?osfolipide/kaoline-suspensie: PTT-reagens van de firmal ünmuno 35 Diagnostica GmbH. Voor de beproeving wordt de noodzakelijke hoeveelheid factor IX-deficient plasma net een gelijk volume fosfolipide/kaoline-suspensie gemengs, 5 minuten bij 3T°C geïncubeerd en dan gedurende de 8103329 wr Μ -12- ^ proefperiode ia een ijsbad bewaard.

Citraat~/keukenzoutoplossing als verdunningsmiddel voor monsters: 7 g/1 trinatriumcitraat .SHgO, 7 g/1 natriumchloride.

Calciumchloride m/20 (0,05 molair): 5 Gedurende de proefperiode bij 37°C bewaren.

2. Proef: .

Van een op 50 factor IX-eenheden/ml ingesteld preparaat worden T geometrische verdunningen (1:2, 1:4, enz. tot 1:128) met een citraat/keukenz out oplos s ing bereid. Van het onverdunde monster, alsmede 10 van de 7 geometrische verdunningen, wordt steeds een’1:10 verdunning in de factor IX-deficientplasma bereid (0,05 ml voorverdund monster + 0,4-5 ml factor IX-deficientplasma).

Deze- 1:1 Q-verdunningen in factor IX-deficientplasma ("incubatie-mengsels”) worden nu onmiddellijk en na 1 uur incubatie bij 37°C volgens het ' 15 volgende proef schema geanalyseerd, waarbij elk incubatiemengsel voor de-bepaling 1:10 met citraat-keukenzautoplossing wordt verdund: 0,2 ml mengsel van het factor IX-deficientplasma en fosfolipide/ka-oline 0,1 ml '’incubatiemengsel,T, 1:10 verdund met citraat/keuzenzout-20 oplossing 1 minuut bij 37°C incuberen 0,1 ml m/20 calciumchloride.

De tijdsduur van de calciumchloridetoevoeging tot aan de stolsel-vorming wordt met een stopwatch gemeten.

25 3. Berekening van de Wessler-activiteit.

Met de stollingstijden van de onmiddellijk bepaalde verdunningen wordt een ijkkramme samengesteld (onverdund monster = 50 factor IX-eenheden/ml) doordat men de stollingstijden ten opzichte van de overeenkomstige verdunningen op dubbel logaritmisch millimeterpapier op-30 tekent. De activiteiten (factor IX-eenheden/ml) van de 1 uur gexncubeer-de verschillende verdunningen werden nu onder toepassing van de ijkkramme berekend en in procenten van de telkens optredende activiteit van niet-gexncubeerde verdunningen uitgedrukt. De gemiddelde waarden van de zo berekende activiteiten geven dan de gemiddelde restactiviteit van het 35 minster na 1 uur incubatie, uitgedrukt in procenten van de uitgangs-activiteit voor de incubatie.

Immunologische bepaling van inter-a-trypsine-inhibitor (ITI): 8103329 ~ -13- ~ " — 1. Methode:

De "bepaling vindt plaats met de Ouchterlany-techniek 'waarbij een specifiek antilichaaa in een ag arme dim tegen een antigeenhoudend monster diffundeert. Het antigeen reageert specifiek met het antilichaam 5 en vormt een immunopr ecipit ati eb and, die als positieve reactie wordt gewaardeerd..

2. Reagentia.

Antiserum tegen ITI van konijnen, Behringwerke A.G. Marburg/Lahn, Bondsrepubliek.

10 Agar:

Een oplossing van 1,25 g agar, 0,9 g natriumchloride en 100 mg natriumazide in 100 ml water wordt kort gekookt en de hete hcmcgene oplossing in een laagdikte van ca 2 mm in platen gegoten. In de af gekoelde vastgeworden gel worden op een afstand van 5m ca 2 mm grote 15 gaten in 2 rijen uitgestanst.

Standaard- resp. monster:

Als ijksubstantie dient een proteïne-standaardserum van de Behringwerke met een gedefinieerd gehalte aan UI. Uit dit referentie-serum wordt een g-ecmetrische verdunningsreeks in fysiologische natrium- / 20 chlorideoplossing (9 g NaCl/l) bereid. Met het te beproeven monster wordt zoals met de standaard te werk gegaan.

3. Proef:

In een reeks gaten in agar worden de verdunningen van de ijksubstantie resp. van het te beproeven monster aangebracht, in de er 25 naast gelegen reeks gaten wordt het onverdunde specifieke antiserum gepipetteerd. De aldus voorziene agarplaat wordt 15 uur bij 37°C gelncubeerd. Daarna vindt de aflezing van de immunoprecipitaties plaats.

4. Berekening van de ITI-concentratie:

Als maatstaf voor de ITI-concentratie van een monster geldt die 30 verdunningstrap, waarbij neg juist een precipitatie zichtbaar is ('’titer" van het monster). De -ITI-concentratie van het te beproeven monster wordt als volgt berekend:

Titer van proefmonster/titer van standaard x ITI-concentratie van de standaard.

35 Se ITI-concentratie wordt in mg-$ (mg/100 ml) aangegeven.

De volgens, de voorbeelden I en II bereide preparaten hadden na uitvoering van de bovengenoemde bepalingsmethoden de volgende kengetallen: 8103329 -tfc- . _

De voorstellingen in de fig. 1 en 2 van de tekening kamen vat de affiniteitschramatografische en elektroforetische isolatie "betreft overeen met de hierna volgende gegevens van voorbeeld II.

81 0 3 3 2 9 ' -15- _ I-) Η Η Η Ο Ο Ο Ο aJ aJ α) β5 „ ig 13 ft a

H $ g g S S

„ Η Ο Ο Ο O [ ft 3 « O IfV ~ - 4 S 8 (O* VO ^ OJ S o o o o Η n CU CU OJ Ol CJ H ^ J.

g o S - « ft > ~ o o •ri

V

B Η Η Η H

S π a a ο o i r cö CÖ CÖ CÖ Γ M Ϊ5 S S 5¾ i h f g s s g B rH I ON r- 0\ ^ §, 3 <k -=r cn p- -=f s? m ¢3 » « * * “ajocoocut- h oooo

Oj ja « * " * * g) _L /Λ ΐ \B 1Λ J· CO J E £

OCMCMOJCUOJ

; £ 2 O O

/

Ci a) oft >r_ ft 0 *!7 I? T pp ft ft _ .

¢)3 ft ft H cd ft ft ra 0 0 ra -P <u <u o o ft ft

é p *rs P ”~3 H

-H :0 -H :0 ¢) bo 0 ,a 0 ,π 0

rH Ö ra ΰ) tD

•rl O <Ö 'ft

0 ft ft -P ft P

>H ft ·Η ft 0 ·Η 0 ·Η Ο <Ρ ft 0 0 0 0 Η -Ρ > ? Λ ί ^ _| Η ι—I ·Η ft 0 η ·Η ι-ι ·Η 00 bOMï<ü!>:0> < r; -ν. d -Pft Ο!0·Η0·Η ö0ft<.-H0 ^jjjfco-psa-p H 0 'ft 0 ft > M ft , J2 , 2 g ft O ft 0 -HO s ft P, ft -P ai ·< 0 ft 0 ft PP P 2 ‘d J* ‘St si ft cl λ3 ü) o ë k H 0 ><t Φ P-j 0 ö 0 s p d 8 -¾ g -S 1 -5 a ft 0 0 0 ft ft 5 2 *d r d Ξ raft i00 0 ft ft cq g > > P-f r*|(—110 ft ft t> ft ft ·Η .

ΐ Η Η X I 0 ·Η ft -P 0 -P 0 0 i—ι ί> H bil S M s ^ O ij « d

Iftftftft 2 Jj J. § J, .§ < o o o o g ft s ^ u ‘5 2 m cq+a+j^+j ¢3^0 >H _ M a Η a I-! ft ft ft ft ft?.'

23 "3 ft al co P ft O q-jftfeSfcS

|x,!2)fe&iE5-f>ft<<:!5 , 3103329 r* ' ~ -16- - V» ft

h I

CQ H S

Ö ft

OP H

&0 H

H<ü 15¾¾¾¾¾ Vt 1¾ 0 CU O P" MD O O t— LA ' ^ p · . fr— t— *- IA A fcp P Ö :

•H O OJ

(1) > * f-i o

CU

P

1ö d Π U H 3 & * a

h Η H

ft <u p 1 (U ft <J P ^5¾.¾¾¾¾ ^ ^ 'v.

pq d t- VP C— O O LA O ÖO

H O * MD *- <— MD MD g ^ > Ό o" o u ft P .

CD cö P S ij P P m d d ·Η ·Η cö d cö cö <D 0) Η g

!> p +3 fn fL, T- CQ

•Η ·Η d 1 03 d

M|> f> d d H O

S ·Η ·Η O d ft P

•Η P +5 +5 , , P

ra o o -h W d P

P cö d d p η <d ·η

•Hl ld ·Η ·Η P

HP Sn^PdOd

ft H O <Ö d O ·Η *H

— ra ft ft d +j p pq h p ft I

h ft ft o <u ·η d η i p <y <u (U CO pp CD >> ft H d P d P d P d P ·Η ft H ft I Ή cö <u <u ft σ ·η ρ h X ra p p Op O p f> Ρ H ft aio O ·Η CÖ ·Η · ·Η · Pi m m X p ra pi (uftaftn H -HH OdP ft _ Ej

O +3 · « « CÖ ·Η ·Η Ö ·Η d I

!> CU ft CU CD <D | 0) b» ·Η fc> ·Η d

δ d ddddd'H -H P

CU O p Ή ·Η Ή ·Η ft P CU P CU ft

> ft CU Η Η H <D ·Η O ·Η ü ·Η H

O 8 2 d d d H cö ft cöp<;

d P p P ft H pcö pcö I

p cu o o O ·η cö rap rap d ft d Η Η H HP cud o d <u cutHcDOcD H (U W O WO P H 0) 1 1 I Cö d d d d

ft P 8 3 a X ft >5. H H

81 03 3 2 9

Claims

1. Bloedstollingsbevorderend preparaat op basis van humane proteïnen met een gehalte aan stollingsf actoren II, VII, IX en X en een factor 7III-inhibitor-bypass-activiteit, met het kenmerk, dat - het vrij is van traubogene activiteit tot ten minste 2 een-5 heden FEIBA per kg konijn in de traabose-inducerende activiteitsproef volgens Wessler, - dat het vrij is van kalliklein-activiteit en vrij van pre-kallikrein-activator-activiteit, gemeten in een waterige oplossing van het preparaat met een FEIBA-concentratie tot aan ten minste 10 10 eenheden/ml, - dat het affiniteitschrcmatografisch aan dextransulfaat-ag arose door middel van een NaCl-gradiënt zodanig isoleerbaar is, dat het proteïne met factor IX-activiteit bij lagere NaCl-concentratie wordt geëlueerd ais het proteïne met EEIB-activiteit; 15. dat de, het proteïne met factor IX-activiteit en het proteïne met EEIB-activiteit bevattende, eluaten bij elektrofcretische isolering ct- en S-globulinen bevatten, waarbij de isoleringskranme in het < a-gebiea een hoofdtop, overeenkomend met 60-80% van het totale proteïne, een daaraan aansluitende schouder van 10-20% van het totale 20 proteïne, alsmede een na het schoudervormig verloop van de kromme volgende, zwak gevormde top in het S-globulinegebied heeft, overeenkomend met 10-20¾ van het totale proteïne.

2. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het proteïne met factor IX-activiteit bij een NaCl-concentratie van 0,1-0,5 25 (molair) en het proteïne met FEIB-aetiviteit bij een NaCl-concentratie van 0,3-0,5 (molair) wordt geëlueerd, waarbij de maximale factor IX-activiteit bij 0,3 (molair) en de maximale EEIB-activiteit bij 0,¾ (molair) wordt geëlueerd.

3. Preparaat volgens conclusies 1-2, met het kenmerk, dat de

30 EEIB-activiteit na incubatie van 1 uur in factor VlII-inhibitor-plasma ten minste tot 50¾ blijft behouden. k. Preparaat volgens conclusies 1-2, met het kenmerk, dat de factor IX-activiteit na een incubatie van 1 uur in factor IX-deficient-piasma ten minste tot 50¾ blijft behouden.

5. Preparaat volgens conclusies 1-k, met het kenmerk, dat dit een 8103329 „ -18- ' - gehalte aan inter-a-trypsine-inhibitor (ITI) van. 0,05-5 mg/FEIBA-eenheid bezit.

6. Werkwijze ter bereiding van een bloedstollingsbevorderend preparaat volgens conclusies 1-5, met het kenmerk, dat humaan plasma 5 met gesulfateerde hoogpolymere koolhydraten en/of met basische ionenuitwisselaars wordt behandeld en het proteïnemengsel met gevormde FEI3-activiteit wordt geadsorbeerd, waarna, het door elueren en concentreren wordt gewonnen.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het plasma 10 eerst met gesulfateerd hoogpolymeer koolhydraat kortstondig wordt behandeld, met proteïnemengsel met gevormde FEIB-activiteit hierna aan een ionenuitwisselaar op dextranbasis wordt geadsorbeerd en onmiddellijk daarop wordt geëlueerd en geconcentreerd.

8. Werkwijze, volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat het plasma 15 met een ionenuitwisselaar op dextranbasis wordt, behandeld en na ten minste een twee-urige inwerking het aan de ionenuitwisselaar geadsorbeerde proteïnemengsel met gevormde FEIB-activiteit wordt geëlueerd en daarna geöoncentreerd. 8103329