DK141955B - Fremgangsmåde til fremstilling af en pattegris-colibacillosisvaccine. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆ6GELSE3SKRIFT 1^1955 DANMARK (51) lnt Cf3 A 61 K 39/108 «(21) Anwgnfng nr. 6524/75 (22) Indlavaret den 5. dec. 1975 (23) Lebedag 5. dec. 1975 (44) Ansegn ingen fremlagt og fremlseggeteeeekriftBt offentliggjort den 28. jul. 1980

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (3°) Prioritet bageret fra den

4. dec. 1972, 511998, US

<71> RECHERCHE ET INDUSTRIE THEREPEUTIftUES R.I.T., RUe du Tilleul, 15, H-152O Genval, BE.

(72) Opfinder: Lucia Dobrescu, Avenue des Eperviers, 90, B-H50 Bruxelles, BE: Constant Huygelen, Vossekoten, 21, B-5055 Huldenberg, BE.

(74) Fuldmægtig under sagene behandling:

Pinnaet Chas. Hude.

(64) Fremgangsmåde til fremstilling af en pattegris-colibacillosisvaccine.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af en patte-gris-colibacillosisvaccine til intramuskulær eller subcutan administrering til drægtige søer.

Neonatal colibacillosis hos svin er en overvejende årsag til dødelighed hos pattegrise, og man har foretaget talrige forsøg for at kontrollere denne sygdom ved en aktiv immunisering af dyremoderen o-ver for Escherichia coli (E. coll), enten med dræbte eller levende vacciner eller ved at give grisene E. ooli-antiserum.

2 141955

En aktiv immunisering af søerne er blevet foretaget ved parenteral administrering af E. coli-vacciner (se f.eks. M.R.Wilson and J.Svendsen, Amer.J.Vet.Res. 32, 1971» 891-898), men da E. coli-stammen eller stammerne, der anvendes til immunisering, kun kan skabe specifikke antistoffer, medens der kan være adskillige og forskellige stammer, der har forbindelse med et givet udbrud, har disse forsøg på prophylaxis baseret på antibakteriel immunitet givet inkonsistente og i almindelighed utilfredsstillende resultater. Selvom man i nogle tilfælde opnåede god beskyttelse, var denne begrænset til de serotyper af E. coli, der var til stede i ' vaccinen.

Administrering af antiserum (se f.eks. O.P.Miniats, Can.Vet.J. 11, 1970, 52-56) kan ikke konstituere et praktisk prophylaktisk middel imod pattegris-colibacillosis. Beskyttelsen, der er frembragt ved administrering af antiserum, er i virkeligheden af kort varighed og kræver stadig administrering over for pattegrisene.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man isolerer varmelabil (LT) E. coll-enterotoxin i form af en cellefri og i det væsentlige lipopolysaccharidfri ekstrakt fra celler af en varmelabil, enterotaxinproducerende E. coli-stamme og blander en-terotoxinisolatet på i og for sig kendt måde med et adjuvans til vaccine.

Man har overraskende fundet, at når man administrerer den således fremstillede vaccine til gravide søer fra tre til seks uger før faringen i stedet for, at man administrerer hele celler af E. coli, udvikler de vaccinerede søer ikke alene antistoffer i deres colostrum og mælk, men beskytter også derved pattegrisene over for virkningen af enterotoxiner, der er frembragt af E. coli-serotyper, enten homologe eller heterologe over for E. coli-stammen, hvorfra den varmelabile (LT) enterotoxin blev isoleret.

Med andre ord, beskytter administreringen af den varmelabile (LT) E. coli-enterotoxin til moderdyret pattegrisene, ikke alene mod colibacillosis på grund af den varmelåbile (LT) E. coli-entero-toxin, men også mod colibacillosis på grund af den varmestabile (ST) enterotoxin.

141955 3

Det er derfor opfindelsens formål at beskytte pattegrise mod co-libacillosis, hvilket består i, at man over for søerne administrerer sammen med et adjuvans et varmelabilt (LT) E. coli-enterotoxin-præparat, der er isoleret fra en kultur af en enteropathogen E. co-li-serotype. En sådan enteropathogen E. coli-serotype er deponeret hos The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A, hvor den fik accessionsnummer 21.972.

Med vaccinen fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen administrerer man en effektiv mængde af det varmelabile (LT) E. coli-enterotoxinpræparat med adjuvanset over for gravide søer ad intra-muskular eller subcutan vej. Dosisenheden er mindst 5 mg og fortrinsvis fra 10 til 150 mg frysetørret ekstrakt.

Adjuvanset, hvis rolle det er at sikre et højt immunresponsum, kan være ethvert produkt eller enhver komposition, der er kendt af fagmanden som havende en adjuvansvirkning på vacciner. Eksempler på adækvate adjuvanser er aluminiumforbindelsesgeler, såsom alumi= niumhydroxid, aluminiumphosphat og "ALHYEGROGEL" ® (handelsnavnet for en aluminiumhydroxidgel, der fremstilles og sælges af Superfos Export Co., København, Danmark), og vand-i-olie-emulsioner, såsom adjuvans 65 (en vand-i-olie-emulsion af antigen i jordnødolie, e->-mulgeret ved tilsætning af mannid monooleat og stabiliseret ved tilsætning af aluminlummonostearat), og den komplette Freund’s adjuvans (en vand-i-olie-emulsion af lys mineralolie, emulgeret ved mannid monooleat og suppleret med dræbt Mycobacterium tuberculo= sis).

Det nævnte varmelabile (LT) E. coli-enterotoxlnpræparat kan isoleres fra enhver E. coli-serotype. som kan fremkalde pattegris-coli= bacillosis, og som nødvendigvis indeholder den varmelabile (LT) E. coli-enterotoxln. Et eksempel på en sådan E. coli-serotype er E. coli-stammen ATCC 21.972, men mange andre eksempler på E. coli-stammer indeholdende LT-enterotoxinet er blevet citeret i litterat turen, f.eks. af W.J. Sojka i Annales de Médecine Vétérinaire 116* 377-446, 1972, som angiver E. colistammer G 7, G 205, G 4/66, G 491, E 68 type I, G 1253 og Abbots-townJ af E.M. Kohier i Ann.

N.Y. Acad. Sci. 1976: 212-19, 1971, som angiver E. colistammerne Arnold, Emery, 263, 407 og P 307; af H.W. Smith og C.L. Gyles i J.

Med. Microbiol. 3: 387-401, 1970 refererende til 25 E. colistammer, « 4 HI 955 som viser forskellige serotyperjaf L, Dobrescu & al. i Zentralbl. Vet. Med. (B) 20: 222-29, 1973, som angiver 4 E. colistammer friskopnåede uden restriktion fra Institut National de Recherches Vété-rinaires, Brussel (Belgium), Faculty og Veterinary Medicine, University og Ghent (Belgium) og Veterinaruntersuchungs-und-Tiergesund-heitsamt, Dresden (Østtyskland).

Fremgangsmåden til isolering af den varmelabile (LT) E. coli-ente= rotoxin er velkendt. Den er beskrevet af Gyles and Bamum (J.Infect. Dis. 120, 1969, 419-426), og variationer af denne fremgangsmåde er beskrevet f.eks. af H.W.Smith og C.L.Gyles (J.Hed.Microbiol. 3, 1970, 387-401), H.W.Smith og S.Halls (J.Path.Bact. 93, 1967, 531-543) og M.R.Wilson, C.Gyles og J.Svendsen (Can.J.Comp. Med. 35, 1971, 294-297).

Hver af disse fremgangsmåder, såvel som enhver anden ækvivalent, der er kendt af fagfolk, kan anvendes til det formål at fremstille det varmelabile (LT) E. coli-enterotoxinisolat, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Denne opfindelse kræver ikke, at man får ren varmelabil (LT) E. coli-enterotoxin, som man eventuelt kunne få, f.eks. enten ved elektroforese eller vægtfyldegradient-ultracentrifugering eller adsorptiojaVelution af hydrofile, krydsbundne dextraner, såsom "Sephadex" 'S' (et produkt fremstillet og solgt af Pharmacia Pine Che= micals AB, Uppsala 1, Sverige).

Opfindelsen kræver i det væsentlige kun, at enterotoxinen befries og skilles fra cellerne af E. coli, og at den i det væsentlige er fri for lipopolysaccharider.

Følgende eksempler belyser opfindelsen. De skal dog ikke opfattes som begrænsende dens omfang.

1/ 141955 5

Eksempel 1

Fremstillingsmedium (fast)

Man sætter vand (10 liter) til 130 g ,raftCTO-lEKXPTOSE,,-sup.pe og 150 g " BACDO-AGAR" (BACT0-TRYPT0SE og BACTO-AGAR er handelsnavne på produkter fremstillet og solgt af DIFCO Laboratories, Detroit 1, Michigan, U.S.A.). Blandingen opvarmes under omrøring til 121°C i 60 minutter. Man opløser 20 g "BfiCTO-nEXTROSB" (handelsnavn på et produkt fremstillet og solgt af DIFCO Laboratories) i 20 ml destilleret vand, og opløsningen føres gennem et 0,45 mikron Milli-pore-steriliseringsfilter (Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, U.S.A.). Begge præparater bringes sammen, og man fordeler 110 ml alikvote dele i 500 cm^ Roux-kolber.

Udsædsfremstilling E. coli-stammen ATCC 21.972 hydratiseres med steril saltopløsning og inkuberer i 18 timer ved 37°C i Petri-skåle, der hver indeholder 20 ml"TKXETOSE-A3KR",w som fast medium, fremstillet ved, at man blander 26 g miK¥PTaSE"-suppe, 30 g * AG8R DIKD" (TRYPTOSE-suppe og AGAR DIFCO er produkter, der fremstilles og sælges af DIFCO Laboratories) op til 1 liter med vand, og blandingen opvarmes i 45 minutter til 115°C.

Man fremstiller så et flydende kulturmedium (betegnet PP^) på følgende måde: Man opløser proteosepepton nr. 3 (et produkt fremstillet og solgt af DIFCO Laboratories) (30 g), gærekstrakt (4 g) og dextrose (5 g) i 1 liter vand ved 60°C. Efter afkøling tilsætter man NaCl (5 g), NaHPO^ (5,05 g) og KH2P0^ (1,2 g). Mediet, hvis pH-værdi er 6,9-7,0, filtreres på Seitz EKS-filter og fordeles i 100 ml kulturkolber.

Disse kulturkolber podes med de glatte kolonier, der er fremkommet på Petriskålene, idet man anvender én koloni pr. 20 ml flydende medium PP^ og inkuberes i 6 timer ved 37°C under omrystning på vuggehylder (22-24 vugninger pr. minut).

141955 6 E. coli-fremstilling

Man poder 4 ml alikvote dele af den fremkomne E. coli-kultur i flydende medium PP^ (d.v.s. oa. 4 x lCr bakterier) i hver 500 cm Roux-kolbe, der indeholder produktionsmediet, som derpå inkuberes et døgn ved 37°C under rystning på vuggehylder (22-24 vugninger pr, minut). Hver cellekultur høstes i 25 ml destilleret vand, og udbyttet fra 15 Roux-kolber (én serie) sammenbringes i én literflaske. Man tager en prøve (1 ml) fra hver serie for renhedsprøve.

Til det formål udsår man 0,5 ml på "TRXPTOSE-AfiftR"-suppe i Petriskåle og inkuberer i 7 dage ved 34°C, og den anden 0,5 ml-fraktion udsås i Petri-skåle, der indeholder 20 ml Sabouraud-dextroseagar, fremstillet ved, at man opløser 65 g Sabouraud-dextroseagar DIFCO (et produkt fremstillet og solgt af DIFCO Laboratories) i 1 liter varmt, destilleret og yderligere destilleret vand, og kulturen inkuberes i 7 dage ved 22°C.

Udbytterne suppleres med en steril 1?£ neomycinsulfat vandig opløsning {1,2 ml neomycinsulfatopløsning pr. 100 ml af det høstede produkt), og cellerne sprænges ved sonicering af mediet i 30 minutter i en Branson Europa-sonicator model J 22 (Branson Europa N.V., Soest, Holland), idet mediet holdes i et smeltet isbad.

Efter sprængning af cellerne centrifugerer man suspensionen i 2 timer ved 2,550omdrejn./min. ved temperaturen 5°C for at fjerne celleresterne.

Den ovenstående væske føres successivt gennem et klaringsfilter og gennem et 0,45 mikron Millipore-steriliseringsfilter (Millipore er et handelsnavn for Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, U.S.A.).

Man sætter ammøniumsulfat, der forud er steriliseret med ethylen= oxid, til filtratet, så man får 50°/é mætning (380 g ammnm'nm.qnlfat pr. liter filtrat), og blandingen får lov til at henstå i 3 timer ved stuetemperatur. Det fremkomne bundfald centrifugeres i 2 timer ved 2,550 omdrejn./min. ved temperaturen 5°C.

Sedimentet hældes i en cellofanpose og dialyseres med rindende 141955 7 vand, indtil koncentrationen af ammoniumsulfat er sænket til mellem 0,1 og 0,01^, idet man prøver ammoniumsulfatindholdene med Nessler’s reagens.

Enterotoxinpræparatet steriliseres ved at passere gennem et 0,45 mikron Millipore-steriliseringsfilter (Millipore er handelsnavnet for Millipore Corporation) og frysetørres.

Eksempel 2

Man rehydratiserer en 1 g alikvot del frysetørret enterotoxinpræ-parat, der er fremstillet som slutprodukt ifølge eksempel 1, ved tilsætning af 20 ml af en steril phosphatstødpudesaltopløsning (pH 7,4), der indeholder NaCl (8 g), KC1 (2 g), Na^HPO^ (11,5 g), KH2P04 (2 g), CaCl2.2H20 (1,325 g), MgCl2.6H20 (l g) og destilleret vand (10 liter).

Den fremkomne vaccine blandes grundigt under sterile betingelser med 20 ml steril, komplet Freund’s adjuvans (d.v.s. en vand-i-olie-emulsion af let mineralolie emulgeret med mannid monooleat og tilsat dræbt Mycobacterium tuberculosis), og den således fremkomne ad-juverede vaccine fordeles i 4 ml ampuller, som enten forsegles eller lukkes tæt, så man får en (LT)-enterotoxinmængde, der svarer til 100 mg frysetørret præparat pr. ampul.

Indholdet af hver ampul svarer til én vaccinedosisenhed. Vaccinen administreres over for gravide søer ad intramuskulær eller subcu-tan vej fra 3 til 6 tiger før faringen.

Alternativt fordeler man den adjuverede vaccine i større ampuller, så man får hele tal for mængden af dosisenheder, så man kan få tilsvarende multidosis-vaccinepræparater.

Eksempel 3

Tekniken er som beskrevet i eksempel 1 og omfatter inkubationen 141955 8 af E. coli ATCC 21,972 i 6 timer ved 37°C i PP^-væskeformet medium.

Fremstillingen af E. coli foretages så i et flydende produktions-medium -på følgende måde.

6 mm alikvote dele af den således fremkomne E. coli (d.v.s. ca.

6 x 10^ bakterier) indpodes i fremstillingskolber, der indeholder 300 ml PP·^-væskemedium, og kulturerne inkuberes 1 døgn under omrystning på vuggehylder (22-24 vugninger pr. minut).

Udbyttet fra 5 fremstillingskolber (1 serie) sammenbringes, og hver serie af udbytter centrifugeres i 2 timer ved 2.550 omårejn./ min., idet sedimentet gensuspenderes i 150 ml destilleret vand, og man undersøger en prøve af suspensionen for renhed som angivet i eksempel 1.

Cellesuspensionen soniceres i 30 minutter i en Branson Europa-so- nicator, model J 22, idet man holder mediet i et smeltende isbad. Efter sprængning af cellerne centrifugeres suspensionen i 2 timer ved 2,550 omdrejn./min. ved 5°C til fjernelse af celleresterne. Den ovenstående væske føres gennem et 0,45 mikron Millipore-steriliseringsfilter (Millipore er et handelsnavn for Millipore Corporation), så man får 100 ml filtrat, hvis pH-værdi indstilles på 6,4 med normal saltsyre. Man tilsætter thiomersal i en endelig koncentration på 0,Q2?6.

Eksempel 4

Man blander 40 ml af en 2% vandig opløsning af "ALHYDROGEL” ® (et produkt fremstillet og solgt af Superfos Export Company) grundigt med 80 ml af det filtrat, der er fremkommet som slutprodukt ifølge eksempel 3, og man standser adsorptionen af enterotoxinet på ^ved udfældningsforsøg med trichloreddikesyre.

Man borthælder 20 ml af den ovenstående væske, og den tilbageblevne blanding fordeles i 10 (10 ml) ampuller, som tillukkes.

Indholdet i hver ampul (9 ml) svarer til en vaccinedosisenhed på 100 mg (tørvægtbasis) af varmelabilt (LT) E. coli enterotoxin.

141955 9

Vaccinen administreres på gravide søer ad intramuskulær eller sub-cutan vej fra 3 til 6 uger før faringen.

Alternativt fordeles den adjuverede vaccine i større ampuller, så man får hele tal for dosisenhedsmængden, så man kan fastlægge tilsvarende multidoser af vaccinepræparaterne.

Eksempel 3

Tekniken er som ifølge eksempel 3, men blandingen distribueres i 100 glasampuller, som tillukkes.

Indholdet af hver ampul (0,9 ml) svarer til én vaccinedosisenhed på 10 mg (tørvægtbasis) af varmelabilt (LT) E. ooli enterotoxin-ekstrakt.

Vaccinen administreres på gravide søer ad intramuskulær eller sub-cutan vej fra 3 til 6 uger før faringen.

Eksempel 6

Man har demonstreret en forebyggelse af pattegris-colibacillosis ved subcutan administrering af varmelabile (LT) E. coll entero= toxinpræparater fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved følgende forsøg i, II og III.

I hvert af disse forsøg blev søerne vaccineret fra 3 til 6 uger før faringen, og man anvendte en so som kontrol. 24 timer efter fødslen provokeredes pattegrisene d.v.s. udsættes for smitte med 400 mg Ag vægt LT E. coli .entemboxin fremstillet ifølge eksempel 1, idet man anvendte et maverør til administreringen.

For 3 grisekuld, som angivet i de følgende tabeller, blev nogle pattegrise også provokeret med varmestabiit (ST) E. coli entero= toxin fremstillet af stammen ATCC 21.972 under anvendelse af 660 mg ST enterotoxin.

Pattegrisenes kliniske udvikling fulgtes regelmæssigt, idet man iagttog fremkomsten af typiske symptomer for colibacillQsis.

10 141955 I følgende tabeller repræsenterer - vaccine A vaccinen ifølge eksempel 2 ved en dosisenhed på 100 mg (tørvægtbasis), - vaccine B vaccinen ifølge eksempel 4 ved en dosisenhed på 100 mg (tørvægtbasis), og - vaccine C repræsenterer vaccinen ifølge eksempel 5 ved en dosisenhed på 10 mg (tørvægtbasis).

Forsøg nr. 1 __So___ Pattegris__ : ] Diarrhoea . Vægt 24

Vaccine- Provoke- Antal timer Varig- Døde- timer ef-

Nr. ret med Nr. ret med ml. provoke- hed lig- ter pro- ring og an- (ti- hed vokering __fald__mer)__ 2-10 LT - - inden ændr.

2-11 LT - + 3,5% 2-12 LT - - ,+9?5% 2 A 2-13 LT - — ingen ændr.

2-14 ST - - - + 3,6% 2- 15 ST - - ingen ændr.

_ 2-16 ST - - - + 2,8% 3- 17 LT - + 10,6% 3-18 LT - + 11,8% 3-19 LT - - - + 6,3% 3 A 3-20 LT - + 5,8% 3-21 ST - + 10% 3-22 ST - + 11,9% 3-23 ST - - - + 10,4% _ 3-24 ST - + 7,5% 10-01 LT 6 24 10% 10-02 LT 6-12 24 - - 10,9% 10-03 LT 6 12 - 5,3% 10-04 LT 6 96 + 14,7% 10 - 10-05 LT 6-12 10 7,6% trol) 10-06 ST - - ingen ændr.

10-07 ST 1 3 ingen ændr.

10-08 ST - - ingen ændr.

10-09 ST 6 12 - ingen ændr.

11 141956

Forsøg nr. 2 _________So i___r __ Pattegris____^ ..... .

1 1 'Diarrhoea " P It/ægt 24

Vaccine- Provoke- Antal timer' Varig- Døde- timer ef-

Nr. ret med Nr. ret med ml. provoke- hed lig- ter pro- ring og an- (ti- hed vokering ___________fald mer)__ 47-12 LT - - ingen ændr.

47-13 LT - +9,2% 47 A 47-14 LT - - - ingen ændr.

47-15 LT - - + 6,4% 47- 16 LT - - - + 6,6% 48- 08 LT - - + 5,2% 48-09 LT - - + 6,7% hQ B 48-10 LT - + 3,7% 48-11 LT - + 10,5% 50-01 LT 5 21 + - 19,8% 50-02 LT - - ingen ændr.

50-03 LT - - - + 2,6% 50 - 50-04 LT 6 14-21 + - 22,1% (kon- 50-05 LT 14 48 + - 18,8% troi) 50_06 lt 21 10 _ - 3,2% 50-07 LT 6 21 + - 28,5% 12 141955

Forsøg nr. 3

So___ Pattegris___ ' Diarrhoea

Vaccine- Provo- Antal timer Varig- Døde- Vægt 24

Nr. ret med Nr. keret ml. provoke- hed lig- timer ef- med ring og an- (ti- hed ter pro- _______fald_mer)__vokering 13-119 LT - - - + 8,4% 13-120 LT - - + 11,4% 13-121 LT - - - + 2% 13-122 LT - ingen ændr.

l3 B 13-123 LT - - - + 7,1% 13-124 LT 4 2 - + 8,1% 13-125 LT - - - + 8% 13-126 LT - + 5,8% 13-127 LT 8 40 + - 21% 13-128 LT - + 8,4% 21-110 LT 3 48 + - 15% 21-111 LT 3 6-11 - - 6,9% 21-112 LT 4 48 + - 14,3% 21 c 21-114 LT - - - - 5,9% (*) 21-115 LT 6 6 - - 6,3% 21-116 LT - - - - 3,6% 21-117 LT - - - - 2% 21-118 ' LT 6 5 - 12,5% 15-129 LT - - - + 7,4% 15-130 LT - - - + 4,9% 15 C 15-131 LT - - - + 13,2% 15-132 LT - - - + 16% 15-133 LT - - - ingen ændr.

20-101 LT 5 6 - - 3,6% 20-102 LT 6 6 - - 16,5% 20-103 LT 25 4 - - 4,5% (**) 20-104 LT 19 6 - - 5,3% 20 - 20-105 LT 6 6 - - 4,7% (kon- 20-106 LT 3 ' 4-9 - ingen ændr.

tro1- 20-107 LT - - 3,2% 20-108 LT 6 6 - - 5,7% 20-109 LT 6 6 4,2% 141955 13 (*) Mastitis fremkommet 48 timer efter faring.

(**) Tab af vægt 4 timer efter fremkomst af diarrhoea.

Resultatet af forsøgene viser, at 6 af de 7 grisekuld fra vaccinerede søer beskyttes mod oral provokerihg med E. coli-entero= toxiner. Den frembragte beskyttelse var 90% for det ene kuld og 100% for de 5 andre kuld. Intet kuld af kontrolsøerne udviste modstand over for samme provokering med enterotoxiner, medens dødeligheden og sygeligheden blandt kontrolpattegrisene rangerede fra 71,4 til 88,8%.

I 5 af 7 kuld fra vaccinerede søer blev alle pattegrisene fuldstændig beskyttede. I ét kuld blev 8 af 10 pattegrise fuldstændig beskyttede. For pattegrisene, der var provokeret med LT-entero= toxin, og som stammede fra.kontrolsøer, var tallene følgende: I ét kuld viste 5 af 5/ dy,r typiske symptomer, i et andet kuld viste 5 af 7 og i et tredie kuld 8 af 9 typiske symptomer.

Eksempel 7

Man suspenderer en 12 g alikvot del af frysetørret enterotoxin-præparat, fremstillet ifølge fremgangsmåden, der er beskrevet i eksempel 1, i 1 liter pyrogenfrit, destilleret vand, og suspensionen blandes med en opløsning af 20 g "ALKSDEDGEL" ^ (et produkt fremstillet og solgt af Superfos Export Company) i 1 liter pyro= genfrit, destilleret vand. Man indstiller pH-værdien til 6 med IN saltsyre, og blandingen får lov til at henstå i mørke ved stuetemperatur i 40 timer med intermitterende omrøring, så der sker en adsorption af enterotoxinen "AIJKDBOGEEEN" ®. Den endelige pH-værdi er 6,3·

Efter centrifugering borthældes den ovenstående væske, og sedimentet rehydratiseres ved tilsætning af 2,2 liter af en 50/50 blanding af fysiologisk serum og stødpude (22 g Na2HP0^ (M/10) og 78 g KHgPO^ (M/10) med 10 mg thiomersal til 100 ml, pH 6,3).

Blandingen omrøres ved 4°C i 2 timer og deles i to 1100 ml char- 14 141956 ger, som henholdsvis betegnes A og B. Chargen A (som indeholder 5,4 mg enterotoxinpræparat og 9 mg"MjKXDEQGEL" ®pr. ml) opdeles i 5 ml alikvote dele (som således indeholder 27 mg enterotoxinpræparat), som fordeles i glasampuller, der forsegles. Chargen B fortyndes ved tilsætning af 303 ml af en 50/50 blanding fysiologisk serym og stødpude (22 g Na^HPO^ (M/lO) og 78 g KH^PO^ (M/lO) med 10 mg thiomersal til 100 ml, pH 6,3)» hvortil der er sat 2,7 g "i^JCffiROGEL" ..Chargen B (som indeholder 4,3 mg enterotoxinpræparat og 9 mg '^μυεβοοεΕι" ® pr. ml) opdeles i 2,5 ml alikvote dele (som således indeholder 10,75 mg enterotoxinpræparat), som distribueres i glasampuller, der så forsegles.

Vaccinepræparatet af chargerne A og B er afprøvet på følgende måde på søer i avlscentre besmittet med colibacillosisdiarrhoea.

Søerne blev subcutant podet mellem 3 og 6 uger før faringen med en enkelt dosis af vaccine: 59 søer modtog én dosis af charge A-vaccine og 28 søer modtog én dosis af charge B-vaccine. 50 sø er anvendtes som kontrol, idet de modtog de samme volumina af den samme "ALHEDKOGEL" ^'stødpude-blanding uden enterotoxinekstrakt.

Alle pattegrisene blev iagttaget for fremkomst af diarrhoea.

Fra og med den anden dag med klinisk symptom på sygdom behandledes pattegrisene ved daglig administrering af chloramphenicol, ampicillin eller sulfadoxin/trimethoprim.

Resultaterne er samlet i følgende tabel I, hvor man angiver fæceskonsistens, varighed af diarrhoea, antallet af antibiotiske admi-nistreringer og dødelighed ved dehydratisering.

4