DK148598B - Fremgangsmaade til dyrkning af mikroorganismer i et hydrofobt miljoe samt middel til anvendelse ved udoevelse af fremgangsmaaden - Google Patents

Description

148598

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til dyrkning af mikroorganismer i et hydrofobt miljø under anvendelse af næringsstoffer i vandig opløsning. Opfindelsen angår endvidere et middel til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden.

5 Industrielle operationer, der udnytter forskellige mikroorganisme- kulturer, især bakterier og svampe, er meget almindelige for tiden.

Talrige levnedsmiddelindustrier, medicinalindustrier, rensningsanlæg o.s.v. er baseret på sådanne operationer. Ofte omfatter arbejdet to faser: for det første dyrkes den pågældende mikroorganisme i et hen-10 sigtsmæssigt næringsmiljø, indtil opvækst af en tilstrækkelig talrig population er nået, i den anden etape kontaktes denne population med de stoffer, som man ønsker mikroorganismerne skal virke på. Operationer i beholdere giver ikke specielle vanskeligheder med hensyn til dette, den indledende dyrkning, d.v.s. multiplikationen, udføres 15 alt efter forholdene i et separat indelukke eller i den samme beholder, hvor den anden driftsfase finder sted. Når operationerne derimod skal udføres i naturen på store jord- eller vandoverflader, som det f.eks. er tilfældet ved eliminering af carbonhydridlag ved mikrobiologisk nedbrydning til havs, på stranden, på vandløb eller på søer, 20 giver den indledende dyrkning af de anvendte mikroorganismer vanskeligheder. Man bør også her tilføre kulturen næringsstoffer, d.v.s.

C-, N- og P-kilder, såvel som mi kronæringsstoffer for at sikre væksten af den pågældende organime, men de klassiske kilder, såsom kulhydrater, nitrater eller ammonikalske salte og phosphater, er oplø-25 selige i vand og vil derfor ikke forblive i overfladelaget af den strækning, der skal behandles, hvor der skal ske en kraftig vækst af de anvendte mikroorganismer; disse stoffer vil diffundere i vandet eller ud i den underliggende jord og unddrages således kulturen.

For at råde bod derpå har man indtil nu anvendt forskellige me-30 toder. En af disse omfatter, at korn af nitrogenforbindelser og faste phosphatforbindeiser overtrækkes med paraffin for at give dem i denne form til mikroorganismerne, hvilke er anført i beskrivelsen til USA patent nr. 1.959.127. I beskrivelsen til USA patent nr. 3.883.397 omtales en variant, hvor det lipofile overtræk er et fedtsyresalt i 35 stedet for paraffin. Men disse metoder gør det ikke muligt for mikroorganismerne at få de ønskede næringsstoffer hurtigt; fedtstoffet i overtrækket er vanskeligt at trænge igennem, d.v.s. at nedbryde, i fravær af ydre nitrogen- og phosphatforbindeiser. Derfor er bakteriernes eller svampenes virkning langsom og kræver uger eller måne- 148598 2 der. En anden løsning, der foreslis, omfatter, at der som N- og P-kilder anvendes forbindelser, der er uopløselige i vand, men opløselige i carbonhydrider, navnlig phosphoaminolipider, som er omtalt i beskrivelsen til fransk patent nr. 2.172.796; de nitrogen-5 forbindelser, der er opløselige i olie, har almindeligvis et lille indhold af nitrogen, og under disse betingelser vil den biologiske nedbrydning af oliens carbonhydrider i havet kræve to til tre måneder. I beskrivelsen til fransk patent nr. 2.230.401 er det ligeledes foreslået at anvende amider, organiske ammoniumsalte og phospho-10 aminolipider opløst i et olieopløsningsmiddel, idet opløsningen emulgeres i vand; den opnåede emulsion fordeles på et carbonhydridlag, der flyder på vand, med henblik på bionedbrydning af laget. Denne metode kræver store mængder af vandig emulsion og resultatet opnås først efter flere uger.

15 Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til dyrkning af mikroorganismer i et hydrofobt miljø under anvendelse af næringsstoffer i vandig opløsning. Uafhængigt af om dette lag, som kan indeholde carbonhydrider, flyder pi vand eller befinder sig på jord eller på et understøttende konstruktionsmateriale, 20 forbliver de næringsstoffer, der tilføres ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hovedsagelig i det hydrofobe lag og tillader mikroorganismernes hurtige multiplikation, hvis der findes mikroorganismer deri.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved at en 25 mi kroemuision, der er frembragt ved at emulgere den vandige næ ringsstofopløsning i form af miceller, hvis diametre ligger mellem 80 og 600 Å, i en væske, som ikke er blandbar med vand, men som er blandbar med det hydrofobe miljø, idet vægtforholdet mellem mikro-emulsionens ydre fase og den vandige opløsning, der emulgeres, er 30 over 0,2, indføres i det hydrofobe miljø, der indeholder eller bringes til at indeholde de mikroorganismer, der skal dyrkes.

Opfindelsen angår også et middel til anvendelse ved udøvelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilket middel er ejendommelig ved, at det er en mikroemulsion, der er frembragt ved at emulgere 35 en vandig næringsstofopløsning i form af miceller, hvis diametre ligger mellem 80 og 600 Å, i en væske, som ikke er blandbar med vand, men som er blandbar med det hydrofobe miljø, idet vægtforholdet mellem mi kroemulsionens ydre fase og den vandige opløsning, der emulgeres, er over 0,2.

3 148598

Det forstår sig, at som det er kendt indenfor fagområdet, indeholder mikroemulsionen mindst ét overfladeaktivt middel og et hjælpemiddel, som er anvendt ved fremstillingen.

I modsætning til den kendte teknik anvendes næringsstofferne 5 således hverken i fast tilstand, i opløsning i et opløsningsmiddel, der ikke er blandbart med vand, eller i en vandig ma kroemu Ision, men i form af en vandig opløsning, der er mikroemuigeret i en væske, der er blandbar med det hydrofobe lag, der skal nedbrydes, d.v.s. i form af mikrodispergerede miceller, hvis diameter ligger 10 mellem 80 og 600 Å og navnlig mellem 100 og 200 Å. Denne form har uventet ført til det bemærkelsesværdige resultat, at bionedbrydningen kan gennemføres på nogle dage i stedet for uger eller måneder, som de kendte fremgangsmåder kræver.

Som nitrogenkilde i mi kroemulsionerne ifølge opfindelsen kan an-15 vendes de forskellige forbindelser, som er opløselige i vand, og som kan assimileres af mikroorganismerne. Det er f.eks. nitrater, ammoniumsulfat og/eller -phosphat, urinstof, proteiner, peptoner o.s.v.

Da urinstof er det nitrogenrigeste næringsstof, og da det er meget opløseligt i vand, er det specielt egnet, eftersom det gør det muligt 20 at have meget koncentrerede vandige opløsninger. Man kan f.eks. anvende urinstofopløsninger på 10-60 vægtprocent, d.v.s. 11-150 dele urinstof pr. 100 dele vand.

Phosphor kan også tilføres til opløsningen i de sædvanlige forbindelser, alkaliphosphater eller -phosphiter eller ammoniumphos-25 phater eller -phosphiter. Ifølge en speciel udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes phosphater i form af et overfladeaktivt middel, som f.eks. et phosphat af en højere al kyl -forbindelse eller en lecitin: man har således phosphorkilden og mi kroemulsionens overfladeaktive middel i samme molekyle.

30 I talrige industrielle operationer udnyttende dyrkningen af mikroorganismer er det nødvendigt, at miljøets pH-værdi indstilles til den værdi, der er mest gunstig for bakterievækst; i almindelighed bør denne pH-værdi ligge i nærheden af neutralitet, og man kan dels tilsætte phosphorsyre som phosphorkilde, hvis miljøet skal tilføres 35 syre, dels ammoniak som nitrogen kilde, hvis miljøet skal neutraliseres med en base.

Ved bakterienedbrydning af carbonhydrider ved hjælp af de ovenfor anførte mikroorganismer er behovet for phosphor meget mindre end behovet for nitrogen, udtrykt i vægt kan P/N-forholdet 4 .

148598 ligge mellem 0,02 og 0,2, fortrinsvis melfem 0,05 og 0,15; med henblik pi væksten ligger de P/N-forhold, der er mest gunstige, så tæt som muligt på 0,05.

Når den vandublandbare, fortrinsvis lipoblandbare væske, der 5 udgør mikroemulsionens ydre fase, eller det hydrofobe lag, der skal nedbrydes, kan udnyttes af mikroorganismerne som carbonkilde, er det ikke nødvendigt at tilsætte andre assimilerbare carbonforbrndelser til mi kroemu Isionen. Hvis den ydre fase af mikroemuisionen og det lag, der skal nedbrydes, derimod vanskeligt kan angribes af mikro-10 organismerne, i det mindste i starten, er det af interesse, at der i næringsopløsningen tilsættes en carbonkilde, der er let at udnytte, f.eks. opløselige kulhydrater, der således muliggør en hurtig start på mikroorganismernes multiplikation.

Som i alle kulturer er mi kronæringsstoffer nødvendige, navnlig 15 salte af Fe, Mg, K, o.s.v., hvilket opnås ved på i sig selv kendt måde at tilsætte en meget lille dosis til næringsopløsningen.

Det siger sig selv, at der til frembringelse af et middel ifølge opfindelsen, skal anvendes et overfladeaktivt middel, der er egnet til brug ved fremstilling af en mikroemulsion. Valget af forbindelsen, 20 hvilket kan udføres af en fagmand, kan gøres blandt de talrige grupper af overfladeaktive midler, der ikke er toxiske overfor de mikroorganismer, der skal være tilstede. Man kan således f.eks. anvende sulfater af fede alkoholer, sulfosuccinater, oxyethylensorbitanestere, alkoholer, oxyethylensyrer eller -olier, saccharoseestere, aminosyrer, 25 alfå-amidoaminosyrer, tauriner, sarcosiner, polyglycoler, phosphater af tunge alkyler, o.s.v.

Fortrinsvis ligger de anvendte emulgeringsmidlers hydrofile/ lipofile-balance mellem 10 og 17 eller bedre mellem 11 og 15.

Når det drejer sig om operationer, der udføres ude, bør det 30 grænsefladeaktive middel selv være bionedbrydeligt for at undgå skadevirkning i naturen.

Som for de grænsefladeaktive midler er valget ligeledes stort, når det drejer sig om det til dannelsen af mikroemuisionen nødvendige hjælpemiddel. Da sådanne hjælpemidler er kendt indenfor faget, er 35 det ikke nødvendigt at anføre meget her; der skal blot eksempelvis bemærkes, at det er muligt at anvende nitrogenforbindelser, såsom carbamater, amider eller aminsalte. Mkroemulsionens viskositet kan sænkes betragteligt ved at tilsætte en alkohol, navnlig med fra 6 til 5 148598 12 carbonatomer, en ether eller en polyolester, navnlig glycoi; dette letter manipulationerne meget.

Eftersom mi kroemulsionens ydre fase skal være blandbar med den hydrofobe væske, der skal bionedbrydes, må den ydre fase 5 nødvendigvis vælges ifølge naturen af væsken. I det vigtigste tilfælde i praksis, hvor sidstnævnte består af oliecarbonhydrider, kan den ydre, lipoblandbare fase f.eks. omfatte alifatiske, aromatiske eller naphteniske carbonhydrider eller såkaldte mineralolier, d.v.s. blandinger af sådanne carbonhydrider. Denne type ydre fase er van-10 skefig for bakterierne at angribe, sålænge de ikke har gennemgået tilstrækkelig adaption. Det er derfor fordelagtigt at anvende vegetabilske eller animalske olier, som kan tjene som carbonkilde, fordi disse kan udnyttes af mikroorganismerne; disse olier eller fortrinsvis de tilsvarende fede syrer muliggør en hurtig vækst af mikroorganismerne, 15 hvilket er nødvendigt for nedbrydningen af det hydrofobe lag, navnlig råolie.

Vægtforholdet mellem den lipoblandbare væske, d.v.s. mikro-emulsionens ydre fase, og den vandige opløsning, der skal emulgeres, skal ligge over 0,2; dette forhold vælges på en sådan måde, at den 20 vandige opløsning befinder sig i den indre fase. Valget af overfladeaktive midler samt overfladeaktive hjælpemidler udføres i overensstemmelse med naturen af den lipoblandbare væske samt koncentrationen af salte opløst i den vandige fase; dette baseres på i sig selv kendte mikroemulsionsformuleringssammensætninger.

25 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes med et stort antal mikroorganismer og navnlig med de mikroorganismer, som muliggør nedbrydning af carbonhydrider; således kan man anvende opfindelsen til dyrkning af bakterier, såsom Pseudomonas, Acineto-bacter, Flavobacterium, Arthrobacter, Corynebacterium o.s.v. Mikro-30 organismerne kan ligeledes være svampe.

Skønt opfindelsen er meget interessant til forskellige bionedbrydningsoperationer udført udenfor, kan den ligeledes anvendes ved forskellige fremstillinger i beholdere, hver gang et hydrofobt lag af et stof anvendes i fremgangsmåden. F.eks. anvendes den 35 således med fordel til fremstilling af proteiner ud fra carbonhydrider ved nedbrydning af disse sidstnævnte ved hjælp af bakterier og/eller svampe. I alle tilfælde fører den bemærkelsesværdige dispersion af vandige næringsstoffer i den hydrofobe fase, opnået 148598 6

Ifølge opfindelsen, til en meget hurtig multiplikation af mikroorganismerne, hvilket resulterer i en betragtelig tidsgevinst ved operationerne.

Blandt anvendelser i fri luft pi vand- og jordoverflader er den 5 vigtigste nedbrydningen af carbonhydrider, der er spildt ved et ulykkestilfæde; af den ovenfor anførte grund, d.v.s. den kendsgerning, at de opløselige næringsstoffer forbliver i det lag, der skal behandles, i stedet for at blive ført bort med vandet, har opfindelsen en stor værdi i kampen mod det "sorte vand". Det samme 10 gælder imidlertid operationer, såsom rensning af diger, bassiner, jorder, beholdere o.s.v. for carbonhydridaflejringer, som kan tilsmudse dem. Andre anvendelser omfatter tilføring af gødningsstoffer til jordbrugskulturer, hvor man undgår at næringsstofferne vaskes bort af vand.

15 Mikroorganismerne er sædvanligvis tilstede i det miljø, der skal behandles; det er imidlertid undertiden nødvendigt at tilføre kim, når begyndelsespopulationen vurderes at være for lav, eller hvis miljøet ikke indeholder de hensigtsmæssige bakterier.

I en speciel udførelsesform for den foreliggende opfindelse an-20 vendes urinstof som nitrogennæringsstof; det er konstateret, at denne forbindelse spiller samme rolle som det grænsefladeaktive hjælpemiddel, og det er derfor ikke nødvendigt at tilføre et andet hjælpemiddel. Da phosphoret for det andet fordelagtigt kan tilføres i alkyl-estere af phosphorsyre, som har overfladeaktive egenskaber, sim-25 plificeres sammensætningen af næringsopløsningen ved den kendsgerning, at det er muligt at anvende urinstof og phosphorsyreester uden andre tilsætningsmidler. Det anbefales imidlertid at tilsætte væsker, som gør det muligt at sænke mikroemulsionens viskositet; ovenfor er der angivet nogle eksempler på sådanne tilsætningsmidler, 30 hvor butyletherethylenglycol i en speciel udførelsesform for opfindelsen har givet udmærkede resultater.

Den lipoblandbare væske, der ifølge opfindelsen egner sig meget godt til mikroemulsionens ydre fase, kan bestå af en eller flere estere af fedtsyre, såsom laurinsyre, myristinsyre, palmitinsyre, ara-35 chidinsyre, oliesyre, stearinsyre, caprinsyre, capronsyre, capryl-syre, o.s.v.; gfyceriderne af disse syrer udgør meget tilgængelige industriprodukter, eftersom de er vegetabilske og animalske olier.

Således kan man f.eks. anvende olier, såsom jordnøddeolie, hvaiolie, rapsolie, linolie, majsolie, ricinusolie, sesamolie, olien o.s.v. Selve 7 148598 fedtsyrerne egner sig specielt godt eventuelt i hensigtsmæssige blandinger til at forblive flydende ved omgivelsestemperaturer; således brugbare fedtsyrer, navnlig med fra 6 til 18 carbonatomer, er f.eks. capronsyre, ønanthsyre, caprylsyre, laurinsyre, palmitinsyre, 5 oliesyre, linolsyre eller stearinsyre. ΤΠ de fedtsyrematerialer, som ikke er flydende ved almindelige temperaturer, er det praksis at tilsætte carbonhydrider som f.eks. olie eller gasolie i et forhold på omkring 5-50%. Fede alkoholer, d.v.s. med fra 6 til 24 carbonatomer, egner sig ligeledes.

10 I et specielt tilfælde, hvor den vandige opløsning indeholder urinstof og laurylphosphater og/eller oleylphosphater, der f.eks.

S) er bragt i handelen af Societe Hoechst under navnet Hostaphat , ligger det foretrukne nitrogenindhold for den samlede mi kroemulsion i området fra ca. 4 til 10 vægtprocent eller bedre fra 5 til 8 vægt-15 procent. Vægtforholdet mellem nitrogen og den lipoblandbare væske ligger almindeligvis i området fra 0,1 til 0,4 og navnlig fra 0,15 til 0,35.

Alment omfatter de foretrukne mi kroemulsioner ifølge opfindelsen 10-30 vægtprocent vand, 4-10 vægtprocent assimilerbar nitrogen i 20 form af nitrogenforbindelser, 5-35 vægtprocent af et alkylphosphat, hvor alkylgruppen indeholder fra 10 til 18 carbonatomer, eller af et ethoxy leret phenolalkylphosphat, 0-20 vægtprocent af en alkylether-alkylenglycol, og 20-50 vægtprocent af en ester, syre og/eller fed alkohol. Disse fede forbindelser kan tilsættes til flydende carbon-25 hydrider, såsom olie, eller forbindelser heraf, i f.eks. et forhold på 5-70%.

En variant af opfindelsen tilvejebringer en forbedring, som gør det muligt at opnå en meget hurtigere virkning fra mikroorganismerne; den gør det muligt at nedbryde carbonhydrider på meget kortere tid 30 ved at sætte et større antal mikrober igang med dette arbejde. Man har faktisk konstateret, at selv med det bedste næringsstof, som er urinstof, sker der ingen udvikling af en del af de mikroorganismer, som normalt er tilstede i havvandet, og som er i stand til at nedbryde carbonhydrider, og de deltager derfor ikke i den ønskede 35 nedbrydning. Ifølge den foreliggende variant, kan denne fraktion af mikroorganismer, der forbliver "inaktive", bringes til at udvikle sig og deltage i nedbrydningen af carbonhydrider, hvis det nitrogen-holdige næringsstof ledsages af en eller flere nitrogenforbindelser 148598 8 med en kemisk sammensætning, der tydelig er forskellig fra den første. Der opnås specielt gunstige resultater, når det første næringsstof er urinstof, og det andet udgøres af en eller flere aminhol-dige syrer.

5 Det følger heraf, at en mikroemulsion ifølge opfindelsen beregnet til mikrobiologisk behandling af et carbonhydridstof fortrinsvis omfatter en vandig opløsning med mindst to nitrogenforbindelser, der tydelig er kemisk forskellige. Hvis det første næringsstof således f.eks. er et ammoniumsalt, såsom ammoniumsulfat, -phosphat eller -nitrat, 10 er det andet næringsstof en amin, et amid, et protein, en aminosyre eller en anden forbindelse, der ikke er ammonium.

Nir den første næringsopløsning omfatter urinstof, er den anden nitrogenforbindelse f.eks. ammoniumsulfat, -phosphat eller -nitrat eller et aminolipid, navnlig en aminosyre. De relative mængder af de 15 to slags nitrogenforbindelser kan variere meget ifølge naturen af mikrofloraen i det miljø, hvor fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes. Oftest ligger den virksomme mængde af urinstof, udtrykt i nitrogen, i området fra ca. 50-99% af total nitrogen, d.v.s. at mængden af aminosyrenitrogen udgør 50-1%. I visse vandige miljøer kan fra 20 ca. 1 til 10% nitrogen i denne anden form være tilstrækkelig for at opnå udmærkede resultater.

De aminosyrer, der med fordel kan anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, kan udvælges blandt alle de aminosyrer, som man finder i naturen, og blandt syntetiske aminholdige syrer. Eksem-25 pelvis kan man anvende glycin, alanin, serin, cystein, valin, gluta-min, leucin, lysin, arginin, prolin, tyrosin, asparaginsyre og glutamin-syre o.s.v. Af økonomiske grunde har det interesse at anvende materialer, der hidrører fra naturprodukter, som almindeligvis indeholder serier af flere aminosyrer, det er f.eks. tilfældet med roebærme, 30 ekstrakter hidrørende fra massakreringen af forskellige planter, navnlig majskolber, gærekstrakt, proteinhydrolyseprodukter, mejeribiprodukter o.s.v.

Opfindelsen fører til dette uventede resultat, at selv om nitro-genholdigt næringsstof alene giver gode resultater, og selv om det 35 også er tilfældet med en anden enlig nitrogenforbindelse af forskellig kemisk natur, bliver mikroorganismernes nedbrydning af carbonhy-drider endnu bedre, når de to stoffer udnyttes samtidig, idet koncentrationen af total assimilerbar nitrogen er den samme.

Således gør mikroemulsionerne ifølge opfindelsen det muligt f.eks. at opnå en mere end 80% nedbrydning af råolie, der er spredt 9 148598 på havvand, i løbet af 7 dage, når næringsopløsningen indeholder urinstof eller aminholdige syrer, men det samme resultat opnås på 6 dage, hvis urinstof og de aminholdige syrer er tilstede samtidig i opløsningen, idet koncentrationen heri af total nitrogen er den sam-5 me i de to nævnte tilfælde.

Opfindelsen illustreres nu yderligere af en serie af eksempler.

EKSEMPEL 1-11

Til hvert forsøg blandedes et bestemt volumen af en 50 vægt-10 procent vandig urinstofopløsning med et volumen oliesyre i nærværelse af en vis mængde overfladeaktivt middel bestående af en blanding af phosphorsyreestere af fede alkoholer indeholdende 12-18 carbonatomer, hvilke forbindelser forhandles af Societe Hoechst under g navnet Hostaphat . I visse af forsøgene tilsattes ligeledes butylester-15 ethylenglycol for at sænke viskositeten. Det temperaturområde, i hvilket den opnåede mikroemulsion var stabil, bestemtes.

Tabel 1 viser de således fremstillede mikroemulsionssammensæt-ninger, stabilitetsområderne for disse og deres viskositet. Det fremgår, at der opnås en udmærket stabilitet i området fra 0 til over 40°C 20 ifølge eksemplerne 4, 5, 6, 8, 10 og 11. Hvad angår viskositeten fremgår det, at den er meget stor uden tilsætning af butyl esterethy-lenglycol (eksempel 1 og 2), hvorimod denne tilsætning bringer den på meget acceptable værdier (eksempel 3-11).

148598 10 co in cm t~* in m cm ’«a· I” » ' · · * 1 t— cn in od o cn i ι ι ιοί ο i t- i- CM r- t-

CO CM

CM CO CM OO CO CM 'ί-

Ο v v ^ v < *. I

i— O CO CD CO CO I OO ι ι Ο ι Oi CM I- CM i-

«3· CO

cm oo m m co co co O'" t CM O ι ιοί m co Γ"· cd ι ι ι ' ' ' o co

r- ϊ— CM r— ΐ— Γ"- Ο O

CO

i- CO O

CM CM O ty O COO 'T

co ' ' ' ' - - loo

T— f- Γ" ^ I lOCM lOO O CD

CM t— CM t— χιό f" in oo in ο σ> o o· o coo ii-

Γ". - - " - " " " C\J ’C

ο o i'«· *3· 1 1 in 1 100 1- t— CM CM CM I- t- r^ 00 13· 1

I— i— I— CO I— CM O lO

CO " " " ' - --01-

O O CM r- I I CO 1 I Ο O

CM CM CO ι— ΙΟ O

CO O ^ CO

CM Ο IO

_ CO CO CO D- i- -- O CM

^ in - - - - - 100 co 00 co 0 1 1 co 1 —* I— T- co I— i— uj in co ro cm t" *3· *3- ~L N r O 3 Ifl < t if τ co --- ico

|— ^- - - - - CO Ο Ο O CM

O' O’ CO CD I CO l I

T— i— CO CM

m M· D" O M" CO CO COCO ΊΓ i— O *3· i— CO'""" --- ‘ίο CO CO CO O in I I I CO O O r- ~

I- t- CO I- CM

Γ" CO

ι— r— in 1- cd f 0

CM""" *3" i— O lO

i— I— CO O ''"OO

t- r- ^3- Ο I CO I 1 in O O T— CM

r>· t— i— CO ΐ— in *3* I— --- - CM i— i— *3· 0 i-i-^r co ι 1 1 --- 1 0 ι- ι- M- 0 co in 0 0 0 (¾

+J

ID

JZ

a in £ S Ό „ ,s„ii 11 0“

8 rn § ^ S lb N

>· _i " i I o'? U Ό ®^Ooe T c °>

S ^ £ 3 0)0) (U

— jj'-'O) .— £- 0) to in > ra _ -C c > 0 om a £ £ % a. o g i 2! f a ΐϊ I i “ 0) ® in s_ Ό E \ ^ j- « 5 o_ 0 ® +j oiS5° 0)-2 tot = 8 ^c2>5=>0£ “°q J2 -* += 3 id .C ·- c -μ 0 <0 in n)^-— -J nj — +J&. ·— £ ·— >DOcQ-iOiua o\o z a. w> 11 148598 EKSEMPLEL 12-16

Der fremstilledes mlkroemulsioner med 33% laurylphosphat, den lipoblandbare væske var oliesyre, hvoraf der tilsattes den dobbelte mængde i forhold til mængden af den vandige opløsning af urinstof 5 og phosphat. % urinstof i den vandige fase varieredes. Resultatet nedenfor viser den maksimale temperatur, ved hvilken mikroemulsio-nen endnu er stabil.

% urinstof i den Øvre temperatu ΓΙΟ vandige fase grænse, °C_ 22,2 36 25 32 33 38 50 35 15 56 Ingen mi kroemulsion

Disse resultater viser, at der kan opnås mikroemulsioner, der i praksis forbliver stabile indtil ca. 36°C, med urinstofkoncentrationer på op til ca. 50% men ikke over.

20 EKSEMPEL 17-19

Med en 50% vandig urinstofopløsning og tilsætning af oleylphos-phat omfattende 30% monoethyletherethylenglycol fremstilledes tre mikroemulsioner omfattende forskellige mængder oliesyre. Her er 25 stabilitetsområderne for disse produkter.

Vægtforhold mellem Overfladeaktivt middel Stabilitetsurinstofopløsning og (oleylphosphat)_ område, °C

oliesyre_ 30 , 0,5 25,3 0-65 0,625 24,2 0-59 0,75 26,7 0 gel-64

Det fremgår, at et forhold mellem den vandige opløsning og 35 oliesyre på over ca. 0,65 og for en fikseret mængde monoethyletherethylenglycol på 30% er mikroemulsionen vanskelig at anvende, idet den har tendens til at danne gel, hvorimod man finder udmærket stabilitet under dette forhold.

T48598 12 NEDBRYDNING AF OLIENS CARBONHYDRIDER EKSEMPEL 20 I en 50 liters fermentor indførtes 30 liter havvand steriliseret ved 120°C i to timer. Pi overfladen af dette havvand udspredtes 30 5 ml 34° API råolie indeholdende 75% mættede carbonhydrider og 25% aromatiske carbonhydrider. Olielaget havde en tykkelse pi 0,5 mm.

På dette lag fordeltes 6 ml af en af de tidligere eksemplificerede mikroemulsioner. Miljøet inokuleredes derefter med bakterier hidrørende fra havvand; disse bakterier opnåedes ved 24 timers 10 dyrkning på en vandig glucoseopløsning, kulturen indeholdt for størstedelen Pseudomonas. Efter denne inokulering taltes bakterierne i olieprøven: der fandtes således fra 2,5x103 til 4x104 bakterier pr. ml.

Derefter påbegyndtes aerob dyrkning, idet fermentorens indhold 15 omrørtes med en omrører, der arbejdede ved 400 omdr./min., medens der pr. time indblæstes 120 liter steril luft, idet denne lufttilførsel svarer nogenlunde til den naturlige luftmængde til havs. Efter 48 timer udførtes en ny tælling: disse resultater er angivet nedenfor.

Efter 7 dage bestemtes nedbrydningsgraden af olien ved eks-20 traktion af resterende carbonhydrider med CCI^ og infrarød måling.

Nedenfor angives de resultater, der er opnået med mikroemul-sionerne fra eksempel 1, 2, 3, 10 og 11.

Mikroemulsion Bakterier i Bakterier efter Nedbrydnings- 25 (Eks.)_ begyndelsen 48 timer_ grad efter 7 dage 1 2,5x1O3 2,5x108 83% 2 2x1O4 9,5x108 90% 3 1,5x1O4 2,5x1O8 90% 10 4,5x1O3 2,5x108 86% 30 11 1,5x103 7,5x107 92% EKSEMPEL 21

Der udføres et forsøg på lignende måde som i eksempel 20, men i fermentoren indførtes havvand, der ikke er steriliseret, og mil-35 jøet inokuleredes ikke med supplerende bakterier. Resultaterne var:

Mikroemulsion Bakterier i Bakterier efter Nedbrydnings- (nr.)_ begyndelsen 48 timer_ grad efter 7 dage 11 2x1O3 5,5x107 82% 13 148598 EKSEMPEL 22

Der udførtes et forsøg ifølge fremgangsmåden fra eksempel 20, men havvandet erstattedes med rent vand tilsat havvandets forskellige mineralbestanddeie, således 30 ppm mikronæringsstoffer, navnlig jern, 5 magnesium og kalium. 6 ml af mikroemulsion 11 udbredtes, og miljøet inokuleredes njed en bakteriekultur.

Efter 7 dage bestemtes oliens nedbrydningsgrad ved ekstraktion af resterende carbonhydrider. med CCI4 og infrarød måling: denne nedbrydningsgrad var 90%.

10 EKSEMPEL 23-24

Nedbrydningsforsøg med arabisk råolie udførtes ved havet i et bassin, der var 2 m dybt, og som var inddelt i fire rum, hver med en vandret sektion på 3 m x 3 m. Rummene kan være adskilte eller 15 forbundet med hinanden, og alle var i stand til at modtage havvand.

Et pumpesystem, en hydroejektorpumpe, sikrede en let omrøring af vandet og fornyelse af luften i bassinet. I hvert rum indførtes 15,6 3 m havvand og 4 liter af den ovenfor nævnte olie, d.v.s. et lag med en tykkelse på 0,45 mm på vandoverfladen.

20 Et af rummene anvendtes til sammenligning: vandet og olien deri omrørtes som de andre rum, men der tilførtes ingen additiver. Til slut bestemtes oliesvindet af- naturlige årsager for at tage hensyn dertil ved vurderingen af den nedbrydning, der er fremkaldt ved tilsætningen ifølge opfindelsen.

25 Til hvert af de tre andre rum tilsattes 0,4 liter af en mikro emulsion af næringsopløsning, der i vægtprocent havde følgende sammensætning:

Urinstof 17,0

Ferskvand 20,8 30 Butyiglycol 10,8

Laurylphosphat 21,1

Oliesyre 30,3

Ved forsøgets begyndelse udgjorde mikrofloraen i bassinets hav-35 vand 10 bakterier pr. ml. Efter 7 dage bestemtes den forsvundne mængde olie i rummene; tabellen herefter angiver disse størrelser i procent af begyndelsesmængden ved to forskellige temperaturer.

148598 14

Sammenligning Eks. 23 Sammenligning Eks. 24 12°C 12°C 18°C 18°C

% svind af naturlige irsager 5 5 17,5 17,5 5 % svind ved behandling ifølge opfindelsen _0 58_ 0_ 61,3 % svind total 5 63 17,5 78,8

Som det fremgår, opnås der en betragtelig bionedbrydning i 10 løbet af 7 dage selv ved den forholdsvis lave temperatur på 12°C; nedbrydningen er imodsætning til kendt teknik opnået uden tilførsel af mikroorganismekulturer, alene under anvendelse af de mikroorganismer, der findes i havvandet.

15 EKSEMPEL 25

Til en 50 liters fermentor tilsattes 30 liter havvand. På overfladen af dette vand spredtes 30 ml 34° API råolie indeholdende 75% mættede carbonhydrider og 25% aromatiske carbonhydrider. På det således dannede olielag med en tykkelse på 0,5 mm spredtes 6 ml 20 mi kroemulsion, der har følgende vægtsammensætning:

Urinstof 17,3%

Vand 21,5%

Butyletherethylenglycol 10,8%

Laurylphosphat 23,7% 25 Oliesyre 26,7% (8,07% nitrogen) 100,0 2 Tælling af bakterierne i olien viste tilstedeværelsen af 10 bakterier pr. ml.

30 Aerob dyrkning påbegyndtes derefter, idet fermentorens ind hold omrørtes med en omrører ved 400 omdr./mih., medens der pr. time indblæstes 120 liter steril luft; denne lufttilførsel svarer nogenlunde til den naturlige lufttilførsel til havs.

Efter 48 timer udførtes en ny tælling, som viser tilstedeværel- g 35 sen af 2,5x10 bakterier pr. ml. Efter 7 dage bestemtes oliens nedbrydningsgrad ved ekstraktion af de resterende carbonhydrider med CCI^ og infrarød måling: nedbrydningsgraden var 83%.

15 148598 EKSEMPEL 26

Fremgangsmåden i eksempel 25 gentoges, men i mikroemulslonen erstattedes en del af urinstoffet med aminosyren DL-valin. Mikro-emulsionens vægtsammensætning var: 5 Urinstof 16,8% DL-valin 2,0%

Vand 20,5%

Butyletherethylenglycol 10,8%

Laurylphosphat 23,7% 10 Oliesyre 26,2% 100,0 (total nitrogen i urinstof og valin: 8,07%).

2 9 Tælling af bakterierne viste 10 i starten og 10 efter 48 timer.

15 Nedbrydningsgraden af olien var 84% på den 6. dag.

Sammenligning med eksempel 25 viser, at tilsætningen af amino- 9 8 syren gør det muligt at opnå 10 bakterier i stedet for 2,5x10 med urinstof alene efter 48 timer; nedbrydningen af samme størrelsesorden (84% mod 83%) har kunnet opnås hurtigere i løbet af 6 dage, 20 medens det tog 7 dage i tilfældet med urinstof alene.

EKSEMPEL 27

Ved den i eksemplerne 25 og 26 beskrevne metode anvendtes en mi kroemulsion, i hvilken en del af urinstoffet var erstattet med et 25 vandigt ekstrakt af majskolber omfattende en serie af aminosyrer, med overvægt af alanin, arginin, glutaminsyre og leucin, medens de andre aminosyrer tilstede i mindre mængder var prolin, isoleucin, threonin, valin, phenylalanin, methionin og cystin. Det totale nitrogenindhold i dette ekstrakt var 1%.

30 Mikroemulsionen udviste følgende vægtsammensætning:

Urinstof 12,4%

Majskolbeekstrakt 18,7%

Butyletherethylenglycol 19,2%

Laurylphosphat 29,1% 35 Oliesyre 20,6%

Vandet i den vandige fase var vandet i det vandige ekstrakt.

Indholdet af total nitrogen i den vandige fase beløb sig til 6%.

2 9

Med en udgang på 10 bakterier blev der talt 4x10 efter 48 timer, og oliens nedbrydningsgrad havde nået 88% efter 6 dage.

148598 16

Sammenligning af disse resultater med resultaterne i eksempel 25 viser, at det har interesse at tilsætte aminosyrer til urinstof.

EKSEMPEL 28-37 5 I denne forsøgsserie, som er analog til eksempel 27, erstattedes laurylphosphat med oleylphosphat og oliensyren med forskellige væsker, der er anført i tabellen nedenfor, og som angiver oliens nedbrydningsgrad efter 6 dage.

10 Eksempel nr. Den anvendte hydrofobe væske Nedbrydning % 28 Jordnøddeolie 88 29 Rapsolie 82 30 Olein 86 31 Blanding af fedtsyrer fra kokos 15 med 10% vaselineolie 85 32 Laurinsyre, som er gjort flydende med 10% råolie 84 33 Butyfcaproat 85 34 Ethyllaurat 87 20 35 Methyloleat 86 36 Amylstearat 88 37 Gasolie med 10% sesamolie 83

Der opnåedes lignende resultater med en blanding af mono-, 25 di- og tri-(alkyltetraglycolether)-o-phosphater af alkyl med 12-14 carbonatomer, kendt i handelen under betegnelsen Hostaphat KL 340 N, i stedet for oleylphosphat.