NL8104298A - Werkwijze voor het kweken van mikro-organismen in een hydrofoob midden, en voor dat doel bestemde voedingsvloeistof. - Google Patents

Description

f- ·* y

Lx 5889 ¥

Werkwijze τοογ het kweken van mikro-organismen in een hydrofoob midden, en τοογ dat doel bestemde voedingsvloeistof.

De uitvinding beeft betrekking op een nieuwe mikro-emulsie, en wel een thermodynamisch stabiele mikro-emulsie van een waterige oplossing van voedingsstoffen, waarvan de uitwendige fase wordt gevormd door een hydrofoob midden. De uitvinding beeft betrekking op 5 een werkwijze voor bet bereiden van een dergelijke mikro-emulsie, en op toepassingen daarvan bij bet gebruik van mikro-organismen, in bet bijzonder voor bet kweken van dergelijke organismen in een hydrofoob midden.

Bewerkingen op industriële schaal, waarbij kweken van ver-10 schillende mikro-organismen, in bet bijzonder bacteriën en zwammen, worden gebruikt, zijn tegenwoordig zeer algemeen. Zowel in de voedingsmiddelen- en de geneesmiddelenindustrie als voor zuiverings-doeleinden worden dergelijke bewerkingen toegepast. Heestal omvatten deze twee stappen, en wel eerst bet kweken van bet desbetreffende 1^ mikro-organisme in een geschikt voedingsmidden, totdat een voldoende aantal organismen is bereikt, waarna in de tweede stap deze organismen in aanraking worden gebracht met stoffen, die men aan de inwerking van deze organismen wil onderwerpen. Bewerkingen in een kweek-vat brengen in dit opzicht geen bijzondere moeilijkheden met zich 20 mede, waarbij de voorafgaande kweek, d.w.z. de vermenigvuldiging van de organismen, kan plaatsvinden in een afzonderlijk vat dan wel in het-zelfde vat als waarin de tweede bewerkingsstap plaatsvindt. Wanneer echter deze bewerkingen in de natuur op grote bodem- of wateroppervlakken moeten worden uitgevoerd, bijvoorbeeld bij bet door mikro-25 biologische afbraak verwijderen van koolwaterstoflagen op bet zeeoppervlak, op stranden* op binnenwateren of op meren, leidt de voorafgaande vermenigvuldiging van de te gebruiken mikro-organismen tot moeilijkheden. Men moet namelijk aan de kweek voedingsstoffen toedienen, d.w.z. bronnen van C, N en P, alsmede sporenelementen, ten-30 einde de groei van de desbetreffende organismen te verzekeren. De gangbare bronnen, zoals koolhydraten, nitraten, ammoniakzouten en fosfaten, zijn echter oplosbaar in water, en zullen derhalve niet in een oppervlakslaag achterblijven binnen het te behandelen gebied, waar een aanmerkelijke groei van de mikro-organismen moet plaatsvin-35 den. Deze stoffen diffunderen in het onderliggende water of in de 8104298 Ü. ....

- 2 - bodem, en worden derhalve aan de kweek, onttrokken.

Om hierin verbetering te brengen zijn reeds verschillende werkwijzen voorgesteld. Den daarvan omvat het met paraffine omgeven van korrels, die uit een vaste stikstofverbinding en een fosfaat be-5 staan, welke korrels onder deze vorm aan de mikro-organismen worden aangeboden, zoals beschreven in US 1 959 127· Bij een ander voorstel volgens. US 3 883 397 bestaat de llpofiele omhulling uit een vetzuur-. zout in plaats van uit paraffine. Een bezwaar hiervan is, dat de mikro-organismen het gewenste voedingsmiddel niet snel ter beschik-10 king hebben. De omhulling kan moeilijk worden doorboord, d.w.z* afgebroken, wanneer uitwendige stikstof en fosfor ontbreken· De werking van de bacteriën of zwammen is derhalve langzaam, en vergt weken ' of zelfs maanden· Den ander voorstel omvat het gebruik van in water onoplosbare doch in koolwaterstoffen oplosbare verbindingen als N- en 15 P-bron, in het bijzonder fosforaminolipiden, zoals beschreven in FR-A 2172796. In olie oplosbare stikstofverbindingen hebben echter in het algemeen een tamelijk gering stikstofgehalte, met het gevolg, dat een biologische afbraak van aardoliekoolwaterstoffen op zee 2·.3 maanden vergt. In FR-A 2 230 401 is verder het gebruik van amiden, 20 organische ammoniumzouten en fosforaminolipiden in oplossing in een aardolie-oplosmiddel beschreven, waarbij de oplossing in water wordt geëmulgeerd· De verkregen emulsie wordt verpulverd over een op water drijvende koolwaterstoflaag om deze biologisch af te breken. Deze werkwijze vereist grote hoeveelheden waterige emulsie, terwijl het 25‘ effekt pas na weken wordt verkregen.

De uitvinding verschaft een nieuwe oplossing voor het toevoeren van in water oplosbare voedingsstoffen aan een hydrofobe organische laag. Ongeacht of deze laag, die uit koolwaterstoffen kan bestaan, op het water drijft dan wel op de bodem of op een bouwwerk 30 rust, zullen de voedingsstoffen, die volgens de uitvinding worden toegevoegd, in hoofdzaak in de hydrofobe laag blijven, waardoor een snelle vermenigvuldiging van mikro-organismen zal plaatsvinden, wanneer de kiemen daarvan in de laag aanwezig zijn.

De werkwijze volgens de uitvinding omvat het vormen van een 35‘mikro-emulsie van water in olie, waarvan de inwendige fase een waterige oplossing van voedingsstoffen, en de uitwendige fase een niet met water mengbare vloeistof is, welke emulsie aan de af te breken hydrofobe laag wordt toegevoegd. Deze mikro-emulsie kan kiemen van geschikte mikro-organismen bevatten, wanneer het te behandelen midden 8104298 * '* - 3 - deze niet of niet voldoende bevat.

Zoals bekend bevat de mikro-emulsie tenminste eèn opper-vlaksactief en een oppervlakscoactief middelt die voor de bereiding daarvan zijn gebruikt.

5 . In tegenstelling tot de bekende werkwijzen worden de voe dingsstoffen noch in de vaste toestand» noch in de vorm van een niet - met water mengbare oplossing of van een waterige makro-emulsie gebruikt, doch in de vorm van een waterige oplossing, die in een met de af te breken hydrofobe laag mengbare vloeistof is gemikro-emul-10 geerd, en zich in de vorm van zeer fijn verdeelde of geïnverteerde micellen bevindt, waarvan de middellijn 8..60 nm, en in het bijzonder 10.*20 nm bedraagt. Deze onverwachte vorm leidt tot een bijzon- . dere uitkomst, en wel dat de biologische afbraak binnen enige dagen kan worden verwezenlijkt, in plaats van in weken of maanden, zoals 15 dit bij de bekende werkwijzen het geval was.

Als stikstofbron kan in de mikro-emulsies volgens de uitvinding gebruik worden gemaakt van verschillende in water oplosbare verbindingen, die door de mikro-organismen kunnen worden opgenomen· Voorbeelden hiervan zijn ammoniumnitraat, -sulfaat en/of -fosfaat, 20 ureum, eiwitten, peptonen e.d. Ureum is een meststof, die zeer rijk is aan stikstof, en die zeer goed in water oplosbaar is, en is derhalve bijzonder geschikt, aangezien daarvan sterk geconcentreerde waterige oplossingen kunnen worden bereid. Zo kunnen bijvoorbeeld ureumoplossingen van 10..60 gew.Jé, d.w.z. 11..150 delen op 100 delen 25. water, worden gebruikt.

Ook fosfor kan aan de oplossing worden toegevoegd in een van de gebruikelijke vormen, zoals fosfaten of fosfieten van alkalimeta-len of ammonium. Bij een bijzondere uitvoeringsvorm wordt fosfor in de vorm van een oppervlaksactieve verbinding gebruikt, zoals bijvoor-50 beeld een fosfaat van een hoger alkyl of een lecithine.'De fosforbron en het oppervlaksactieve middel zijn dan in hetzelfde molekuul in de mikro-emulsie aanwezig.

Bij vele industriële bewerkingen, die het kweken van mikro-organismen omvatten, is het nodig de pH van het midden op een voor de 55'bacteriegroei gunstige waarde in te stellen. In het algemeen dient het midden ongeveer neutraal te zijn, waarbij voor het neutraliseren ofwel fosforzuur, dat een fosforbron is, ofwel ammoniak, dat een stikstofbron is, kan worden gebruikt.

In het geval van het afbreken van koolwaterstoffen door 8 1 0 4 2 9 8' - k - * *· * · it * nader te noemen mikro-organismen is de fosforbehoefte aanmerkelijk geringer dan-de stikstofbehoefte. In gewichten uitgedrukt kan de verhouding P/N 0,02..0,2, en bij voorkeur 0,05..0,15 bedragen. Wat de groei betreft dient de verhouding P/N zó dicht mogelijk bij 0,05 te 5 liggen.

Wanneer de niet met water mengbare vloeistof, die bij voorkeur met olie mengbaar is, en die de uitwendige fase van de mikro-emulsie vormt, dan wel de af te breken hydrofobe laag, door de mikro-* organismen als zodanig als koolstofbron kan worden gebruikt, is het 10 niet meer nodig andere opneembare koolstofverbindingen aan de mikro-emulsie toe te voegen. Wanneer de uitwendige fase daarvan en de af te breken laag tenminste in het begin moeilijk door de mikro-organismen kunnen worden aangetast, is het van belang in de voedingsoplossing een gemakkelijk te gebruiken koolstofbron op te nemen, bijvoorbeeld 15 oplosbare koolhydraten, teneinde de vermenigvuldiging van de mikro-organismen snel op gang te brengen.

Zoals in alle kweken zijn ook hier sporenelementen vereist, in het bijzonder zouten van Fe, Mg, K e.d·, zodat op de bekende wijze —zeer geringe hoeveelheden daarvan aan de voedingsoplossing moeten wor-20 den toegevoegd.

Het spreekt vanzelf, dat voor het verkrijgen van een mikro-emulsie volgens de uitvinding een opppervlaksactieve verbinding moet worden gebruikt, die toelaat een dergelijke emulsie te verkrijgen.

De keus van een geschikte verbinding ligt voor de vakman voor de hand, 25 en kan worden gemaakt in talrijke groepen van oppervlaksactieve stoffen, die voor de aanwezige mikro-organismen niet vergiftig zijn. Zo kan men bijvoorbeeld gebruik maken van vetzuursulfaten, sulfosucci-naten, geoxyethyleneerde esters -van sorbitan, alkoholen, geoxyethy-leneerde zuren of oliën, saccharose-esters, aminozuren, cs-amido-30 aminozuren, taurinen, sarcosinen, polyglycolen, fosfaten van zware alkylen e.d. Deze opsomming is niet beperkend bedoeld, daar ook nog andere oppervlaksactieve stoffen kunnen worden gebruikt, in het bijzonder stoffen, die ten opzichte van koolwaterstoffen verspreidende eigenschappen vertonen.

35" Bij voorkeur bedraagt het hydrofiel-lipofiel-evenwicht van de gebruikte emulgeermiddelen 10..17, en in het bijzonder 11··15«

Wanneer het gaat om in de buitenlucht uit te voeren bewerkingen, moet het oppervlaksactief middel zelf biologisch afbreekbaar zijn om verontreiniging van de omgeving te voorkomen.

8104298 I * * - 5 - - . _ Ook wat het voor het bereiden van de mikro-emulsie vereiste coactieve middel betreft is de keus groot- Dergelijke middelen zijn bekend, zodat een volledige opsomming daarvan overbodig is. Br wordt als niet beperkend voorbeeld op gewezen, dat stikstofverbindingen, zo-5 als carbamaten, amiden en aminezouten,kunnen worden gebruikt. De viscositeit van de mikro-emulsie kan aanmerkelijk worden verminderd door toevoeging van een alkohol, in het bijzonder met 6*.12 C-atomen, een ether of een ester van polyol, en in het bijzonder van glycol, waardoor de bewerkingen aanmerkelijk kunnen worden vergemakkelijkt.

10 Daar de uitwendige fase van de mikro-emulsie met de af te breken hydrofobe vloeistof mengbaar moet zijn, wordt de keus daarvan noodzakelijkerwijs door de aard van deze vloeistof bepaald. In het meest belangrijke praktische geval, waarin deze laatste wordt gevormd door aardoliekoolwaterstoffen, kan de uitwendige fase bijvoorbeeld 15 worden gevorm'd door alifatische, aromatische of naftenische koolwaterstoffen, of door minerale oliën, d.w.z. mengsels van dergelijke koolwaterstoffen. Een dergelijke uitwendige fase wordt echter moeilijk door bacteriën aangetast, wanneer deze niet een voldoende aanpassing hebben ondergaan. Het verdient derhalve de voorkeur plantaardige of 20 dierlijke oliën te gebruiken, die als een koolstofbron kunnen dienen, daar deze door mikro-organismen kunnen worden verteerd. Deze oliën, of bij voorkeur de overeenkomstige vetzuren, laten een snelle ontwikkeling van de mikro-organismen toe, die nodig zijn voor de afbraak van de hydrofobe laag, in het bijzonder ruwe aardolie.

25 De gewichtsverhouding tussen de met olie mengbare vloeistof, d.w.z. de uitwendige fase van de mikro-emulsie, en de te emulgeren waterige oplossing moet in het algemeen groter zijn dan 0,2. Deze verhouding wordt zodanig gekozen, dat de waterige oplossing de inwendige fase vormt. De keus van de oppervlaksactieve en -coactieve middelen 50 hangt af van de aard van de met olie mengbare vloeistof, en van de concentratie van de in de waterige fase opgeloste zouten. Een en ander is bekend, zodat hierop niet nader behoeft te worden ingegaan.

De werkwijze volgens de uitvinding kan op een groot aantal mikro-organismen worden toegepast, en in het bijzonder op die, die 35 koolwaterstoffen kunnen afbreken. De uitvinding kan derhalve worden toegepast bij het gebruik van bacteriën zoals pseudomonas, acineto-bacter, flavobacterium, artrobacter, corynebacterium e.d. De mikro-organismen kunnen ook zwammen zijn.

Hoewel de uitvinding zeer belangrijk is voor verschillende 8104298 ..... .- ./ « > - 6 - m in de buitenlucht uit te voeren biologische afbraakbewerkingen, kan deze ook nuttig zijn bij in een vat uit te voeren bewerkingen, zodra een hydrofobe laag van een stof in de bewerking is betrokken. Zo kan deze werkwijze bijvoorbeeld worden toegepast bij het bereiden van ei-5 witten uit koolwaterstoffen door afbraak van de laatstgenoemde met behulp van bacteriën en/of zwammen. Zo leidt de opmerkelijke verspreiding van waterige voedingsstoffen in de hydrofobe fase tot een snellere vermenigvuldiging van de mikro-organismen, zodat een aanmerkelijke tijdwinst in de bewerkingen kan worden bereikt.

10 Onder de toepassingen in.de open lucht op water- of bodem- oppervlakken is de belangrijkste wel het afbreken van door een ongeval verspreide koolwaterstoffen. Wegens het bovengenoemde feit, dat • de oplosbare voedingsstoffen nu in de te behandelen laag blijven en niet door water worden meegesleept, is de uitvinding van grote waarde 15 voor het bestrijden van verontreiniging van de zee met olie. Hetzelfde beginsel is echter ook van toepassing op bewerkingen zoals het verwijderen van koolwaterstofneerslag van wegenj bekkens, vloeren'e.d.'Een andere toepassing is het verspreiden van kunstmest over landbouwgronden e.d.

20 De mikro-organismen zijn in het algemeen in het te behande len midden aanwezig. Het is echter soms nodig dit midden te enten, wanneer de geschikte organismen niet of in te gering aantal aanwezig zijn.

Bij een bijzondere uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt 25 ureum als stikstofhoudende voedingsstof gebruikt. Het is gebleken,üat ureum coactief werkt, zodat geen .anderrmiédel:meer behoeft te worden toegevoegd. Daar verder fosfor met voordeel kan worden toegevoegu. door middel van alkylesters van fosforzuur, die oppervlaksactieve eigenschappen hebben, wordt de samenstelling van de voedingsoplossing ver-30 eenvoudigd doordat zonder verdere toevoegingen met ureum en fosfor-zuurester kan worden volstaan. Het kan nochtans aanbeveling verdienen vloeistoffen toe te voegen, waarmede de viskositeit van de mikro-emulsie wordt verminderd. In het voorgaande zijn reeds voorbeelden vein dergelijke toevoegsels genoemd. Bij een bijzondere uitvoerings-35 vorm van de uitvinding heeft butylether van ethyleenglycol uitstekende uitkomsten gegeven.

De met olie mengbare vloeistof, die bijzonder geschikt is voor de uitwendige fase van de mikro-emulsie volgens de uitvinding, kan worden gevormd door een of meer vetzuuresters, bijvoorbeeld van 8104298 % - 7 - laurine-, myristine-, palmitine-, arachidine^'ólie-rfr.'stearins-*· caprine-, capron- en caprylzuur e.d. De glycerxden van dergelijke zuren zijn in de handel verkrijgbaar, daar deze plantaardige of dierlijke oliën zijn. Zo kan men bijvoorbeeld gebruik maken van oliën zoals 5 van aardnoten, walvistraan, koolzaad, lijnzaad, mais, ricinus-, sesamzaad, talk e.d. De vetzuren zelf zijn bijzonder geschikt, en kunnen zonodig in bepaalde mengsels worden gebruikt, teneinde bij de omgevingstemperatuur vloeibaar te blijven. Zo kunnen bijvoorbeeld vetzuren r in het bijzonder met 6..18 C-atomen, worden gebruikt, zoals 10 capron-, oenanthyl-, capryl-, laurine-, palmitine-, olie-, linolr- of stearinezuur. Bij die vette stoffen, die bij de normale temperaturen niet vloeibaar zijn, kunnen koolwaterstoffen zoals aardolie of gasolie in een hoeveelheid van ongeveer 5-*50 % worden toegevoegd. Vet-zuuralkoholen, d.w.z. met 6..2½ C-atomen, zijn eveneens geschikt.

15 In een bijzonder geval, waarin de waterige oplossing ureum en lauryl- of oleylfosfaten bevat, welke laatste in de handel verkrijgbaar zijn onder de naam "Hostaphalt*1 (van Hoechst), bedraagt het voorkeursgehalte aan stikstof in de mikro-emulsie ongeveer ^..10 gew.#, en in het bijzonder 5·»8 gew.#. De gewichtsverhouding tussen 20 stikstof en de mengbare vloeistof bedraagt in het algemeen 0,1..0,^, en in het bijzonder 0,15*.0,35·

In het algemeen bevatten de voorkeurs-mikro-emulsies volgens de uitvinding 10..30 gew.% water, ^..10 gew.# opneembare stikstof in de vorm van stikstofverbindingen, 5·»35 gew.% alkylfosfaat 25 met 10..18 C-atomen of geëthoxyleerd alkylfenolfosfaat, 0..20 gew.% alkylether van alkyleenglycol, en 20..50 gew. tester, zuur of vet-zuuralkohol. Daaraan kunnen nog vloeibare koolwaterstoffen worden toegevoegd, zoals aardolie of derivaten daarvan, bijvoorbeeld in een hoeveelheid van 5*»70 3P De uitvinding verschaft voorts een verbetering, die een snellere werking van. de mikro-organismen toelaat. Daardoor wordt het afbreken van koolwaterstoffen in een kortere tijd mogelijk, en wel door daartoe een groter aantal mikroben te gebruiken. Men heeft namelijk vastgesteld, dat zelfs met de beste voedingsmiddelen zoals ureum een 35 deel van de normalerwijs in zeewater aanwezige mikro-organismen, die in staat zijn koolwaterstoffen af te breken, zich niet zal ontwikkelen, zodat deze niet aan de gewenste afbraak kunnen deelnemen. Volgens de uitvinding wordt er-'voor gezorgd, dat dit onwerkzaam gebleven gedeelte van de mikro-organismen zich kan ontwikkelen, teneinde aan 8104298 « .

/ , i - · - δ - het afbreken van de koolwaterstoffen te kunnen deelnemen, hetgeen mogelijk wordt, wanneer de stikstofhoudende voedingsstof een of meer stikstofhoudende bestanddelen bevat, waarvan de scheikundige samenstelling verschilt van de eerste. Bijzonder gunstige uitkomsten kun-5 nen worden verkregen, wanneer de eerste voedingsstof ureum is, en de tweede door een of meer aminozuren wordt gevormd.

.....Hieruit volgt, dat een mikro-emulsie volgens de uitvinding, die bestemd is voor een mikrobiologische behandeling van een koolwaterstof, bij voorkeur een waterige oplossing van tenminste twee 10 stikstofverbindingen bevat, die van scheikundig standpunt bezien duidelijk van elkaar verschillen. Wanneer de eerste voedingsstof bijvoorbeeld een zout zoals een ammoniumsulfaat, -fosfaat of -nitraat is, dan wordt de tweede gevormd door een amine, amide, eiwit, aminozuur of andere niet-ammoniakale verbinding.

15 Wanneer de voedingsstof ureum bevat, is de tweede stikstof houdende verbinding bijvoorbeeld ammoniumsulfaat, -fosfaat of -nitraat, of een aminolipide, en in het bijzonder een aminozuur. Be verhouding tussen de beide soorten stikstofhoudende stof kunnen binnen een breed gebied worden veranderd, afhankelijk van de aard van de mikroben in 20 het midden, waarop de werkwijze volgens de uitvinding wordt toegepast. Meestal bedraagt de doeltreffende hoeveelheid ureum, uitgedrukt in stikstof, ongeveer -99 % van de totale stikstofhoeveelheid, zodat de stikstofhoeveelheid uit het aminozuur 50..1 % bedraagt. In bepaalde waterige middens kan 1..10 % stikstof in de laatstgenoemde vorm 25 voldoende zijn om uitstekende uitkomsten te verkrijgen.

Be bij voorkeur volgens de uitvinding gebruikte aminozuren kunnen zowel in de natuur gevonden als synthetische aminozuren zijn.

Voorbeelden daarvan zijn glycine, alanine, serine, cysteine, valine, glutamine, leucine, lysine, arginine, proline, tyrosine, aspartine-30 en glutaminezuur e.d. Om ekonomische redenen is het van belang natuurlijke produkten te gebruiken, die in het algemeen reeksen van verschillende aminozuren bevatten. Bit is bijvoorbeeld het geval bij bietensap, plantenextracten, in het bijzonder van maisstelen, gist-extract, eiwithydrolyseprodukten, nevenprodukten van de zuivelberei-35 ding en dergelijke.

Be uitvinding leidt tot de onvoorziene vaststelling, dat, wanneer- een stikstofhoudende voedingsstof alleen al goede uitkomsten geeft, en wanneer dit ook voor een andere stikstofhoudende stof van scheikundig andere aard geldt, de aantasting van koolwaterstoffen door 8104298 - 9 - mikro-organismen nog beter wordt, wanneer deze beide stoffen samen worden gebruikt, terwijl de totale hoeveelheid opneembare stikstof dezelfde is·

De mikro-emulsies volgens de uitvinding laten derhalve bij-5 voorbeeld toe een afbraak van meer dan 80 % van over het zeeoppervlak verspreide ruwe olie binnen 7 dagen tot stand te brengen, wanneer de voedingsoplossing ureum of aminozuren bevat. Deze zelfde uitkomst kan in 6 dagen worden bereikt, wanneer zowel ureum als aminozuren samen in de oplossing aanwezig zijn, terwijl de totale hoeveelheid 10 stikstof daarin in beide gevallen dezelfde is.

De uitvinding zal nu aan de hand van enige niet-beperkende voorbeelden nader worden toegelicht.

Voorbeelden I..XI:

Bij elke proefneming werd bij een bepaald volume van een 15 waterige ureumoplossing van 50 gew.# een hoeveelheid oliezuur gevoegd in tegenwoordigheid van een bepaalde hoeveelheid van een opper-vlaksactief middel, dat werd gevormd door een mengsel van fosforzuur-esters van alkanolen met 12..18 C-atomen, zoals in de handel gebracht onder de naam “Hostaphat" (Hoechst). Bij bepaalde proeven werd boven-20 dien butylether van ethyleenglycol toegevoegd om de viskositeit te verminderen· Het temperatuurgebied, waarin de verkregen mikro-emulsies stabiel waren, werd bepaald·

De tabel geeft de samenstelling van de aldus verkregen mikro-emulsies aan, alsmede het stabiliteitsgebied ervan en de vis-25,-kositeit. Daaruit blijkt, dat in het gebied van 0..A-0 °C een uitstekende stabiliteit kan worden verkregen in het geval van de voorbeelden IV, V, VI, VIII, X en XI. Wat de viskositeit betreft kan worden vastgesteld, dat zonder toevoeging van butylether de viskositeit groot is (voorbeelden I en II), terwijl de toevoeging daarvan tot aanvaard-30 bare waarden leidt (voorbeelden III..XI).

Voorbeelden XII..XVI;

Er werden mikro-emulsies bereid met 33 % laurylfosfaat. De met olie mengbare vloeistof was oliezuur, waarvan de hoeveelheid tweemaal zo groot was als die van de waterige oplossing van ureum en 35 fosfaat. Hierbij werd het ureumgehalte in de waterige fase veranderd. De maximale temperatuur, waarbij de emulsie nog stabiel was, was daarbij als volgt: 8104298 - 10 - ureum in waterige fase bovengrens van de temperatuur _ _ _(#) __H?)__ 22,2 36 25 32 33 .38 5 50 35 56 geen mikro-emulsie

Deze uitkomsten tonen aan, dat praktisch bruikbare mikro-emulsies, die tot ongeveer 36 °C stabiel zijn, met ureumconcentraties tot 50 # kunnen worden bereid, doch daarboven niet meer.

10 Voorbeelden XVII..XlXi

Met een waterige oplossing van 50 % ureum onder toevoeging van oleylfosfaat met 30 % monoethylether van ethyleenglycol werden drie mikro-emulsies met verschillende gehalten aan oliezuur bereid.

De stabiliteitsgebieden waren daarbij als volgt· 15 gewichtsverhouding ureum- oppervlaksactief middel stabiliteitsge-oplossing/ollezuur_ (oleylfosfaat) bied (°C)_ 0,5 25,3 0..65 0,625 24,2 0..59 0,75 26,7 °geV6k

Hieruit volgt, dat boven een oplossing/oliezuur-verhouding 20 van ongeveer 0,65 ea voor een vaste hoeveelheid ether van 30 % de mikro-emulsie moeilijk kan worden gebruikt, daar deze een neiging tot geleren heeft. Beneden deze verhouding blijkt echter een uitstekende stabiliteit te worden verkregen.

Voorbeeld XX: Afbraak van aardolie-koolwaterstoffen.

25 In een gistingsvat van 50 1 werd 30 1 zeewater gevoerd, dat gedurende 2 h bij 120 °G was gesteriliseerd. Op het oppervlak daarvan werd 30 ml ruwe olie van 34 °API uitgespreid, die 75 % verzadigde en 25 % aromatische koolwaterstoffen bevatte. De olielaag had een dikte van 0,5 mm. Op deze laag werd 6 ml van een van de mikro-emul- 30 sies volgens de voorafgaande voorbeelden verpulverd. Het midden werd vervolgens geënt met kiemen, die uit zeewater afkomstig waren. Deze kiemen werden verkregen door een kweek gedurende 24 h op een waterige glucose-oplossing te houden. Deze oplossing bevatte in hoofdzaak pseudomonas.

35 Na deze enting werden de kiemen in oliemonsters geteld. Daar- * j.

bij werden 2,5*10 **4.10 kiemen/ml geteld.

8104298 i -11-- ... Vervolgens werd een aerobe kweek uitgeroerd, waarbij de in-hond van het vat met een met 400 min draaiende roerder werd ge- roerd, terwijl 120 1/h gesteriliseerde lucht werd ingeblazen, het- [ geen in hoofdzaak overeenkwam met de in de zee van nature plaatsvin-5 dende beluchting· ,

Na 48 h werd opnieuw een telling uitgevoerd, waarvan de uitkomsten kleiner waren dan in het eerste geval· - - Na 7 d werd de afbreking van de aardolie bepaald door ex tractie van de overgebleven koolwaterstoffen met CCl^ en een infra-10 roodmeting. De uitkomsten met de mikro-emulsies van de voorbeelden I, II, III, X en XI waren als volgt:

Voorbeeld kiemen bij kiemen na afbraakgraad __________ het begin 48 h na 7 d I 2,5-103 2,5-100 83 # 1Γ 2 .104 9,5-108 90 # 15 III 1,5-10^ 2,5-108 90 % X 4,5-103 2,5-108 86 % XI 1,5-103 7,5-107 92 $>

Voorbeeld XXI:

Br werd een proef op de wijze van voorbeeld XX uitgevoerd, 20 waarbij echter niet-gesteriliseerd zeewater werd gebruikt, terwijl geen bijkomende bacteriën werden geënt. Daarbij werden de volgende uitkomsten verkregen:

Voorbeeld kiemen bij kiemen na afbraakgraad _ het begin 48 h na 7 d XI 2.103 5,5-107 82 % 25 Voorbeeld XXII:

De proef volgens voorbeeld XX werd herhaald, doch het zeewater werd door een ander natuurlijk water vervangen, waaraan de verschillende minerale bestanddelen van het zeewater waren toegevoegd, alsmede 30 dpm sporenelementen, in het bijzonder ijzer, magnesium en 30 kalium· Daarna werd 6 ml van de mikro-emulsie XI daarover verpulverd, terwijl het midden werd geënt met een bacteriecultuur.

Na 7 d werd de afbraakgraad van de aardolie bepaald door extractie van de rest koolwaterstoffen met CCl^ en infraroodmetingj deze bedroeg 9° #· 35 Voorbeelden XXIII en XXIV:

Proefnemingen met biologische afbraak van Arabische ruwe 8104298 v s» - 12 - olie werden aan de zeeoever in een bak met een diepte van 2 m uit- 2 gevoerd, met vier vakken van elk J.x3m · De vakken konden daarbij van elkaar worden gescheiden of met elkaar worden verbonden, terwijl :9an elk daarvan zeewater kon worden toegevoerd. Met behulp van een 5 pomp werd een zekere beweging in het water en luchtverversing teweeggebracht.

In elk vak werd 15*6 m^ zeewater en b 1 aardolie gevoerd, die een laag met een dikte van 0,^5 mm op het wateroppervlak vormde. Een van de vakken diende voor een vergelijkingsproef, waarbij het 10 water en de olie zoals bij de andere vakken werden doorgeroerd, doch zonder enig toevoegsel. Aan het einde van de proef werden de olie-verliezen bepaald, die door natuurlijke oorzaken waren veroorzaakt, om daarmede rekening te houden bij de bepaling van de afbraak, die door de toevoegsels volgens de uitvinding waren veroorzaakt.

15 In de andere vakken werd 0,½ 1 mikro-emulsie van een voe dingsstof gevoerd, die de volgende samenstelling in gew.$ had: ureum 17*0 zoet water 20,8 butylglycol 10,8 20 laurylfosfaat 21,1 oliezuur 30,3 2

Bij het begin van de proeven bevatte het zeewater 10 kiemen/ml. Na 7 d werd de hoeveelheid verdwenen olie in de vakken bepaald, en wel bij twee verschillende temperaturen:

^5 vergelijking voorb. XXIII vergelijking voorb.XXIV

12 °G 12 °C 18 °0 18 °C

vermindering door natuurlijke oorzaken (%) 5 5 17,5 · 17,5 vermindering door de behandeling vol- 30 gens de uitvinding (%) 0 58 0 6.1,3 totale vermindering (#) 5 63 17,5 78,8

Hieruit blijkt, dat zelfs bij een betrekkelijk lage temperatuur van 12 °C de biologische afbraak binnen 7 d door de behandeling volgens de uitvinding opmerkelijk was. Deze werd, in tegenstel-35 ling tot de bekende werkwijzen, zonder enige toevoeging van mikro-organismen verkregen, zodat alleen van de reeds in het zeewater aanwezige organismen gebruik werd gemaakt.

8104298 - 13 - * Voorbeeld XXV:

In een vat van 50 1 werd 30 1 zeewater gevoerd. Op het oppervlak ervan werd 30 ml ruwe olie van 34 °API verspreid, die 75 % verzadigde en 25 # aromatische koolwaterstoffen bevatte. Op de aldus 5 verkregen olielaag met een dikte van 0,5 mm werd 6 ml mikro-emulsie verspreid, die de volgende samenstelling had. (in gew·#)* ureum 17,3 water 21,5 butylether van ethyleenglycol 10,8 10 laurylfosfaat 23»7 oliezuur 26,7 (8,07 % stikstof) 100,0

De telling van de kiemen in de olie leverde 10 kiemen/ml op.

15 Vervolgens werd een aerobe kweek uitgevoerd, waarbij de in- houd van het vat met een met 400 min draaiende roerder werd geroerd, terwijl 120 l/h gesteriliseerde lucht werd ingeblazen* Deze beluchting kwam weer in hoofdzaak overeen met de natuurlijke beluchting van ...zeewater* 20 Na 48 h werd een nieuwe telling uitgevoerd, die de aanwe- g zigheid van 2,5,10 kiemen/ml aantoonde.

Na 7 d werd de afbraak van de olie vastgesteld door extractie van de overblijvende koolwaterstoffen met CCl^ en een infra-roodmeting, waarbij de afbraak 83 % bleek te bedragen.

25 Voorbeeld XXVI:

De proef van voorbeeld XXV werd herhaald, waarbij echter ia de mikro-emulsie een deel van het ureum werd vervangen door een aminozuur, en wel DL-valine. De samenstelling in gew.% van deze emulsie was als volgt: 30 ureum 16,8 DL-valine 2,0 water 20,5 butylether van ethyleenglycol 10,8 laurylfosfaat 23,7 35 oliezuur 26,2 100,0 (totale hoeveelheid stikstof 8,07 3») 8104298 - 14 - 2 9

Aan het begin werden 10 , en na ^8 h 10 kiemen geteld· Vanaf de zesde dag bedroeg de afbraak van de olie Sb

Vergelijking met voorbeeld XXV toont aan, dat door toevoeging van het aminozuur 10^ inplaats van 2,5*10^ kiemen na bS h kon-5 den worden bereikt. De afbraak was van vergelijkbare waarde (Sb % tegen 83 %), doch deze kon nu binnen 6 d inplaats van binnen 7 d worden bereikt.

Voorbeeld XXVII:

Op de wijze van de voorbeelden XXV en XXVI werd een mikro-10 emulsie gebruikt, waarin een deel van het ureum door een waterig aftreksel van maisstengels werd vervangen, dat een reeks aminozuren bevatte, en voornamelijk alanine, arginine, glutaminezuur en leucine. Andere in geringere hoeveelheden aanwezige aminozuren waren proline, isoleucine, threonine, valine, fenylalaline, methionine en cystine.

15 Het totale stikstofgehalte in het aftreksel bedroeg 1 #. De samenstelling van de raikro-emulsie was als volgt: ureum 12,*l· maisaftreksel 18,7 butylether van ethyleenglycol 19,2 20 laurylfosfaat 29,1 oliezuur 20,6

Het water van de waterige fase was dat van het aftreksel.

Het totale stikstofgehalte van de waterige fase bedroeg 6 %· 2 9

Uitgaande van 10 kiemen werden na bS h 4.107 geteld, ter-25 wijl de afbraakgraad van de olie na 6 d 88 # bedroeg. Uit vergelijking met voorbeeld XXV blijkt het belang van de toevoeging van aminozuren aan het ureum.

Voorbeelden XXVIII..XXXVII:

Bij deze proeven, die met die van voorbeeld XXVII overeen-50 kwamen, werd het laurylfosfaat vervangen door oleylfosfaat, en het oliezuur door verschillende vloeistoffen, die in het onderstaande zijn aangegeven, terwijl tevens de afbraakgraad na 6 d is vermeld.

8104296 - 15 -

Voorbeeld Gebruikte hydrofobe vloeistof Afbraak __ _;_ __________(o ......

XXVIII arachide-olie ’ 88 XXIX koolzaadolie 82 XXX talkolie 86 5 XXXI mengsel van vetzuren van copra met 10 Jé vaseline-olie 85 XXXII laurinezuur met 10 % ruwe olie 84 XXXIII butylcaproaat 85 XXXIV ethyllauraat 8? XXXV methyloleaat 86 10 XXXVI amylstearaat 88 XXXVII · gasolie met 10 # sesamolie 83

Overeenkomstige uitkomsten werden verkregen met een mengsel van mono-, di- en tri(alkyltetraglycolether)-o-fosfaten van al-kylen met 12..14 C-atomen, in de handel verkrijgbaar onder de naam 15 "Hostaphat KL 340 N“, inplaats van het oleylfoefaat.

# 8104298 . · -16- - ' - ,.- 1 Π 1 ti '

it II

μ vo I I in w r- in in j j c\j_ j j -=r; I- o^" in a: o w I I I 11 I o" I I I d i r— r— C\i <— *— II It

_II_ I I

" 111 I I 1 I I

ii ii

II vo II CM

O <\j vO 5 -M CO 00 II CM I I ^

r* « λ ·* « *· II ” I I

Ο iO cn vO CO I CO I I I I O I IIO I

--^ -:-H-H-- !! vo 3 !! vo cn CM CO in in 11 cm o i i on 'o

_ - -,- II «* - -II· Q

<n ifi o f" φ I I ί I I e- ο ο I ) o . . . r— r~ CM i~* r— _II_I I ____ ..... ..... II--.'- . "" -1' II' It ii m ii ^ II r~ vO I I O 00 CO cn CM^ cn “ OV j j μ o j ι -7 cn e-T pT I I in cm i ι ο" α ι d o --3.,.-, -—=——-H-vo u- i t in co 11 c*~ y-t cn cn σ ι zr σι 11 , η ο 11 in 4· « ·« « m » II *> » l I · a t>- 0 0 p- .=r 1 1 in iiit ο ο 11 cm T-t CM CM CM t-·_ It I I - ! ! cn crv ! ! C— Er • r- «- «- vo ·“ I I CM Ο I I ΖΓ °1· ....... - 11 - -11--7 vo 0 0 cm *~ ι ι vo ι 11 ι ο ο ii a ” cm cm on »—_ «— 11 _ 1 j II CV I I c_

ι ι m cn 11 O

on on vo p- *- 11 cm οι ι ·=γ Q..

in ω" co’ vo* a* . 1 1 vo“ 1 1 1 1 o' o' 1 1 d ‘ W

1— '— m ,— r— II i I “ _————————— -ri-1 1 11 in on 1 1 11 CM, II fl· 1Λ =r -=r -=r co ι ι p. t- ο ι ι 3· ·νο I I - - - I I t .=r -=r co cn I on 1 1 1 1 vo 0 0 1 1 0 cm r~ i— on CM j j j _ ►q---—1—— 11 ι 1 m μ in 11 zl 1 1 =r c- cn 11 zr 0- ffl on 00 co CO VO I I r* Ο I I if Ό yj* * * * » ii - - -ti : - , , m m vo a m 1 1 1 1 1 vo 0 0 11 r- ^

e~l r r (fl r (Μ I I II

__ _—W-H-

II t I

11 c— -=r 1 1 1 1 in 1- vo 1 1 vo p- p- c~- 11 3· 1- 0 1 1 s· ον . 1 1 — — — ι ι : —

r-r-voaio I I I I in ο O I I Q CM

r- »- 3Γ cn 11 1 1 «- . —--——-H--H------

I I p— 3Γ I I

II r in II 3 r-T-zr m ι i cn r <" ι ι λ m r- - ~ - - I I - - . I I ί , zt . τ- r* zr 0 m ι t ι ι ι m ο ο ι ι 0 ^ - - * m ! i II *“ .

—---H-H—1- ·

- I I II

• I-! II

II I I

Η II I I PI

s i! 1? !! < · >? . II .rf 60 I I 03 rl _ J. II τ3 C I ι · S’- 'S' 0 ‘j g 3 !i^ & 3 ^ £ >· § 0 llw „ % 3 g S til! > £ il ««

s n 4-11 y t ui N

S : 5 0 ch ί I ιθ ,,-p «J ·Ρ ^ 'nil S +s [ } §) $ 8 1$ 8 3 g s jg 11 j2 14 ιμ «5 <D td O (u d 5 ,4 l ‘ <D 03 CH H CH § [ j q , _ij J j φ fl) ι ij -p 0 03 t*» co H J j jj r_, in ! ! +5 d ο) H ch o Vi H +> h { H cn

!4 S fc3 H r“* cl ·*? S ! ·Η <Q- O ! ! «Ί O

3 3 <D >> H ti g 5 jx! <H P O

ω .rj 4» 3. ® ·$ I 03 .rl ω · id 03 cd f-i H 0 cd H “ 3 +5 0 1 45 ·Η 8 1 0 4 2 9 o g' ° w^QO ι {^s. co 1¾ {f co >

Claims (9)

1. Werkwijze voor het kweken van mikro-organismen in een hydrofoob midden onder toepassing vein voedingsstoffen in een waterige oplossing, met het kenmerk, dat de oplossing wordt gemikro-emulgeerd.in een niet met water mengbare vloeistof, die mengbaar is 5 met het hydrofobe midden, en dat de aldus verkregen mikro-emulsie in dit midden wordt ingevoerd, dat kiemen van de te kweken mikro-organismen bevat· 2* Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de voedingsoplossing in water oplosbare stikstof- en fosforverbindingen bevat, met het 10 kenmerk, dat voor de niet met water mengbare vloeistof een met olie mengbare vloeistof wordt gekozen, die door de desbetreffende mikro-organismen opneembare koolstofverbindingen bevat.

3· Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de waterige oplossing, die de inwendige fase van de mikro-emulsie 13 vormt, twee scheikundig van elkaar verschillende stikstofverbindingen bevat, die door de mikro-organismen kunnen worden opgenomen. k. Werkwijze volgens een van de conclusies 1**3» met het kenmerk, dat de waterige oplossing, die de inwendige fase van de mikro-emulsie vormt, ureum en een alkyl- of alkenylfosfaat bevat, 20 terwijl de uitwendige fase door een of meer esters, zuren en/of alko-holen wordt gevormd.

3· Werkwijze volgens een van de conclusies 1··^, met het kenmerk, dat de waterige oplossing, die de inwendige fase van de mikro-emulsie vormt, 11..150 gew.delen ureum op 100 delen water bevat. 25 6. Werkwijze volgens conclusie A· of 5» met het kenmerk, dat de waterige ureumoplossing een of meer aminozuren bevat.

7· Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de hoeveelheid aminozuur 1..10 gew*.delen op 99-«90 delen ureum is.

8. Werkwijze volgens een van de conclusies 1..7, met het 30 kenmerk, dat het hydrofobe midden wordt gevormd door koolwaterstoffen, die een water- of bodemoppervlak bedekken, terwijl de gekweekte mikro-organismen in staat zijn deze koolwaterstoffen af te breken.

9- Werkwijze volgens een van de conclusies 1..8, met het kenmerk, dat de mikro-emulsie bestaat uit 10..30 ,gew.2» water, 35 k·.10 gew.% stikstof, opneembaar in de vorm van stikstofverbindingen, 5..35 % alkyl- of alkenylfosfaat met 10*.18 C-atomen, of een geêthoxy-leerd alkylfenolfosfaat, 0..20 gew.# alkylether van alkyleenglycol, 8104298 « - 18 - en 20. .50 gew. # ester, zuur en/of alkohol. .¾ *

10. Vloeibare voedingsstof, bestemd om aan een hydrofoob midden te worden toegevoegd voor bet daarin kweken van mikro-organismen, met bet kenmerk, dat deze bestaat uit een mikro-emulsie, waarvan de 5 inwendige fase wordt gevormd door een waterige oplossing, die opneembare stikstof- en fosforverbindingen bevat, terwijl de uitwendige fase een organische met olie mengbare en met water onmengbare vloeistof is.

11. Voedingsstof volgens conclusie 10, bestemd voor bet af- 10 breken van koolwaterstoffen door mikro-organismen 1 met bet kenmerk, dat de waterige oplossing, die de inwendige fase van de mikro-emulsie vormt, ureum en een oppervlaksactieve fosförverbinding bevat, terwijl de organische vloeistof van de uitwendige fase een vetzuur-ester, een vetzuur en/of een alkohol, dan wel een mengsel daarvan met 15 vloeibare koolwaterstoffen is.

12. Voedingsstof volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de mikro-emulsie bestaat uit 10·.30 gew.% water, k·.10 gew.% opneembare stikstof, waarvan 50·*99 # in de vorm van ureum en 50..1# in de vorm van aminozuur is, 5··35 gew.% alkyl- of alkenylfosfaat 20_jnet 10..18 C-atomen of een geëthoxyleerd alkylfenolfosfaat, 0..20 gew.% alkylether van alkyleenglycol, en 20..50 gew.% van een vette stof, al dan niet gemengd met vloeibare koolwaterstoffen. 8104298