DK147942B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af kanamycin a- eller kanamycin b-derivater eller syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

147942

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte kanamycin A- eller kanamycin B-derivater med form- len I (se kravet), hvori R betegner en primær eller sekundær alkyl-gruppe med 3-7 carbonatomer, af hvilke i det mindste to, der er forskellige fra det carbonatom, som er knyttet til aminogruppen, bærer 2 g hydroxyIgrupper, R betegner en amino- eller hydroxylgruppe, R be- 7 tegner en 3-amino-3-deoxy-a-D-glucopyranosylgruppe og R betegner et hydrogenatom eller en -C4-alkylgruppe, eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

i 2 U7962

Disse forbindelser har antibakterielle egenskaber.

Det er kendt at beslægtede forbindelser, hvori den til R svarende gruppe betegner en alkansyrerest eller alkylgruppe substitueret med en aminogruppe og med en enkelt hydroxylgruppe har anti-microbielle egenskaber, se f. eks. dansk patentansøgning nr.

4811/75 og J. Antibiotics, 1974, 27, p. 851-858.

I forhold til disse kendte forbindelser udmærker forbindelserne med formlen I sig imidlertid ved at have særlig lav toxici-tet og samtidig besidde en meget bredspektret aktivitet mod bakterier, som ellers udviser resistens mod antibiotica af den pågældende type.

Den væsentligste ulempe, der knytter sig til aminoglycosid-terapi er generelt risikoen for beskadigelse af høreevnen samt beskadigelse af nyrerne, hvis stoffernes koncentration i blodet øges væsentligt over den terapeutiske dosis. Derfor er en formindskelse af et aminoglycosids potentielle toxicitet af stor betydning. Den pågældende toxicitet kan vurderes efter en prøve i det væsentlige som beskrevet af Kunin i Journal of Infectious Diseases 121, p 55 (1970). Denne prøve er baseret på bestemmelse af den procentvise hæmning af den antibakterielle virkning, som forårsages ved tilstedeværelse af nyrevæv. Det har vist sig, at jo mere toxisk et amino-glycosidantibiotikum er, jo kraftigere bindes det til nyrevæv og jo større er derfor den procentvise hæmning af antibakteriel virkning. Ved denne prøve er en række forbindelser, der fremstilles efter fremgangsmåden ifølge opfindelsen, blevet sammenlignet med kendte aminoglycosidantibiotika, hvorved blev opnået følgende resultater: 3 147942

Resultater: ** ^

Prøveforbindelsér Procentvis hæmning ,af antibakteriél virkning ribostamycin 55 streptomycin 57 kanamycin A 58 butirosin 58 amikacin 61 butakacin 67 kanamycin B 69 tobramycin '73 netilmycin 76' 3',4'-dideoxykanamycin B 77 gentamicin 81 neomycin 83 'Forbindelse ifl.eks.1 ' 38 ' " " ' 2 33 ...... 3 32.

" " · 4 34 II II II ς 37 •I II II n 48 17 52 .. .. ·· 18 42 η i. ·· i9 46

Amikacin: 1 —N—[(S)-4-amino-2-hydroxybutyryl]kanamycin A

Butakacin: 1-N-[(S)S-4-amino-2-hydroxybutyl]kanamycin A

Netilmycin: 1-N-ethyl-sisomycin 4 147942

Som det vil ses udviser de afprøvede forbindelser, fremstillet' efter fremgangsmåden ifølge opfindelsen, en væsentlig mindre procentvis hæmning af antibakteriel virkning.Det bemærkes i denne forbindelse/ at de for de kendte forbindelser bestemte procentvise hæmninger viser god overensstemmelse med den relative toxicitet af disse forbindelser, som den er erfaret ved klinisk brug.

Det vil ses/ at forbindelserne fremstillet efter fremgangsmåden ifølge opfindelsen viser lavere hæmningsværdier end butakacin, der er den bedste af forbindelserne der kendes fra ovennævnte danske patentansøgning 4811/75, og de er også overlegne i forhold til amikacin, som kendes fra ovennævnte artikel i Journal of Antibiotics.

Endvidere foretages in vitro vurdering af forbindelsernes an-tibakterielle virkning ved at bestemme den minimale hæmningskoncentration (M.I.C.) for forbindelserne i et egnet medium, ved hvilken væksten af den specielle mikroorganisme ikke finder sted. I praksis inoculeres agarplader i hver af hvilke der er inkorporeret en prøveforbindelse i en bestemt koncentration, med et standard antal celler af mikroorganismen, og hver plade inkuberes derpå i 24 timer ved 37°C.

Pladerne iagttages derpå for tilstedeværelse eller fravær af bakterievækst, og den tilsvarende M.I.C.-værdi konstateres. Mikroorganismerne, som er anvendt ved sådanne forsøg, har omfattet stammer af Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Streptococcus faecalis.

Resultaterne fremgår af nedenstående tabel: 5 147942

TABEL

In vitro aktivitet _ ' ' ' Μ .I .C.' yg/mi ' __

Eksempel E. Coli Klebsiella Proteus Pseudomonas Staphylo- nr. pneumoniae mirabilis aeruginosa coccus ............aureus 1 6,:2 6/2 25 6,2 6,2' 2 12/5 6/2 12,5 6,2 6,2 3 12,5 12,5 12,5 6,2 6,2 4 12,5 12,5 25 12, 5 12,5 5 12,5 12,5 25 12,5 12,5 6 25 25 50 25 25 7 12,5 12,5 25 12,5 6,2 8 50 25 100 25 25 9 25 12,5 25 12,5 25 10 . 25 25 100 25 - 25 11 6,2 3,1 6,2 3,1 1,6 12 3,1 3,1 6,2 1,6 1,6 13 3,1 3,1 12,5 3,1 1,6 14 3,1 3,1 6,2 3,1 1,6 15 6,2 6,2 100 6,2 6,2 16 6,2 3,1 12,5 3,1 3,1 17 6,2 6,2 12,5 6,2 3,1 18 6,2 6,2 25 3,1 6,2 19 3,1 1,6 6,2 1,6 1,6 6 147942

In vivo vurdering er udført ved administrering af forbindelserne subcutant til mus, som udsættes for en stamme af Escherichia coli.

Hver forbindelse administreres i en serie med forskellige dosisniveauer til grupper af mus, og forbindelsens aktivitet bestemmes som det niveau, ved hvilke.t der opnås 50%'s beskyttelse mod den letale virkning af Escherichia coli organismen over et tidsrum på 72 timer.

Farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af de pågældende forbindelser er sådanne, som dannes ud fra syrer som danner ikke toxiske syreadditionssalte indeholdende farmaceutisk acceptable anioner, såsom hydrochlorid, hydrobromid, sulfat eller bisulfat, phosphat eller surt phosphat, acetat, maleat, fumarat, succinat, lactat, tartrat, citrat, gluconat, saccharat, p-toluensulfonat og carbonat. *

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at en 2 6 7 forbindelse med formlen II (se kravet), hvori R , R og R har den ovenfor anførte betydning, og hvori en eller flere af de fri amino-grupper, bortset fra 1-aminogruppen, eventuelt kan være beskyttet, alkyleres ved reduktiv alkylering med et tilsvarende hydroxy-substi-tueret aldehyd eller en tilsvarende hydroxy-substitueret keton, og de aminobeskyttende grupper fjernes, såfremt de har været til stede, og forbindelsen med formlen I isoleres, om Ønsket i form af et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt.

Den eventuelle beskyttelse af frie aminogrupper i forbindelsen med formlen II kan opnås ved omsætning med et reagens som er selektivt med hensyn til frie aminogrupper og som let senere kan fjernes derfra ved sædvanlig teknik, f.eks. ved hydrolyse eller hydrogeno-lyse. Eksempler på egnede beskyttende grupper er formyl-, acetyl-, trifluoracetyl-, methoxycarbony1-, t.butyloxycarbony1- og benzyloxy-carbonyIgruppen.

I tilfælde af at der er frie aminogrupper til stede foruden 1-amino-gruppen, vil der selvsagt også finde reaktion sted ved disse, og det vil derfor være nødvendigt at adskille det ønskede 1-N-sub-stituerede derivat fra blandingen af produktet, som opnås.

7 147942

Dette kan ske ved sædvanlig teknik, f .eks. ved ionbytnings-chrcmatografi. Det er imidlertid ønskeligt at beskytte nogle eller fortrinsvis alle aminogrupperne bortset fra 1-aminogruppen under alkyleringsreaktionen for at forenkle den afsluttende isolering af det ønskede produkt. I dette tilfælde vil det være nødvendigt at fjerne de beskyttende grupper som et ekstra trin ved fremgangsmåden.

Ved en udførelsesform for fremgang anåden til fremstilling af forbindelser med formlen I omsættes således et selektivt beskyttet aminoglycosidderivat med formlen II, hvilket derivat har en fri 1-aminogruppe, med aldehydet eller ketonen, hvilken sidstnævnte fortrinsvis anvendes i overskud, og den Schiff-base, som først dannes ved reaktionen reduceres samtidigt eller på trinvis måde til opnåelse af det 1-N-substituerede produkt. Reduktionen kan passende foretages under anvendelse af natriumborhydrid eller natriumcyanobor-hydrid som reduktionsmiddel, og udføres bekvemt ved tilsætning af sidstnævnte til reaktionsblandingen ved en pH-værdi saadvanligvis mellem 4 og 7, hvilket muliggør, at reaktionen kan udføres effektivt i et enkelt trin. Alternativt kan blandingen af aminoglycosidet (II) og aldehydet eller ketonen underkastes en konventionel katalytisk hydrogenering.

Reaktionen kan passende udføres med reaktanterne opløst i et for reaktionen indifferent opløsningsmiddel, f.eks. vand eller vandig dioxan eller vandig methanol ved én temperatur mellem 0°C og opløsningsmidlets tilbagesvalingstemperatur. Den tid der kræves til praktisk taget afslutning af reaktionen afhænger selvsagt af reaktanternes natur, af opløsningsmidlet og af den anvendte temperatur, men det har vist sig, at reaktionen mellem aminoglycosidet med formlen II og hydroxysubstitueret aldehyd eller keton (f.eks. glyceraldehyd eller dihydroxyacetone) under tilstedeværelse af et overskud af natriumcyanoborhydrid ved en pH-værdi me 11 on 4 og 7 saadvanligvis er helt afsluttet inden to døgn, når den udføres i vandig methanol ved en temperatur på 60°C.

Som et andet trin ved fremstillingen er det nødvendigt at fjerne eventuelt tilstedeværende beskyttende grupper for aminogrupperne i aminoglycosidmolekylet. Der er forskellige betingelser som kræves til fuldstændig fjernelse af de aminobeskyttende grupper, afhængigt af naturen af den beskyttende gruppe som er anvendt og af den beskyttede amins omgivelser. Det anvendte medium kan vaare vandfrit eller vandigt,og i specielle tilfælde kan det vaare surt eller 8 147942 basisk i varierende udstrækning. En særligt foretrukket beskyttende gruppe for forbindelserne med formlen II er formylgruppen. Denne kan let fjernes ved mild basisk hydrolyse, f.eks. ved behandling med fortyndet natriumhydroxid ved stuetemperatur i adskilllige timer eller ved opvarmning med hydrazinacetat eller ved mild sur hydrolyse, f.eks. med 5 N saltsyre ved stuetemperatur i adskillige timer. Også egnet er t-butyloxycarbonylgruppen som kan fjernes under svire betingelser, f.eks. ved behandling med vandfri trifluoreddikesyre ved stuetemperatur i op til 45 minutter, benzyloxycarbonylgruppen som kan fjernes ved katalytisk hydrogenolyse, f.eks. ved hydrogenering i vandig eddikesyreopløsning under tilstedeværelse af en palla-dium-på-trækul-katalysator ved 30°C og et tryk på 50 psi i adskillige timer, og acetylgruppen som fjernes ved opvarmning med 3 N natriumhydroxid til 80-90°C i adskillige timer. Efter fjernelse af de beskyttende grupper oparbejdes produktet på sædvanlig måde, f.eks. ved filtrering og afdampning af opløsningsmidlet, og det rå produkt kan derpå renses ved krystallisation eller ved chromatogra-f i.

Et særligt foretrukket beskyttet aminoglycosidderivat med formlen II til anvendelse ved fremstilling af kanamycin A derivater 7 2 (med formlen I, hvori R betegner hydrogen, R betegner hydroxyl) er 3,3",6'-tri-N-formyl-kanamycin A. Det tilsvarende 2',3,3",6'- tetra-N-formyl-kanamycin B derivat foretrækkes til fremstilling af 2 1-N-substituerede kanamycin B derivater (med formlen I, hvori R betegner amino). Ligeledes egnede er de selektivt beskyttede kanamycin A og B derivater, som er beskrevet i britisk patentskrift nr. 1530201, f.eks. 3",6'-di-N-acetyl-kanamycin A og 2,,3",6'-tri-N-trifluoracetyl-kanamycin B.

Aminoglycosiderne eller de beskyttede aminoglycosidderivater med formlen II er kendte forbindelser som tidligere er beskrevet i litteraturen. F.eks. er aminoglycosider, som er N-formylerede ved alle aminogrupper bortset fra 1-aminogruppen, hvilke forbindelser omfatter 3,3",6'-tri-N-formyl-kanamycin A og 2',3,3"-6'-tetra-N-for-myl-kanamycin B,beskrevet i belgisk patentbeskrivelse nr. 817546. Lignende derivater af andre aminoglycosider kan fremstilles på analog måde. Derivater i hvilke 6'-aminogruppen er beskyttet er velkendte og deres^fremstilling er f.eks. beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.401.220 og i tysk patentskrift nr. 2.311.524,, 2.350.169 og 2.512.587.

9 147942

Hydroxysubstituerede aldehyder og ketoner som er egnet til anvendelse ved fremgangsmåden til fremstilling af forbindelserne med formlen I er let tilgængelige.

F.eks. giver D-glyceraldehyd, når det anvendes ved fremgangsmåden, et produkt,! hvilket R^ betegner (S)2,3-dihydroxypropyl.

Andre let tilgængelige aldoser og deoxyaldoser kan også anvendes til reaktionen f.eks. D-erythrose, D-ribose og 2-deoxy-D-ribose. Tilsvarende kan dihydroxyacetone anvendes til opnåelse af 1-N-(1,3-dihydroxy-2-propyl)-derivatet·

Til human anvendelse kan de antibakterielle forbindelser administreres alene, men de vil sædvanligvis administreres opblandet med en farmaceutisk bærer udvalgt under hensyntagen til den påtænkte administreringsvej og sædvanlig farmaceutisk praksis.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere ved hjælp af nedenstående eksempler. Temperaturen er anført i °C. "Amber-lite" og "Sephadex" er registrerede varemærker. Tyndtlagschromato-grafi blev udført på silicaplader under anvendelse af det angivne opløsningsmiddelsystem. Pletterne blev gjort synlige efter tørring af pladerne ved påsprøjtning af en 5%'s opløsning af t-butylhypo-chlorit i cyclohexan, tørring af pladerne ved 100°C i 10 minutter i ventileret ovn og afkøling og sprøjtning med stivelse-kaliumiodid-opløsning.

Eksempel 1 l-N-[(S)-2,3-Dihydroxypropyl]kanamycin A.

100 mg, 0,18 mmol 3,3 ",6'-tri-N-formyl-kanamycin A, 31,6 mg 0,35 mmol, D-glyceraldehyd og 33 mg, 0,652 mmol, natriumcyanobor-hydrid blev opløst i vandig methanol (10ml methanol, 2 ml vand) og opløsningens pH-værdi indstillet til 6,0 med 5 N saltsyre. Opløsningen blev holdt ved stuetemperatur i 40 timer. Opløsningsmidlet blev derpå afdampet under reduceret tryk, og remansen behandlet med 1 N natriumhydroxid og henstillet ved stuetemperatur i yderligere 20 timer. Efter koncentrering under reduceret tryk blev remanensen chramatograferet på en søjle af "Amberlite" CG-50 ionbytter-harpiks i NH^+ form. Elueringen blev foretaget med en ammonium-hydroxidgradient med koncentration stigende fra 0 til 0,1 N, til opnåelse af 66 mg, 67%, lvJH- [ (S)-2,3-dihydroxypropyl]kanamycin A.

Rf 0,27 i 1 M vandig natriumchlorid (kanamycin A gav en Rf-værdi 10 147942 på 0,21), Rf 0,70 i methanol/ 0,880 ammoniumhydroxid 1:2 (kanamycin A, 0,70).

Analyse:

Fundet: C 40,1? H 7,0; N 8,3? C21H4 2N4°13'2H2C03 svarer til C 40,5; H 6,08 og N 8,2%.

En prøve blev omdannet til det flygtige tetra-N-acetyl-nona- 0- trimethylsilylderivat ved behandling med eddikesyreanhydrid i methanol ved stuetemperatur i 24 timer efterfulgt af omsætning med en 2:1 blanding af hexamethyldisilazan og trimethylchlorsilan ved stuetemperatur i 24 timer, m/e fundet 1285. C5gH]_22N4°17S;’'9 minus en C^HgOSi-gruppe svarer til m/e 1285.

Eksempel 2 1- N-[(S)(R)2,3,4-Trihydroxybutyl]kanamycin A.

En opløsning af 100 mg, 0,18 mmol, 3,3",6'-tri-N-formyl-kana-mycin A, 107 mg, 0,90 mmol, D-erythrose og 66 mg, 1,04 mmol, natrium-cyanoborhydrid i en blanding af 10 ml methanol og 2 ml vand ved pH 6,0 blev opvarmet til 60° i 50 timer. Opløsningen blev koncentreret under reduceret tryk. Remanensen blev opløst i 12 ml 10% hydrazinhydrat, opløsningens pH-værdi indstillet til 6,0 med iseddikesyre og opløsningen derpå opvarmet under tilbagesvaling i 6 timer. Opløsningsmidlet blev afdampet under reduceret tryk, og remanensen chromatograferet på "Amberlite" CG-50 som beskrevet i eksempel 1, efterfulgt af chromatografi af hovedfraktionen indeholdende produktet på "Sephadex" CM 25 (NH^+ form), eluering med en gradient af ammoniumhydroxid som før til opnåelse af 1-N~[(S)(R)- 2,3,4-trihydroxybutyl]kanamycin A (37 mg, 36%). Rf 0,29 i methanol, 0,880 ammoniumhydroxid 2:1 (kanamycin A: 0,32).

Analyse:

Furriet: C 41,6; H 6,6; N 7,9 C22H44^4014f2H2C°3 svarer c 40*5? H 6,8; N 7,9%.

Eksempel 3 1-N-[(S)(S)(R)2,3,4,5-TetrahydroxypentylIkanamycin blev fremstillet under anvendelse af den i eksempel 2 anførte fremgangsmåde, men med 2-ribose som udgangsmateriale. Rf 0,68 i methanol, 0,880 ammoniumhydroxid 1:2 (kanamycin A: 0,70).

11 147942

Eksempel 4 1-N-[(S)(R)3,4,5-Trihydroxypentyl]kanamycin A blev fremstillet under anvendelse af den i eksempel 2 anførte fremgangsmåde, men med 2-deoxy-D-ribose. Rf 0,68 i methanol, 0,880 ammoniumhydroxid 1:2 (kanamycin A: 0,70).

Eksempel 5 1-N-[(S)(R)(R)(R)2,3,4,5-Pentahydroxyhexyl]kanamycin A blev fremstillet under anvendelse af den i eksempel 2 anførte fremgangsmåde, men med D-glucose. Rf 0,55 i methanol, 0,880 ammoniumhydroxid 1:2 (kanamycin A: 0,71).

Eksempel 6 1-N-[(R)(S)(R)2,3,4,5—Tetrahydroxypentyl]kanamycin A blev fremstillet under anvendelse af den i eksempel 2 anførte fremgangsmåde, men med D-arabinose. RF 0,34 i methanol, 0,880 ammoniumhydroxid 1:1 (kanamycin A: 0,49).

Eksempel 7 1-N-[(S)(R)(R)2,3,4,5-Tetrahydroxypentyl]kanamycin A.

En opløsning af 100 mg, 0,18 mmol,3,3",6'-tri-N-formyl- kanamycin A, 79 mg, 0,53 mmol, D-xylose og 44 mg, 0,68 mmol;natrium- cyanoborhydrid i 10 ml vand ved pH 4,6 blev opvarmet til 90° i 3 1/2 time. Opløsningsmidlet blev afdampet under reduceret tryk o og remansen opløst i 10 ml 5 N saltsyre og omrørt ved 30 i 16 timer. Opløsningsmidlet blev afdampet og remansen chromatograferet på en søjle af "Amberlite" CG-50 ionbytterharpiks (NH4+-form) under eluering med en gradient af ammoniumhydroxid med stigende koncentration fra 0 til 0,2 N til opnåelse af 1-N-[(S)(R)(R)2,3,4,5-tetra-hydroxypentyl]kanamycin A (56 mg, 51%). Rf 0,58 i methanol, 0,880 ammoniumhydroxid 1:2 (kanamycin A gav en Rf-værdi på 0,66).

Eksempel 8 1-N-[(R)(S)(S)2,3,4,5-Tetrahydroxypentyl]kanamycin A blev fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 7 men med L-xylose som udgangsmateriale. Rf 0,34 i methanol, 0,88 ammoniumhydroxid 1:1 (kanamycin A: 0,50).

147942 12

Eksempel 9 1-N-[(R)(R)(S)2,3,4,5-Tetrahydroxypentyl]kanamycin A blev fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 7 men med anvendelse af L-ribose som udgangsmateriale. Rf 0,38 i methanol, 0,88 ammoniumhydroxid 1;1 (kanamycin A: 0,51). m/e (felt-desorption) M + 1:619.

Eksempel 10 1-N-[(R)(R)(R)2,3,4,5-Tetrahydroxypentyl)kanamycin A blev fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 7 men med anvendelse af D-xylose som udgangsmateriale. Rf 0,37 i methanol, 0,880 ammoniumhydroxid 1:1 (kanamycin A: 0,48) .

Eksempel 11 1-N-[(S)2,3-Dihydroxypropyl]kanamycin B.

En opløsning af 45 mg, 0,5 mmol, D-glyceraldehyd i 1 ml methanol blev sat til en opløsning af 100 mg, 0,17 mmol, 2',3,3",6'-tetra-N-formyl-kanamycin B i 5 ml methanol og 1 mill vand.

20 mg, 0,3 mmol natriumcyanoborhydrid blev sat til den omrørte opløsning, pH-værdien indstillet til 6,0 med 5 N saltsyre/ og opløsningen omrørt ved stuetemperatur natten over. Opløsningen blev inddampet til tørhed under reduceret tryk, og remanensen optaget i 5 N saltsyre, hvorpå opløsningen blev henstillet natten over ved stuetemperatur. Opløsningens pH-værdi blev indstillet til 6,0 med natriumhydroxidopløsning, og opløsningen chrcmatograferet på "Amberlite" CG-50 som beskrevet i eksempel 1. Frysetørring af de relevante fraktioner gav 53 mg, 56%, 1-N-[(S)2,3-dihydroxypropyl]-kanamycin B. Rf 0,51 i 3 M vandig natriumchloridopløsning (kanamycin B: 0,42), Rf 0,54 i methanol, 0,880 ammoniumhydroxid 1:1 (kanamycin B: 0,58). Feltdesorptionsma&sespektrometri udviste en ler af tig M + 1 spids ved m/e 558. C2iH43N5°i2 svarer til M + 1 = 558.

Eksempel 12 1-N-[ (S)(R)2,3,4-Trihydroxybutyl] kanamycin B blev fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 11,men med D-erythrose som udgangsmateriale. Rf 0,60 i 3 M natriumchloridopløsning (kanamycin B: 0,45).

i 13 147942

Eksempel 13 1-N-t(S)(S)(R)2,3,4,5-Tetrahydroxypentyl]kanamycin B blev fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 11, men med D-ribose. Rf 0,3 i 2 M natriumchloridopløsning (kanamycin B: 0,2).

Eksempel 14 1-N-[(S)(R)3,4,5-Trihydroxypentyl]kanamycin B· blev fremstilet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 11, men med 2-deoxy-D-ribose. Rf 0,3 i 2 M natriumchloridopløsning (kanamycin B: 0,2) .

Eksempel 15 1-N-[(S)(R)(R)(R)2,3,4,5-Pentahydroxyhexyl]kanamycin B blev fremstillet under anvendelse af fremgangsmådæ ifølge eksempel 11, men med D-glucose. Rf 0,25 i methanol, 0,880 ammoniumhydroxid 1:1 (kanamycin B: 0,42).

Eksempel 16 l-N-(2,3-Dihydroxy-2-hydroxymethylpropyl)kanamycin B blev fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge ékssnpel 11, men med DL-2-hydroxymethyl-2,3-0-isopropyliden-glyceraldehyd. Rf 0,55 i 3 M natriumchloridopløsning (kanamycin B: 0,42). m/e (felt- desorption) M + 1 fundet 588. C22H45N5°13 svarer til M + 1 = 588.

Eksempel 17 1-N-[(R)2,3-Dihydroxypropyl]kanamycin B blev fremstillet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 11, men med L-glyceraldéhyd som udgangsmateriale. Tyndtlagschromatografi viste identitet med produktet fra eksempel 11.

Eksempel 18 1-N-[l,3-Dihydroxy-2-propyl]kanamycin A.

200 mg, 0,36 mmol, 3,3",6'-tri-N-formyl-kanamycin A, 95 mg, 1,05 mmol, dihydroxyacetone og 88 mg, 1,40 mmol, natriumcyanobor-hydrid blev opløst i 20 ml methanol og 4 ml vand, og pH-værdien af opløsningen blev indstillet til 6,6 med 5 N saltsyre. Opløsningen blev opvarmet under tilbagesvaling i 22 timer. Yderligere 95 mg dihydroxyacetone og 88 mg natriumcyanoborhydrid blev tilsat, og pH- 14 147942 værdien indstillet til 5,5. Tilbagesvalingen blev fortsat i yderligere 24 timer, og opløsningsmidlet derpå afdampet under reduceret tryk, hvorefter remanensen blev behandlet med 10% hydrazinhydrat/ed-dikesyre ved pH 6,0 (20 ml) og opvarmet under tilbagesvaling i 6 timer. Efter koncentration under reduceret tryk blev remanensen chrcmatograferet på en søjle af "Amberlite" CG-50 ionbytterharpiks (NH^+-form) under eluering med en gradient af ammoniumhydroxid med øgende koncentration fra 0 til 0,1 N. Fraktioner indeholdende produktet (bestemt ved tyndtlagschrcmatografi) blev forenet og inddampet, og produktet genchromatograferet på "Sephadex" CM25 (ammonium-ionform), idet der blev elueret som før til opnåelse af 0,11 g, 57%, 1-N-[l,3-dihydroxy-2-propyl]kanamycin A. Rf 0,40 i methanol, 0,880 ammoniumhydroxid 2:1 (kanamycin A: 0,30).

Analyse:

Fundet: C 40,6; H 6,5; N 8,4 C21H42N4°13'2H2C03 tiJL C 40,5; H 6,8; N 8,2%.

Eksempel 19 1- N-[1,3-Dihydroxy-2-propy1]kanamycin B.

88 mg, 1,40 mmol, natriumcyanoborhydrid blev sat til en opløsning af 200 mg, 0,33 mmol, 21,3,3",6'-tetra-N-formyl-kanamycin B og 95 mg, 1,05 mmol dihydroxyacetone i 12 ml methanol og 3 ml vand. Opløsningens pH-værdi blev indstillet til 4,5 med 2 N saltsyre,og opløsningen blev opvarmet under tilbagesvaling i 20 timer. Opløsningsmidlet blev afdampet under reduceret tryk, og remanensen optaget i 10 ml vand. 2 ml 60%'s hydrazinhydrat blev tilsat, pH-vaer-dien indstillet til 6 med 2 ml iseddikesyre, og opløsningen opvarmet under tilbagesvaling til 6 timer og derpå inddampet under reduceret tryk til en gummiagtig masse. Produktet blev opløst i 8 ml vand, pH-værdien indstillet til 5,5 med 0,2 N saltsyre, og opløsningen chrcmatograferet på en kolonne af "Amberlite" CG-50 ionbytterharpiks i ammoniumionform, idet der først blev elueret med vand og derpå med en gradient af ammoniumhydroxid med øgende koncentration til 0,25 N. Fraktioner indeholdende produktet (bestemt ved tyndtlagschrcmatograf i) blev forenet og inddampet, og produktet genchromatograferet på en kolonne af "Sephadex" CM25 (ammdniumform),idet der blev elueret som før til opnåelse af 59 mg, 32%, l-N-[l,3-dihydroxy- 2- propy1] kanamycin B. Rf 0,55 i methanol, 0,880 ammoniumhydroxid (1:1) (kanamycin B: 0,47), Rf 0,37 i 2 H natriumchlorid (kanamycin B: 0,26).

15 147942

Analyse:

Fundet: C 37,6* H 6,3* N 9,2 C21H43N5°12'til C 37,8; H 6,8; N 9,2%.

Eksempel 20 1-N-(1,3-Dihydroxy-2-propyl)kanamycin A.

500 mg, 0,88 mmol, 6',3"-di-N-acetyl-kanamycin A, 237 mg, 2,64 mmol, 1,3-dihydroxyacetone og 181 mg, 2,64 mmol, natriumcyano-borhydrid blev opløst i 45 ml methanol og 5 ml vand, og pH-værdien af opløsningen indstillet til 6,0 med 2 N saltsyre. Opløsningen blev henstillet i stuetemperatur i 3 døgn. Tyndtlagschromatografi (methanol, chloroform, 1-N-ammoniumhyåroxid 4:2:1) viste to hovedkomponenter med Rf-værdi henholdsvis 0,17 og 0,22. Opløsningen blev inddampet og produkterne adskilt ved ionbytningschrcmatografi på "Sephadex" CM25 i ammoniumionform, idet elueringen skete med en gradient af ammoniumhydroxid med Øgende koncentration. Den langsommere løbende komponent (Rf O,17),som var den anden komponent som blev elueret fra kolonnen blev befriet for beskyttelsesgrupper ved opvarmning i 3 N natriumhydroxidopløsning til 80-90°C i 4 timer. Neutralisation og rensning ved ionbytningschrcmatografi på "Amber-lite" CG-50 (ammoniumionform) med eluering som før gav 1-N-(1,3~ dihydroxy-2-propyl)kanamycin A identisk med produktet fra eksempel 18.