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DE93619T1 - Plasminogenaktivator fuer menschliches gewebe, diesen aktivator enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen, verfahren zur herstellung des aktivators sowie dna und transformierte zellzwischenprodukte hierfuer. - Google Patents

Plasminogenaktivator fuer menschliches gewebe, diesen aktivator enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen, verfahren zur herstellung des aktivators sowie dna und transformierte zellzwischenprodukte hierfuer.

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DE93619T1
DE93619T1 DE198383302501T DE83302501T DE93619T1 DE 93619 T1 DE93619 T1 DE 93619T1 DE 198383302501 T DE198383302501 T DE 198383302501T DE 83302501 T DE83302501 T DE 83302501T DE 93619 T1 DE93619 T1 DE 93619T1
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DE
Germany
Prior art keywords
human tissue
plasminogen activator
human
activator
type found
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE198383302501T
Other languages
English (en)
Inventor
David Vannorman Hillsborough California 94010 Goeddel
William Jack San Mateo California 94403 Kohr
Diane Foster City California 94404 Pennica
Gordon Allen San Carlos California 94070 Vehar
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27409206&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE93619(T1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US06/483,052 external-priority patent/US4766075A/en
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of DE93619T1 publication Critical patent/DE93619T1/de
Pending legal-status Critical Current

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Claims (15)

83302501.8 0093819 Patentansprüche:
1. Plasminogenaktivator des im menschlichen Gewebe vorkommenden Typs, der im wesentlichen frei von anderen Proteinen menschlichen Ursprungs ist. .
2. Plasminogenaktivator des im menschlichen Gewebe vorkommenden Typs, unbegleitet von assoziierter, natürlicher Glykosylierung.
3. Plasminogenaktivator des im menschlichen Gewebe vorkommenden Typs, gebildet durch rekombinante Wirtszellen.
4. Plasminogenaktivator des im menschlichen Gewebe vorkommenden Typs in im wesentlichen reiner Form.
5. Plasminogenaktivator des im menschlichen Gewebe vorkommenden Typs nach Anspruch 1-4, enthaltend eine Sequenz eines Polypeptides, die sich vom N-Terminus der normalerweise ersten Aminosäure des genannten, im menschlichen Gewebe vorkommenden Plasminogenaktivators aus erstreckt.
6. Eine DNA-Sequenz,enthaltend eine Sequenz, die für einen Plasmingenaktivator des im menschlichen Gewebe vorkommenden Typs kodiert.
7. Ein replizierbarer Expressionsvektor, der fähig ist, in
einem transformanten Mikroorganismus oder einer transformanten Zellkultur eine DNA-Sequenz nach Anspruch 6 zu exprimieren.
8. Das Plasmid paRIPA' oder pt-PAtrp12.
9. Ein Mikroorganismus oder eine Zellkultur, der (die) mit dem Vektor nach Anspruch 7 oder 8 transformiert ist.
10. Ein Mikroorganismus nach Anspruch 9, erhalten durch Transformierung eines E.coli-Stammes.
-2- 0093618
11. Eine Zusammensetzung,umfassend eine therapeutisch wirksame Menge eines Plasminogenaktivators des im menschlichen Gewebe vorkommenden Typs nach Anspruch 1 - 5,vermischt mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermittel.
12. Die Zusammensetzung nach Anspruch 11, geeignet für parenterale Verabreichung.
■13. Die Verwendung von Plasminogenaktivator des im menschlichen Gewebe vorkommenden Typs nach Anspruch 1 - 5 für die Behandlung von Gefäßerkrankungen oder -zustände oder für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für solche Behandlungen nützlich sind.
14. Ein Verfahren, das die Expression von DNA-kodierendem Plasminogenaktivator des im menschlichen Gewebe vorkommenden Typs in einer rekombinanten Wirtszelle umfaßt.
15. Ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem t-PA, welches Verfahren umfaßt:
a) Herstellung eines replizierbaren Expressionsvektors, der fähig ist, die menschliches t-PA kodierende DNA-Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle zu exprimieren;
b) Transformierung einer Wirtszellenkultur, um eine rekombinante Wirtszelle zu erhalten;
c) Kultivieren der genannten rekombinanten Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression der das genannte t-PA kodierenden DNA-Sequenz zur Erzeugung von menschlichem t-PA ermöglichen; und die
d) Gewinnung des genannten menschlichen t-PA.
DE198383302501T 1982-05-05 1983-05-04 Plasminogenaktivator fuer menschliches gewebe, diesen aktivator enthaltende pharmazeutische zusammensetzungen, verfahren zur herstellung des aktivators sowie dna und transformierte zellzwischenprodukte hierfuer. Pending DE93619T1 (de)

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US39800382A 1982-07-14 1982-07-14
US06/483,052 US4766075A (en) 1982-07-14 1983-04-07 Human tissue plasminogen activator

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Families Citing this family (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4558010A (en) * 1980-04-03 1985-12-10 Abbott Laboratories Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator and method of making plasminogen activator protein therefrom
IL68561A (en) * 1982-05-05 1991-01-31 Genentech Inc Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof
US5010002A (en) * 1983-01-19 1991-04-23 Genentech, Inc. Human t-PA production using vectors coding DHFR protein
US5011795A (en) * 1983-01-19 1991-04-30 Genentech, Inc. Human tPA production using vectors coding for DHFR protein
US4713339A (en) * 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
IE56716B1 (en) * 1983-01-19 1991-11-20 Genentech Inc Method for producing human tpa and expression vectors therefor
AU2353384A (en) * 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US5169762A (en) * 1983-03-03 1992-12-08 Genentech, Inc. Human nerve growth factor by recombinant technology
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS59196824A (ja) * 1983-04-21 1984-11-08 Kowa Co 吸着防止剤
US5639639A (en) * 1983-11-02 1997-06-17 Genzyme Corporation Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof
PT79518B (pt) * 1983-11-21 1986-12-12 Ciba Geigy Ag 54). 5 ^ig do plasmídeo pBR 322 /PHO5 Bam Rsa 637 são digeridos com a endonuclease de restrição Xbal. Apos digestão completa o DNA ê extraído com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol. 0 DNA ê redissolvido em Tris.HCl 50mM pH8,0 numa concentração de 50 p-g/nd. e ê digerido com 11 unidades de fosfatase alcalina do intestino de vitela (Boehringer), durante 1 hora a 379C. - 97 fORHjf y| A enzima ê inativada a 65 9C durante 1 hora. 0 DNA ê purificado por cromatografia de troca iõnica em DE 52 ( Whatman) e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 9Aa. Dois oligodeoxinucleotídeos sintéticos com a formula 5’-CTAGAAGGGGTATCTTTGGATAAGA - 3' 3’- TTCCCCATAGAAACCTATTCTCTAG -5' são fosforilados individualmente nas suas extremidades 5' como descrito no Exemplo 9Ab. Os oligodeoxinacleotídeos fosforilados são misturados em quantidades equimolares . A mistura ê aquecida durante 10 min. a 759C, depois deixada arrefecer lentamente atê à temperatura ambiente e guardada a -209C. Este adaptador ê designado por adaptador C. 1 ^ig (120 pmoles) do adaptador C emparelhado e fosforilado e 5 pg (1,5 pmoles) de pBR322/ /PH05 Bam-Rsa 637 desfosforilado e cortado com Xba I são ligados em 40^1 de Tris.HCl 60mM pH 7,5, MgCl2 lOmM, DTT 5mM, ATP lmM, 1600 unidades da ligase de DNA do T4 a 159C durante 20 horas. A ligase de DNA ê inactivada durante 10 min. a 859C e o excesso de adaptadores ê removido por precipitação com isopropanol. 0 DNA ê redissolvido em H20 numa concentração de 0,25 mg/ml. Os múltiplos de adaptadores são removidos por digestão com a endonuclease de restrição BglII. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido e depois digerido com Bam HI. Os fragmentos de restrição são separados num gel de 0,6¾ de agarose de baixo ponto de fusão em Tris-borato-EDTA pH8,3. 0 fragmento Bam HI-BglII de 662 pb (derivado de fragmento Bam HI-Rsa I de 637 pb) ê localizado e removido do gel. c) Isolamento de um fragmento de vector contendo a sequência codificadora do TPA maduro ( fig. 23) 5 yig do plasmídeo p31R/SS-TPA /\ 2, são digeridos com as endonucleases de restrição Bam HI e BglII. Após digestão completo de DNA e precipitado com etanol e ressuspenso em Tris.HCl 50mM pH 8,0 numa concentração de 75 jxg /ml. Os fragmentos de DNA sao desforilados nas suas extremidades 5' por digestão com 1 unidade de fosfatase alcalina de intestino de vitela ( Boehringer) em 60 de Tris.HCl 50mM pH 8,0 durante 1 hora a 379 C. A fosfatase ê inactivada por incubação a 659C durante 1,5 horas. 0 DNA é purificado por cromatografia de troca iónica em DE-52 (Whatman) como descrito no Exemplo 9Aa. 0 DNA ê precipitado com etanol, redissolvido em Tris-HCl lOmM, pH8,0 e aplicada num gel de 0,6 °'o de agarose de ponto de fusão baixo. 0 fragmento maior Bam HI -BglII de 5,2 kb ê removido do gel. d) Ligação dos fragmentos de DNA isolados e transformação de E.coli HB 101 (cf. figs 23 e 24 ). Dois blocos de gel de agarose de ponto de fusão baixo contendo 0,1 pmoles do fragmento Bam HIBglII de 5,2 kb de p31R/SS-TPA/\ 2 e 0,2 pmoles do fragmen to BamHI -BglII de 662 pb de pBR322/PHO5 Bam-Rsa 637, respectivamente, são misturados, liquefeitos a 659C e diluídos para baixar a concentração de agarose para 0,3¾. A ligação ê feita em 150^1 de Tris.HCl 60mM, pH 7,5; MgCl^ lOmM, 99 jr £ DTT 5mM, ATP ImM e 800 unidades de ligase de DNA do T4 (Biolabs) a 159C durante 16 horas. Amostras de 10 ^il e 30 yjl são misturadas com 100 p.1 de células E.coliHB 101 competentes para a transformação como descrito no Exemplo 4a. - R 6 colonias transformadas amp são crescidas individualmente em meio LB contendo 100 ^g/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídeo ê analisado quanto ao tamanho e orientação da invenção por corte com a endonuclease de restrição Bam Hl. Um único clone com a orientação correcta da inserção é designado por p31/PHO5 637-TPA (cf. fig. 23). 0 plasmídeo pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 pode também ser substituído por pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 595, pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 811 e pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 1312 . Seguindo o processo descrito atras são isolados clones únicos com inserções do tamanho e orientação esperados e designados por p31/PHO5 595C-TPA, p51/PHO5 811C-TPA e p31/PHO5 1312 C-TPA. 0 adaptador C pode também ser substituído pelo adaptador B com a seguinte férmula 5' -CTAGATAAGAGATCTGC -3’ 3’ TATTCTCTAGACG -5' o qual codifica Lis -Arg na construção final (fig. 24). A fosforilação dos oligodeoxinucleotídeos sintéticos e emparelhamento são como descrito para o adaptador C. Para a adição do adaptador 5 de pBR 322/PHO5 Bam-Rsa 637 cortado com Xba I são digeridos com 2 unidades de nuclease (Sigma) em 50 yjl de acetato de sédio 30mM pH 4,6, NaCI 200mM e ZnSO^ ImM durante 40 min. a 379C para criar extremidades cerses (ver fig.23). Apos extração com fenol clorofórmio o DNA ê precipitado com etanol e redissolvido em H^O numa concentração de 0,25 mg/ml. 0,4 ^g (120 pmoles) de adaptador A fosforilado e emparelhado e 5 ^ig (1,5 pmoles) de pBR 322/PHO5 Bam -Rsa 637 cortado com Xba I /S^ são ligados através das extremidades cerses como descrito para o adaptador C exceptuando a utilização de ATP 3,5 mM. As outras construções são como descrito atras. Os clones resultantes são identificado pela letra A e referidos como p31/PHO5 595A-TPA, p31/PHO5 637A-TPA, p31/PHO5 811A-TPA e p31/PHO5 1312 A-TPA. Exemplo 16: Subclonagem de construção genética no vector de levedura de elevado numero de copias pJDB2O7 e transformação de S. cerevisiae GRF18 As construções descritas nos Exemplos 13-19 contêm o promotor de PH05 com ou sem extensões para a região codificadora do gene de PH05 . A região codificadora do TPA com ou sem prepo-sequência e os sinais de terminação da transcrição de PH05 num arranjo tendem, tudo inserido num vector derivado do pBR 322. Os fragmentos Bam HI-HIND III contendo todo o arranjo são ligados ao fragmento Bam Hl -Hind III de 6,4 kb do pJDB 207 como descrito para uma reacção analoga no Exemplo 10. Células E.coli HB101 competentes são transformadas e vãrias colonias amp^ de cada experiência são crescidas individualmente em meio LB com 100 ^ig/ml de ampicilina. 0 DNA de plasmídio é analisado por corte com as endonucleases de restrição Hind III, Bam Hl e Pst I. Partindo dos plasmídeos p31/PHO5-TPA 18, ρ31 /PHO5-TPA 42, p31R/SS-TPA /\ 2, p31R/SS-TPA/\ 3, Ρ31/ΡΗΟ5 595C-TPA, p31/PHO5 637C-TPA,’ p31/PHO5 811C-TPA, P31/PHO5 1312C-TPA, p31/PHO5 595B-TPA, p31/PHO5 637-TPA, P31/PHO5 811 B-TPA, p31/PHO5 1312 B-TPA, p31/PHO5 595 A-TPA P31/PHO5 637-TPA, p31/PHO5 811-A-TPA e p31/PHO5 1312A-TPA obtem-se os clones que se seguem com as inserções correctas PJDB2O7/PHO5-TPA18 PJDB2O7/PHO5-TPA42 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 2 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA Λ 3 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA PJDB2O7/PHO5 637C-TPA PJDB2O7/PHO5 811C-TPA PJDB2O7/PHO5 1312C-TPA PJDB2O7/PHO5 595B-TPA PJDB207/PH05 637B-TPA pJDB2O7/PHO5 811B-TPA PJDB2O7/PHO5 1312B-TPA pJDB2O7/PHO5 595A-TPA PJDB2O7/PHO5 637A-TPA PJDB2O7/PHO5 811A-TPA PJDB2O7/PHO5 1312A-TPA . Estes plasmídeos são introduzidos individualmente em Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 como descrito no Exemplo 11. Uma única colónia de levedura de cada uma das transformações de levedura ê picked. Os clones obtidos são designados por . Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2Ò7/PHO5-TPA18 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA42 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7R/PHO5-SS-TPA/\ 2 Sacchãtúiuycea cerevisíae GRFi8/pJD32O7R/?HO5~SS-TPA /\ 3 Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312C-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 595B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 637B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 811B-TPA Saccharomyces cerevisíae GRF18/pJDB2O7/PHO5 1312B-TPA As células de levedura são crescidas colhidas e extraídas como descrito nos Exemplos 11 e 12. A actividade de TPA nos extractos celulares é testado como descrito no Exemplo 12. Os resultados estão apresen tados na tabela 3. Tabela 3: Actividade de TPA da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae GRF18 transformada com diferentes plasmídeos e testada em condições de desrepressão (Pi baixo) : plasmídeo Actividade de TPA(unidades/l de cultura de células de levedura/ OD^qq) PJDB2O7/PHO5-TPA18 750 PJDB2O7/PHO5-TPA42 700 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA_A 2 600 PJDB2O7R/PHO5-SS-TPA 3 650 PJDB2O7/PHO5 595C-TPA 900 Exemplo 17: Substituição cromossómica do gene de PHO5 pelo gene do TPA (ver fig.25) A região codificadora da proteína TPA ê colocada no cromossoma II de levedura na posição da região codificadora da proteína PH05 . Experimentálmente isto ê con seguido por cotransformação. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18 ê cotransformada com 25 ^ig do plasmídeo p31/PHO5 -TPA 18, linearizado com BnmHI e Hind III, e 3 ^xg do plasmídeo de levedura Yepl3 (51). De 24 colónias Leu obtidas, uma ê Pho5 e ao mesmo tempo produz aproximadamente 35 unidades de TPA/1 de cultura de células de levedura /0D600. Por crescimento deste transformante num meio contendo leucina (YPD, 10g/l de Bacto Yeast Extract, 20g/l de Bacto Peptone, 20 g/l de glucose) durante 10 gerações, segregantes Leu~são obtidos com uma frequência de 10-20¾ os quais provavelmente perderam o plasmideo Yep31. Por análise ou Southern do DNA total de levedura isolado dos segregantes Leu (52) verifica-se que no nível de DNA que as sequências codificadoras da proteína TPA substituem as sequências codificadores da proteína PH05 deixando inal. teradas as sequências ladeantes do cromossoma II. Seleccionou-se uma estirpe que se designou por Saccharomyces cerevisiae GRF 18 (pho-5-ΤΡΑ)♦ Exemplo 18: Melhoramento de estirpe por mutação A estirpe Saccharomyces cerevisiae GRF18 /pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) é ainda desenvolvida para produção de TPA por mutação e selecção de baixa actividade de fosfatase ácida. Saccharomyces cerevisiae H2 4 3/pJDB 20 7/ /PH05 -TPA (IA) um mutante termo-sensível de Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB2O7/PHO5 TPA (IA) ê obtido por irra_2 diação com UV (0,08 yiWcm , 15 segundos, 99,2¾ de morte). As colónias são crescidas em meio YPD osmc ticamente estabilizado contendo sorbitol 1,2M (10 g/l de Bacto Yeast Extract, 20 g/l de Bacto Peptone, 20g/l de glucose, 20 g/l de agar Bacto) e transferidas para meio YPD sem sorbitol. Saccharomyces cerevisiae H243 ê isolada como colónia de crescimento lento. Cerca de 10$ células de Saccharomyces cerevisiae H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA (IA) são semeadas em agar YNB (6,8 1 de yeast Nitrogen Base sem aminoãcidos ; 20 g/1 de glucose, 20 g/1 de agar Bacto, suplementado com 20 mg/1 de histidina) e são irradiadas directamente com UV (0,08 -2 uWcm durante 12 segundos). A morte e de 98¾. As colonias obtidas a partir das células sobreviventes são transferidas para meio de Pi baixo e dois dias depois coradas para a actividade de fosfatase acida por um teste de sobrecamada de agar mole (48). Os mutantes negativos para a fosfatase _4 acida são obtidos com uma frequência de mutaçao de 3,2x10 . A estirpe com o título de TPA mais elevado é seleccionado e referido como Saccharomyces cerevisiae H423/pJDB2O7/PHO5-TPA (IA). As actividades de TPA de tres estirpes diferentes de levedura transformadas com pJDB2O7/PHO5-TPA (IA) estão apresentadas na Tabela 4. Tabela 4: Actividade de TPA de diferentes estirpes de Saccharomyces cerevisiae transformadas em condi ções de desrepressão (Pi baixo) Actividade de TPA (unidades/1 de cultura de células de levedura /OD^qq) GRF18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) 625 H243/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 1560 H423/pJDB2O7/PHO5 -TPA(IA) 7200 • 1 Exemplo 19 : Produção de TPA por uma estirpe recombinante da levedura Saccharomyces cerevisiae numa escala de 30 1. Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF 18/pJDB2O7/PHO5-TPA(lA) possui um plasmídeo que inclui uma marca para leucina permitindo manutenção selectiva do plasmídeo no organismo hospedeiro, um gene estrutural para o TPA humano e o promotor da fosfatase acida PH05 que permite a expressão do gene do TPA em meios com quantidades limitativas de fosfato inorgânico (condições de desrepressão). A estirpe ê mantida em culturas de agar inclinado preparadas com um meio definido sem o aminoãcido leucina para assegurar a retenção do plasmídeo. Agar recentemente inoculado e incubado durante 24 horas a 30?C. A cultura â superfície de um dos agares inclinados ê ressuspensa em 3ml de meio de pre-cultura o qual ê então transferido para o primeiro balão de pre-cultura com agitação. 0 balão de 500 ml tem uma unica saída e contem 100 ml de meio I de pre-cultura tendo o seguinte composição ( valoreq em g/1). L-asparagina, 2,0; L-histidina, 0,02 glucose, 10 ; Kt^PO^, 1,0 ; MgSO4· 7H2O, 0,5 ; NaCl 0,1 ; CaCl2~2H2O, 0,1 ; solução de vitaminas 5 jil/1 e solução de micronutriantes 5 ml/1. 0 meio e ajustado a pH7,2 usando NaOH antes da esterilização . A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados à parte e adicionados ao meio. As soluções "stock” de vitaminas e micronutrientes têm as seguintes composições (em g/1): Vitaminas - biotina, 0,0002; D-pantotenato de cãlcio , 0,04 ; acido fõlico, 0,0002; acido micotínico, 0,04 ; acido p-aminobenzõico, 0,02 ; hidrocloreto de piridoxina, 0,04; riboflãvina, 0,02 ; hidrocloreto de tiamina, 0,04; e inositol 0,2 em 1 1 de agua desionizada ; micronutrientes - acido bórico 0,05 ; CuSO "^H 0, 0,004 ; Kl, 0,01; FeCl^.óH^O, 0,02 ; MnSO^, 0,04 ; NaMoO^. 2^0, 0,02 e ZnSO^.71^0, 0,04 em 1 1 de agua desionizada. 0 meio ê preparado usando agua desionizada. A primeira pré-cultura é incubada durante 24 horas a 309C num agitador orbitol com 5cm de excentricidade a uma velocidade de 250 rev/min. Os balões com a primeira pré-cultura constituem o inoculo para os balões da segunda pré-cultura. Estes balões recebem um inoculo de 1¾ (v/v). Eles contem 100 ml de meio II de pré-cultura tendo a seguinte composição (mg/1): Extracto de levedura (Difco), 10,0 ; L-asparagina, 6,6; Κ^ΡΟ^ 1.0 ; MgSO^.7H2O, 1,0 ; L-histidina, 0,02 e D-glucose (mono-hidrato) , 33,0. 0 meio que ê preparado usando agua desionizada tem um pH de aproximadamente 6,0. A glucose é esterilizada separadamente. As condições de incubação são idênticas âs da primeira pré-cultura. 0 caldo de cultura de 3 balões ê combinado para dar um inoculo a 1¾ v/v para o fermentador principal de produção. 0 fermentador de produção tem um volume total de aproximadamente 45 1, contem 4 saliências e um agitador de turbina de disco de seis lâminas com um diâmetro de 115 mm. A velocidade de agitação é de 600 rev/min, a sobrepressão de 0,3 bar e uma velocidade de arejamento de 0,5 vol/vol/min. * ,· Η Ο fermentador contem 30 1 de um meio com as composições seguintes: (valores em g/1): L-asparagina, 2,0 ; L-histidina, 0,02 ; Kí^PO^, 0,03; MgSO^. 71^0, 0,5; NaCl, 0,1, CaCl2.2H2O, 0,1 ; KC1, ip ; D-glucose (mono -hidrato) , 20,0 ; solução de vitaminas 5 ml/1 e solução micronutrientes, 5ml/l. 0 meio ê ajustado pH 7,2 usando NaOH antes da esterilização. A glucose, vitaminas e micronutrientes são esterilizados separadamente e adicionados ao meio. As soluções "stock" de vitaminas e micronutrientes têm composição idêntica às descritas para o meio I de prê-cultura. A temperatura de fermentação ê de 309C. 0 pH desce para 5,0 onde ê controlado usando NaOH. Apos fermentação durante cerca de 20 horas atinge-se a produção máxima de TPA. A densidade óptica que atinge 2-3 unidades e a actividade de fosfatase ácida dão indicações uteis àcer ca do progresso da fermentação. 0 calor de fermentação ê arrefecido para 109C antes da colheita das células de levedura. Exemplo 20: Recuperação e purificação do TPA e pro-TPA por cromatografia com anticorpos monoclonais anti-TPA a) Preparação de extractos celulares 0 líquido de cultura (pH4) dos 30 1 de fermentação (cf.Exemplo 19) é arrefecido atê 109C e centrifugado usando uma centrífuga Alfa-Laval BRPX-207. As células separadas são ressuspensas em 21 de tampão de lise A ( NaH2P04 20mM, f^HPO^ 80mM, NaCl 150 mM, 0,01¾ de Tween, Benzamidina lOmM e EDTA lOmM). • 1 ί »» A solução é arrefecida atê 59C e passa da através de um moinho Dyno (tipo KDL-Pilot) com uma velocidade de alimentação de 101/h. 0 moinho estã equipado com 500 ml de pérolas de vidro de 0,5 -0,75 m de diâmetro e ê ligado a 3000 rev/min. Antes da adição das pérolas de vidro às células em suspensão aquelas são lavadas com 300 ml de tampão de lise A contendo 30 mg de BSA. A suspensão de células ê centrifugada ( rotor Sorvall 653, 40 min. 9000 rpm) e o sedimento rejeitado. b) Digestão do DNA^e fraccionamento com sulfato de amonio Adiciona-se 5 mg de DNAse a 2 1 da suspensão clarificada e a mistura ê agitada durante 30 min. a 49C. Subsequentemente a solução é levada a 35¾ de saturação com (NH^^SO^ (p/v) e ê agitada durante 1 hora a 49C. A solução ê centrifugada como descrito atrãs e o sedimento contendo toda a actividade de TPA ê ressuspensa em 1 1 de tampão H contendo 1¾ de Tween e 0,1¾ de SDS. A suspensão ê agitada durante pelo menos 1 hora a 49C. c) Cromatografia de imunoafinidade I) Purificação do anticorpo anti-TPA 5 ml de soro de coelho, anti -TPA (oferecido pelo Dr. E. Reich, Friedrich -Miescher-Institut Basel) são passados por uma coluna de sefarose com lisina para renovar o plasminogenio de soro. A coluna ê lavada com 1-2 volumes de PB5 pH 7,4 contendo NaCl 100 mM, KCI 2,7 mM, Na2HP04 8,lmM e KH2PO4 1,5 mM. $ rf* « « Ο líquido da coluna e de lavagens são juntos. 0 anti-soro sem plasminogênio é precipitado pela adição de (NH^)2SO^ sólido para uma concentração final de 50¾ (p/v). A solução ê mantida durante a noite a 4?C e em seguida centrifugada ( rotor Sorvall GSA,1200 rpm, 20 min.) . 0 precipitado e dissolvido num peque no volume de PB5 e dializado contra PBS contendo 0,1 ¾ de NaNj. A IgG desta solução dializada e purificada numa coluna de proteína A -sefarose (55). II) Preparação de uma coluna com anticorpo anti-TPA 13 mg de anticorpo anti-TPA purificado são dializados contra MOPS 0,1 M pH7,0. 0 anticorpo e ligado a 5 ml de Affigel 10 activado ( Biorad ) segundo as instruções do fabricante. A matrix do gel ó equilibrada com PBS contendo 1¾ de Tween 80, 0,1¾ de SDS, NaCl 0,2M, Benzamidin lOmM e 0,1¾ de NaN^. A matrix e aplicada numa coluna de 5 ml. III) Purificação de TPA por cromatografia de imunoafinidade. 0 sedimento redissolvido do fraccionamento com sulfato de amónio ê centrifugado para remover o material insolúvel ( rotor Sorvall GSA, 30 min. 12000rpm) e subsequentemente aplicado â coluna de afinidade a uma ve locidade de fluxo de cerca de lOml/hr a 49C. Depois de todo o volume ter passado através da coluna esta ê lavada com 10 volumes da coluna de PBS contendo 0,05¾. de Tween 80. A coluna ê eluída usando glicina-ΗΟΙΟ,ΙΜ pH2,5 contendo 0,1 ¾ de Tween. São colhidas fracções de 2 ml e testados para a actividade de TPA segundo o método de Rânby (49). Como substracto usa-se D-Val-Leu-Lis -pNA (Kabi -S-2251). As fracções com actividades mais elevadas são reunidas, neutralizadas usando Tris IM e concentradas por ultrafiltração usando uma membrana Amicon YM10. 0 TPA assim obtido apresenta cerca de 90¾ de pureza e estã predominantemente em forma de cadeia unica ( pro-TPA) como evidenciado por SDS-PAGE em condições de redução. 0 peso molecular aparente em condições não redutoras ê de cerca de 60 000 por SDS -PAGE (ver figura A). Figuras A e B : electroforese em gel de poliacrilamida-SDS do produto do gene TPA em levedura (Figura A) e a sua actividade enzimãtica num gel de actividade (placas com caseína) ( figura B). B:gel de actividade A:gel com SDS ad figura A (SDS-PAGE): Faixas 1 e 4 : proteínas padrão (marcadores de peso molecular) Faixas 2 e 5 : TPA de melanoma Faixas 3 e 6 : TPA de levedura Faixas 1 - 3 : em condições de redução Faixas 4 - 6 : em condições de não-redução As amostras correram num gel de 12,5¾ que se corou para proteínas usando azul Coomassie brilhante. ad. figura B (gel de actividade, cf. Exemplo 23): Faixa 1 : TPA de melanoma Faixa 2 : TPA de levedura Sobre-camada para plasminogénio de agar com caseira (referência 56) . Exemplo 21: Recuperação e purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia de afinidade com DE-3 a. Preparação de uma coluna de DE-3 Sepharosé 26 mg do inibidor DE-3 purificado a partir de Erythrina latíssima (16) são acoplados a 5 ml de Sepharose 4b ® activada com brometo de cianogênio (Pharmacia) segundo as instruções do fabricante. A matrix ê equilibrada com tampão fosfato salino ("PBS") pH 7,4 contendo NaCl 0,4M, 0,1¾ de Triton X-100R e 0,02¾ de azida de sódio. A matrix ê então acamada numa coluna de 5 ml. b. Purificação de TPA e pro-TPA por cromatografia em DE-3 R Sepharose 4b Os extractos celulares (cf. Exemplo 20a) são tornados 0,4 M relativamente a NaCl e 0,1¾ para Triton X-lOCr^ e filtrados através de uma membrana de 0,45 ^im (Millipore). A solução ê então aplicada à coluna de DE-3 Sepharose (ver atras) a uma velocidade de fluxo de 45ml/hr â temperatura ambiente e o efluente ê rejeitado. Depois do volume total do extracto ter passado através da coluna esta ê lavada com cerca de 50 ml de PB5 contendo NaCl 0,4 M e 0,1 ¾ de Triton X-lOO*' sendo colhidos fracções de 2 ml a 49C. 0 conteúdo protêico de cada fracção ê determinado por medição da absorvância de UV a 280nm. A proteína adsorvida verificou-se ser eluída como um pico bem definido. As fracções contendo os valores mais elevados de absorvância de UV e de activida125 de fibrinolítica determinada pelo teste da I fibrina (47) são reunidas dando 8 ml de solução que se guardou a -209 C. Isto representa aproximadamente 70-80¾ da actividade total aplicada à coluna. As fracções com as actividades »· mais baixas são reunidas separadamente. A recuperação total de actividade em ambos os conjuntos de fracções monta os 90-100¾. c). Purificação de pro-TPA por cromatografia em DE-3 Sepharose 4b® na presença de um inibidor de proteíases. A cromatografia dos extractos de células de levedura ê feita de modo semelhante ao descrito no Exemplo 21b exceptuando a inclusão neste caso do inibidor de tripsina pancreãtica bãsica (BPTI) a 0,1 KlU/ml usando o teste fluorimétrico como Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC como substracto (37) determinou-se o conteúdo em TPA e pro-TPA da solução purificada. 90¾ do TPA estã na forma de pro-enzima e 10¾ na forma activa. Assim, a conversão de pro-TPA em TPA durante o processo de purificação é inibido pelo BPTI. Exemplo 22: Separação de pro-TPA do TPA A solução de TPA e pro-TPA obtida como descrito no Exemplo 21c e ajustada a pH8,0 com Tris.HCl O,1M contendo 0,1¾ de Triton X-lOcP e tornado lmM relativamente ao diisopropilfluorofosfato. Apos incubação a 37?C durante 4 horas, a mistura ê passada através de uma coluna de 5 ml de DE-3 Sepharose® (cf. Exemplo 21a). 0 efluente contendo o TPA irreversivelmente inibido é rejeitado. A coluna e lavada com 6 volumes de coluna de PBS contendo NaCl 0,4 M e 0,1¾ de Triton X-IOC^ e subsequentemente eluída com PB5 contendo K SCN 1,6M, NaCl 0,4M e 0,1¾ de Triton X-10C^ como descrito no Exemplo 21b . As fracções apresentando as absorvân. 1 s· P0RWI « ? » ... Ή , - - - , __. «τ'. cias de UV mais elevadas são reunidas. 0 conjunto de fracções contem pro-TPA numa forma substancialmente pura uma vez que não se detecta actividade amidolítica no teste fluorimêtrico usando Cbz-Gli-Gli-Arg-AMC (37) como substrato. A actividade amidolítica assim como a fibrinolítica pode ser restabelecida por tratamento com plasmina a qual converte pro-TPA em enzima activa. Exemplo 23: Propriedades do produto do gene TPA em levedura a. Propriedades enzimãticas 0 produto do gene TPA em levedura obtido segundo o Exemplo 19 e purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 (cf. Exemplo 21b) ê enzimãticamente activo como se mostra por clivagem de plasminogênio zimogênio em plasmina na ausência e na presença de fibrina. A actividade enzimãtica pode ser verificada pelos testes colorimêtricos descritos por Ranby (49) (cf. Exemplo 12) e por Verheijen et al. (60) , em placas de caseína e de fibrina (56) e num teste de fase solida com 12 9 I - fibrinogenio ( 47). A actividade enzimãtica em placas de caseína ê mostrada na figura B ( cf. Exemplo 20 c III). A actividade enzimãtica do TPA obtido ê grandemente estimulada pela fibrina. 0 TPA parcialmente purificado por eromatografia de afinidade em DE-3 ê testado num teste de velocidade parabólica (cf. Ranby (49)). Tomando a velocidade reacção Δ E versus Δ t^ entre e 5 minutos como uma medida da actividade enzimãtica a estimulação por concentração óptimas de fibrina ê de 10-20 vezes ( ca. 100 yig /ml) . 0 efeito pode ser observado com fragmentos de fibrina obtidos por digestão com CnBr
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
JP2648301B2 (ja) * 1983-12-27 1997-08-27 ジエネテイツクス・インスチチユ−ト・インコ−ポレ−テツド 真核細胞の形質転換のための補助ｄｎａを含むベクター
DE3585097D1 (de) * 1984-02-27 1992-02-20 Green Cross Corp Herstellung menschlicher urokinase.
EP0156169B1 (de) * 1984-02-29 1991-12-18 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Wässrige Lösung eines darin in erhöhter Konzentration aufgelösten Gewebe-Plasminogen-Aktivators und Herstellungsverfahren
US4758512A (en) * 1984-03-06 1988-07-19 President And Fellows Of Harvard College Hosts and methods for producing recombinant products in high yields
EP0173552B1 (de) * 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Rekombinante DNA-Verbindungen und Expression von Polypeptiden wie tPA
US4753879A (en) * 1984-08-27 1988-06-28 Biogen N.V. Modified tissue plasminogen activators
EP0174835A1 (de) * 1984-09-11 1986-03-19 The Upjohn Company Menschlicher Gewebeplasminogenaktivator und rekombinante DNA-Zusammensetzungen
UA54363C2 (uk) 1984-09-28 2003-03-17 Кірін-Амген, Інк Виділена молекула днк, яка кодує людський еритропоетин (варіанти), біологічно функціональний кільцевий плазмідний або вірусний днк-вектор, штам еукаріотичних клітин-хазяїв (варіанти), спосіб одержання поліпептиду, фармацевтична композиція
EP0178105B1 (de) * 1984-10-01 1997-04-02 Genzyme Corporation Rekombinante DNS-Verfahren und dadurch hergestellte Produkte
FI90990C (fi) * 1984-12-18 1994-04-25 Boehringer Ingelheim Int Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi
DE3500961A1 (de) * 1985-01-14 1986-07-17 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig Escherichia-coli-staemme, dna-teilsequenzen dieser staemme und herstellungsverfahren
JPH082308B2 (ja) 1985-01-28 1996-01-17 インタ−ナショナル・ジェネティック・エンジニアリング，インコ−ポレイテッド ａｒａＢプロモーターを含有する複製可能な発現ビヒクル
EP0201153A3 (de) * 1985-02-09 1987-10-07 Beecham Group Plc Modifiziertes Enzym und Verfahren zu dessen Herstellung
GB8508717D0 (en) * 1985-04-03 1985-05-09 Beecham Group Plc Composition
PT82326B (pt) * 1985-04-04 1988-10-14 Beecham Group Plc Processo para a preparacao de activador de plasminogenio de tipo tissular fibrinoliticamente activo
US5756093A (en) * 1985-04-22 1998-05-26 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator variants
DE3682104D1 (de) * 1985-04-22 1991-11-28 Genentech Inc Plasminogenaktivator-mutante des menschlichen gewebes, verfahren und zwischenprodukte dafuer und diese mutante verwendende zusammensetzungen.
US5736134A (en) * 1985-04-22 1998-04-07 Genentech, In.C Tissue plasminogen activator variants
CA1297008C (en) * 1985-05-28 1992-03-10 Michael D. Johnston Aqueous parenteral solution of tissue-plasminogen activator
AU593264B2 (en) * 1985-07-10 1990-02-08 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Chromosomal DNA sequence, expression vector for human tissue plasminogen activating factor, cultured cells transfected with same and method of producing said activating factor
US4916071A (en) 1985-08-14 1990-04-10 American Home Products Corporation Poly-kringle plasminogen activator
US5244806A (en) * 1985-08-26 1993-09-14 Eli Lilly And Company DNA encoding novel tissue plasminogen activator derivatives having kringles 1 and 2 deleted, vectors and host cells
USH2055H1 (en) 1985-09-20 2002-12-03 Zymogenetics, Inc. Expression of tissue-type plasminogen activator in bacteria
DE3537708A1 (de) 1985-10-23 1987-04-23 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten
GB8528321D0 (en) * 1985-11-18 1985-12-24 Ciba Geigy Ag Modified fibrinolytic agents
JP2581668B2 (ja) * 1985-11-27 1997-02-12 三井東圧化学株式会社 ヒト正常細胞由来のヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子をコ−ドする新しいｄｎａ配列とそれを含むベクタ−及び細胞
DE3682754D1 (de) * 1985-12-16 1992-01-16 Ethicon Inc Hemmung von post-chirurgischer adhaesionsbildung durch topische verabreichung von gewebeplasminogenaktivator.
ATE85081T1 (de) * 1985-12-20 1993-02-15 Upjohn Co Analoge des gewebespezifischen plasminogenaktivators.
US5106741A (en) * 1985-12-20 1992-04-21 The Upjohn Company Tissue plasminogen activator (TPA) analogs
DK623186A (da) * 1985-12-23 1987-08-26 Chiron Corp Polypeptid med vaevsplasminogen-aktivator-virkning
JPS62149625A (ja) * 1985-12-25 1987-07-03 Green Cross Corp:The 生理活性物質の製造方法
DK43387A (da) * 1986-01-29 1987-07-30 Beecham Group Plc Fibrinolytisk enzym
US5002887A (en) * 1986-01-31 1991-03-26 Genetics Institute, Inc. Truncated thrombolytic proteins
DE3781420T2 (de) * 1986-01-31 1993-02-25 Central Glass Co Ltd Hybrides plasminogenaktivatoraehnliches polypeptid.
US5258298A (en) * 1986-01-31 1993-11-02 Genetics Institute, Inc. Deletion and glycosylation mutant of human tissue plasminogen activator
US5204255A (en) * 1986-01-31 1993-04-20 Sagami Chemical Research Center Hybrid tissue plasminogen activator/urokinase polypeptides
US5837518A (en) * 1986-01-31 1998-11-17 Genetics Institute, Inc. Thrombolytic proteins
EP0234051B1 (de) * 1986-02-17 1991-12-11 Stichting Centraal Laboratorium van de Bloedtransfusiedienst van het Nederlandse Rode Kruis Gewebeplasminogen-Aktivator-Mutant, dafür kodierende rekombinante genetische Information und Verfahren zur Herstellung dieser Mutanten, deren Verwendung und pharmazeutische Zusammensetzungen
FR2594845B1 (fr) * 1986-02-21 1989-12-01 Genetica Preparation par voie microbiologique de l'activateur tissulaire humain du plasminogene (t-pa) et conversion de l'enzyme ainsi obtenue en sa forme active
US4851517A (en) * 1986-02-26 1989-07-25 Monsanto Company Tissue plasminogen activator oligosaccharide from normal human colon cells
US4927630A (en) * 1986-02-26 1990-05-22 Monsanto Company Tissue plasminogen activator from normal human colon cells
US5132214A (en) * 1986-04-09 1992-07-21 Monsanto Company Large scale production of plasminogen activator from normal human colon cells
US4751084A (en) * 1986-02-26 1988-06-14 Monsanto Company Tissue plasminogen activator from normal human colon cells
US5589361A (en) * 1986-03-18 1996-12-31 Genentech, Inc. Human tissue-type plasminogen activator variant
JPH01500322A (ja) * 1986-03-28 1989-02-09 クリエイティブ　バイオモレクレス，インコーポレーテッド 組織プラスミノーゲンアクテイベーター類縁蛋白質
WO1987005934A1 (en) * 1986-03-28 1987-10-08 Roberto Crea Protein analogues of tissue plasminogen activator
PT84589B (en) * 1986-04-02 1989-05-09 Beecham Group Plc Process for preparing a fibrinolytic enzyme
PT84588B (en) * 1986-04-02 1989-05-09 Beecham Group Plc Process for preparing a fibrinolytic enzyme
GB8608020D0 (en) * 1986-04-02 1986-05-08 Beecham Group Plc Compounds
PT84587B (pt) * 1986-04-02 1989-11-30 Beecham Group Plc Processo para preparacao de uma enzima fibrinolitica
DE3643158A1 (de) * 1986-04-21 1987-11-19 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogen-aktivator(tpa) - derivat und seine herstellung
DE3613401A1 (de) * 1986-04-21 1987-12-17 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung von plasminogen-aktivatoren in prokaryonten
JP2585532B2 (ja) * 1986-05-10 1997-02-26 三井東圧化学株式会社 動物細胞の形質転換体及びそれを得る方法並びにその形質転換体を用いてｔ−ＰＡを生産する方法
IL82746A (en) * 1986-06-06 1994-10-07 Genentech Inc Process for producing biologically active tissue-type plasminogen activator
DK345087A (da) * 1986-07-11 1988-01-12 Novo Industri As Modificeret vaevsplasminogenaktivator
PT86162B (pt) * 1986-11-21 1990-11-20 Smithkline Beecham Corp Expressao de proteina recombinante
GB8628398D0 (en) * 1986-11-27 1986-12-31 Central Blood Lab Authority Pharmaceutically-active conjugates
ZA879286B (en) 1986-12-16 1988-10-26 Smith Kline Rit New plasminogen activators
NL8700013A (nl) * 1987-01-06 1988-08-01 Leuven Res & Dev Vzw Hybride plasminogeenactivatoren met verbeterde trombolytische eigenschappen en geneesmiddelen die deze plasminogeenactivatoren bevatten.
MY103358A (en) * 1987-04-15 1993-06-30 Novartis Ag Process for the production of protiens.
US5681713A (en) * 1987-05-08 1997-10-28 Smithkline Beecham Corporation Expression of heterologous proteins in Drosophila cells
CA1341345C (en) * 1987-05-08 2002-03-05 Hanne Ranch Johansen Expression of foreign genes in drosophila cells
NO179874C (no) * 1987-06-04 1997-01-02 Zymogenetics Inc Fremgangsmåte for fremstilling av en t-PA-analog, DNA-sekvens som koder for t-PA-analogen, samt ekspresjonsvektor omfattende DNA-sekvensen og vertcelle omfattende denne
US5266474A (en) * 1987-06-24 1993-11-30 Genentech, Inc. Balanced inducible transcription system
ATE120491T1 (de) * 1987-06-24 1995-04-15 Genentech Inc Ausgeglichenes, konstitutives, induzierbares transkriptionssystem.
US4935237A (en) * 1988-03-21 1990-06-19 Genentech, Inc. Processes for the preparation of t-PA mutants
WO1989000191A1 (en) * 1987-07-06 1989-01-12 Genetics Institute, Inc. Novel thrombolytic proteins
IL87276A (en) * 1987-08-03 1995-07-31 Fujisawa Pharmaceutical Co Analog of tissue plasminogen activator comprising only the kringle 2 and protease domain dna encoding the same processes for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing the same
US5504001A (en) * 1987-11-25 1996-04-02 Zymogenetics, Inc. Hybrid plasminogen activator
US5364622A (en) * 1987-12-04 1994-11-15 Dr. Karl Thomae Gmbh Methods for preventing adhesions to organs and parts of organs by application of tissue plasminogen activator and hydroxyethylcellulose hydrogel
DE3741149A1 (de) * 1987-12-04 1989-06-15 Thomae Gmbh Dr K Zubereitungsformen zur verhinderung von adhaesionen von organen und organteilen
US4929560A (en) * 1988-02-03 1990-05-29 Damon Biotech, Inc. Recovery of tissue plasminogen activator
JP2576200B2 (ja) * 1988-03-09 1997-01-29 味の素株式会社 生理活性タンパク質の製造法
WO1989009257A1 (en) * 1988-03-22 1989-10-05 Invitron Corporation METHOD TO ENHANCE tPA PRODUCTION
US5210037A (en) * 1988-03-22 1993-05-11 Centocor Incorporated Method to enhance TPA production
US5037646A (en) * 1988-04-29 1991-08-06 Genentech, Inc. Processes for the treatment of vascular disease
US5346824A (en) * 1988-05-20 1994-09-13 Genentech, Inc. DNA encoding variants of tissue plasminogen activators and expression vectors and hosts thereof
US5270198A (en) * 1988-05-20 1993-12-14 Genentech, Inc. DNA molecules encoding variants of tissue plasminogen activators, vectors, and host cells
US5023078A (en) * 1988-08-10 1991-06-11 Albert P. Halluin Plasminogen activator-heparin conjugates
US5714145A (en) * 1988-09-02 1998-02-03 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties
US5262170A (en) * 1988-09-02 1993-11-16 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, DNA molecules encoding them, vectors, and host cells
DE3831714A1 (de) * 1988-09-17 1990-03-22 Basf Ag Tpa-aehnliche polypeptide, ihre herstellung und verwendung
US5252713A (en) * 1988-09-23 1993-10-12 Neorx Corporation Polymeric carriers for non-covalent drug conjugation
US5866413A (en) * 1989-03-06 1999-02-02 Board Of Regents Of The University Of Texas System Pai-1 mutants
US5550042A (en) * 1989-03-06 1996-08-27 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Serine protease mutants of the chymotrypsin superfamily resistant to inhibition by their cognate inhibitors and genes encoding the same and serine protease inhibitor mutants and genes encoding the same
DK0462207T3 (da) * 1989-03-06 2001-06-18 Univ Texas t-Pa mutanter resistente mod deres respektive inhibitorer
EP0559795B1 (de) * 1990-11-30 1995-12-27 Monoclonetics International, Inc. Verfahren zur diagnose chronischer niedriger rückenschmerzen und nackenschmerzen
ES2107041T3 (es) * 1992-06-03 1997-11-16 Genentech Inc Variantes de activador de plasminogeno tisular obtenidos por glicosilacion, que presentan propiedades terapeuticas.
DE10153601A1 (de) 2001-11-02 2003-05-22 Paion Gmbh DSPA zur Behandlung von Schlaganfall
JP4595968B2 (ja) * 2007-07-12 2010-12-08 パナソニック電工株式会社 往復式電気かみそりの内刃

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL43343A (en) * 1972-10-24 1976-03-31 Lilly Co Eli Production of plasminogen activator
FR2252842B1 (de) * 1973-12-03 1977-11-04 Fabre Sa Pierre
FR2310133A2 (fr) * 1975-05-05 1976-12-03 Fabre Sa Pierre Nouveau medicament comportant un activateur du plasminogene perfectionne
US4245051A (en) * 1978-03-30 1981-01-13 Rockefeller University Human serum plasminogen activator
DE3015699C2 (de) * 1979-04-26 1982-07-15 Asahi Kasei Kogyo K.K., Osaka Herstellung eines Plasminogen-Aktivators
CA1154671A (fr) * 1979-07-27 1983-10-04 Lucien D. D'hinterland Separation d'un activateur tissulaire du plasminogene
US4370417A (en) * 1980-04-03 1983-01-25 Abbott Laboratories Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator
NL8003402A (nl) * 1980-06-11 1982-01-04 Leuven Res & Dev Vzw Nieuwe plasminogeen-activator en farmaceutisch preparaat met trombolytische werking.
JPS5852634B2 (ja) * 1980-12-05 1983-11-24 株式会社林原生物化学研究所 ウロキナ−ゼの製造法
IL68561A (en) * 1982-05-05 1991-01-31 Genentech Inc Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof
GT198302091A (es) * 1982-05-05 1984-10-25 Activador de plasminogeno de tejido humano a),b),c).

Also Published As

Publication number Publication date
ZW10483A1 (en) 1983-09-21
CA1293211C (en) 1991-12-17
GB2119804B (en) 1986-02-26
OA07419A (fr) 1984-11-30
GB2119804A (en) 1983-11-23
DE3316297C2 (de) 1989-09-21
EP0093619A1 (de) 1983-11-09
CY1341A (en) 1987-01-16
NO831575L (no) 1983-11-07
DK174236B1 (da) 2002-10-07
CS248705B2 (en) 1987-02-12
BG60253B1 (bg) 1994-03-24
RO90639B (ro) 1987-01-31
DE3380567D1 (en) 1989-10-19
DE3316297A1 (de) 1983-11-17
FR2526443B1 (fr) 1985-12-06
RO90639A (ro) 1987-01-30
DK198883A (da) 1983-12-20
DD210303A5 (de) 1984-06-06
BG60253B2 (bg) 1994-03-24
HK88586A (en) 1986-11-28
ES522085A0 (es) 1984-12-16
FR2526443A1 (fr) 1983-11-10
GB8312221D0 (en) 1983-06-08
EP0093619B2 (de) 1996-09-18
EP0093619B1 (de) 1989-09-13
BR8302318A (pt) 1984-01-10
IE54975B1 (en) 1990-04-11
AU563031B2 (en) 1987-06-25
PL152438B1 (en) 1990-12-31
PT76636A (en) 1983-06-01
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IL68561A (en) 1991-01-31
ES8501629A1 (es) 1984-12-16
JP2564444B2 (ja) 1996-12-18
JPH05137583A (ja) 1993-06-01
JPH0448440B2 (de) 1992-08-06
KE3647A (en) 1986-07-25
MY8700119A (en) 1987-12-31
IL68561A0 (en) 1983-09-30
AR241654A1 (es) 1992-10-30
NO852065L (no) 1983-11-07

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