NL8700013A

NL8700013A - Hybride plasminogeenactivatoren met verbeterde trombolytische eigenschappen en geneesmiddelen die deze plasminogeenactivatoren bevatten.

Info

Publication number: NL8700013A
Application number: NL8700013A
Authority: NL
Original assignee: Leuven Res & Dev Vzw
Priority date: 1987-01-06
Filing date: 1987-01-06
Publication date: 1988-08-01
Also published as: JPS63169987A; EP0275606A1

Description

» o.cv.. d^OO0\3> P HP/AB/Leuven 41.

- 1 -

Hybride plasrainogeenactivatoren met verbeterde trombo-lytische eigenschappen en geneesmiddelen die deze plasmino-geenactivatoren bevatten

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe plasminogeen-activatoren welke een hybride zijn van plasminogeenactivator van het weefseltype (t-PA) en plasminogeenactivator van het urokinasetype met de 1-ketenvorm (scu-PA), welke verbeterde 5 trombolytische eigenschappen bezitten. Verder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het vervaardigen van deze nieuwe plasminogeenactivatoren en op geneesmiddelen die deze plasminogeenactivatoren bevatten.

Het is bekend dat bepaalde enzymen, zogenaamde plas-10 minogeenactivatoren, na intraveneuze toediening aan de mens of aan dieren in vivo een trombolytische werking kunnen uitvoeren. Deze werking is gebaseerd op de aktivering van in bloed aanwezig plasminogeen dat een keten van reakties initieert, welke leidt tot lysis van een fibrine bevattend 15 bloedstolsel dat aanwezig is in bloedvaten. Het mechanisme van deze werking is zeer complex en kan in afhankelijkheid van het gebruikte type plasminogeenactivator verschillend zijn.

Plasminogeenactivatoren kunnen worden opgesplitst in 20 twee typen, namelijk plasminogeenactivator van het weefseltype (t-PA) en plasminogeenactivator van het urokinasetype (u-PA). De plasminogeenactivatoren van het urokinasetype kunnen verder worden onderverdeeld in die met een 2-keten-vorm (tcu-PA) en met een 1-ketenvorm (scu-PA).

25 t-PA kan plasminogeen aktiveren maar is in aanwezig heid van fibrine werkzamer dan in afwezigheid daarvan. Dit betekent dat aktivering in hoofdzaak zal plaatsvinden in de direkte nabijheid van een bloedstolsel dat opgelost is, terwijl de aktivering van plasminogeen in de bloedcirculatie 30 veel minder is. t-PA geeft geen kruisreaktie met antisera voor tcu-PA of scu-PA.

^ : V

* - 2 - tcu-PA induceert de aktivering van plasminogeen in bloed zowel in aanwezigheid als in afwezigheid van fibrine. Dit betekent dat bloedstolsels kunnen worden opgelost maar dat eveneens een aktivering van het fibrinolytische systeem 5 in de bloedcirculatie optreedt, hetgeen leidt tot een fibri-nogeenafbraak en tot een neiging tot bloeden.

scu-PA aktiveert plasminogeen slechts in aanwezigheid van fibrinebevattende bloedstolsels. Op dezelfde wijze als voor t-PA zal slechts een geringe aktivering van het fibri-10 nolytische systeem in de bloedcirculatie optreden ongeacht het feit dat het aktiveringsmechanisme verschillend is en scu-PA en t-PA immunologisch niet verwand zijn. Van deze drie plasminogeenactivatoren wordt tcu-PA reeds lange tijd gebruikt in de geneeskunde, maar de hiervoor beschreven bij-1 15 verschijnselen vormen een grote handicap.

Ofschoon veel vragen met betrekking tot het optimale gebruik van deze werkzame stoffen tot nu toe onbeantwoord zijn gebleven, is inmiddels vastgesteld dat de fibrine-spe-cificiteit bij de mens minder uitgesproken is dan in ver-20 schillende diermodellen. Er bestaat dan ook een grote behoefte aan trombolytische middelen met een hogere specifieke trombolytische aktiviteit en een betere fibrine-selectivi-teit.

Eén benadering voor het ontwikkelen van verbeterde 25 trombolytische middelen bestaat uit de bereiding van hybride-eiwitten welke strukturen bevatten, die in t-PA en scu-PA verantwoordelijk zijn voor de fibrine-specificiteit.

De fibrine-specificiteit van t-PA is in hoofdzaak het gevolg van zijn affiniteit voor fibrine en zijn opmerkelijk 30 vergrote plasminogeenactivering aan het fibrine-oppervlak.

De strukturen in t-PA die verantwoordelijk zijn voor zijn fibrine-aktiviteit zijn gelocaliseerd in het NH2-terminale deel van het molecuul, waarschijnlijk in het vingerachtige gebied en in de tweede lus. u-PA daarentegen vertoont 35 slechts fibrine-specificiteit in de scu-PA vorm, waarin de LyS158_xie159 peptidebinding intakt is. De fibrine-specificiteit is niet afhankelijk van de aanwezigheid van de 8700013 * * - 3 - NH2”terniinale 143 aminozuren of van een mogelijke splitsing van de Lys^58_LyS159 peptidebinding. Hybride-eiwitten die bestaan uit het NH2“terminale deel van t-PA en het COOH-terminale deel van scu-PA en waarin de omzetting naar u-PA 5 is geblokkeerd, kunnen een hogere fibrine-selectiviteit bezitten dan t-PA of scu-PA en kunnen daardoor betere trom— bolytische middelen vormen.

Op basis van deze hypothese zijn reeds hybridemolecu-len van t-PA en u-PA bereid door expressie van cDNA fragmen-10 ten voor t-PA (coderende aminozuren 1 t/m 67, 1 t/m 212 of 1 t/m 313) welke zijn gefuseerd met cDNA fragmenten van scu-PA (coderende aminozuren 136 t/m 411, 139 t/m 411 of 195 t/m 411). Deze recombinantprodukten aktiveren na opsplitsen door piasmine plasminogeen met een snelheid die sterk overeenkomt 15 met die voor u-PA, hetgeen aangeeft dat de fusie van de t-PA strukturen met de u-PA strukturen niet de katalytische akti-viteit van het enzym belemmeren. Verdere onderzoeken met een van deze hybride moleculen (1 t/m 67 van t-PA met 136 t/m 411 vana scu-PA) hebben echter opgeleverd dat noch de 20 fibrine-affiniteit van t-PA, noch de verbeterde fibrine-selectiviteit in vergelijking tot scu-PA aanwezig zijn in dit hybridemolecuul.

Tijdens verder onderzoek is een hybridemolecuul gevonden dat de gecombineerde mechanismen voor fibrine-specifici-25 teit van t-PA en aktiviteit van scu-PA beide bezit. Voor het eerst is dus een hybridemolecuul verschaft waarin gecombineerd een verbeterde fibrine-selectiviteit en een meer specifieke trombolytische aktiviteit tot expressie zijn gebracht. In een voorkeursuitvoeringsvorm bestaat het hybride-30 molecuul uit de NH2“terminale aminozuren 1 t/m 263 van t-PA en in frame daarmee de COOH-terminale aminozuren 144 t/m 411 van scu-PA (Fig. 1). Gebleken is dat in een plasmamilieu in vitro dit hybridemolecuul een hogere specifieke trombolytische aktiviteit en een betere fibrine-specificiteit ten 35 opzichte van scu-PA bezit. Verder bezitten dergelijke hybride moleculen een fibrinolytische werking op fibrine-vergroeiingen op exudaten. Heilzame werking is ook te ver- 87 0 0 01 3 » - 4 - wachten bij atone wonden als gevolg van slechte doorbloeding.

Met betrekking tot de NH2”terminale aminozuren van t-PA wordt opgemerkt, dat tenminste de aminozuren die de 5 vinger (aminozuren 1 t/m 44 of 45) en die welke de tweede lus (aminozuren 178 t/m 261 of 262) vormen aanwezig moeten zijn. Eventueel kan de tweede lus in tandem voorkomen. Van de COOH-terminale aminozuren van scu-PA moeten tenminste de aminozuren vanaf aminozuur 148 aanwezig zijn. De peptide-10 keten kan eventueel zijn verlengd tot bij voorkeur aminozuur 144 of zelfs aminozuur 136.

De uitvinding heeft betrekking op werkwijzen voor het bereiden van deze nieuwe hybride plasminogeenactivatoren met verbeterde fibrine-specificiteit, op de vervaardiging van 15 cDNA moleculen die coderen voor deze plasminogeenactivatoren, op zoogdiercelsystemen waarin deze cDNA moleculen tot expressie kunnen worden gebracht, op werkwijzen voor het zuiveren van kweekmedia en extracten van deze celsystemen, en op geneesmiddelen en bereidingswerkwijzen daarvoor, waar-20 mee patiënten kunnen worden behandeld die lijden aan trombo-ëmbolytische ziekten.

Voor het bereiden van een geneesmiddel kan de hybride plasminogeenactivator worden gecombineerd met een farmaceutisch geschikt excipiens dat elk voor dit doel gebruikelijk 25 medium kan zijn. Verder is het mogelijk om naast deze hybride plasminogeenactivatoren andere plasminogeenactivatoren op te nemen, waardoor synergetische werking kan optreden. Bij voorkeur bezit het geneesmiddel de vorm van een intraveneuze infusievloeistof aangezien deze 30 vorm de beste kans op doeltreffende resultaten biedt.

De uitvinding wordt nader geïllustreerd in de navolgende experimenten zonder daartoe te zijn beperkt.

I Bereiding van t-PA cDNA klonen 35 --------------------------------- t-PA werd gezuiverd uit in geconditioneerd kweekmedium Ρ“0ΠΠ1Χ V V -U' i· w i - 5 - opgenomen melanomacellen (Bowes). Totaal RNA werd geïsoleerd uit humaan Bowes melanomacellen met de bekende guanidinium-thiocyanaat-extractie/lithiumchloride-precipitatiemethode.

Poly A+ mRNA werd bereid met oligo-dT chromatografie. Het 5 oligo-dT aangezette (primed) cDNA werd volgens een bekende methode bereid en gekloneerd in Xgtll (T.V. Huynn et al,

XgtlO and Xgtll DNA cloning techniques; a practical approach, IRC Press, Oxford (1984)).

Twee partieel overlappende desoxyoligonucleotiden die 10 de complementaire strengen van t-PA cDNA voorstellen werden chemisch gesynthetiseerd. Deze twee strengen 5’-GGGCACCTGCCAGCAGGCCCTGTACTTCTC-3' en 51-GGGCACTGGCACACGAAATCTGAGAAGTAC-3' werden complementair verkleefd en aangevuld onder gebruikmaking van het Klenow-15 fragment van E. coli DNA polymerase I (eindconcentratie 0,1 eenheid/ml, Boehringer Mannheim), en 200μΜ van dGTP, dTTP en dATP (Pharmacia, Uppsala, Zweden) en 250 pCi (α-^^P) dCTP, 5000 Ci/mmol (New England Nuclear, Boston, MA) leverde een 49 nucleotide bevattende probe die een specifieke aktiviteit 20 van 10® cpm/pg had. Deze probe overspant de nucleotiden 366 t/m 416 van de cDNA sequentie (D. Pennica et al. Nature 301, 214-221 (1983)). Met deze probe werd plaque-hybridisatie uitgevoerd.

Het cDNA uit positieve plaques (Xt-PA4 en Xt-PA8) 25 werden tezamen met pUC18 uitgeknipt en leverde een opeenvolgende cDNA sequentie die codeert voor t-PA. De t-PA cDNA sequenties werden vervolgens gesubkloneerd in M13mpl8 of Ml3mpl9 (C. Yannish-Perron et al, Gene 33, 103-118, (1985)). Vervolgens werd "gesequenced" met behulp van de 30 dideoxynucleotideketen-terminatiemethode.

II Bereiding van u-PA cDNA klonen 35 pUCscu-PA bevattende cDNA sequenties die coderen voor scu-PA werden als volgt verkregen. Totaal RNA werd geïsoleerd uit CALU-3 cellen (ATCC, HTB-55) volgens de guanidi- 8700013 - 6 - niumisothiocyanaat-extractie/lithuimchloride-precipitatie-werkwijze. Poly A+ mRNA werd bereid door oligo-dT cellulose-chromatografie. Het oligo-dT "primed" cDNA werd bereid en gekloond inlgtll.

5 Twee partieel overlappende desoxyoligonucleotiden die complementaire strengen scu-PA cDNA voorstellen werden chemisch gesynthetiseerd. Deze twee strengen 5'-GGGCAGGTGTGCGCAGCCATCCCGGACT en 5'-GGGCAGGCAGATGGTCTGTATAGTCCGGG werden complementair ver-10 kleefd en ingevuld onder gebruikmaking van het Klenow-frag-ment van E. coli DNA polymerase I (eindconcentratie 0,1 een-heid/μΐ) en 200μΜ dGTP, dTTP en dATP, en 250μ0ΐ(α-32ρ) dCTP en leverde een 49 nucleotiden bevattende probe met een specifieke aktiviteit van ongeveer 10^ cpm/pg. Dit nucleotide 15 overspant de nucleotiden 931 t/m 979 van de cDNA sequentie (W.E. Holmes et al. Biotechnology 3, 923-929, (1985)). Vervolgens werd plaque-hybridisatie uitgevoerd. Een tweede specifiek "geprimede" cDNA library werd bereid in Agtll onder gebruikmaking van het als tweede genoemde deoxyoligonucleo-20 tide voor het starten van de cDNA synthese van de eerste streng. Drie overlappende cDNA klonen werden gezamenlijk uitgeknipt en leverden een opeenvolgende cDNA sequentie die codeert voor scu-PA.

25 III Bereiding van t-PA/u-PA hybride cDNA klonen

Het BlgII-Sau3AI fragment uit pUCscu-PA (nucleotiden 399 t/m 732, dat codeert voor de aminozuren Arg®8 t/m 30 Vall99) werd ingebouwd in BamHI verteerd M13mpl8 en leverde M13intl. Het Sstl-fragment uit pUCt-PA (nucleotiden -20 t/m 1422) dat codeert voor de aminozuren vanaf het terminale Mef·^ t/m Leu^ll werd vervolgens ingebouwd in de SstI plaats van M13intl en wel bovenstrooms van de scu-PA sequen-35 tie en leverde M13t-PA scu-PA (zie fig. 2). De sequenties van t-PA en scu-PA hebben dezelfde oriëntatie in dit DNA molecuul. Het aaneenlassen van het DNA molecuul bij t-PA

S7C0013 - 7 - * codon Thr263 met het seu-PA codon Leul44 werd uitgevoerd door een plaatsgerichte mutagenesis in vitro waarbij gebruik werd gemaakt van template DNA met een enkele streng van M13t-PA-scu-PA en van de synthetische desoxyoligonucleotide-5 deletion-primer 51-CTGAAATTTTAAGGTGGAGCAGGA-31 (New England Biolabs) dat complementair is aan de codons voor de aminozuren Ser260 t/m Thr263 van t-PA en de aminozuren Leul44 t./m Gln247 van scu-PA. 200ng van het gefosforyleerde desoxyoli-gonucleotide werd gedurende 5 minuten bij 65eC verwarmd met 10 lpg van het template in 50mM Tris-HCl buffer pH 7,8, 10mM MgCl2 en 20mM DTT, vervolgens werd stapsgewijs afgekoeld tot kamertemperatuur en 0°C. ATP werd toegevoegd tot een concentratie van 0,4mM en dNTPS tot een concentratie van 0,05mM in een eindvolume van 50μ1. 400 ü T4 DNA ligase en 5 eenheden 15 Klenow-fragment van E. coli DNA polymerase I werden toegevoegd. Het DNA dat werd verkregen na 1 uur incuberen bij 14eC werd gebruikt voor het transfecteren van E. coli JM 101 cellen.

250ng van de deletion-primer werd radioaktief gemerkt 20 tot een specifieke aktiviteit van 10^ cpm/pg door gedurende 30 minuten bij 37eC te incuberen in 70mM Tris-HCl buffer pH

8,0 dat bevatte lOmM MgCl2 en 5mM DTT, ΙΟΟμΟί (a-32p)ATP en 10 eenheden T4-polynucleotidekinase in een reaktiemengsel van 20μ1. Deze gemerkte probe werd vervolgens 25 gebruikt in plaque-hybridisatie om het uitgeknipte DNA van Ml3t-PA/u-PA te identificeren. Hybridisatie vond over de nacht bij 22°C plaats in 0,09M Tris-HCl buffer pH 7,5 dat bevatte 0,9M NaCl, 0,5% Nonidet P40 detergens, IX Denhardts, 6mM EDTA, ImM Na-pyrofosfaat, 0,lmM ATP en 0,2 mg/ml E. coli 30 tRNA. Nitrocellulosefilters werden gedurende 1 uur bij 49°C een aantal malen gewassen met 75mM NaCl en over de nacht blootgesteld aan Röntgenfilms. De plaques die een positief hybridisatie-signaal leverden werden geselecteerd door dideoxynucleotide-sequencen teneinde het verwijderen van 35 ongewenst DNA vast te stellen.

8700013 W " - 8 - IV Eukaryotische expressie van hybride t-PA/u-PA cDNA klonen

Het expressie plasmide werd in twee stappen bereid.

5 Het Bglïl-partiële EcoRI restrictie-endonuclease-fragment .......... · van Ml3 t-PA/u-PA dat codeert voor Seri t/m Thr263 j.n ae t-PA sequentie en Leul44 t/m Glul63 van de scu-PA sequentie en het partiële EcoRI-Sstl restrictie-endonuclease-fragment van pUCscu-PA dat codeert voor Phel64 t/m Leu^H, 78 nucleo-10 tiden van 3'-niet-vertaalde sequentie van scu-PA cDNA en een restant van de pUC18 polylinker, werden ingebouwd in BglII-SstI verteerd pUCscu-PA.

Het HindlII-BglII restrictie-endonuclease-fragment van pUCt-PA dat bevat de 51-niet-gevertaalde sequenties van t-PA * 15 cDNA en codeert de t-PA aminozuren Met“35 t/m Arg“l, het

BglII-SstI restrictie-endonuclease-fragment van plntl (de hybride aminozuren Seri t/m Leu531 en 73 nucleotiden an de 3'-niet-gevertaalde sequentie) en het Sstl-HindlII vector-fragment van psV328DHFR werden gekoppeld en leverden pSVt-PA/u-PADHFR (fig. 2).

5pg van het pSVt-PA/u-PADHFR plasmide werden gebruikt om DHFR deficiënte ovariacellen van Chinese hamsters te transfecteren. Deze cellen werden verkregen van W. Fiers van de Universiteit van Gent, België. De transfectie werd uitge-25 voerd met de bekende calciumfosfaat-coprecipitatie methode.

De DHFR+ cellen werden geïsoleerd en onderzocht op de secretie van met laagmoleculair u-PA verwand antigeen, waarbij gebruik werd gemaakt van een ELISA-test.

Verder werd op grote schaal geproduceerd waarbij het 30 geconditioneerde medium 3 maal werd geoogst na opeenvolgende incubatieperioden van 2 dagen in serumvrij medium.

V Zuivering van de t-PA/u-PA hybride eiwitten uit het geconditioneerde kweekmedium 35

De hybride cellen werden gezuiverd door chromatografie op zinkchelaat-Sepharose en iramunoadsorptie aan geïnsolubi- 0c 0 1 3 κ - 9 - liseerde monoklonale antilichamen (MA-1C8) die de binding van t-PA aan fibrine tegenwerken. Ongeveer 15 liter van het medium werd gebracht op een zinkchelaat-Sepharose kolom (5 x 25 cm) die vooraf was geëquilibreerd in 0,3M NaCl, 0,02M Tris-HCl buffer pH 7,5, die bevatte 0,01% Tween 80 en 10 5 KIU/ml aprotinine. De kolom werd bij 4°C beladen met een stroomsnelheid van 250ml per uur. Vervolgens werd de kolom gewassen met de hiervoor beschreven buffer en geëlueerd met een buffer die 50mM imidazool bevat. Frakties van 7,5ml werden verzameld in buizen die 2,5ml 0,4M arginine, Q,08M 10 citraatbuffer pH 5,0 en 40KIU/ml aprotinine bevatten. Het met ELISA gemeten antigeen elueerde in een piek die in hoofdzaak samenviel met de belangrijkste eiweitpiek.

De helft van de verzamelde u-PA bevattende frakties 15 werd gechromatografeerd op een immunoadsorptie kolom (0,9 x 7 cm) met een stroomsnelheid van 8 ml per uur. De kolom werd gewassen met 0,3M NaCl, 0,02M Tris-HCl buffer pH 7,5 die bevatte 0,01% Tween 80 en 10 Klü/ml aprotinine, en werd vervolgens geëlueerd met 2M KSCN in dezelfde buffer. Frakties 20 van 7,5ml werden verzameld in buizen die 2,5ml 0,4M arginine, 0,08M citraatbuffer pH 5,0 en 40 KIU/ml aprotinine bevatten. De antigeen bevattende frakties werden verzameld en gedialyseerd tegen 0,3M NaCl-Ο,ΙΜ arginine-0,02M citraatbuffer pH 5,0 die 0,01% Tween 80 en 10 KIU/ml aprotinine bevat.

25 De zuiveringsstap met zinkchelaat-Sepharose had een opbrengst van 85% en leverde een 75-voudige volumereduktie op. De immunoadsorptie chromatografie leverde 3,0mg met u-PA verwant antigeen in een totaal volume van 10ml op. Deze laatste zuiveringsstap leverde een 24-voudige zuiveringsfak-30 tor op en had een 10-voudige volumereduktie. De totale Opbrengst aan met u-PA verwant antigeen bedroeg 53% en 420ug gezuiverd materiaal per liter medium werd verkregen. Door toevoeging van aprotinine was het t-PA/u-PA hybride eiwit in hoofdzakelijk tot vrijwel uitsluitend aanwezig in de t-PA/scu-PA vorm.

35 s ~. ' : 13 - 10 - VI Karakterisering van de t-PA/u-PA hybriden

Het gezuiverde t-PA/scu-PA hybride migreert in SDS-PAGE als een doubletband onder niet-reducerende condi-5 ties en als een enkelvoudige hoofdband met een Mr van 70000 onder reducerende omstandigheden. De beide banden van de doubletband zijn zowel immunologisch aktief tegen antiserum voor u-PA als antiserum voor t-PA.

De aminozuursamenstelling van het t-PA/scu-PA hybride 10 wordt getoond in tabel I. Deze aminozuursamenstellingen komen overeen met die van bekende sequenties voor t-PA/scu-PA hybriden.

De specifieke aktiviteit op fibrineplaten bedroeg 175000 Iü/mg voor het t-PA/scu-PA hybride en voor het 15 t-PA/tcu-PA hybride 205000 Iü/mg in vergelijking met 160000 IU/mg voor scu-PA en 50000 Iü/mg voor t-PA.

VI.1 Behandeling met piasmine 20 Een t-PA/scu-PA hybride oplossing in 0,02M citraatbuf- fer pH 5,0 die bevatte 0,3M NaCl, 0,2M arginine en 0,01% Tween 80 werd 3 maal verdund in 0,038M NaCl, 0,05M Tris-HCl buffer pH 7,4 die bevatte 0,01% Tween 80 (eindconcentratie 2,0μΜ), en werd bij 37°C behandeld met piasmine (eindconcen-25 tratie 30-90nM). Op vastgestelde tijden (0-30 minuten) werd 5μ1 verwijderd en toegevoegd aan 800μ1 van dezelfde buffer die S-2444 bevatte in een eindconcentratie van 0,3mM. Uro-kase-aktiviteit werd bepaald door de meting van de absorptie bij 405nm en werd uitgedrukt in IU door vergelijking met een 30 internationaal referentiepreparaat (66/46). De moleculaire vorm van het hybride werd aan het einde van de behandeling na reduktie onderzocht met 12% SDS-PAGE. De specifieke aktiviteit van het t-PA/scu-PA hybride bedroeg 340 Iü/mg. Het piasmine veroorzaakte een tijdsafhankelijke omzetting van 35 het t-PA/scu-PA hybride tot het amidolytisch aktieve urokinase (zie fig. 3: A= specifieke amidolytische aktiviteit, B= tijd in min), Maximale conversie leidt tot een amidolytische 87 0 0 0 1 3 i, - 11 - aktiviteit die overeenkomt met een specifieke aktiviteit van ongeveer 33000 IU/mg voor het t-PA/scu-PA hybride. 0,1M arginine had geen effekt op de S-2444 hydrolyse door urokinase .

5 SDS-PAGE toonde aan dat het t-PA/scu-PA hybride vol ledig is omgezet vanuit de 1-keten vorm naar de 2-keten vorm na incubatie gedurende 30 minuten bij 37°C met plasmide (3% op molaire basis).

10 VI.2 Aktivering van plasminogeen door t-PA/u-PA hybride

De aktivering van plasminogeen door het t-PA/scu-PA hybride werd gemeten in aanwezigheid van een overmaat substraat. Het t-PA/scu-PA hybride werd bij een concentratie 15 van 25nM bij 37°C geïncubeerd met variërende concentraties plasminogeen (eindconcentratie 0,25-2μΜ) in 0,038M NaCl, 0,05M Tris-HCl buffer pH 7,4 dat bevatte 0,01% Tween 80 en ImM S-2251. De vorming van piasmine werd gedetecteerd door het meten van de adsorptie bij 405nm gedurende 3 tot 4 minu-20 ten en werd uitgedrukt in nM door vergelijking met een plas-mine-ijk curve.

De aktivering van plasminogeen (eindconcentratie 10-95μΜ) door t-PA/scu-PA hybride (eindconcentratie 225nM) werd gemeten door incubatie met plasminogeen bij 37°C in 25 0,05M Tris-HCl buffer pH 7,4 die bevatte 0,038M NaCl en 0,01% Tween 80. Het op verschillende tijdsintervallen gevormde piasmine (0-6 minuten) werd gemeten met S-2251 (eindconcentratie 0,3mM) na 200-voudige verdunning van het monster, De initiële aktiveringssnelheden werden verkregen uit 30 grafieken waarin de concentratie van gevormd piasmine werd uitgezet tegen de incubatietijd.

Het effekt van fibrine op de aktiveringssnelheid van plasminogeen door t-PA/tcu-PA hybride werd onderzocht door het incuberen van plasminogeen (eindconcentratie 1,5μΜ) bij 35 37°C in 0,05M Tris-HCl buffer pH 7,4 die bevatte 0,038M NaCl en 0,01% Tween 80, met 0,25 of 0,50μΜ CNBr-verteerd fibrino-geen alvorens t-PA/tcu-PA (eindconcentratie l,25nM) werd b : v v * 5 * - 12 - toegevoegd. Gevormd piasmine werd gemeten in een 20-voudige verdunning van het monster.

De aktivering van plasminogeen door t-PA/scu-PA hybride volgt de Michaelis-Menten kinetiek (zie fig. 4A: C= de 5 reciproke van de intiële aktiveringssnelheid (v) en D= de reciproke van de plasminogeenactivatorconcentratie). 0,1M arginine had geen invloed op de aktiveringssnelheid van plasminogeen door of op de hydrolysesnelheid van S-2251 door piasmine. Uit deze Lineweaver-Burk grafieken is af te lezen 10 dat Km = 2,2μΜ en k2 = 0,0013s"1 (r = 0,998).

De aktivering van plasminogeen door het t-PA/tcu-PA hybride volgt ook de Michaelis-Menten kinetiek (zie fig. 4B waarin E en F overeenkomen met de grootheden C en D uit fig. 4A). Verder is Km = 85μΜ en k2 = 5s-1 (r = 0,999).

15 Toevoegen van CNBR verteerd fibrinogeen aan het incu- batiemengsel van plasminogeen en t-PA/tcu-PA hybride leidde tot een opmerkelijke vergroting van de aktiveringssnelheid (zie fig. 5; E= de plasmine-concentratie, B= tijd).

20 VI.3 Binding aan gezuiverd fibrine

Humaan fibrinogeen (eindconcentratie 0-3,3 mg/ml) in 0,038M NaCl, 0,05M Tris-HCl buffer pH 7,4 dat bevatte 0,01% Tween 80 en 1 mg/ml BSA, werd gemengd met scu-PA, tcu-PA, 25 t-PA/scu-PA, t-PA/tcu-PA of t-PA (eindconcentratie 50-100 ng/ml). In het mengsel werden stolsels gevormd door het toevoegen van thrombine tot een eindconcentratie van 20 NIH eenheden/ml. Na een incubatie bij 37°C gedurende 1 minuut werd thrombine geïnaktiveerd door het toevoegen van 30 D-Ile-Pro-Arg-CH2Cl (eindconcentratie 10μΜ) waardoor de in-aktivatie van urokinase wordt vermeden en de monsters werden gedurende 1 minuut bij 10000g gecentrifugeerd. De concentraties aan met u-PA of t-PA verwant antigeen in de supernatant werd bepaald met de hiervoor beschreven ELISA test.

35 Fig. 6 (F = antigeenrest, G = fibrine) toont dat t-PA, het t-PA/scu-PA hybride en in mindere mate het t-PA/tcu-PA hybride een specifieke affiniteit voor fibrine bezitten 6700013 - 13 - welke affiniteit niet wordt vertoond door scu-PA of tcu-PA.

VI.4 Lysis van plasmastolsels gemerkt met 125i_fibrine in een plasmamilieu 5

De relatieve fibrine-specificiteit van scu-PA, tcu-PA, t-PA/scu-PA, t-PA/tcu-PA en t-PA werd gemeten in een systeem dat bestaat uit humaan plasmastolsel gemerkt met 125χ_ fibrine dat is gesuspendeerd in een humaan citraat-plasma 10 (C. Zamarron et al, Thronrëu ‘Haemost. 52, 19-23, 1984).

Fibrinogeenspiegels werden gemeten met een bekende coagula-tiesnelheid-test. De relatieve stabiliteit van de plasmino-geenactivatoren in plasma werd gemeten in plasma door het plasmastolsel eerst na 4 uur voorincuberen bij 37°C van de 15 enzymen in plasma, toe te voegen. Het vrijkomen van het radio-isotoop en de fibrinogeenafbraak werden beide gemeten.

Al de geteste plasminogeenactivatoren induceerden een concentratie-afhankelijke lysis van de in humaan plasma gesuspendeerde met 125i_fibrine gelabelde stolsel (fig. 7: H = 20 lysis, I = fibrinogeenrest, J = tijd in uren). Voor tcu-PA en t-PA/tcu-PA hybride ging de lysis van het stolsel gepaard met een sterke afbraak van fibrinogeen. t-PA/scu-PA hybride had een significant hogere specifieke trombolytische aktivi-teit dan scu-PA. Voorincubatie van de plasminogeenactiva-25 toren met plasma leidde tot een inhibitie van het fibrino-lytische vermogen van tcu-PA en het t-PA/tcu-PA hybride, echter niet voor scu-PA en voor het t-PA/scu-PA hybride. Voorincubatie leidde tot fibrinogenolyse vergelijkbaar met die welke werd verkregen in aanwezigheid van het stolsel 30 (zie fig. 8, waarin Η, I en J dezelfde betekenis hebben als in fig. 7).

13 t - 14 - ψ

Lijst van gebruikte afkortingen

Mr : moleculaire massa 5 u-PA : plasminogeenactivator van het urokinase-type

tcu-PA : 2-keten u-PA

scu-PA : 1-keten u-PA

rscu-PA : recombinant scu-PA verkregen door expressie van cDNA in een zoogdiercelsysteem 10 nscu-PA : natuurlijk scu-PA gezuiverd uit humane long-adeno-carcinoom cellen (CALU-3) in geconditioneerd medium t-PA : plasminogeenactivator van het weefseltype rt-PA : recombinant t-PA verkregen door expressie van 15 cDNA in een zoogdiercelsysteem i nt-PA : natuurlijk t-PA gezuiverd uit humane melanoma (Bowes) cellen in geconditioneerd medium t-PA/u-PA : recombinant-fusie eiwit dat bevat de aminozuren Seri t/m Thr263 van t-PA en de amino-20 zuren Leul44 t/m Leu^ll van u-PA, waarbij de

Lysl58_iie159 peptidebinding ofwel intakt ofwel gesplitst is t-PA/scu-PA : t-PA/u-PA met de Lysl58-ne159 peptidebinding intakt 25 t-PA/tcu-PA ! t-PA/u-PA met de Lysl58_iie159 peptidebinding gesplitst S-2444 : pyroglutamyl-glycyl-arginine-p-nitroanilide S-2251 ï D-valyl-leucyl-lysine-p-nitroanilide D-Ile-Pro-Arg-CH2Cl: D-isoleucyl-prolyl-arginine-chloor-30 methyl-keton IU : internationale eenheden KIU : kallikreine inhibitor eenheden SDS ï natriumdodecylsulfaat PAGE : polyacrylamide-gel-elektroforese 35 DTE ï dithioerythritol DTT s dithiothreitol PEG : polyethyleenglycol 8700013 * s - 15 - ELISA : enzymgebonden-immunosorbent-test CHO cellen : ovariacellen van Chinese hamsters DHFR : dihydrofoliaatreductase BSA : runderserum albumine 5 dNTP ï desoxyribonucleoside-trifosfaat vinger ï het NH2~terminale gebied van t-PA, homoloog aan de vingervormige domeinen in fibronectine welke betrokken zijn bij zijn affiniteit voor fibrine 10 lus : door disulfidebindingen gevormde drievoudige lus die voorkomen in plasminogeen (vijf), prothombine (twee), t-PA (twee) en u-PA (een).

8700013 5 - 16 - ψ ,

Tabel

Aminozuursamenstelling van het t-PA/scu-PA hybride

Aminozuur_t-PA/ scu-PA_sequentie

Asx 47 45

Thr 31 33 10 Ser 48 48

Glx 60 52

Pro 33 27

Gly 44 44

Ala 25 28 15 Val 16 22

Met 7 8

He 16 23

Leu 35 35

Tyr 25 27 20 Phe 16 16

His 14 15

Lys 27 28

Arg 33 32 25

De waarden geven het gemiddelde van een duplo-analyse en zijn genormaliseerd op 483 dat overeenkomt met het aantal aminozuren in de sequentie (onder uitsluiting van Cys en Trp die niet bepaald zijn) 30 870 0 0 1 3

- N

- 17 -

Legenda Figuur 1 5 Nucleotide-sequentie en afgeleide aminozuursequentie coderend voor respektievelijk van de NH2-terminale aminozuren 1 t/m 263 van t-PA en de COOH-terminale aminozuren 144 t/m 411 van scu-PA.

10 Figuur 2

Fysische map voor de verschillende plasmiden die zijn gebruikt in de deletie-mutagenesis en in de bereiding van de expressievector. Dunne lijnen zijn bacteriële sequenties, open blokken geven t-PA cDNA sequenties, blokken met + zijn 15 scu-PA sequenties, zwarte blokken geven het SV40 promotor/ enhancer gebied weer, gearceerde blokken het 3'-niet-vertaalde gebied van het konijne β-globulinegen met het polyadenylatiesignaal, en de gestippelde blokken geven DHFR cDNA van muizen weer. De restrictie endonucleaseplaatsen 20 worden aangegegen door B s BglII, E : EcoRl, H : HindlII, S ï Sau3AI, Ss : Sstl.

Start en stopcodons zijn aan de bovenzijde voorzien van een lijn en codons voor aminozuren die door deletie met elkaar verbonden worden zijn weergegeven door het onderstreepte 25 aminozuur. Plasmidesecties die onderstreept zijn geven restrictiefragmenten weer die zijn gebruikt voor het vormen van M13t-PA-scu-PA, de secties die zijn weergegeven door een onderbroken lijn geven de fragmenten weer die zijn gebruikt voor het vormen van een expressieplasmide PSVt-PA/u-PADHFR.

30

Figuur 3 Behandeling van t-PA/scu-Pa met piasmine Vorming van urokinase-achtige amidolytische aktiviteit uitgedrukt in Iü/mg, gevolgd door toevoeging van piasmine tot een eindconcentratie van 30nM ( · ),♦ 60nM ( ) of 90nM 35 ( A ), aan 2,0μΜ t-PA/scu-PA hybride.

f:" 0 D 0 1 3 - 18 -

Figuur 4 Lineweaver-Burk grafieken voor de plasminogeen-aktivatie door t-PA/scu-PA (A) en door t-PA/tcu-PA (B).

Figuur 5 5 Het effekt van CNBr verteerd fibrinogeen op de aktivering (1,5μΜ) plasminogeen door t-PA/tcu-PA hybride (l,25nM).

( · ): zonder; ( A ): 0,25μΜ en ( · ): 0,50μΜ CNBr verteerd fibrinogeen.

10 Figuur 6 Binding aan fibrinestolsels

Open tekens; antigeenrest gemeten met u-PA ELISA; gesloten tekens; gemeten met t-PA ELISA.

(o); scu-PA, (Π); tcu-PA; (): t-PA; (Δ,Α); t-PA/scu-PA hybride; (7,F); t-PA/tcu-PA hybride. De concentraties van 15 met t-PA of u-PA verwant antigeen werden gemeten in de supernatant na het induceren van de stolling van fibrinogeen met thrombine.

Figuur 7 20 Lysis van humane plasmastolsels gemerkt met 125i_fikrine en gesuspendeerd in humaan plasma A; scu-PA; B: tcu-PA; C; t-PA/scu-PA; D; t-PA/tcu-PA;

E; t-PA

scu-PA ( ; 8; T: 16; 1; 24; ·; 32; *; 48; 4:64 Iü/ml) 25 tcu-PA ( ; 5; T; 10; A: 20; ·: 30; *; 40 IU/ml) t-PA/scu-PA ( : 3; y; 6; A: 9; ·: 12; *: 18; ♦; 24 IU/ml) t-PA/tcu-PA ( : 5; f; 10; A: 15; ·;20 Iü/ml) t-PA ( ; 2; ▼; 4; *: 8; ·;16 Iü/ml) 30 Figuur 8

Invloed van preïncubatie van plasminogeenactivatoren met plasma op hun fibrinolytische eigenschappen A; scu-PA; B; tcu-PA; C; t-PA/scu-PA; D; t-PA/tcu-PA scu-PA ( ·: 0; ▼; 16; ·: 32; *; 48; 4: 64 Iü/ml) 35 tcu-PA ( T; 10; A: 20; ·: 30; *: 40 Iü/ml) t-PA/scu-PA ( : 0; V: 6; A: 9; ·: 12; *: 18 Iü/ml) t-PA/tcu-PA ( *: 5; ▼: 10; A: 15; ·: 20 IU/ml) $700013

Claims

1. Plasminogeenactivator verkregen door expressie van gefuseerd cDNA dat codeert voor fragmenten van humane plasminogeenactivator van het weefseltype (t-PA) en van humane plasminogeenactivator van het urokinasetype (u-PA), geken- 5 merkt door de combinatie van de fibrine-affiniteit van t-PA met de fibrine-specificiteit van u-PA met een 1-ketenvorm (scu-PA) en/of met de enzymatische aktiviteit van u-PA met een 2-ketenvorm (tcu-PA).

2. Plasminogeenactivator volgens conclusie 1, die een 10 verbeterde fibrine-specificiteit bezit voor bloedstolsel- lyse in een plasmamilieu.

3. Plasminogeenactivator volgens conclusie 1 of 2, dat een hybride molecuul is, dat is verkregen door fusie van tenminste één gedeelte van het NH2~terminale deel van t-PA 15 met tenminste één gedeelte van het COOH-terminale deel van scu-PA.

4. Plasminogeenactivator volgens conclusie 3, samengesteld uit de NH2-terminale aminozuren 1 tot en met 263 van t-PA en gefuseerd daarmee de COOH-terminale aminozuren 144 20 tot en met 411 van scu-PA.

5. Plasminogeenactivator volgens conclusie 4, met de peptideketen zoals weergegeven in fig. 1.

6. Recombinant DNA-molecuul bevattende de coderende sequentie waarvan het translatieprodukt, een plasminogeen- 25 activator volgens conclusie 1-5 is, en een verbeterde fibrine-specificiteit bezit.

7. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 6 omvattende de coderende sequentie voor tenminste één gedeelte van het NH2~terminale deel van t-PA dat is gefuseerd met 30 tenminste één gedeelte van het COOH-terminale deel van scu-PA.

8. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 7, omvattende de coderende sequentie voor de NH2“terminale aminozuren 1 tot en met 263 van t-PA en de COOH-terminale amino- 8700013 ^ . - 20 - zuren 144 tot en met 411 van scu-PA.

9. Recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 7, met de coderende nucleotidensequentie volgens fig. 1.

10. Zoogdierexpressievector bevattende de coderende 5 DNA-sequentie volgens conclusie 6-9.

11. Getransfeeteerde zoogdiercellijn die het recombinant DNA-molecuul volgens conclusie 10 bevat.

12. Werkwijze voor het bereiden van een plasminogeen-activator volgens conclusie 1-5, waarin de plasminogeenacti- 10 vator wordt verkregen uit een kweekmedium of extract van een zoogdiercellijn volgens conclusie 11.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, waarin de plas-minogeenactivator wordt geïsoleerd uit het kweekmedium of uit het extract door chromatografie op zink-chelaat-Sepharo- i 15 se, lysine-Sepharose, SP-Sephadex, gelfiltratie benzami-dine-Sepharose, chromatografie op geïnsolubiliseerde poly-klonale of monoklonale antilichamen tegen t-PA of tegen u-PA, of combinaties daarvan.

14. Stof verkregen door expressie van gefuseerd cDNA 20 volgens conclusie 1-5, voor gebruik als een aktieve therapeutische stof.

15. Plasminogeenactivator volgens conclusie 1-5, voor gebruik als trombolytisch aktieve stof.

16. Medisch preparaat bevattende een stof verkregen 25 door expressie van gefuseerd cDNA volgens conclusie 1-5 en een farmaceutisch acceptabel excipiens.

17. Medisch preparaat met trombolytische aktiviteit bevattende een plasminogeenactivator volgens conclusie 1-5 en een farmaceutisch acceptabel inert excipiens. 30

18. Werkwijze voor het behandelen van patiënten met tromboëmbolytische ziekte waarin een intraveneuze infusie-vloeistof met een medisch preparaat volgens conclusie 16 wordt gebruikt. 8700C13