DE908409C

DE908409C - Verfahren zur Herstellung eines Antibioticums

Info

Publication number: DE908409C
Application number: DEU1449A
Authority: DE
Inventors: Herbert Edmund Carter; David Gottlieb Champaign
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1950-12-08
Filing date: 1951-12-07
Publication date: 1954-04-05

Description

Verfahren zur Herstellung eines Antibioticums Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung bzw. Isolierung eines neuen, als Endomycin bezeichneten, gegen Bakterien, Pilze und Hefen wirksamen Antibioticums.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Züchtung und Kultivierung des zur Erzeugung des neuen Antibioticums dienenden Mikroorganismus.

Fungi

Sclerotinia fructiola . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 bis 5

Torula utilis ...... ... ... *'''*»*'**''* i - 5

Endomyces magnusii ................. i - 5

Mycoderma cereviseae . . . . . . . . . . . . . . . . . i - 5

Candida albicans ..................... 5

C. guilliermondi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

Microsporium canis ................... 7,5

Endomycin wirkt in vitro germicid gegen eine große Anzahl von Bakterien und Pilzen, die im folgenden angeführt sind. Die in der Aufzählung angegebenen Zahlenwerte bedeuten die in Verdünnungseinheiten je Kubikzentimeter angegebene Menge Endomycin, welche ausreicht, um das Wachstum des betreffenden Organismus zu verhindern.

Bacterien

Bacillus subtilis ...................... 5 bis io

B.cereus ............................ i - 5

Staphlococcus aureus ................. i - 5

Corynebacterium xerose ............... i - 5

Listerella monocytogenes .............. i - 5

Erysipelothrix rhusiopathiae ........... i - 5

Brucella abortus in . . . . . . . . . . . . . . . . . . . i - 5

Fungi Trichophyton interdigitale . . . . . . . . . . . . . 25 T.rubrum ........................... 25 Microsporium audouini ...:............ 25 Rhizoctonia solani .................... 25 Glomerella cingulata .................. 25 Macrosporium sarcinaeforme .... . ..... . 25 Colletotrichum phomoides ..... . ... . .. . 25 Fusarium lycopersici, schwach.......... 25 Endomycin ist bei einem pH-Wert von 7 oder mehr leicht wasserlöslich. Bei einem pH-Wert von 4,o bis 6,o ist es fast wasserunlöslich, während es bei einem pH-Wert von 2 oder niedriger wieder leicht wasserlöslich wird. Die Wasserlöslichkeit bei einem pH-Wert von 7 wird durch die Anwesenheit von o,i bis 2,o °% Natriumchlorid oder durch die Gegenwart von Calcium- oder Magnesiumionen stark vermindert. Endomycin, das durch Zusatz von Natrium-, Calcium-oder Magnesiumionen aus Wasser gefällt wurde, löst sich nicht mehr leicht in Wasser, aber sehr leicht in 5o0/Qigem Methylalkohol. Im wasserhaltigen Butylalkohol ist es viel besser löslich als im wasserfreien. Wäßrige Lösungen von Endomycin haben ausgesprochene Netz- und Reinigungswirkung über den ganzen pH-Bereich. Wäßrige Lösungen mit pH-Werten von etwa 7,o bis io,o sind stabil, wenn sie in einem AutokIav unter Druck auf iio°C erhitzt wurden.

Der Organismus, der die neue antibiotisch wirksame Substanz produziert, wurde im Cache River Valley, Illinois, aus dem Boden isoliert. Sowohl der natürliche, im Boden gefundene als auch der durch spontane oder induzierte Mutation dargestellte Organismus gehört strukturmäßig wie auch funktionell zu der allgemeinen Gattung Streptomyces. Seine Eigenschaften, auf die später noch näher eingegangen wird, unterscheiden ihn von den in Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 6. Aufl., Williams and Wilkins, Baltimor, i948, angegebenen Arten. Der Organismus gleicht dem Streptomyces albus darin, daß er kein lösliches Pigment produziert, er unterscheidet sich aber von diesem dadurch, daß er Stärke hydrolysiert, Lakmusmilch nach der Koagulation nicht peptisiert, daß er eine saure Reaktion gibt und Gelatine nicht leicht verflüssigt, während Streptomyces albus die gegenteiligen Eigenschaften zeigt. Der neue Organismus wurde als Streptomyces endus bezeichnet.

Streptomyces endus ist typisch aerob und wächst nicht unter anaeroben Bedingungen. Wenn er in einem günstigen Medium wächst, bildet sich ein Substratmycel, das selbst keine bestimmte Eigenfarbe hat, aber die Farbe des Mediums annimmt und das aus sich ziemlich gerade verzweigenden Hyphen besteht. Am dritten Tag entwickelt sich ein weißes Luftmycel, von dem aus seiner ganzen Länge nach und im rechten Winkel dazu Sporophoren wachsen. Durch fortgesetztes Wachstum kommt es zu einer leichten Krümmung der Sporophoren, später zur Verdrehung und ausgeprägten Spiralbildung. Die Sporophore nimmt im Durchmesser zu, und ihre Teilung in Sporen beginnt. Mit dem Fortschreiten

Bacterien

B.abortus io28 ...................... = bis 5

Argobacterium tumefaciens ............ 1o

Mycobacterium tuberculosis . . . . . . . . . . . . io bis ioo

Streptococcus faecalis ................. io - ioo

Aerobacter aerogenes ................. WO

Escherichia coli ...................... ioo

Gram negative rod ................... ioo

Pseudomonas aeruginosa ....... . ...... ioo

des Wachstums dunkeln die Sporen nach, die Spirale wird sehr fest und gleicht einer gewickelten Feder, oft mit zehn Schleifen, so dicht gewickelt, daß beim Brechen der Spirale jede Windung einem Pfannkuchen ähnlich ist. Die Sporenbildung beginnt im älteren Teil der Kolonie und ist oft schon vorhanden, während der jüngere Teil um Rand wächst, so daß die weiße Oberfläche der Kolonie lichtgrau und später dunkelgrau wird. In alten Kulturen wird das Substratmycel schwarz und zerfällt. Das charakteristische makroskopische Merkmal einer Kultur von Streptomyces endus ist das Grauwerden des hlycels.

Die junge periphere Hyphe hat einen Durchmesser von o,7 bis i,oß, während die ältere Hyphe dicker ist (Durchmesser 425 bis i,5o ,u). In reifen Teilen der Kolonie findet man auch Durchmesser von 2,o lc. Die Spiralen haben im Durchmesser 3,5 bis 4,0 tc mit einem offenen Zentrum von ungefähr 1,4 ,u. Die Sporen gehen nicht leicht ab, sie haben das Bestreben, an der Spiralform zu haften.
Kohlehydrate sind als Zusatz zum alkalischen Medium nach Czapek, das keine andere Kohlenstoffquelle als Stärke, Mannose, Dextrin, Glukose, Arabinose, Maltose und Levulose besitzt, gut verwendbar. Gelatine und Asparagin können ebenfalls als Kohlenstoffquelle verwendet werden. Spärliches Wachstum erfolgt bei Zusatz von Gelaktose, Laktose, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure und Cellulose. Kein Wachstum tritt ein, wenn zum Medium Rohrzucker, Sorbitol, Dulcitol, Inositol oder Paraffin beigefügt werden.
Bei Verwendung von Czapeks Säureagar mit Stärke als Kohlenstoffquelle wird nur ein spärliches Wachstum von Streptomyces endus erzielt.
Streptomyces endus koaguliert Lakmusmilch, wobei saure Reaktion eintritt, aber ohne beobachtbare Peptonisation von Protein. Es hydrolysiert Stärke sofort, während Gelatine sehr langsam und nur wenig verflüssigt wird.
Mit der Kultur von Streptomyces endus auf Kartoffelschrägboden oder Kartoffeldextroseagar wird gutes Wachstum bei stark zunehmendem Mycel und lichtgrauer Oberfläche erzielt. Eine Kultur auf Emersonagar und Nähragar ergibt sehr gutes Wachstum mit baldiger Graufärbung und Sporulation. Bei Kulturen auf Trypton-Glucose-Agar und Norths Gelatineagar erzielt man gutes Wachstum mit weißem Luftmycel, aber keine Spiralbildung, demzufolge bleibt auch die Sporulation aus.
Streptomyces endus produziert nie lösliches Pigment, weder im natürlichen Milieu noch in chemisch definiertem Medium. Endomycin kann durch Kultivierung einer Endomycin produzierenden Art von Streptomyces endus erhalten werden, besonders unter submersen, aeroben Bedingungen in einer Nährlösung, die Kohlehydrate, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält, bei einem pH-@@'ert von etwa 6,5 bis etwa 8,5 und bei Temperaturen von etwa 2o bis etwa 3o° C. Der größere Teil des auf diese Art erhaltenen Endomycins ist mit dem Mycel verbunden, es befindet sich aber auch etwas davon in der Kulturflüssigkeit. Das Mycel kann z. B. durch Filtration von der Kulturflüssigkeit getrennt und das Antibioticum aus dem Filtrat durch Extraktion, z. B. mit Butylalkohol, wiedergewonnen werden. Das im Mvcel enthaltene Antibioticum kann, wie noch eingehender beschrieben werden wird, ebenfalls zurückgewonnen werden. Bevorzugterweise wird das die Nährflüssigkeit enthaltende Mycel vor der Filtration auf einen pH-Wert von etwa q. bis 6 angesäuert. Dadurch wird das Endomycin in der Kulturflüssigkeit unlöslich, so daß nur ein ganz kleiner Teil des -Antibioticums im Filtrat erscheint und dieses ohne nennenswerten Endomycinverlust entfernt werden kann. Zur Filtration verwendet man am besten Filter mit Diatomeenerde, wodurch ein Verstopfen des Filters durch das Mycel und damit eine starke Verminderung der Filtrationsgeschwindigkeit vermieden wird.
Das Endomycin wird aus dem Mycel enthaltenden Filterkuchen durch einen Alkohol niederen Molekulargewichtes extrahiert. Man kann wasserfreien Methyl- oder Äthylalkohol verwenden; die Propyl-und Butylalkohole sind jedoch schlechte Lösungsmittel für Endomycin, wenn sie nicht mit Wasser gemischt sind. Als Extraktionsmittel bevorzugt werden Mischungen von aliphatischen Alkoholen mit niederem Molekulargewicht und Wasser, welche 3o bis 9o °/o Alkohol und io bis 7o °/o Wasser enthalten. Die Zusammensetzung der optimalen Mischung ist von dem jeweils verwendeten Alkohol abhängig.
Nach der Extraktion des mycelhaltigen Filterkuchens wird das Extrakt unter vermindertem Druck konzentriert, bis der größte Teil des Alkohols verdampft ist. Wenn die Extraktionslösung einen hohen Alkoholgehalt hat, so muß Wasser zugegeben werden, um den Verlust während der Konzentration zu ersetzen. Das entstandene, im wesentlichen wäßrige Konzentrat von Endomycin wird mit einem Fettlösungsmittel, wie Chloroform oder Petroläther, extrahiert, um die während des Fermentationsprozesses zugesetzten Antischaummittel zu entfernen. Diese würden die folgenden Reinigungsprozesse stören und auch die therapeutische Verwendbarkeit des Endomycins beeinträchtigen. Die wäßrige Lösung oder Suspension wird mit Alkalihydroxyd, -carbonat oder -bicarbonat, z. B. mit Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Natriumcarbonat u. dgl., durch Einstellen auf einen pH-Wert von etwa 8 bis ii, vorzugsweise von 8,5 bis 9, alkalisch gemacht. Die Mischung wird dann filtriert und das geklärte Filtrat auf einen pH-Wert von 3,5 bis 5, vorzugsweise von 4,8, angesäuert, wobei Endomycin ausfällt. Das ausgefällte Endomycin wird getrocknet. Es kann weitergereinigt werden durch Extraktion des trockenen Produktes mit einem niederen, aliphatischen Alkohol, Filtrieren und Ausfällen des Endomycins durch Zusatz eines unpolaren Lösungsmittels, wie Äther, Benzol, Amylacetat, Chloroform u. dgl., wovon Amylacetat bevorzugt wird. Das ausgefällte Endomycin ist nach Sammlung und Trocknung für therapeutische Verwendung geeignet.
Die Prüfung von Endomycin in der Kulturflüssigkeit erfolgt am besten durch eine Verdünnungsreihe mit Torula utilis als Testorganismus. Gereinigte Präparate werden am besten durch die Cup-plate-Methode mit Candida albicans als Testorganismus geprüft.
Die Einheiten bei der Verdünnungsmethode werden festgelegt durch experimentelle Bestimmung jener stärksten Verdünnung einer kompletten Kulturflüssigkeit samt Mycel, die das Wachstum von Torula utilis verhindert. Auf diese Weise ist die Zahl der Verdünnungseinheiten einer Kulturflüssigkeit gleich der größten Verdünnung jener Flüssigkeit, die das Wachstum des Testorganismus verhindert.
Die Cup-plate-Methode gibt einen Vergleich zwischen der Stärke einer unbekannten Lösung und eines willkürlich festgelegten Präparats Nr. 111-30-11I mit 25 °/o Isopropylalkohol als Lösungsmittel. Das Präparat Nr. 111-30-11I wurde als Testlösung mit einer Stärke von iooo Einheiten je Milligramm willkürlich festgelegt.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung des Erfindungsgegenstandes, ohne daß dieser darauf beschränkt ist. Beispiel I Herstellung einer vegetativen Impfkultur von Streptomyces endus In mehrere 500 cm3 fassende Flaschen wurden je ioo cm3 einer Mischung folgender Zusammensetzung gegeben: Maiszucker .................... io g Rindfleischextrakt ............. io g Natriumchlorid ................ 5 g Pepton........................ 5 g Wasser (q. s.) . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 Die Flaschen mit der Mischung wurden durch 2o Minuten langes Erhitzen auf i20° C bei einem Druck von 1054,6 g;icm2 sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde jede Flasche mit Sporen einer auf Agar gewachsenen Kultur von Streptomyces endus beschickt. Die Flaschen wurden in eine hin und her gehende Schüttelvorrichtung gegeben in einem Raum, dessen Temperatur auf 2q.° C gehalten wurde. Die Schüttelvorrichtung wurde in Betrieb gesetzt und die Kultur 6 Tage wachsen gelassen. In dieser Zeit wurde sie für die Verwendung gemäß Beispiel 1I fertig.
Beispiel II Herstellung einer Impfkultur für den Fermenter In eine 18,91 fassende Flasche, die mit einem Rührer und einer Belüftungseinrichtung versehen war, nurden z21 eines Mediums folgender Zusammensetzung gegeben: Maiszucker............................ so g Brauereihefe........................... so g Fermentationssubstrat (Curbay B. G.) ... 5 g Natriumchlorid ........................ 4 g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g Wasser (q. s.) ......................... 1 1 und ein Antischaummittel, bestehend aus 30 cm3 Schweinefettöl mit 1 0,1, Stenol, einem Präparat, das im wesentlichen aus Stearylalkohol besteht. Fermentationssubstrat (Curbay B. G.) ist ein festes Konzentrat aus Melasserückständen nach deren Fermentierung und Destillation, welches Vitamine des B-G-Komplexes enthält.
Das Medium und das Antischaummittel wurden, wie im Beispiel I angegeben ist, bei 12o° C und einem Druck von 1054,6 g/cm2 in einem Autoklav sterilisiert. Das Medium wurde auf etwa 27' C gekühlt und mit einem mit einer Geschwindigkeit von 27o Umdrehungen in der Minute rotierenden Rührer bewegt. Zum Medium wurden so cm3 der nach Beispiel I erhaltenen Kultur von Streptomyces endus unter sterilen Kautelen zugesetzt. Durch die Belüftungsvorrichtung wurde Luft am Boden der Flasche in einer Menge von etwa 8 1 je Minute eingeleitet, wobei dauernd ein kleiner Druck in der Flasche aufrechterhalten wurde. Die Kultur wurde 48 Stunden lang unter diesen Bedingungen wachsen gelassen und «rar nach dieser Zeit für die Verwendung gemäß Beispiel III fertig. Beispiel III Herstellung von Endomycin Für die Herstellung von Endomycin wurde ein mit Glas ausgekleideter Tank mit 378,51 Fassungsraum verwendet. Für die Durchmischung diente ein mit Phenol-Formaldehyd-Kunststoff umkleideter Rührer mit einer Geschwindigkeit von 27o Umdrehungen in der Minute. Die Belüftung wurde durch eine Belüftungsvorrichtung besorgt mit Düsen, welche den Luftstrom gegen die Drehrichtung des Mediums richteten. Ein Strom von 84961 steriler Luft in der Stunde, bei einem Druck von 351,54 g/cm2, wurde dauernd aufrechterhalten. Zum Schutz gegen den Schaum war eine automatische Öltropfvorrichtung angeordnet, die etwa 3oo bis 40o cm3 eines schaumzerstörenden Mittels (Schweinefettöl mit 10/, Stenol) an den Tank abgab, wenn der während der Fermentation steigende Schaum mit einer Elektrode in Berührung kam.
In diesen Behälter wurden 24o 1 eines Mediums mit folgender Zusammensetzung j e Liter eingebracht Maiszucker .......................... 25,09 Brauereihefe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5 g Ammonsulfat ........................ 5,o g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8,o g Natriumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,09 primäres Kaliumphosphat . . . . . . . . . . . . . 0,49 Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7,o g Das Medium wurde im Behälter durch 2o Minuten andauerndes Erhitzen auf 12o° C bei einem Druck von 1054,6 g/cm2 sterilisiert. Nach Abkühlung wurde es mit Streptomyces endus geimpft, indem der entsprechend Beispiel II behandelte Inhalt einer z8,91 fassenden Flasche zugesetzt wurde. Die Temperatur des Mediums wurde während des Wachstums auf 24'C gehalten.
Die Kultivierungszeit und der Endomycingehalt in Verdünnungseinheiten sind aus folgender Tabelle zu entnehmen

Kultivierungszeit Endomycingelialt

End-PH-Wert Verdünnungs-

Stunden einheiten/cm3

44 6,9 Spur

64 6,7 210

88 6,5 496

112 7,3 433

136 6,8 444

Beispiel IV Isolierung und Reinigung von Endomycin Es wurde von einer Endomycin enthaltenden Mischung ausgegangen, die entsprechend Beispiel III hergestellt war, mit dem Unterschied, daß an Stelle von Natriumchlorid 4,09 Kaliumchlorid verwendet wurden. 2o51 dieser Mischung mit einem pH-Wert von 8,2 wurden durch Zugabe von 300 cm3 konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von etwa 5,5 angesäuert. In diese angesäuerte Mischung wurden 2,o kg Diatomeenerde eingerührt. Diese Suspension wurde mit Hilfe einer Platten- und Rahmenpresse filtriert. Der Filterkuchen wurde mit so 1 Wasser gewaschen, das Filtrat und die Waschflüssigkeit entfernt.
Der Mycelkuchen wurde aus der Filterpresse genommen und in einem Autoklav so Minuten lang unter einem Druck von 703 g/cm2 erhitzt. Der so behandelte Filterkuchen wurde filtriert und mit Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate (471) wurden einmal mit 121 und viermal mit je 81 Butylalkohol extrahiert. lach der Extraktion des Filtrats wurde jeder Extrakt durch den Mycelkuchen geschickt. Nach der letzten Butanolextraktion wurde der Mycelkuchen mit so 1 Wasser gewaschen, um das Butanol zu verdrängen.
Die Butanolauszüge wurden vereinigt und unter vermindertem Druck destilliert. Es ergaben sich 3800 cm3 einer wäßrigen Suspension, die ausgefroren und getrocknet wurde. Die so erhaltene feste Substanz wog 2o2 g; die Prüfung ergab eine Stärke von 500 Verdünnungseinheiten je Milligramm.
121 g dieses Materials wurden durch 2- bis 3 stündiges Schütteln in 11 Äther suspendiert. Der Äther wurde vom festen Rückstand abgetrennt und der Vorgang unter Verwendung von 11 bzw. 300 cm3 Äther wiederholt. Der so erhaltene feste Anteil wurde mit kochendem Benzol extrahiert, wobei 52,1 g eines schwach braungefärbten festen Rückstandes erhalten wurden. Dieser wurde durch kräftiges, 4- bis 5stündiges Rühren in 1,51 Wasser suspendiert, wobei sich eine trübe Emulsion bildete. Diese wurde mit Äther so lange extrahiert, bis der Ätherextrakt farblos war. Die wäßrige Emulsion wurde zentrifugiert und die sich dabei ansammelnden geringen Mengen eines weißen Niederschlages entfernt. Dann wurde die Emulsion mit Essigsäure auf einen pH-Wert von etwa 4,5 eingestellt. Beim Abstehen über Nacht setzte sich ein dunkelbraunes, gummiartiges Präcipitat ab, von welchem die darüberstehende Flüssigkeit abgegossen wurde. Das Präcipitat wurde in 68o cm3 einer etwa 0,o5 normalen Natriumhvdroxydlösung gelöst. Die so hergestellte Lösung zeigte einen pH-Wert von etwa 8,4. Nach Abtrennung des ungelösten Rückstandes wurden zur klaren Lösung 12 cm3 Eisessig zugesetzt. Der dabei entstehende Niederschlag wurde gesammelt und über gesättigter Kaliumhydroxvdlö sung und Phosphorpentoxyd getrocknet. Es wurden so 32,9 g Endomycin erhalten, die 1750 bis 2000 Verdünnungseinheiten je Milligramm, das sind insgesamt 57 557 000 Einheiten, entsprachen.
ii g dieses Materials wurden 5 Stunden hindurch mit 250 cm3 absoluten Alkohols geschüttelt. Der unlösliche Anteil wurde abgetrennt und die klare Lösung mit 8 Volumteilen Äther versetzt. Nach weiterer dreimaliger Wiederholung dieses Vorganges wurden 2,4 g Endomycin, entsprechend .I000 Verdünnungseinheiten je Milligramm, erhalten. Beispiel V Isolierung und Reinigung von Endomycin 25 1 einer 6-Tage-Kultur von Streptomyces endus mit etwa i50 Verdünnungseinheiten je kubikzentimeter wurden zur Trennung des Myceliums von der Kulturflüssigkeit dekantiert und zentrifugiert.
Das abgetrennte Mycelium wurde achtmal mit je 11 Butylalkohol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte wurden unter vermindertem Druck und unter Zusatz von Wasser bis zur Bildung eines braunen Gummis eingedampft. Dieser Rückstand wurde zweimal mit je 25o cm3 Äthyläther extrahiert. Es blieben 4,6 g einer schwach braungefärbten, pulverförmigen, festen Substanz zurück, die i3oo Verdünnungseinheiten je Milligramm ergaben.
Die in der oben angegebenen Weise abgesonderte Kulturflüssigkeit betrug 22 1. Sie wurde zweimal mit je 41 Butylalkohol extrahiert. Die Butanolextrakte wurden nach Waschen mit Wasser unter vermindertem Druck bis zur Bildung eines braunen Gummis eingedampft. Dieser Rückstand betrug nach Extraktion mit 50o cm-' siedenden Äthers 4,2 g und entsprach 50o Verdünnungseinheiten Endomycin im Milligramm. Beispiel VI Isolierung und Reinigung von Endomycin 2001 einer nach Beispiel I bereiteten 4-Tage-Kultur von Streptomyces endus, entsprechend 666 Verdünnungseinheiten Endomycin im Kubikzentimeter, wurden mit 4 kg Diatomeenerde als Filtrierhilfe gemischt. Nach Einstellen der Lösung mit Schwefelsäure auf einen PH-Wert von 4, 5 wurde filtriert. Der Mycelkuchen wurde mit 301 Wasser gewaschen, das Filtrat und das Waschwasser wurden entfernt. Der Filterkuchen wurde mit 6o 1 So°/"igem Methylalkohol und dann mit 2q.1 Methylalkohol behandelt. Die Auszüge wurden vereinigt und unter vermindertem Druck so lange destilliert, bis ein im wesentlichen wäßriges Konzentrat verblieb. Dieses wurde mit handelsüblichem Hexan zur Entfernung des Fettes und des während der Fermentation zugesetzten Antischaummittels extrahiert. Das wäßrige Konzentrat wurde dann durch Zusatz von io g Natriumbicarbonat je Liter (insgesamt i50 g) alkalisch gemacht. Die alkalisch.-Suspension wurde auf 40° C erwärmt, 2 Stunden gerührt und dann filtriert. Das klare Filtrat wurde mit Essigsäure auf einen ph-Wert von 4,8 eingestellt und über Nacht bei etwa 5° C stehengelassen. Der sich bildende Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet. Es wurden so 140 g Endomycin, entsprechend 755 Cupplate-Einheiten je Milligramm, erhalten.
13z g dieses Produktes wurden mit 1300 cm3 95°/"igem Äthylalkohol gemischt und filtriert. Zum klaren Filtrat wurden unter Rühren allmählich 650o cm3 Amylacetat zugesetzt, wobei Endomycin ausfiel.
ach Abstehen der Mischung über Nacht bei 5° C wurde der Niederschlag gesammelt und unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurden so 49,r g Endomt#cin als braunes Pulver erhalten, entsprechend 1:I80 Cup-plate-Einheiten je Milligramm.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Herstellung eines als Endomycin bezeichneten Antibioticums, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces endus unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Nährmedium gezüchtet und das sich bildende Endomycin isoliert wird.
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kultur von Streptomyces endus unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen, ein lösliches Kohlehydrat, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff und die erforderlichen Mineralsalze enthaltenden Medium bei etwa 2o bis 30° C etwa 44 bis etwa 144 Stunden wachsen gelassen wird.
3. Verfahren nach Anspruch i oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Sporen und vegetatives Mycel von Streptomyces endus in ein wäßriges Nährmedium eingeführt werden, welches eine kohlenstoffhaltige Substanz, organische oder anorganische Quellen für assimilierbaren Stickstoff und für die das Wachstum des Organismus erforderlichen Mineralsalze enthält und das Nährmedium durch die erwähnten Mikroorganismen bei Temperaturen von etwa 2o bis 35°C und einem p11-Wert von etwa 6 bis etwa 8,5 fermentiert wird, daß das wäßrige fermentierte Medium auf einen pH-Wert zwischen etwa 4. und etwa 5,5 angesäuert und das unlösliche Mycel und Endomcin von der wäßrigen Lösung abgetrennt werden.' 4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces endus bei einer Temperatur von etwa 24° C unter Belüftung in einer wäßrigen Lösung wachsen gelassen wird, die etwa 25 Teile Maiszucker, etwa 2,4 Teile trockene Brauereihefe, etwa 5 Teile Ammoniumsulfat, etwa 8 Teile Calciumcarbonat, etwa 0,
4 Teile primäres Kaliumphosphat, etwa 7 Teile Sojabohnenmehl und etwa q. Teile Natrium- oder Kaliumchlorid enthält und einen pH-Wert von etwa h bis 8,5 besitzt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche z bis q., dadurch gekennzeichnet, daß ein Endomycin enthaltendes, wäßriges, fermentiertes Medium auf einen pH-Wert zwischen etwa q. und etwa 5,5 angesäuert wird, das unlösliche Mycel und Endomycin von der wäßrigen Lösung abgetrennt werden und daraus das Endomycin mit einem r bis q. Kohlenstoffatome enthaltenden aliphatischen Alkohol extrahiert und aus der alkoholischen Lösung isoliert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Endomycin enthaltende wäßrige fermentierte Medium auf einen pn-Wert von etwa 4,8 angesäuert wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche z bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert einer Endomycin enthaltenden Lösung auf etwa 4,8 eingestellt wird, wonach das unlösliche Endomycin von der wäßrigen Lösung abgetrennt wird.