DE882138C

DE882138C - Verfahren zur Herstellung von Substanzen, die das Wachstum pathogener Mikroorganismen hemmen

Info

Publication number: DE882138C
Application number: DEA14795A
Authority: DE
Inventors: Walton Earle Grundy; Merlin Henry Peterson; Julian Eliot Philip
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1950-12-22
Filing date: 1951-12-22
Publication date: 1953-07-06

Description

Verfahren zur Herstellung von Substanzen, die das Wachstum pathogener Mikroorganismen hemmen Die Erfindung betrifft biochemische Verbindungen, insbesondere ein neues Antibioticum und dessen Herstellungsverfahren.
Die Erfindung bezieht sich auch auf das Herstellungsverfahren und die Isolierung von Substanzen, die das Wachstum pathogener Microorganismen inklusive Mycobacterius tuberculosis hemmen. Besagte Verbindungen bestehen a) aus einer Substanz mit saurem Charakter, die von Säuren gefällt wird und sich in wäßrigem Alkali löst. Diese Substanz zeigt so gut wie gar kein Diffusionsvermögen und hat ein Molgewicht von nahezu 1o ooo. Im UV-Absorptionsspektrum hat sie bei etwa 26o nu eine Spitze; sie kann weiterhin durch E I`,m von etwa 7o charakterisiert werden. Im Ultrarotgebiet zeigt sie im folgenden Frequenzbereich (aus gedrückt in cm')

100s 1282

1100 1739

1121 3390

charakteristische Absorptionsbanden; b) aus dem Alkalisalz besagter Substanz.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin darauf, in ein wäßriges Nährmedium eine Kultur von Streptomyces arenae einzuführen, das Medium anschließend zu belüften und zu bewegen. Es ist schon seit längerer Zeit bekannt, daß bestimmte Mikroorganismen beim Wachstum auf verschiedenen Nährbodentypen Antibiotica bilden. So entsteht zum Beispiel bei der Kultivierung oder Fermentierung von Penicillium notatum Penicillin, aus einer Art von Streptomyces griseus Streptomycin und aus einer Art des Streptomyces aureofaciens Aureomycin.
Der Organismus, der das Antibioticum der. vorliegenden Erfindung produziert, wurde aus einer Bodenprobe aus dem sandigen Gebiet des Illinois State Beach in der Nähe von Zion, Illinois, USA. isoliert. Er gehört zur Gattung der Streptomyces und wurde Streptomyces arenae genannt. Je nachdem., auf welchem Nährboden er gewachsen ist, hat er folgende charakteristische Eigenschaften: Trypton, Rindfleischextrakt, Hefeextrakt, Glucoseagar Gemäßigtes Wachstum, dunkelbraunes Substratmycel, weißes Mycel an der Luft, das grau wird, mit Sporen.
Pepton, Rindfleischextrakt, Glucose, Na Cl-Agar . Gemäßigtes Wachstum, goldbraunes Substratmycel, grauweißes Mycel an der Luft, das dunkel wird, mit Sporen, hellbraunes, wasserlösliches Pigment.
Hafermehlagar Üppiges Wachstum, gelbbraunes Substratmycel, das. beim Altern in ein dunkles Orangebraun übergeht, dunkelgraue Sporen, Tropfenbildung an der Oberfläche, braunes, wasserlösliches Pigment.
Gewöhnliches Agar Spärliches Wachstum, cremefarbiges Substratmycel, flaumiges, dünnes, lockeres Mycel, kein wasserlösliches Pigment.
Agar mit apfelsaurem Ca Reiches Wachstum, cremefarbiges Substratmycel, das beim Altern in ein helles Rotbraun übergeht, flaumiges, cremefarbiges Mycel an der Luft von grauer Farbe mit rosa Schimmer, hellrosa, lösliches Pigment. Das apfelsaure Ca löst sich vollständig auf.
Dextrose, Asparaginagar Spärliches Wachstum, goldbraunes Substratmycel, das einige Büschel mit weißem, luftigem Mycel und einige erhabene Kolonien mit dunkelgelbem Mycel bildet, gelbes, wasserlösliches Pigment.
Lakmusmilch Starkes Häutchen, das in 7 Tagen Lakmus reduziert, innerhalb von 25 bis 28 Tagen die Milch vollkommen verdaut, wobei sich kurz vor der vollständigen Verdauung Quark bildet; dunkelbraunes, lösliches Pigment, das innerhalb von 3o Tagen schwarz wird.
Stärkeagar Stärke hydrolysiert langsam, wobei die hydrolysierte Zone keine scharfe Grenze bildet. Nährgelatine Starkes Häutchen von grauem Mycel auf der Oberfläche, dunkles, rotbraunes, wasserlösliches Pigment, das sich mit der verflüssigten Nährgelatine mischt. Innerhalb von 22 Tagen ist die Hälfte der Nährgelatine verflüssigt.
Kartoffeloberflächen Reiches, ausgedehntes Wachstum, goldbraunes Substratmycel, das dunkelbraun wird, starke, dunkelgraue Sporen, flaumiges, lockeres Mycel; die Kartoffel wird dunkelgrau bis schwarz.
Nitratagar Test auf Nitratanhäufung verläuft negativ. Kliglers Eisenagar Mäßiges Wachstum von dunkelgrauem Mycel, Bildung von H2 S.
Czapeks synthetisches Agar Üppiges Wachstum, sehr runzliges, rissiges Agär, gelbes Substratmycel, das beim Altern eine dunkle, orangebraune Färbung annimmt, grauweißes Mycel an der Luft, helles, gelbbraunes, lösliches Pigment. Beschreibung der Kolonie (gewachsen auf dem erstgenannten Medium) Kolonien mittlerer Größe, braunes Substratmycel, hellgraues Mycel an der Luft, bernsteinfarbige Tröpfchen auf der Oberfläche der Kolonie, dunkelbraunes, lösliches Pigment. Bei dem Wachstum der Kolonie bildet sich zunächst im Mittelpunkt der Kolonie eine kleine Vertiefung mit vier vertieften, radial ausstrahlenden Linien, die die. Kolonie in vier Teile teilen. Bei fortschreitendem Wachstum wird die Kolonie durch die gleichen vertieften Linien in acht Sektoren geteilt, wobei der Mittelpunkt eine kleine Erhöhung bildet.
Folgende Kohlenstofflieferanten unterhalten gutes Wachstum: Xylose, Glucose, Mannose, Galactose, Lactose, Maltose, Saccharose, Stärke, Mannit, Glycerin, Natriumacetat, Natriumcitrat und Seignettesalz. Sorbit und Calciumlactat werden nicht als Kohlenstofflieferanten benutzt. Außerdem unterstützen folgende Stickstofflieferanten das Wachstum: NaN03, (N H4)2HP04, Harnstoff, Asparagin, Tryptophan und Arginin. Tyrosin fördert dagegen das Wachstum von Streptomyces arenae nicht.
Die Kulturen bilden auf einer großen Anzahl von Nährmedien Sporen. Die stärkste Sporenbildung wurde auf Hafermehlagar, Kartoffeloberflächen und Agar mit apfelsaurem Calcium beobachtet. Das sporenbildende Mycel ist grau gefärbt. Die Sporen, die in reichem Maße bei der Teilung des Mycels an der Luft entstehen, sind rund bis oval und werden in langen Ketten in dichten Spiralen gebildet. Das Mycel ist durch monopodiale Verzweigungen charakterisiert, deren sporenbildende Spitzen in dichten Spiralen endigen. Das luftige Mycel, das keine Sporen bildet, ist zwar auch verzweigt, bildet aber keine Spiralen. Wird der Organismus in einem flüssigen Nährmedium, das sich bei 24 bis 26° C auf einer Rotationsschüttelapparatur befindet, bebrütet, so wächst es in Form von sehr kleinen Kügelchen oder unregelmäßigem Granulat und produziert ein dunkles, orangebraunes, wasserlösliches Pigment. Das auf diesem Wege entstandene Antibioticum löst sich in Wasser und hemmt Mikroorganismen in der gleichen Weise wie die Kulturen von Agarplatten.
Da das Antibioticum so gut wie gar kein Diffusionsvermögen besitzt, wurde eine nephelometrische Bestimmungsmethode entwickelt. Als Standardsubstanz diente eine partiell gereinigte und getrocknete Probe des Antibioticums, der ein bestimmter Wert in Agarverdünnungseinheiten zugeteilt wurde.
Es wurden Ausbeuten bis zu 320 Verdünnungseinheiten nach der Agarverdünnungsmethode erhalten, wobei Mycobacterium tuberculosis A.T.C.C. 607 als Testorganismus verwendet wurde.
In folgendem Beispiel werden die Bedingungen beschrieben, unter denen der Mikroorganismus unter Schütteln in einer Kultur wächst und das Antibioticum bildet.
Beispiel I 5oo ccm Erlenmeyer werden mit je 15o ccm eines Nährmediums folgender Zusammensetzung beschickt: Sojabohnenmehl .................. 15 g NaCl ............................ 59 Glucose ......................... 15 g CaC03 .......................... I g Destilliertes Wasser ... ... . .. . ... . . looo ccm.
Die Erlenmeyer werden mit Baumwolle zugestopft, in einem Autoklav bei IM' C 30 Minuten sterilisiert, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 1 ccm einer Sporensuspension von Streptomyces arenae beimpft. Dazu verwendet man Sporen von Agarflächen, die in 2 bis 5 ccm sterilen Wassers suspendiert sind. Danach setzt man die Erlenmeyer bei 24 bis 26° C auf eine Rotationsschüttelapparatur mit 22o bis 240 Umdr./Min. und 5,7 mm Hub. Nach 48 Stunden werden 6 ccm dieser Kultur in Erlenmeyer mit frischem Nährmedium der gleichen Zusammensetzung übertragen und dieser Erlenmeyer während 48 Stunden in der gleichen Weise bebrütet.
5oo ccm Erlenmeyer werden mit je 125 ccm eines Nährmediums folgender Zusammensetzung beschickt: Hefe ........................... 2 g Maiseinweichwasser (feucht) ...... 1o g Glucose ........................ 25 g Sojabohnenmehl ................. 159 NaCI ........................... 39 NH,N 03 ....................... I g CaC03 ......................... 2 g Leitungswasser . . . . . . .. . . .. . . . . . . looo ccm.
30 Minuten im Autoklav bei I21° C sterilisiert, abgekühlt und mit je 5 ccm der zweiten 48-Stunden-Kultur (vgl. oben) aasgeimpft. Die Erlenmeyer werden auf eine Rotationsschüttelapparatur gestellt und bei z4 bis 26° C bebrütet. Vom dritten Tage an werden täglich Proben entnommen und auf antibiotische Wirksamkeit geprüft. Die antibiotische Wirksamkeit wird mit Mycobacterium tuberculosis A. T. C. C. 607 als Testorganismus und in Agarverdünnungseinheiten gemessen. Die Ergebnisse gehen aus der folgenden Tabelle hervor:

Bebrütungszeit Antibiotische Wirksamkeit

in Tagen in Einheiten,'ccm

3 715

4 40

5 140

6 240

7 320

Die Fermentierungen wurden in I,5-cbm-Tanks nach dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren ausgeführt. Sie ergaben Ausbauten von 5oo bis über looo Einheiten je Kubikzentimeter.
Beispiel II Isolierung des Antibioticums Die Fermentierungsflüssigkeit aus den großen Fermentern (vgl. oben) wird zunächst filtriert und das feuchte, unlösliche Mycel bei neutralem pH mit Äthanol extrahiert. Die erste Extraktion kann auch in einem PH-Bereich von 4 bis 1o mit anderen organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Aceton, Butanol und tert.-Butanol, vorgenommen werden. In früheren Untersuchungen verblieb die aktive Substanz nach Abtrennen des Mycels im Filtrat, aus dem sie mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert werden konnte. Jetzt sind jedoch go bis 95°/p der aktiven Substanz in irgendeiner Form an das Mycel gebunden; daher filtriert man vorteilhafterweise das Mycel vor der Extraktion ab. Man kann jedoch auch die gesamte Fermentierungsflüssigkeit mitsamt dem Mycel mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. Butanol, extrahieren und den Extrakt, wie unten beschrieben, auf das Antibioticum aufarbeiten.
Dieser Extrakt aus einem wasserhaltigen, organischen Lösungsmittel wird zu einer wäßrigen Lösung eingeengt, die ihrerseits in dem PH-Bereich von 2 bis 1o mit C H C13 extrahiert wird.
Dieser C H C13 Extrakt wird dann an wasserfreiem Kieselsäuregel als Adsorber chromatographiert. Dabei genügen 4,5 kg Kieselsäuregel, um 2 kg Wirksubstanz in 41 CHC13 gelöst, mit einer Aktivität von 5oo Einheiten je Milligramm zu adsorbieren. Anschließend fraktioniert man das Kieselsäuregel mit CHC13, das einen steigenden Prozentsatz an Methanol enthält, wobei der größte Teil der unerwünschten Nebenprodukte am Kieselsäuregel haftenbleibt und nur einige vor dem Antibioticum in die C H C13 Methanol-Fraktionen gehen. Diese C H Cl,-Methanol-Fraktionen werden dann zur Trockne eingedampft, wobei man einen antibiotisch wirksamen Rückstand mit 2ooo bis 5ooo Einheiten je Milligramm erhält. Die Einheiten werden nach der Agarverdünnungsmethode mit Mycobacterium tuberculosis 607 als Testorganismus bestimmt. Bei Wiederholen dieser chromatographischen BehandlungmiteinemAdsorptionsmittel,wieMg-Silicat, kann ein Präparat erhalten werden, das eine Aktivität von 5ooo bis ioooo Agarverdünnungseinheiten je Kubikzentimeter besitzt.
An Stelle von Kieselsäuregel kann man auch Aktivkohle zur Adsorption des Antibioticums aus dem C H C13 Ektrakt benutzen. In diesem Falle wird das Antibioticum durch Elution mit einer Methanol-(8o°/o)-CHC13(zo°/a)-Mischung, die o,i n-HCl enthält, aus der Aktivkohle gewonnen. Handelsübliches Kieselsäuregel ist dafür ungeeignet. Durch orientierende Untersuchungen kann man jedoch schnell feststellen, welche Gele sich für die gewünschte selektive Adsorption eignen.
Gegenwärtig wird folgende Extraktionsmethode bevorzugt: Das Mycel wird mit einem 5o- bis 8o°/oigen, niederen, aliphatischen Alkohol, wie z. B. Äthanol, extrahiert, der Extrakt so weit eingeengt, daß eine wäßrige Lösung verbleibt, die anschließend bei pH 2 bis 4 mit Butanol extrahiert wird. Das aktive Material wird danach bei pH Zo in Wasser reextrahiert. Zur weiteren Reinigung kann die aktive Substanz bei niederem pH in Butanol und bei hohem pH in Wasser reextrahiert werden.
Bei dieser gegenläufigen Verteilung zwischen Wasser und Butanol hat es sich gezeigt, daß die antibiotische Mischung zwei verschiedene Komponenten enthält. Davon ist die eine bei neutralem pH mehr in Butanol, die andere mehr in Wasser löslich. Diese beiden Komponenten können durch Extraktion mit Lösungsmitteln voneinander getrennt werden. Tests zeigen, daß beide Fraktionen sowohl gegenüber dem Mycobacterium tuberculosis wie auch gegenüber dem Staphylococcus aureus wirksam sind.
Die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene -antibiotische Substanz ist nicht ganz rein und scheint aus einer Mischung der beiden Komponenten zu bestehen. Das Antibioticum besitzt eine Aktivität von etwa 5ooo bis zu io ooo Agarverdünnungseinheiten j e Milligramm, d. h. im Agar müssen etwa o,i y/ccm vorhanden sein, um das Wachstum von Mycobacterium tuberculosis, wie oben beschrieben, zu hemmen. Sie kann in unreiner Form verwendet werden. Sie ist in rohem Zustand bei gleichem Gewicht zwei- bis fünfmal so wirksam wie Streptomycin, wenn der Test nach der Agar- oder Nährmedium-(broth)-verdünnungsmethode ausgeführt wird.

Die neue antibiotische Substanz hat saure Eigenschaften; sie löst sich in verdünntem Alkali, bildet zum Beispiel mit wäßrigem Alkalihydroxyd Alkalimetallsalze, wie das Na-Salz, und wird beimAnsäuern ausgefällt. Die Alkalimetallsalze sind löslich. Andere Salze, wie das Cu-, Ca-, lVIg- und Pb-Salz, sind unlöslich und können zur Reinigung des Antibioticums verwendet werden. Es gibt nicht die für die Proteine charakteristische Biuret=Reaktion. Das Antibioticum diffundiert nicht durch eine Membran von regenerierter Cellulose und hat nach osmotischen Messungen ein Molgewicht in der Größenordnung von ioooo. Es gehört zu den Antibiotica, die keine Inhibitionszone geben, wenn sie nach der Plättchenmethode getestet werden, die bei Substanzen mit niederem Molgewicht, wie Streptomycin, Penicillin u. a., angewandt wird. Folgende Tabelle zeigt sein antibacterielles Wirkungsspektrum

Einheiten des

Antibioticums

Organismus ccm von Agar,

die zur Hemmung

erforderlich

Staphylococcus albus ......... 20

Staphylococcus aureus ........ 20 .

Escherichia coli .............. > 640

Bacillus subtilis .... . ...... . . 40

Pseudomonas fluorescens ...... > 640

Serratia maroescens ... . ...... > 640

Aerobacter aerogens .......... > 640

Proteus vulgaris ............. > 640

Bacillus mycoides .... . ... ... . 2,5

Streptococcus fecalis ......... 40

Monila albicans . . . . . . . . . . . . . . > 640

Eberthella typhosa . . . . . . . . . . . > 640

Salmonella paratyphi . . . . . . . . . > 640

Salmonella schottmuelleri ..... > 64o

Shigella dysenteriae . . . . . . . . . . > 640

Klebsiella pneumoniae . . . . . . . . > 640

Neisseria catarrhalis . . . . . . . . . . > 640

Streptococcus pyogenes ....... 40

Brucella äbortus ............. 640

Corynebacterium diphtheriae... 10

Hemophilus pertussis . . . . . . . . . > 640

Brucella bronchiseptica ....... > 640

Mycobacterium tuberculosis ... o,63

Mycobacterium phlei ......... o,63

Bacillus bodenheimer . . . . . . . . . > 640

Staphylococcus aureus, Strepto-

mycin resistent . . .. . . . . . . . . 10

Staphylococcus aureus, Strepto-

thricin resistent . . . . . .. . . . . . 20

Das Ultraviolettspektrum zeigt bei etwa 26o mit eine charakteristische Spitze, die mit der antibiotischen Wirksamkeit gekoppelt zu sein scheint, da sie in allen nach der obigen Vorschrift hergestellten Verbindungen vorhanden ist. Die antibiotischen Verbindungen mit hoher Wirksamkeit zeigen auch ein E jI,m von etwa 7o. .

Das Ultrarotabsorptionsspektrum des Antibioticums der vorliegenden Erfindung ist beiliegender Tabelle zu entnehmen. Die charakteristischen Absorptionsbanden der in einem Kohlenwasserstofföl suspendierten Substanz liegen im Ultrarotgebiet bei folgenden Frequenzen (in cm-'): ioo8 ............. 1282 1100 ............. 1739 1121 - ............ 3390 Infolge seines hohen Molgewichts zeigt das Antibioticum keinen definierten Schmelzpunkt. Es wird bei etwa 17o° C dunkler und verkohlt etwas über 2oo° C. Auf Grund seiner sauren Natur wird es von Anionenaustauschern adsorbiert und kann von ihnen wieder eluiert werden. -Untersuchungen haben ergeben, daß die Substanzen C, H, etwas N, weniger als i°/, S und gar kein P enthalten.
Elektrophoretische Untersuchungen haben ergeben, daß das Antibioticum der vorliegenden Erfindung negativ geladen ist. Nach dem Anthrontest enthält es im gegenwärtigen Reinheitsstadium beträchtliche Mengen an Kohlehydraten. Fügt man wäßriges Pb-Acetat zu der wäßrigen Lösung des Antibioticums mit 30000 Einheiten je Kubikzentimeter, so bildet sich ein Niederschlag mit etwa 99,6°;r, Aktivität. Die restliche Flüssigkeit zeigt nur 15 Einheiten je Kubikzentimeter. Die Aktivität kann durch Zugabe von H. S oder H, S 04 in einem Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol, n-Butanol, tert.-Butanol, denaturiertem Äthanol usw., wiedergewonnen werden.
Man kann die Erfindung unter veränderten Bedingungen leicht in der Praxis anwenden, wobei man die eine oder andere neu entdeckte Methode oder eine gleichwertige übernimmt,

Claims

PATEN TAN SPP C. CHE: i. Verfahren zur Herstellung von das Wachstum pathogener Mikroorganismen unter Einschluß des My cobacterium tuberculosia hemmenden Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß ein wäßriges Nährmedium mit einer Kultur von Streptomyces arenae geimpft, die Flüssigkeit belüftet und geschüttelt wird und nach Bildung des Antibioticums eine Substanz isoliert wird, deren eine Komponente sauren Charakter hat, mit Säuren fällbar ist und sich in wäßrigem Alkali löst, ein verhältnismäßig geringes Diffusionsvermögen besitzt und ein Molekulargewicht von nahezu ioooo besitzt, die im ultravioletten Licht bei 26o mcc und weiterhin durch E ,`en; auf etwa 7o charakterisiert ist und die im Ultrarotgebiet bei folgenden Frequenzen (in cm-'): I,08 .......... 1282 1100 .......... 1739 1121 .......... 3390 als Suspension in einem Kohlenwasserstofföl charakteristische Absorptionsbanden zeigt, während die andere Komponente das Alkalisalz der sauren Komponente darstellt.
2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch gekennzeichnet, daß ein wäßriges Nährmedium mit einer Kultur von Streptomyces arenae geimpft wird und das Antibioticum nach einer aeroben Fermentierung bei 24 bis 26° aus der Fermentationsflüssigkeit isoliert wird.
3. Verfahren nach Anspruch i oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentierung während wenigstens 48 Stunden durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch i bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation in Gegenwart einer von Streptomyces arenae verwertbaren Kohlenstoffquelle und Stickstoffquelle durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium Sojabohnenmehl und eine Quelle von dem Organismus assimilierbare Mineralstoffe enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium Sojabohnenmehl und Glucose enthält.
7. Verfahren nach Anspruch i' bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation in Gegenwart von CaCO3 ausgeführt wird. B.
Verfahren nach Anspruch* i bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibioticum aus dem gebildeten Mycel mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Äthanol, extrahiert wird, der sich eine Extraktion in Wasser, eine Extraktion in C H Cl, oder n-Butanol, eine chromatographische Adsorption mit nachfolgender Elution anschließen.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur chromatographischen Adsorption wasserfreies Kieselsäuregel und zur Elution eine Mischung von C H C13 und Methanol verwendet werden. io. Verfahren nach Anspruch i bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibioticum aus dem gebildeten Mycel mit 5o- bis 8o°/,igem Äthanol extrahiert, das Äthanol verdampft, die zurückbleibende wäßrige Lösung zunächst bei px 2 bis 4 mit Butanol extrahiert und dann bei pz; io in Wasser reextrahiert wird.