DE2344780A1 - Antibiotikum xk-49-1-b-2, verfahren zu seiner herstellung auf mikrobiologischem wege und arzneipraeparate - Google Patents

Description

Antibiotikum XK-49-1-B-2, Verfahren zu seiner Herstellung auf mikrobiologischem Wege und Arzneipräparate

Priorität: 7. September 1972, Japan, Nr. 89085/72

Die Erfindung betrifft das neue Antibiotikum XK-49-1-B-2, ein Verfahren zu seiner Herstellung auf mikrobiologischem Wege und Arzneipräparate.

Das Hydrochlorid des Antibiotikums XK-49-1-B-2 ist durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet:

(a) Elementaranalyse: C = 32,13 %, N = 14,20 %, H = 6,34 %

und Cu = 3,4 %r

(b) UV-Spektrum (Wasser): im wesentlichen gemäß Fig. 1 mit

Absorptionsmaxima bei 244 und 293 mu?

(c) IR-Spektrum: im wesentlichen gemäß Fig. 2 mit Hauptbanden

bei folgenden Wellenzahlen (cm ): 3400, 3200 (sh),'295O, 1720, 1655, 1635, 1580 bis 1550, 1520 bis 1510 (sh), 1460, 1250, 1050, 1010, 980 (sh);

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"² - 234A780

(d) Verhältnis der UV-Absorption (Wasser) 244/293 ΐηι: 1,34;

(e) Farbreaktion: positive Sakaguchi-, Pauli- und Ehrlich-

Reaktionen, negative Ninhydrinreaktion;

(f) Papierchromatographie: R_f-Werte gemäß Tabelle I;

(g) Dünnschichtchromatographie an Kieselgel: R^-Werte gemäß

Tabelle II.

Das Antibiotikum XK-49-1-B-2 ist wasserlöslich und reagiert alkalisch. Daher betrifft die Erfindung auch die Salze des Antibiotikums mit Säuren, insbesondere das Hydrochlorid.

Das Hydrochlorid XK-49-1-B-2 ist leicht bläulich oder grünlich gefärbt und gut wasserlöslich. Es ist löslich in Methanol, schwach löslich in Äthanol und fast unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Butanol, Essigsäureäthylester, Essigsäurebutylester, Diäthylather und Benzol. Es weist keinen definierten Schmelz- oder Zersetzungspunkt auf, sondern zersetzt sich bei Temperaturen über 190 C allmählich. Das in Fig. abgebildete UV-Spektrum ist in Wasser, 0,1 η Salzsäure und 0,ln Natronlauge aufgenommen. Das in Fig. 2 abgebildete IR-Spektrum ist die Aufnahme eines KBr-Preßlings.

Außer den vorgenannten Farbreaktionen zeigt das Plydrochlorid von XK-49-1-B-2 eine schwache Reaktion beim Farbtest mit Kaliumpermangat. Die R^-Werte dieses Hydrochlorids sind in Tabelle I zusammengestellt.

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Tabelle I

Rf-Werte des Hy<3 roch lor ids von XK-49-1-B-2 bei aufsteigender Papierchromatographie:

Laufmittel	Rf-Wert	Laufzeit, Std.
20 % (Gew./Vol.) Ammoniumchlorid 10 % (Gew./Vol.) Ammoniumchlorid 1 /o (Gew./Vol.) Ammoniumchlorid 0,5 %(Gew./Vol.) Ammoniumchlorid mit Wasser gesättigtes n-Butanol n-Butanol-Essigsäure-Wasser (3:1:1 Volumverhältnis) mit Wasser gesättigter Essigsäure- äthylester mit Wasser gesättigtes n-Butanol mit 2 % (Gew./Vol.) p-Toluolsulfon- säure und 2 % (Vol./Vol.) Piperidin	0,75 0,72 0,40 0,15 0,00 0,08 0,00 0,02	3 3 3 3 ' 15 15 4 15

Im folgenden wird das Antibiotikum der Erfindung mit bekannten Antibiotika verglichen. Bisher.sind keine wasserlöslichen, basisch reagierenden Antibiotika bekannt, die von Mikroorganismen der Gattung Streptosporangium gebildet werden. Aus den vorstehenden Ausführungen geht hervor, daß XK-49-1-B-2 wasserlöslich ist, basisch reagiert, Amidbindungen aufweist, Kupfer enthält und UV-Absorptionsmaxima bei 244 und 293 mu aufweist. Es sind bisher folgende Antibiotika mit diesen Eigenschaften bekannt: Phleomycin (vgl. T. Ikekawa et al., J. Antibiotics, Ser.Al7, (1964), S. 194), Bleomycin (vgl. H. Umezawa et al., J. Antibiotics Ser.Al9 (1966), S. 200; H. Umezawa et al., J. Antibiotics Ser. A19 (1966), S. 210 und US-PS 3 681 491), Zorbamycin, Zorbonomycin B, Zorbonomycin C (vgl. A.D. Argoudelis et al., L_ J. Antibiotics, Bd. 24 (1971), S. 543), YA56-X und YA56-Y ^

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(vgl. Y. Ito et al., J. Antibiotics, Bd. 24 (1971), S. 727). Wie bereits erwähnt, beträgt das Verhältnis der XJV-Absorption 244/293 bei XK-49-1-B-2 1,34, während dieses Verhältnis bei Phleomycin, Zorbamycin, Zorbonomycin C, YA45-X und YA56-Y 2,89, 2,91, 2,77, 2,78 bzw. 2,85 beträgt. Das Antibiotikum der Erfindung unterscheidet sich also darin von den vorgenannten bekannten Antibiotika. Die entsprechenden Absorptionsverhältnisse für Bleomycin und Zorbonomycin B betragen 1,1 bis 1,3 bzw. 1,21. In dieser Beziehung ist das Antibiotikum der Erfindung diesen beiden Antibiotika ähnlich. Bekanntlich gibt es von Bleomycin die Komponenten A^, A^, A.,, A^, Aj-/ Ag, B,, B2, B~, B^ und B₅. Bei der Sakaguchi-Reaktion reagieren XK-49-1-B-2- und die Bleomycin-B-Komponenten positiv, während alle A-Komponenten von Bleomycin negativ reagieren. Außerdem gibt XK-49-1-B-2 eine negative Ninhydrin-Reaktion, während Bleomycin A^, A₅ und A^ positiv reagieren. Das Antibiotikum der Erfindung unterscheidet sich also in dieser Beziehung von den genannten Bleomycin A-Komponenten.

In Tabelle II sind die R_f-Werte von XK-49-1-B-2 bei Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter verwendung von verschiedenen Laufmitteln mit den entsprechenden Werten von Bleomycin A₂, A₅, B„ und B. sowie von Zorbonomycin B verglichen.

L _J

U 0 9 8 1 1 / 1 1 7 4

Tabelle II

	1	Rf-Wert	2	3	4
	0,20	0,75	0,35	0,40
	0,28	0,46	0,55	0,08
	0,05	0,60	0,25	0,08
	0,54	0,80	0,70	0,10
	0,14	0,75	0,68	0,10
	0,05	0,77	0,83	0,25
Substanz ^^"""^^-^
XK-49-1-B-2
Bleomycin A?
Bleomycin A5
Bleomycin B3
Bleomycin B4
Zorbonomycin B

Laufmittel 1: obere Phase eines Gemisches aus Chloroform,

Methanol und 17prozentigem wässrigem Ammoniak (2:1:1 Volurateile)

2: Gemisch aus einer lOprozentigen Ammoniumacetatlösung und Methanol (1:1 Volumteile)

3: Gemisch avxs Methanol, einer lOprozentigen

Ammoniumacetatlösung und lOprozentigem wässrigem Ammoniak (10:9:1 Volumteile)

4: 0,05 m Citronensäurepuffer vom pH-Wert 6,5

Aus Tabelle II geht hervor, daß sich das Antibiotikum der Erfindung von Bleomycin B₃ und Zorbonomycin B in den R_f-Werten

bei Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unterscheiden. Außerdem geht aus dieser Tabelle hervor, daß XK-49-1-B-2 den gleichen R^-Wert wie Bleomycin B* bei Verwendung eines Gemisches aus einer lOprozentigen Ammoniumacetatlösung und Methanol (1:1) als Laufmittel aufweist. Aus der US-PS 3 681 491 ist es bekannt, daß die R_f-Werte von Bleomycin B,, B₃ und B₅ bei der Dünnschichtchromatographie mit dem gleichen Lösungsmittelsystem, d.h. einem Gemisch aus einer lOprozentigen Ammoniumacetatlösung

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sich
und Methanol (1:1),/vom entsprechenden Wert von B₄ unterscheiden.

Der Rjr-Wert von B^ beträgt 0,50, während die entsprechenden Werte von B,, B₃ und B₁- 0,15, 0,68 bsw. 0,52 betragen. Daraus ergibt sich ein Unterschied des Antibiotikums der Erfindung von Bleomycin B,, B^ und B₁-.

Aus den vorstehenden Ausführungen geht hervor, daß das Antibiotikum XK-49-1-B-2 neu ist und sich von den vorgenannten Antibiotika deutlich unterscheidet.

Das Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums XK-49-1-B-2 auf mikrobiologischem Wege ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Streptosporangium, der zur Bildung von XK-49-1-B-2 fähig ist, in einem Nährmedium züchtet, das Antibiotikum XK-49-1-B-2 in der Gärmaische anreichert und anschließend daraus gewinnt.

Als besonders geeignet hat sich die Art Streptosporangium violaceochromogenes erwiesen. Der typische Stamn Streptosporangium violaceochromogenes I-K-49 wurde aus einer Bodenprobe aus dem Sumpf gebiet in Yoshioka-rnura, Kitagunma-gun, Gunma-ken, Japan, isoliert. Dieser Stamm wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, unter der Nummer 21807 hinterlegt. Dieser Stamm hat die folgenden Eigenschaften: I. Morphologische Eigenschaften;

Gutentwickeltes Substratmycel, verzweigt, Durchmesser 0,4 bis 0,8 u,
Luftmycel septiert, 0,6 bis 0,8 u Durchmesser, gerade mit ein-

L_ fachen Verzweigungen. _j

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Es wird praktisch keine Bildung von schleifen- oder spiralförmigem Luftmycel beobachtet. Es bilden sich reichlich kugelförmige Sporangien auf dem Luftmycel. Die Sporangien haben einen Durchmesser von 4 bis 9 u. Die Sporangxophoren sind länglich geformt und weisen eine Länge von 15 bis 30 u und einen Durchmesser von etwa 0,6 bis 0,8 ρ auf.

Die Sporangiosporen sind spiralförmig in den Sporangien angeordnet. Sie sind oval oder zylindrisch geformt, v/eisen eine Größe von 0,8-0,9p χ 1,2-1,Sp auf. Sie haben eine glatte Oberfläche, v/eisen keine Geißeln auf und sind nicht beweglich.

II. Züchtuncfseigenschaften auf verschiedenen Nährmedien Das Wachstum auf natürlichen Nährmedien ist im allgemeinen sehr gut. Das Substratmycel ist goldfarben und das Luftmycel weiß bis rosa-weiß. Auf einem /^gar-Medium bildet sich tief rötlich-violettes Pigment. Das Wachstum auf synthetischen Medien ist gering, wobei sich reichlich Luftmycel in pulvriger Form bildet.

Die Züchtungseigenschaften auf verschiedenen allgemein verwendeten Nährmedien nach einer zweiwöchigen Züchtung bei 27°C sind in Tabelle III zusammengestellt. Die Farbangaben entsprechen der Einteilung in "Color Harmony Manual" (Container Corporation of America).

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Tabelle III Züchtungseigenschaften auf verschiedenen Nährmedien

Medium	Substratmycel	Luftmycel	lösliches Pigment
Czapek-Ägar	W: gering F: farblos	W: mäßig, pulvrig F: muschel- rosa (5ba)	keines
Glucose-. Asparagin-Ägar	W: gering F: farblos	W: mäßig, pulvrig F: muschel- rosa (5ba)	keines
Nähragar	W: gut F: orange farben (41a)	W: gut F: v.'eiß (a)	F: himbeer farben (9nc)
J3i-Albumin- Agar	Vi: gering F: farblos	W: mäßig, pulvrig F: muschel- rosa (5ba)	keines
Stärke-7\gar	W: gering F: farblos	W: gering F: muschel- rosa (5ba)	keines
Hefeextrakt- Malzextrakt- Agar	W: mäßig F: goldfarben (21c) .	W: gering F: weiß (a)	keines
Hafermehl-Agar	W: mäßig F: goldfarben (21c)	W: gut F: muschel- rosa (5ba)	C: schrnutzig- gelb (l«l/2gc)
Glycerin- Asparagin-Agar	W: gering F: kolonial gelb, mais gelb (2ga)	W: gering F: weiß (a)	keines
Bennett-Agar	W: gut F: melonen gelb (3ga)	W: gut F: weiß (a) pfir- sichrosa (5ea)	C: himbeer- farben (9nc)

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234Α780

Emerson-Agar

W: gut

F: bernsteinfarben (3nc)

W: gut

F: weiß (a)

C: himbeer· farben (9nc)

Glucose-Hefeextrekt-Agar

W: gut

F: kolonialgelb, maisgelb (2ga)

W: gut

F: weiß (a)

keines

Pepton-Eisen-Agar

W: gering

F: senf-goldfarben (2ne)

W: gering F: weiß (a)

keines

Tyrosin-Agar

W: gering F: kolonialgelb

maisgelb (2ga)

W: mäßig, pulvrig

F: muschelrosa (5ba)

keines

W: Wachstum
F: Farbe

III.Verwertung von Kohlenstoffquellen:

Die Verwertung von Kohlenstoffquellen ergibt sich aus Tabelle IV,

Tabelle IV Verwertung von Kohlenstoffquellen

Kohlenstoffquelle	Verwertung	Kohlenstoffquelle	Verwertung
D-Arabinose	-	D-Mannit	-
D-Galactose	+	D-Mannose	++
D-Glucose	++	D-Raffinose	-
Glycerol	+	L-Rhamnose	-
D-Lactose	-	" Stärke	++
D-Fructose	++	D-Xylose	+
D-Inosit	+	Saccharose	+

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- 10 - "1

IV. Physiologische Eigenschaften;

(1) Wachsturasbedingungen;

Das Wachstum ist gut unter aeroben Bedingungen. Die Wachsturastemperatur beträgt 25 bis 4O°C mit einem Teraperaturoptimum bei 30 bis 37 C. Der genannte Stamm wächst in einem pH-Bereich von 6,0 bis 8,5 bei einem pH-Optimum um 7,3.

(2) Verflüssigung von Gelatine:

Bei einer Stichkultur wird keine Verflüssigung von Gelatine beobachtet (2 Wochen bei 27 C) . Es tritt aber eine leichte Verflüssigung nach einer längeren Züchtungsdauer auf.

(3) Wirkung auf Milch:

Das Wachstum ist gering,und es tritt nach zweiwöchiger Züchtung bei 27 C keine Änderung ein. Nach einer Züchtung von etwa einem Monat wird Koagulation und Heptonisierung beobachtet.

(4) Zersetr.ung von Cellulose: negativ

(5) Stärkehvdrolvse: positiv

(6) Reduktion von Uitrat: positiv

(7) Bildung von Tyrosinase: negativ

(8) Chromoqene Wirkung: negativ

Der Stamm MK-49 bildet auf einem Agar-I-Iedium kugelförmige Sporangien am Luftmycel. Die Sporangiosporen bilden keine Geißeln und sind nicht beweglich. Eine reichliche Anzahl von Sporangiosporen ist innerhalb eines Sporangiums spiralenförmig miteinander verbunden.

Aufgrund dieser morphologischen Eigenschaften wird der Stamm

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" ⁿ - 23U780

MK-49 als sporangienbildender Actinomycet, insbesondere als Stamm der Gattung Streptosporangium eingeordnet. Es sind etwa 20 Arten der Gattung Streptosporangium bekannt. Es existiert zwar bisher keine systematische Klassifikation der Mikroorganismen der Gattung Streptosporangium, jedoch werden nach der Farbe des Luftmycels vier Ilauptgruppen unterschieden/ d.h. eine rosafarbene, eine grünlichgraue, eine dunkelgraue und eine weiße Gruppe. Die Farbe des reifen Luftmycels des Stammes MK-49 ist

rosa

musche.l/farben. Aus diesem Grund wird dieser Stamm in die rosafarbene Gruppe eingeordnet. In dieser rosafarbenen Gruppe sind bisher die folgenden 7 Arten bekannt: Stroptosporangium amethystogenes, Streptosporangium longisporum, Streptosporangium nondiastaticum, Streptosporangium pseudovulgare, Streptosporangium roseum, Streptosporangium rubrum und Streptosporangium vulgäre.

Tabelle V zeigt die Eigenschaften des Stammes MK-49 im Vergleich mit den vorgenannten sieben bekannten Arten.

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23U780

Tabelle V

	Sporan- giura	Sporangio- spore	Substrat- mycel
Mikro- organisus	6-8μ	1,0-1,3 χ1,5-1,9μ	hellgrau, gelblich braun
Strepto- sporangium arnethy- atogenfts	7-13μ	0 ,7χ2,,1μ	rot, hellrot, bräunlich rot
Strept.o- Djiorangium longlsporum	10-15μ	1,3χ1,5μ	blaßgelb, braun
Streptc- sporangium non- diastaticum	7-10μ	1,2χ1,5μ	blaßbraun, hellbraun
Strepto- sporangiura pseudo- vulgare	5-9μ	1,0-1,3 χ1,5-1,9μ	rötlicht orangefarben^ blaßgeIb
Stregto- sporangium roseum	6-11μ	0,8-l,4u kugel förmig	blaßrosa, hellrot, weiß,schmutz igweiß
Strepto- sporangium rubrura	6~8μ	1,0-1,2 χΐ^δ-ΐ^μ	gelblich orangefarben, orangefarben, blaßrosa
Strepto- sporangium vulgäre	3,5-9μ	0,8-0,9 Χΐ,2-1,6μ	goldfarben melonengelb
MK-4 9

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Tabelle V (Fortsetzung)

lösliches Pigment	Kohlenstoffquelle	L-Rhamnose	Gela tine	Milcl	Reduktion des Nitrats	Wa cli s- tums- temp.
keines	Inosit	±	-	+	+ .
keines	+			+	-
blaßgelb braun		-	+	+	+	42°C
blaßgelb braun	-	-	+	+	+	420C
purpur- stichig braun	-	+	+	+	+
keines	+			+	±
blaßgelb, gelb		+	+	+	-
himbeer farben	+		±	+	+
±

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"¹⁴" 23U780 ^Π

Da der Stamm MK-49 ein hirabeerfarbenos lösliches Pigment bildet, ist er der Species Streptosporangium roseum ähnlich. Streptosporangium roseum weist ein rötlich-orangefarbenes bis blassgelbes Substratraycel auf Medien mit gutem Wachstum auf und bildet ein lösliches Pigment von purpurfarbener bis brauner Farbe. IEC-49 bildet demgegenüber ein goldfarbenes bis melonengelbes Substratmycel und ein himbeerfarbenes lösliches Pigment mit antibakterieller Wirkung gegen gram-positive Bakterien. Außerdem verwertet der Stamm MK-49 L-Rhamnose nicht, während diese von Streptosporangium roseum verwertet wird. Aufgrund dieser Eigenschaften unterscheidet sich der Stamm MK-49 klar von der Art Streptosporangium roseum.

Der Stamm MK-49 wird einer neuen Art zugeordnet, die aufgrund des charakteristischen löslichen Pigments als Streptosporangium violaceochromogenes bezeichnet wird.

V7ie im Fall von anderen Actinomyceten können aus diesem Stamm künstliche Mutanten erhalten werden, beispielsweise mit Hilfe von W-Strahlen, Co -Strahlen, Röntgenstrahlen und Behandlung mit verschiedenen mutagenen Verbindungen. Die Erfindung betrifft auch sämtliche Mutanten, die zur Bildung von XK-49-1-B-2 in der Lage sind.

Zur Züchtung des Erfindungsgemäßen Stammes und seiner Mutanten können übliche Verfahren verwendet werden. Das Nährmedium kann verschiedene Kohlenstoffquellen, v/ie Glucose, Stärke, Glycerin, Mannose, Fructose, Inosit, Mannit, Saccharose und/oder Melassen,

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enthalten. Je nach ihrer Verv;ertbarkeit können auch Kohlenwasserstoffe, Alkohole und organische Säuren verwendet werden. Als anorganische und organische Stickstoffquellen können Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Casaminsäure und/oder lösliche pflanzliche Proteine verwendet werden. Gegebenenfalls können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und/oder verschiedene Phosphate zugesetzt v/erden. Außerdem können gegebenenfalls organische oder anorganische Substanzen zugesetzt werden, die das Wachstum des verwendeten Mikroorganismus und die Bildung von XK-49-1-B-2 fördern.

Die Züchtung wird vorzugsweise in einem flüssigen Nährmedium durchgeführt. Insbesondere eignet sich das Submersverfahren unter gleichzeitigem Rühren. Die Züchtungstemperatur beträgt 25 bis 40 C. Vorzugsweise wird die Züchtung bei einem pH-Wert um den Neutralwert durchgeführt.

Das Antibiotikum der Erfindung reichert sich in der Gärmaische im allgemeinen nach 5- bis 15-tägiger Züchtung an. Sobald die Bildung von XK-49-1-B-2 in der Gärmaische ihr Maximum erreicht, wird die Züchtung unterbrochen und das gewünschte Produkt aus der Gärmaische nach dem Abtrennen der Mikroorganismenseilen, beispielsweise durch Filtration, isoliert und gereinigt.

Die Isolation und Reinigung des Antibiotikums aus dem Filtrat wird nach Verfahren durchgeführt, die zur Isolation und Reini-

^L 409811/1174 ^J

gung von Stoffwechselprodukten von Mikroorganismen aus Gärmaischen üblich sind.

Da XK-49-1-B-2 basisch reagiert und in Wasser gut löslich, aber in organischen Lösungsmitteln mit Ausnahme von Methanol und Äthanol kaum löslich ist, kann das gewünschte Produkt nach üblichen Verfahren, die zur Reinigung von wasserlöslichen, ?oasischreagierenden Verbindungen angewendet werden, gereinigt v/erden. Insbesondere kann XK-49-1-B-2 durch eine geeignete Kombination folgendermaßen gereinigt v/erden: Adsorption und Desorption an einem Kationenaustauscherharζ und Aktivkohle, Säulenchromatographie unter Verwendung von modifizierter Cellulose, Sephadex LH-20, Sephadex G-IO, Sephade;: G-25 und Carboxymethyl-Sephadex C-25 und Adsorption und Desorption an porösen Ionenaustauscherharzen .

Beispielsweise wird das Gärmaische-Filtrat zuerst auf den pH-Wert 6,5 eingestellt und anschließend am Kationenaustauscherharz Amberlite IRC-50 (H⁺-Form) adsorbiert. Nach dem Waschen mit Wasser wird mit 0,5n Salzsäure eluiert. Die aktive Fraktion

-i-

wird neutralisiert und an Amberlite IRC-50 (M-I. -Form) adsorbiert. Sodann wird mit wässriger 0,5m Ammoniumformiatlösung eluiert. Die aktive Fraktion wird an Amberlite IRC-50 (H -Form) adsorbiert und sodann mit 0,5n Salzsäure eluiert. Die erhaltene Aktive Fraktion wird mit Dowex 44 (OH -Form) neutralisiert und anschließend zur Trockene eingedampft. Das erhaltene trockene Produkt wird in 50prozentigem Methanol gelöst. Diese Lösung wird an Sephadex LH-20 säulenchromatographisch gereinigt. Als Lauf-L und Elutionsmittel wird 50prozentiges Methanol verwendet. ι

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^Γ -17- ^Π

Nach dem Trocknen der aktiven Fraktion erhält man ein grünlichgraues rohes Pulver. Dieses rohe Pulver wird in 0,1m wäßriger Ammoniumformiatlösung gelöst. Die erhaltene Lösung wird an Carboxymethy1-Sephadex C-25 adsorbiert und mit einem 0,1-1,0m Ammoniumforiniat-Konzentrationsgradienten eluiert. Das XK-49-1-B-2 wird mit einer Fraktion, die 0,30 "bis 0,35m an Ammoniumformiat ist, eluiert. Sodann wird die XK-4-9-1-B-2-Fraktion an Amberlite CG-50 (H -Form) adsorbiert und mit 0,5n Salzsäure eluiert. Die aktive Fraktion wird mit Dowex 44 (OH~-Form) auf den pH-Wert 6,5 eingestellt und zur Trockne eingedampft. Das trockne Produkt wird in 50prozentigem Methanol gelöst und die Lösung an Sephadex LH-20 saulenchromatographisch gereinigt. Als Lauf- und Elutionsmittel wird 50prozentiges Methanol verwendet. Die aktive Fraktion wird eingedampft. Beim Versetzen der konzentrierten Lösung mit Aceton erhält man das blaugefärbte Hydrochlorid von XK-49-1-B-2.

XK-49-1-B-2 ist ein wertvolles Antibiotikum mit einem breiten antibakteriellen Wirkungsspektrum gegen gram-positive und gramnegative Bakterien. Es besitzt auch eine starke antibakterielle Wirkung gegen bestimmte Stämme von Staphylocoecus aureus und Escherichia coli, die gegen verschiedene bekannte Antibiotika resistent sind.

Das Antibiotikum der Erfindung hat auch eine Antitumorwirkung gegen bestimmte Tumoren.Es hemmt das Wachstum von HeLazellen in Gewebekulturen bei sehr geringen Konzentrationen. Außerdem weist es eine hervorragende Antitumorwirkung auf den festen Tumor

^L- 40981 1/1174 ^J

Sarcoma 180 und auf Ehrlich-Ascites-Tumorzollen bei Mäusen auf.

Die Erfindung betrifft daher auch Arzneipräparate, bestehend aus dem Antibiotikum XK-49-1-B-2 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsmitteln.

Die antibakterielle Wirkung von XK-49-1-B-2 gegen verschiedene Mikroorganismen geht aus Tabelle VI hervor.

Tabelle VI

Antibakterielles V/irkungsspektrum von XK-49-1-B-2, bestimmt nach der Agar-Verdünnungsmethode.

Untersuchter Mikroorganismus

j Minimale Hemmkon-Izentration, μ/ml

Streptococcus faecalis ATCC 10541 Staphylococcus aureus ATCC 6538-P

Staphylococcus aureus KY 8942 (resistent gegen Kanamycin, Paromomycin und Streptomycin)

Staphylococcus aureus KY 8950

(resistent gegen Streptomycin, Tetracyclin,

Penicillin und Sulfonamid)

Staphilococcus aureus KY 8953 (resistent gegen Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin, Neomycin, Kanendomycin und Erythromycin)

Staphylococcus aureus KY 8956

(resistent gegen Streptomycin, Paromomycin,

Tetracyclin, Erythromycin und Oleandomycin)

Staphylococcus aureus KY 8957

(resistent gegen Chloramphenicol, Streptomycin,

Kanendomycin, Tetracyclin und Paromomycin)

41,7 0,066 4,2

0,26 ■ 4,2

• 4,2 4,2

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Tabelle VI (Fortsetzung)

23U78Ö

Bacillus subtilis Nr. IO7O7	0,0011
Bacillus cereus ATCC 9654	0,066
Bacillus cereus var. rnycoides ATCC 9465	< 0,0001
Klebsieila pneumoniae ATCC IOO5I	0,055
Escherichia coll ATCC 26	0,004
Escherichia coli KY 8302 (resistent gegen Chloramphenicol, Strepto mycin, Kanamycin, Paromomycin, Tetracyclin und Spectinomycin)	0,26
Escherichia coli KI 8510 (resistent gegen Chloramphenicol, Strepto mycin, Kanamycin, Gentamicin, Kanendomycin, Paromomycin, Tetracyclin und Spectinomycin)	0,13
Escherichia coli KY 8514 (resistent gegen Streptomycin)	0,26
Escherichia coli KY 8515 (resistent gegen Streptomycin, Kanamycin, Paromomycin und Neomycin)	0,033
Pseudomonas aeruginosa BMH //1	10,4
Proteus vulgaris ATCC 6890	1,52
Shigella sonnei ATCC 9290	0,055
Salmonella typhosa ATCC 9992	0,055

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23U78Q

Aus dieser Tabelle geht hervor, daß XK-49-1-B-2 eine sehr starke antibakterielle Wirkung gegen eine Reihe von gram-positiven und gram-negativen Bakterien aufweist.

Die Antitumorwirkung des Antibiotikums der Erfindung wird am festen Tumor Sarcoma 180 bei Mäusen untersucht. Dazu v/erden männlichen Mäusen von etwa 20 g Körpergewicht üubkutan kleine Mengen des festen Tumors Sarcoma 180 transplantiert. Jeweils 10 Mäusen, denen der Tumor transplantiert wurde, wird eine Lösung mit 3 mg/kg der zu untersuchenden Verbindung intraperitoneal verabfolgt. Die Verabfolgung beginnt am Tag nach der Transplantation und wird die folgenden 8 Tage einmal täglich vorgenommen. Zur Kontrolle wird auf die gleiche Weise ein entsprechendes Volumen Kochsalzlösung injiziert. Am 10. Tag nach der Transplantation werden die Mäuse getötet, und das Gewicht der Tumoren wird bestimmt. Das Verhältnis des durchschnittlichen Tumorgewichts der Testtiere zum durchschnittlichen Tumorgewicht der Kontrolltiere (T/K) wird bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengestellt.

Tabelle VII Wirkung von XK-4-9-1-B-2 bei Mäusen mit Sarcoma 180 (fest)

Untersuchte Verbindung	Dosis mg/kg	Durchschnittliches Tumorgewicht am 10. Tag, g	T/K
XK-4-9-1-B-2 Hydrochlorid Bleomycin Komplex Kochsalzlösung L (Kontrolle)	3,0 χ 8 3,0 χ 8	0,36 1,03 3,13	0,12 0,33 I

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Zur Bestimmung der Antitumoraktivität des Antibiotikums der Erfindung gegen Ehrlich-Ascites-Tumorzellen bei Mäusen werden 0,5 ml (mit 10 Tumorzellen) einer verdünnen Abdominaleffusion intraperitoneal an männliche Mäuse von etwa 20 g Körpergewicht verabfolgt. Die Lösung der zu untersuchenden Verbindung wird in einer bestimmten Dosis intraperitoneal verabfolgt· Die Verabfolgung beginnt am Tag nach der Ascites-Injektion und wird" 6 Tage lang täglich vorgenommen. Zur Kontrolle wird ein entsprechendes Volumen Kochsalzlösung auf die gleiche Weise verabfolgt. Die Mäuse werden 60 Tage lang beobachtet. Das Verhältnis der durchschniti liehen Überlebenszeit der Testtiere zur durchschnittlichen Überlebenszeit der Kontrolltiere (T/K) wird berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengestellt.

Tabelle VIII

Wirkung von XK-4-9-1-B-2 auf Ehrlich-Ascites-Tumorzellen bei Mäusen

Untersuchte	Dosis	durchschnitt	;	durch	T/K	Anzahl
Verbindung	mg/kg	liche Körper	schnitt		der über
		gewicht sverän	liche		lebenden
		derung am 10.	Überle		Tiere am
		Tag, g	benszeit;		25. Tag
			Tage
XK-4-9-1-B-2	2,0 χ 6	-1,1	>38,4	>2,86	9/10
(Hydrochlorid)
Mitomycin C	1,8 χ 6	+0,5	30, A	2,22	5/10
Kochsalzlösung		.3,8	13,7	_	0/10
(Kontrolle)

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Aus den Tabellen VII und VIII geht hervor, daß das Antibiotikum der Erfindung eine ausgezeichnete Hemmwirkung auf das Vachstua von Sarcoma 180 (fester Tumor) sowie eine starke Wirkung auf die Überlebenszeit von Mäusen mit Ehrlich-Ascites-Tumor auf v/eist. Das Antibiotikum der Ex^findung hemmt den festen Tumor Sarcoma 180 bei Mäusen zu nahezu 90 Prozent. 9 von 10 Mäusen, denen Ehrlich-Ascites-Tumorzellen transplantiert wurden, überlebten bei Behandlung mit XK-49-1-B-2. Außerdem hemmt das Antibiotikum der Erfindung das Wachstum von HeLazellen in Gewebeku.lturen bei einer Konzentration von 1 /u/ml zu 40 bis !30 Prozent.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Streptosporangium violaceochromogenes ΜΚ-Λ9 ATCC 21807 (PERM ITr. 1518) wird als Inocolum verwendet. Als erstes Anzuchtmedium wird ein 2 Prozent Glucose, 0,5 Prozent Hefeextrakt, 0,5 Prozent Pepton und 0,1 Prozent Calciumcarbonat enthaltendes Medium verwendet, das vor der Sterilisation einen pH-Wert von 7,2 aufweist. Eine öse des Anzuchtstamms wird als Inoculum auf 3O ml des ersten Anzuchtmediums, das sich in einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben befindet, übertragen und unter Schütteln 5 Tage bei 30⁰C gezüchtet. 30 ml der flüssigen Anzuchtkultur v/erden als Inoculum auf 300 ml eines zweiten Anzuchtmediums übertragen, das

mit

sich in einen/iettprallplatten versehenen, 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben befindet. Die Zusammensetzung des zweiten Anzuchtmediums ist die gleiche wie die des ersten. Die zweite Anzucht wird unter Schütteln 2 Tage bei 3O⁰C durchgeführt,

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1,5 Liter der zweiten flüssigen Anzuchtkultur (entsprechend dem Inhalt von 5 Flaschen) werden als Inoculum auf 15 Liter eines dritten Anzuchtmediurns übertragen, das sich in einem 30 Liter fassenden Fermenter aus korrosionsbeständigem Stahl befindet. Die Zusammensetzung des dritten Ansuchtniediums ist die gleiche wie die des ersten. Man züchtet 2 Tage bei 3O⁰C bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 15 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 350 U/min. 15 Liter der dritten flüssigen Anzuchtkultur v/erden auf 100 Liter eines vierten Anzuchtmediums der gleichen Zu3ammeηsetaung wie des ersten Mediums, das sich in einem 300 Liter fassenden Fermenter befindet, übertragen. Man züchtet 2 Tage bei 30⁰C bei einer Belüftungsgeschviindigkeit von 100 Liter/ min und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min. Schließlich werden 100 Liter der vierten flüssigen Anzuchtkultur als Inoculum auf 1000 Liter eines in einem 3000 Liter fassenden Fermenter befindlichen Fermentationsmediums übertragen. Das Fermentationsmedium enthält 2 Prozent Glucose, 0,1 Prozent Hefeextrakt, 1,5 Prozent Pepton und 0,1 Prozent Calciumcarbonat. Der pH-V/ert vor der Sterilisation beträgt 7,2. Man züchtet 12 Tage bei 30⁰C bei einer Belüftungsgeschviindigkeit von 500 Liter/min und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U/min. Nach 12tägiger Züchtung haben sich in der Gärmaische 0,5 mg/Liter XK-4-9-1-B-2 gebildet.

Beispiel 2

100 Liter der gemäß Beispiel 1 erhaltenen vierten flüssigen Anzuchtkultur vierdon als Inoculum auf 1000 Liter eines in einem 3OOO Liter fassenden Fermenter befindlichen Fermentationsmediuins übertragen. Das Fermentationsmedrum enthält 2 Prozent Glucose,

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5 Prozent Maiscuellflüssigkeit ui:l 0,1 Prozent Calciumcarbonat. Der pH-V/ert des Mediuns vor der Sterilisation beträgt ?,2. Nan züchtet 12 Tage bei 30⁰C bei einer Belüftungsgeschwindigkeit von 3000 Liter/min und einer Rührgeschv/indigkeit von I50 U/min. Nach Htägiger Züchtimg weist die Gärmaische eine Aktivität auf, die 2 mg/Liter ΧΚ-Λ9-1-Β-2 entspricht.

Beispiel 3

1000 Liter der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Fermentationsflüssigkeit i\'erden mit konzentrierter Salzsäure auf den pH-'./ert 3 eingestellt. Sodann v/erden etwa 40 kg Filtrierhilfe (Radiolite Kr. 600 der Firma Showa Kagaku Kogyo Co., Ltd.) zugesetzt. Die Mikroorganismenzellen und unlösliche Bestandteile werden abfiltriert. Das Filtrat wird mit konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung auf den pH-^:.7ert 6,5 eingestellt und auf eine Chromatographiersäule aufgesetzt, die 50 Liter Kationenaustauscherharz, Amberute IRC-50 (H -Form), enthält. Das XK-4-9-1-B-2 wird an diesem Harz adsorbiert. Das Harz wird mit Wasser gewaschen und anschließend mit 0,5n Salzsäure eluiert. Die aktive Fraktion wird mit Amberlite IR-4B (0H~-Form) neutralisiert und anschließend über eine Chromatographiersäule gegeben, die 500 ml Amberlite IRC-50 (ML· -Form) enthält. Alle aktiven Substanzen werden am Harz adsorbiert. Nach dem V/aschen mit Wasser werden Verunreinigungen durch Elution mit 0,3n wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Sodann wird das Harz wieder mit Wasser gewaschen und anschließend mit 0,5m wäßriger Ammoniumformiatlösung eluiert. Man erhält eine Fraktion, die das XK-49—1-B-2 enthält. Diese Fraktion wird mib der etwa 4-fachen Volumenmenge Wasser verdünnt, mit konzentrierter Salzsäure auf

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den pH-'.-.'ert 6,5 eingestellt und über eine Chromatograph! er säule gegeben, die 200 ml Amberlite IRC-50 (H -Form) enthält. Die aktiven Sxibstanzen werden am Harz adsorbiert. Nach dem Waschen mit V/asser wird· mit 0,5n Salzsäure eluiert. Die aktive Fraktion wird mit Dowex 44 (OH -Form) neutralisiert und sodann unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in einer geringen Menge einer 50prozentigen wäßrigen Methanollösung gelöst und über eine Ohromatographiersäule gegeben, die mit 50prozentigem, wäßrigem Methanol vorbehandeltes Sephadex LH-20 enthält. Als Lauf- und Elutionsmittel wird 50prozentiges wäßriges Methanol verwendet. Die aktive Fraktion wird unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird mit der 10fachen Volumenmenge Aceton versetzt. Dabei fällt ein graugrüner Niederschlag aus. Man erhält 1,2g eines trockenen Pulvers. Die Aktivität von 1 mg dieses Pulvers entspricht der von 200 μ des Hydrochloride von XK-4-9-1-B-2.

Beispiel 4 Liter

950 / der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Fermentationsflüssigkeit werden mit konzentrierter Salzsäure auf den pH-Wert 5»0 eingestellt. Nach Zusatz von etwa 40 kg Filtrierhilfe Radiolite Nr. 600 wird die Gärmaische filtriert. Das Filtrat wird über eine Chromatographiersäule gegeben, die 100 Liter eines porösen Ioivenaustauscherharzes, HP 10, enthält. Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser wird mit einer 50prozentigen wäßrigen Methanollösung die aktive Substanz eluiert. Die entsprechende Fraktion wird eingeengt. Nach dem Versetzen des Rückstands mit der etwa lOfachen Volumenmenge Aceton erhält man 50 g eines dunkelbraunen

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Pulvers. Die Aktivitrat von 1 mg dieses Pulvers entspricht der von 20 μ des Hydrochloride von XK-4-9-1-B-2. Dieses Pulver wird in 200 ml V/asser gelöst und über eine Chromatographiersäule mit Amberlite IRC-50 (KH^ -Form) gegeben. Zuerst wird mit O,3n wäß-

wäßriger riger Ammoniaklösung^ sodann mit 0,5m/Ammoniumforaiatlösung und schließlich mit O,5n Salzsäure eluiert. Auf diese V/eise erhält man eine das XK-4-9-1-B-2 enthaltende Fraktion. Diese !Traktion wird unter Verwendung von Amberlite IRC-50 (H -Form) und Sephadex LH-20 gemäß Beispiel 3 gereinigt. Man erhält schließlich 2,8 g eines graugrünen Pulvers. Die Aktivität von 1 mg dieses Pulvers entspricht der von 200 ,u des Hydrochlorids von XK-4-9-1 B-2.

Beispiel 5

500ng des gemäß Beispiel 3 und Beispiel 4- erhaltenen rohen Pulvers von XK-49-1-B-2 werden in 50 ml einer 0,1m wäßrigen Ammoniumf ormiatlösung gelöst. Die erhaltene Lösung wird über eine mit 30 ml CM-Sephadex C-25 beschickte Säule gegeben. Die aktive Verbindung wird am Harz adsorbiert. Das Harz wird mit 300 ml einer 0,1m wäßrigen Ammoniumformiatlösung gewaschen. Sodann wird mit insgesamt 2 Liter einer wäßrigen Ammoniumformiatlösung mit einem Konzentrationsgradienten von 0,1 bis 1,0m eluiert. XK-4-9-1-B-2 wird mit der 0,30 bis O,35m-Fraktion eluiert.' Diese Fraktion wird über eine mit 20 ml Amberlite CG-50 (H -Form) gegeben. Nach dem Waschen des Harzes mit Wasser wird es mit 0,5n Salzsäure eluiert. Die aktive Fraktion wird mit Dowex 4-4- (OH -Form) auf den pH-Wert 6,0 eingestellt und sodann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in einer geringen Menge einer 50prozentigen

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wäßrigen Methane lic sung gelöst und eodann über eine mit Sephadex LH-20 "beschickte Säule gegeben, die mit einer JpOprozentigen wäßrigen Methanollösung vorbehandelt wurde. Als Lauf- und EIutionsmittel v:ird eine 50prozentige wäßrige Methanollösung verwendet. Die aktive Fraktion wird eingedampft und das Konzentrat mit der lofachen Volumeninenge Aceton versetzt. Man erhält schließlich % mg des Hydrochlorids von XK-A-9-1-B-2 in Form eines blauen Pulvers.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   Antibiotikum XK-49-1-B-2, dessen Hydrochlorid folgendermaßen gekennzeichnet ist

   (a) Elementaranalyse:-C 32,13 Prozent, N 14,20 Prozent,

   H 6,34 Prozent und Cu 3,4 Prozent;

   (b) UV-Spektrum (Wasser): im wesentlichen gemäß Fig. 1 mit

   Absorptionsmaxima bei 244 und 293· πρΐ

   (c) IR-Spektrum: im wesentlichen gemäß Fig. 2 mit Haupt

   banden bei folgenden Wellenzahlen (cm ) 3400, 3200 (sh), 2950, 1720, 1655, 1635, 1580 bis 1550, 1520 bis 1510 (sh), 1460, 1250, 1050, 1010, 980 (sh);

   (d) Verhältnis der UV-Absorption (Wasser) 244/293 mju: 1,34;

   (e) Farbreaktion: positive Sakaguchi-, Pauli- und Ehrlich-

   Reaktion, negative Ninhydrinreaktion5

   (f) Papierchromatographie: R -Werte gemäß Tabelle I;

   (g) Dünnschichtchromatographie an Kieselgel: R~-Werte gemäß

   Tabelle II.

   2. Hydrochlorid des Antibiotikums gemäß Anspruch 1.

   3. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums XK-49-1-B-2 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Streptosporangium, der zur Bildung von XK-49-1-B-2 fähig ist, in einem geeigneten Nährmedium züchtet und das in der Gärmaische angereicherte Antibiotikum gewinnt.

   L— / Λ Λ η Ί Ί i Λ Λ *~i I —-I

   A-, Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Art Streptοsporangium violaceochro mogenes verwendet.

   5« Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptοsporangium violaceochromogenes ATGC 21807 verwendet,

   6. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet,, daß man die Züchtung bei Temperaturen von 25 his 40°0 und bei einem etwa neutralen pH-Wert durchführt.

   7. Arzneipräparate, bestehend aus dem Antibiotikum XK-4-9-1-B-2 gemäß Anspruch 1 und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen.

   8. Streptοsporangium violaceochromogenes ATOO 21807.

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