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82 902 WI". 3
A/S Alfred Benzon
Patentansprüche
1·' HulFN-a-Proteine, die unter SDS PAGE- und Markierungsbedingungen, wie sie hier definiert sind, bei einer
vollständigen Interferon-Beladung von 5 χ 10 IFU 13 scharfe,markierte Proteinbanden zeigen, die antivirale
Interferonaktivität aufweisen bei
16600, Ί698Ο, 17380, 17580, 18410, 18840, 19050,
19500, 20420, 20890, 21380, 21880 und 22910
"Daltons", (das "Dalton"-Molekulargewicht weist eine
experimentelle Genauigkeit von - 100 "Daltons" auf), wobei die SDS PAGE im wesentlichen keine andere markierte
Proteinregion zeigt.
2. Einzelnes Protein, das eine antivirale Interferonaktivität aufweist und eine Komponente der HulFN-a-Interferon-
^5 Proteine nach Anspruch 1 ist.
3. Protein mit antiviraler Interferonaktxvifcät nach Anspruch
2, das bei 16600 - 100 "Daltons" erscheint.
14. Protein nach Anspruch 3, das immunologische Eigenschaf ten
aufweist, die sich von elender restlichen 12 spezifischen Proteine unterscheiden.
5. Protein, das etwa 40 % des reinen HulFN-a-Proteins ausmacht,
wobei das genannte Protein nur vernachläßigbare Aktivität irn Human-System und eine sehr hohe Aktivität
im Rinder-System aufweist und immunologisch verschieden ist von den HulFN-a-Proteinen, die eine nennenswerte
Aktivität im Human-System haben«
6. Protein mit antiviraler Interferonaktivität nach Anspruch
2, das bei 16980 ί 100 "Daltons" erscheint.
7- Protein mit antiviraler Interferonaktivität nach Anspruch
2, das bei 17380 t 100 "Daltons" erscheint.
8. Protein mit antiviraler Interferonaktivität nach Anspruch
2, das bei 17580 - 100 "Daltons" erscheint.
9. Protein mit antiviraler Interferonaktivität nach Anspruch 2, das bei 18410 ί 100 "Daltons" erscheint.
10. Protein mit antiviraler Interferonaktivität nach Anspruch
2, das bei 18840 - 100 "Daltons" erscheint.
11. Protein mit antiviraler Interferonaktivität nach Anspruch
2, das bei 19050 - 100 "Daltons" erscheint.
12. Protein mit antiviraler Interferonaktivität nach Anspruch
2, das bei 19500 - 100 "Daltons" erscheint.
13- Protein mit antiviraler Interferonaktivität nach Anspruch 2, das bei 20420 - 100 "Daltons" erscheint.
14. Protein mit antiviraler Interferonaktivität nach An-
. ■ ■ ■ ' '
spruch 2, das bei 20890 - 100 "Daltons" erscheint.
15. Protein mit antiviraler Interferonaktivität nach Anspruch
2, das bei 21380 - 100 "Daltons" erscheint.
16. Protein mit antiviraler Interferonaktivitat nach An-. spruch 2, das bei 21880 + 100 "Daltons" erscheint.
17. Protein, mit antiviraler Interferonaktivitat nach Anspruch
2, das bei 22910 + 100 "Daltons" erscheint.
18. Interferonprotein, das eine distinkte Aktivität im Rinder-System
und eine vernachlässigbare Aktivität im Human-Systein hat, wobei das genannte Protein bei 16600 -100
"Daltons" erscheint.
19. Protein nach Anspruch 1, das eine spezifische Aktivi-
8 Q
tat von mindestens 10 bis 10 IFU pro mg Protein auf
weist, bestimmt durch vergleichende SDS PAGE Markierun
20. Proteinenach Anspruch 19 mit einer spezifischen Aktivi
8 Q
tat von 10 bis 2 χ 10 IFU pro mg Protein, bestimmt
durch vergleichende SDS PAGE Markierung.
21. Protein(e) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, zusätzlich
dadurch gekennzeichnet, daß es
f 25 (sie) antizelluläre Aktivität aufweist (aufweisen) und das natürliche Killer-Zell-Stystem verstärkt (verstärken)
.
22. Protein nach einem der Ansprüche 6 bis 17, zusätzlich dadurch gekennzeichnet, daß es Antikörper
neutralisiert, die gegen eins der Proteine nach einem der Ansprüche 6 bis 17 oder gegen Proteinenach
Anspruch 1, ausgenommen die 16600 "Daltons"-Art entstanden sind.
35
23· Interferonprotein(e) menschlicher Leukocyten nach einem
der vorhergehenden Ansprüche.
24. Formulierung, enthaltend ein Protein oder Proteine
nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die genannte Formulierung zur Anwendung an Mens-chen oder
Tieren zur Erzielung einer prophylaktischen, therapeutischen oder immunisierenden Wirkung geeignet ist,
25. Formulierung nach Anspruch 24, geeignet für parenterale,
intranasale oder topische Anwendung, mit oder ohne Zugabe
eines chemostatisch aktiven Mittels,
26. Formulierung nach Anspruch 25 als Creme oder Salbe für
die topische Anwendung.
27- Formulierung nach Anspruch 24 in Form einer stabilisierten,
wässrigen Lösung.
28. Formulierung nach Anspruch 27, vrobei der Stabilisator
ein Protein oder eine Proteinzusaramensetzung ist, das (die) nicht toxisch und nicht immunisierend beim Mensehen
ist.
29. Formulierung nach Anspruch 28 s wobei der Stabilisator
ausgewählt wird aus einer Gruppe, bestehend aus menschlichen Serumproteinen und Fraktionen von diesen,
beispielsweise menschlichem- Albumin oder einem anderen
Protein, das nicht immunisierend beim Menschen ist.
30. Formulierung nach einem der Ansprüche 24 bis 29, in der die Konzentration des reinen Interferons in einem Bereich
liegt entsprechend zu 1 bis 40 Millionen IFU pro ml.
31- Formulierung nach Anspruch 27 zum Immunisieren von
Tieren, in der der Stabilisator SDS ist. 35
32. Formulierung nach Anspruch 31, die mit PBS bei einem
pH von etwa 7,2 gepuffert ist.
_5-
33. Formulierung nach einem der Ansprüche 31 oder 32, die
zusätzlich ein Adjuvans enthält.
34. Formulierung nach Anspruch 33, in der das Adjuvans
Freund's Adjuvans ist.
35. Ein SDS-Komplex eines Proteins oder von Proteinen nach
einem der Ansprüche 1 bis 23-
36. Ein SDS-Komplex nach Anspruch 35, der in fester Form
isoliert wurde.
37· Antikörper, die gegen immunologische Determinanten der
menschlichen Le-Form-Interferonproteine entwickelt wurden
oder im wesentlichen nur gegen diese gerichtet sind, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23-
38. Antikörper nach Anspruch 37, die durch Immunisieren eines immunisierbaren Tiers mit einem der
16600, I698O, 17380, 17580, 18410, 18840,
19050, 19500, 20420, 20890, 2138O, 2188O5
229IO
"Daltons" HulFN-a Komponenten der Proteine nach Anspruch
1 oder einer beliebigen Zusammenstellung dieser Proteine erhalten wurden oder durch Einsatz derselben Komponenten
mittels Hybridoma-Teehnik oder Tränsformations-Technik
erhalten wurden.
39- Antikörper nach Anspruch 37, die durch Immunisierung
eines immunisierbaren Tiers mit einem der
I698O, 1738O, 17580, 18410, 18840,
19050, 19500, 20420, 20890, 21380, 21880 22910 .
'"Daltons" HulFN-a Komponenten oder den Proteinen nach
Anspruch 1 oder mit einer beliebigen Zusammensetzung
dieser erhalten wurden
40. Antikörper nach Anspruch 37, die durch Immunisieren
eines irnmunisierbaren Tiers mit der 16600 ~ 100 "DaI-tons"
HulFN-a Komponente erhalten werden.
41. Antikörper nach einem der Ansprüche 37 bis 40, die durch Immunisieren eines immunisierbaren Tiers mit der
HulFN-a Komponente oder Komponenten, die aus der entsprechenden Bande oder den Banden aus dem SDS PAGE-GeI
geschnitten wurden, erhalten wurden.
42. Antikörper nach Anspruch 41, wobei die Banden aus dem SDS PAGE-GeI nach Markierung des genannten Geels und
kurzem Waschen in destilliertem Wasser geschnitten werden .
43. Verfahren zum Herstellen von Antikörpern nach Anspruch 37, wobei ein immunisierbares Tier gegen menschliches
Le-Form-Protein oder Proteine gemäß einem der Ansprüche 2 bis 23 immunisiert wird und das Antiserum aus dem
Tier gewonnen wird.
44. Verfahren nach Anspruch 43, wobei die Immunisierung mit einem Protein oder Proteinen gemäß einem der Ansprüche
2 bis 23 durchgeführt wird.
45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Immunisierung
durchgeführt wird mit einer der
16600, 16980, 17380, 17580, 18410, 18840,
19050, 19500, 20420, 20890, 21380, 21880, 22910
"Daltons" HulFN-a Komponenten der Proteine gemäß An-^
°° spruch 1 oder mit einer beliebigen Zusammenstellung
dieser.
46. Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Immunisierung
durchgeführt wird mit einer der
16980,
17380,
17580,
18410,
18840,
21880,
19050,
19500,
20420,
20890,
21380,.
22910
"Daltons" HulFN-a Komponenten der Proteine gemäß An-■
spruch 1 oder mit einer beliebigen Zusammenstellung dieser.
47- Verfahren nach Anspruch 45, wobei die Immunisierung
mit der I66OO -, 100 "Daltons" HulFN-a Komponente durchgeführt
wird.
P- 48. Verfahren nach Anspruch 46, wobei die Immunisierung mit
der 2188O - 100 "Daltons" Komponente durchgeführt wird.
49. Verfahren nach einem der Ansprüche 43 bis 48, wobei die
Immunisierung mit einer Formulierung gemäß einem der
n Ansprüche 27 und 31 bis 34 durchgeführt wird.
50. Verfahren zum Herstellen von Antikörpern nach Anspruch 37, wobei ein Hybridoma-Cell-Klon kultiviert wird, der
Antikörper produziert, die gegen immunologische Determinanten der HulFN-a Komponenten nach Anspruch 1 gerich-tet
sind und Wiedergewinnung der Antikörper aus dem Kulturmedium.
51. Antikörper, hergestellt durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 43 bis 50.
52. Antikörper nach einem der Ansprüche 37 bis 42 oder 51 oder Fragmente oder Abkömmlinge dieser Antikörper, die
die wesentlichen Anti-Interferondeterminanten behalten haben, die an einer Matrix immobilisiert sind.
53- Antikörper nach Anspruch 52, die kovalent an die Matrix J
- P gebunden sind. /
-δι 54. Antikörper nach Anspruch 53, wobei die Matrix eine
vernetzte Agarose, beispielsweise Sepharose 4B ist.
55. Matrix-immobilisierte Antikörper nach einem der Ansprü»
ehe 52 bis 54, die im wesentlichen frei von proteolytischer
Enzymaktivität sind.
56. Matrix-immobilisierte Antikörper nach Anspruch 55,
deren wesentliche proteolytische Enzymaktivität dadurch
entfernt wurde, daß sie mit Enzym-Inhibitoren oder Enzyme zerstörenden Mitteln behandelt wurden.
57. Matrix-immobilisierte Antikörper nach Anspruch 56, wobei die Behandlung mit Enzym-Inhibitoren oder Enzyme
. zerstörenden Mitteln durch Matrix-immobilisierte En-' zym-Inhibitoren oder Enzyme zerstörende Mittel durchgeführt
wird.
58. Matrix-immobilisierte Antikörper nach Anspruch 57,
die, vor ihrer kovalenten Bindung an die Matrix, durch
eine Säule geschickt werden, die Matrix-immobilisiertes poly-L-Lysin und/oder Matrix-immobolisierterl Soyabohnen-Trypsin--Inhibitor-und/oder
Matrix-immobilisierten Kallikrein-Inaktivator enthält.
59- Verwendung der Antikörper gemäß einem der Ansprüche 37 bis 42 und 51 bis 58 zum Reinigen von Lösungen, die
menschliches Le-Form-Interferon enthalten,
60. Protein, das die signifikanten Interferon-charakterisierenden
Determinanten aufweist, die die Proteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 besitzen.
61. Protein, das die signifikanten immunologischen Determinanten
aufweist, die die Proteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 besitzen.
62. Verfahren zum Herstellen von menschlichen Le-Form-Inter-
feron-Proteinen gemäß einem der Ansprüche 1 oder 3 bis »;
5, wobei eine Lösung, die menschliche Le-Form-Interferon-Proteine
enthält, einer Affinitätschromatographie i unterworfen wird, so daß die genannten menschlichen Le- j
Form-Interferon-Proteine selektiv rückgewonnen werden
und die genannten wiedergewonnenen Interferonproteine I
eluiert werden.
63. Verfahren nach Anspruch 62, wobei die Affinitätschromatographie
darin besteht, daß die Antikörper Matriximmobilisierte Antikörper gemäß einem der Ansprüche 52
bis 58 sind.
64. Verfahren nach Anspruch 63, wobei höchstens 85 % der
Antikörper, die der Matrix aufgegeben werden, im immobilisierten
Zustand kovalent gebunden werden.
65. Verfahren nach Anspruch 63 oder 64, wobei die Antikörper, ehe sie an die Matrix gebunden werden, im wesentliehen
von jeder proteolytischen Enzymaktivität durch Behandlung mit Enzym-Inhibitoren und/oder Enzyme zerstörenden
Mitteln gereinigt werden.
66. Verfahren nach Anspruch 65, wobei das Entfernen der
proteolytischen Aktivität mit einem Matrix-imraobilisierten
Enzym-Inhibitor und/oder Enzyme zerstörenden Mitteln durchgeführt wird.
67. Verfahren nach einem der Ansprüche 62 bis 66, wobei die Lösung, die der Antikörper-Affinitätsmatrix aufgegeben
wird, eine rohe, unkonzentrierte Interferon-Präparation ist.
68. Verfahren nach einem der Ansprüche 62 bis 66, wobei die
Lösung^ die der Antikörper-Affinitätsmatrix aufgegeben "*
wird, eine konzentrierte oder teilweise gereinigte Interferon-Präparation ist. .'. *
0085693 -ιοί 69. Verfahren nach einem der Ansprüche 62 bis 66, wobei
die Interferon enthaltende Lösung diejenige, Interferon enthaltende Proteinfraktion ist>
die durch eine Protein-Präzipitations-Behandlung einer rohen, unkonzentrierten
Interferon-Präparation erhalten wurde,
70. Verfahren nach Anspruch 69, wobei die Protein-Präzipitations-Behandlung
die Zugabe von KSCN und das Einstellen der Lösung auf pH 4,5 einschließt.
71. Verfahren nach einem der Ansprüche 62 bis 70, wobei die Lösung, die der Antikörper-Affinitätsmatrix aufgegeben
wird, eine Interferonlösung ist, die im wesentlichen nur Proteine im 10000 bis 20000 Dalton-Bereich enthält.
72. Verfahren nach Anspruch 71, wobei die Lösung das 10000 bis 20000 Dalton-Eluat aus einer Gelfiltration ist, die
mit einer Pufferlösung durchgeführt wird, die etwa 25 Volumen-% eines Glycols, beispielsweise Äthylen-Glycol
enthält und eine Ionenstärke, entsprechend 1 M NaCL, pH etwa 7,2, hat.
73. Verfahren nach einem der Ansprüche 63 bis 72, wobei das
HulFN-a Interferon der Lösung, die der Antikörper-Affini«
täts-Matrix aufgegeben wird, aus einer Gruppe ausgewählt wird, die enthält: menschliche Leukozyten-Interferone,
■ menschliche Lymphoblasten-Interferone und Proteine gemäß
einem der Ansprüche 60 oder 61, einschließlich solcher Proteine, die durch Kultivieren eines Mikroorganisraus
erhalten werden, der eine DNA enthält, die für die Herstellung eines solchen Proteins codiert.
74. Verfahren nach Anspruch 73, wobei die Interferon enthaltende
Lösung diejenige Interferon enthaltende Proteinfraktion aufweist, die durch Protein-Präzipitations-Behandlung
einer rohen, unkonzentrierten Interferon-Präparation
erhalten wird. ■
75. Verfahren nach Anspruch 74, wobei die Protein-Präzipitations-Behandlung
die Zugabe von KSCN und das Einstellen der Lösung auf pH 4,5 einschließt.
76. Verfahren nach einem der Ansprüche 73 bis 75, wobei die
der Antikörper-Affinitäts-Matrix aufgegebene Lösung eine
Interferonlösung ist, die im wesentlichen nur Proteine
im 10000 bis 20000 Dalton-Bereich enthält.
77. Verfahren nach Anspruch 76, wobei die Lösung das 10000
bis 20000 Dalton-Eluat einer Gelfiltration ist, die mit
einer Pufferlösung durchgeführt wird, die etwa 25 VoIumen-% eines Glycols, beispielsweise Ä'thylen-Glycol enthält
und eine Ionenstärke, entsprechend 1 M MaCl, pH etwa
7,2 , hat.·
78. Verfahren nach einem der Ansprüche 74 bis 77, wobei die
Antikörper-Affinitäts-Matrix direkt mit dem Eluat im
Gel-Filtrationspuffer beladen wird. :
79. HulFN-a Interferon, hergestellt durch die Verwendung
von Matrix-immobilisierten Antikörpern gemäß einem der Ansprüche 52 bis 58 oder durch ein Verfahren gemäß, einem der Ansprüche 62 bis 78.
80. HulFN-a Interferon nach Anspruch 79, das eine spezifische
Aktivität von mindestens 30 χ 10 IFU pro mg Protein hat, wobei die Bestimmung des Proteins auf dem Lowry-Verfahren
basiert,unter Verwendung von reinem menschlichen Albuminserum als Standard.
■81. HulFN-a Interferon nach Anspruch 80 mit einer spezifischen
Aktiv
mg Protein.
r Q
sehen Aktivität im Bereich von 30 χ 10 bis 10 IFU pro
82. HulFN-a Interferon nach Anspruch 81, mit einer spezifischen Aktivität von 30 χ 10 bis 7Ox 10 IFU pro mg Protein
.
83- Verfahren zum Herstellen von Interferonproteinen oder
Proteinen, die die signifikanten, biologischen Interferon-Aktivitätsdeterminanten
dieser Proteine aufweisen, indem ein Mikroorganismus kultiviert wird, der eine
DNA trägt, die für die Herstellung von HulFN-aInterferonproteinen
gemäß einem der Ansprüche 1 bis 23 oder 60 codiert und die genannten Proteine aus dem Kulturmedium
gewonnen werden.
84, Verfahren nach Anspruch 83, wobei die DNA, die für die Herstellung der Interferonproteine codiert auf einem
Plasmid liegt.
85. Verfahren nach Anspruch 83 oder 84, wobei die DNA, die für die Herstellung der Interferonproteine codiert, hergestellt
wird durch Behandlung mit reverser Transkriptase einer messenger-RNA, die aus Interferon-produzierenden
Zellen isoliert wurde, wobei das Verfahren per se bekannt ist und wobei das Verfahren weiterhin das Stadium
der Antikörper-Affinitäts-Chromatographie und/oder Immunopräzipitation eines Lysats der Zellen enthält
und die Antikörper, die in der Antikörper-Affinitäts-Chromatographie
oder in einer Immunopräzipitation verwendet werden, Antikörper gemäß einem der Ansprüche 37
bis 42 oder 51 sind.
86. Verfahren nach Anspruch 83 bis 85, wobei die Interferon
produzierenden Klone des Mikroorganismus mittels Radiomarkierung monospezifischer Antikörper gemäß einem der
Ansprüche 37 bis 42 oder 51 selektiert werden.