DE69232201T2

DE69232201T2 - Für proteine des menschlichen papillomavirus kodierende rekombinante virusvektoren

Info

Publication number: DE69232201T2
Application number: DE69232201T
Authority: DE
Inventors: Edward Boursnell; Charles Inglis; James Munro
Original assignee: Cantab Pharmaceuticals Research Ltd
Current assignee: Cantab Pharmaceuticals Research Ltd
Priority date: 1991-03-14
Filing date: 1992-03-10
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2012-03-11
Also published as: MX9205131A; HK1001657A1; AU1414792A; KR100240183B1; JPH06505626A; NO933260L; CA2106069A1; NO310033B1; CN1090239C; BR9205771A; EP0576471B1; DK0576471T3; EP0576471A1; WO1992016636A1; US5719054A; CN1064892A; OA10085A; AU665531B2; DE69232201D1; GB9105383D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Virusvektoren. Insbesondere betrifft sie rekombinante Virusvektoren, die dazu bestimmt sind, das Problem der Rekombination zwischen homologen Nucleotidsequenzen zu überwinden. Sie betrifft auf rekombinante Virusvektoren, die für Human-Papillomavirus-Proteine kodieren; Immuntherapeutika und Vakzine für Affektionen, die mit HPV-Infektion in Zusammenhang stehen; die Herstellung eines Virus (z. B. Vaccinia-Virus), der durch Engineering dazu gebracht wird, Antigene zu exprimieren, für die die Human-Papillomavirus-Typen 16 und 18 kodieren, sowie Immuntherapeutika und Vakzine für Gebärmutterhalskrebs.
In den letzten Jahren gab es starke Hinweise für eine Verbindung zwischen Gebärmutterhals-Karzinom und Infektionen mit bestimmten Typen von Human-Papillomavirus (HPV), insbesondere mit den Typen 16, 18, 31, 33 und. 35 (Gissman et al., Cancer Cell 5, 275 (1987)). Das basiert auf Hybridisierungsuntersuchungen, die darauf hinweisen, dass bei mehr als 85 bis 90% der Biopsien von Gebärmutterhalstumoren gezeigt werden kann, dass sie Papillomavirus-DNA enthalten. HPV16-DNA ist am häufigsten zu finden (bei etwa 60% der Tumore), wobei HPV18 am zweithäufigsten ist (etwa 20%) und die anderen Typen weitere 5 bis 10% ausmachen. In vielen Fällen jedoch enthalten Tumorzellen aus den Biopsien nicht das vollständige Genom, sondern stattdessen eine deletierte Form. Das Ausmaß und die Stelle der deletierten Information innerhalb des Virusgenoms ist variabel, aber ein allgemeines Merkmal ist die Beibehaltung des Teils des Genoms, der für das E7-Protein kodiert (Schwarz et al., Nature 314, 1 11 (1985)). Außerdem ist üblicherweise die angrenzende E6-Kodierungsregion vorhanden. Das allgegenwärtige Vorhandensein der E7-Kodierungsregion in Tumrozellen lässt darauf schließen, dass das Proteinprodukt dieses Gens eine Rolle bei der Herbeiführung oder Aufrechterhaltung des transformierten Phanotyps spielen kann. Tatsächlich kann in den meisten Zelllinien, die bei Tumorbiopsien festgestellt werden, die Expression des E7-Gens detektiert werden (Smotkin & Wettstein, PNAS 83, 4680 (1986)). Weiters ist gezeigt worden, dass sich das E7-Genprodukt an das Rentinoblastom- (Rb-) Genprodukt binden kann, ein anerkanntes "Anti-Onkogen" in normalen menschlichen Zellen (Mugner et al., EMBO J. 8, 4099 (1989)). Das unterstützt die Annahme, dass E7 direkt an der Zelltransformation beteiligt ist.
Das Vorhandensein und die Expression des E7- und des E6-Gens in Tumorzellen, die von Gebärmutterhalskarzinom-Biopsien stammen, lässt auf die Möglichkeit schließen, dass diese Proteine potentielle Ziele für die immunologische Erkennung der Tumorzelleri sein können. Es ist allgemein bekannt, dass virale Proteine, die innerhalb von Säugetierzellen produziert werden, durch einen Wirtszellen-Stoffwechselweg zu kurzen Peptiden verarbeitet werden können, die dann einen Komplex mit Wirt-Haupt-Histokompatibilitätskomplex- (MHC-) Klasse 1-Molekülen bilden und an die Zelloberfläche transportiert werden. Diese Komplexe können dann ein Ziel für die Erkennung durch das Wirtsimmunsystem darstellen. Wechselwirkung des Komplexes mit dem Rezeptormolekül an der Oberfläche von zytotoxischen T-Zellen (dem T-Zellen-Rezeptor) können dann zur Aktivierung der T-Zellen führen, um die erkannte Zelle zu vermehren oder zu zerstören. Es ist daher möglich, dass das Vorhandensein einer Population an zytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) im Körper, die fähig sind, Zellen zu erkennen, die die HPV E6- und/ oder E7-Proteine exprimieren, für Schutz gegen die Entwicklung und Vermehrung von Gebärmutterhalstumoren sorgen könnte. Es ist tatsächlich berichtet worden, dass normalerweise onkogene Mäusezellen, die durch Engineering dazu gebracht wurden, das HPV E7-Protein zu exprimieren, nicht fähig sind, Tumore in Mäusen zu bilden, die zuvor mit nicht-tumorigenen E7-exprimierenden Zellen immunisiert worden sind, und dass diese Zurückweisung durch CD8+-Lymphozyten (CTLs) vermittelt wird (Chen et al., PNAS 88, 110 (1991)). Weiters könnte die Erzeugung einer aktiven Population solcher Zellen nach der Tumor-Initiierung zur Regression des Tumors führen könnte.
Es gibt zahlreiche Berichte über die Konstruktion rekombinanter Viren, z. B. Vaccinia- Viren, die fremde Gene enthalten und exprimieren (Macket & Smith, J. Gen. Virol. 67, 2067 (1986)), und mehrere Berichte über die Verwendung dieser rekombinanten Viren zur Erzeugung wirksamer Immunreaktionen gegen die exprimierten fremden Antigene. Ein besonderer Vorteil dieses Wegs zur Bereitstellung von Antigenen für die Impfung besteht darin, dass er zur Entwicklung zellulärer ebenso wie humoraler Immunität führen kann. Der Grund dafür ist, dass fremde Proteine innerhalb von Zellen des infizierten Individuums auf ähnliche Weise erzeugt werden, wie das während der natürlichen Infektion der Fall ist. Das bedeutet, dass sie über den korrekten Stoffwechselweg verarbeitet werden sollten, um die Hervorrufung einer CTL-Reaktion zu ermöglichen. In mehreren Fällen ist direkt gezeigt worden, dass durch Immunisierung mit der rekombinanten Virus eine zelluläre Immunreaktion in Form fremder Antigen-spezifischer CTLs hervorgerufen werden kann (Moss & Flexner, Ann. Rev. Immunol. 5, 305 (1987)). Weiters ist gezeigt worden, dass Impfung von Tieren mit rekombinanten Vaccinia-Viren, die bestimmte Tumor-spezifische Antigene exprimieren, wie z. B. das Human-Melanom-assoziierte Antigen P97 (Estin et al., PNAS 85, 1052 (1988)), das Rinder-Papillomavirus E7- Protein (Meneguzzi et al., Vaccine 8,199 (1990)) und das Human-Brustkrebs-assoziierte Antigen eTA (Hareuveni et al., PNAS 87, 9498 (1990)) zur Herbeiführung von Immunität gegen Tumor-Initiierung und dessen Fortschreiten führt.
Die Beschreibung WO 90/10459 (Transgene) offenbart einen rekombinanten Virusvektor, der zumindest für die essentielle Region eines nicht-strukturellen Papillomavirus- Proteins kodiert. In diesem Dokument wird das Ausdehnen des Bereichs einer Vakzine oder das Bereitstellen von mehr als einem HPV-Antigen jedoch nicht erörtert.
Die vorliegende Erfindung stellt weitere rekombinante Virus-Vakzine für Human-Papillomavirus-Infektion bereit.
Die Anmelder der vorliegende Erfindung haben erkannt, dass es wünschenswert ist, einen rekombinanten Virusvektor zu erzeugen, der als Immuntherapeutikum oder Vakzine für Affektionen nützlich ist, die durch HPV-Infektion verursacht werden, beispielsweise für Gebärmutterhalskrebs. In Bezug auf Gebärmutterhalskrebs wird nach dem Stand der Technik zu dem Zeitpunkt, als die Anmelder diese Erfindung gemacht haben, anerkannt, dass das E7-Gen das Potential hat, Zellen zu immortalisieren. Daher scheint es unangebracht, das E7-Gen in ein Immuntherapeutikum aufzunehmen. Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben jedoch die überraschende Nützlichkeit der Aufnahme des E7-Gens in ein Immuntherapeutikum erkannt. Sie haben auch erkannt, dass die vorteilhaften Auswirkungen, die durch die Behandlung mit einem Immuntherapeutikum zu erzielen sind, welches das E7-Gen umfasst, gegenüber jedem Risiko, das mit der onkogenen Aktivität des E7-Gens verbunden ist, wahrscheinlich weit überwiegen. Daher umfasst ein Aspekt der Erfindung der Anmelder die Verwendung eines rekombinanten Virusvektors, der ein E7-Gen exprimiert, als Immuntherapeutikum oder Vakzine. Weiters stellen die Anmelder Ausführungsformen ihrer Erfindung bereit, bei denen diese Risiken durch spezifische Veränderungen der Gensequenz noch weiter reduziert werden, um das onkogene Potential des E7-Gens zu verringern, ohne seine Fähigkeit zu beeinträchtigen, eine angemessene Immunreaktion zu stimulieren.
Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben auch festgestellt, dass, wenn bei einer Anzahl von HPV-Proteinen, für die verschiedene HPV-Stämme kodieren, impliziert ist, dass sie mit einer bestimmten mit HPV in Zusammenhang stehenden Affektion verbunden sind (beispielsweise Gebärmutterhalskrebs, HPV16 und HPV18; Genitalwarzen, Condyloma acuminata, Atemwegs-Papillomatose, HPV6 und HPV11; squamöses Zellkarzinom bei Individuen mit Immunsuppression, HPV5 und HPV8) es vorteilhaft wäre, ein einzelnes Virus-Recombinant zu erzeugen, das fähig ist, einen antigenen Teil der oder die gesamten Sequenzen von mehr als einem der Proteine zu erzeugen, anstatt eine Vielzahl rekombinater Viren getrennt zu erzeugen, die durch Engineering dazu gebracht werden, jedes der implizierten Viren zu exprimieren. Daher wäre es in Bezug auf Gebärmutterhalskrebs besonders vorteilhaft, ein einzelnes rekombinantes Virus zu erzeugen, das fähig ist, den antigenen Teil der oder die gesamten Sequenzen von mehr als einem der Proteine, vorzugsweise zumindest zwei der Proteine, und am meisten bevorzugt aller vier Proteine zu exprimieren, anstatt vier rekombinante Viren zu erzeugen, die durch Engineering getrennt dazu gebracht werden, jedes der potentiellen Ziele für die immunologische Erkennung von Gebärmutterhals-Tumorzellen, d. h. die HPV6 E6-, HPV16 E7-, HPV28 E6- und HPV18 E7-Proteine, zu exprimieren. Dass es den Anmeldern der vorliegenden Erfindung gelungen ist, das zu erreichen, ist besonders überraschend. Der Grund dafür ist, dass die Kodierungssequenzen für viele HPV-Proteine in hohem Maße homolog zu anderen äquivalenten HPV-Proteinen (beispielsweise von anderen Virusstämmen) sind. Daher weisen die HPV16 E6- und HPV18 E6-Proteine eine ,Gesamthomologie von 62% auf und umfassen Regionen mit sehr hoher Homologie. Dasselbe gilt für HPV16 E7 und HPV18 E7, die eine Gesamthomologie von 57% aufweisen, mit speziellen Regionen mit sehr hoher Homologie. Das bedeutet, dass zu erwarten wäre, dass Rekombination Probleme wie den Verlust von Gensequenzen aufwerfen würde. Die Anmelder haben jedoch eine neue Strategie entwickelt, die dazu be- stimmt ist, die Wahrscheinlichkeit solcher Rekombinationsereignisse zu minimieren und die schädlichen Wirkungen dieser Ereignisse zu umgehen, sollten sie tatsächlich stattfinden. So stellt die vorliegende Erfindung eine Vakzine bereit, die einen rekombinanten Virusvektor umfasst, der zumindest ein Paar Nucleotidsequenzen umfasst, die gegenüber dem Virus heterolog sind, wobei jede einen Promotor und einen offenen Leserahmen umfasst, der für das gesamte oder einen antigenen Teil eines Human-Papillomavirus- (HPV-) Proteins der Wildform oder ein mutiertes Protein kodiert; das mit dem Protein der Wildform immunologisch kreuzreaktiv ist, wobei die Nucleotidsequenzen ausreichende Sequenzhomologie aufweisen, damit Rekombination zwischen ihnen zu erwarten ist; worin das Paar Nucleotidsequenzen im Virusvektor so angeordnet ist, dass sie zueinander umgekehrt vorliegen, so dass die Wahrscheinlichkeit verringert wird, dass Rekombinationsereignisse zum Verlust eines Teils der oder aller Sequenzen führt und der Virusvektor in der Lage ist, eine Säugetier-Wirtszelle zu infizieren und den offenen Leserahmen in der Wirtszelle als Polypeptid zu exprimieren. Insbesondere stellt die Erfindung einen rekombinanten Vektor bereit, der einen Teil der oder alle vier der gewünschten Gensequenzen von HPV16 und HPV18 stabil beibehalten und exprimieren kann.
Ebenfalls von der Erfindung bereitgestellt wird ein rekombinanter Virusvektor zur Verwendung als Immuntherapeutikum oder Vakzine, der zumindest ein Paar zum Virus heterologer Nucleotidsequenzen umfasst, die jeweils einen Promotor und einen offenen Leserahmen umfassen, der für ein gesamtes oder einen antigenen Teil eines Human-Papillomavirus- (HPV-) Proteins der Wildform oder ein mutiertes Protein kodiert, das mit dem Protein der Wildform immunologisch kreuzreaktiv ist, wobei die Nucleotidsequenzen ausreichende Sequenzhomologie aufweisen, damit Rekombination zwischen ihnen zu erwarten ist; worin das Paar Nucleotidsequenzen im Virusvektor so angeordnet ist, dass sie zueinander umgekehrt vorliegen, so dass die Wahrscheinlichkeit verringert wird, dass Rekombinationsereignisse zum Verlust eines Teils der oder aller Sequenzen führt und der Virusvektor in der Lage ist, eine Säugetier-Wirtszelle zu infizieren und die offenen Leserahmen in der Wirtszelle als Polypeptid zu exprimieren. Das Paar Nucleotidsequenzen kann für einen Teil des oder das gesamte Protein E7 sowohl von HPV26 als auch HVP18 oder funktionelle Äquivalente davon kodieren.
Der rekombinante Virusvektor kann ein weiteres Paar Nucleotidsequenzen umfassen, die zum Virus heterolog sind und die (i) ausreichende Sequenz-Homologie aufweisen, damit Rekombination zwischen ihnen zu erwarten ist, wobei das weitere Paar Nucleotidsequenzen im Virusvektor so angeordnet ist, dass sie zueinander umgekehrt vorliegen, und der Virusvektor fähig ist, eine Säugetier-Wirtszelle zu infizieren, und als Polypeptid das weitere Paar heterologe Nucleotidsequenzen in der Wirtszelle zu infizieren.
Das weitere Paar Nucleotidsequenzen kann für einen Teil oder die gesamten HPV-Proteine der Wildform oder mutierte Proteine kodieren, die immunologisch kreuzreaktiv damit sind, kodieren.
Beispielsweise stellt die vorliegende Erfindung auch einen rekombinanten Virusvektor bereit, der zusätzlich zu den E7-Kodierungssequenzen auch Gensequenzen umfasst, die für einen Teil oder das gesamte Protein E6 von wohl HPV16 als auch HPV18 oder deren funktionelle Äquivalente kodieren, und zu deren Expression ausgebildet ist. Die Gensequenzen können Sequenzen umfassen, die für HPV16 E6/E7 und HPV18 E6/E7 kodieren, wie in den Fig. 1(a) bzw. 1(b) gezeigt.
Die Gensequenzen können für eine antigene Gruppe der Proteine kodieren.
Eine oder beide der Nucleotidsequenzen in einem Nucleotidsequenzen-Paar kann geändert werden, um sie weniger homolog zu machen als ein äquivalentes Paar Nucleotidsequenzen, die für HPV-Proteine der Wildform kodieren. Die Änderung der Nucleotidsequenz kann in einem Bereich mit hoher Sequenz-Homologie erfolgen. Vorzugsweise führt die Änderung der Nucleotidsequenz nicht zu einer Änderung der kodierten Aminosäuresequenz.
Zwei oder mehr Nucleotidsequenzen, die jeweils für eigene Proteine kodieren, können miteinander fusioniert werden, um einen einzigen offenen Leserahmen zu bilden. So können die Gensequenzen, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine E6 und E7 von HPV16 kodieren, miteinander fusioniert werden, um einen einzigen offenen Leserahmen zu bilden. Die Gensequenzen, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine E6 und E7 von HPV18 kodieren, miteinander fusioniert werden, um einen einzigen offenen Leserahmen zu bilden. Die Gensequenzen, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine E6 und E7 von HPV16 und HPV18 kodieren, miteinander fusioniert werden, um einen einzigen offenen Leserahmen zu bilden. So kann der rekombinante Virusvektor die Nucleotidsequenzen-Paare gemäß einer der in Fig. 26 gezeigten Möglichkeiten angeordnet aufweisen. Wenn der rekombinante Virusvektor einen offenen Leserahmen, der eine fusionierte Gensequenz aufweist, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine E6 und E7 von HPV16 kodiert, und einen getrennten offenen Leserahmen umfasst, bei dem Gensequenzen fusioniert sind, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine E6 und E7 von HPV18 kodieren, können die offenen Leserahmen zueinander umgekehrt vorliegen. Beispielsweise können die zwei offenen Leserahmen im rekombinanten Virusvektor angrenzend aneinander angeordnet sein. Die Umkehrung kann eine solche sein, dass die E6-Kodierungssequenzen von HPV16 und HPV18 beide zwischen den E7-Kodierungssequenzen von HPV16 und HPV18 angeordnet sind. Alternativ dazu könnte die Umkehrung eine solche sein, dass die E7-Kodierungssequenzen von HPV16 und HPV18 beide zwischen den E6-Kodierungssequenzen von HPV16 und HPV18 angeordnet sind. Insbesondere die beiden offenen Leserahmen, jeder mit seinem jeweiligen Promotor, können im rekombinanten Vektor nebeneinander angeordnet sein. In diesem Fall können die Promotoren zwischen den Genen angeordnet sein, die nach außen transkribiert werden, oder die Promotoren können außerhalb der Gene angeordnet werden, die nach innen transkribiert werden.
Auf ähnliche Weise können die Gensequenzen, die für einen Teil des oder das gesamte E7-Protein(s) von HPV16 und E7-Protein von HVP18 kodiert, miteinander fusioniert werden, um einen einzigen offenen Leserahmen zu bilden. Die Gensequenzen, die für einen Teil des oder das gesamte E6-Protein(s) von HPV16 und E6-Protein von HPV18 kodieren, können miteinander fusioniert werden, um einen einzigen offenen Leserahmen zu bilden. Das führt zu einer anderen Bandbreite von Anordnungen, die den in Fig. 26 gezeigten ähnlich sind. Die Fusionen können über ein einziges Codon erfolgen, das für eine relativ kleine neutrale Aminosäure, z. B. Glycin, kodiert.
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch einen rekombinanten Virusvektor bereit, der einen ersten offenen Leserahmen mit einer fusionierten Gensequenz umfasst, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine der Wildform E6 und E7 von HPV16 kodiert; und einen getrennten zweiten offenen Leserahmen mit einer fusionierten Gensequenz, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine der Wildform E6 und E7 von HPV18 kodiert; worin der erste und der zweite offene Leserahmen zueinander umgekehrt vorliegen wodurch entweder: i) die E6-Kodierungssequenzen von HPV16 und HPV18 beide zwischen den E7-Kodierungssequenzen von HPV16 und HPV18 angeordnet sind; oder 11) die E7-Kodierungssequenzen von HPV16 und HVP18 beide zwischen den E6- Kodierungssequenzen von HPV16 und HPV18 angeordnet sind; und worin jedes beliebige der Proteine der Wildform durch ein mutiertes Protein ersetzt sein kann, das immunologisch kreuzreaktiv damit ist.
Der erste und der zweite offene Leserahmen können jeweils einen entsprechenden Promotor aufweisen, und die beiden offenen Leserahmen jeweils mit ihrem Promotor sind im Virus nebeneinander angeordnet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen rekombinanten Virusvektor bereit, worin entweder: i) die Promotoren zwischen dem ersten und dem zweiten Leserahmen angeordnet sind, wodurch die offenen Leserahmen nach außen transkribiert werden; oder ii) die Promotoren außerhalb des ersten und des zweiten offenen Leserahmens angeordnet sind, wodurch die offenen Leserahmen nach innen transkribiert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen rekombinanten Virusvektor bereit, der einen ersten offenen Leserahmen umfasst, der eine fusionierte Gensequenz aufweist, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine der Wildform E6 und E7 von HPV16 kodiert; und einen getrennten zweiten offenen Leserahmen, der eine fusionierte Gensequenz aufweist, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine der Wildform E6 und E7 von HPV18 kodiert; worin die E6-Kodierungssequenzen von HPV16 und HPV18 beide zwischen den E7-Kodierungssequenzen von HPV16 und HPV18 angeordnet sind; und jeder offene Leserahmen einen entsprechenden Promotor aufweist, wobei die Promotoren zwischen dem ersten und dem zweiten offenen Leserahmen angeordnet sind, wodurch die offenen Leserahmen nach außen transkribiert werden; und worin jedes der Proteine der Wildform durch ein mutiertes Protein ersetzt sein kann, das immunologisch kreuzreaktiv damit ist.
Die Proteine der Wildform HPV16E7 und HPV18E7 können durch mutierten Proteine ersetzt sein, die im Wesentlichen homolog zu den Proteinen der Wildform sind und bei denen die Reste cys 24 und glu 26 des Proteins der Wildform HPV16E7 und die Reste cys 27 und glu 28 des Proteins der Wildform HPV18E7 durch Glycin-Reste ersetzt sind.
Der rekombinante Virusvektor kann von Vaccinia-Virus abgeleitet werden.
Die Anmelder haben auch erkannt, dass es für die wirksame Funktion als Immuntherapeutikum wünschenswert ist, dass das rekombinante Virus seine Fähigkeit zur Replikation und dadurch zur Erzeugung einer aktiven Infektion beibehält, damit eine zelluläre Immunreaktion gegen die Proteine einsetzen kann, für die das Virus kodiert. Daher schlagen die Anwender vor, die fremden Gensequenzen in das Virusvektor an Stellen zu insertieren, deren Unterbrechung durch die Insertion der heterologen Gensequenzen die viralen Funktionen, die mit der replikativen Fähigkeit des Virus im infizierten Wirtstier in Zusammenhang stehen, im Wesentlichen nicht stört und daher im Wesentlichen nicht beeinträchtigt. Die Anmelder bezeichnen diese Stellen als "neutrale Orte" (obwohl der Begriff "neutral" nichtstreng interpretiert werden sollte, da bekannt ist, dass die Unterbrechung dieser Orte geringfügige, aber relativ folgenlose negative Auswirkungen auf die Replikationsfähigkeit hat).
DNA-Sequenzen, die die Virus-Replikation beeinträchtigen, können in mehrere Kategorien fallen:
i) Protein-Kodierungssequenzen;
ii) Elemente, die an der Kontrolle der Genexpression beteiligt sind; und
iii) Elemente, die an der Virus-DNA-Replikation beteiligt sind.
Eine nicht-essentielle und neutrale Insertionsstelle muss daher solche Regionen vermeiden, und solche Stellen sind auf der Basis von Nucleotidsequenzierungs-Untersuchungen identifiziert worden. So können die Gensequenzen in neutrale Orte innerhalb des Virus-Genoms insertiert werden. Eine oder mehrere Gensequenzen können in denselben neutralen Ort insertiert werden.
Tests auf neutrale Orte können nach Techniken, die nach dem Stand der Technik allgemein bekannt sein, leicht durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein Ort unter Einsatz von Standardmethoden selektiert, unterbrochen oder deletiert werden, und das resultierende rekombinante Virus normalerweise unter Bedingungen gebracht werden, die das Wachstum des Virusvektors der Wildform normalerweise unterstützen, um die Wirkung der Manipulationen zu bewerten. Die Pathogenität des Virus kann weiters mit jener des nichtmodifizierten Virusvektorstamms in Tiermodellen verglichen werden, um sein Attenuationsausmaß zu bewerten.
Gemäß vorliegender Erfindung kann der Virusvektor das Vaccinia-Virus sein. Das Vaccinia-Virus kann nicht-infektiös gemacht oder untauglich gemacht werden, so dass es unfähig ist, vollständig zu replizieren und eine umfassende Infektion von Wirtszellen zu bewirken.
Vaccinia-Virus ist in der Vergangenheit in großem Umfang für die Pockenimpfung verwendet worden, und seine weltweite Verwendung hat zur vollkommenen Ausrottung der Krankheit geführt (Bhebehami, Microbiol. Rev. 47, 455 (1983)). Im Verlauf der Kampagne der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zur Ausrottung der Pocken sind mehrere verschiedene Vaccinia-Virus-Stämme als Vakzinen eingesetzt worden. 1984 hat unter der Verantwortlichkeit der WHO eine Konferenz stattgefunden, um die Verwendung von Vaccinia-Virus als Lebend-Virusvektoren zu erörtern (Bulletin of the WHO 63(3), 471-477). Die Daten in diesem Bericht weisen darauf hin, dass die Anzahl an Komplikationen, die mit der Impfung verbunden waren; beim Wyeth-Stamm des Vaccinia-Virus am geringsten war, und daher wurde dieser Stamm als Basis für die Konstruktion des rekombinanten Virus gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gewählt.
Es ist allgmein bekannt, dass die Insertion fremder DNA in das Genom von Vaccinia-Virus an bestimmten bevorzugten Stellen, wie z. B. dem Thymidin-Kinase-Gen-Ort, die Fähigkeit des Virus zur Replikation in vivo dramatisch verringern kann. Wie oben erörtert besteht das Ziel des hier beschriebenen therapeutischen Ansatzes darin, eine aktive Infektion in vivo hervorzurufen, so dass eine zelluläre Immunreaktion gegen die Proteine hervorgerufen werden kann, für die das Virus kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Insertieren fremder Gene an neutralen Orten innerhalb des Genoms eines Virus bereit, wobei die Unterbrechung der Stellen durch die Insertion die Virus- Replikation nicht beeinflusst und daher nicht nennenswert beeinträchtigt.
Wenn das Virus ein Vaccinia-Virus ist, kann der neutrale Ort gemäß vorliegender Erfindung innerhalb des Wyeth-Stamms von Vaccinia-Virus auf Basis der verwandten WR- Stamm-Nucleotidsequenz identifiziert werden. Alternativ dazu können, wenn andere Vaccinia-Virus-Stämme verwendet werden, Stellen eingesetzt werden, die zu den oben identifizierten Orten äquivalent sind. Die neutralen Orte können beliebige der nachstehend als A, B, C oder D identifizierten oder funktionelle Äquivalente davon sein.
Für die erfolgreiche Expression fremder Proteine durch den rekombinanten Virusvektor müssen die fremden Gene unter die Kontrolle einer Promotorsequenz gebracht werden, die für das Virus operabel ist. So kann der rekombinante Virusvektor einen einzigen Promotor umfassen, der die Expression aller heterologer Gensequenzen innerhalb eines einzigen offen Leserahmens kontrolliert. Alternativ dazu kann, wenn der rekombinante Virusvektor für mehr als einen offenen Leserahmen kodiert, der heterologe Gensequenzen enthält, das Virus einen ersten Promotor umfassen, der die Expression der Gensequenz von einem ersten offen Leserahmen kontrolliert, sowie einen oder mehrere weitere Promotoren, die die Expression der Gensequenz von einem oder mehreren weiteren offenen Leserahmen kontrollieren. Die Promotorsequenz kann virusspezifisch sein, und bisher sind mehrere charakterisiert worden (Davison & Moss, J. Mol. Biol. 210, 749 (1989); Davison & Moss, J. Mol. Biol. 210, 771 (1989)). Der einzelne Promotor und der erste und ein oder mehrere weitere Promotoren können der p7.5 Promotor sein. Es gibt Berichte, dass die Induktion von für fremdes Antigen spezifischen CTLs die Expression des Antigens früh im Virus-Replikationszyklus erfordert (Coupar et al., Eur. J. Immunol. 16, 1479 (1986)). Daher kann ein rekombinantes Virus, wie gemäß vorliegender Erfindung bereitgestellt, die Verwendung des p7.5-Promotors (Venkatesan et al., Cell 125, 805 (1981)) und/oder des H6-Promotors (Rosel et al., J. Virol. 60, 436 (1988)) umfassen, die beide sowohl früh als auch spät in der Infektion aktiv sind.
Wie bereits erwähnt ist berichtet worden, dass das E7-Gen allein das Potential hat, Zellen zu immortalisieren (Phelps et al., Cell 53, 549 (1988)). Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Strategie zur Expression des Proteins die Produktion von E7 als Fusionsprotein mit E6, bei dem es unwahrscheinlich ist, dass es biologische Funktion beibehält. Ausführungsformen der Erfindung sorgen dafür, dass dieses Risiko noch weiter verringert wird, indem Änderungen innerhalb des E7-Gens vorgenommen werden, von denen bekannt ist, dass sie seine onkogene Kapazität zerstören (Chesters et al., J. Gen Virol. 71, 44 (1990)). Daher können in den rekombinanten Virusvektoren gemäß vorliegender Erfindung die Gensequenzen, die für einen Teil oder die gesamten E7-Proteine kodieren, gegenüber den äquivalenten Sequenzen der Wildform verändert werden, um die Sequenzen, die bei den rekombinanten Virusvektoren eingesetzt werden, weniger onkogen zu machen als ihre äquivalenten Sequenzen der Wildform.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Pharmazeutika bereit, die rekombinante Virusvektoren wie gemäß vorliegender Erfindung definiert umfassen. Das Pharmazeutikum kann zur Verwendung gegen eine durch HPV-Infektion bewirkte Affektion dienen, die eine immuntherapeutisch wirksame Menge eines rekombinanten Virusvektors umfasst. Das Pharmazeutikum kann zur Verwendung gegen Gebärmutterhalskrebs dienen.
Das Pharmazeutikum kann eine Vakzine zur Immunisierung gegen eine durch HPV-Infektion bewirkte Affektion sein, die eine Menge an rekombinantem Virusvektor wie gemäß vorliegender Erfindung vorgesehen umfasst, die, wenn sie einem Rezipienten verabreicht wird, spezifisch Zellen des Immunsystems gegen HPV-Proteine aktivieren kann. Die Vakzine kann zur Immunisierung gegen Gebärmutterhalskrebs dienen.
Die Pharmazeutika können einen oder mehrere Exzipienten umfassen. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Verwendung der rekombinanten Virusvektoren wie gemäß vorliegender Erfindung definiert zur Herstellung von Medikamenten zur Verwendung als Immuntherapeutika oder Vakzinen gegen Affektionen bereit, von denen angenommen wird, dass die durch HPV-Infektion verursacht werden, beispielsweise für die Prophylaxe und Behandlung von Gebärmutterhalskrebs.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Behandlung von Säugetieren mit rekombinanten Virusvektoren und Pharmazeutika wie gemäß vorliegender Erfindung bereitgestellt bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Bestimmen eines neutralen Orts in einem Virusvektor bereit, dessen Unterbrechung durch die Insertion heterologer Gensequenzen die virale Funktion, die mit der Replikationsfähigkeit des Virus in Zusammenhang steht, nicht beeinflusst und daher im Wesentlichen nicht beeinträchtigt. Das Verfahren für diese Bestimmung umfasst: (a) das Analysieren eines viralen Genoms, um offene Leserahmen zu identifizieren, bei denen wahrscheinlich ist, dass sie für funktionelle Gene kodieren, indem nach der erwarteten Codon-Nutzung zwischen beabstandeten Start- und Stop-Codons gesucht wird; und (b) das Auswählen von Stellen, die sich nicht in solchen offenen Leserahmen befinden, bei denen wahrscheinlich ist, dass sie für funktionelle Gene kodieren, wie in (a) identifziert. Das kann das Auswählen von Stellen zwischen offenen Leserahmen für Sequenzen funktioneller Gene und das Auswählen von Stellen umfassen, die in offenen Leserahmen vorliegen, die gewisse funktionelle Gencharakteristika aufweisen, wie z. B. eine erwartete Codon-Nutzung, die aber andere essentielle Charakteristika, wie z. B. ein Start-Codon, verloren haben. Das Verfahren kann auch das Unterbrechen oder Deletieren der ausgewählten Stellen aus dem viralen Genom und das Versetzen des resultierenden Vektors in Bedingungen umfassen, die normalerweise das Wachstum des Virus der Wildform unterstützen.
Die vorliegende Erfindung stellt auch neutrale Orte bereit, die durch den Einsatz der obigen Verfahren identifiziert wurden.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Ausführungsform bereit, die einen Weg zur Herbeiführung einer zellulären Immunreaktion gegen die Papillomavirus-Proteine, die üblicherweise in Gebärmutterhals-Krebszellen exprimiert werden, durch die Schaffung eines rekombinanten Vaccinia-Virus zeigt, das durch Engineering dazu gebracht worden ist, während seines Replikationszyklus die HPV E6- und E7-Proteine oder solche Proteine zu erzeugen, die die HPV E6- und E7-Sequenzen enthalten. Dieses therapeutische Vaccinia-Virus enthält die E6- und E7-Gene von sowohl HPV16 als auch HPV18, den Viren, die am häufigsten mit Gebärmutterhalskarzinom in Verbindung stehen. Impfung mit diesem einzelnen Virus kann daher die Immunität gegen die E6- und E7-Proteine der HPV- Typen stimulieren, die mit mehr als 80 0/0 der Gebärmutterhalstumore in Verbindung stehen. Expression aller vier Gensequenzen (z. B. HPV16 E6 und E7; HPV18 E6 und E7) in einem einzigen Virus stellt jedoch ein Problem dar, da es wahrscheinlich ist, dass Gensequenzen durch Rekombination verloren gehen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um diese Schwierigkeit zu umgehen, erstens durch spezifische Sequenz-Veränderung, um die Sequenz-Homologie zu verringern, und zweitens durch ihre Insertion in das Vaccinia-Virus-Genom auf solche Weise, dass, wenn eine solche Rekombination stattfinden sollte, sie nicht zum Verlust von Sequenzen führen würde (d. h. in umgekehrter Ausrichtung in Bezug aufeinander). Expression der gewünschten vier Gensequenzen im Vaccinia-Virus-Genom könnte ebenfalls schwer (wenn auch nicht unmöglich) als unabhängige Expressionseinheiten zu erreichen sein, und daher sieht die vorliegende Erfindung statt dessen vor, dass die offenen E6- und E7-Leserahmen miteinander fusioniert werden können. Ein Problem bei Standardverfahren zur Insertion fremder Information in das Vaccinia-Virus-Genom besteht darin, dass die Verwendung selektierbarer Marker, um die Rekombinationseffizienz zu erhöhen, dazu führt, dass schlussendlich auch das selektierbare Markergen selbst im rekombinanten Virus vorhanden ist. Es sind jedoch Verfahren zur Insertion entwickelt worden, die die nachfolgende Beseitigung dieser nicht-zugehörigen Sequenzen ermöglichen (Falkner & Moss, J. Virol., 64, 3108 (1990)), und diese werden bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet, um zu gewährleisten, dass das fertige rekombinante Vaccinia-Virus nur jene zusätzlichen Sequenzen aufweist, die für seine erforderliche Funktion notwendig sind.
Zum besseren Verstädnis der vorliegenden Erfindung wird nun eine Ausführungsform unter Bezugnahme auf die Figuren detaillierter beschrieben, in denen:
Fig. 1 (a) eine Nucleotidsequenz und Drei-Rahmen-Translation von HPV16 E6/E7-Polymerasekettenreaktionsprodukt zeigt (unterstrichene Regionen bezeichnen die E6- und E7-Kodierungssequenzen); Fig. 1 (b) die Nucleotidsequenz und Drei-Rahmen-Translation von HPV18 E6/E7-Polymerasekettenreaktionsprodukt zeigt (unterstrichene Regionen bezeichnen die E6- und E7-Kodierungssequenzen);
Fig. 2 die Klonierung und Modifikation der HPV16- und HPV18-E6- und E7-Gene zeigt;
Fig. 3 ein Schema eines offenen Leserahmens von Vaccinia-Virus von den Positionen 17201-18450 der Region zeigt, die von den vier Fragmenten SalF,G,H und I abgedeckt wird; kurze vertikale Linien bezeichnen Terminationscodons, Linien mit Kästchen am oberen Ende bezeichnen Initiationscodons, Rechtecke zeigen relevante offene Leserahmen; und Pfeile zeigen die Richtung der oberen und unteren DNA-Stränge an;
Fig. 4 ein Schema des offenen Leserahmens von Vaccinia-Virus von den Positionen 21001-22000 der Region zeigt, die von den vier Fragmenten SalF, G, H und 1 abgedeckt wird; kurze vertikale Linien bezeichnen Terminationscodons, Linien mit Kästchen am oberen Ende bezeichnen Initiationscodons, Rechtecke zeigen relevante offene Leserahmen, und Pfeile zeigen die Richtung der oberen und unteren DNA-Stränge an;
Fig. 5 ein Schema des offenen Leserahmens von Vaccinia-Virus von den Positionen 23501-25000 der Region zeigt, die von den vier Fragmenten SalF, G, H und I abgedeckt wird; kurze vertikale Linien bezeichnen Terminationscodons, Linien mit Kästchen am oberen Ende bezeichnen Initiationscodons, Rechtecke zeigen relevante offene Leserahmen, und Pfeile zeigen die Richtung der oberen und unteren DNA-Stränge an;
Fig. 6 ein Schema der Codon-Nutzung von Vaccinia-Virus von den Positionen 17201- 18450 der Region zeigt, die von den vier Fragmenten SalF, G, H und I abgedeckt wird; Pfeile zeigen die Richtung eines jeden DNA-Strangs an;
Fig. 7 ein Schema der Codon-Nutzung von Vaccinia-Virus von den Positionen 210001- 22000 der Region zeigt, die von den vier Fragmenten SalF, G, H und I abgedeckt wird; Pfeile zeigen die Richtung eines jeden DNA-Strangs an;
Fig. 8 ein Schema der Codon-Nutzung von Vaccinia-Virus von den Positionen 23501- 25000 der Region zeigt, die von den vier Fragmenten SalF, G, H und I abgedeckt wird; Pfeile zeigen die Richtung eines jeden DNA-Strangs an;
Fig. 9 die DNA-Sequenz um Ort A zeigt, die Translationen im Ein-Buchstaben-Aminosäurecode der Gene SalF 17R und SalF 19R zeigt;
Fig. 10 die DNA-Sequenz um Ort B zeigt, die Translationen im Ein-Buchstaben-Aminosäurecode der Gene SalF 20R und SalF20.5R zeigt;
Fig. 11 eine Vergleich des offenen SalG2R-Leserahmens mit der Hefe-Guanylat-Kinase- Gensequenz zeigt;
Fig. 12 die DNA-Sequenz um Ort D zeigt, die Translationen im Ein-Buchstaben-Aminosäurecode der Gene HindB3R und Hind B4R zeigt;
Fig. 13 das Klonieren von neutralen Orten des Vaccinia-Virus (Wyeth-Stamm) zeigt;
Fig. 14 das Klonieren von Vaccinia-Virus-Promotorsequenzen zeigt;
Fig. 15 die Konstruktion einer Vaccinia-Promotor-angetriebenen E6-7-Kassette zeigt;
Fig. 16 das Klonieren der E6-7-Kassette in neutrale Orte des Vaccinia-Virus (Wyeth- Stamm) zeigt;
Fig. 17 ein Diagramm ist, das die Rekombination zeigt, die erforderlich ist, um das fertige therapeutische Vaccinia-Virus - rekombinantes HPV-Virus, zeigt;
Fig. 18 die synthetischen Oligonucleotide zeigt, die bei der Konstruktion des therapeutischen Vaccinia-Virus-HPV-Recombinants verwendet werden;
Fig. 19 die Nucleotidsequenz von Vaccinia-Virus (WR-Stamm) von den Positionen 17201-18450 der Region zeigt, die von den vier Fragmenten SalF, G, H und I abgedeckt wird;
Fig. 20 die Nucleotidsequenz von Vaccinia-Virus (WR-Stamm) von den Positionen 21001-22000 der Region zeigt, die von den vier Fragmenten SalF, G, H und I abgedeckt wird;
Fig. 21 die Nucleotidsequenz von Vaccinia-Virus (WR-Stamm) von den Positionen 23501-25000 der Region zeigt, die von den vier Fragmenten SalF, G, H und I abgedeckt wird.
Fig. 26 eine Vielzahl von Optionen für die Anordnung von HPV16E6- und -E7- und HPV18E6- und -E7-Kodierungssequenzen in einem rekombinanten Virusvektor zeigt.
Alle Klonierungsverfahren werden nach den Vorschriften durchgeführt, die in "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook, Fritsch und Maniatis (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, beschrieben werden. Alle Plasmide, an denen ortsgerichtete Mutagenese vorgenommen wird, gehören dem "Phagemid"-Typ an, der durch Superinfektion mit dem Bacteriophagen f1 in einsträngige DNA umgewandelt werden kann. Vorbereitung und ortsgerichtete Mutagenese von einsträngiger DNA wird durchgeführt wie von Brierley et al., Cell 57, 537 (1989), beschrieben. Die Sequenz aller verwendeten synthetischen Oligonucleotide ist in Fig. 18 dargelegt.

Herstellung der E6- und E7-Gene von HPV16 und HPV18 zur Insertion in Vaccinia-Virus

Klonieren von HPV16- und HPV18-E6 und E7

Ein Fragment von DNA, das die HPV16 E6/7-Kodierungsregion enthält, wird durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifizierung aus dem Plasmid pBR322/HPV16 (Durst et al., PNAS 80, 3812 (1983)) hergestellt, wobei die Oligonucleotide S05 und 506 verwendet werden. Ein Fragment, das die gleiche Region von HPV18 enthält, wird durch das gleiche Verfahren aus Plasmid pBR322/HPV18 (Boshart et al., EMBO). 3, 1151) hergestellt, wobei die Oligonucleotide 501 und SO&sub2; verwendet werden. Die Plasmide pBR- 322/HPV16 und pBR322/HPV18 sind beide von der Behringwerke AG, Postfach 1140 D-3550, Marburg, BRD, erhältlich (alternativ dazu können die erforderlichen Sequenzen synthetisch aus der Sequenzinformation erzeugt werden, die die vorliegende Anmeldung bereitstellt).
In jedem Fall wird dadurch ein DNA-Fragment mit etwa 800 Basenpaaren (bp) erzeugt, das eine Stelle für das Restriktionsenzym Nco 1 (CCATGG) aufweist, die genau am Beginn des E6-Gens liegt, sowie eine Sma1-Stelle unmittelbar stromab vom Terminationscodon für das E7-Gen (Fig. 1 (a) und (b)). Die Produkte werden dann mit Nco1 und Sma1 verdaut und in mit Nco1-Sma1 verdautes Plasmid pUC118Ns kloniert (eine modifizierte Version des "Phagemids" pUC118 (Viera & Messing, Methods Enzymol. 153, 3 (1987)), in dem Nco1- und Sma1-Stellen durch ortsgerichtete Mutagenese innerhalb der Polylinker-Region erzeugt worden sind), wodurch die Plasmide p1MS7, das die HPV16-Sequenzen enthält, und pIMS8, das die HPV18-Sequenzen enthält, erzeugt werden (Fig. 2). Die Verwendung von pUC118 ist für die vorliegende Strategie nicht entscheidend, da jedes Plasmid, das durch ortsgerichtete Mutagenese manipuliert werden kann, erfolgreich eingesetzt werden kann.

Fusion der E6- und E7-ORFs

Zur Insertion in Vaccinia-Virus werden die E6- und E7-Gene von jeder HPV-Type zunächst miteinander fusioniert, um einen einzigen kontinuierlichen ORF zu bilden. Das wird durch ortsgerichtete Mutagenese wie folgt erreicht:
(i) Das Terminationscodon TAA von HPV16 E6 in pIMS7 wird unter Verwendung des Oligonucleotids 520 zur Sequenz GGAA abgeändert. Das dient dazu, die normalerweise getrennten ORFs von HPV16 E6 und E7 in einen einzigen ORF umzuwandeln (pIMS7.1 - Fig. 2).
(11) Das Terminationscodon TAA von HPV18 E6 in pIMS8 wird unter Verwendung des Oligonucleotids 521 zur Sequenz GGAA abgeändert. Das dient dazu, die normalerweise getrennten ORFs für HPV16 E6 und E7 in einen einzigen ORF umzuwandeln (pIMS8.1 - Fig. 2).

Beseitigung des Immortalisierungspotentials von E7

Um die Immortalisierüngseigenschaften jedes der E7-Proteine zu zerstören, werden zwei Schlüsselcodons innerhalb der HPV16 E7-Kodierungssequenzen (cys24 und g1u26 Fig. 1 (a)) und die äquivalenten Codons von HPV18 E7 (cys27 und glu29 - Fig. 1 (b)) durch ortsgerichtete Mutagenese wie folgt zu Glycinresten geändert.
(i) Die Sequenz des E7-Gens wird zu pIMS7 geändert, um an den Codons 24 und 26 (die normalerweise für Cystein bzw. Glutamat kodieren) für Glycin zu kodieren, wobei Oligonucleotid 522 verwendet wird (pIMS7.2 - Fig. 2).
(11) Die Sequenz des E7-Gens wird zu pIMS8 geändert, um an den Codons 27 und 29 (die normalerweise für Cystein bzw. Glutamat kodieren) für Glycin zu kodieren, wobei Oligonucleotid 523 verwendet wird (pIMS8.1 B - Fig. 2).

Reduktion des ntertypischen Kekombinationspotentials oer MMV 16 Una MMV 18 E6- ung E7-Sequenzen und Beseitigung des potentiellen Vaccinia-Virus-Transkriptionsterminationssignals

Eine potentielle Schwierigkeit durch das Vorhandensein sowohl der HPV16- als auch der HPV16 E6- und E7-spezifischen DNA innerhalb des Genoms eines einzelnen Virus besteht darin, dass Rekombination zwischen den beiden Sätzen verwandter Sequenzen zum Verlust oder zur Neuanordnung von Information führen kann, so dass die Expression der erforderlichen Proteine unterbrochen wird. Die Erfindung stellt Möglichkeiten bereit, dieses Risiko zu minimieren. Erstens durch das Insertieren der beiden Sätze genetischer Information im Vaccinia-Genom in zueinander entgegengesetzter Ausrichtung (so dass Rekombination nicht zum Verlust von Sequenzinformation führt, sondern zu ihrer Umkehrung). Zweitens durch das Erzeugen spezifischer Änderungen in der E6%7-. Sequenz eines der HPV-Virusstämme an Stellen, wo die Homologie am stärksten ist. Diese Änderungen erfolgen jedoch auf solche Weise, dass das Aminosäure-Kodierungspotential der Gene unverändert bleibt.
Die HPV18 E6-Sequenz wird daher durch ortsgerichtete Mutagenese wie folgt geändert:
Die Sequenz TTTTTATTCTAGAATTAGAG (die 210 Nucleotide vom Start von E6 beginnt - in Fig. 1 (b) unterstrichen) wird unter Verwendung von Oligonucleotid 524 zur Sequenz TTTCTACAGTAGAATCAGAG mutiert (pIMS8.2 - Fig. 2) (geänderte Nucleotide sind fett gedruckt).
Ein zweites Ziel dieser Änderung besteht darin, aus der HPV18 E6-Sequenz die Sequenz TTTTTAT zu eliminieren, die ein potentielles Terminationssignal für das frühe Vaccinia- Virus-Transkriptionsenzym ist (Rohrmann et al., Cell 46, 1029 (1986)).

Quelle und Vermehrung des Vaccinia-Virus

Der Wyeth-Stamm von Vaccinia-Virus wird für die Konstruktion des therapeutischen Virus verwendet. Er wird in Vero-Zellen zum Zweck genetischer Manipulation vermehrt, und in der diploiden Human-Fibroblasten-Zelllinie MRCS für die Erzeugung des fertigen therapeutischen Virus-Vorrats.
Beide Zeillinien werden vom National Institute of Biological Standards and Control, South Mims, UK, erhalten. Der Wyeth-Stamm von Vaccinia-Virus, Vero-Zellen und die Zelllinie MRC5 sind auch von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, erhältlich.

Identifizierung und Klonierung neutraler Orte aus dem Vaccinia-Virus

Beschreibung neutraler Orte

Für den Zweck der Insertion von Papillomavirus-Genen innerhalb des Vaccinia-Virus- Genoms sind die Orte so gewählt worden, dass sie zwei Charakteristika aufweisen.
Zunächst sollten sie nicht-essentielle Regionen sein, d. h. die Insertion fremder Gene an diesen Punkten unterbricht keinerlei Funktionen des Vaccinia-Virus in einem solchen Ausmaß, dass sich das Virus in Gewebekultur nicht mehr vermehren kann.
Zweitens sollten sie neutrale Orte sein, d. h. durch die Insertion fremder Gene an all diesen Punkten wird das Ausmaß an Attenuation des Vaccinia-Virus weder erhöht und verringert.
Der Unterschied zwischen diesen beiden Faktoren ist durch Betrachtung des Thymidin- Kinase- (TK-) Gens von Vaccinia-Virus zu erkennen. Es handelt sich dabei um eine nichtessentielle Region, und daher können sich Viren, bei denen Gene in das TK-Gen insertiert sind, in Gewebekultur gut vermehren (Mackett et al., J. Virol. 49, 857 (1984)). Es ist jedoch festgestellt worden, dass derartige Viren in vivo stark attenuiert werden (Buller et al., Nature 317, 813 (1985)). Für den Zweck prophylaktischer Impfung kann eine solche erhöhe Attenuation wünschenswert sein. Bei einer imuntherapeutischen Strategie jedoch, wo die Gefahr von der zu behandelnden Krankheit das Risiko von mit der Vakzine verbundenen Komplikationen deutlich übersteigt, wird die Verwendung eines attenuierten Virus als unerwünscht angesehen, da es die immunologische Reaktion auf Papillomavirus-Antigene beeinträchtigen könnte. Daher haben die Anmelder Stellen identifiziert, von denen sie glauben, dass sie das Virus nicht weiter attenuieren werden, und haben sie als "neutrale Orte" bezeichnet. Derartige Orte sind durch sorgfältige Analyse der DNA-Sequenz des WR-Stamms innerhalb des Virusgenoms identifiziert worden. Der WR-Stamm wurde ursprünglich durch Passage in Mäuse-Gehirn vom Wyeth-Stamm abgeleitet. Daher sind die beiden Stämme eng verwandt. Die Nucleotidsequenz von drei Regionen des WR-Genoms, die die selektierten neutralen Orte enthalten, werden in den Fig. 19, 20 und 21 gezeigt. Vier neutrale Orte (A-D) sind nach den oben erörterten Kriterien wie folgt ausgewählt worden:
Ort A: Gap zwischen SalF17R und SalF19R
Ort B: Gap zwischen SalF19R und SalF20.5R
Ort C: in Salg2R, einpotentielles nicht-funktionelles Gen
Ort D: in HindB3.5R, ein potentielles nicht-funktionelles Gen
Diese Orte (A-D) können durch die folgenden DNA-Sequenz-Längen identifiziert werden, die jeweils eine Länge von 40 Nucleotiden aufweisen:
A CTATCTACCAGATTATTATGTGTTATAAGGTACTTTTTCT
B TATTGTGCTACTGATTCTTCACAGACTGAAGATTGTTGAA
C TCTCTTAAAATGGTTGAGACCAAGCTTCGTTGTAGAAACA
D TGAGGCTACCTCGACATACGTGTGCGCTATCAAAGTGGAA
Bei anderen Stämmen können diese Sequenzen variieren, können aber weiterhin beträchtliche Homologie mit den oben angeführten aufweisen. Insbesondere kann eine Stelle zumindest 90%, mehr bevorzugt 95%, Homologie mit der oben angeführten Sequenz aufweisen.
Die Fig. 3 bis 5 zeigen die Verteilung der Inititiationscodons und offenen Leserahmen (ORFs) in den Regionen des Vaccinia-Virus-Genoms, wie in den Fig. 19, 20 und 21 gezeigt. Die Fig. 6 bis 8 zeigen die gleichen Regionen, wobei die Grafik zeigt, in welchem Ausmaß jeder Leserahmen dem Muster der Codon-Nutzung entspricht, das für Vaccinia- Gene erwartet wird. Eine Grafik der Codon-Nutzung wird für jeden der drei möglichen Leserahmen in jeder Richtung aufgetragen (R. Staden, Nucl. Acids Res. 12, 521 (1984); R. Staden, Nucl. Acids Res. 12, 551 (1984)). Bei diesen Codon-Nutzungs-Grafiken stellen die kurzen vertikalen Striche, die sich von den horizontalen Achsen weg erstrecken, Startcodons dar. Die längeren vertikalen Striche, die sich oberhalb der horizonalen Achsen erstrecken, stellen Stopcodons dar. Diese Art von Grafik ist eine nützliche Methode, die dabei hilft, zu bestimmen, ob ein bestimmter ORF ein echtes Vaccinia-Gen ist. Wenn es sich wahrscheinlich um ein echtes Gen handelt, steigt die Kurve der Codon- Nutzung zwischen einem Startcodon und einem Stopcodon an. Beispielsweise ist in Fig. 7 zu erkennen, dass die Kurve der Codon-Nutzung über die Region des SalG2R-ORFs ansteigt (die gepunktete Linie zeigt, dass dieser Rahmen der erwarteten Codon-Nutzung weitgehend entspricht). Für die anderen beiden Rahmen zeigen die Grafiken, dass sie der Vaccinia-Codon-Nutzung nicht entsprechen. Der mit "Teil von gk" bezeichnete Peak, der mit einer strichlierten Linie markiert ist, entspricht ebenfalls weitgehend der Vaccinia-Codon-Nutzung. Zusammenfassend muss ein echtes Gen mit einem Initiations- (Start-) Codon beginnen, mit einem Terminations- (Stop-) Codon enden und sollte der Vaccinia-Codon-Nutzung entlang seiner Länge weitgehend entsprechen. In den meisten Fällen fällt die Konformität der Vaccinia-Codon-Nutzung außerhalb des Gens steil ab.
Die neutralen Orte werden in der Folge näher beschrieben:

Ort A. Gap zwischen SalF17R und SalF19R

Ort A ist in den Fig. 3 und 6 markiert. Fig. 8 zeigt die tatsächliche DNA-Sequenz mit einer Translation der ORFs auf beiden Seiten der Stelle. Es ist zu erkennen, dass Ort A in einer Intergerl-Region zwischen SalF17R und SalF19R angeordnet ist. Er ist etwa 195 Basen stromauf von SalF19R angeordnet, um jegliche mit diesem Gen assoziierten Promotor-Elemente zu vermeiden. Die Sequenz TTTTTCT (kursiv gedruckt) fungiert als Terminator der frühen RNA-Transkription für das SalF17R-Gen, wenn es sich um ein frühes Gen handelt. Der ist jedoch stromauf vom ersten davon angeordnet, so dass er die frühe Termination der Transkription nicht beeinträchtigt, wenn sie stattfindet. Prüfung von Fig. 6 zeigt, dass es kein erkennbares Gen auf dem entgegengesetzten Strang an diesem Punkt gibt, und daher eignet sich diese Sequenz-Stelle als neutrale Insertionsstelle.

Ort B. Gap zwischen SalF19R und SalF20.5R

Ort B ist in den Fig. 3 und 6 markiert. Fig. 10 zeigt die tatsächliche DNA-Sequenz mit einer Translation der ORFs an beiden Seiten der Stelle. Es ist zu erkennen, dass Ort B in einer Intergen-Region zwischen SalF19R und SalF20.SR angeordnet ist. Fig. 6 zeigt, dass sie sich innerhalb einer Region mit hoher Vaccinia-Codon-Nutzung befindet, aber dass diese Region kein echtes Gen bildet, weil es kein Initiationscodon aufweist. Außerdem lässt Fig. 6 darauf schließen, dass Sa120.5R kein vollständiges Gen ist, da die Konformität der Vaccinia-Codon-Nutzung am Start des Gens dramatisch absinkt. Für den Fall, dass SalF20.5R ein echtes Gen ist, ist Ort B etwa 70 Basen stromauf von SalF20.5R angeordnet, wodurch jegliche Promotorelemente, die mit diesem Gen assoziiert sind, weitgehend vermieden werden können (Anmerkung: viele Vaccinia-Promotorelemente befinden sich etwa 35 Basen stromauf vom Start des Gens.) Außerdem weist SalF20R kein TTTTTNT-Transkriptionsterminationssignal (N = ein beliebiges Nucleotid) auf, das Ort B stören könnte. Daher eignet sich diese Sequenzstelle als neutraler Insertionsort.

Ort C. Innerhalb von SalG2R, ein potentielles nicht-funktionelles Gen

Ort C ist in Fig. 4 markiert. Der ORF SalG2R weist beträchtliche Ähnlichkeit mit dem Guanylat-Kinase- (GK-) Gen von Hefe auf. Diese Ähnlichkeit wird in Fig. 11 gezeigt.
Die Sequenz stromauf vom SalG2R ORF (aber in einem anderen Rahmen) ist auf Sal-G2R hinzugefügt worden, um zu erkennen, ob sich die Lbereinstimmung mit GK über die Grenzen der ursprünglichen offenen Leserahmens hinaus erstreckt. Die Übereinstimmung scheint sich über das 5-Ende des SalG2R ORF hinaus zu erstrecken. Insbesondere stimmt eine wichtige Stelle im Hefe-GK-Gen, die ATP/GTP-Bindungsstelle (unterstrichen gezeigt) nur in der außerhalb des Rahmens liegenden. Sequenz stromauf vom SalG2R ORF überein. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass das SalG2R-Gen nicht als Guanylat- Kinase aktiv ist und als "Pseudogen" bezeichnet werden kann. Wenn das Gen inaktiv ist, wie die Anmelder folgern, dient es als neutraler Insertionsort.

Ort D. Innerhalb von HindB3.5R, ein potentielles nicht-funktionelles Gen

Fig. 5 zeigt, dass Ort D innerhalb der mit Hind83.5R bezeichneten Region liegt. Diese Region entspricht zwar der Vaccinia-Codon-Nutzung, weist jedoch kein Start-Codon auf und ist daher kein echtes Gen. Das in Fig. 8 gezeigte Codon-Nutzungsdiagramm weist darauf hin, dass es vermutlich früher ein funktionelles Gen war und möglicherweise an HindB3R gebunden war (eine Verschiebung der Codon-Nutzungspräferenz tritt hier weit weg vom Terminationscodon des HindB3R-ORF auf, vas darauf hinweist, dass der letzte Abschnitt von HindB3R nicht wirklich Teil dieses Gens ist.) Daher ist es wahrscheinlich, dass HindB3.5R nicht als Gen aktiv ist und als neutraler Insertionsort verwendet werden kann. Fig. 12 zeigt die tatsächliche DNA-Sequenz mit einer Translation der ORFs auf beiden Seiten des Orts. Es ist zuerkennen, dass Ort D in einer Intergen-Re- gion zwischen HindB3R und HindB4R angeordnet ist und sich auch innerhalb des nicht-funktionellen HindB3.5R befindet.

Herstellung eines Vektors zum Klonieren neutraler Orte

Um fremde genetische Information in die oben beschriebenen neutralen Orte zu insertieren, müssen zunächst DNA-Kopien der neutralen Orte gemeinsam mit einer angemessenen Menge an Flankierungs-DNA vom Vaccinia-Genom (etwa 500 Basen auf beiden Seiten) in einen Plasmidvektor kloniert werden. Diese Plasmide können dann verwendet werden, um die fremde DNA in das Vaccinia-Virus-Genom einzubringen; die Vaccinia- Virus-"Flankierungssequenzen" um das insertierte Gen dienen dazu, homologe Rekombination zwischen der Plasmid-DNA und der viralen DNA zu ermöglichen, mit der daraus folgenden Insertion des fremden Gens an der gewünschten Position.

Klonierung neutraler Ort-Sequenzen

Plasmide, die Flankierungsregionen von den neutralen Orten enthalten, werden wie folgt konstruiert. DNA wird aus dem Wyeth-Stamm von Vaccinia-Virus nach dem Verfahren von Espositio et al. (J. Virol. Meth. 2, 175 (1981)) hergestellt. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird eingesetzt, um ein Fragment mit etwa 1.000 Basenpaaren (bp) aus dem DNA des Wyeth-Stamms von Vaccinia-Virus zu entfernen. Paare von Oligonucleotiden werden etwa 500 bp auf beiden Seiten des gewählten neutralen Orts gewählt. Diese Oligonucleotide basieren auf der Sequenz des WR-Stamms, sind aber in Regionen gewählt, wo die Sequenz des WR-Stamms mit jener des Copenhagen-Stamms identisch ist (Goebel et al., Virology 179, 247 (1990)). Die Oligonucleotide umfassen Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen, so dass sie leicht in ein Plasmid kloniert werden können. Bei den neutralen Orten A, B und C sind die Restriktionsorte EcoR1 und Hind- III. Beim neutralen Ort C ist die HindIII-Stelle durch eine Sphl-Stelle ersetzt, da es keine interne HindIII-Stelle in den gewählten Flankierungssequenzen gibt.
Die für die PCR verwendeten Oligonucleotide sind nachstehend angeführt:
Ort A linksMB 16
Ort A rechtsMB 17
Ort B linksMB 24
Ort B rechtsMB 25
Ort C linksMB 18
Ort C rechtsMB 19
Ort D linksMB 22
Ort D rechtsMB 23
DNA-Fragment mit etwa 1 kb werden dann unter Verwendung dieser Paare von Oligonucleotiden durch PCR-Amplifizierung hergestellt, mit EcoRI und HindIII (für die Orte A, B, und D) oder mit EcoRI und Sphl (für Ort C) verdaut und in mit HindIII und Ecorl verdauten pUC118 kloniert (Fig. 13), um die Plasmide pIMMC7a, pIMMC7b, pIMMC7c und pIMMC7d zu erzeugen.

Erzeugung einziger Restriktionsorte für die Insertion an neutralen Orten

Eine geeignete Restriktionsenzymstelle wird dann an der gewählten Stelle innerhalb jedes der Plasmide eingeführt. Das erfolgt unter Einsatz von ortsgerichteter Mutagenese unter Verwendung eines Oligonucleotids, das die gewünschte, neue, einzige Stelle enthält und von 15 Sequenzbasen auf beiden Seiten flankiert wird (siehe unten). Die auf diese Weise modifizierten Plasmide werden als pIMMC8a-d bezeichnet (Fig. 13).

Klonierung der frühen/späten Vaccinia-Virus-Promotorsequenzen

Die p7.5- und H6-Promotoren von genomischer Vaccinia-Virus-DNA werden durch PCR-Amplifizierung wie nachstehend beschrieben hergestellt.
Ein Paar komplementärer Oligonucleotide (57 und 58) wird so synthetisiert, dass es die folgenden Restriktionsenzymstellen, HindIII, SnaB1, Hpa1, HindIII, Sal1, Nco1, Sma1, SnaB1 und EcoR1, enthält, so dass das Paar nach dem annelieren an einem Ende mit HindIII kompatible überhängende Enden und am anderen Ende mit EcoR1 kompatible überhängende Enden aufweist. Die beiden Oligonucleotide werden annelieren gelassen und werden in pUC118, geschnitten mit EcoR1 und HindIII, insertiert (Fig. 14). Der resultierende Vektor wird als pIMMC3 bezeichnet.
Ein DNA-Molekül mit etwa 180 bp, das den H6-Promotor enthält, wird aus dem WR- Stamm von Vaccinia-Virus durch PCR-Amplifizierung entfernt, wobei die Oligonucleotide MB15 (anneliert stromab und umfasst einen 5-Sall-Stelle) und MB7 (anneliert stromab und umfasst eine 5'-HindIII-Stelle) verwendet wird. Das wird in pIMMC3, gespalten mit HindIII und Sall kloniert, um pIMMC4a zu erzeugen (Fig. 14). Ein DNA-Molekül mit etwa 200 bp, das den p7.5-Promotor enthält, wird dann durch PCR-Amplifizierung aus dem WR-Stamm von Vaccinia-Virus entfernt, wobei die Oligonucleotide MB32 (anneliert stromauf und umfasst eine 5'-Sall-Stelle) und MB33 (annehiert stromab und umfasst eine 5'Nco1-Stelle) verwendet wird. Das wird in pIMMC3, gespalten mit Nco1 und Sall, kloniert, um PIMMC14b zu erzeugen.

Konstruktion des therapeutischen Virus

Die Strategie, die erforderlich ist, um ein rekombinantes Vaccinia-Virus zu erzeugen, das die E6-E7-Proteine von HPV16 und HPV18 enthält und exprimiert; basierend auf den oben beschriebenen Elementen, umfasst fünf Hauptschritte, wie nachstehend dargelegt.

i) Klonieren der modifizierten E6-7-Gene stromab von den frühen Vaccinia-Promotorsequenzen

Ein DNA-Fragment, das die modifizierte Hpvl6 E6-7-Sequenz enthält, wird durch Verdau mit HindIII und Sma1 von plMS7.2 ausgeschnitten und in mit HindIII und Hpa1 verdautes pIMMC4a kloniert, um plMS12 zu erzeugen (Fig. 15).
Ein DNA-Fragment, das die modifizierte HPV18 E6-7-Sequenz enthält, wird durch Verdau mit Ncol und Sma1 ausgeschnitten und in mit Nco1 und Sma1 verdautes pIMMC- 14b kloniert, um pIMS14 zu erzeugen (Fig. 15).

ii) Herstellung eines Plasmidvektors, der sowohl HPV 16 als auch HPV 18 E6-7-Sequenzen gemeinsam mit ihren stromauf gelegenen Vaccinia-Promotoren enthält

Ein DNA-Fragment, das die HPV16 E6-7-Region gemeinsam mit dem stromauf gelegenen p7.5-Promotor enthält, wird von pIMS14 mit Sah und Sma1 ausgeschnitten und in mitSal1 und Smal verdauten pIMS12 insertiert, um pIMS15 zu erzeugen (Fig. 15).

iii) Insertion des HPV E6-7/Promotor-"Doppel"-Patrone in den Plasmide enthaltenden neutralen Ort

Ein DNA-Fragment, das sowohl die HPV16- als auch HPV18-E6-7-Kodierungsregionen gemeinsam mit ihren stromauf gelegenen Promotoreiementen enthält, wird aus pIMSlS mit SnaB1 ausgeschnitten und in die entsprechend verdauten, neutrale Orte enthaltenden Plasmide pIMMC7a-d insertiert. Dieser Schritt wird in Fig. 16 gezeigt, und die resultierenden Plasmide werden als pIMMC9a-d bezeichnet.

iv) Einführen der neutralen Ort-DNA gemeinsam mit den intervenierenden HPV-Sequenzen in das Vaccinia-Virus-Genom durch homologe Rekombination, um ein rekombinantes Virus zu erzeugen, das die beiden modifizierten HPV E6-7-Sequenzen exprimiert

Die rekombinanten Plasmide pIMMC9a-d werden gereinigt und in Vaccinia rekombinieren gelassen (F i 17), wobei Standard-Vorschriften eingesetzt werden (Macket et al., "DNA Cloning: A Practical Approach", D. M. Glover (Hrsg.), Oxford und Washington CD, IRL Press, 1985).
Viren, die die HPV-Sequenzen erworben haben, werden durch Sondieren mit radioaktiv markierten HPV-spezifischen Sequenzen identifiziert. Virale Plaques werden auf Nitrocellulose (Villareal und Berg, Science 196, 183 (1977)) abgehoben und mit radioaktiv markiertem Nco1-Sma1-Fragment von pIMS14 sondiert, das das HPV18 E67-Gen enthält. Rekombinante Viren werden dann aus der Agarose-Deckschicht isoliert und dreimal Plaque-gereinigt. Sie werden durch Southern-Blotting von gereinigter Virus-DNA unter Verwendung von DNA-Sonden, die von den HPV E6- und E7-Genen stammen, auf das Vorhandensein der entsprechenden DNA-Sequenzen, und durch Western-Blotting unter Verwendung von Antiseren, die für die HPV E6- und E7-Protein spezifisch sind, auf die Expression der geeigneten Sequenzen geprüft.

Klonierung des therapeutischen Virus in MRCS-Zellen

Vorräte des fertigen rekombinanten Virus werden durch Wachstum in Vero-Zellen hergestellt und werden verwendet, um MRC&sub5;-Zellen zu infizieren, von denen angenommen wird, dass die für die Herstellung von Material geeignet sind, das sich zur Verwendung als Human-Vakzine eignet. Das Virus wird dreimal durch Standard-Verfahren Plaque-gereinigt; und schließlich wird eine Vorrat zur klinischen Verwendung hergestellt.

Bestätigung des Vorhandenseins des korrekten HPV DNA-Inserts

Eine Probe dieses Vorrats-Virus wird erneut auf das Vorhandensein korrekt konfigurierter Virus-DNA und auf die Expression der korrekten Virus-Proteine überprüft. Fig. 22 zeigt die Analyse durch PCR eines rekombinanten Vaccinia-Virus (v9a.1), in dem die HPV DNA-Kassette an Ort A insertiert ist. Das in Abbildung (a) gezeigte Diagramm zeigt die DNA-Fragmente an, die erwartet werden, wenn Insertion der korrekten DNA stattgefunden hat. In Abbildung (b) ist zu erkennen, dass das tatsächliche Muster der erzeugten PCR-Produkte mit dem erwarteten übereinstimmt.

Bestätigung der Expression des HPV DNA-Inserts

Die rekombinanten Viren werden dann auf Expression der erwarteten HPV-Proteine überprüft. Ein Beispiel für diese Analyse wird in Fig. 23 gezeigt. Vero-Zellen werden mit rekombinantem Virus v9a.1 infiziert (HPV DNA insertiert an Ort A), und die Zellen durch Western-Blotting auf das Vorhandensein der HPV E67-Fusionsproteine untersucht, indem monoklonale Antikörper verwendet werden, die für das HPV16 E7-Protein (camvir3) und für das HPV18 E7-Protein (7E10) spezifisch sind. Es ist zu erkennen, dass beide monoklonale Antikörper spezifisch Proteine der erwarteten Größe in Zellen erkennen, die mit dem rekombinanten Virus v9a.1 infiziert sind, aber nicht in Zellen, die mit dem Vergleichs-Ausgangsvirus (Wyeth-Stamm) infiziert sind. Diese erkannten Proteine migrieren gemeinsam mit Proteinen, die durch in vitro-Translation von mRNA synthetisiert wurden, die für die erwarteten HPV-Fusionsproteine kodiert (HPV 16 E67 und HPV 18 E67). Dieser Versuch zeigt die erfolgreiche Expression der heterologen Gen-Sequenzen vom rekombinanten Virus an.

Stabilität des HPV DNA-Inserts

Damit das rekombinante Virus von klinischem Nutzen ist, ist es wichtig, dass die insertierten Sequenzen über mehrfache Virus-Passage genetisch stabil bleiben, und das DNA- Insert wurde sorgfältig so konstruiert, dass es diese genetische Instabilität fördert. Um die Stabilität der HPV-Information innerhalb des rekombinanten Virusgenoms zu bestätigen, wird das Virus 9 seriellen Passagen (Vielfaches der Infektion = 10 pfu/Zelle) in Vero-Zellen unterzogen. Daraufhin werden 20 Plaque-Isolate ausgewählt und durch PCR- Analyse auf das Vorhandensein des korrekten HPV DNA-Inserts analysiert, wie in Fig. 22 beschrieben. Die für rekombinantes Virus A erhaltenen Daten werden in Fig. 23 gezeigt, Alle 20 Virus-Isolate behielten die HPV-Information in der erwarteten genetischen Anordnung bei, was auf ein beträchtliches Ausmaß an genetischer Stabilität hinweist.

Tierversuche

Die Virulenz des rekombinanten Virus wird in Tierversuchen mit jener des Ausgangs- Wyeth-Stamms verglichen. Gruppen aus 20 Mäusen werden intranasal jeweils mit 10' pfu Wyeth-Stamm oder rekombinantem Virus in einem Gesamtvolumen von 20 pl beimpft. Zwei Mäuse werden an Tag 1, Tag 3 und Tag 5 nach der Impfung getötet und die Lungen herausseziert. Die in den Lungen vorhandene Virusmenge wird dann durch Zermahlen des Gewebes und einen Test des Homogenats mittels Standard-Vaccinia-Virus- Plaque-Test gemessen. Die Ergebnisse eines solchen Versuchs für das rekombinante Virus v9a.1 (HPV-Information an Ort A insertiert) werden in Fig. 25 gezeigt. Es ist zu erkennen, dass das rekombinante Virus die Fähigkeit zum Replizieren in Mäusen beibehält und dass die in den Lungen der infizierten Tiere erzeugte Virusmenge der ähnlich ist, die beim Ausgangs-Wyeth-Stamm festzustellen ist.

Therapeutische Verwendung

Ein Vorrat des rekombinanten Virus wird durch Infektion von MRC&sub5;-Zellen hergestellt und auf eine Konzentration von nicht weniger als 108 pfu/ml eingestellt. 20 ul dieses Materials werden auf den Arm des Patienten aufgebracht, der dann durch das Viruströpfchen hindurch mit einer gegabelten Nadel skarifiziert wird, nach dem Standard-Verfahren, das für Impfung gegen Pocken eingesetzt wird.

Claims

1. Vakzine, umfassend einen rekombinanten Virusvektor, der zumindest ein Paar zum Virus heterologer Nucleotidsequenzen umfasst, die jeweils einen Promotor und einen offenen Leserahmen umfassen, der für ein gesamtes oder einen antigenischen Teil eines Human-Papillomavirus- (HPV-) Proteins der Wildform oder eines mutierten Proteins kodiert, das mit dem Protein der Wildform immunologisch kreuzreaktiv ist, wobei die Nucleotidsequenzen ausreichende Sequenzhomologie aufweisen, damit Rekombination zwischen ihnen zu erwarten ist; worin das Paar Nucleotidsequenzen im Virusvektor so angeordnet ist, dass sie zueinander umgekehrt vorliegen, so dass die Wahrscheinlichkeit verringert wird, dass Rekombinationsereignisse zum Verlust eines Teils der oder aller Sequenzen führt und der Virusvektor in der Lage ist, eine Säugetier- Wirtszelle zu infizieren und die offenen Leserahmen in der Wirtszelle als Polypeptide zu exprimieren.

2. Vakzine nach Anspruch 1, worin das Paar Nucleotidsequenzen für einen Teil der oder die gesamten HPV-Proteine der Wildform HPV16E7 und HPV18E7 oder mutierte Proteine, die damit immunologisch kreuzreaktiv sind, kodiert.

3. Vakzine nach Anspruch 1, worin das Paar Nucleotidsequenzen für einen Teil der oder die gesamten HPV-Proteine der Wildform HPV16E6 und HPV18E6 oder mutierte Proteine, die damit immunologisch kreuzreaktiv sind, kodiert.

4. Vakzine nach Anspruch 2, die ein weiteres Paar Nucleotidsequenzen umfasst, die für einen antigenischen Teil oder die gesamten HPV-Proteine der Wildform HPV16- E6 und HPV18E6 oder mutierte Proteine, die damit immunologisch kreuzreaktiv sind, kodieren.

5. Vakzine nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin zwei oder mehr Nucleotidsequenzen verschiedener Paare miteinander fusioniert sind, um einen einzigen offenen Leserahmen zu bilden.

6. Vakzine nach Anspruch 5, worin die Fusionen über ein einziges Codon, das für eine kleine neutrale Aminosäure kodiert, gegeben sind.

Vakzine nach Anspruch 6, worin die Aminosäure Glycin ist.

8. Vakzine nach Anspruch 4, worin zumindest einer der Leserahmen in der heterologen Nucleotidsequenz ein fusionierter Leserahmen ist.

9. Vakzine nach Anspruch 4, worin die heterologen Nucleotidsequenzen so angeordnet sind, dass die Leserichtung jedes Leserahmens zum anderen hin verläuft.

10. Vakzine nach Anspruch 4, worin die heterologen Nucleotidsequenzen so angeordnet sind, dass die Leserichtung jedes Leserahmens vom anderen weg verläuft.

11. Vakzine nach einem der Ansprüche 8 bis 10, Folgendes umfassend: einen ersten offenen Leserahmen mit einer fusionierten Gensequenz, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine der Wildform E6 und E7 von HPV16 kodiert; und

einen getrennten zweiten offenen Leserahmen mit einer fusionierten Gensequenz, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine der Wildform E6 und E7 von HPV18 kodiert;

worin der erste und der zweite offene Leserahmen zueinander umgekehrt vorliegen, wodurch entweder

(i) die E6-Kodiersequenzen von HPV16 und HPV18 beide zwischen den E7-Kodiersequenzen von HPV16 und HPV18 angeordnet sind; oder

(ii) die E7-Kodiersequenzen von HPV16 und HPV18 beide zwischen den E6-Kodiersequenzen von HPV16 und HPV18 angeordnet sind; und

worin jedes der Proteine der Wildform durch ein mutiertes Protein ersetzt sein kann, das damit immunologisch kreuzreaktiv ist.

12. Vakzine nach Anspruch 11, worin der erste und der zweite offene Leserahmen jeweils einen entsprechenden Promotor aufweisen und die beiden offenen Leserahmen mit ihrem jeweiligen Promotor im Virus nebeneinander angeordnet sind.

13. Vakzine nach Anspruch 12, worin entweder

(i) die Promotoren zwischen dem ersten und dem zweiten offenen Leserahmen angeordnet sind, wodurch die offenen Leserahmen nach außen transkribiert werden; oder

(ii) die Promotoren außerhalb des ersten und des zweiten offenen Leserahmens angeordnet sind, wodurch die offenen Leserahmen nach innen transkribiert werden.

14. Vakzine nach einem der Ansprüche 8 bis 13, Folgendes umfassend:

einen ersten offenen Leserahmen mit einer fusionierten Gensequenz, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine der Wildform E6 und E7 von HPV16 kodiert; und

worin die E6-Kodiersequenzen von HPV16 und HPV18 beide zwischen den E7- Kodiersequenzen von HPV16 und HPV18 angeordnet sind; und

jeder offene Leserahmen einen entsprechenden Promotor aufweist, wobei die Promotoren zwischen dem ersten und dem zweiten offenen Leserahmen angeordnet sind, wodurch die offenen Leserahmen nach außen transkribiert werden; und

15. Vakzine nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin eines oder beide der Nucleotidsequenzen im Paar von Nucleotidsequenzen verändert ist bzw. sind, um sie weniger homolog als ein äquivalentes Paar von Nucleotidsequenzen zu machen, die für die HPV-Proteine der Wildform kodieren.

16. Vakzine nach Anspruch 15, worin die Änderung in der Nucleotidsequenz nicht zu einer Änderung der kodierten Aminosäuresequenz führt.

17. Vakzine nach Anspruch 2, worin die Proteine der Wildform HPV16E7 und HPV- 18E7 durch mutierte Proteine ersetzt sind, die zu den Proteinen der Wildform homolog sind und in denen die Reste cys 24 und glu 26 des Proteins der Wildform HPV16E7 und die Reste cys 27 und glu 29 des Proteins der Wildform HPV18E7 durch Glycinreste ersetzt sind.

18. Vakzine nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die heterologen Nucleotidsequenzen einen Teil der oder die gesamten in den Fig. 1 (a) und 1 (b) dargestellten Sequenzen umfassen können.

19. Vakzine nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der rekombinante Virusvektor ein rekombinantes Vaccinia-Virus ist.

20. Vakzine nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Nucleotidsequenzen in den Virusvektor an einer oder mehreren neutralen Orten insertiert sind, wobei deren Unterbrechung durch die Insertion der Nucleotidsequenzen virale Funktionen, die mit der Replizierbarkeit des Virus in der Säugetier-Zelle in Zusammenhang stehen, im Wesentlichen nicht beeinträchtigt.

21. Vakzine nach Anspruch 20, worin der rekombinante Virusvektor ein rekombinantes Vaccinia-Virus ist und worin die neutralen Orte eine oder mehrere der folgenden umfassen:

A) den Zwischenraum zwischen SalF17R und SalF19R von Stamm WR, der zumindest einen Teil der Sequenz

CTATCTACCAGATTATTATGTGTTATAAGGTACTTTTTCT umfasst;

B) den Zwischenraum zwischen SalF19R und SalF20.5R von Stamm WR, der zumindest einen Teil der Sequenz

TATTGTGCTACTGATTCTTCACAGACTGAAGATTGTTGAA umfasst;

C) einen Bereich in SalG2R von Stamm WR, der zumindest einen Teil der Sequenz

TCTCTTAAAATGGTTGAGACCAAGCTTCGTTGTAGAAACA umfasst;

D) einen Bereich in HindB3.5R von Stamm WR, der zumindest einen Teil der Sequenz

TGAGGCTACCTCGACATACGTGTGCGCTATCAAAGTGGAA umfasst

E) eine Sequenz mit zumindest 90% Sequenzhomologie zu den oben angeführten Sequenzen A) bis D).

22. Rekombinanter Virusvektor zur Verwendung als Immuntherpeutikum oder Vakzine, umfassend zumindest ein Paar zum Virus heterologer Nucleotidsequenzen, die jeweils einen Promotor und einen offenen Leserahmen umfassen, der für ein gesamtes oder einen antigenischen Teil eines Human-Papillomavirus- (HPV-) Proteins der Wildform oder eines mutierten Proteins kodiert, das mit dem Protein der Wildform immunologisch kreuzreaktiv ist, wobei die Nucleotidsequenzen ausreichende Sequenzhomologie aufweisen, damit Rekombination zwischen ihnen zu erwarten ist; worin das Paar Nucleotidsequenzen im Virusvektor so angeordnet ist, dass sie zueinander umgekehrt vorliegen, so dass die Wahrscheinlichkeit verringert wird, dass Rekombinationsereignisse zum Verlust eines Teils der oder aller Sequenzen führt und der Virusvektor in der Lage ist, eine Säugetier-Wirtszelle zu infizieren und die offenen Leserahmen in der Wirtszelle als Polypeptide zu exprimieren.

23. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 22, worin das Paar Nucleotidsequenzen für einen Teil der oder die gesamten HPV-Proteine der Wildform HPV16E7 und HPV18E7 oder mutierte Proteine, die damit immunologisch kreuzreaktiv sind, kodiert.

24. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 22, worin das Paar Nucleotidsequenzen für einen Teil der oder die gesamten HPV-Proteine der Wildform HPV16E6 und HPV18E6 oder mutierte Proteine, die damit immunologisch kreuzreaktiv sind, kodiert.

25. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 23, der ein weiteres Paar Nucleotidsequenzen umfasst, die für einen antigenischen Teil oder die gesamten HPV-Proteine der Wildform HPV16E6 und HPV18E6 oder mutierte Proteine, die damit immunologisch kreuzreaktiv sind, kodieren.

26. Rekombinanter Virusvektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin zwei oder mehr Nucleotidsequenzen verschiedener Paare miteinander fusioniert sind, um einen einzigen offenen Leserahmen zu bilden.

27. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 26, worin die Fusionen über ein einziges Codon, das für eine kleine neutrale Aminosäure kodiert, gegeben sind.

28. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 27, worin die Aminosäure Glycin ist.

29. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 25, worin zumindest einer der Leserahmen in der heterologen Nucleotidsequenz ein fusionierter Leserahmen ist.

30. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 25, worin die heterologen Nucleotidsequenzen so angeordnet sind, dass die Leserichtung jedes Leserahmens zum anderen hin verläuft.

31. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 25, worin die heterologen Nucleotidsequenzen so angeordnet sind, dass die Leserichtung jedes Leserahmens vom anderen weg verläuft.

32. Rekombinanter Virusvektor nach einem der Ansprüche 29 bis 31, Folgendes umfassend:

33. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 32, worin der erste und der zweite offene Leserahmen jeweils einen entsprechenden Promotor aufweisen und die beiden offenen Leserahmen mit ihrem jeweiligen Promotor im Virus nebeneinander angeordnet sind.

34. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 33, worin entweder

35. Rekombinanter Virusvektor nach einem der Ansprüche 29 bis 34, Folgendes umfassend:

einen ersten offenen Leserahmen mit einer fusionierten Gensequenz, die für einen Teil der oder die gesamten Proteine der Wildform E6 und E7 von HPV16 kodiert;

und

36. Rekombinanter Virusvektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin eines oder beide der Nucleotidsequenzen im Paar von Nucleotidsequenzen verändert ist bzw. sind, um sie weniger homolog als ein äquivalentes Paar von Nucleotidsequenzen zu machen, die für die HPV-Proteine der Wildform kodieren.

37. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 36, worin die Änderung in der Nucleotidsequenz nicht zu einer Änderung der kodierten Aminosäuresequenz führt.

38. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 23, worin die Proteine der Wildform HPV16E7 und HPV18E7 durch mutierte Proteine ersetzt sind, die zu den Proteinen der Wildform homolog sind und in denen die Reste cys 24 und glu 26 des Proteins der Wildform HPV16E7 und die Reste cys 27 und glu 29 des Proteins der Wildform HPV18- E7 durch Glycinreste ersetzt sind.

39. Rekombinanter Virusvektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die heterologen Nucleotidsequenzen einen Teil der oder die gesamten in den Fig. 1 (a); und 1 (b) dargestellten Sequenzen umfassen können.

40. Rekombinanter Virusvektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, der ein rekombinantes Vaccinia-Virus ist.

41. Rekombinanter Virusvektor nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Nucleotidsequenzen in den Virusvektor an einer oder mehreren neutralen Orten insertiert sind, wobei deren Unterbrechung durch die Insertion der Nucleotidsequenzen virale Funktionen, die mit der Replizierbarkeit des Virus in der Säugetier-Zelle in Zusammenhang stehen, nicht nennenswert beeinträchtigt.

42. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 41, der ein rekombinantes Vaccinia- Virus ist und worin die neutralen Orte eine oder mehrere der folgenden umfassen:

CTATCTACCAGATTATTATGTGTTATAAGGTACTTVCT umfasst;

TATTGTGCTACTGATTCTTCACAGACTGAAGATTGTTGÄA umfasst;

C) einen Bereich in SalG2R von Stamm WR, der zumindest einen Teil der Sequenz

TCTCTTAAAATGGTTGAGACCAAGCTTCGTTGTAGAAACA umfasst;

TGAGGCTACCTCGACATACGTGTGCGCTATCAAAGTGGAA umfasst;

43. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Virusvektors nach Anspruch 41 oder 42, welches das Insertieren einer der heterologen Nucleotidsequenzen in einen oder mehrere neutrale Orte in einem Virusvektor umfasst, wobei die Unterbrechung eines solchen Orts durch die Insertion die Replizierbarkeit des Virus im Wesentlichen nicht beeinträchtigt und worin der neutrale Ort durch: (a) Analysieren eines viralen Genoms, um offene Leserahmen zu identifizieren, die wahrscheinlich für funktionelle Gene kodieren; und (b) Selektieren von Orten zwischen offenen Leserahmen für funktionelle Gene oder Orte innerhalb von Sequenzen auf nicht-funktionelle Gene; zuvor identifiziert worden ist.

44. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 22, umfassend einen ersten Promotor, der zur Kontrolle der Expression von Gensequenzen aus einem ersten der offenen Leserahmen angeordnet ist, sowie einen weiteren Promotor, der zur Kontrolle der Expression von Gensequenzen aus einem weiteren der offenen Leserahmen angeordnet ist, worin der erste Promotor und der weitere Promotor jeweils ein p7.5-Promotor sind.

45. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 22, umfassend einen ersten Promotor, der zur Kontrolle der Expression von Gensequenzen aus einem ersten der offenen Leserahmen angeordnet ist, sowie einen weiteren Promotor, der zur Kontrolle der Expression von Gensequenzen aus einem weiteren der offenen Leserahmen angeordnet ist, worin der erste Promotor und der weitere Promotor jeweils ein H6-Promotor sind.

46. Rekombinanter Virusvektor nach Anspruch 22, umfassend einen ersten Promotor, der zur Kontrolle der Expression von Gensequenzen aus einem ersten der offenen Leserahmen angeordnet ist, und einen weiteren Promotor, der zur Kontrolle der Expression von Gensequenzen aus einem weiteren der offenen Leserahmen angeordnet ist, worin der erste Promotor ein p7.5-Promotor ist und der weitere Promotor ein H6-Promotor ist.

47. Verfahren, umfassend die Verwendung eines rekombinanten Virusvektors nach einem der Ansprüche 22 bis 42 oder 44 bis 46 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung als Immuntherapeutikum oder Vakzine gegen ein Leiden, das mit HPV-Infektion in Zusammenhang steht, beispielsweise Gebärmutterhalskrebs.

48. Verfahren, umfassend die Verwendung eines rekombinanten Virusvektors nach einem der Ansprüche 22 bis 42 oder 44 bis 47 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der spezifischen Aktivierung von Zellen des Immunsystems gegen HPV-Proteine.