DE69101683T2

DE69101683T2 - Rekombinantes Mareks-Krankheitsvirus.

Info

Publication number: DE69101683T2
Application number: DE69101683T
Authority: DE
Inventors: Robin Wilson Morgan
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 1990-07-30
Filing date: 1991-07-10
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2011-07-11
Also published as: DE69101683D1; AU8143791A; HU912526D0; HUT58371A; ES2056565T3; EP0473210B1; HU219377B; CA2047290A1; CA2047290C; KR920002782A; KR0153005B1; CN1060680A; EP0473210A2; EP0473210A3; JP3159476B2; AU645333B2; JPH06233682A; ZA915563B; NZ239146A; CN1056879C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen viralen Vektor, der fähig ist, Fremdgene, besonders in Hühnern, zu exprimieren. Vor allem bezieht sich diese Erfindung auf die Entdeckung einer Insertionsregion des DNA-Genoms der Virus der Marek'schen Krankheit ("MDV") vom Serotyp 1, in die eine heterologe Nukleinsäurensequenz inseriert werden kann, die ein Fremdgen umfasst, das von DNA-Sequenzen der besagten Insertionsregion flankiert wird; ein Plasmid, das die besagte Nukleinsäurensequenz umfasst; auf einen Impfstoff, der das rekombinante MDV umfasst; und auf ein Antiserum, das rekombinante anti MDV-Antikörper enthält.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Marek'sche Krankheit ist eine maligne, lymphomatöse Funktionsstörung bei Hühnern, die durch einen Herpesvirus, das Virus der Marek'schen Krankheit, verursacht wird. Das Virus infiziert Hühner und verursacht in den der Infektion folgenden Wochen die Entwicklung von T-Zell-Lymphomen in den verschiedenen Geweben, was letztlich in dem Tod oder der Vernichtung der infizierten zu verarbeitenden Hühner resultiert. Diese Krankheit ist unter den Herpesvirus-induzierten Funktionsstörungen selten, da sie in der Geflügelindustrie seit zwanzig Jahren durch Impfung aller kommerziellen Brathähnchen und Brathähnchenzüchter in den Vereinigten Staaten und vielen Teilen der Welt kontrolliert wird.
MDV ist ein DNA-Virus, das eine Hülle besitzt und das zur Familie der Herpesviridae gehört. Es ist weiterhin in die folgenden drei Serotypen unterteilt:
Typ I: Virulente MDV-Stämme, die für Hühner pathogen und tumorinduzierend sind, und abgeschwächte, nichtpathogene Stämme, die von diesen abstammen;
Typ II: natürlich vorkommende nichtpathogene MDV-Stämme und
Typ III: Herpesviren von Truthühner-("HVT")-Stämmen, die für Hühner nicht pathogen sind.
Die Pathogenese der MDV-infektion und die klassische Virologie des MDV wurden während des ganzen zwanzigsten Jahrhunderts hindurch studiert.
Fortschritte in der molekularen Analyse des MDV wurden während des letzten Jahrzehnts gemacht. Wichtige Weiterentwicklungen schliessen Klonieren der viralen DNS-Moleküle (Fukuchi et al., J. Virol. 51:102-109, 1984), die Erzeugung monoklonaler Antikörper gegen MDV, die Identifizierung viraler Polypeptide, die Aufstellung von Restriktionskarten (Schat et al., Int. J Cancer 44:101-109, 1989), und die Identifizierung von Genen im MDV-Genom (Buckmaster et al., J. Gen. Virol 69:2033-2042, 1988) ein. Bis jetzt lag nahezu keine genetische Analyse des Virus vor, obwohl von einer Phosphonoacetat-resistenten HVT- Mutanten berichtet wurde.
Die Marek'sche Krankheit ist von enormer wirtschaftlicher Bedeutung und wirksame Impfstoffe gegen diese Erkrankung sind für das Auskommen der Geflügelindustrie kritisch. Der am verbreitesten angewendete Impfstoff ist HVT, obwohl in vielen Regionen Hühner gegenwärtig mit einer Kombination von MDV- Impfstämmen geimpft werben. Die bestehenden Impfstoffe gegen die Marek'sche Krankheit werden in der Zukunft kaum noch angemessen sein und die Entwicklung rekombinanter Impfstoffe gegen die Marek'sche Krankheit wird weiterhin eine wichtige Herausforderung für die Wissenschaftler auf diesem Gebiet sein. Da bestehende Impfstoffe gegen die Marek'sche Krankheit schon seit zwanzig Jahren in der Geflügelindustrie als lebende Herpesvirus-Impfstoffe verwendet werden, werden sie zur Zeit als potentielle Herpesvirus-Vektoren, die für Geflügel geeignet sind, erforscht.
Es wurde von Virus-Vektoren berichtet, bei denen zum Beispiel Vaccinia, Papillomavirus, Baculovirus, Parvovirus und Tabak- Mosaik-Virus Anwendung finden. Von allen wurde als Klonierungsvektor oder Expressionsvektor für Fremdgene berichtet. Auch von MDV wurde als Expressionsvektor für ein Fremdgen berichtet, wie von T. Ishikawa et al. in der Europäischen Patentanmeldung 0 334 530 beschrieben. Diese Anmeldung beschreibt die Insertion eines Fremdgens, z.B. das Gene, das das Hemagglutinin und die Neuraminidase das Virus der Newcastle'schen Krankheit ("NDV") codieren, in das Gen, das für die A-Antigenstelle (das gp 57-65-Gen) des HVT codiert. Das rekombinante HVT wird verwendet, um einen Impfstoff gegen beide, NDV und MDV, herzustellen.
In WO 88/07088 beschreiben S. Martin et al. die Methode, ein Fremdgen in eine nichtessentielle Region des HVT zu inserieren und den Vogel mit dem viralen Vektor zu infizieren, der letztlich eine immunogene Reaktion gegen beide, das Fremdgenprodukt und das HVT hervorruft. Vor allem ist HVT das einzige aviäre Herpesvirus, von dem als viraler Vektor gelehrt wurde, und die verwendeten nichtessentiellen Regionen codieren für Thymidinkinase und für 1-β-D- Arabinofuranosylthyminresistenz.
Cochran et al., beschreiben in der PCT-Anmeldung WO/89/0140 die Insertion von Fremd-DNA in abgeschwächte Herpesvirusvektoren. Sie beschreiben ein rekombinantes Fusionsprotein, in dem eine antigene Aminosäurensequenz mit einem Abschnitt des gpX- Glyko-proteins des Pseudorabiesvirus fusioniert ist. Eine cDNA-Kopie des grossen Segments der RNA des Virus der infektiösen bursalen Krankheit ("IBDV"), die drei Polypeptide codiert, nämlich VP2, VP4 und VP3, und das E. coli-β-Galactosidasegen wurden in eine nichtessentielle Stelle innerhalb der einzigen langen Region des HVT-Genoms inseriert. Dieses rekombinante Virus wurde als Impfstoff gegen IBDV angewendet. MDV A-Antigen (gp 57-65) wurde in dieselbe Stelle von HVT inseriert, um einen verbesserten Impfstoff gegen MDV zu erzeugen.
Für Herpes simplex-Viren wurde von Weber et al. (Science 236: 576-579) eine Methode zur schnellen Identifizierung nichtessentleller Gene mit Hilfe von Transposon-Mutagenese beschrieben. Diese Methode basiert auf der Tatsache, dass durch die Insertion von Fremd- (z.B. Transposon-)DNA in ein Gen dieses Gen inaktiviert wird. Wenn ein Transposon in ein normal exprimiertes Gen inseriert wird, (die Insertion manifestiert sich durch die Tatsache, dass das normalerweise vorgefundene entsprechende Genprodukt nicht mehr nachgewiesen werden kann), und das Virus noch lebensfähig ist, kann man von dem Gen sagen, das es nicht essentiell ist. Von zwölf offenen Leserahmen, die mit Tn5 mutagenisiert wurden, konnte für die mutierten Derivate von US2, US4 und US5 gezeigt werden, dass sie für die Replikation Von HSV-1 in Vero-Zellen nicht essentiell sind.
Diese Methode ist dann nützlich, wenn Gene mit unbekannten Funktionen identifiziert wurden.
Obwohl die genetische Analyse einiger Herpesviren, einschliesslich dem Herpes simplex-Virus und dem Pseudorabiesvirus, durchgeführt wurde, ist die genetische Struktur des DNA- Genoms des MDV von Serotyp 1 nicht gut bekannt.
Gegenwärtige Impfstoffe gegen die verschiedenen Geflügelkrankheiten werden oft durch die Verwendung von lebenden, abgeschwächten Krankheitserregern hergestellt, die ein Risiko, dass Tiere mit unzureichend abgeschwächten pathogenen Mikroorganismen geimpft werden, darstellen.
Inaktivierte Impfstoffe inäuzieren im allgemeinen nur eine niedrige Stufe an Immunität, die zusätzliche Immunisierungen erordert. Darüberhinaus onnen die neutralisationsinduzierenden antigenen Determinanten der Viren durch die Inaktivierungsbehandlung verändert werden, wodurch die schützende Potenz des Impfstoffs abnimmt.
Wenn mehrere abgeschwächte, lebende Krankheitserreger in einem Impfstoff vereinigt werden, kann ein anderes Problem entstehen. Der wechselseitige Einfluss der antigenen Komponenten kann in der Abnahme der Immunogenität eines oder mehrere der eingesetzten Antigene resultieren.
Um einen potenten Impfstoff gegen die Marek'sche Krankheit und mindestens eine andere aviäre Krankheit unter Verwendung eines MDV-Vektors herzustellen, wobei das DNA-Genom des MDV ein Fremdgen enthält, das ein Antigen von einem eine andere aviäre Krankheit verursachenden Agens codiert, muss eine nichtessentielle Region des MDV-Genoms gefunden und als Insertionsregion benutzt werden. Ist ein Fremdgen erst einmal in die Insertionsregion inseriert, muss das korrespondierende Genprodukt exprimiert werden. Der MDV-Vektor wird, wenn den Hühnern erst einmal verabreicht, eine Immunantwort gegen beide, das MDV und das Fremdgenprodukt, z.B. ein Protein auslösen, vorzugsweise mit einer grösseren Potenz als der von einem kombinierten Impfstoff gezeigten.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figur 1 zeigt die Restriktionskarte des offenen Leserahmens in dem terminalen 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragment von BamHI-A in der einzigen kurzen Region des DNA-Genoms des MDV-1.
Figur 2 zeigt die DNA-Sequenz der Insertionsregion des MDV-1.
Figur 3 zeigt das Plasmid pMD100, das das in den Plasmidvektor pUC19 klonierte terminale 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragment vor BamHI-A enthält.
Figur 4 zeigt die das lacZ-Gen enthaltende Kassette, die β- Galactosidase, von dem frühen SV40-Promotor exprimiert, codiert.
Figur 5 zeigt die Plasmide pMT1A und pMT1B, die das lacZ-Gen enthalten, das von dem frühen SV40-Promotor exprimiert wird, der in die BglII-Stelle inseriert ist, die innerhalb des 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragments liegt.
Figur 6 zeigt eine Southern Blot-Analyse der DNA des GA-El- ternteils und der GAlac-rekombinanten MDV-1 Isolate, die zeigen, dass das Rekombinierungsereignis stellenspezifisch war.
Figur 7 zeigt die Wachstumskurve der elterlichen und rekombinanten MDV-1-Isolate bei 37ºC.
Figur 8 zeigt die Wachstumskurve der elterlichen und rekombinanten MDV-1-Isolate bei 41ºC.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist die Entdeckung einer zuvor unbekannten, nichtessentiellen Insertionsregion in dem DNA-Genom von MDV-1. Diese Region enthält einen offenen Leserahmen in dem terminalen 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragment von BamHI-A in der einzigen kurzen Region des Genoms. BamHI-A ist das grösste von 29 BamHI-Fragmenten, die nach vollständigem Verdau des MDV-1-Genoms mit BamHI und BamHI-A-Karten für die einzige kurze Region des Genoms erhalten wurden. Die Region ist durch die in Figur 1 gezeigte Restriktionskarte definiert. Diese Region umfasst im wesentlichen die DNA-Sequenz von Nukleotidposition 238 bis 1050, wie in Figur 2 zu sehen ist. Zusätzlich in der Erfindung eingeschlossen ist ein Plasmid, das diese Insertionsregion umfasst.
Ebenfalls eingeschlossen in die vorliegende Erfindung ist das rekomoinante MDV-1, das ein Fremdgen enthält, vorzugsweise eines, das ein Immunogen eines anderen eine Geflügelkrankheit herrufendes Agens codiert. Dieses rekombinante Virus kann in einem Impfstoff verwendet werden, um bei gesunden Tieren eine Immunantwort gegen beide, MDV und das die Krankheit verursachende Agens, dessen Fremdgen in das MDV-Genom inseriert wurde, auszulösen.
Es ist hinreichend bekannt, dass Tiere, die bereits mit einem spezifischen Krankheitserreger infiziert sind, mit einem Antiserum gegen diesen Krankheitserreger behandelt werden können. In der vorliegenden Erfindung, werden die Antikörper durch ein rekombinantes MDV-1 hervorgerufen, das ein heterologes Gen umfasst, das ein von einem spezifischen Krankheitserreger stammendes antigenes Polypeptid codiert. Antiseren, die gegen ein erfindungsgemässes rekombinantes MDV-1 gerichtet sind, können durch Immunisieren von Tieren, z.B. Geflügel, mit einer wirksamen Menge des besagten rekombinanten MDV-1 hergestellt werden, um eine entsprechende Immunantwort auszulösen. Danach werden die Tiere ausgeblutet und das Serum kann gemäss Standardverfahren hergestellt werden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Voraussetzung für ein brauchbares rekombinantes MDV-1 ist, dass die heterologe Nukleinsäurensequenz in eine nichtessentielle Position oder Region des MDV-1-Genoms eingefügt ist, d.h. eine Position oder Region, die für eine solche Einfügung benutzt werden kann, ohne essentielle Funktionen des Virus zu zerstören, wie zum Beispiel jene, die für die Infektion oder Replikation notwendig sind. Solch eine Region wird als Insertionsregion bezeichnet. Die Insertionsregion der vorliegenden Erfindung wurde zuvor noch nicht für die Einfügung heterologer DNA beschrieben. Darüberhinaus stand keine Information bezüglich der Restriktionsenzymkarte der genomischen Region des MDV-1 zur Verügung, die, wie hierin beschrieben, zur Einfügung einer heterologen DNA-Sequenz verwendet wird.
Die bevorzugte als DNA-Sequenz von Nukleotidposition 238 bis 1050 in Figur 2 definierte Insertionsregion, die verwendet wird, um heterologe DNA-Sequenzen einzufügen, um ein erfindungsgemässes rekombinantes MDV herzustellen, befindet sich in der einzigen kurzen Region des Genoms. Die Insertionsregion liegt innerhalb des 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragments von BamHI- A, wie in der in Figur 1 gezeigten Restriktionsenzymkarte der den offenen Leserahmen enthaltenden genomischen Region dargestellt ist. Die Insertionsregion enthält, kennzeichnenderweise eine BglII-Stelle innerhalb des 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragments des BamHI-A, wie in der Restriktionsenzymkarte der den offenen Leserahmen enthaltenden genomischen Region in Figur 1 dargestellt ist.
DNA-Sequenzen, die der oben beschriebenen nichtessentiellen Insertionsregion entsprechen, können für die Insertion von Genen in das MDV-1-Genom verwendet werden.
Es muss verstanden werden, dass es von der DNA-Sequenz des MDV-1-Genoms natürliche Variationen unter den Stämmen geben kann. Diese Variationen können in Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Hinzufügen eines oder mehrerer Nukleotide resultieren, die möglicherweise die Position einer oder mehrerer Restriktions stellen beeinflussen, und daher eine Restriktionsenzymkarte produzieren, die mit der in Figur 1 gezeigten verwandt ist.
Darüberhinaus gibt es auch die Möglichkeit Gentechnologie anzuwenden, um die obengenannten Variationen entstehen zu lassen, was in einer DNA-Sequenz mit einer Restriktionsenzymkarte resultiert, die der in Figur 1 gezeigten verwandt ist.
Es ist beabsichtigt, dass ein rekombinantes MDV-1, ein heterologes Gen umfassend, das in eine Insertionsregion eingefügt ist, die innerhalb einer genomischen Region eines MDV-1 liegt, die durch jede dieser verwandten Restriktionsenzymkarten charakterisiert ist, auch in dem Rahmen der vorliegenden Erfindung enthalten ist. Darüberhinaus, da die der vorliegenden Erfindung entsprechend identifizierte Insertionsregion keine essentiellen Funktionen ausübt, kann die besagte Region teilweise oder vollständig deletiert werden, wonach ein heterologes Gen in besagte Region eingefügt werden kann. Es wird verstanden, dass ein rekombinantes NDV-1, das ein heterologes Gen umfasst, das in eine Region eingefügt ist, die der Insertionsregion oder einem Teil der Insertionsregion der vorliegenden Erfindung entspricht und hierin charakterisiert ist, auch einen Teil der Erfindung darstellt.
Zusammenfassend charakterisiert die oben definierte Insertionsregion im wesentlichen die Lokalisation einer Region innerhalb des MDV-Genoms, die benutzt werden kann, um heterologe Nukleinsäurensequenzen einzufügen.
Die DNA-Sequenz der Insertionsregion ist in Figur 2 als die die Nukleotidpositionen 238 bis 1050 umfassende DNA-Sequenz gezeigt. Beim Kennzeichnen der Insertionsregion der vorliegenden Erfindung ist es wichtig festzustellen, dass natürliche Variationen unter MDV-1-Viren existieren können, die in Deletionen, Substizutionen, Insertionen, Inversionen, etc., von einem oder mehreren Nukleotiden resultieren. Diese Variationen können auch durch Gentechnologie hergestellt werden. Rekombinantes MDV-1, dem ein heterologes Gen in eine solche verwandte aber nicht identische Region des MDV-1-Genoms eingefügt wurde, ist auch in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Zum Beispiel kann ein heterologes Gen in einen MDV-1-Stamm eingefügt werden, der eine Deletion in der Nukleisäuresequenz des MDV-1-Genoms, wie in Figur 2 gezeigt, besitzt. Die MDV-1- Insertionsregion, die hierin durch die in Figur 2 gezeigte DNA-Sequenz definiert wird, charakterisiert die Lokalisation einer Region innerhalb des MDV-1-Genoms, die benutzt werden kann, um heterologe Nukleinsäuresequenzen einzufügen.
Die heterologe Nukleinsäurensequenz, die gemäss der vorliegenden Erfindung in das MDV-1-Genom eingefügt werden soll, kann von jeder Quelle stammen, z.B. viral, prokaryotisch, eukaryotisch oder synthetisch. Besagte Nukleinsäurensequenz kann von einem Krankheitserreger stammen, vorzugsweise einem aviären Krankheitserreger, der nach der Insertion in das MDV-1-Genom angewendet werden kann, um Immunität gegen diese Krankheit zu induzieren. Nukleinsäurensequenzen, die von dem infektiösen Bronchitis Virus ("IBV"), MDV, NDV, IBDV, dem Hühneranämiagens ("CAA"), dem Reovirus, dem aviären Retrovirus, dem Geflügeladenovirus, dem Truthühnerrhinotracheitis-Virus, dem infektiösen Laryngotracheitis-Virus, Eimeria-Arten, Samonellenarten, Escherichia coli und Mycoplasma gallisepticum stammen, werden für die Einfügung in die Insertionsregion des MDV-1-Genoms in Betracht gezogen. Darüberhinaus können Nukleinsäurensequenzen, die für Polypeptide für pharmazeutische oder diagnostische Anwendungen, insbesondere Immunmodulatoren wie Lymphokine, Interferone oder Cytokine codieren, in besagte Insertionsregion eingefügt werden.
Die Expression solcher heterologen Nukleinsäuresequenzen erfordert, dass die Sequenzen an einen geeigneten und funktionalen Promotor gebunden sind. Solch ein Promotor kann jeder prokaryotische, eukaryotische, virale oder synthetische Promotor sein, der die Genexpression in mit MDV-1 infizierten Zellen steuern kann.
Das rekombinante MDV-1 kann mit Hilfe eines Verfahrens, das aus den folgenden Schritten besteht, hergestellt werden:
ein erster Vektor wird erhalten, der das 4,3 kb BamHI-EcoRI- Subfragment des BamHI-A-Restriktionsfragments des MDV-1-Genoms enthält, das in ein geeignetes Vehikel kloniert wird;
mindestens eine Fremdgensequenz wird in das MDV-1-DNA-Fragment des ersten Vektors inseriert, um einen zweiten Vektor zu bilden;
Zellen werden mit DNA vom zweiten Vektor und DNA von einem MDV-1 zu kotransfiziert;
die kotransfizierten Zellen werden eine Zeit inkubiert, die ausreicht um homologe Rekombination zwischen dem DNA-Fragment des zweiten Vektors, das die MDV-1-DNA enthält, die von einem Fremdgen unterbrochen ist, und der genomischen DNA des abgeschwächten MDV-1, das eine homologe oder gleiche Nukleotidsequenz wie das MDV-1-DNA-Fragment des zweiten Vektors enthält, zu ermöglichen; und
ein rekombinantes Virus wird aus den transfizierten Zellen isoliert, das aus einem abgeschwächten MDV-1 und einem darin inserierten Fremdgen besteht.
In dem ersten Schritt wird das 4,3 kb BamHI-EcoRI-Subfragment des BamHI-A-Restriktionsfragments des MDV-1-Genoms in einen geeigneten Vektor ligiert, um den ersten Vektor herzustellen. Der Vektor kann von jedem geeigneten Plasmid, Cosmid oder Bakteriophagen stammen, wobei Plasmide bevorzugt werden. Das am meisten bevorzugte Plasmid ist das pMD100-Plasmid. Das 4,3 kb BamHI-EcoRI-Subfragment des BamHI-A-Restriktionsfragments wird durch Verdau eines Klons, der das 23 kb BamHI-A-Fragment des MDV-1 enthält, gemäss den üblichen Methoden mit BamHI und EcoRI isoliert.
Ein Klon, der das 23 kb BamHI-A-Fragment des MDV-1 enthält, kann, wenn notwendig, von einer genomischen Bibliothek des MDV-1 isoliert werden. Eine genomische Bibliothek des Virus kann durch Züchten von MDV-1 in einer Wirtszellkultur, wie z.B. aviäre Zellkulturen, gemäss den üblichen Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel werden Hühnerembryofibroblastenzellen mit MDV-1 inokuliert und kultiviert, um virus-infizierte Zellen zu erhalten. Die virus-infizierten Zellen werden geerntet, mit Puffer gewaschen, zentrifugiert und in Tris-Hydrochlorid und EDTA zu einer Dichte von 1 bis 5 x 10&sup8; Zellen pro ml resuspendiert. Natriumdodecylsulfat ("SDS") wird bis zu einer Endkonzentration von 0,5% zugegeben und Proteinase K wird bis zu einer Endkonzentration von 200 ug/ml zugegeben. Nach der Inkubation wird zusätzliche Proteinase K zugegeben und die Inkubation für eine Stunde fortgesetzt. Die Lösung wird zweimal mit einer Mischung aus Phenol-Chloroform (1:1) extrahiert und die Nukleinsäuren werden gemäss üblichen Verfahren mit Aethanol gefällt. Die Gesamt-DNA der infizierten Zellen wird durch Zentrifugation gewonnen und in 10 mM Tris- Hydrochlorid (pH 7,5) und 1 mM EDTA ("TE") gelöst. Die DNA wird mit einem Restriktionsenzym, wie z.B. Sau3A, gemäss den empfohlenen Bedingungen des Enzymlieferanten, inkubiert. Die Reaktionsprodukte werden auf einem Agarosegel getrennt und die Grössenfraktion zwischen 16 und 20 kb wird isoliert. Einhundert Nanogramm dieser DNA-Fragmente werden mit einem geeigneten DNA-Vektor ligiert, der mit den entsprechenden Restriktionsenzymen gemäss den üblichen Methoden verdaut wurde. Ein geeigneter Vektor wäre zum Beispiel BamHI-EcoRI-verdaute LambdaEMBL3-DNA. Nach der Ligierung wird die Reaktionsmischung, kommerzielle Extrakte verwendend, in vitro verpackt. Rekombinante Bakteriophagen werden auf geeignete E.coli Wirtstämme, wie LE392 oder K802, in einer Dichte von 100 PBE/Platte ausplattiert. Replikas der Kulturplatten werden im Doppel hergestellt, wobei Nitrozellulosefilter gemäss den üblichen Verfahren verwendet werden. Der erste Filtersatz wird entsprechend den üblichen Methoden mit radioaktiv-markierter DNA von nichtinfizierten Zellen hybridisiert und der zweite Filtersatz wird mit radioaktiv-markierter DNA von MDV-1-infizierten Zellen hybridisiert. Nach dem Waschen und dem Belichten eines Röntgenfilms, werden die Bilder der duplizierten Filter in der korrekten Orientierung übereinander gelegt und verschiedene der Plaques, die spezifisch mit der Sonde, die von MDV-1-infizierten Zellen hergestellt wurde, ein Signal ergeben, werden isoliert und ihre Bakteriophagen vermehrt. Diese Bakteriophagenklone wurden im Detail durch Restriktionskartierung des Inserts analysiert, um einen Klon zu finden, der das Erkennungsmuster für Restriktionsenzyme aufweist, das zeigt, dass das BamHI-A-Fragment des MDV-1-Genoms enthalten ist.
Wie oben beschrieben, wird das 4,3 kb BamHI-EcoRI-Subfragment des BamHI-A-Restriktionsfragments des MDV-1-Genoms durch Verdau eines genomischen Klons, der BamHI-A enthält, mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI, gemäss den üblichen Verfahren, isoliert. Die Fragmente des Verdaus werden mittels Elektrophorese auf einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt getrennt und das 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragment gemäss Standardverfahren, die zum Beispiel Phenolextraktion und Aethanolfällung umfassen, isoliert und gereinigt. Das gereinigte 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragment wird gemäss den üblichen Verfahren, die DNA-Ligase verwenden, in einen geeigneten Vektor ligiert, um einen ersten Vektor zu erzeugen. Ein bevorzugter Vektor ist das Plasmid pUC18 oder pUC19, das von Life Technology, Inc., P.O. Box 6009. Gaithersburg, MD 20877, bezogen werden kann. Die Produkte der Ligierung werden in geeignete Wirtszellen transformiert. DNA der Transformanten wird gemäss üblicher Methoden gereinigt und analysiert, um sicherzugehen, dass der korrekte erste Vektor ernalten wird. Der erste Vektor enthält eine Erkennungsstelle innerhalb des 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragments für das Restriktionsenzym BglII. Ein bevorzugter erster Vektor ist das in Figur 3 dargestellte Plasmid pMD100.
Im nächsten Schritt wird mindestens eine Fremdgensequenz in das MDV-1-DNA-Fragment des ersten Vektors inseriert, um einen zweiten Vektor herzustellen.
Jedes Fremdgen kann für die Insertion in die BglII-Stelle des ersten Vektors verwendet werden. Das Fremdgen, das zur Insertion in den ersten Vektor verwendet wird, kann von einem dem MDV-1 heterologen Organismus isoliert werden. Falls das Fremdgenom aus RNA besteht, ist es notwendig, DNA, die komplementär zu dem Genom ist, mit Hilfe üblicher, kommerziell erhältlicher Reverse Transkriptase anwendender Verfahren herzustellen. Für die richtige Insertion des Fremdgens in den ersten Vektor, wird vorgezogen, eine Restriktionskarte des Fremdgens herzustellen und die Nukleotidsequenz des Fremdgens zu bestimmen. Die Herstellung der Restiktionskarte und der Nukleotidsequenz kann mit üblichen Verfahren durchgeführt werden.
Für das Exprimieren des Fremdgens ist es notwendig, dass ein geeigneter und funktionaler Promotor mit dem Fremdgen verbunden ist. Der Promotor kann jeder eukaryotische, prokaryotische oder virale Promotor sein, der fähig ist, die gentranskribierenden Zellen, die mit dem rekombinanten MDV-1 infiziert wurden, zu dirigieren. Beispiele schliessen Promotoren ein, die von der retroviralen langen terminalen Wiederholung (long terminal repeat) stammen, SV40-Promotoren oder Promotoren, die in dem Genom von MDV oder HVT vorkommen.
Die Insertion des Fremdgens in den ersten Vektor kann mit üblichen Methoden durchgeführt werden. Der erste Vektor wird in der BglII-Stelle, die Innerhalb des 4,3 kB EcoRI-BamHI-Subfragments des BamHI-A-Restriktionsfragments des MDV-1-Genoms liegt, geschnitten. Die Fremd-DNA wird in die BglII-Stelle mit Hilfe von DNA-Ligase und üblichen Verfahren ligiert, um einen zweiten Vektor zu bilden. Die Ligierungsprodukte werden in geeignete Wirtszellen transformiert. Die Transformanten werden mit üblichen Verfahren gereinigt und analysiert, um sicherzugehen, dass der korrekte zweite Vektor erhalten wurde. Die Plasmid-DNA des zweiten Vektors wird hergestellt und zweimal durch Zentrifugieren im Cäsiumchlorid-Aequilibrium angereichert, wobei übliche Verfahren angewendet werden.
Im dritten Schritt werden Zellen mit DNA, die von dem zweiten Vektor, wie oben beschrieben, erhalten wurde, und DNA von einem MDV-1-Stamm, kotransfiziert. Es sollte auch möglich sein, MDV-1-infizierte Zellen mit DNA des zweiten Vektors zu transfizieren.
DNA von einem MDV-1 wird durch Infektion sekundärer Kulturen von Hühnerembryofibroblasten mit einem geeigneten abgeschwächten MDV-1 und Inkubation der Kulturen, gemäss üblicher Methoden, bis ausgedehnte cytopathische Wirkungen sichtbar werden, erhalten. Vollständige zelluläre DNA wird durch vierstündige Inkubation der MDV-1-infizierten Zellen in Verdauungslösung, die 0,2 mg/ml Proteinase K, 0,5% SDS, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 8) und 1 mM EDTA enthält, gereinigt. Die Lösung wird einmal mit Phenol und zweimal mit Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Die DNA wird durch Zugabe des zweifachen Volumens an absolutem Aethanol gefällt, durch Zentrifugieren wiedergewonnen, in TE gelöst und die Menge bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Auf diese Weise hergestellte DNA wird im Folgenden als "MDV-DNA" bezeichnet. MDV-DNA kann aus Kulturen, die mit jedem geeigneten MDV-1 infiziert sind, hergestellt werden.
Kotransfektion von DNA des zweiten Vektors mit MDV-DNA wird gemäss üblicher Verfahren mit den folgenden Veränderungen durch Calcium-Phosphat vermittelte Transfektion hergestellt (F.L. Graham et al., Virology 52:456-467, 1977; und N.D. Stow et al., J. Gen. Virol. 33:447-458, 1976). Primäre Hühnerembryofibroblasten werden von zehn Tage alten Hühnerembryonen, die von spezifisch pathogenfreien Eiern stammen, erhalten. Einen Tag später werden sekundäre Hühnerembryofibroblasten von den Primärkulturen hergestellt. Während die sekundären Hühnerembryofibroblasten vorbereitet werden, werden Calcium-Phosphat-Fällungen hergestellt, die Reaktionsgefässe bleiben stehen, bis ein feines Präzipitat sichtbar ist, und die Inhalte werden dann gleichmässig zwischen zwei Platten frischausplattierter Zellen verteilt. Nach der Inkubation werden die Kulturen mit serumfreien Medium gespült, 3 Minuten mit 15% Glycerin in 1 x HBSP (0,75 mM Na&sub2;HPO&sub4;.7H&sub2;O, 5 mM KCl, 140 mM NaCl, 6 mM Glukose, 25 mM HEPES, PH 7) behandelt und mit vollständigem Erhaltungsmedium gefüttert.
In dem vierten Schritt werden die kotransfizierten Zellen eine genügend lange Zeit inkubiert, damit sich eine homologe Rekombination zwischen dem DNA-Fragment des zweiten Vektors, das das DNA-Fragment des MDV-1-Genoms zusammen mit dem Fremdgen enthält, mit einem Teil der DNA des abgeschwächten MDV-1, das eine homologe oder ähnliche Nukleotidsequenz wie das MDV-1- Fragment in dem zweiten Vektor besitzt, ereignen kann.
Schliesslich wird ein rekombinantes Virus, das ein abgeschwächtes MDV-1 und ein darin inseriertes Fremdgen enthält, aus den gezüchteten transfizierten Zellen isoliert und Rekombinante, andere Fremdgene enthaltend, können durch verschiedene Methoden, einschliesslich der Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde, Reaktionsvermögen mit einem Spezifischen Antikörper und Verlust oder Gewinn einer relevanten Enzymaktivtät, identifiziert werden.
Um zum Beispiel ein rekombinantes Virus durch Hybrisisierung zu identifizieren, wird das Erhaltungsmedium der Kulturen abgegossen und die Zellen mit frischem Medium, das Agarose enthält, überzogen. Die Kulturen werden ein bis drei Tage inkubiert, bis sich Plaques zu bilden beginnen. Ein Teil einer jeden Plaque wird zusammen mit einem Teil des Agarosegels gewonnen und auf einen im Handel erhältlichen Membranfilter übertragen. Der Filter wird einer Denaturierung und Neutralisierung unterzogen und die DNA von jeder Plaque wird auf dem Filter, gemäss üblichen Methoden, immobilisiert. Der daraus resultierende Filter wird einer Plaquehybridisierung, gemäss den üblichen Methoden, unterzogen, indem eine radioaktiv markierte, aus dem Fremdgen bestehende Sonde verwendet wird. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden als positiv betrachtet. Die rekombinanten Plaques, die mit den positiven Hybridisierungssignalen übereinstimmen, werden aus dem Agaroseüberzug der Gewebekulturplatte isoliert und entsprechend den für MDV-1 üblichen Verfahren vermehrt.
Andere Verfahren können angewendet werden, um die Gegenwart von Fremdgenen in den Transfektanten herauszufinden. Zum Beispiel können die die rekombinanten MDV-1-Plaques enthaltenden Gewebekulturplatten mit einem Antikörper gefärbt werden, der für das Fremdgenprodukt spezifisch ist. Plaques, die das das Fremdgen produzierende rekombinante MDV-1 enthalten, werden spezifisch von dem Antikörper erkannt.
Das rekombinante MDV-1 wird, wie oben beschrieben, in kultivierten Zellen vermehrt. Die Gesamt-DNA wird aus den mit rekombinantem MDV-1 infizierten Zellen isoliert und einer Southern-Blot-Analyse entsprechend üblicher Methoden unterzogen, um sicherzugehen, dass das Fremdgen in der Zielstelle inseriert ist; nämlich in dem 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragment von BamHI-A.
Ein lebendes, rekombinantes MDV-1, das ein oder mehrere verschiedene heterologe Polypeptide eines aviären Krankheitserregers exprimiert, kann verwendet werden, um Tiere zu impfen, insbesondere aviäre Spezies wie Hühner oder Truthühner, die für solche Krankheitserreger zugänglich sind. Der Impfung mit einer von dem rekombinanten MDV-1, wie hier beschrieben, hergestellten lebenden Vektorvakzine, folgt vorzugsweise die Replikation des MDV-1 in dem geimpften Wirt, der in vivo das heterologe Polypeptid und das MDV-1-Polypeptid exprimiert. Wenn eine schützende Immunantwort ausgelöst wird, wird das auf diese Weise geimpfte Tier von Folgeinfektionen durch diese Krankheitserreger geschützt sein.
Ein rekombinantes MDV-1 der vorliegenden Erfindung, ein oder mehrere verschiedene heterologe Polypeptide enthaltend, kann als monovalenter oder multivalenter Impfstoff dienen. Solch ein MDV-1 kann auch verwendet werden, um inaktivierte Impfstoffe herzustellen. Diese Impfstoffe können mit dem Fachmann bekannten Verfahren zur Impfstoffherstellung hergestellt werden.
Die Beispiele werden aufgeführt um die Erfindung weiter zu erklären, aber nicht zu limitieren.

Beispiel 1 - Materialien

Der GA-Stamm von MDV-1 wurde von M. Nonoyama, Showa Research Institute for Biomedicine, St. Petersburg, Florida, erhalten. Dieser Stamm wurde verwendet um die BamHI-Plasmid-Bibliothek von MDV-1 herzustellen (Fukuchi et al., 1984). Der Stamm wurde in sekundären Hühnerembryofibroblasten ("CEF") passagiert, bis ungefähr die 75. Passage erhalten wurde.

Beispiel 2 - Plasmidkonstruktion

Klonierungsverfahren wurden, Standardverfahren anwendend, durchgeführt. Restriktionsenzymverdau wurde entsprechend den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Das Plasmid pMD100 enthält das terminale EcoRI-BamHI-Subfragment von BamHI-A, in den Plasmidvektor pUC19, wie in Figur 3 gezeigt, cloniert. Das 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragment liegt vollständig innerhalb der einzigen kurzen Region des Genoms. Eine lacZ-Kassette wurde von Intervet International, Boxmeer, Niederlande, erhalten. Die Kassette wurde durch Entfernen des lacZ-Gens von dem eukaryotischen Assayvektor pCH110 konstruiert (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) und das Gen wie folgt modifiziert: das 72 Basenpaare grosse Sph1-Fragment nahe dem Replikationsursprung (origin of replication) von SV40 wurde durch ein doppelsträngiges synthetisches Oligonukleotid ersetzt, das die folgende Struktur besitzt:
5' - GGATCCGTCGACCATG - 3'
3' - GTACCCTAGGCAGCTG - 5'.
Die Insertion des Verbindungsstücks (linker) zwischen den beiden Sph1-Restriktionsstellen des pCH110 hat die Erkennungssequenz für Sph1 auf keiner Seite wieder hergestellt und sowohl eine BamHI- als auch eine SaII-Stelle stromaufwärts von dem frühen SV40-Promotor entstehen lassen. Der folgende Verdau dieses Konstrukts mit BamHI liess eine 4,0 kb-Expressionskassette entstehen. Das lacZ-Gen ist 4056 BP lang und steht, wie in Figur 4 gezeigt, unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors.
Um die lacZ-Kassette in pMD100 zu inserieren, wurde ein Mikrogramm pMD100 mit BglII (Bethesda Research Laboratories [BRL], Gaithersburg, MD) verdaut. Ungefähr eine Einheit alkalische Phosphatase aus dem Kälberdünndarm (Boehringer, Mannheim, Indianapolis, IN) wurde zugegeben und die Inkubation für 30 Minuten fortgesetzt. Die Reaktionsbedingungen wurden auf 20 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,4), 5 mM EDTA, 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS), und 100 ug/ml Proteinase K (BRL) angepasst und die Inkubation eine weitere Stunde fortgesetzt. Die Reaktion wurde einmal mit Phenol extrahiert, Natriumazetat wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M zugegeben, und zwei Volumen absoluter Aethanol wurde zugegeben. Die DNA wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei Spitzengeschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge gesammelt. Das DNA-Pellet wurde in 20 ul 10 mM Tris- Hydrochlorid (pH 7,4), 1 mM EDTA (TE) gelöst.
Das modifizierte lacZ-Gen wurde in die BglII-Stelle des pMD100 durch folgende Ligierungsreaktion inseriert. Fünfzig Nanogramm BglII-verdauter pMD100 und 10 ng der lacZ-Kassette wurden über Nacht bei 4ºC mit 2 Einheiten T4-Ligase (BRL) in einem Gesamtvolumen von 10 ul Ligasepuffer inkubiert, der aus 66 mM Tris- Hydrochlorid (pH 7,6), 6 mM MgCl&sub2; und 1 mM ATP bestand. Die Ligasereaktion wurde in TE bis zu einer Konzentration von 1 ng Vektor pro ul verdünnt und 2 ul der verdünnten Reaktion wurden verwendet um kompetente DH5α-Zellen zu transformieren. Plasmid-DNA der einzelnen Kolonien wurde gereinigt und auf die Anwesenheit der lacZ-Sequenz hin analysiett. Die lacZ-enthaltenden pMD100 wurden, wie in Figur 5 gezeigt, als pMT1A bezeichnet. Ein zweites Plasmid, pMT1B, ebenfalls in Figur 5 gezeigt, wurde konstruiert, das sich von pMT1A durch die Orientierung der lacZ-Kassette unterscheidet. Plasmid-DNAs wurden durch Standardverfahren hergestellt und zweimal durch Zentrifugieren im Cäsiumchloridequilibrium angereichert.

Beispiel 3 - MDV-DNA-Herstellung

Gesamt-DNA von MDV-infizierten CEF wurde, wie oben beschrieben, hergestellt. Kurz, sekundäre CEF, die in 75 cm²-Flaschen (1,6 x 10&sup7; ausplattierte Zeilen/Flasche) wuchsen, wurden mit zellassoziertem Virus (10&sup5; PBE/Flasche) infiziert und sechs Tage inkubiert. DNA wurde durch 4-stündiges Inkubieren der Zellen in 0,2 mg/ml Proteinase K (BRL), 0,5 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 8) und 1 mM EDTA enthaltende Verdauungslösung gereinigt. Die Lösung wurde einmal mit Phenol und zweimal mit Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 2 Volumen absolutem Aethanol gefällt, durch Zentrifugieren wiedergewonnen, in TE gelöst und die Menge durch Extinktion bei 260 nm bestimmt. DNA, die auf diese Weise hergestellt wurde, wird als MDV-DNA bezeichnet.

Beispiel 4 - Transfektionen

Eine Dosis-Antwort bezüglich Plaquebildung durch MDV-DNA wurde für jede MDV-DNA-Präparation bestimmt und diejenige Menge an MDV-DNA, die die maximale Ausbeute an Plaques ergab, wurde für Kotransfektionen verwendet. Vor der Transfektion wurden 4 bis 8 ug MDV-DNA und 0,5 ug Plasmid-DNA mit Aethanol gefällt, durch Zentrifugation gewonnen und in 50 ul TE gelöst.
Primäre Hühnerembryofibroblasten wurden von 10 Tage alten Hühnerembryonen aus spezifisch-pathogenfreien Eiern erhalten. Die Zellen wurden zu einer Konzentration von 8 x 10&sup5; Zellen/ml suspendiert und in einer Dichte von 1,6 x 10&sup7; Zellen/75 cm²- Flasche (20 ml/Flasche) ausplattiert. Einen Tag später wurden die Primärkulturen einmal in serumfreiem Erhaltungsmedium gewaschen und von den Flaschen durch Zugabe von 0,05 % Trypsin entfernt. Das Trypsin wurde durch Zugabe von ungefähr 0,5 ml Kälberserum inaktiviert und die Zellen 10 Minuten mit 2500 UpM zentrifugiert, in dem 1,5-fachen des ursprünglichen Volumens resuspendiert und als Sekundärkultur in einer Konzentration von ungefähr 8 x 10&sup5; Zellen ausplattiert und zweimal durch ein Baumwolltuch filtriert. Die Zellen wurden in 60 mm-Gewebekulturplatten mit Zählgitter n einer Dichte von 4 x 10&sup6; Zellen/Platte (5ml/Platte) unmittelbar vor Zugabe der Calcium- Phosphat/DNA-Niederschläge ausplattiert.
Während die sekundären Hühnerembryofibroblasten vorbereitet wurden, wurden die Calcium-Phosphat/DNA-Niederschläge durch sukzessive Zugabe der folgenden Reagentien in 15 ml-Polystyrolröhrchen hergestellt: 388 Mikroliter Wasser, 50 Mikroliter der DNA in TE und 62 Mikroliter 2 M Calciumchlorid. Genau 500 Mikroliter 2 x HBSP (2 x HBSP = 1,5 mM Na&sub2;HPO&sub4; . 7H&sub2;O, 10 mM KCl, 280 mM NaCl, 12 mM Glukose, 50 mM HEPES, pH 7) wurden langsam zugegeben und der Inhalt des Röhrchens wurde durch vorsichtiges Einblasen von 5 - 6 Blasen mit der Pipettenspitze in die Lösung gemischt. Die Röhrchen wurden 30 Minuten bei Umgebungstemperatur stehengelassen, bis ein feiner Niederschlag sichtbar wurde, vorsichtig gemischt und gleichmässig auf zwei Platten mit frisch ausplattierten Zellen verteilt. Nach einer vierstündigen Inkubation bei 37ºC wurden die Kulturen vorsichtig in serumlreiem Erhaltungsmedium gewaschen, 3 Minuten mit 15 % Glycerin in 1 x HBSP (1,5 ml/Platte) behandelt, gespült und mit vollständigen Erhaltungsmedium gefüttert.
Plaques wurden sechs Tage später gezählt. Die Häufigkeit der Plaquebildung bei den Kotransfektionsexperimenten variierte, wie in Tabelle 1 gezeigt, in Abhängigkeit von der verwendeten MDV-DNA-Präparation. Tabelle 1: Zusammenfassung der Kotransfektionsversuche zur Herstellung von GAlac-Rekombinanten Plasmidb Plaque/Niederschlagc Gesamtzahl der erhaltenen Plaques β-gal positive Plaques Frequenz β-gal Positive (%) Stabile β-gal Positive (Bestimmung)d Frequenz Stabiler β-gal Positive (%)
a Gesamt-DNA von GA-infizierten CEF wurde, wie in Material und Methoden beschrieben, hergestellt.
b 500 ng Plasmid-DNA wurde mit MDV-DNA kopräzipitiert
c Jeder Calclumphosphatniederschlag wurde gleichmässig auf zwei mit Zählgitter versehene 60mm-Platten verteilt. Die Zahlen entsprechen der Summe der Plaques, die pro Niederschlag erhalten wurden.
d Anzahl der plaquegereinigten Isolate, die 100% β-galactosidase-positiv waren.
Die Anzahl der Plaques, die nach drei Transfektionsexperimenten erhalten wurde, betrug durchschnittlich 296 ± 96 und bewegte sich in dem Bereich von 116 bis 411 Plaques pro Niederschlag. Für eine optimale Kotransfektion sollte daher jede MDV-DNA-Präparation bezüglich ihrer Transfektionseffizienz charakterisiert werden.

Beispiel 5 - Nachweis und Isolierung stabiler GAlac-Rekombinanten

Rekombinante, die das lacZ-Gen von E. coli enthielten, wurden wie folgt identifiziert. Sieben Tage nach der Transfektion wurde das Gewebekulturmedium auf 2 ml reduziert und 20 ul einer Bluogal-(BRL)-Lösung (20 mg/ml, frisch angesetzt in Dimethylsulfoxid) wurde den Platten zugegeben, was in einer Bluogal-Endkonzentration von 0,2 mg/ml resultierte. Die Platten wurden in einem Gewebekulturinkubator 1-2 Stunden inkubiert. Blaue Plaques wurden, so wie sie auftraten, gestochen und in 0,05% Trypsin suspendiert um die Zellen zu trennen. Nach 5 Minuten wurden 1-2 Tropfen Kälberserum zugegeben um das Trypsin zu inaktivieren und die isolierten Plaques wurden auffrisch ausplattierten sekundären CEF titriert. Sieben Tage später wurden die Platten gefärbt und die blauen Plaques wurden gestochen und wieder ausplattiert.
Aufgrund des Färbens zeigten sich 0,3 bis 1% der gezählten Plaques bezüglich β-Galactosidaseaktivität positiv, wie oben in Tabelle 1 dargestelft ist. Jede positive Plaque wurde ungefähr vier Zyklen Stechen und Färben unterzogen, um ein stabiles, rekombinantes, plaquegereinigtes Isolat zu erhalten. Stabile, plaquegereinigte Isolate wurden von 18% der anfänglich gestochenen blauen Plaques erhalten, und stabile, rekombinante Isolate wurden daher von ungefähr 0,1% der ursprünglichen, auf den Platten befindlichen Plaques erhalten. War eine stabile Rekombinante erst einmal isoliert, blieben die von ihr abstammenden Plaques nach jeder Passage des Virus in Zellkulturen oder erneuter Transfektion der viralen DNA in sekundäre CEF 100% galactosidase-positiv. Insgesamt wurden vier rekombinante, lacZ-exprimierende Viren isoliert. Diese Isolate wurden als GAlac1, GAlac2, GAlac3 und GAlac4 bezeichnet. Drei der Isolate (GAlac1, GAlac2 und GAlac3) wurden unter Verwendung von pMT1B hergestellt und eines (GAlac4) wurde mit pMT1A hergestellt.

Beispiel 6 - Analyse der GAlac-rekombinanten DNA

Sekundäre, in 75 cm²-Flaschen wachsende CEF wurden mit gereinigten GAlac-Rekombinanten infiziert, um annähernd 10'000 Plaques/Flasche zu ergeben. Gesamt-DNA von mit dem rekombinanten Virus infizierten Kulturen wurde, wie oben beschrieben, gereinigt. Southern Blots wurden durch Anwenden von Standardverfahren hergestellt und entweder, wie in Figur 6 gezeigt, mit dem 4,3 kb Insert des pMD100, einem 2,5 kb PvuII-Fragment von pCH110, das das 5'-Ende des lacZ-Gens enthielt, oder mit pBR322 hybridisiert. Die Sonden wurden mit ³²P-Desoxynukleotiden unter Verwendung eines zufällig initierenden (random priming) DNA-Synthese-Kits (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) markiert. DNA-DNA-Hybridisierungen wurden 16 Stunden bei 42ºC in 50% Formamid, 10 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5), 0,1% SDS, 100 ul/ml denaturierter Lachssperma-DNA, 5 x Denhardtq sche Lzesung, 0,1% Ficoll 400 (SIGMA Chemical Company, St. Louis, MO, USA), 0,1 % Polyvinylpyrrolidon und 6 x SSC (1 x SSC enthält 0,15 M Natriumchlorid und 0.015 N Natriumzitrat [pH 7]), durchgeführt. Hybridisierte Nitrozellulosefilter wurden viermal je 30 Minuten bei 65ºC in Waschlösung bestehend aus 0,1 x SSC und 0,1% SDS gewaschen.
DNA-Sequenzierung von RNA-freien Plasmiden wurde unter Verwendung der Didesoxy-Sequenziermethode und Sequenase I (United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio) durchgeführt. Die Sequenzen wurden mit dem im Handel erhältlichen Software- Paket "Microgenie" (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA) analysiert.

Beispiel 7 - Southern Blot-Analyse der GAlac-Rekombinanten

Um zu untersuchen, ob die Rekombination restriktionsstellenspezifisch innerhalb des 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragments des BamHI-A erfolgte, wurde die DNA der rekombinanten Viren Southern-Blot-Analysen, wie in Figur 6 gezeigt, unterzogen. Auf Tafel A wurden die Blots mit dem 4,3 kb-EcoRI-BamHI-Subfragment von BamHI-A, das aus pMD100 erhalten wurde, hybridisiert. Auf Tafel B ist die verwendete Sonde das 2,5 kb PvuII- Fragment, das innerhalb des lacZ-Gens liegt. Für jede Sonde wurden 10 ug DNA mit BamHI oder einer Kombination von BamHI und EcoRI verdaut. Spalten 1, 6, 13 - CEF-DNA mit BAmHI geschnitten; Spalten 2, 7, 14 - DNA mit BamHI und EcoRI geschnitten, die von mit dem elterlichen GA-Stamin infizierten CEF stammt; Spalten 4, 9, 11, 16 - DNA von mit GAlac1 bzw. 2, 3 oder 4 infizierten CEF mit BamHI geschnitten; Spalten 5, 10, 12, 17 - DNA von mit GAlac1 bzw. 2, 3 oder 4 infizierten CEF mit BamHI oder EcoRI geschnitten. In allen Fällen erfolgte die Rekombination an der Zielstelle. Die 4,3 kb-Insertion des pMD100 hybridisierte mit einer 4,6 kb und einer 3,8 kb EcoRI- BamHI-Bande von GAlac1, GAlac2 und GAlac3, was zeigt, dass die elterliche 4,3 kb-Bande durch die Addition von 4 kb DNA, die eine EcoRI-Schnittstelle enthielten, modifiziert wurde. Die lacZ-Sonde hybridisierte in diesen Rekomobinanten mit einer 4,6 kb-Bande, was zeigt, dass die 4,6 kb-Bande lacZ-Sequenzen enthielt. Die 3,8 kb-Bande wurde von der lacZ-Sonde nicht entdeckt, da die verwendete 2,5 kb PvuII-Sonde dem 5'-Ende des lacZ-Gens homolog ist und sich nicht über die EcoRI-Stelle innerhalb des lacZ-Gens erstreckte. Hybridisierung der gleichen Sonden mit GAlac4 zeigte, dass das Rekombinationsereignis in gleicher Weise auftrat; jedoch befand sich das lacZ-Gen in der entgegengesetzten Orientierung in dem Virus (Figur 6).
Rekombination von lacZ in das MDV-Genom könnte auf zwei Wegen erfolgt sein. Ein doppeltes Crossover-Ereignis, das beide Flanken des lacZ-Gens im pMD100 einschliesst, hätte den Ersatz des 4,3 kB EcoRI-BamHI-Subfragments des BamHI-A durch den lacZ-enthaltenden Abkömmling zur Folge gehabt. Einzelcrossover-Ereignisse in jedem der Flanken des lacZ-Gens hätte einen Abkömmling zur Folge gehabt, der die gesamten elterlichen Sequenzen plus das vollständige pMT1A oder pMT1B, einschliesslich pUC19-Sequenzen enthält.
Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse zeigen, dass die Rekombination als Doppelcrossover-Ereignis aufgetreten ist. Erstens, falls pUC19-Sequenzen in das MDV durch ein Einzelcrossover-Ereignis inseriert worden wären, wäre zu erwarten gewesen, dass die 4,3 kb-Insertion des pMD100 mit drei Fragmenten der Grössen 4,6, 4,3 und 3,8 kb in den Fällen des GAlac1, 2 und 3 hybridisiert hätte, und drei Fragmente der Grössen 6,9, 4,3 und 1,5 im Fall von GAlac4. Die Tatsache, dass die von pMD100 abstammende Sonde die 4,3 kb-Bande nicht entdeckt hat, liefert den Beweis, dass pUC19-Sequenzen nicht mit MDV-Rekombinanten rekombiniert wurden. Zweitens, pBR322, das DNA-Sequenzen mit pUC19 gemeinsam hat, hybridisierte mit keiner der DNAs der Rekombinanten, was zeigt, dass pUC19-Sequenzen nicht mit dem Virus rekombinierten.

Beispiel 8 - Sequenzen der Insertionsstelle

Insertion des lacZ in die BglII-Stelle des 4,3 kb EcoRI-BamHI- Subfragments von BamHI zeigte, dass diese Stelle für die Virusreplikation in Zellkulturen nicht essentiell ist. Wie Figur 2 zeigt, wurden Sequenzierungen der beiden, die relevante BglII-Stelle umgebenden Richtungen, durchgeführt, um Gene zu identifizieren, die hätten unterbrochen sein können. Insertion in die BglII-Stelle hätte den linksgerichteten offenen Leserahmen auf eine Länge von 810 Basenpaaren unterbrochen und einen rechtsgerichteten offenen Leserahmen in einer Länge von 462 Basenpaaren.

Beispiel 9 - Wachstumskurven der elterlichen und rekombinanten MDV-Isolate

Primäre CEF wurden hergestellt und in 75 cm²-Flaschen ausplattiert. Primäre Kulturen wurden hergestellt und als Sekundärkulturen an den Tagen 0, 1, 2, 4 und 6, nach Bedarf, ausplattiert. Am Tag 0 wurden zwölf 60 mm-Platten sekundäre CEF mit annähernd 300 PbE des elterlichen MDV-Stammes inokuliert und zwölf Platten wurden mit annähernd 300 PbE der GAlac1-Rekombinanten inokuliert. Die auf den Platten der beiden Stämme vorhandenen Plaques wurden sechs Tage nach der Inokulation gezählt, um die eigentlich ausplattierten PbE zu bestimmen. An den Tagen 0, 1, 2, 4, sind 6 wurden die im Doppel inokulierten Platten geerntet und das vorhandene Virus auffrisch präparierten sekundären CEF titriert. Sechs Tage nach der Titrierung wurden die Plaques gezählt und die Anzahl der vorhandenen PbE der ursprünglichen Inokulationsplatten bestimmt.
Ueber einen Zeitraum von sechs Tagen gab es, wie in den Figuren 7 und 8 gezeigt, keine erkennbaren Unterschiede in den Wachstumseigenschaften der beiden Stämme in sekundären CEF bei 37ºC oder 41ºC. Beide Stämme wuchsen bei 41ºC schneller als bei 37ºC; jedoch war die erhaltene Endausbeute der Viren pro Platte die gleiche bei beiden Temperaturen.

Beispiel 10 - In vivo-Analyse der elterlichen und rekombinanten MDV-Isolate

Tagealten, spezifisch-pathogenfreien, einkämmigen Weissen Leghornhühner wurden die Flügel eingebunden und sie wurden intraabdominal mit Zellen geimpft, die mit dem elterlichen MDV- Stamm infiziert waren, mit Zellen, die mit der GAlac1-Rekombinanten infiziert waren oder mit nichtinfizierten Zellen. Eine Woche post inokulationem (PI), wurden jedem Huhn Plasmaproben entnommen. Milzzellen wurden von jeder Gruppe isoliert, gezählt und die entsprechende Anzahl lebender Zellen (5 x 10&sup7; und 5 x 10&sup6;) wurde mit frisch präparierten CEF kokultiviert. Lymphozyten wurden durch Zentrifugation durch "Histopaque 1077" (SIGMA Chemical Co., St. Louis, MO) gereinigt, gezählt und die entsprechende Mengen an lebenden Zellen. (1 x 10&sup7; und 1 x 10&sup6;) wurden auf frisch präparierten CEF kokultiviert. Sechs Tage später wurden die Plaques auf den Kokultivierungsplatten gezählt. Das Ergebnis der Titration ist in Tabelle 2 für Milzzellen und in Tabelle 3 für Lymphozyten dargestellt. Tabelle 2. Virusisolierungen aus der Milz Stamm Dosis (PbE) Erhaltene Plaques (Anzahl der aus-) plattierten Zellen Durchschnittl. erhaltene Plaques (Anzahl der ausplattierten Zellen Eltern Tabelle 3. Virusisolierung aus Lymphozyten Stamm Dosis (PbE) Erhaltene Plaques (Anzahl der ausplattierten Zellen) Durchschnittl. erhaltene Plaques (Anzahl der ausplattierten Zellen) Eltern
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein rekombinantes MDV, das ein β-Galactosldase-Gen, das in die BglII-Stelle des 4,3 kb EcoRI- BamHI-Subfragments des BamHI-A inseriert ist, aus Milzzellen isoliert werden und in Hühnern in gleicher Weise wie der elterliche Stamm Virämie auslösen kann. Einige der Titrationsplatten wurden zum Nachweis auf β-Galactosidaseaktivität unter Verwendung von Bluogal als Substrat gefärbt, um die Stabilität der GAlac-Rekombinanten nach ihrer Passage durch Hühner zu beurteilen. Von 473 gefärbten Plaques der GAlac-Titrationen waren alle bezüglich der β-Galactosidaseaktivität positiv. Nach 3 und 6 Wochen PI wurden nochmals Plasmaproben erhalten, und Lymphozyten wurden gereinigt und auf das Vorhandensein von MDV untersucht, um die Dauer der Virämie für jeden Stamm zu bestimmen. Beide Viren verblieben mindestens 6 Wochen PI in den Lymphozyten, obwohl die Virämie nach dem 3-Wochen-Beobachtungspunkt beträchtlich abnahm. Antikörperreaktionen auf MDV wurde bei jeder einzelnen Plasmaprobe der Wochen 1, 3 und 6 PI durch einen direkten Immunfluoreszenzassay untersucht. Eine anti-MDV-Antikörperreaktion wurde in allen mit entweder dem Elternvirus oder der GAlac-Rekombinanten injizierten Gruppen beobachtet. Die Antikörperreaktion trat bei der Probenentnahme nach drei Wochen auf und nahm an Stärke bis zur 6-Wochen-Probenentnaäme zu.
Von diesen Experimenten kann geschlossen werden, dass die innerhalb des 4,3 kb EcoRI-BamHI-Subfragments des BamHI-A liegende BglII-Stelle für eine stabile Integration von Fremdsequenzen ohne signifikante Wirkung auf essentielle MDV-Funktionen, die für die Infektion und Replikation erforderlich sind, genutzt werden kann. Darüberhinaus kann geschlossen werden, dass die Fähigkeit des Virus, eine Anti-MDV-Immunantwort auszulösen, durch die Integration von Fremdsequenzen in die Insertionsstelle nicht beeinträchtigt wird.

Claims

1. Eine Nukleinsäurensequenz des DNA-Genoms des Virus der Marek'schen Krankheit vom Serotyp ("MDV-1"), die einen offenen Leserahmen in dem terminalen 4,3 kB EcoRI-BamHI- Subfragment von BamHI-A in der einzigen kurzen Region dem Genoms enthält, welche eine, im wesentlichen wie in Figur 1 dargestellte Restriktionsenzymstellenkarte besitzt.

2. Eirie Nukleinsäurenregion gemäss Anspruch 1, die DNA-Sequenz von Nukleotidposition 238 bis 1050, wie in Figur 2 dargestellt, enthaltend.

3. Eine Nukleinsäurenregion gemäss Anspruch 2, in der die besagte Region eine Insertionsstelle umfasst, die die Erkennungssequenz des BglII-Restriktionsenzyms enthält.

4. Ein Plasmid, die Nukleinsäurensequenz gemäss Anspruch 1 enthaltend.

5. Ein Plasmid gemäss Anspruch 4, worin das Plasmid das in Figur 3 dargestellte pMD100 ist.

6. Ein Plasmid gemäss Anspruch 4, worin ein Fremdgen, das von einem eine Geflügelkrankheit verursachenden Agens stammt, in die besagte Insertionsregion inseriert ist.

7. Ein Plasmid gemäss Anspruch 6, worin das besagte Fremdgen aus der Gruppe, die im wesentlichen aus dem Virus der Marek'schen Krankheit, dem infektiösen Bronchitis-Virus, dem Virus der Newcastle Krankheit, dem infektiösen Virus der bursalen Krankheit, dem Hühneranämieagens, dem Reovirus, dein aviären Retrovirus, den Geflügeladenovirus, dem Truthühner-Rhinotracheitis-Virus, dem infektiösen Laryngotracheitis-Virus, Eimeria, Salmonella, E. coli und Mycoplasma gallisepticum besteht, ausgewählt ist, worin das besagte Fremdgen unter der Kontrolle eines Promotors steht, der in der Lage ist, die Expression der besagten Sequenz zu lenken.

8. Ein Plasmid gemäss Anspruch 6, in dem das besagte Fremdgen unter der Kontrolle eines Promotors steht, der in der Lage ist, die Expression der besagten Sequenz zu lenken.

9. Ein Plasmid gemäss Anspruch 8, worin der besagte Promotor der frühe SV40 Promotor ist.

10. eine Wirtszelle, ein Plasmid gemäss Anspruch 4 enthaltend.

11. Ein rekombinantes MDV-1, das die genomische DNA des MDV-1 und mindestens ein Fremdgen enthält, das von einem eine Geflügelkrankheit verursachenden Agens stammt, worin besagtes Fremdgen in die besagte genomische DNA der Insertionsregion gemäss Anspruch 1 inseriert ist.

12. Ein rekombinantes MDV-1 gemäß knspruch 11, das einen Promotor für die Insertionsregion enthält, welcher Promotor einer Wirtszelle eine Funktion für die Expression des besagten Fremdgens hat.

13. Ein rekombinantes MDV-1 gemäss Anspruch 11, worin besagtes Fremdgen in die BglII-Restriktionsstelle des 4,3 kB Subfragmentes von BamHI-A eingefügt ist.

14. Ein rekombinanter MDV-1 gemäss Anspruch 12, worin mindestens ein Polypeptid, das von besagtem Fremdgen kodiert wird und mindestens ein Polypeptid, das von besagte genomischer DNA des MDV-1 kodiert wird, exprimiert werden.

15. Verfahren zur Herstellung eines Geflügelimpfstoffes, umfassend: Züchten des rekombinanten MDV-1 Vektors gemäss Anspruch 12, Expression bes Vektors in einer geeigneten Wirtszelle, Ernte der exprimierten Polypeptide und Mischen des Polypeptids mit einem physiologisch annehmbaren Träger.

16. Ein Impfstoff, der einen rekombinanten MDV-1 gemäss Anspruch 12 enthält.