DE69412137T2

DE69412137T2 - Sensoreinrichtung zum sandwichtest

Info

Publication number: DE69412137T2
Application number: DE69412137T
Authority: DE
Inventors: Janys Bagshot Surrey Gu19 5Dl Fletcher; Grenville Arthur London W13 7Ye Robinson
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1993-12-16
Filing date: 1994-12-15
Publication date: 1999-01-21
Anticipated expiration: 2014-12-16
Also published as: DE69412137D1; ES2119369T3; DK0734527T3; EP0734527B1; AU689174B2; CA2177362A1; WO1995016914A1; JP3458860B2; EP0734527A1; AU1198895A; GB9325718D0; CA2177362C; JPH09510774A; US5856203A; ATE169117T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von Sandwichassays auf chemische, biochemische oder biologische Einheiten und Vorrichtungen zur Verwendung in einem solchen Verfahren.
Es besteht nun ein großes Interesse an der Entwicklung von Assayvorrichtungen und -techniken zum Nachweis und/oder zur Messung der Anwesenheit eines Analyts in einer Probe, und die verschiedenen Methoden und Vorrichtungen, die verfügbar sind, wurden ausgiebig besprochen, beispielsweise in Biosensors: Fundamentals and Applications, herausgegeben von A. P. F. Turner, I. Karube, G. S. Wilson, Oxford Scientific Publications, 1987. Standardassaytechniken sind jedoch hochempfindlich gegenüber einer breiten Vielzahl von Bedingungen und Störfaktoren, die die Höhe des beobachteten Signals beeinflussen können, z. B. Temperatur, Reagensstabilität, Inkubation und Entwicklungszeit. Folglich wird die analytische Leistungsfähigkeit von Standardassaytechniken oft durch das Kalibrationsverfahren des verwendeten Immunsensors begrenzt, was üblicherweise mit der Durchführung eines Tests an einer Standardprobe, die eine bekannte Menge an Analyt enthält, verbunden ist. Bezüglich Assays mit Antikörperbeteiligung sind die immunologischen Bindungsreaktionen, die auftreten, oft irreversibel. So muß jeder Kalibrationsschritt unter Verwendung einer separaten Vorrichtung oder Vorrichtungen (bevorzugt aus der gleichen Herstellercharge) durchgeführt werden, was unvermeidlich Fehler einführt.
Die Notwendigkeit einer separaten Kalibrationsstufe unter Verwendung zusätzlicher Sensorvorrichtungen kann durch Verwendung einer Vorrichtung in dem Assay vermieden werden, der mit separaten Zonen versehen ist, wobei die Kalibrationsstufe in dem Assayverfahren durchgeführt wird.
Solche Methoden, die sowohl auf Sandwichassays als auch auf Kompetitionsassays anwendbar sind, sind in der WO92/09892 beschrieben.
Standardsandwichassaytechniken neigen besonders dazu, den 'Hook'-Effekt bei hohen Konzentrationen (eine paradoxe Umkehrung der Standardkurve bei hohen Dosen des Analyts) zeigen, wobei eine typische Standardkurve für einen herkömmlichen Immunoassay in Fig. 1 dargestellt ist. Dieser Effekt kann durch Verwendung der aufeinanderfolgenden statt der gleichzeitigen Anwendung der verschiedenen spezifischen Bindungspartner für den zu testenden Analyt beseitigt werden. Alternativ benötigt die Beseitigung des 'Hook'-Effekts bei hohen Dosen einen Test auf eine Probe in mindestens zwei verschiedenen Verdünnungen. Der übliche Weg jedoch, einen einstufigen Sandwichassay durchzuführen, ist die Verwendung eines großen Überschusses eines markierten spezifischen Bindungspartners, um den 'Hook'-Effekt bei hoher Konzentration abzumildern.
Eine Alternative zur Verwendung eines Überflusses an einem markierten spezifischen Bindungspartner ist, den Sandwichassay durch Abmessen einer bekannten Menge des zu testenden Analyts in die Assayvorrichtung zu kalibrieren. In Abwesenheit des interessierenden Analyts in der Probe wird ein festes Signal erhalten, aber wenn der Analyt vorhanden ist, wird die Dosis-Antwort-Kurve des Referenzassays, verglichen mit der des Testassays, verschoben, wobei die relative Größe der Verschiebung mit der Zunahme der Analytkonzentration abnimmt. Schließlich wird jedoch bei hoher Analytkonzentration die Verschiebung null, da der immobilisierte spezifische Bindungspartner mit dem Analyt gesättigt ist. Dies wird für einen Immunoassay in Fig. 2 erläutert, und klar sind daher derartige Referenztechniken in allen Konzentrationen des in der Probe vorhandenen Analyts, aber besonders bei hoher Analytkonzentration, nicht zufriedenstellend und mildern den 'Hook'-Effekt bei hoher Konzentration nicht ab.
Bei den in der WO92/09892 beschriebenen Sandwichassaytechniken wird bei einem Referenzverfahren eine Vorrichtung mit einer Referenzzone, die einen immobilisierten spezifischen Antikörper gegen das zu testende Antigen enthält, verwendet, wobei die Referenzzone auch ein vorkomplexiertes Gemisch des markierten zweiten spezifischen Antikörpers gegen den zu testenden Antikörper und das zu testende Antigen enthält. Obwohl ein solcher Komplex wahrscheinlich stabiler ist als die separaten Komponenten, ist er leider nicht in der Lage, die Leistungsfähigkeit des zweiten spezifischen Bindungspartners in der Meßzone der Vorrichtung nachzuahmen. Es kann daher also bei diesem Kalibrationstyp ein weiterer Nachteil sein, daß, sofern der zweite spezifische Antikörper während der Herstellung oder der Lagerung der Vorrichtung abgebaut worden sein sollte, keine Information über seine Reaktivität durch Austesten der Referenzzone erhalten werden kann. Es wurde nun gefunden, daß diese Nachteile überwunden werden können, wenn der spezifische Antikörper und das zu testende Antigen anfänglich in der Vorrichtung separat statt vorkomplexiert vorhanden sind.
Es wurde nun eine Assayvorrichtung und ein Assayverfahren entwickelt, das sich für Sandwichassays eignet, die die Probleme bekannter Assaytechnik überwindet und das Mittel zur Kalibrierung des Assays als Teil des Assayverfahrens anbietet.
So wird gemäß einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung eine Sensorvorrichtung bereitgestellt, die umfaßt i) eine getrennte Zone (die Meßzone), bei der in einer Region (die Meßregion) direkt oder indirekt ein erster spezifischer Bindungspartner für den zu testenden Liganden (oder ein Reagens, das mit einem Komplex mit einem spezifischen Bindungspartner für den zu testenden Liganden vorkomplexiert ist oder einen solchen Komplex bilden kann) immobilisiert ist, wobei die Zone zusätzlich in freisetzbarer Form eine erste bekannte Menge eines gegebenenfalls markierten zweiten spezifischen Bindungspartners für den zu testenden Liganden enthält, wobei der zweite spezifische Bindungspartner gegen ein Epitop des zu testenden Liganden gerichtet ist, das sich von dem Epitop unterscheidet, gegen das der erste spezifische Bindungspartner gerichtet ist; und ii) eine zweite getrennte Zone (die Referenzzone) bei der in einer Region direkt oder indirekt einer erster spezifischer Bindungspartner für den zu testenden Liganden (oder ein Reagens, das mit einem Komplex mit einem spezifischen Bindungspartner für den zu testenden Liganden vorkomplexiert ist oder einen solchen Komplex bilden kann) immobilisiert ist, wobei die Zone zusätzlich in freisetzbarer Form eine bekannte Menge eines Liganden- Analogons enthält und separat in freisetzbarer Form eines bekannte Menge eines gegebenenfalls markierten zweiten spezifischen Bindungspartners für den zu testenden Liganden, wie vorstehend definiert, enthält, wobei die zweite bekannte Mange weniger als die vorstehend genannte erste bekannte Menge in der Meßzone ist.
Der Ausdruck Ligandenanalogon wird verwendet, um ein Teilchen zu bezeichnen, das an die gleiche Epitopstelle des gleichen spezifischen Bindungspartners wie der zu testende Ligand binden kann, und umfaßt unter anderem in seinem Umfang eine bekannte Menge des zu testenden Liganden.
Die bekannte Menge eines gegebenenfalls markierten spezifischen Bindungspartners in der Referenzzone muß weniger als die in der Meßzone sein, damit die Referenzzone zu einem Signal führt, das konstant ist und von der Menge des in der Probe vorhandenen Analyts bis zu der hochkonzentrierten Hook-Konzentration für den Test unabhängig ist.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch ein oder mehrere weitere Referenzzone(n) enthalten, wobei jede vorhandene Referenzzone verschiedene bekannte Mengen eines gegebenenfalls markierten spezifischen Bindungspartners enthält. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Testverfahren auf einen Liganden in der Probe bereitgestellt, das die Stufen umfaßt
i) Inkubieren der Probe mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, wie vorstehend definiert;
ii) Überwachen des Signals entsprechend der verwendeten Assaytechnik, das aus der Meßzone (wie vorstehend definiert) der Vorrichtung hervorgeht (das Assaysignal);
iii) gleichzeitig mit oder nachfolgend auf das Überwachen in ii) Überwachen des Signals entsprechend der verwendeten Assaytechnik, das aus der Referenzzone/den Referenzzonen (wie vorstehend definiert) der Vorrichtung hervorgeht (das Referenzsignal/die Referenzsignale); und
iv) Vergleichen des Referenzsignals/der Referenzsignale mit dem Assaysignal, wodurch unter Verwendung eines geeigneten Algorithmus bestimmt wird, ob und/oder in welchem Ausmaß der zu testende Ligand in der Probe vorhanden ist.
Die Inkubation in Stufe i) umfaßt das Inkontaktbringen der Probe mit der Meßzone der Vorrichtung und das gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Inkontaktbringen der Probe mit der Referenzzone/den Referenzzonen der Vorrichtung.
Eine breite Vielzahl von Vorrichtungen kann verwendet werden, um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen, umfassend beispielsweise tauchstäbenchenförmige oder teststreifenförmige Biosensoren, eine Vorrichtung unter Verwendung einer Probendurchflußkonfiguration oder Vorrichtungen unter Verwendung des Proben-Behältnisses. Beispiele für Biosensoren, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, umfassen Sensoren mit Oberflächenplasmonresonanz, Resonanzspiegeltechniken, piezoelektrische und gesamtinterne Reflexionstechniken.
Jedoch ist eine bevorzugte erfindungsgemäße Vorrichtung eine Kapillarfüllvorrichtung, insbesondere eine Fluoreszens-Kapillarfüllvorrichtung, beispielsweise des Typs, wie in der EP-A-171 148 oder in der WO90/14590 beschrieben. Solche Kapillarfüllvorrichtungen können einzeln oder in einer geeigneten Haltevorrichtung, wie in der WO90/1830 beschrieben, verwendet werden.
Wie in der EP-A-171 148 beschrieben, besteht eine Kapillarfüllvorrichtung (nachstehend als CFD abgekürzt) typischerweise aus zwei Platten aus transparentem Material, z. B. Glas, getrennt durch einen engen Spalt oder Kavität. Eine Platte wirkt als optischer Wellenleiter und trägt ein immobilisiertes Reagens, das dem in der Vorrichtung durchzuführenden Test angepaßt ist. Wie in der WO90/14590 beschrieben, kann die andere transparente Platte auf ihrer Oberfläche getrennt von der Kavität eine Schicht aus lichtabsorbierendem oder opakem Material tragen. Zur Verwendung in einem Sandwichassay kann das immobilisierte Reagens beispielsweise ein spezifischer Bindungspartner gegen den Liganden, der nachgewiesen werden soll, sein, und jede der Platten kann ein lösliches Reagens, umfassend einen weiteren spezifischen Bindungspartner für den zu testenden Liganden, markiert mit einem Fluoreszensfarbstoff (das Nebenreagens), enthalten. Wenn eine Probe an einem Ende der CFD angebracht wird, wird sie in den Spalt durch Kapillarwirkung gezogen und löst das Nebenreagens auf. Weil der Kapillarspalt eng ist (typischerweise etwa 100 um) läuft die Bindungsreaktion im allgemeinen in kurzer Zeit vollständig ab, möglicherweise in weniger als 5 Minuten, in Abhängigkeit von der Probenmatrix, dem Assaytyp und den Reagensaffinitäten. In einem Sandwichimmunoassay auf ein Antigen bildet ein Probenantigen einen Sandwichkomplex mit einem fluoreszierend markierten Antikörper und einem auf dem Wellenleiter immobilisierten Antikörper. So ist in einem Sandwichimmunoassay die Menge zu fluoreszierend markierten Antikörpers, der indirekt an den Wellenleiter durch Komplexbildung gebunden wird, im allgemeinen der Konzentration des Antigens in der Probe direkt proportional.
Der hier verwendeten Ausdruck Antigen soll sowohl antigene Teilchen (beispielsweise Proteine, Bakterien, Bakterienfragmente, Zellen, Zellfragmente und Viren) als auch Haptene, die unter geeigneten Bedingungen antigen gemacht werden können, umfassen.
So wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine spezifisch reaktive Probensammel- und -testvorrichtung zur Verwendung in einem Sandwichassay auf einen Liganden bereitgestellt, die eine Kavität mit zwei Zonen I und II, die wechselseitig voneinander getrennt sind, umfaßt, wobei jede Zone eine Schicht enthält, die in freisetzbarer Form ein Reagens, das für den gewünschten Assay geeignet ist, umfaßt, wobei die Oberfläche eine Oberfläche einer ersten festen Platte aus transparentem Material ist, wobei die Wand der oder jeder Kavität gegenüber der ersten Platte eine zweite Platte aus transparentem Material und so angepaßt, daß sie als lichtdurchlässiger Wellenleiter wirken kann, umfaßt, wobei die zweite Platte auf ihrer Oberfläche benachbart zu der Kavität zwei Zonen IV und V, entsprechend in ihrer Orientierung den vorstehend genannten Zonen I bzw. II, besitzt, wobei jede der Zonen IV und V eine Schicht, umfassend ein immobilisiertes Reagens, das für den gewünschten Assay geeignet ist, enthält. Die erste Platte enthält vorteilhafterweise auf ihrer äußeren Seite eine opake Beschichtung.
Die Anordnung der vorstehend genannten Zonen ist so, daß die Zone I zusammen mit der Zone IV gepaart wird und die Zone II zusammen mit der Zone V gepaart wird, so daß eines der Paare die Meßzone, wie vorstehend definiert, ergibt und das andere Paar die Referenzzone, wie vorstehend definiert, ergibt.
Wie vorstehend erwähnt, können die CFDs und andere erfindungsgemäße Vorrichtungen gegebenenfalls mehr als eine Referenzzone enthalten. Sie können gegebenenfalls mehrere Meßzonen enthalten, die die Durchführung gleichzeitiger oder aufeinanderfolgender Assays auf Liganden in der gleichen Probe erlauben. Beispielsweise könnte die Vorrichtung eine Meßzone und zwei oder drei Referenzzonen, wie vorstehend definiert, für den gleichen Assay enthalten, um die Genauigkeit der Kalibration des Assays zu verbessern.
Alternativ könnte die Vorrichtung eine erste Meßzone und eine Referenzzone, wie hier definiert, für einen Assay zusammen mit einer weiteren Meßzone für einen anderen Assay enthalten. Die Referenzzone würde auch als Kalibration für die weitere Meßzone dienen, obwohl eine solche Kalibration sich von der für die Meßzone unterscheiden würde.
Die in den Zonen auf der ersten transparenten Platte enthaltenen Reagentien können in einer auflösbaren Schicht eines geeigneten Materials enthalten sein. Nach der Aufbringung des löslichen Reagenses kann eine Deckschicht, z. B. Polyvinylalkohol (PVA), auf das Reagens aufgebracht werden, wobei die Deckschicht die Auflösung des Reagenses für ein paar Sekunden nach der Zugabe der Probe in die Vorrichtung verzögert. Dies dient dazu, zu verhindern, daß die Reagentien von einer Zone in die andere Zone gewaschen werden, wodurch ein akurater Assay verhindert wird. Die Kavität oder Kavitäten der Vorrichtung ist/sind bevorzugt klein genug dimensioniert, damit die Probenflüssigkeit in die Kavität durch die Kapillarwirkung gezogen werden kann, obwohl jedes andere Verfahren zur Füllung der Kavitäten verwendet werden kann. Die Zonen auf der ersten transparenten Platte und dadurch die entsprechenden Zonen auf der zweiten transparenten Platte können entweder tandemartig oder in jeder anderen geometrischen Anordnung, die die Integrität der Zonen beibehält, angeordnet sein.
Die erfindungsgemäßen Kapillarfüllvorrichtungen können nach Verfahren hergestellt werden, die breit ausgedrückt denjenigen, die in der EP-A-171 148 beschrieben sind, ähnlich sind. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung spezifisch reaktiver Proben-Testvorrichtungen, wie vorstehend beschrieben, bereitgestellt, umfassend die Stufen
(a) Bilden einer Anordnung von Flecken geeigneter Reagentien, getragen von den Zonen I und II, wie vorstehend beschrieben, auf der Oberfläche eines flächenförmigen Materials, das Teil einer Vielzahl der Vorrichtungen sein soll,
(b) Bilden eine Anordnung von Flecken geeigneter Reagentien, die von den Zonen IV und V, wie vorstehend beschrieben, getragen werden, auf der Oberfläche einer weiteren Struktur, umfassend, sofern geeignet, die Immobilisierung spezifisch reaktiver Teilchen, wie vorstehend beschrieben, wobei die zusätzliche Struktur zusammen mit dem flächenförmigen Material für jede der Vielzahl von Vorrichtungen eine Kavität zum Gewinnen und Zurückhalten eines Volumens an Probenflüssigkeit in Kontakt mit den Schichten geeigneter Reagentien bereitstellt, wobei die Kavität bevorzugt kapillardimensioniert ist und
(c) Abtrennen des flächtförmigen Materials in Anteile, die jeweils einen oder eine Vielzahl von Probensammel- und - testvorrichtungen bereitstellen.
In diesem Verfahren können die Zonen der Reagentien, die auf der ersten Plattte enthalten sind, kontinuierlich sein, wenn die Reagentien, die in den Zonen enthalten sind, identischer Natur sind. Alternativ können die Reagentienzonen, die auf der ersten Platte enthalten sind, wie die Reagentienzonen, die auf der zweiten Platte enthalten sind, in ein Muster getrennter Teile aufgeteilt werden, beispielsweise als eine zweidimensionale Anordnung von Flecken. Wenn solche Flecken gebildet werden, können sie beispielsweise so hergestellt werden, daß man zuerst eine kontinuierliche Schicht bildet und dann Anteile davon entfernt, wodurch das gewünschte Muster identischer Reagentienflecke zurückgelassen wird. Alternativ kann das gewünschte Muster an Flecken direkt nach jedem herkömmlichen Druckverfahren (beispielsweise durch Tintenstrahldrucken oder Siebdrucken) aufgebracht werden, wobei eine solche Technik am meisten auf Ausführungsformen anwendbar ist, bei denen für jede der vorstehend genannten Platten die in den Zonen auf der Platte enthaltenen Reagentien nicht identischer Natur sind oder ansonsten sehr teuer sind und ihre Verwendung minimalisiert werden muß. Tintenstrahldrucken ist das bevorzugte Verfahren zur Aufbringung der Reagentien.
Die Immobilisierung eines spezifisch reaktiven Teilchens auf der Oberfläche der Kavität kann direkt oder indirekt durchgeführt werden. Wenn beispielsweise das spezifisch reaktive Teilchen ein Antikörper ist, kann eine indirekte Immobilisierung mit einem Antiteilchen-Antikörper durchgeführt werden, der selbst an die Oberfläche gebunden wird. Alternativ kann die Immobilisierung durch Konjugieren eines Antikörpers mit Biotin und Komplexieren mit auf der Oberfläche vorimmobilisiertem Avidin durchgeführt werden oder umgekehrt. Ein weiteres Beispiel einer indirekten Immobilisierung umfaßt die Konjugation von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) an den spezifischen Bindungspartner für das zu testende Teilchen und die Immobilisierung von Anti-FITC-Antikörpern auf der Oberfläche. Die direkte Immobilisierung kann durch Aktivieren der Oberfläche durch Behandlung mit einem geeigneten Reagens (z. B. einem Silanisierungsreagens, wie Aminopropyltrimethoxysilan) durchgeführt werden, gegen das der Antikörper covalent unter Verwendung eines geeigneten Vernetzungsreagenses (z. B. Glutaraldehyd oder Glykolaldehyd) gekoppelt werden kann. Alternative Techniken, die einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, können zur Immobilisierung des Überzugs verwendet werden. Haptene und Antigene können direkt auf der Oberfläche der Kavität unter Verwendung einer geeigneten Immobilisierungschemie immobilisiert werden. Alternativ können diese Haptene und Antigene an ein Protein, z. B. Poly-L-lysin, konjugiert werden und dann über das Protein auf die Oberfläche der Kavität unter Verwendung bekannter Methoden immobilisiert werden.
Die Betriebsweise einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nun anhand eines Immunoassays auf ein antigenes Teilchen beschrieben.
Das Assaysignal wird dadurch bestimmt, daß man die Probe mit einem immobilisierten ersten spezifischen Antikörper gegen das zu testende Antigen und einem fluoreszierend markierten zweiten spezifischen Antikörper gegen das zu testende Antigen in Kontakt bringt. Die Menge des markierten Antikörpers, der in der Meßregion als Ergebnis einer immunologischen Reaktion gebunden wird, kann nach Standardmethoden bestimmt werden, und diese Menge kann in Beziehung zu der Antigenmenge in der Probe gesetzt werden. Die Kalibration des Assays wird durch Inkontaktbringen der Probe mit einem immobilisierten ersten Antikörper gegen das zu testende Antigen und mit einer nichtvorkomplexierten Kombination einer bekannten Menge eines markierten spezifischen zweiten Antikörpers gegen das zu testende Antigen und einer bekannten Menge an Antigen durchgeführt. Wenn in der Probe kein Analyt vorhanden ist, führen die Reagentien in der Referenzzone zu einem Signal, das das Ergebnis der bekannten Menge des markierten Antikörpers in der Referenzzone ist, da die Gesamtmenge des markierten Antikörpers an die Grundplatte als Ergebnis der immunologischen Reaktion unter Beteiligung der bekannten Menge an Antigen gebunden wird. Da die Analytkonzentration in der Probe abnimmt, bindet die bekannte Menge des markierten Antikörpers immer noch an das immobilisierte Reagens in der Referenzzone, was zu einem Signal führt, das dem äquivalent bleibt, das auftritt, wenn kein Analyt vorhanden ist, weil die feste Menge des markierten Antikörpers in der Referenzzone, i. e. das Signal, das aus der Referenzzone hervorgeht, unabhängig von der Gesamtkonzentration des Antigens in der Vorrichtung ist. Wenn die Konzentration des Antigens in der Probe der äquivalent ist, die zu einem Assaysignal mit einem Wert der Hook-Region in hoher Konzentration der Assaykurve führt, bindet eine gewisse Menge markierter Antikörper in der Referenzzone an das Antigen, das an den immobilisierten Antikörper gebunden ist, und eine gewisse Menge bindet an das Antigen, das frei in der Lösung bleibt. Folglich führt dies zu einer Abnahme in dem Signal, das aus der Referenzzone hervorgeht, was es dem Anmelder ermöglicht, zu wissen, daß die Konzentration des in der Probe vorhandenen Analyts größer ist als die Hook-Konzentration in hoher Konzentration. Diese Ausführungsform und die erhaltenen Signale sind in Fig. 3 erläutert.
Das erfindungsgemäße Sandwichassayverfahren liefert die folgenden spezifischen Vorteile:
i) die in der Referenzzone verwendeten Reagentien sind denjenigen äquivalent, die in der Meßzone verwendet werden, und sie verhalten sich daher auf gleiche Weise, i. e. sie antworten ähnlich in beiden Zonen auf Variationen in ihrer Umgebung,
ii) in der Referenzzone sind der (markierte) spezifische Bindungspartner und das Ligandanalogon getrennt, d. h. sie sind nicht vorkomplexiert. Folglich ist es möglich, eine Information über die Qualität des spezifischen Bindungspartners (und seines Markers) zu erlangen, i. e. eine Information dahingehend, ob er während der Herstellung oder Lagerung der Vorrichtung abgebaut wurde, indem in geeigneter Weise die Referenzzone ausgemessen wird,
iii) es gibt ein Mittel, den Anwender zu warnen, daß die Konzentration des Analyten in der Probe sehr hoch ist und daß die Probe beispielsweise daher verdünnt und erneut getestet werden muß, d. h. die Abnahme in dem Signal von der Referenzzone bei einer hohen Analytkonzentration,
iv) sollten endogene Störfaktoren in der Probe vorliegen, (z. B. für einen Immunoassay, bei dem einer der spezifischen Bindungspartner ein polyclonaler Antikörper ist, die Anwesenheit von Antikörpern, wie z. B. menschliche Anti-Maus-Antikörper (HAMA)), dann wird die Referenzzone in gleicher Weise wie die Meßzone beeinflußt. Die Referenzzone kann daher dazu verwendet werden, entweder eine solche Interferenz zu korrigieren oder den Anwender auf seine Existenz hinzuweisen.
Ein weiterer Vorteil tritt auf, wenn eine Vielzahl von Referenzzonen verwendet werden, wobei jede Referenzzone verschiedene Mengen an markiertem spezifischen Bindungspartner und Ligandenanalogon enthält. Die Signale, die aus jeder der Referenzzonen hervorgehen, entsprechen den verschiedenen Konzentrationswerten auf der Meßzonen- Assaykonzentration/Antwortkurve, und dies erlaubt daher eine volle quantitative Bestimmung des Assays.
Insbesondere können Referenzzonen konstruiert werden, die über die Mittelregion der Assaykurve Auskunft geben, wobei diese Region oft die nützlichste Region für eine Assaybestimmung ist. Eine Erläuterung einer DFD, die vier Referenzzonen enthält, und der Signale, die aus diesen Zonen hervorgehen, bezogen auf die aus der Assayzone, ist in Fig. 4 erläutert.
Obwohl die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen erläutern, daß das erfindungsgemäße Verfahren besonders auf Immunoassays anwendbar ist und in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung der Ligand ein Antigen ist und der spezifische Bindungspartner einen Antikörper gegen das Antigen umfaßt, soll die Erfindung nicht als auf Assays auf Antikörper oder Antigene beschränkt aufgefaßt werden. Beispiele für Liganden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben, zusammen mit einer Angabe eines geeigneten spezifischen Bindungspartners in jedem Fall.
In den Fig. 1 bis 4 bezeichnen die erläuterten Symbole die folgenden Einheiten:
Y - Einfangantikörper
L - Markierter zweiter Antikörper
- Probenantigen
- Antigen, das in die Assayvorrichtung abgemessen wurde Tabelle 1
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt eine sehr breite Anwendbarkeit, aber kann insbesondere verwendet werden zur Bestimmung von Hormonen einschließlich Peptidhormonen (z. B. schilddrüsenstimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), humanes Choriongonadotropin (hCG), follikelstimulierendes Hormon (FSH), Insulin und Prolactin) oder Nicht-Peptidhormonen oder Schilddrüsenhormonen), Proteinen (z. B. carcinoembryonales Antigen (CEA) und α-Fetoprotein (AFP)), Zucker, Toxinen, Vitaminen, Proteinen, Viren, wie Influenzavirus, Para-Influenzavirus, Adenovirus, Hepatitisvirus, respiratorisches Virus und AIDS-Viren, oder Mikroorganismen.
Es ist zu verstehen, daß der hier verwendete Ausdruck Antikörper umfaßt:
(a) jeden der verschiedenen Klassen oder Subklassen von Immunglobulin, z. B. IgG, IgA, IgM oder IgE, abgeleitet von jedem der herkömmlicherweise verwendeten Tiere, z. B. Schafe, Kaninchen, Ziegen oder Mäuse,
(b) monoclonale Antikörper,
(c) intakte Moleküle oder Fragmente von Antikörpern (monoclonal oder polyclonal), wobei die Fragmente diejenigen sind, die die Bindungsregion des Antikörpers enthalten, i. e. Fragmente ohne den Fc-Anteil (z. B. Fab, Fab', F(ab')2) oder die sogenannten Halbmolekül- Fragmente, erhalten durch reduktive Spaltung der Disulfidbindungen, die die schwerkettigen Komponenten in dem intakten Antikörper verknüpfen"
(d) Antikörper oder Antikörperfragmente, produziert oder modifiziert durch rekombinante DNA--Techniken:
Das Verfahren zur Herstellung von Fragmenten von Antikörpern ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und wird hier nicht beschrieben.
Wie vorstehend angegeben, können verschiedene Reagentien gegebenenfalls markiert werden. Als Beispiele für Teilchen zur Verwendung als Marker bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können Fluorophore, Enzyme, Teilchen mit einem hohen Brechungsindex und andere Teilchen, die einem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, genannt werden. Bevorzugt werden Fluorophore als Marker verwendet. Beispiele für geeignete Fluorophore umfassen Fluorescein und seine Derivate (z. B. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin und seine Derivate (z. B. XRITC, TRAP, TRITC), Luzifergelb, 2,4-Dinitrofluorbenzol, Phenylisothiocyanat, Dansylchlorid, Phycobiliproteine (z. B. Allophycocyanin und Phycoerythrin) und Indocyanine.
Es ist auch vorteilhaft, zur zusätzlichen Kompensation verschiedene Faktoren in das Assaysystem aufzunehmen, die die Höhe des beobachteten Signals beeinflussen können. Gegenwärtige Assaytechniken sind hochempfindlich gegenüber Temperatur, Reagensstabilität, Inkubation und Entwicklungszeit und anderen Bedingungen und störenden Faktoren, die die Höhe des beobachteten Signals beeinflussen können. Diese zusätzliche Kompensation kann beispielsweise unter Verwendung eines Assayverfahrens, wie vorstehend beschrieben, in dem eine zusätzliche separate Kalibrationsstufe bzw. -stufen durchgeführt wird/werden, erzielt werden. Bei einem solchen Verfahren wird eine Vorrichtung verwendet, die mit geeigneten Reagentien versehen ist, die in einer oder mehreren Zone(n) (Kalibrationszone(n)), getrennt von der Meßzone und der Referenzzone, vorgesehen sind. Das Konzept der Verwendung von Kalibrationszonen für eine solche Kompensation ist ausführlich in der WO92/09892 beschrieben.
Die Verwendung einer solchen Kalibrationsstufe/solcher Kalibrationsstufen dient zwei Hauptzwecken, nämlich
i) zu bestätigen, daß die verschiedenen Reagentien in dem Assayverfahren verwendet werden, gemäß ihrer Spezifikation leistungsfähig sind und
ii) eine bestimmte Konzentrationshöhe in der Testprobe zu definieren und dadurch Hintergrundfluoreszensspiegel, Temperatur- und pH-Veränderungen und andere Faktoren zu kompensieren, die die Höhe der beobachteten Signale verändern können.
Alternativ kann eine zusätzliche Kalibrationszone zur Kompensation des Kanteneffekts, wie in dem Internationalen Patent WO93/25098 beschrieben, verwendet werden.
So wird gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zur Verwendung in einem Assay bereitgestellt, in dem eine oder mehrere weitere Kalibrationsstufe(n) durchgeführt wird/werden, die in einer Vorrichtung wie vorstehend definiert ist, die zusätzlich eine oder mehrere weitere getrennte Zone(n) (Kalibrationszone(n)) umfaßt, bei denen in einer Region direkt oder indirekt ein Reagens (das Kalibrationsreagens), das der verwendeten Assaytechnik angepaßt ist, immobilisiert ist, wobei die Zone auch geeignete Nebenreagentien, die für den gewünschten Assay geeignet sind, enthalten kann.
So wird gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegendlen Erfindung ein Assayverfahren auf einen Liganden in einer Probe, wie vorstehend definiert, bereitgestellt, das zusätzlich die Stufen umfaßt:
v) gleichzeitig mit oder nachfolgend auf die Inkubation in Stufe i) Inkubieren der Probe, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Nebenreagens(tien) mit der Ka librationszone(n) einer vorstehend definierten Vorrichtung;
vi) Überwachen des Signals/der Signale (das Kalibrationssignal/die Kalibrationssignale), die der verwendeten Assaytechnik angepaßt sind, die aus der Kalibrationszone/den Kalibrationszonen hervorgehen und
vii) anschließendes Vergleichen des Kalibrationssignals/der Kalibrationssignale sowohl mit dem Assaysignal als auch dem Referenzsignal, wie vorstehend definiert, und unter Verwendung eines geeigneten Algorithmus wird damit das Maß des Aufmaßes, in dem der zu testende Ligand in der Probe vorhanden ist, wie von dem Assaysignal und dem Referenzsignal abgeleitet, kalibriert.
Die Herstellung von Vorrichtungen, die eine Vielzahl von Referenzzonen und/oder eine oder mehrere Kalibrationsregionen, wie vorstehend beschrieben, besitzen, kann nach einem Verfahren, das dem vorstehend beschriebenen für Vorrichtungen, die nur Zonen I und II besitzen, analog ist, durchgeführt werden, indem zusätzlich ein Fleck geeigneter Reagentien in der weiteren Zone/den weiteren Zonen auf der Oberfläche des flächenförmigen Materials gebildet wird und die geeigneten Reagentien in der weiteren Zone/den weiteren Zonen auf der Oberfläche der zusätzlichen Struktur immobilisiert werden.
Wenn mehr als eine Kalibrations- und/oder Referenzzone vorhanden ist, werden die Reagentien in jeder im allgemeinen so gewählt, daß die Signale, die aus jeder Zone hervorgehen, nicht identisch sind. Solche nichtidentischen Signale können auftreten, wenn das Signal, das aus jeder Zone auftritt, die gleiche Funktion der Menge des in der Probe vorhandenen Liganden ist. Ein Beispiel ist, wobei die Kalibrationsreagentien in jeder Kalibrationszone die gleichen sind, aber die Menge des Nebenreagenses/der Nebenreagentien, die einen Komplex mit den Kalibrationsreagentien in jeder Zone bildet, sich unterscheidet. Ein weiteres Beispiel ist, wenn die Kalibrationsreagentien in jeder Kalibrationszone jeweils zu einem Signal führen, ohne daß ein Nebenreagens benötigt wird, und in verschiedenen Mengen vorhanden sind. Wenn gefunden wird, daß trotz einer solchen Wahl von Kalibrationsreagentien identische Signale auftreten, dann wird ein Versagen der Vorrichtung (z. B. infolge von extrem hohem pH-Werten, eines zu hohen Probenhintergrundsignals, Reagentienabbau oder Störung in dem Assay durch einen Faktor in der Probe) angezeigt, und der Assay kann verworfen werden. Dies ist ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung.
So werden die Reagentien, die in der Kalibrationszone/den Kalibrationszonen verwendet werden, so ausgewählt, daß sie ein Null- oder Nicht-Null-Signal für die Zwecke der zusätzlichen Kalibration des Assays ergeben. Der Ausdruck Nullsignal bezeichnet das Hintergrundsignal für den infragekommenden Assay. Der Ausdruck Nicht-Null-Signal soll entsprechend verstanden werden. In einem Sandwichassay ist das Null-Signal das Signal, das erhalten wird, wenn kein Analyt vorhanden ist. Verschiedene Methoden können verwendet werden, um das Assaysignal mit dem Kalibrationssignal/den Kalibrationssignalen zu kalibrieren. Diese Methoden können als entweder ein additives, multiplikatives oder ein kombiniert additives/multiplikatives Verfahren zusammengefaßt werden. Alle Methoden beruhen auf der Charakterisierung der Kalibrationsregion/Kalibrationsregionen während der Herstellung, so daß jeder Unterschied, der zum Zeitpunkt des Assays gemessen wird, verwendet werden kann, um die Daten aus der Meßregion zu korrigieren.
In einem Sandwichassay gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei der eine oder mehrere weitere Kalibrationsstufe(n) durchgeführt wird/werden, wie vorstehend beschrieben, ist in Stufe v) entweder a) das Kalibrationsreagens (oder gegebenenfalls ein Nebenreagens, das mit einem Komplex unter Beteiligung des Kalibrationsreagenses vorkomplexiert ist oder einen solchen Komplex bilden kann) ein spezifischer Bindungspartner für den zu testenden Ligand, ein markierter spezifischer Bindungspartner für den zu testenden Liganden als Nebenreagens vorhanden, und eine bekannte Menge des zu testenden Liganden, der mit seinem spezifischen markierten Bindungspartner vorkomplexiert ist, als noch weiteres Nebenreagens vorhanden oder b) ein markierter spezifischer Bindungspartner für den zu testenden Liganden als Nebenreagens vorhanden, und das Kalibrationsreagens (oder gegebenenfalls ein Nebenreagens, das mit einem Komplex, an dem das Kalibrationsreagens beteiligt ist, vorkomplexiert ist oder einen solchen Komplex bilden kann) eine bekannte Menge des zu testenden Liganden, der mit seinem immobilisierten spezifischen Bindungspartner vorkomplexiert ist oder c) ein Ligand, der sich von dem zu testenden Liganden unterscheidet, als Nebenreagens vorhanden und das Kalibrationsreagens (oder gegebenenfalls ein Nebenreagens, das mit einem Komplex, an dem das Kalibrationsreagens beteiligt ist, vorkomplexiert ist oder einen solchen Komplex bilden kann) ein markierter spezifischer Bindungspartner für den Liganden, der sich von dem zu testenden Liganden unterscheidet oder d) das Kalibrationsreagens ein markierter Bindungspartner, der für jedes vorhandene Nebenreagens/vorhandene Nebenreagentien nicht spezifisch ist oder e) das Kalibrationsreagens führt zu dem gewünschten Signal ohne daß ein Nebenreagens vorhanden sein muß.
Ein weiter Bereich von Möglichkeiten bietet sich für die Konfiguration der Kalibrationsregionen zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren an. Diese Möglichkeiten sind ausführlich in der WO92/09892 beschrieben.
So wird gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zur Verwendung in einem As say bereitgestellt, in der eine oder mehrere weitere Kalibrationsstufe(n), wie vorstehend durchgeführt wird/werden, die eine spezifisch reaktive Probensammel- und Testvorrichtung wie vorstehend definiert ist, die zusätzlich auf der ersten Platte eine oder mehrere weitere Zone(n) trägt, die eine Schicht trägt/tragen, die in löslicher freisetzbarer Form ein Nebenreagens/Nebenreagentien, die für den gewünschten Assay geeignet sind, umfaßt und zusätzlich auf der zweiten Platte ein oder mehrere weitere Zone(n) enthält, von der jede in ihrer Orientierung einer der weiteren Zone(n) auf der ersten Platte entspricht, und von denen jede eine Schicht, umfassend ein immobilisiertes Kalibrationsreagens, wie vorstehend definiert, umfaßt.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter eine Vorrichtung mit der Eignung zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Assayverfahren, wie vorstehend beschrieben, die eine Vorrichtung gemäß der Erfindung, wie vorstehend definiert, und Mittel zur Erzeugung und Überwachung der Signale aus der Vorrichtung umfaßt.

Claims

1. Sensorvorrichtung zur Verwendung in einem Sandwichassay auf einen Liganden in einer Probe, umfassend i) eine abgetrennte Zone (die Meßzone), bei der in einem Bereich (der Meßbereich) direkt oder indirekt ein erster spezifischer Bindungspartner für den zu testenden Liganden (oder ein Reagens, das mit einem Komplex mit einem spezifischen Bindungspartner für den zu testenden Liganden vorkomplexiert ist oder einen solchen Komplex bilden kann) immobilisiert ist, wobei die Zone zusätzlich in freisetzbarer Form eine erste bekannte Menge eines gegebenenfalls markierten zweiten spezifischen Bindungspartners für den zu testenden Liganden enthält, wobei der zweite spezifische Bindungspartner gegen ein Epitop des zu testenden Liganden gerichtet ist, das sich von dem Epitop, gegen das der erste spezifische Bindungspartner gerichtet ist, unterscheidet und ii) eine zweite getrennte Zone (die Referenzzone), bei der in einem Bereich direkt oder indirekt ein erster spezifischer Bindungspartner für den zu testenden Liganden (oder ein Reagens, das mit einem spezifischen Bindungspartner für den zu testenden Liganden vorkomplexiert ist oder einen einen solchen Komplex bilden kann) immobilisiert ist, wobei die Zone zusätzlich in freisetzbarer Form eine bekannte Menge eines Liganden-Analogons enthält und getrennt davon in freisetzbarer Form eine zweite bekannte Menge eines gegebenenfalls markierten zweiten spezifischen Bindungspartners für den zu testenden Liganden, wie vorstehend definiert, enthält, wobei die zweite bekannte Menge weniger als die vorstehend genannte erste bekannte Menge in der Meßzone ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin eine oder mehrere Referenzzone(n) enthält, wobei jede vorhandene Referenzzone verschiedene bekannte Mengen des gegebenenfalls markierten zweiten spezifischen Bindungspartners enthält.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Vorrichtung eine Kapillar-Füllvorrichtung ist.

4. Vorrichtung zur Verwendung in einem Sandwichassay auf einen Liganden in einer Probe, wobei eine oder mehrere zusätzliche Kalibrationsstufe(n) durchgeführt wird/werden, wobei die Vorrichtung eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ist, und weiterhin eine oder mehrere weitere getrennte Zone(n) enthält (die Kalibrationszone(n)), bei der in einem Bereich direkt oder indirekt ein Reagens (das Kalibrationsreagens), das für die verwendete Assaytechnik geeignet ist, immobilisiert ist, wobei die Zone(n) auch geeignete Nebenreagentien, die für den gewünschten Assay geeignet sind, enthalten kann/können.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine spezifisch-reaktive Probensammel- und Testvorrichtung zur Verwendung in einem Sandwichassay auf einem Liganden ist, eine Kavität mit zwei Zonen I und II besitzt, die wechselseitig getrennt sind, und wobei jede Zone eine Schicht enthält, die in freisetzbarer Form ein Reagens, das für den gewünschten Assay geeignet ist, enthält, wobei die Oberfläche eine Oberfläche einer ersten festen Platte aus transparentem Material ist, wobei die Wand der oder jeder Kavität gegenüber der ersten Platte eine zweite Platte aus transparentem Material und angepaßt zur Wirkung als lichtdurchlässiger Wellenleiter umfaßt, wobei die zweite Platte auf ihrer Oberfläche in Nachbarschaft zu der Kavität zwei Zonen IV und V, die in der Orientierung den vorstehend genannten Zonen I bzw. II entsprechen, enthält, wobei jede der Zonen IV und V eine Schicht mit einem immobilisierten Reagens, das für den gewünschten Assay geeignet ist, enthält.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine spezifisch reaktive Probensammel- und Testvorrichtung nach Anspruch 5 ist, zusätzlich auf der ersten Platte eine oder mehrere weitere Zone(n) enthält, die eine Schicht enthält/enthalten, die in löslicher freisetzbarer Form ein Nebenreagens bzw. Nebenreagentien, das/die für den gewünschten Test geeignet ist/sind, enthält, und zusätzlich auf der zweiten Platte eine oder mehrere weitere Zone(n) enthält, wobei jede davon in der Orientierung einer der weiteren Zone(n) auf der ersten Platte, entspricht und wobei jede davon eine Schicht, umfassend ein immobilisiertes Kalibrationsreagens, wie in Anspruch 4 definiert, umfaßt.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, wobei die erste Platte auf ihrer Oberfläche getrennt von der Kavität eine Schicht aus einem lichtabsorbierenden oder opaken Material enthält.

8. Sandwichassayverfahren auf einen Liganden in einer Probe, umfassend die Stufen

i) Inkubieren der Probe mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 5 oder 7;

ii) Überwachen des Signals, das der verwendeten Assaytechnik angepaßt ist, und aus der. Meßzone (wie vorstehend definiert) der Vorrichtung hervorgeht (das Assaysignal);

iii) gleichzeitig mit oder nachfolgend zu der Überwachung in ii) Überwachen des Signals, das der verwendeten Assaytechnik angepaßt ist, das aus der Referenzzone/den Referenzzonen (wie in Anspruch 1 definiert) der Vorrichtung hervorgeht (das Referenzsignal/die Referenzsignale); und

iv) Vergleich des Referenzsignals/der Referenzsignale mit dem Assaysignal, wodurch unter Verwendung eines geeigneten Algorithmus bestimmt wird, ob und/oder in welchem Ausmaß der zu testende Ligand in der Probe vorhanden ist.

9. Sandwichassayverfahren auf einen Liganden in einer Probe, bei dem eine oder mehrere weitere Kalibrationsstufe(n) durchgeführt wird/werden, wobei das Verfahren ein Verfahren nach Anspruch 8 ist, wobei in Stufe i) die Probe in Gegenwart einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4, 6 oder 7 inkubiert wird, umfassend weiterhin die Stufen

v) gleichzeitig mit oder nachfolgend zu der Inkubation die Stufe i, Inkubation der Probe, gegebenenfalls zusammen mit einem oder mehreren Nebenreagentien, mit der Kalibrationszone/den Kalibrationszonen einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4, 6 oder 7;

vi) Überwachen des Signals/der Signale (das Kalibrationssignal/die Kalibrationssignale), das/die der verwendeten Assaytechnik angepaßt ist/sind und aus der Kalibrationszone/den Kalibrationszonen hervorgeht/hervorgehen; und

vii) anschließender Vergleich des Kalibrationssignals/der Kalibrationssignale sowohl mit dem Assaysignal als auch mit dem Referenzsignal, wie in Anspruch 8 definiert, und wobei unter Verwendung eines geeigneten Algorithmus das Maß des Ausmaßes, in dem der zu bestimmende Ligand in der Probe vorhanden ist, wie von dem Assaysignal und dem Referenzsignal abgeleitet wird, kalibriert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei in Stufe v) entweder a) das Kalibrationsreagens (oder gegebenenfalls ein Nebenreagens, das mit einem Komplex, an dem das Kalibrationsreagens beteiligt ist, vorkomplexiert ist oder einen solchen Komplex bilden kann) ein spezifischer Bindungspartner für den zu testenden Liganden ist, ein markierter spezifischer Bindungspartner für den zu testenden Liganden als Nebenreagens vorhanden ist und eine bekannte Menge des zu testenden Liganden, der mit seinem markierten spezifischen Bindungspartner vorkomplexiert ist, als noch weiteres Nebenreagens vorhanden ist, oder b) ein markierter spezifischer Bindungspartner für den zu testenden Liganden als Nebenreagens vorhanden ist und das Kalibrationsreagens (oder gegebenenfalls ein Nebenreagens, das mit einem Komplex, an dem das Kalibrationsreagens beteiligt ist, vorkomplexiert ist oder einen solchen Komplex bilden kann), eine bekannte Menge des zu testenden Liganden ist, der mit seinem immobilisierten spezifischen Bindungspartner vorkomplexiert ist, oder c) ein Ligand, der sich von dem zu testenden Liganden unterscheidet, als Nebenreagens vorhanden ist und das Kalibrationsreagens (oder gegebenenfalls ein Nebenreagens, das mit einem Komplex, an dem das Kalibrationsreagens beteiligt ist, vorkomplexiert ist oder einen solchen Komplex bilden kann) ein markierter spezifischer Bindungspartner für den sich von dem zu testenden Liganden unterscheidenen Liganden ist oder d) das Kalibrationsreagens ein markierter Bindungspartner, der für jedes vorhandene Nebenreagens nicht spezifisch ist, ist oder e) das Kalibrationsreagens zu dem gewünschten Signal ohne Notwendigkeit der Anwesenheit eines Nebenreagenses führt.

11. Verfahren zur Herstellung einer spezifisch reaktiven Probentestvorrichtung nach Anspruch 5, umfassend die Stufen

(a) Bilden einer Anordnung von Flecken geeigneter Reagentien, die in den Zonen I und II, wie in Anspruch 5 definiert, auf der Oberfläche eines flächenförmigen Materials angebracht sind, das einen Teil einer Vielzahl der Vorrichtungen darstellen soll,

(b) Bilden einer Anordnung von Flecken von geeigneten Reagentien, die in den Zonen IV und V in Anspruch 5, definiert, auf der Oberfläche einer weiteren Struktur angebracht sind, wobei, sofern geeignet, eine Immobilisierung der Reagentien durchgeführt wird, wobei die weitere Struktur zusammen mit dem flächenförmigen Material für jede der Vielzahl der Vorrichtungen eine Kavität zum Sammeln und Aufnehmen eines Volumens an Probenflüssigkeit in Kontakt mit den Schichten der geeigneten Reagentien bildet, wobei die Kavität bevorzugt kapillardimensioniert ist, und

(c) Auftrennen des flächenförmigen Materials in Teile, die jeweils eine oder eine Vielzahl der Probensammel- und Testvorrichtungen bereitstellen.

12. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung nach Anspruch 6, umfassend ein Verfahren nach Anspruch 11, umfassend weiterhin die Stufen der Bildung eines Fleckens geeigneter Reagentien in der weiteren Zone/den weiteren Zonen auf der Oberfläche des flächenförmigen Materials, und Immobilisieren der geeigneten Reagentien in der weiteren Zonen/den weiteren Zonen auf der Oberfläche der zusätzlichen Struktur.

13. Vorrichtung, geeignet zur Verwendung in einem Assayverfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, umfassend eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, und Mittel zur Erzeugung und Überwachung der Signale aus der Vorrichtung.