DE69219963T2

DE69219963T2 - Verfahren zur bestimmung der zahl lebender mikroorganismen

Info

Publication number: DE69219963T2
Application number: DE69219963T
Authority: DE
Inventors: Atsumi Yokohama-Shi Kanagawa-Ken 244 Hirose; Takuji Hamamatsu-Shi Shizuoka-Ken 432 Kataoka; Susumu Yokohama-Shi Kanagawa-Ken 245 Seto
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK; Nihon Millipore KK
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 1991-02-13
Filing date: 1992-02-13
Publication date: 1997-10-16
Anticipated expiration: 2012-02-14
Also published as: EP0529084A4; WO1992014838A1; US5627042A; EP0529084A1; EP0529084B1; US5811251A; JP3133328B2; DE69219963D1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Zählen der Anzahl an lebenden Mikroorganismen in einer Testlösung. Insbesondere betrifft die Erfindung ein schnelles, geeignetes und hochempfindliches Verfahren zum Zählen der Anzahl von lebenden Mikroorganismen, welche in einer Testlösung aus beispielsweise Wasser, Rohmaterialien, Zwischenprodukten und Produkten, die in der Nahrungsmittel-, Pharma-, Kosmetik-, Elektronikindustrie und dgl. verwendet werden, vorkommen.

Beschreibung des Standes der Technik

In der Nahrungsmittel-, Pharma- oder Kosmetikindustrie ist bekanntlich die Kontrolle bezüglich lebender Mikroorganismen in Wasser, Rohmaterialien, Zwischen- und Endprodukten von extremer Wichtigkeit. Die Qualitätskontrolle von Industriewasser ist auch in der Elektronikindustrie eine Angelegenheit von großer Bedeutung und man muß sich immer über die Anzahl von lebenden Mikroorganismen im Wasser im klaren sein. Infolgedessen ist das Zählen der Anzahl von lebenden Mikroorganismen in diesen Industrien ein wesentliches Erfordernis.
Zur Durchführung einer derartigen Messung wird im allgemeinen ein übliches bekanntes sogenanntes "Standardagarplattenverfahren" entsprechend den Nahrungsmittelhygienetestrichtlinien durchgeführt, wobei bei diesem Verfahren lebende Mikroorganismen in Testlösungen auf einem Agarplattennährmedium zur Bildung der Kolonien für ihren Nachweis kultiviert werden. Dieses Verfahren birgt jedoch ziemliche Probleme. Darüber hinaus ist die bis zum Erhalt der Ergebnisse erforderliche Zeit lang, wodurch sich ein Urteil über das Vorhandensein von Mikroorganismen oder deren Zahl wesentlich verzögert. Diese Verzögerung zwingt zur Einplanung einer "Beurteilungswartezeit", insbesondere während der Stufen der Herstellung oder der Versendung, wobei ein beträchtlicher Zeit- und Raumverlust eintritt. Infolgedessen ergab sich in diesen Industrien ein Bedarf nach der Entwicklung eines schnelleren und geeigneteren Verfahrens.
In einem Versuch, diesen Bedarf zu befriedigen, wurden verschiedenste schnelle Nachweisverfahren, von welchen das Biolumineszenzverfahren bekannt ist (japanisches Patent Nr. Tokukai-Hei 2-57,197 und Nr. Tokukai-Hei 2-163,098; M. Haruta und Mitarbeiter: "Facilitation, Automatization, and Acceleration of Food Microorganism Testing", Science Forum, S. 58, Japan, 1985) vorgeschlagen. Das Verfahren besteht im wesentlichen aus Sammeln einer geringen Menge der Testlösung in einem kleinen Teströhrchen, Hinzufügen eines Extraktionsreagens plus eines Lumineszenz induzierenden Reagens zur Lösung zur Bestimmung der in den Mikroorganismen enthaltenen Menge von Adenosintriphosphat (im folgenden als ATP bezeichnet) unter Einsatz eines Luminometers und Berechnen der Anzahl der lebenden Mikroorganismen. Die Testlösung kann nur für den Fall direkt getestet werden, daß die Zahl der Mikroorganismen genügend groß ist. Bei einer relativ kleinen Zahl an Mikroorganismen muß die Testlösung zum Festhalten und Konzentrieren der Mikroorganismenpopulation in der Testlösung auf einem Membranfilter filtriert werden, dann das Filter entfernt werden, dieses in eine ziemlich kleine Menge von beispielsweise sterilem Wasser zur Suspendierung der lebenden Mikroorganismen getaucht und ein Teil der Suspension in ein kleines Teströhrchen gegeben werden, bevor die genannten Reagenzien zugefügt werden.
Für den Fall, daß die Testlösung eine äußerst kleine Zahl lebender Mikroorganismen (z.B. 10³ bis 10&sup4; oder weniger) enthält, fällt jedoch die Menge an ATP unter die untere Bestimmungsgrenze für das Luminometer, wodurch dieses Verfahren undurchführbar wird. In einem derartigen Fall sind weiter fortgeschrittene Techniken erforderlich, bei welchen beispielsweise das Membranfilterelement mit darauf festgehaltenen lebenden Mikroorganismen in ein Kulturmedium mit mehreren für das Wachstum von Mikroorganismen geeigneten Nährsubstanzen plaziert wird und nach einer Kultivierung der Mikroorganismen zur Erhöhung ihrer Zahl bis zur genannten Bestimmungsgrenze eine Messung durchgeführt werden kann. Diese Tatsache stellt einen ziemlich großen Nachteil des Verfahrens dar, so daß eine weitere Verbesserung unvermeidlich wird.
Andererseits gibt es ein weiteres Verfahren zum Zählen der Anzahl von lebenden Mikroorganismen, bei welchem die Messung nach dem Filtrieren und Einschließen in gitterförmig abgeteilte Abschnitte des Membranfilters und dem Kultivieren zur Ausbildung von Kolonien innerhalb der gitterförmig abgeteilten Abschnitte, wobei das Gitter aus einer Lösung nicht benetzbarer Kohlenwasserstoffwachse, Vaseline, Siliconwachse oder -öle und ebenso Epoxy-, Polytetrafluorethylen- oder Polystyrolharzen hergestellt und in der Form von Quadraten, Rechtecken oder Ringen auf das Membranfilter aufgedruckt worden war (US-Patent Nr. 3 929 583), durchgeführt wird.
Bei diesem Verfahren werden im Vergleich zum Standardagarplattenverfahren die Mikroorganismen daran gehindert, sich zu überlagern und gegenseitig aneinander zu haften, so daß eine dichte Population von Mikroorganismen leichter gemessen werden kann, und gleichzeitig wird zwischen den Mikroorganismenkolonien und der Oberfläche des Membranfilters ein starker optischer Kontrast ausgebildet, so daß eine automatische Messung der Kolonien erleichtert wird.

Durch die Erfindung zu lösende Probleme

Das Membranfilter gemäß dem genannten US-Patent wurde im ursprünglichen Versuch nicht zum Nachweis einer einzelnen Zelle lebender Mikroorganismen, sondern zum Messen der durch Einschließen bzw. Festhalten und Kultivieren von lebenden Mikroorganismen auf einem Membranfilter gebildeten Kolonien entwickelt. Ein derartiges Verfahren weist den Vorteil auf, daß Mikroorganismen getrennt innerhalb der Abschnitte des nicht benetzbaren Gittermusters Kolonien bilden können, so daß eine gegenseitige Überlappung der Kolonien selbst bei einer großen Anzahl zu zählender Mikroorganismen verhindert wird, wobei ein genaues Messen der Kolonien möglich wird. Andererseits besteht die Vorrichtung zum Zählen der Anzahl von Mikroorganismen gemäß dem genannten Patent darin, daß sie die Zahl der Kolonien, welche isoliert innerhalb des Gittermusters nach der Kultivierung bei beispielsweise 20ºC während 24 h auf dem Membranfilter gewachsen sind, zählt. Das Verfahren gemäß dem genannten Patent liefert zwar ein nicht benetzbares Gitter auf einem Membranfilter zur Trennung von Kolonien, zur Aufrechterhaltung ihres Zustands einer relativ hohen Dichte, Gleichförmigkeit und optischen Kontrastierung und zur Erleichterung einer genauen automatischen Messung der Anzahl von Mikroorganismen, es ist jedoch nicht geeignet, ein Überfließen und Dispergieren der Mikroorganismen in benachbarte Abschnitte zu verhindern, wie dies zum Nachweis einer einzelnen Mikroorganismenzelle, worauf die vorliegende Erfindung gerichtet ist, erforderlich ist, oder die durch eine große Fläche der einzelnen Abschnitte verursachte Verdünnung mikrobieller Bestandteile zu verhindern. Daher wird in diesem Patent kein derartiges Konzept vorgelegt.
Im Hinblick auf die Tatsache, daß es zur Lösung der genannten Probleme zwingend erforderlich ist, bestimmte hydrophile Abschnitte herzustellen und in diese eine für den Nachweis der selbst von einer Einzelzelle von lebenden Mikroorganismen emittierten Lumineszenz erforderliche Menge Reagens zu geben, stellt die vorliegende Erfindung vorzugsweise ein Membranfilter mit darauf gegebenen Abschnitten bereit, wobei eine vollkommenere Trennung zwischen den Abschnitten erreicht wird, die extrahierten Bestandteile an einem Dispergieren oder Herausfließen gehindert werden und die Abschnitte geringe Flächen aufweisen. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ferner vorzugsweise ein schnelles, geeignetes und hochempfindliches Verfahren zum Zählen der Anzahl von lebenden Mikroorganismen durch ein verbessertes Zugabeverfahren für die Reagenzien zur Extraktion, Induktion von Lumineszenz und dgl. und ein neu eingeführtes hochempfindliches photometrisches System bereit.

Maßnahmen zur Lösung der Probleme

Als Ergebnis intensiver Untersuchungen gelangten wir zur folgenden Tatsache und zur vorliegenden Erfindung: Die genannten Probleme werden gelöst durch Herstellen von Trenneinsätzen bzw. -wänden, welche aus einem auf einem Membranfilter hergestellten hydrophoben Gitter bestehen und aus dem Membranfilter etwas herausragen, so daß innerhalb des hydrophoben Gitters hydrophile Abschnitte mit möglichst kleinen Flächen gebildet werden; dadurch Herstellen von Membranfilterelementen, bei welchen die hydrophilen Abschnitte praktisch vollkommen voneinander durch die Trenneinsätze bzw. -wände getrennt sind; Applizieren eines Sprühfilms aus Mikropartikeln auf das Membranfilter zur Zugabe von Extraktions- bzw. extrahierenden und Lumineszenz induzierenden Reagenzien in einer jeden Abschnitt der Filtermembran benetzenden Menge; und danach Behandeln der erhaltenen Probe mit einem hochempfindlichen Biolumineszenzbildanalysesystem.
Demgemäß liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Zählen der Anzahl lebender Mikroorganismen in einer Testlösung, umfassend: Filtrieren der betreffenden Lösung durch ein Membranfilterelement mit einer Mehrzahl von kleinen hydrophilen Membranfilterabschnitten, die im wesentlichen von einer Mehrzahl von hydrophoben Trenneinsätzen bzw. -wänden umgeben sind, so daß die in der Lösung enthaltenen lebenden Mikroorganismen in diesen Abschnitten eingeschlossen bzw. festgehalten werden können;
Trocknen des Membranfilterelements;
Aufsprühen eines Extraktionsreagens auf das Membranfilterelement zur Extraktion eines möglicherweise lumineszierenden Bestandteils der in den Abschnitten eingeschlossenen bzw. festgehaltenen lebenden Mikroorganismen;
Aufsprühen eines Lumineszenz induzierenden Reagens auf das Element, damit der lumineszierende Bestandteil innerhalb der Abschnitte Lumineszenz emittieren kann;
Darstellen der emittierten Lumineszenz als hellen Fleck unter Benutzung eines Biolumineszenzbildanalysesystems und
Zählen der Zahl der hellen Flecken als Repräsentanten für die Zahl der lebenden Mikroorganismen in der Testlösung.
Das erfindungsgemäße Membranfilterelement wird durch Aufteilen eines hydrophilen Membranfilters in eine Mehrzahl hydrophiler Abschnitte, die von einer Mehrzahl hydrophober Trenneinsätze bzw. -wände umgeben sind, gebildet. Das hydrophile Membranfilter ist ein fein hergestelltes film- oder folienartiges Produkt aus Kunststoffmaterialien, wie hydrophilem Polytetrafluorethylen, hydrophilem Poly(vinylidendifluorid), hydrophilem Polysulfon und hydrophilem Polyamid, Polycarbonat, Cellulosematerialien, wie Acetylcellulose, Nitrocellulose und deren Gemischen, mit fast einheitlichen Mikroporen einer Porengröße von 0,1 bis 1 µm.
Eine Mehrzahl der kleinen Abschnitte mit hydrophilen Membranfilterbereichen wird von dünnen hydrophoben Trenneinsätzen bzw. -wänden (im folgenden als "Trenneinsätze" bezeichnet), welche vorzugsweise leicht aus der Oberfläche der Membranfilterabschnitte herausragen, umgeben. Die Form der Abschnitte ist vorzugsweise ein quadratisches oder rechteckiges Gitter oder ein Ring, obwohl auch eine wabenartige Form verwendet werden kann. Zum Zwecke eines effizienten Filtrierens der Testlösungen ist die Form vorzugsweise so, daß für die Abschnitte breite Filterfläche sichergestellt sind und das erforderliche Vorgehen möglichst einfach wird, wobei die Trenneinsätze vorzugsweise geringfügig aus dem Membranfilter herausragen. Ferner werden die Trenneinsätze vorzugsweise so verarbeitet, daß sie das hydrophile Membranfilter durchdringen und dieses in im wesentlichen perfekte Abschnitte teilen. Da jedoch die vorliegende Erfindung das gleichförmige Verteilen einer erforderlichen Menge an Reagens möglich macht, kann ein Bewegen der extrahierten Bestandteile und Reagenzien in benachbarte Abschnitte im wesentlichen verhindert werden. So können die gewünschten Ergebnisse der Messung selbst bei einem nicht vollständigen Durchdringen des Trenneinsatzes in Dickerichtung durch das hydrophile Membranfilter von einer Oberfläche zur anderen erfolgreich erhalten werden. Die Höhe des Trenneinsatzes betragt im allgemeinen 0,01 bis 0,05 mm über der Oberfläche des Membranfilters und vorzugsweise 0,02 bis 0,04 mm und die Breite allgemein 0,1 bis 2 mm und vorzugsweise 0,2 bis 1 mm. Die Fläche der einzelnen Abschnitte beträgt weniger als 2 mm² und vorzugsweise weniger als 1 mm².
Geeignete Materialien zur Bildung der Trenneinsätze sind Wachse, Epoxyharze, Siliconwachse, Siliconöle, fluorierte Harzwachse, Polystyrolharze und dgl.
Zur Formung von Trenneinsätzen auf einem hydrophilen Membranfilter zur Bildung des erfindungsgemäß verwendeten Membranfilterelements ist es bevorzugt, die Trenneinsatzmaterialen auf der Oberfläche des Membranfilters im Bereich der genannten Dimensionen unter Verwendung von beispielsweise Siebdruck, Reliefdruck aufzubringen, wohingegen andere Druckverfahren wie Mimeographendruck, anastatischer Druck, Offsetdruck, Umdruck und eine Vielzahl von Techniken wie Prägen, Linienziehen oder Siebdruck unter Verwendung lichtempfindlicher Harze in Kombination verwendet werden können. Bei Anwendung der genannten Techniken zum Zwecke einer wesentlichen Durchdringung des hydrophilen Membranfilters in Richtung der Dicke zur Ausbildung der hydrophoben Trenneinsätze können jedes geeignete Lösungsmittel und/oder Monomere und Oligomere mit geeigneter Kompatibilität zugegeben werden. Nach der Beendigung des genannten Verfahrens dringen hydrophobe Harze in das hydrophile Membranfilter ein, wobei Teile hiervon hydrophob werden und das Membranfilter im wesentlichen von einer Oberfläche zur anderen durchdringende hydrophobe Trenneinsätze in einer Gitteranordnung bilden.
Alternativ können die erfindungsgemäß zu verwendenden Membranfilterelemente unter Verwendung einer porösen hydrophoben Membran hergestellt werden; deren Oberfläche wird mit einem Monomer beschichtet, welches bei Bestrahlung mit UV- Licht zur Ausbildung eines hydrophilen Polymers vernetzen kann. Danach wird die Oberfläche zur Induzierung der Polymerisation oder Copolymerisation mit UV-Licht bestrahlt, wobei die Bereiche, die die Trenneinsätze werden sollen, abgedeckt sind, oder die Oberfläche wird während der Bildung der hydrophilen Polymere oder Copolymere durch eine Schattenmaske hindurch mit UV-Licht bestrahlt. Auf diese Weise wird der nicht abgedeckte Bereich im wesentlichen hydrophil. Es sei auf ein derartiges in US-Patent Nr. 4 618 533 beschriebenes Verfahren verwiesen. Vorzugsweise kann das poröse hydrophobe Membranfilter aus einer Membran aus Polymeren, welche insbesondere aus der Gruppe Polytetrafluorethylen, Poly(vinylidendifluorid), Polycarbonat ausgewählt sind, bestehen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist die Darstellung eines erfindungsgemäßen Membranfilterelements in der Draufsicht, in der Gesamtansicht (A) und einer vergrößerten Teilansicht (B) einer in (A) durch die gestrichelten Linien begrenzten Fläche;
Fig. 2 ist eine vergrößerte Teilansicht des Membranfilterelements im Querschnitt und
Fig. 3 ist das Schemadiagramm eines erfindungsgemäßen Biolumineszenzbildanalysesystems in der Gesamtansicht (A) und einer vergrößerten Teilansicht (B) einer in (A) durch einen Kreis begrenzten Fläche.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Bezugnehmend auf Fig. 1 besteht das erfindungsgemäß verwendete Membranfilterelement aus einer Schicht des hydrophilen Membranfilters 1; wobei Teile des hydrophilen Membranfilters 1 aus einer Mehrzahl kleiner Unterteilungen, d.h. den hydrophilen Membranfilterabschnitten 2, bestehen; aus hydrophoben Trennwänden 3, welche beispielsweise durch Drucken hydrophober Harze auf das Membranfilter 1 in der genannten Weise hergestellt werden und welche die hydrophilen Membranfilterabschnitte 2 im wesentlichen perfekt nicht nur in planarer Richtung, sondern auch in vertikaler Richtung umgeben; und aus einem Rahmen des Membranfilters 1. Wie bereits ausgeführt, wird unmittelbar nach dem Einschließen bzw. Festhalten der lebenden Organismen ein Spray mit Extraktions- und Lumineszenz induzierenden Reagenzien auf die hydrophilen Membranfilterabschnitte 2 appliziert. Daher ist es bevorzugt, daß die hydrophoben Trennwände 3 aus der Oberfläche der Membranfilterabschnitte 2 etwas herausragen, um ein Dispergieren und Herausfließen der die Reagenzien und ATP der lebenden Organismen enthaltenden Extraktionslösung aus dem speziellen hydrophilen Membranfilterabschnitt zu verhindern. Theoretisch kann dieses Dispergieren und Überfließen - selbst wenn die Höhe des Herausragens fast Null ist - durch Applikation eines Sprays von Teilchen kleinerer Größe verhindert werden. In diesem Fall erfordern jedoch äußerst feine Mikropartikel gewöhnlich eine längere Zeitspanne bis zur Beendigung des Sprühens und es wird manchmal eine bevorzugte Extraktion und/oder Lumineszenz nicht erreicht. Es empfiehlt sich daher, daß die hydrophoben Trennwände 3 in einer gewissen Höhe aufragen. Ferner ist ein Membranfilterelement mit einer großen Anzahl kleinerer Flächen und Trennwänden geringerer Breite theoretisch bevorzugt, doch würde dies die zusätzliche Einschränkung von größeren Schwierigkeiten bei der Herstellung verursachen.
Im folgenden wird eine Beschreibung der Verfahren zur Einschließung bzw. zum Festhalten äußerst kleiner Mengen von in einer Testlösung vorhandenen lebenden Organismen und zum Zählen ihrer Anzahl gegeben.
Zuerst wird das genannte Membranfilterelement auf einen becherförmigen Filterbehälter o.dgl., z.B. die Milliflex Filter Unit-Sterifil von Nippon Millipore Ltd. und dgl., montiert, so daß die Testlösung filtriert wird und die lebenden Mikroorganismen in einer Mehrzahl von Abschnitten, die durch die genannten Trennwände begrenzt sind, eingeschlossen sind.
Dann wird das Membranfilter entfernt und getrocknet und dann auf dieses ein Extraktionsreagens gesprüht, wobei die mikrobiellen Bestandteile auf dem Membranfilter extrahiert werden. Bei der Ausführung dieser Stufe sollte die Teilchengröße des Sprays entsprechend der Fläche der Membranfilterabschnitte unter Verwendung beispielsweise einer Sprühpistole oder eines Zerstäubers vom entweder pneumatischen Typ oder Ultraschall-Typ (im folgenden als "Sprühgeräte" bezeichnet) variiert werden. Als Sprühgeräte werden diejenigen bevorzugt, welche ein gleichmäßiges und feines Zerstäuben bewirken. Ein zu dichtes Besprühen sollte vermieden werden. Ferner sollte das Besprühen gleichförmig über alle Abschnitte durchgeführt werden, damit nicht eine zu große Menge des Reagens auf einen bestimmten Abschnitt aufgebracht wird, wobei sich die mikrobiellen Bestandteile über die Trennwände verteilen. Bei einer nicht genügend sorgfältigen Beachtung der genannten Beschreibung kann eine hinreichend genaue Bestimmung wegen der Verdünnung möglicherweise lumineszierender Bestandteile nicht erreicht werden.
Danach wird ein Lumineszenz induzierendes Reagens auf die Membranfilterabschnitte zur Induzierung von Lumineszenz aufgesprüht. Auch bei dieser Stufe ist es bevorzugt, das Besprühen unter Einsatz eines Sprühgeräts unter Berücksichtigung der genannten das Besprühen betreffenden Beschreibungen auszuführen.
Das nach den genannten Prozeduren Lumineszenz emittierende Membranfilterelement (im folgenden als "Probe" bezeichnet) wird auf einen Probenhalter montiert und kann bei Ausrüstung mit einer totalreflektierenden Platte einem Biolumineszenzbildanalysesystem (z.B. ARGUS - 50/CL vom konischen Lichtfaser-Eingabetyp von Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) zum Zählen der Anzahl lebender Mikroorganismen unterworfen werden. Die Messung erfolgt durch Verarbeiten der Bilder nach Akkumulation der Lumineszenz während 2 min, weiteres Verarbeiten der Bilder zur Eliminierung jeglicher als Rauschen betrachteter Lumineszenz und schließlich Zählen der Anzahl der erhalten gebliebenen hellen Flecken.
Das hier verwendete Biolumineszenzbildanalysesystem ist eine neuartige und in der Tat innovative Vorrichtung, in welcher selbst eine so schwache Lumineszenz, die durch übliche bekannte Instrumente nicht registriert werden konnte, mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen und zum Verarbeiten intensiviert werden kann. Ferner erfolgt das Verarbeiten und die Analyse der Daten schnell und in bequemer Weise. Darüber hinaus ermöglicht das System in Kooperation mit dem Effekt des Besprühens unter Verwendung eines ungewöhnlichen Membranfilters und eines erfindungsgemäßen Reagenssprühgeräts den Nachweis selbst einer einzelnen lebenden Mikroorganismenzelle, wodurch dieses ungewöhnliche ausgezeichnete Zählverfahren beträchtlich aktualisiert wird.
Die Anordnung des Systems ist in Fig. 3 angegeben. Dieses System umfaßt einen Probenhalter 9 zur Aufnahme eines Membranfilterelements (Probe) 5 nach der Behandlung mit den genannten extrafixierenden und Lumineszenz induzierenden Reagenzien; eine totalreflektierende Platte 6; ein Blendschutzgehäuse 8; eine sich verjüngende, möglichst nahe an das Membranfilterelement positionierte Faser 7 zur Registrierung der Lumineszenz in zweidimensionalem Ausmaß; eine ultrahochempfindliche Fernsehkamera 10 aus einer Photoverstärkerkomponente und einer Kameraröhre; eine Kamerasteuereinheit 11; einen Bildprozessor 12; einen Datenanalysator 13 und einen Fernsehmonitor 14. Das mit ARGUS - 50/CL des konusförmigen Lichtfaser-Eingangstyps von Hamamatsu Photonics Co., Ltd., ausgerüstete System oder Systeme mit einer ähnlichen Zählleistung sind besonders bevorzugt. Als ultrahochempfindliche Fernsehkamera kann eine Kamera, bei welcher das Rauschen von der Kamera selbst zur Akkumulierung selbst einer sehr schwachen Lumineszenz durch Kühlen auf eine Temperatur von etwa -30 bis -12ºC unter Verwendung einer gekühlten Festkörperkameravorrichtung (CCD) unterdrückt werden kann, verwendet werden. Beispielsweise ist ein gekühltes CCD-Digitalbildsystem von Hamamatsu Photonics verfügbar. Alternativ kann das genannte Verfahren durch Umkehren sowohl der konusförmigen Faser 7 im Kameraröhrenbereich als auch der ultrahochempfindlichen Fernsehkamera 10 und dortiges Plazieren eines Probenhalters mit einer Probe durchgeführt werden.
Die Probe 5 wird vorzugsweise möglichst nahe an der konusförmigen Faser 7 plaziert, so daß die Meßempfindlichkeit dadurch signifikant gesteigert wird. Je nach Bedarf können ein Sprühgerät oder Sprühgeräte für Extraktions- und Lumineszenz induzierende Reagenzien und Probenträger und dgl. in Kombination plaziert werden, so daß das Zählen automatisch erfolgen kann.
Zum Zählen der Anzahl von lebenden Mikroorganismen wird der Probenhalter 9 mit der Probe (Membranfilterelement mit den zu prüfenden Mikroorganismen) nach der Lumineszenz induzierenden Behandlung in engen Kontakt mit den Oberflächen der konusförmigen Fasern 7 gebracht und dann die aus den Mikrobenkörpern emittierte Lumineszenz durch die ultrahochempfindliche Fernsehkamera 10 und das Kamerasteuergerät 11 zum Bildprozessor 12 geführt, in welchem die Photonen während 30 bis 180 s, z.B. bei einer zweidimensionalen Aufnahme des Bildes während 120 s, akkumuliert werden. Der Datenanalysator 13 verarbeitet dann das Bild, wobei schwächere Hintergrundlumineszenz eliminiert wird, und zeigt am Fernsehmonitor 13 die allein zurückbleibende, von den lebenden Mikroorganismen herrührende helle Lumineszenz als hellen Fleck an. Durch dieses Verfahren wird die Lumineszenz anderer als der Mikrobenkörper eliminiert und die gezählte Anzahl heller Flecken entspricht damit im wesentlichen der Anzahl lebender Mikroorganismen.
In der erfindungsgemäß bevorzugtesten Ausführungsform ist der zur extrahierende Mikrobenbestandteil ATP. In diesem Fall wird ein ATP-extrahierendes Reagens (z.B. NRB , Lumac Co.) als Extraktionsreagens verwendet. Das Reagens wird in Form sehr feiner Teilchen unter Verwendung eines Sprühgeräts (z.B. Ultrasonic Aspirator , Matsushita Electric Industries Co., Ltd.) zur Extraktion von ATP aus innerhalb der Membranfilterabschnitte eingefangenen bzw. festgehaltenen lebenden Organismen aufgesprüht Ferner wird Lumineszenz induzierendes Reagens (z.B. Lumit-PM , Lumac Co.) in ähnlicher Weise zur Induzierung der Lumineszenz aufgesprüht. Wie bereits erwähnt, wird die so erhaltene Probe dann dem genannten Biolumineszenzbildanalysesystem zur Akkumulierung der Lumineszenz während 30 bis 180 s und zur Anzeige der im Vergleich zur Hintergrundlumineszenz helleren Lumineszenz als heller Fleck auf dem Fernsehmonitor unterzogen. Zur Bestimmung der maximalen Helligkeit der Hintergrundlumineszenz (d.h. des Hintergrundpegels) wird ein der zu prüfenden Lösung entsprechendes Volumen derselben Testlösung hergestellt und sterilisiert. Nach dem Filtrieren dieser Lösung auf dem erfindungsgemäßen Membranfilter wird das Membranfilter in der genannten Weise zur Induzierung der Lumineszenz behandelt. Die maximale Helligkeit des auf dem Fernsehmonitor angezeigten hellen Flecks bei Unterwerfen einer auf diese Weise erhaltenen Probe unter das Biolumineszenzbildanalysesystem stellt den Hintergrundpegel (im folgenden als "Schwellenwert" bezeichnet) dar. Demgemäß stellen bei vollständiger Eliminierung der Lumineszenz, die weniger helles Licht als den Schwellenwert ergibt, die auf dem Fernsehmonitor angezeigten hellen Flecken der übrigen Lumineszenz (d.h. der helleren Lumineszenz als der Schwellenwert) direkt die aus lebenden Mikroorganismen stammende Lumineszenz dar.

Wirkungen der Erfindung

In der vorliegenden Erfindung wird ein Membranfilterelement aus einer Mehrzahl kleiner Membranfilterabschnitte mit hydrophoben leicht aus der Filteroberfläche herausragenden Trennwänden verwendet, so daß alle lebenden Mikroorganismen innerhalb eines dieser Abschnitte eingeschlossen sind. Dann werden eine Extraktionslösung (ATP-Extraktionslösung) und ein Lumineszenz induzierendes Reagens (Luciferin-Luciferase- Reagens) in einem besonderen Zustand aufgesprüht, so daß das Reagens innerhalb der speziellen Membranfilterabschnitte verbleibt und weder aus den Abschnitten dispergiert wird noch eine Verdünnung erfährt. Ferner ist die Vorrichtung so, daß die Verdünnung innerhalb eines Abschnitts weitestgehend verzögert ist. Lumineszierende Mikrobenbestandteile werden dadurch in höherer Konzentration zurückgehalten, wodurch die Bestimmung selbst einer extrem kleinen Menge von Mikrobenbestandteilen ohne Schwierigkeiten möglich ist.
Darüber hinaus wurde es durch Unterwerfen der Proben (Membranfilterelement), welche auf diese Weise Lumineszenz emittieren konnten, unter ein Biolumineszenzbildanalysesystem möglich, eine schwache Lumineszenz eines einzelnen Objekts zweidimensional zu registrieren, wobei die Zahl lebender Mikroorganismen automatisch, hochempfindlich, schnell und in geeigneter Weise, selbst bei einer äußerst geringen Anzahl, ermittelt werden kann. Mit anderen Worten ermöglichte die Anwendung eines Fernsehkamerakopfes aus einer konusförmigen Faser, einem Photoverstärker und einer Kameraröhre die Anzeige (Detektion) von Lumineszenz aus lebenden Mikroorganismen als sehr helle Flecken, so daß jegliches Lumineszenzrauschen von anderen Materialien als lebenden Mikroorganismen im Vergleich mit einem Lumineszenzschwellenwert ohne Schwierigkeiten eliminiert werden kann, so daß auf diese Weise die Anzahl lebender Mikroorganismen automatisch, schnell und in geeigneter Weise selbst bei einer äußerst geringen Anzahl (z.B. weniger als einige Zellen/100 ml der Testlösung) gezählt werden kann. Ferner kann der Fall auftreten, in welchem die Beurteilung der Existenz eines einzelnen lebenden Mikroorganismus in Probelösungen signifikant ist, beispielsweise der Fall eines Coliform-Tests für Nahrungsmittel oder Kühlgetränke. Zwar ist die vorliegende Erfindung nahezu immer verwendbar, doch wird das Membranfilterelement nach dem Filtrieren der Testlösungen und dem Einschließen der lebenden Mikroorganismen vorzugsweise auf eine Unterlage oder eine Nähragarplatte mit den für däs Wachstum der lebenden Mikroorganismen am besten geeigneten Nährstoffen aufgebracht. Beim Zählen nach dem Wachsen der lebenden Mikroorganismen innerhalb der gleichen Abschnitte nach einer kurzzeitigen Kultivierung (von z.B. einigen Stunden) sind signifikant leuchtende helle Flecken verfügbar, so daß ein Mittel zur genaueren Beurteilung zur Verfügung steht. Kulturbedingungen diesen Ausmaßes ermöglichen einer einzelnen Zelle natürlicherweise nicht die Ausbildung von Kolonien.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele genauer erläutert.

Beispiel 1

Saccharomyces cerevisiae (IFO 0209), welches über Nacht in einem Glucosepeptonmedium (Eiken Chemicals Co., Ltd.) bei 30ºC gezüchtet worden war, wurde mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Mikrobenkonzentration von etwa 20 CFU/ml (CFU: Kolonie bildende Einheit) verdünnt. 1 ml der Lösung wurde als Testlösung gesammelt.
Auf ein Membranfilter aus hydrophilem Polycarbonat mit einer Porengröße von 0,45 µm und einem Durchmesser von 25 mm wurden unter Verwendung einer Farbe mit guten Übertragungseigenschaften und guten Härtungseigenschaften durch UV-Strahlung und einer üblichen bekannten Siebdrucktechnik gitterförmige hydrophobe Trenneinsätze gemäß Fig. 1 und 2 aufgedruckt, so daß ein Membranfilterelement mit quadratischen hydrophilen Abschnitten der Seitenlänge 0,5 mm, die von Trennwänden mit einer Höhe von 20 µm über der Membranoberfläche und einer Breite von 0,2 mm umgeben waren, erhalten wurde.
Unter Verwendung eines mit diesem Membranfilterelement ausgerüsteten Filtergeräts wurde die genannte Testlösung abgesaugt und filtriert.
Das Membranfilter wurde dann vom Filtriergerät entfernt, getrocknet und auf einen Probenhalter montiert. Ein ATP-Extraktionsreagens von Lumac Co. (NRB ) wurde 10 s lang auf das Membranfilter unter Verwendung einer Sprühpistole (Koike Chemicals Co.), welche im Abstand von etwa 15 cm in einem Winkel von 45º darüber gehalten wurde, sorgfältig gesprüht, so daß keine großen Tröpfchen darauf fielen. Nach 20 s wurde das Lumineszenz induzierende Luciferin-Luciferase-Reagens (Lumit-PM , Lumac Co.) 10 s unter Verwendung derselben Sprühpistole aufgesprüht, so daß das Membranfilter Lumineszenz emittieren konnte. Dann wurde das Membranfilter dem ARGUS- 50/CL -Biolumineszenzbildanalysesystem (Hamamatsu Photonics Co.) unterworfen und 2 min lang eine Photonenakkumulation durchgeführt. Nach Anzeige der Lumineszenz als helle Flecken auf dem Fernsehmonitor wurde das Lumineszenzrauschen zum Zählen der Anzahl von lebenden Mikroorganismen eliminiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
Als Vergleichsexperiment wurde eine ähnliche Testlösung wie die obige nach 48-stündigem Züchten bei 30ºC unter Verwendung des Standardagarplattenverfahrens dem Zählen der Anzahl von lebenden Mikroorganismen unterworfen. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1

Beispiel2

Saccharomyces cerevisiae (IFO 0209), welches gemäß Beispiel 1 gezüchtet worden war, wurde mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Mikrobenkonzentration von etwa 200 CFU/ml verdünnt. 1 ml der Lösung wurde als Testlösung gesammelt. Nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 zum Zählen der Anzahl der hellen Flecken wurden die in Tabelle 2 angegebenen Ergebnisse erzielt. Tabelle 2

Beispiel 3

Pseudomonas diminuta (IFO 14213) wurde mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Mikrobenkonzentration von etwa 50 CFU/ml verdünnt. 1 ml wurde als Testlösung gesammelt.
Auf einem Membranfilter aus hydrophilem Polytetrafluorethylen mit der Porengröße 0,45 µm und dem Durchmesser 25 mm wurden unter Verwendung einer in die Membran zu einem gewissen Grad eindringenden Farbe mit guten Übertragungseigenschaften und guten Härtungseigenschaften durch UV-Strahlung und der üblichen bekannten Siebdrucktechnik quadratische hydrophile Abschnitte der Seitenlänge 0,4 mm und Trennwände der Höhe 20 µm und der Breite 0,3 mm erzeugt. Unter Verwendung des so erhaltenen Membranfilterelements wurde die Testlösung gemäß Beispiel 1 filtriert. Das Membranfilter wurde dann entfernt, getrocknet, extrahiert und gemäß Beispiel 1 Lumineszenz emittieren gelassen. Nach dem Unterziehen unter ein Bildanalyseverfahren zur Eliminierung der Hintergrundlumineszenz wurde die Anzahl der hellen Flecken gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammen mit den durch Zählen der Anzahl von lebenden Mikroorganismen unter Verwendung des Standard-Agarplattenverfahrens für die ähnlichen Testlösungen erhaltenen Ergebnissen angegeben. Tabelle 3

Beispiel 4

Escherichia coli (IFO 13898) wurde mit physiologischer Kochsalzlösung auf eine Mikrobenkonzentration von etwa 100 CFU/ml verdünnt. 1 ml der Lösung wurde als Testlösung gesammelt. Unter Verwendung des gemäß Beispiel 3 hergestellten Membranfilterelements und gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 wurde die Testlösung filtriert. Dann wurde das Membranfilter entfernt, getrocknet, extrahiert und Lumineszenz emittieren gelassen. Nach dem Unterziehen unter ein Bildanalyseverfahren zur Entfernung der Hintergrundlumineszenz wurde die Anzahl der hellen Flecken gezählt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammen mit den unter Verwendung des Standard- Agarplattenverfahrens für die ähnlichen Testlösungen erhaltenen Ergebnissen angegeben. Tabelle 4

Beispiel 5

Ein Teströhrchen mit 5 ml Glucosepeptonmedium (Eiken Chemicals Co., Ltd.) wurde mit einer Platinöse mit Saccharomyces cerevisiae (IFO 0209) beimpft und über Nacht bei 30ºC kultiviert. Nach der Verdünnung des Mediums mit Phosphatpufferlösung (pH = 7,2) auf eine Mikrobenkonzentration von etwa 10 CFU/ml wurde 1 ml der Lösung als Testlösung gesammelt.
Es wurde ein Membranfilter verwendet, bei welchem gitterförmige hydrophobe Trenneinsätze der Höhe 20 µm und der Breite 0,3 mm unter Verwendung einer in die Membran bis zu einem gewissen Grad eindringenden Farbe mit guten Übertragungseigenschaften und guten Härtungseigenschaften durch UV-Strahlung und der üblichen bekannten Siebdrucktechnik auf ein Membranfilter (Durchmesser 25 mm) aus hydrophilem Poly(vinylidendifluorid) zur Ausbildung quadratischer hydrophiler Membranfilterabschnitte der Seitenlänge 0,3 mm aufgedruckt waren. Nach dem Filtrieren von 1 ml der Testlösung wurde das Membranfilter gewaschen und getrocknet und dann mit einem Extraktionsreagens (NRB , Lumac Co.) 10 s lang durch ein Ultraschall-Sprühgerät (Matsushita Electric Industries) im Abstand von etwa 10 cm und anschließend mit einem Lumineszenz induzierenden Reagens (Lumit-PM , Lumac Co.) 10 s lang in der gleichen genannten Weise besprüht. Das Membranfilter wurde dann dem Bildanalyseverfahren nach den Verfahren gemäß Beispiel 1 unter Verwendung eines Systems gemäß Fig. 3 zur Eliminierung des Lumineszenzrauschens unterzogen. Die Anzahl der hellen Flecken wurde gezählt, wobei die Ergebnisse nach Tabelle 5 erhalten wurden. Tabelle 5

Beispiel 6

Ein Teströhrchen mit 5 ml m-TGE-Medium (DIFCO LABORATORIES) wurde mit einer Platinschlaufe mit Escherichia coli (IFO 13898) beimpft und über Nacht bei 37ºC kultiviert. Nach der Verdünnung des Mediums mit Phosphatpufferlösung (pH = 7,2) auf eine Mikrobenkonzentration von etwa 10 CFU/ml wurde 1 ml der Lösung als Testlösung gesammelt.
Unter Verwendung eines Membranfilterelements ähnlich dem in Beispiel 5 beschriebenen wurde 1 ml der Testlösung filtriert. Nach dem Waschen und Trocknen des Membranfilters wurden die Verfahren Extrahieren und Induzieren der Lumineszenz durchgeführt und das Membranfilter dem Bildanalyseverfahren unterworfen. Das Lumineszenzrauschen wurde eliminiert und die Anzahl heller Flecken gezählt. Andererseits wurden weitere Membranfilterelemente nach Filtrieren von 1 ml der genannten Testlösung auf eine mit m-TGE-Medium getränkte Unterlage gegeben, 4 h lang bei 37ºC kultiviert, und dann den Vorgängen Extrahieren und Induzieren der Lumineszenz unterworfen. Nach den weiteren Vorgängen für die Bildanalyse und die Eliminierung des Rauschens wurde die Anzahl heller Flecken gezählt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6
* helle Flecken/Membranfilterelement
** Lichtintensität der hellen Flecken, entsprechend der auf dem Fernsehmonitor erhaltenen maximalen Helligkeit der von den lebenden Mikroorganismen herrührenden hellen Flecken.

Beispiel 7

Ein Teströhrchen mit 5 ml m-TGE-Medium (DIFCO LABORATORIES) wurde mit einer Platinöse mit Streptococcus faecalis (IFO 12580) beimpft und über Nacht bei 37ºC kultiviert. Nach dem Verdünnen des Mediums mit Phosphatpufferlösung (pH = 7,2) auf eine Mikrobenkonzentration von etwa 30 CFU/ml wurde 1 ml der Lösung als Testlösung verwendet. Unter Verwendung eines ähnlichen Membranfilterelements und nach den in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren wurde das Membranfilterelement 4 h kultiviert, getrocknet, extrahiert und Lumineszenz emittieren gelassen. Nach Durchführung der Bildanalyse und der Eliminierung des Rauschens wurde die Anzahl heller Flecken gezählt. Hierbei wurden die in Tabelle 7 angegebenen Ergebnisse erhalten. Tabelle 7

Beispiel 8

100 ml kommerziell erhältliches Dosenbier (Asahi Breweries Co.) wurde axenisch filtriert. Zum Filtrat wurden 2 ml einer Lösung mit etwa 30 CFU/ml von Saccharomyces cerevisiae (IFO 0209), welche wie in Beispiel 5 kultiviert und mit Phosphatpufferlösung (pH = 7,2) verdünnt worden war, zur Herstellung einer Testlösung gegeben.
Ein Membranfilter aus hydrophobem Polytetrafluorethylen der Porengröße 0,45 µm, des Durchmessers 25 mm und der Dicke 50 µm wurde mit Methanol benetzt und mit Wasser nach dem in Beispiel 34 im US-Patent Nr. 4 618 533 (von Michael J. Steuck) beschriebenen Verfahren gewaschen. Es wurde dann in eine wäßrige Lösung mit 5% Hydroxypropylacrylat, 1% Glycidylacrylat und 1% Ammoniumpersulfat getaucht und zwischen zwei Folien aus Polyethylenfilm mit jeweils quadratischen durchsichtigen Bereichen der Seitenlänge 0,5 mm und die durchsichtigen Bereiche umgebenden gitterartigen Abdeckbereichen der Breite 0,2 mm, wobei diese Folien hinsichtlich der Abdeckbereiche aufeinander ausgerichtet waren, gelegt. Nach der UV-Bestrahlung wurde das Membranfilter mit Wasser, dann mit Methanol gewaschen und getrocknet. Während des genannten Verfahrens wird das Membranfilter in den durchsichtigen Bereichen hydrophil.
Unter Verwendung des so erhaltenen Membranfilterelements und gemäß den Verfahren von Beispiel 5 wurde die Testlösung filtriert und das Membranfilterelement gewaschen, getrocknet, extrahiert und Lumineszenz emittieren gelassen. Dann wurde das Bildanalyseverfahren unter Verwendung des Systems gemäß Fig. 3 zur Entfernung des Lumineszenzrauschens durchgeführt und die Zahl der hellen Flecken gezählt, wobei die in Tabelle 8 angegebenen Ergebnisse erhalten wurden. Tabelle 8

Beispiel 9

100 ml im Handel erhältliches in Dosen abgefülltes Coca-Cola (Nippon Coca-Cola Bottlers Inc.) wurde axenisch filtriert. Zum Filtrat wurden 3 ml einer Lösung mit etwa 10 CFU/ml Saccharomyces cervisiae (IFO 0209), welche gemäß Beispiel 5 kultiviert und mit Phosphatpufferlösung (pH = 7,2) verdünnt worden war, zur Herstellung einer Testlösung gegeben.
Unter Verwendung eines Beispiel 8 ähnlichen Membranfilters und nach den Verfahren gemäß Beispiel 5 wurde die Testlösung filtriert und das Membranfilterelement gewaschen, getrocknet, extrahiert und Lumineszenz emittieren gelassen. Dann wurde das Bildanalyseverfahren zur Eliminierung des Lumineszenzrauschens durchgeführt und die Zahl der hellen Flecken gezählt, wobei die Ergebnisse nach Tabelle 9 erhalten wurden. Tabelle 9

Claims

1. Verfahren zum Zählen der Anzahl an lebenden Mikroorganismen in einer Testlösung durch

Filtrieren der betreffenden Lösung durch ein Membranfilterelement mit einer Mehrzahl von kleinen hydrophilen Membranfilterabschnitten, die im wesentlichen von einer Mehrzahl von hydrophoben Trenneinsätzen bzw. -wänden umgeben sind, so daß die in der Lösung enthaltenen lebenden Mikroorganismen in diesen Abschnitten festgehalten werden können;

Trocknen des Membranfilterelements;

Aufsprühen eines Extraktionsreagens auf das Membranfilterelement zur Extraktion eines möglicherweise lumineszierenden Bestandteils der in den betreffenden Abschnitten eingeschlossenen bzw. festgehaltenen lebenden Mikroorganismen;

Aufsprühen eines Lumineszenz induzierenden Reagens auf das Element, damit der lumineszierende Bestandteil innerhalb der betreffenden Abschnitte Lumineszenz emittieren kann;

Darstellen der emittierten Lumineszenz als hellen Fleck unter Benutzung eines Biolumineszenzbildanalysesystems und Zählen der Zahl der hellen Flecken als Repräsentanten für die Zahl der lebenden Mikroorganismen in der Testlösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei zusätzlich das Membranfilterelement nach dem Filtrieren der Probenlösung und vor dem Trocknen des Membranfilterelements auf ein geeignetes Kulturmedium für das Wachstum der lebenden Mikroorganismen gelegt und die lebenden Mikroorganismen kurzzeitig zur Erhöhung ihrer Zahl gezüchtet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die hydrophoben Trenneinsätze bzw. -wände aus der Oberfläche der hydrophilen Membranfilterabschnitte, durch welche die Testlösung hindurchlaufen gelassen wird, herausragen.

Verfahren nach Anspruch 3, wobei die hydrophoben Trenneinsätze bzw. -wände in einer Höhe von 0,01 bis 0,05 mm über die Oberfläche der hydrophilen Membranfilterabschnitte herausragen und eine Breite von 0,1 bis 2 mm aufweisen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der möglicherweise lumineszierende Bestandteil der lebenden Mikroorganismen aus Adenosin-5'-triphosphat (ATP) und das Lumineszenz induzierende Reagens aus Luciferin- Luciferase-Reagens bestehen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei jeder der hydrophilen Membranfilterabschnitte eine Oberfläche zwischen 0,04 mm² und 2 mm² aufweist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die hydrophoben Trenneinsätze bzw. -wände durch Aufdrucken, Aufstempeln bzw. -prägen oder Aufzeichnen eines Musters aus einem hydrophoben Werkstoff, ausgewählt aus der Gruppe Wachse, Epoxyharze, Siliconharzwachse, Siliconöle, fluorierte Harzwachse und Polystyrolharze, auf ein hydrophiles Membranfilter zur Herstellung der betreffenden Membranfilterabschnitte oder mit Hilfe eines Photosensibilisatorverfahrens unter Verwendung lichtempfindlicher Harze als Rohmaterialien für das Membranfilterelement gebildet werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 7, wobei die hydrophilen Membramfilterabschnitte aus einem hydrophilen Werkstoff, ausgewählt aus der Gruppe Polytetrafluorethylen, Poly(vinylidenfluorid), Polycarbonat, Polyamid, Polysulfon, Polymerlegierungen hiervon, Acetylcellulose, Nitrocellulose und Mischungen, derselben hergestellt sind.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Aufsprühen von Reagenzien durch Aufsprühen eines Nebels einer Teilchengröße zwischen 5 µm bis 20 µm unter Verwendung einer Sprühpistole oder eines Zerstäubers vom entweder pneumatischen Typ oder Ultraschall-Typ erfolgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Biolumineszenzbildanalysesystem einen Fernsehkamerakopf aus einem konischen Faserlichtleiter, einem Lichtverstärker und einer Kameraröhre oder einem konischen Faserlichtleiter und einer gekühlten CCD-Videokamera enthält.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei ein Probenhalter verwendet wird und dieser das Membranfilterelement mit einer daneben anordneten total reflektierenden Scheibe enthält.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 10, wobei das photoelektrische Bildanalysesystem eine Bildverarbeitung zur Eliminierung eines von irgendwelchen anderen Substanzen als den nachzuweisenden Mikroorganismen herrührenden Lumineszenzrauschens und zur Zählung der hellen Punkte oberhalb eines vorgegebenen Niveaus durchführt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 10, wobei das Membranfilterelement mit einer Reihe von hydrophilen Membranfilterabschnitten, die von einer Reihe von hydrophoben Trennwänden umgeben sind, durch Beschichten einer porösen hydrophoben Filtermembran mit einem polymerisierbaren Monomer mit der Fähigkeit, die hydrophobe Membran mit einer hydrophilen Oberfläche zu versehen, Einwirkenlassen einer UV-Strahlung unter Maskierung der (später) die hydrophoben Trennwände bildenden Flächen zur Polymerisation des Monomers an die oder zur Copolymerisation des Monomers mit der poröse(n) hydrophobe(n) Filtermembran oder zur Polymerisation des Monomers als solchem zur Umwandlung der nicht maskierten Flächen zur Hydrophilisierung der nicht maskierten Fläche hergestellt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die poröse hydrophobe Filtermembran aus der Gruppe Polytetrafluorethylen, Polyvinylidenfluorid und Polycarbonat ausgewählt ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Aufsprühen in einem derart feinverteilten Zustand erfolgt, daß es während der ATP-Extraktions- und Lumineszenzemissionsstufen nicht zu einer nennenswerten Verdünnung und Diffusion kommen kann.