DE69219787T2

DE69219787T2 - Immuntherapeutische vektorkonstrukte gegen krebs

Info

Publication number: DE69219787T2
Application number: DE69219787T
Authority: DE
Inventors: Jack R. San Diego Ca 92129 Barber; Mordechai San Diego Ca 92104 Bodner; Sunil Vista Ca 92083 Chada; Cataline San Diego Ca 92129 Dejesus-Harkleroad; Douglas J. Leucadia Ca 92024 Jolly
Original assignee: Chiron Viagene Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1991-11-29
Filing date: 1992-11-30
Publication date: 1997-08-28
Anticipated expiration: 2012-12-01
Also published as: CA2117303C; EP0615453A1; FI942503L; JPH07501942A; ATE152915T1; DE69219787D1; CA2117303A1; WO1993010814A1; AU3229793A; EP0615453B1; FI942503A0; NO941986D0; FI942503A7; AU671971B2; NO941986L; US5693522A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Anti- Krebs-Immuntherapie und insbesondere Verfahren zur Abtötung ausgewählter Tumorzellen durch Erzeugen einer Immunantwort gegen die Tumorzellen.

Hintergrund der Erfindung

Krebs macht 1/5 der Gesamtmortalität in den Vereinigten Staaten aus und ist die zweite führende Todesursache. Krebs ist typischerweise durch die unkontrollierte Teilung einer Zeilpopulation gekennzeichnet. Diese unkontrollierte Teilung fuhrt typischerweise zur Bildung eines Tumors, der anschließend an anderer Stelle metastasieren kann.
Feste primäre Tumore können allgemein adäquat durch einen chirurgischen Eingriff behandelt werden. Jedoch besitzen die meisten Patienten mit festen Tumoren auch Mikrometastasen jenseits der primären Tumorstelle. Bei Behandlung mit einem chirurgischen Eingriff allein erleiden etwa 70 % dieser Patienten ein Krebsrezidiv. Zusätzlich zu dem chirurgischen Eingriff werden viele Krebsarten nun auch mit einer Kombination von Therapien einschließlich cytotoxischer Chemotherapeutika (z.B. Vincristin, Vinblastin, Cisplatin etc.) und/oder Strahlentherapie behandelt. Eine Schwierigkeit bei dieser Variante ist jedoch die Tatsache, daß Radiotherapeutika und Chemotherapeutika für normale Gewebe toxisch sind und oft lebeusbedrohliche Nebenwirkungen erzeugen. Zusätzlich haben diese Behandlungsmodalitäten oft extrem hohe Versagens/Remissionsraten (bis zu 90 % in Ahängigkeit von dem Krebstyp).
Zusätzlich zu den Chemo- und Strahlentherapien wurden viele Versuche unternommen, das patienteneigene Imunsystem zu stimulieren oder zu verstärken, um die Krebezellen zu beseitigen. Mehrere Immuntherapien verwendeten bakterielle oder virale Komponenten, um das Immunsystem zu stimulieren, die Tumorzellen zu zerstören. Beispiele für solche Komponenten umfassen Immunmodulatoren (wie beispielsweise BCG, Endotoxin und gemischte bakterielle Vaccine), Interferone (α, β und γ), Interferoninduktoren (z.B. Brucella abortus und verschiedene Viren) und Thymusfaktoren (z.B. Thymosinfraktion 5 und Thymosin-alpha-1) (vgl. allgemein "Principles of Cancer Biotherapyt", Oldham (Hrg.), Raven Press, New York, 1987). Solche Mittel waren allgemein als Adjuvantien und als nichtspezifische Stimulanzien bei Tiertumormodellen nützlich, haben sich jedoch nicht als allgemein effektiv beim Menschen erwiesen.
Lymphokine wurden auch zur Behandlung von Krebs verwendet. In Kürze, Lymphokine werden von einer Vielzahl von Zellen sezerniert und besitzen im allgemeinen eine Wirkung auf spezifische Zellen bei der Erzeugung einer Immunantwort. Beispiele für Lymphokine umfassen Interleukin (IL)-1, -2, -3 und -4 sowie koloniestimulierende Faktoren, wie G-CSF, GM-CSF und M-CSF. Jüngst verwendete eine Gruppe IL-2, um periphere Blutzellen zu stimulieren um große Zellmengen zu vermehren und zu produzieren, die für die Tumorzellen cytotoxisch sind (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 313:1485-1492, 1985).
Andere schlugen die Verwendung von antikörpervermittelten Anti- Krebetherapien vor. In Kürze, es können Antikörper entwickelt werden, die bestimmte Zelloberflächenantigene erkennen, die entweder einzigartig für oder vorherrschend auf Krebezellen, verglichen mit normalen Zellen, sind. Diese Antikörper oder "magische Kugeln" können entweder allein oder in Konjugation mit einem Toxin verwendet werden, um Tumorzellen spezifisch zielgerecht anzugehen und abzutöten (Dillman, "Antibody Therapy", Principles of Cancer Biotherapy, Oldham (Hrg.), Raven Press, Ltd., New York, 1987). Beispielsweise behandelten Ball et al. (Blood 62:1203-1210, 1983) mehrere Patienten mit akuter myelogener Leukämie mit einem oder mehreren aus verschiedenen monoclonalen Antikörpern, die für die Leukämie spezifisch sind, was zu einer deutlichen Abnahme der zirkulierenden Laukämiezellen während der Behandlung führte. Auf ahnliche Weise verwendeten andere toxinkonjugierte Antikörper therapeutisch zur Behandlung einer Vielzahl von Tumorarten einschließlich beispielsweise Melanome, Kolonrektalkarzinome, Prostatakarzinome, Brustkarzinome und Lungenkarzinome (vgl. Dillman, a.a.O.). Eine Schwierigkeit ist jedoch, daß die meisten monoclonalen Antikörper aus Mäusen stanmen und somit eine Hypersensitivität gegen Maus-Antikörper, deren Wirksamkeit insbesondere nach wiederholten Therapien einschränken kann. Übliche Nebenwirkungen umfassen Fieber, Schweißausbrüche und Schüttelfrost, Hautrötungen, Arthritis und Nervenlahmungen.
Die WO/89/01973 beschreibt ein cloniertes verkürztes Protooncogen, das von einem Rattentumor abgeleitet ist, der zu einer Immunantwort in anderen Arten als der Ratte führt.
Salgaller et al., Proc. Annu. Meet. Am. Assoc. Cancer Res., 32:A1622, 1991, betrifft die Erzeugung einer Maus-Tumorlinie, die menschliches karzinoemoryonales Antigen durch Übertragen von Maus-Adenokarzinomzellen MC-38 mit einem retroviralen Expressionsvektor, in den eine CEA-umfassende cDNA cloniert war, exprimiert.
Hareuveni et al., Vaccine 9:618-626, 1991, beschreiben zwei alternative mRNA-Arten des ETA-Gens, von denen eine bei Expression in Säugerzellen meistens sezerniert wird, während die andere membranassoziiert bleibt.
Hill et al., Mutant Oncogenes: Targets for Therapy?, September 9-10, 1991, spekulieren, daß es möglich sein könnte, daß Oncogenmutationen Epitope für die Erkennung der gytotoxischen T-Lymphocyten bieten.
Jung et al., The Journal of Experimental Medidine 173:273-276, 1991, beschreiben eine Punktmutation in dem normalen P2lras-Gen, die zu einem neuen ras-Oncogen führt, wobei die Mutation zu einem Austausch in der codierenden Region entsprechend der Aminosäureposition 12 eines Valincodons für das natürlich vorkommende Glycincodon führt.
Daher können Mittel, die die natürlichen Wirtsaowehrmechanismen gegen Tumorinduktion oder -progression verstärken können, Remissionsraten erhöhen und das Überleben der Patienten erhöhen, ohne die cytotoxischen Nebenwirkungen der Methoden aus dem Stand der Technik. Die vorliegende Erfindung betrifft solche Mittel und liefert weiter andere verwandte Vorteile.

Zusammenfassung der Erfinduny

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Zerstörung ausgewählter Tumorzellen mit einer veränderten zellulären Komponente, die normalerweise mit den ausgewählten Tumorzellen assoziiert ist. Gemäß einem Gesichtspunkt wird ein Verfahren zur Zerstörung ausgewählter Tumorzellen bereitgestellt, umfassend die Stufe der Verabreichung eines Vektorkonstrukts an ein warmolütiges Tier, das die Expression mindestens einer immunogenen, nichttumorigenen Form einer veränderten zellulären Komponente, die normalerweise mit den ausgewählten Tumorzellen assoziiert ist, steuert. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Zerstörung ausgewählter Tumorzellen in einem warmalütigen Tier bereitgestellt, umfassend die Stufen (a) Entfernen der Zellen aus einem warmblütigen Tier, (b) Verabreichen eines Vektorkonstrukts an die entfernten Zellen, das die Expression mindestens einer immunogenen, nichttumorigenen Form einer veränderten zellulären Komponente, die normalerweise mit den ausgewählten Tumorzellen assoziiert ist, steuert und (c) Rückführung der Zellen in ein wamblütiges Tier, so daß die ausgewählten Tumorzellen zerstört werden. Wie einem Durchschnittsfachmnn auf dem Gebiet offensichtlich ist, meß das Tier, dem die Zellen entnommen werden, nicht das gleiche Tier sein, in das sie zurückgeführt werden, obwohl sie bevorzugt histokompatibel sein sollten. Zusätzlich ist zu verstehen, daß erfindungsgemäß bei Bezugnahme auf ein virales Konstruut, das eine beliebige Substanz in einer Zelle exprimiert, dies in der Tat sich auf die Proteinproduktion des so erhaltenen Provirus als Folge einer reversen Transkription der viralen RNA in die Zelle bezieht. Innerhalb verschiedener Ausführungsformen der Erfindung kann das Vektorkonstrukt von einem rekombinanten Retrovirus getragen werden. Alternativ kann eine immunogene Form einer veränderten zellulären Komponente in vitro hergestellt werden und Patienten mit einem geeigneten Adjuvans, bevorzugt einem, das die zelluläre Imunität induziert, verabreicht werden.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Vektorkonstrukt bereitgestellt, das die Expression mindestens einer inmunogenen, nichttumorigenen Form einer veränderten zellulären Komponente steuert. Im Rahmen verschiedener Ausführungsformen kann die zelluläre Komponente durch eine Punktmutation, durch eine Deletion oder durch eine chromosomale Translokation verändert sein. Im Rammen anderer Ausführungsformen umfassen die veränderten zellulären Komponenten ras*. Im Rahmen einer weiteren Ausführungsform werden nichttumorigene veränderte zelluläre Komponenten bereitgestellt, die beispielsweise Δ ras*¹², Δ ras*¹³ und Δras*&sup6;¹ umfassen. Gemäß weiteren Gesichtspunkten der Erfindung ist die veränderte zelluläre Komponente Mucin*. Bereitgestellt werden ebenfalls Vektorkonstrukte, die die Expression mehrerer veränderter Zellkomponenten steuern einschließlich beispielsweise einem Vektorkonstrukt, das die Expression sowohl von ras * als auch p53 * steuert oder ein Vektorkonstrukt, das die Expression von ras*, Mucin* und DCC steuert. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung werden rekombinante Retroviren zur Aufnahme der vorstehend beschriebenen Vektorkonstrukte bereitgestellt. Mit diesen rekombinanten Viren infizierte Target-Zellen werden ebenfalls bereitgestellt und umfassen beispielsweise die Ausführungsformen, bei denen die Target-Zellen aus der Gruppe, bestehend aus menschlichen, Makaken-, Hunde-, Ratten- und Mauszellen, ausgewählt sind.
Ebenfalls bereitgestellt werden pharmazeutische Präparate, umfassend die vorstehend beschriebenen rekombinanten Viren in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
Diese und weitere Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung gehen unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung und beigefügten Zeidinungen hervor.

Kurze Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 ist eine schematische Erläuterung, die die Konstruktion des Plasmids SP-Val¹²(100) darstellt.
Die Fig. 2 ist eine schematische Erläuterung, die die Konstruktion des Plasmids SP-Δ-Val¹² darstellt.
Die Fig. 3 ist eine schematische Erläuterung, die die Konstruktion des Plasmids N2-ras-Val¹² darstellt.
Die Fig. 4 ist eine schematische Erläuterung, die die Konstruktion des Plasmids N2-Δ-ras-Val¹² darstellt.
Die Fig. 5 ist eine schematische Erläuterung von Mucin-cDNA, cloniert in das retrovirale KT-3-Rückgrat.
Die Fig. 6 ist ein Western-Blot, der die Expression von Mucin aus verschiedenen Zelltypen erläutert.
Die Fig. 7 ist eine graphische Darstellung, die die CTL-Antwort für mehrere BC10ME-Clone erläutert.
Die Fig. 8 ist eine FACS-Analyse der Mucinexpression an verschiedenen unterschiedlichen BC10ME-Clonen.
Die Fig. 9 ist ein Balkendiagramm, das die Tumorigenität von zwei B16F10-Clonen erläutert.
Die Fig. 10 ist ein Balkendiagramm, das den Schutz von Mäusen erläutert, denen der B16F10-Mucin-Clon injiziert wurde.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Vor der Darlegung der Erfindung kann es für deren Verständnis hilfreich sein, zuerst Definitionen bestimmter Ausdrücke darzulegen, die anschließend verwendet werden.
Der Ausdruck "veränderte Zellkomponente" bezeichnet Proteine und andere Zellbestandteile, die entweder mit der Tumorigenitätserzeugung einer Zelle assoziiert sind oder mit tumorigenen Zellen im allgemeinen assoziiert sind, aber nicht benötigt werden oder essentiell sind zur Erzeugung einer tumorigenen Zelle. Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung kann vor der Veränderung der zellulären Komponente die zelluläre Komponente für das normale Zellwachstum und die Regulation wesentlich sein. Beispiele umfassen Proteine, die den intrazellulären Proteinabbau, die Transkriptionsregulation, die Kontrolle des Zellzyklus und die Zelle- Zelle-Wechselwirkung regulieren. Nach der Veränderung führen die zellulären Komponenten nicht länger ihre regulatorischen Funktionen aus und können daher ein unkontrolliertes Wachstum erfahren. Repräsentative Beispiele solcher veränderter zellulären Komponenten umfassen ras*. Gemäß anderen Gesichtspunkten der vorliegenden Erfindung können die Zellkomponenten durch Expression in einem Zelltyp verändert werden, der die Zellkomponente normalerweise nicht exprimiert. Beispielsweise erleidet Mucin eine fehlerhafte Glycosylierung nach Expression in anderen Zelltypen als in normalen Brust- oder Pankreasepithel und wird dadurch "verändert". Diese sowie andere Zellkomponenten werden nachstehend ausführlicher beschrieben sowie in den genannten Literaturstellen diskutiert.
"Nichttumorigen" bezeichnet veränderte Zellkomponenten, die keine Zelltransformation verursachen oder Tumorbildung in Nackutäusen induzieren. Repräsentative Assays, die tumorigene Zellkomponenten von nichttumorigenen Zellkomponenten unterscheiden, sind ausführlich nachstehend und in Beispiel 4 beschrieben.
Der Ausdruck "immunogen" bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung veränderte Zellkomponenten, die unter geeigneten Bedingungen eine Immunantwort hervorrufen können. Diese Antwort meß zellvermittelt sein und kann auch eine humorale Antwort umfassen. Repräsentative Assays, die zur Bestimmunsg der Immunogenität verwendet werden können, sind ausführlicher nachstehend und in Beispiel 5 beschrieben.
"Vektorkonstrukt" bezeichnet ein zusammengebautes Molekul, das die Sequenz/Sequenzen oder Gen/Gene von Interesse exprimieren kann. Das Vektorkonstrukt meß Promotorelemente umfassen und umfaßt bevorzugt ein Signal, das die Polyadenylierung steuert. Zusätzlich meß das Vektorkonstrukt eine Sequenz umfassen, die bei Transkription funktionell an die Sequenz/Sequenzen oder das Gen/die Gene von Interesse geknüpft ist und als Translationsinitiationssequenz wirkt. Bevorzugt kann das Vektorkonstrukt auch einen selektierbaren Marker, wie Neo, SV&sub1; Neo, TK, Hygromycin, Phleomycin, Histidinol oder DHFR, sowie eine oder mehrere Restriktionsspaltstelle (n) und eine Translationsterminationssequenz umfassen. Zusätzlich meß, wenn das Vektorkonstrukt in ein Retrovirus eingebracht wird, es ein Verpackungssignal und lange terminale Repeats (LTRs) umfassen, die für das Retrovirus geeignet sind (sofern diese nicht schon vorhanden sind).
Wie vorstehend festgestellt, betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren und Präparate, die zur Zerstörung ausgewählter Tumorzellen geeignet sind. Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das die Stufe dar Verabreichung eines Vektorkonstrukts an ein warmalütiges Tier umfaßt, das die Expression mindestens einer immunogenen nichttumorigenen Form einer veränderten zellulären Komponente, die normalerweise mit den ausgewählten Tumorzellen assoziiert ist, steuert. Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfähren zur Zerstörung von ausgewählten Tumorzellen in einem warmblütigen Tier bereitgestellt, umfassend die Stufen (a) Entnehmen von Zellen aus einem warmalütigen Tier, (b) Verabreichen eines Vektorkonstrukts, das die Expression mindestens einer immunogenen nichttumorigenen Form einer veränderten zellulären Komponente, die normalerweise mit den ausgewählten Tumorzellen assoziiert ist, steuert, an die entnommenen Zellen und (c) Zurückführen der Zellen in ein warmblütiges Tier, so daß die ausgewählten Tumorzellen zerstört werden. Gemäß einem dritten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Einschleusung von anderswo hergestellten Proteinen bereitgestellt, die veränderten zellulären Komponenten entsprechen, mit einem geeigneten Adjuvans an ein warmblütiges Tier, so daß eine Immunantwort erzeugt wird und die ausgewählten Tumorzellen zerstört werden. Unter Verwendung dieser Verfahren kann eine Immunantwort erzeugt werden, die Tumorzellen zerstört, die mit der veränderten Zellkonponente assoziiert sind.
In Kürze, die Fähigkeit, fremde Krankheitserreger zu erkennen und abzuwehren, ist eine wesentliche Eigenschaft der Funktion des Immunsystems. Dieses System kann durch Immunerkennung "selbst" von "nichtselbst" (fremd) unterscheiden, was wesentlich ist, um sicherzustellen, daß die Verteidigungsmechanismen gegen eindringende Teilchen und nicht gegen Wirtsgewebe gerichtet sind. Die Grundmerkmale des Immunsystems sind das Vorhandensein von stark polymorphen Zelloberflächen-Erkennungsstrukturen (Rezeptoren) und Effektormechanismen (Antikörper und cytolytische Zellen) zur Zerstörung eindringender Krankheitserreger.
Cytolytische T-Lymphocyten (CTL) werden normalerweise durch Ausstellen von prozessierten pathogenspezifischen Peptiden zusammen mit MHC- Molekulen zusammen mit Zusatzmolekulen, wie CD3, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1 oder Analoga davon, induziert (z.B. Altmann et al., Nature 338:512, 1989). Andere Gene, die Proteine codieren, die die Stimulierung oder Erkennung von zellvermittelten Antworten verstärken, können in diesem Zusanmenhang ebenfalls verwendet werden. Die antigene Peptidpräsentation zusammen mit MHC (Haupthistokompotibilität) Klasse I-Molekül führt zu einer CDB+-CTL-Produktion. Peptide, die zusammen mit MRC-Klasse II-Molekulen präsentiert werden, führen zur Produktion von Antikörpern, Helferzeilen und B-Gedächthiszellen und können CD4&spplus;-CTLs induzieren. Die Verfahren, die nachstehend ausführlicher beschrieben sind, stellen ein wirksames Mittel zur Induktion potenter Klasse I-beschränkter protektiver und therapeutischer CTL-Antworten sowie humoraler Antworten dar.
Wie vorstehend ausgeführt, bezeichnet der Ausdruck veränderte Zellkonponenten Proteine und andere Zellbestandteile, die entweder mit dem Prozeß der Tumorzellbildung assoziiert sind oder mit tumorigenen Zellen im allgemeinen assoziiert sind, aber zur Erzeugung der Tumorigenese nicht benötigt werden oder nicht essentiell sind. Pepräsentative Beispiele von Veränderungen, die bei Zellkomponenten auftreten, umfassen Punktmutationen, Deletionen und chromosomale Transiokationen. Diese Veränderungen dienen der Erzeugung einer veränderten Zellkomponente, die das Wirtsimmunsystem nicht als "selbst" erkennt und dadurch die neoplastischen oder preneoplastischen Zellen, die die veränderte Zellkomponente enthalten, beseitigt.
Im Rahmen einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Vektorkonstrukt bereitgestellt, das die Fxpression eines nichttumorigenen veränderten ras (ras*)-Gens steuert. In Kürze, das ras*-Gen ist ein attraktives Ziel, weil es ursächlich mit dem neoplastischen Phänotyp verbunden ist und in der Tat für die Induktion und Aufrechterhaltung der Tumorigenese in einem weiten Bereich verschiedener Krebsarten verantwortlich sein kann, wie Pankreaskarzinom, Kolonkarzinom und Lungenadenokarzinom. Zusätzlich findet man ras *-Gene in preneoplastischen Tumoren und daher kann eine Immuninterventionstherapie vor der Detektion eines malignen Tumors angewendet werden.
Normale ras-Gene sind nichttumorigen und kommen überall in Säugetieren vor. Sie sind evolutionär hoch konserviert und scheinen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des Zellzyklus und der normalen Wachstumseigenschaften zu spielen. Das normale ras-Protein ist ein C-Protein, das GTP bindet und GTPaseaktivität besitzt und ist an der Übertragung von Signalen von dem externen Medium in das Zellinnere beteiligt und erlaubt dadurch einer Zelle, auf ihre Umgebung zu antworten. Ras*-Gene andererseits verändern die normale Wachstumsregulation neoplastischer Zellen durch Entkoppeln des Zellverhaltens von der Umgebung und führen so zur unkontrollierten Proliferation neoplastischer Zellen. Eine Mutation in dem ras-Gen gilt als ein frühes Ereignis bei der Karzinogenese (Kumar et al., "Activation of ras Oncogenes Preceding the Onset of Neoplasia", Science 248:1101-1104, 1990), die bei früher Behandlung die Tumorigenese verhindern kann.
Ras *Gene kommen bei einer breiten Vielzahl von Krebsarten vor einschließlich beispielsweise Pankreas-, Kolon- und Lungenadenokarzinome (siehe die nachstehende Tabelle 1). Tabelle 1
Das Spektrum der Mutationen, die in den ras*-Genen auftreten, die in einer Reihe von Krebsarten gefunden werden, ist ziemlich beschränkt. Diese Mutationen verändern die GTPaseaktivität des ras-Proteins, indem sie den normalen Ein/Aus-Schalter in eine konstitutive EIN-Position umwandeln. Tumorigene Mutationen in ras* kommen in erster Linie (in vivo) bei nur 3 Codons vor: 12, 13 und 61; wobei Mutationen an Codon 12 die häufigsten sowohl bei menschlichen als auch bei tierischen Tumoren sind. Die nachstehende Tabelle 2 zeigt das Auftreten von Mutationen in den Codons 12 und 13 für verschiedene menschliche Tumore. (Die normalen Codons für die Positionen 12 und 13 sind GGT bzw. GGC, die beide die Aminosäure Glycin codieren). Tabelle 2 Ungefährer Prozentsatz von spezifischen Mutationen in den Codons 12 und 1§3 von ras*
Die Tabelle 3 faßt die bekannten in vivo Mutationen (Codons 12, 13 und 61) zusammen, die menschliches ras aktivieren, sowie potentielle Mutationen, die eine in vitro transformierende Aktivität besitzen. In Kürze, potentielle Mutationen mit in vitro transformierender Aktivität können durch systematische Substitution einer Nucleinsäure eines normalen Codons produziert werden, um nach Expression eine andere Aminosäure zu produzieren (z.B wird so normales Glycin durch andere Aminosäuren in Position 12 substituiert). Solche Mutationen, von denen gegenwärtig nicht bekannt ist, daß sie bei Menschen oder Tieren vorkommen, können als Basis für ein Anti-Krebs-Immuntherapeutikum dienen, falls ggf. gefunden wird, daß sie in vivo auftreten. Tabelle 3 Aminosäuresubstitutionen, die menschliche ras-Proteine aktivieren
Die vorstehend beschriebenen Veränderungen führen zur Produktion von Proteinen, die eine neue codierende Sequenz/codierende Sequenzen enthalten. Die von dieser Sequenz/Sequenzen codierten Proteine können als Marker tumorigener Zellen verwendet werden, und eine gegen diese neuen Codierungsregionen gerichtete Immunantwort kann zur Zerstörung der tumorigenen Zellen, die die veränderten Sequenzen (ras*) enthalten, verwendet werden.
Ähnliche Mutationen kommen beim Lungenkrebs und in Hirn- und Brusttumoren vor.
Wie vorstehend gemäß weiteren Gesichtspunkten der vorliegenden Erfindung festgestellt, wird ein Vektorkonstrukt bereitgestellt, das bei Expression in Zelltypen außer normalen Brust- oder Pankreasepithel, die Fxpression von Mucin, das falsch glycosyliert ist (Mucin*) steuert. In Kürze, die Mucine sind Glycoproteine mit einem hohen Molekulargewicht, die etwa 50 % Kohienhydrate enthalten. Polymorphes Epithelmucin (PEM) ist ein tumorassoziiertes Mucin (Girling et al., Int. J. Cancer, 43:1072- 1076, 1989), das in Serum von Krebepatienten gefunden wird. Die cDNA-Sequenz in voller Länge wurde identifiziert (Gendler et al., J. Biol. Chem. 265(25):15286-15293, 1990; Lan et al., J. Biol Chem. 265(25):15294- 15299, 1990; und Ligtenberg et al., J. Biol. Chem. 265:5573-5578, 1990). Brusttumore und Pankreastumore exprimieren beide ein Mucin mit einer identischen Core-Sequenz, die ein 20 Aminosäuren langes Tandem-Repeat enthält (Jerome et al., Cancer Res. 51:2908-2916, 1991). CTL-Linien, die gegen Brusttumore entwickelt wurden, zeigen eine Kreuzreaktion mit Pankreastumorzellen und scheinen weiter spezifisch das spezifische 20 Aminosäuren lange Tandem-Repeat zu erkennen (Jerome et al., a.a.O.). Eine Sequenz, die eine oder mehrere der 20 Aminosäure-Tandem-Repeats codiert oder sogar die gesamte Mucin-cDNA, kann durch ein erfindungsgemäßes Vektorkonstrukt exprimiert werden, um eine Immunantwort gegen Tumorzellen zu entwickeln, die fehlerhaft glycosyliertes Mucin exsprimieren. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ausführlicher nachstehend in den Beispielen 6 bis 10 dargestellt.
Sequenzen, die die vorstehend beschriebenen veränderten Zellkopponenten codieren, können aus einer Vielzahl von Quellen erhalten werden. Beispielsweise können Plasmide, die Sequenzen, die veränderte Zellprodukte codieren, enthalten, von einer Hinterlegungsstelle, wie der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland) oder von anderen Handelsquellen, wie Advanced Biotechnologies (Columbia, Maryland) erhalten werden. Repräsentative Beispiele für Plasmide, die einige der vorstehend beschriebenen Sequenzen enthalten, umfassen ATCC Nr. 41000 (enthaltend eine G-nach-T-Mutation im 12. Codon von ras) und ATCC Nr. 41049 (enthaltend eine G-nach-A-Mutation im 12. Codon).
Alternativ können auch Plasmide, die normale zelluläre Komponenten codieren, von Hinterlegungsstellen, wie der ATCC (vgl. beispielsweise ATCC Nr. 41001, die eine Sequenz enthält, die das normale ras-Protein codiert, ATCC Nr. 57103, die abl codiert und ATCC Nrn. 59120 oder 59121, die den bcr-Lokus codieren), erhalten werden und so mutiert werden, daß sie zu der veränderten Zellkomponente passen. Verfähren zur Mutation spezieller Stellen können leicht unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Methoden durchgeführt werden (vgl. Sanbrook et al., a.a.O., 15.3 et seg.). Insbesondere können Punktmututationen normaler Zellkkomponenten, wie ras, leicht durch ortsspezifische Mutagenese des speziellen Codons, beispielsweise der Codons 12, 13 oder 61, erhalten werden.
Auf ännliche Weise können Sequenzen, die normale Zellkomponenten codieren, aus Zellen erhalten werden und durch ortsspezifische Mutagenese mutiert werden, um Sequenzen zu erhalten, die die veränderte Zellkomponente codieren. Solche Sequenzen können leicht erhalten werden, beispielsweise durch Herstellen von Primern auf beiden Seiten der Sequenz und Amplifikation der Sequenz mit PCR (vgl. US-Patent Nrn. 4 683 202, 4 683 195 und 4 800 159) (vgl. auch PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich (Hrg.), Stockton Press, 1989). In Kürze, doppelsträngige DNA wird durch Erhitzen in Anwesenheit einer hitzestabilen Taq-Polymerase, spezifischer DNA-Primer, ATP, CTP, GTP und TTP denaturiert. Doppelsträngige DNA wird produziert, wenn die Synthese vollendet ist. Dieser Zyklus kann viele Male wiederholt werden, was zu einer großen Amplifikation der gewunschten DNA führt.
Sequenzen, die veränderte Zellkomponenten codieren, können auch synthetisiert werden, beispielsweise auf einem Applied Biosystem Inc-DNA- Synthesegerät (z.B. ABI-DNA-Synthesegerät, Modell 392 (Foster City, California)). Solche Sequenzen können unter Bildung eines langen einzelsträngigen DNA-Molekuls ligiert werden. In Kürze, kurze überlappende Antisense-Linker werden mit den Primärsequenzen vermischt, wonach die Primärsequenzen unter Bildung eines langen einzeisträngigen DNA-Moleküls ligiert werden können.
Sobald eine Sequenz, die die veränderte Zellkomponente codiert, erhalten wurde, ist es notwendig, sicherzustellen, daß die Sequenz ein nichttumorigenes Protein codiert. Verschiedene Assays sind bekannt und können leicht durchgeführt werden, und sie bewerten die Tumorigenität einer speziellen Zellkomponente. Repräsentative Assays umfassen einen Rattenfibroblasten-Assay (der ausführlicher nachstehend in Beispiel 4 beschrieben ist), die Tumorbildung an Nacktmäusen oder Patten, die Koloniebildung in Weichagar und die Herstellung von transgenen Tieren, wie transgenen Mäusen.
Die Tumorbildung in Nacktmäusen oder Ratten ist ein besonders wichtiges und empfindliches Verfahren zur Bestimmung der Tumorigenität einer speziellen Zellkomponente. Nacktmäusen fehlt ein funktionelles zelluläres Immunsystem (d.h. sie besitzt keine CTLs) und daher stellen sie ein nützliches in vivo Modell dar, an dem das tumorigene Potential von Zellen getestet werden kann. Normale nichttumorigene Zellen zeigen keine unkontrollierten Wachstumseigenschaften, wenn sie in Nacktmäusen infiziert werden. Jedoch proliferieren transformierte Zellen rasch und erzeugen Tumore in Nacktmäusen. Kurz, in einer Ausführungsform wird das Vektorkonstrukt syngenen Mauszellen, gefolgt von einer Injektion in Nacktmäuse, verabreicht. Die Mäuse werden visuell für eine Zeitspanne von 2 bis 8 Wochen nach Injektion untersucht, um das Tumorwachstum zu bestimmen. Die Mäuse können auch getötet und autopsiert werden, um zu bestimmen, ob Tumore vorhanden sind. (Giovanella et al., J. Natl. Cancer Inst. 48:1531- 1533, 1972; Furesz et al., "Tumorigenicity testing of cell lines considered for production of biologinal drugs," Abnormal Cells, New Products and Risk, Hopps und Petricciani (Hrg.), Tissue Culture Association, 1985; und levenbook et al., J. Biol. Std. 13:135-141, 1985).
Die Tumorigenität kann auch durch Sichtbarmachen einer Koloniebildung in Weichagar (Mamherson und Montagnier, Vir. 23:291-294, 1964) bewertet werden. In Kürze, eine Eigenschaft normaler nichttumorigener Zellen ist die "Kontakthemmung" (d.h. die Zellen stoppen die Proliferation, wenn sie Nachbarzellen berühren). Wenn Zellen in ein halbfestes Agarträgermedium plattiert werden, werden normale Zellen rasch durch den Kontakt gehermmt und stoppen die Proliferation, während die tumorigenen Zellen weiter proliferieren und Kolonien in Weichagar bilden.
Transgene Tiere, wie transgene Mäuse, können auch verwendet werden, um die Tumorigenität einer veränderten Zellkomponente zu bewerten. (Stewart et al., Cell 38:627-637, 1984; Qualfe et al., Cell 48:1023-2034, 1987; und Koike et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5615-5619, 1989). In transgenen Tieren kann das interessierende Gen in allen Geweben des Tieres exprimiert werden. Diese dysregulierte Expression des Transgens kann als Modell für das tumorigene Potential des neu eingeschleusten Gens dienen.
Wenn die veränderte Zellkomponente damit verbunden ist, die Zelle tumorigen zu machen, dann ist es notwendig, die veränderte Zellkomponente nichttumorigen zu machen. Beispielsweise wird gemäß einer Ausführungsform die Sequenz oder das Gen von Interesse, das die veränderte Zellkomponente codiert, verkürzt, um das Genprodukt nicht tumorigen zu machen. Das Gen, das die veränderte Zellkomponente codiert, kann auf eine Vielzahi von Größen verkürzt werden, obwohl es bevorzugt ist, möglichst viel von der veränderten Zellkomponente beizubehalten. Zusätzlich ist es notwendig, daß jede Verkürzung mindestens einige der immunogenen Sequenzen der veränderten Zellkomponente intakt läßt. Alternativ können mehrfache Translationsterminationscodons in das Gen eingeschleust werden, das die veränderte Zellkomponente codiert und zwar stromabwärts der immunogenen Region. Die Insertion von Terminationscodons beendet vorzeitig die Proteinerpression, wodurch die Expression des transformierenden Teils des Proteins verhindert wird.
Gemäß einer Ausführungsform wird das ras*-Gen verkürzt, um das ras*-Protein nichttumorigen zu machen. In Kürze, die carboxylterminalen Aminosäuren von ras* erlauben funktionell die Bindung des Proteins an die Zellmembran. Die Verkürzung dieser Sequenzen macht die veränderte Zellkopponente nichttumorigen. Bevorzugt ist das ras*-Gen bezüglich der Purinringbildung verkürzt, beispielsweise um die Sequenz, die die Aminosäuren 110 codiert. Die ras*-Gensequenz kann so verkürzt sein, daß nur etwa 20 Aminosäuren (einschließlich der veränderten Aminosäure/Aminosäuren) von dem Vektorkonstrukt codiert werden, obwohl bevorzugt so viele Aminosäuren wie möglich exprimiert werden sollten (während die Nichttumorigenität aufrechterhalten wird).
Wie vorstehend festgestellt, muß zur Erzeugung einer geeigneten Immunantwort die veränderte Zellkomponente ebenfalls irr unogen sein. Die Immunogenität einer speziellen Sequenz ist oft schwierig vorherzusagen, obwohl die T-Zellepitope oft eine immunogene amphipathische alpha-Helix- Komponente besitzen. Im allgemeinen ist es jedoch bevorzugt, die Immunogenität in einem Assay zu bestimmen. Repräsentative Assays umfassen einen ELISA, der die Anwesenheit von Antikörpern gegen den neu eingeschleusten Vektor nachweist, sowie Assays, die auf T-Helferzellen testen, wie γ- Interferon-Assays, IL-2-Produktionsassays und Proliferationsassays. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der Immunogenität ist der CTL-Assay, der nachstehend in Beispiel 5 ausführlich beschrieben ist.
Wie vorstehend festgestellt&sub1; können im Rahmen weiterer Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung nehrere verschiedene veränderte Zellkopponenten gleichzeitig exprimiert werden, um ein allgemeines Antikrebetherapeutikum zu bilden. Im allgemeinen ist es einem Durchachnittsfachmann offensichtlich, daß eine Vielzahl von Kombinationen hergestellt werden kann. Im Rahmen bevorzugter Ausführungsformen kann dieses Therapeutikum einem speziellen Krebstyp angepaßt werden. Beispielsweise besitzen nahezu alle Kolonkrebsarten Mutationen in den ras-, p53-, DCC-APC- oder MCC-Genen. Ein Vektorkonstrukt, das eine Anzahl dieser veränderten Zellkopponenten gleichzeitig esprimiert, kann einem Patienten mit Kolonkrebs verabreicht werden, um alle möglichen Mutationen zu behandeln. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um andere Krebsarten zu behandeln. So kann ein Vektorkonstrukt, das gleichzeitig Mucin*, ras*, neu und p53* exprimiert, zur Behandlung von Brustkrebs verwendet werden.
Zusätzlich können die erfindungsgemäßen veränderten Zellkomponenten auch mit einem Lynphokin und/oder Immunmodulator gleichzeitig exprimiert werden. Repräsentative Beispiele für Lynphokine umfassen den Tumornecrosefaktor IL-1, TL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-S, IL-9, IL-10, IL-11, GM-CSF, CSF-1 und G-CSF. Repräsentative Beispiele für Immunmodulatoren umfassen CD3, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, β-2-Mikroglobulin, Chaperone, α-Interferon und γ-Interferon und den Haupthistokompotibilitätskomplex (MHC).
Sobald eine spezielle veränderte Zellkomponente ausgewählt wurde, wird sie in ein Vektorkonstrukt gegeben, das dessen Expression steuert. Erfindungsgemäße Vektorkonstrukte können als Alternative zur Chirurgie verwendet werden oder können in Kombination mit chirurgischen oder begleitenden Modalitäten verwendet werden und können sich postchirurgisch als effektiver erweisen als Chemotherapie oder Radiotherapie, da eine spezifische Cytotoxizität gegen die verbleibenden Tumorzellen hervorgerufen wird. Die Konstruktion von retroviralen Vektorkonstrukten ist ausführlicher nachstehend in Beispiel 2 beschrieben. Zusätzlich ist die Konstruktion weiterer Vektorkonstrukte sowie die Verabreichung von retroviralen Konstrukten durch direkte Injektion ausführlicher in einer Anmeldung mit dem Titel "Recombinant Retroviruses" (WD91/02805, eingereicht am 21. September 1990) beschrieben. Auf diese Anmeldung wird hiermit in vollem Umfang Bezug genommen.
Virale Träger können ein homologer, nichtpathogener (defekter) replikationskompetenter Virus (z.B. Overhaugh et al., Science 239:906-910, 1988) sein und induzieren dennoch zelluläre Immunantworten einschließlich CTL.
Verschiedene Verfahren können verwendet werden, um das Vektorkonstrukt oder Nucleinsäuren, die die veränderte Zellkomponente codieren, direkt Patienten zu verabreichen einschließlich beispielsweise Transfektion durch Methoden, bei denen verschiedene physikalische Verfahren verwendet werden, wie Lipofektion (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84:7413-7417, 1989), direkte DNA-Injektion (Acsadi et al., Nature 352:815-818, 1991); Mikroprojektilbeschuß (Williams et al., PNAS 88:2726- 2730, 1991); Liposome (Wang et al., PNAS, 84:7851-7855, 1987); CaPO&sub4; (Dubensky et al., PNAS 81:7529-7533, 1984) oder DNA-Ligand (Wu et al., J. of Biol. Chem., 264:16985-16987, 1989).
Zusätzlich kann eine CTL-Antwort auch durch die Verabreichung eines Bakteriums erzeugt werden, das die veränderte Zellkomponente (n) auf seiner Zelloberfläche exprimiert. Repräsentative Beispiele umfassen BCG (Stover, Nature 351:456-458, 1991) und Salmenella (Newton et al., Science 244:70-72, 1989).
Zellvermittelte und humorale Antworten können auch gegen Tumore durch die parenterale Verabreichung der veränderten Zellkomponenten als solche induziert werden. In Kürze, veränderte Zellkomponenten (ras*) oder Peptide, die relevante Epitope tragen, können auf eine Reihe bekannter Arten produziert werden (Ellis und Gerety, J. Med. Virol 31:54-58, 1990) umfassen chemische Synthese (Bergot et al., Applied Biosysteme Peptide Synthesizer User Bulletin Nr. 16, 1986, Applied Biosysteme, Foster City California) und DNA-Expression in rekombinanten Systemen, wie dem insektenabgeleiteten Baculovirussystem (Doerfler, Gurrent Topics in Immunology 131:51-68, 1986), säugerabgeleiteten Systemen (wie CHO-Zellen) (Berman et al., J. Virol. 63:3489-3498, 1989), hefeabgeleitete Systeme (McAleer et al., Nature 307:178-180) und prokaryotiscne Systeme (Burrel et al., Nature 279:43-47, 1979).
Die Proteine oder Peptide können mit herkömmlichen Mitteln gereinigt werden und durch eine Reihe von Methoden abgegeben werden, um zellvermittelte Antworten einschließlich Klasse I- und Klasse II-Antworten zu induzieren. Diese Methoden umfassen die Verwendung von Adjuvantien verschiedener Typen, wie ISCOMS (Morein, Immunology Letters 25:281-284, 1990; Takahashi et al., Nature 344:873-875m, 1990), Liposome (Gergoriadis et al., Vaccine 5:145-151, 1987), Lipidkonjugation (Deres et al., Nature 342:561-564, 1989), Beschichtung des Peptids auf autologe Zellen (Staerz et al., Nature 329:449-451, 1987), Pinosone (Moore et al., Cell 54:777- 785, 1988), Aluminium, komplettes oder inkomplettes Freundsches Adjuvans (Hart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9448-9452, 1991) oder verschiedene andere nützliche Adjuvantien (z.B. Allison und Byars, Vaccines 87:56-59, Cold Spring Harbor Laboratory, 1987), die eine effektive parenterale Verabreichung erlauben.
Alternativ können die veränderten Zellkomponenten entsprechenden Proteine oder Peptide für die orale Verabreichung zur Anregung der Immunantwort in magensaftresistenten Kapseln (Channock et al., J. Amer. Med. Assoc. 195:445-452, 1966) oder andere geeignete Träger, wie Poly(DL- lactidcoglycolat)-Kügelchen (Eldridge et al. in Proceedings of the International Conference on Advances in AIDS Vaccine Development, DAIDS, NIAID U.S. Dept. of Health & Human Services, 1991) für die Freisetzung im Magen-Darm-Trakt verkapselt werden.
Zusätzlich können die Proteine oder Peptide so manipuliert werden, daß sie immunogener werden (z.B. durch Anfügen von Aminosäuresequenzen, die den T-Helferepitopen entsprechen), um die zelluläre Aufnahme zu fördem, indem hydrophobe Reste an spezielle Strukturen angefügt werden oder eine beliebige Kombination davon (Hart et al., PNAS 88:9448-9452, 1991; Milich et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:1610-1614, 1988; Willis, Nature 340:323-324, 1989; Griffiths et al., J. Virol. 65:450-456, 1991).
Gemäß einem Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur selektiven Zerstörung von Tumorzellen in einem warmblütigen Tier bereitgestellt, umfassend die Stufen (a) Entnahme von Zellen aus einem warmblütigen Tier, (b) Verabreichen eines Vektorkonstrukts an die entnommenen Zellen, das die Expression mindestens einer immunogenen, nichttumorigenen Form einer veränderten Zellkomponente, die normalerweise mit den ausgewählten Tumorzellen assoziiert ist, steuert und (c) Zurückführen der Zellen in ein warmblütiges Tier, so daß die ausgewählten Tumorzellen zerstört werden. Erfindungsgemäß ist zu verstehen, daß die entnommenen Zellen nicht notwendigerweise in das gleiche Tier zurückgeführt werden müssen, sondern verwendet werden können, um ausgewählte Tumorzellen bei einem anderen Tier zu zerstören. In diesem Fall ist es allgemein bevorzugt, bezüglich der Histokompatibilität passende Tiere zu haben (obwohl nicht immer, vgl. z . B. Yamamoto et al.,"Efficacy of Epperimental FIV Vaccines", ist International Conference of FIV Researchers, University of California at Davis, September 1991). Zusätzlich ist zu verstehen, daß eine Vielzahl von Zellen (Zielzellen) erfindungsgemäß verwendet werden kann, einschließlich menschlicher Zellen, Makakenzellen, Hundezellen, Pattenzellen und Mauszellen.
Die Zellen können an einer Vielzahl von Orten einschließlich beispielsweise der Haut (Hautfibroblasten) und des Blutes (periphere Blutleukocyten) entnommen werden. Ggf. können Fraktionen von Zellen, wie eine T-Zelluntergruppe oder Stammzellen, dem Blut ebenfalls zur Verabreichung des Vektorkonstrukts entnommen werden (z.B. PCT WO91/16116, eine Anmeldung mit dem Titel "Immunoselection Device and Method"). Vektorkonstrukte können dann den entnommenen Zellen unter Verwendung einer beliebigen der vorstehend beschriebenen Techniken verabreicht werden, gefolgt von der Zurückführung der Zellen in das warmblütige Tier.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Vektorkonstrukt bereitgestellt, das die Expression einer tumorigenen Zellkomponente und eines Prodrug-Aktivators steuert. Beispielsweise werden qemäß einer Ausführungsform Gene für eine veränderte Zellkomponente und einem Prodrug-Aktivator, wie die Herpes-Simplex-Virus-Thymidin-Kinase (HSVTK) in das Vektorkonstrukt eingeschleust. Dieses Vektorkonstrukt wird dann den Zellen in Gegenwart einer exogenen Substanz, wie Acyclovir, die Zellen, die HSVTK exprimieren, abtötet, verabreicht. Wie einem Fachmann auf dem Gebiet leicht klar ist, kann dieses Vektorkonstrukt auch verwendet werden, um sicherzustellen, daß selbst, wenn die abgegebenen Gene zu einem tumorigenen Ereignis in den Zellen beitragen, die den Vektor aufgenommen haben, diese Zellen, beispielsweise durch Anyclovir, getötet werden können.
Vor der Verabreichung des Vektorkonstrukts kann es zuerst wunschenswert sein zu bestimmen, welche veränderte Zellkomponente(n) mit den Tumorzellen assoziiert ist/sind. Dies kann auf eine Vielzahl von Arten bestimmt werden. Beispielsweise können Assays auf ELISA-Basis verwendet werden, um spezifische Tumormarker oder veränderte Zellkomponenten nachzuweisen.
Alternativ kann die Anwesenheit einer veränderten Zellkomponente auch auf genetischer Ebene bestimmt werden. Beispielsweise können DNA oder cDNA direkt aus einem Tumor erhalten werden und unter hybridisierenden Bedingungen mit einer für die veränderte Zellkomponente spezifischen markierten Sonde in Kontakt gebracht werden. Wenn die Anzahl der Tumorzellen gering ist, kann die PCR (wie vorstehend beschrieben) verwendet werden, um ausgewählte Nudeinsäureregionen zu amplifizieren, die dann auf ähhiiche Weise der Hybridisierung mit der markierten Sonde unterworfen werden können. Die Hybridisierungs sonde sollte unter Bedingungen ausgewählt und verwendet werden, die die spezifische Bindung an die Sequenz erlauben, die die veränderte Zellkomponente codiert (vgl. Orkin et al., J. Clin. Invest. 71:775-779, 1983). Zusätzlich sollte klar sein, daß ein Fachann auf dem Gebiet leicht andere Nachweisverfahren auf native oder anplifizierte Nucleinsäuren anwenden kann, einschließlich beispielsweise der Verwendung der RNase A-Fehlpaarungs-Spaltungsmethode (Lobez- Galindez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3522-3526, 1988).
Im Rahmen bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Präparate bereitgestellt, die einen der vorstehend beschriebenen rekombinanten Viren umfassen, wie ein rekombinantes Retrovirus oder ein rekombinantes Virus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus adenoassoziiertem Virus, kanarischem Pockenvirus, Adenovirus und Pockenvirus, oder ein rekombinanter DNA-Vektor mit oder ohne befestigte Liganden zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel. Das Präparat kann entweder als eine flüssige Lösung oder als feste Form (z.B. lyophilisiert) hergestellt werden, die in einer Lösung vor der Verabreichung suspendiert wird. Zusätzlich kann das Präparat mit geeigneten Trägern oder Verdünnungsmitteln entweder zur Injektion, oralen oder rektalen Verabreichung hergestellt werden. Im Rahmen bestimmter erfindungsgemäßer Ausführungsformen können die Präparate so hergestellt werden, daß sie direkt in einen ausgewählten Tumor injiziert werden können.
Pharmazeutisch verträgliche Träger oder Verdünnungsmittel sind für den Empfänger in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch. Repräsentative Beispiele für Träger oder Verdünnungsmittel für Injektionslösungen umfassen Wasser, isotone Kochsalzlösungen, die bevorzugt bei einem physiologischen pH-Wert gepuffert sind (beispielsweise phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder Tris-gepufferte Kochsalzlösung), Mannit, Dextrose, Glycerin und Ethanol, sowie Polypeptide oder Proteine, wie menschliches Serumalbumin. Ein besonders bevorzugtes Präparat umfaßt einen Vektor oder ein rekombinantes Virus in 10 mg/ml Mannit, 1 mg/ml HSA, 20 mM Tris, pH = 7,2, und 150 mM NaCl. In diesem Fall kann, da der rekombinante Vektor etwa 1 µg des Materials darstellt, er weniger als 1 % des Materials mit hohem Molekulargewicht und weniger als 1/100.000 des gesamten Materials (einschließlich Wasser) ausmachen. Das Präparat ist bei -70ºC für mindestens sechs Monate stabil. Das Präparat kann intravenös (i.v.) oder subkutan (s.c.) injiziert werden, obwohl es allgemein bevorzugt ist, es intramuskulär (i.m.) zu injizieren. Die Einzeldosen, die normalerweise verwendet werden, betragen 10&sup7; bis 10&sup8; KBE (koloniebildende Einheiten von Neomycinresistenz, titriert auf HT1080-Zellen). Diese werden in ein- oder zweiwöchigen Intervallen für anfänglich drei oder vier Dosen verabreicht. Anschließende Auffrischungsinjektionen können als eine oder zwei Dosen nach 6 bis 12 Monaten und anschließend jährlich verabreicht werden.
Die oralen Formulierungen können auch mit Trägern oder Verdünnungsmitteln, wie Cellulose, Lactose, Mannit, Poly(DL-lactidcoglycolat)-Kügelchen und/oder Kohlenhydraten, wie Stärke, verwendet werden. Das Präparat kann die Form von beispielsweise einer Tablette, eines Gels, einer Kapsel, einer Pille, einer Lösung oder Suspension annehmen und kann zusätzlich für die verzögerte Freisetzung formuliert werden. Für die rektale Verabreichung können Präparate eines Suppositoriums mit herkömmlichen Trägern, wie Polyalkylenglucose oder einem Triglycerid, hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung und nicht der Beschränkung.

Beispiele

Beispiel 1

Isolierung von ras*¹²

Ein 700 Basenpaar HindIII-Fragment, das die vollständige T24- ras*¹²-codierende Region enthält, wird aus dem Plasmid HRAS1 (ATCC Nr. 41000) erhalten und in die HindIII-Spaltstelle von PSP73 (Promega, Madison, Wisconsin) ligiert. Das Plasmid wird als SP-Val¹²(100) (siehe Fig. 1) bezeichnet. Plasmide, die ras*¹² enthalten, können auch aus anderen Quellen, wie Advanced Biotechnologies (Columbia, Maryland), erhalten werden.
Um die richtige Orientierung von ras*¹² in pSP73 zu bestimmen, werden die Clone mit PvuII gespalten, und ein Clon, der ein 100 bp Spaltstück enthält, wird ausgewählt. Dieser Clon wird als SP-Val¹²(100) bezeichnet.
E. coli (DH5 alpha) (Bethesda Research labs, Gaithersburg, Maryland) wird mit dem SP-Val¹²-Vektorkonstrukt transformiert und vermehrt, um eine Menge an Plasmid-DNA zu erzeugen. Das Plasmid wird dann isoliert und gereinigt, im wesentlichen wie von Birnboim et al. (Nuc. Acid Res. 7:1513, 1979); vgl. auch "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook et al. (Hrg.), Cold Spring Harbor Press, S. 1.25 et seg., 1989) beschrieben.

Beispiel 2

Herstellung eines Δras¹²* enthaltenden Vektorkonstrukts

A. Herstellung von Δras¹²*

Ein NcoI-SmaI-Fragment aus SP-Val¹²(100) wird durch Restriktionsspaltung (siehe Fig. 2) entfernt. Ein XbaI-linker (New England BioLabs, Beverly, Massachusetts), der ein universelles Stoppcodon in allen drei Leserastern enthält, wird 3' zu der ras-codierenden Sequenz insertiert. Dieses Verfahren bildet eine Poly-XbaI-Region, die durch Restriktionsspaltung an den XbaI-Stellen entfernt werden kann, gefolgt von einer Ligierung. Diese Mutante wird als SP-Δ-Val¹² bezeichnet und exprimiert ein nichtaktives verkurztes ras (ras*) -Protein.

B. Insertion von Δras¹²* in das retrovirale Rückgrat

N2-ras-neo und N2-ras*-neo retrovirale Vektoren werden im wesentlichen, wie in USSN 07/586 603 beschrieben, konstruiert. In Kürze, dieses gentechnisch erzeugte rekombinante Maus-N2-Petrovirus enthält den frühen SV40-Promotor und das Neanycinphosphotransferasegen, um die Isolierung der infizierten und transfizierten Zellinien zu erleichtern. Das N2 Mo MLV gag ATG-Initiationscodon wird auch zu ATT durch ortsspezifische in vitro Mutagenese verändert, um den retroviralen Titer zu erhöhen und die Expressionshöhe der transduzierten Gene zu verstärken.
Ein 350 bp großes XhoI-ClaI-Fragment aus SP-Δ-Val¹²(100) wird dann in den retroviralen Vektor ligiert. Dieses Konstrukt wurde als N2-Δ-ras*- Val¹² bezeichnet (siehe Fig. 4).
Die SP-Val¹²(100)-cDNA in voller Länge wird in ähnlicher Weise an den als positive Kontrolle für die Transformation zu verwendenden retroviralen Vektor ligiert. Dieses Konstrukt wird als N2-ras-Val¹² (siehe Fig. 3) bezeichnet.

Beispiel 3

Transfektion von Säugerzellen

Die murinen Fibroblastenzellinien BC10ME (BC mit dem MHC I-Typ H-2d) und L33 (auch H-2d) (erhalten von Gunther Dennert, University of Southern California) und die menschliche Fibroblastenzellinie HT1080 (HT) (ATCC Nr. CCL 121) werden in DMEM (Irvine Scientific, Santa Ana, California), enthaltend 10 % fötales Rinderserum (Gemini, Calabasas, California), gezüchtet. BC- oder HT-Zellen werden mit den vorstehend beschriebenen Vektorkonstrukten transduziert oder trans fiziert. BC-ras*- Zellen werden zur Immunisierung von Mäusen verwendet.
Das rekombinante Retrovirus wird nach dem CaPO&sub4;-Verfahren in CA- Zellen (eine anphotrope Verpackungslinie), hergestellt aus der Hundezelllinie CF2; (siehe USSN 07/586 603) transfiziert. Die Zellen werden auf G418 selektiert, cloniert und in mit 10 % fötalem Rinderserum supplementiertem DMEM expandiert. Der virale Überstand aus dem Clon mit dem höchsten Titer wird mit einem 0,45 µm-Filter filtriert und bei -70ºC gelagert.
Alternativ können höhere Titer erhalten werden, wenn retrovirale Vektoren in die Verpackungszellinien (PCLs) durch Infektion (Miller et al., Somat. Cell Mol. Genet. 12:175-183, 1986) eingeschleust werden. In Kürze, obwohl amphotrope MLV-Vektoren bekanntlich PCLs infizieren, können sie gegen die Infektion solcher Zellinien infolge der Expression von Ampho-env blockiert werden ("virale Interferenz"). Um dieses Problem zu überwinden, können Vektoren, die andere virale Umhüllungen (wie z.B. xenotropes env oder VSG-G-Protein, die an andere Zellrezeptoren als den Ampho-Rezeptor binden) enthalten, erzeugt werden. In Kürze, 10 µg der Vektor-DNA von Interesse werden mit 10 µg DNA, die entweder Xeno-env (pCMVxeno, siehe vorstehend) oder einen VSV-G-Proteinexpressionsvektor, MLP-G, exprimieren, in einer Zellinie, die hohe MoMLV-gag/pol-Spiegel, wie 2 bis 3 Zellen, exprimiert, kotransfiziert. Der so erhaltene Vektor, der das xenotrope env bzw. VSV-G-Protein enthält, kann dann vorübergehend in den kotransfizierten Zellen produziert werden, und nach zwei Tagen können zellfreie Überstände dem potentiellen PCLs zugesetzt werden Die vektorinfizierten Zellen können durch Selektion in G418 identifiziert werden.
Die Maus-Fibroblastenzellinien BC10M und L33 können mit der retroviralen Vektor-DNA unter Verwendung der CaPO&sub4;-Technik transfiziert werden, und Clone werden unter Verwendung von 800 µg/ml G418 für 8 Tage ausgewählt. Die Zellen können dann lysiert werden und auf ras* -Proteinexpression unter Verwendung von Western-Blots (vgl. allgemein Sanbrook et al., 18.60 et seq.) analysiert werden.

Beispiel 4

Transformations-(Tumorigenitäts)-Assay

Ratte-2-Zellen (ATCC Nr. CRL 1764) werden in nach Dulbecco-Vogt- modifizierten Fagle-Medium, das mit 10 % fötalem Rinderserum supplementiert ist, gezüchtet. Die Ratte-2-Zellen werden in einer Konzentration von 10&sup6; Zellen pro 5 cm Schale einen Tag vor der Transfektion plattiert. Die Zellen werden mit 0,1 bis 110 µg DNA-Konstrukt, wie vorstehend beschrieben (Graham und Van Der Eb, 1973; Corsaro und Pearson, 1981) transfiziert. Am nächsten Tag werden die Zellen mit Trypsin behandelt und in 5 cm Schalen geimpft und alle drei Tage anschließend mit Medium, das 5 % fötales Rinderserum plus 2 x 10&supmin;&sup6; M Dexamethason enthält, beimoft (dies verstärkt den Kontrast zwischen der Morphologie zwischen einer transformierten und nichttransformierten Ratte-2-Zelle). Die transformierten Foci sind nach etwa einer Woche sichtbar. Die Platten werden angefärbt und die Foci werden nach etwa drei Wochen gezählt (Miller et al., Cell 36:51, 1984).
Mit rekombinanten ras*-Retroviren transfizierte Zellen bildeten transformierte Foci, wohingegen die mit den rekombinanten Δras* -Retroviren transfizierten dies nicht taten.

Beispiel 5

Cytotoxizitätsassay

6 bis 8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse /Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, Indiana) erhalten einmal eine intraperitoneale (i.p.) Injektion mit 5 X 10&sup6; bestrahlten (10.000 Pad, 60ºC) vektortransfizierten Zellen (z.B. BC-ras*). Die Tiere werden 7 Tage später getötet und die Milzzellen (3 x 10&sup6;/ml) werden in vitro mit bestrahlten syngenen transduzierten Zellen (6 x 10&sup4;/ml) in Kolben (T-25, Corning, Corning, New York) gezüchtet. Das Kulturmedium besteht aus RFMI 1640, hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (5 %, Hydone, Logan, Utah), Natriumpyruvat (1 mM), Gentamicin (50 µg/ml) und 2-Mercaptoethanol (10&supmin;&sup5; M, Sigma Chemical, St. Louis, Missouri). Die Effektorzellen werden 4 bis 7 Tage später gewonnen und unter Verwendung verschiedener Effektor: Zielzellverhältnisse in Miktrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Corning, Corning, New York) in einem Standard 4 bis 6 h-Assay getestet. Bei dem Assay werden Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4;-markierte (Amersham, Arlington Heights, Illinois) (100 µCi, 1 h bei 37ºC) Zielzellen (1 x 10&sup4; Zellen/Vertiefung) in einem Endvolumen von 200 µl verwendet. Nach der Inkubation werden 100 µl Kulturmedlum entfernt und in einem Beckman-Gamma-Spektrometer analysiert. Die spontane Freisetzung (SR) wird als CPM aus den Zielzellen plus Medium bestimnt, und die maximale Freisetzung (MR) wird als CPM aus den Zielzellen plus 1 M HCL bestimmt. Die prozentuale Lyse der Zielzellen wird berechnet als: [(Effektorzelle + Ziel-CPM) - (Sk)/(MR) - (SR)] x 100. Die Werte für die spontane Freisetzung der Zielzellen betragen typischerweise 10 % bis 20 % der MR.

Beispiel 6

Herstellung der murinen Provektor-DNA

1. Clonierung des Mücingens in KT-3

Um Immuntherapeutika, basierend auf der veränderten Form von Mucin, zu entwickeln, können die folgenden Versuche vorgenommen werden, um zu zeigen, daß das Gen für die cDNA von polymorphem epithelialem Mucin ("PEM") in verschiedene Zelltynen verpackt, abgegeben und exprimiert werden kann. In Kürze, Mucin-cDNA wird von Dr. Joyce Taylor-Papadimitriou beim Imperial Cancer Research Fund (ICRF) in dem SK&spplus;-Vektor (Stratagene, San Diego, Ca.) erhalten. Das Mücin-cDNA-Fragment, das die volle codierende Sequenz enthält, dem aber die Polyadenylierungsstelle fehlt, wird durch Spaltung mit XmnI (Nucleotid 38) und BamHI (Nucleotid 1766) (EC 3.1.21.4, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indians) isoliert. Diese Zählung entspricht der veröffentlichten Sequenz mit einer einzelnen hypothetischen Tandemwiederholung, während der tatsächliche cDNA-Clon etwa 32 Tandemwiederholungen enthält. Das 4,0 Kilobasen (kb) XmnI-BamHI-MucincDNA-Fragment wird unter Verwendung von Klenow (EC 2.7.7.7, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) glattendig gemacht und in ein replikationsdefektes MoMuLV-KT-3-retrovirales Rückgrat, das ein Neomycinresistenzgen enthält, cloniert (siehe Fig. 5). Das retrovirale Rückgrat wird mit XhoI und ClaI gespalten, unter Verwendung von Klenow glattendig gemacht, und die Enden werden mit Kälberdarmphosphatase (CIP EC 3.1.3.1, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) dephosphoryliert.
Der ligierte Vektor wird in bakterielle Zellen transformiert, und die Orientierung der cDNA wird unter Verwendung des Restriktionsenzyms sowie der Sequenzierung der 5'- und 3'-Verbindungen bestimmt. Zwei Clone werden ausgewählt, einer mit PEM in der Sinnorientierung und der andere mit PEM in der Antisinnorientierung.

2. Transduktion der Verpackungszellinie CA

Eine Zellinfe (CA) für die Verpackung von replikationsdefekten Vektoren, basierend auf der CF-2-Hundezellinie (ATCC CRL 6574) kann im wesentlichen, wie in der Patentanmeldung WO 92/05266 beschrieben, hergestellt werden. In Kürze, die CA-Verpackungszellinie exprimiert die amphotropen MoMuLV-Umhüllungs- und gag-pol-Proteine, die von zwei verschiedenen Plasmiden, die Nicht-LTR-Promotoren besitzen, codiert werden. Zusätzlich kann auch eine MoMuLV-gag-pol-exprimierende menschliche Zellinie 293 (abgeleitet von ATCC Nr. CRL 1573), wie in der Patentanmeldung WO 92/05266 beschrieben, etabliert werden. Dies ist eine vielseitige Teilverpackungszellinie, in der verschiedene Umhüllungsspezifitäten durch Kotransfektion eines Umhüllungsexpressionsvektors, in diesem Fall das in der vorstehenden Anmeldung beschriebene VSVG-protein, mit dem replikationsdefekten retroviralen Vektor, der die Mucin-cDNA enthält, exprimiert werden kann.
Der rekombinante retrovirale Vektor (mit der Bezeichnung "PFM-Vektort'), der, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wird, kann dann verwendet werden, um Zellinien, wie L33, BC10ME und CA, zu transduzieren.

Beispiel 7

Transduktion der Maus-Tumorlinie

L33-, BC10ME- und CA-Zellinien werden mit dem PEM-Vektor, der die Mucin-cDNA enthält, in eine Infektionsmultiplizität ("M.O.I.") zwischen 1 bis 10 in Gegenwart von Polybrene (4 mg/ml, 1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylen, Polymethobromid, Sigma, St. Inuis, Missouri) transduziert. Die G418-Selektion wird 24 h nach der Infektion initiiert. Zelltypen, die PEM exprimieren sollten, werden lysiert und durch Western-Blots unter Verwendung von HMF-1 (ein monoclonaler menschlicher Milchfettglobulin-Antikörper), der das sowohl von AGM als auch normalem Mucin exprimierte Epitop erkennt, analysiert. Die HMFG-1-, HMFG-2- und SM3-Antikörper wurden von Dr. Joyce Taylor-Papadimitriou am ICRF erhalten. Die Mucinexpression wird in allen drei Zellinien mit einer Überlegenheit gegenüber Formen mit niedrigem Molekulargewicht, verglichen mit der menschlichen Brustkrebszellinie MCF-7 (ATCC HTB-22) (siehe Fig. 6), nachgewiesen. Das elektrophoretische Muster führte zu einem Schmierbereich von Formen mit verschiedenem Molekulargewicht, vermutlich infolge der Heterogenität der Glycosylierung. Die Daten legen nahe, daß das Mucinprotein in diesen Zelltypen überwiegend unterglycosyliert ist und daher höchstwahrscheinlich das AGM-Epitop exprimiert, das von dem SM3-Antikörper erkannt wird.

Beispiel 8

BC10ME-Assays

Um zu bestimmen, ob retrovirale Vektoren, die die Expression der veränderten Formen von Mucin steuern, eine CTL-Antwort hervorrufen können, wurden BALB/C-Mäusen entweder BC10ME-Zellen oder einer der zwei anderen BC10ME-Clone, die AGM exprimieren, injiziert. Diesen Mäusen wurde einmal intraperitoneal (i.p.) 1,0 x 10&sup7; bestrahlte (10.000 Rad) vektortransduzierte Zellen injiziert. Die Tiere wurden 7 bis 14 Tage später getötet, und die gewonnenen Splenocyten (3.000.000 Zellen/ml) wurden mit bestrahlten mucinvektortransduzierten Zellen (entweder BC10ME, BC10ME-AGM #6 bzw. BC10ME-AGM #10 in einer Konzentration von 60.000 Zellen/ml) gezüchtet. Das Kulturmedlum bestand aus RPMI 1640 (Irvine Scientific, Calif.), supplementiert mit 5 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS, Hydone Logan, Utah), 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM HEPES, pH = 7,4, 50 µg/ml Gentimicin (Sigma, St. Louis, Missouri) und 1,0 x 10&supmin;&sup5; 2-Mercaptoethanol. Nach 4 bis 7 Tagen werden diese in vitro restimlilierten Splenocyten geerntet und unter Verwendung verschiedener Effektorzielzellverhältnisse in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einem Standard-4-6 h-Assay getestet. Bei dem Assay wurden radioaktive chrommarkierte (CR&sup5;¹) Zielzellen (10.000 Zellen/Vertiefung) in einem Endvolumen von 200 µl verwendet. Nach der Inkubation wurden 100 µl Überstand den verschiedenen Vertiefungen entnommen und in einem Beckman-Ganme-Zähler (Beckman, Calif.) analysiert. Die prozentuale Zielzeillyse wurde als [(Effektorzelle + Ziel-CPM) - (SR)/(MR) - SR] x 100 berechnet. Nur einer der AGM-exprimierenden Clone (BC10ME #6) erzeugte eine CTL-Antwort (siehe Fig. 7).
Um zu verstehen, warum die CTL-Antwort sich für die zwei AGM-Clone unterscheidet, ist es notwendig, die Expeessionshöhe von AGM auf der Oberfläche dieser jeweiligen Clone zu bestimmen. Einzelzellsuspensionen von AGM #6 und AGM #10 werden mit monodonalen Maus-HMF-2 oder S5M3-Antikörpern inkubiert, gewaschen und mit einem FITC-konjugierten Kaninchen- Anti-Maus-Antikörper inkubiert und dann in einem fluoreszenzaktivierten Zellsorter (FACS) analysiert. Die FACS-Analyse von AGM #10 bestätigte die Expression von AGM auf der Zelloberfläche. Der Clon AGM #6, der die CTL- Antwort erzeugte, zeigte, daß es keine Oberflächenexpression von AGM gab (siehe Fig. 8). Jedoch bestätigten Daten aus einer vorherigen Western- Blot-Analyse, daß der Clon AGM #6 AGM intrazellulär exprimierte. So legt die Indüktion der CTL-Antwort die Möglichkeit nahe, daß die Maus-T-Zellen AGM im Zusammenhang von Selbst-MHC-Molekülen erkennen können und daß große Mengen AGM bei Expression auf der Oberfläche die Präsentation des Peptids durch den MHC blockieren können.

Beispiel 9

Wirkung von PEM auf die Tumorigenese

Der folgende Versuch kann durchgeführt werden, um zu testen, ob Mucin die Tumorbildung hemmen kann. In Kürze, die B16F10-Zellinie wurde mit replikationsdefekten Virusteilchen, die Mucin-cDNA in einer M.O.I. von 1 bis 10 enthielten, in Gegenwart von Polybrene (4 mg/ml) transduziert. Die G418-Selektion wurde 24 h später begonnen. Den Mäusen wurden 400.000 Zellen entweder des Stamms B16F10 oder eines der zwei B16F10- Clone, die Mucin exprimieren, intravenös injiziert. Es wurde gezeigt, daß einer der Clone geringfügig weniger tumorigen war als entweder der Stamm B16F10 oder der andere mucinexprimierende Clon. Dies ist vermutlich auf die erhöhte Immunogenität, die durch die Oberflächenexpression einer der Formen von Mucin erzeugt wird, zurückzuführen (Fig. 9).

Beispiel 10

Impfung von Mäusen gegen PFM-exprimierende Tumore durch Injektion des PEM-Vektors

Um zu testen, ob retrovirale Vektoren, die die Expression veränderter Mucinformen steuern, als Impfstoff funktionieren können, wurden Mäusen mucincodierende retrovirale Vektoren injiziert, und dann wurden sie mit B16F10 oder B16F10-Zellen, die Mucin exprimieren, stimuliert. In Kürze, vorbehandelten C571B1/6-Mäusen wurden intraperitoneal 1,8 x 10&sup6; Virusteilchen in einem 2 ml Volumen in einem Zweidosisschema mit einer Woche zwischen jeder Dosis injiziert. Zwei Wochen nach der zweiten Vektordosis werden die Mäuse intravenös mit 400.000 Zellen mit entweder B16F10 oder B16F10 mit Mucinexpression stimuliert. Wie die Daten in Fig. 10 zeigen, schützte die Immunisierung mit dem Mucinvektor vor dem anschließenden Wachstum der mucinexprimierenden Tumore.

Claims

1. Rekombinantes Retrovirus, das in der Lage ist, die Expression einer immunogenen, nichttumorerzeugenden Form eines aktivierten Ras-Proteins oder die Expression polymorphen epithelialen Muzins zu steuern.

2. Rekombinantes Retrovirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das aktivierte Ras-Protein eine Mutation im Codon 12 des Ras-Gens enthält.

3. Rekombinantes Retrovirus nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Mutation eine Punktmutation ist, welche die Konversion von Glycin in Valin zur Folge hat.

4. Rekombinantes Retrovirus nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Mutation eine Punktmutation ist, welche die Konversion von Glycin in eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Arginin, Aspartat, Cystein, Alanin, Serin und Phenylalanin besteht, zur Folge hat.

5. Rekombinantes Retrovirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte aktivierte Ras-Protein eine Mutation im Codon 13 des Ras-Gens enthält.

6. Rekombinantes Retrovirus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte Mutation eine Punktmutation ist, welche die Konversion von Glycin zu einer Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Valin, Asparat und Arginin besteht, zur Folge hat.

7. Rekombinantes Retrovirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte aktivierte Ras-Protein eine Mutation im Codon 61 des Ras-Gens enthält.

8. Rekombinantes Retrovirus nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte tumorerzeugende Mutation eine Punktmutation ist, die die Konversion von Glutamin in eine Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arginin, Histidin und Leucin, zur Folge hat.

9. Rekombinantes Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Ras-Protein verkürzt ist.

10. Rekombinantes Retrovirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Ras-Protein ein verkürztes Ras-Protein ist, welches wie in Figur 2 gezeigt, von SP-Δ-Val¹² codiert wird.

11. Rekombinantes Retrovirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Muzin von einer cDNA codiert wird, die etwa 32 Muzin-Tandemsequenzwiederholungen enthält.

12. Rekombinantes Retrovirus nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es ein wie in Figur 5 gezeigtes replikationsdefektes MoMuLV-KT-3-retrovirales- Grundgerüst enthält.

13. Pharmazeutisches Präparat, umfassend ein rekombinantes Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel

14. Rekombinantes Retrovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder ein Präparat nach Anspruch 13 zur Verwendung in einer Behandlungsmethode des menschlichen oder tierischen Körpers.

15. Zielzelle, welche mit einem rekombinanten Retrovirus infiziert ist, das eine wie in einem der Ansprüche 1 bis 12 definierte immunogene, nichttumorerzeugende Form eines aktivierten Ras-Proteins exprimiert.